Wykorzystanie bakterii produkujących biosurfaktanty w
Transkrypt
Wykorzystanie bakterii produkujących biosurfaktanty w
Wykorzystanie bakterii produkujących biosurfaktanty w bioremediacji gleb skażonych związkami ropopochodnymi Związki ropopochodne stanowią poważne zagrożenie dla funkcjonowania wielu ekosystemów. Obiecującą metodą bioremediacji środowisk skażonych tymi związkami jest bioaugmentacja. autochtonicznych Metoda ta zespołów polega na zwiększeniu mikroorganizmów poprzez zdolności degradacyjnych wprowadzenie do gleby wyselekcjonowanych, pojedynczych szczepów mikroorganizmów lub też ich konsorcjum. Wprowadzane szczepy, obok właściwości degradacyjnych, powinny również charakteryzować się zdolnością do produkcji związków powierzchniowo-czynnych (biosurfaktantów). Związki te zwiększają biodostępność węglowodorów, w efekcie czego są one łatwiej rozkładane przez mikroorganizmy. Celem rozprawy doktorskiej było określenie efektywności procesu bioaugmentacyjnego prowadzonego w glebie zanieczyszczonej związkami ropopochodnymi z wykorzystaniem szczepów bakterii zdolnych do degradacji węglowodorów oraz produkcji biosurfaktantów, a także ocena wpływu tych bakterii na strukturę i aktywność metaboliczną autochtonicznych zespołów mikroorganizmów w oczyszczanej glebie. Ponadto, w celu obniżenia kosztów produkcji biosurfaktantów przez testowane szczepy, oceniano możliwość zastąpienia komercyjnych podłoży stosowanych do ich hodowli przez “niskokosztowe” podłoża naturalne, w postaci ścieków i produktów ubocznych z różnych gałęzi przemysłu. Spośród 45 szczepów bakterii rozkładających węglowodory, wyizolowanych z gleby zanieczyszczonej związkami ropopochodnymi, do badań wybrano 4 izolaty (Bacillus sp. T-1, T’-1, I’-1a oraz Pseudomonas sp. P-1). Szczepy te wykazywały zdolność do produkcji biologicznych związków powierzchniowo-czynnych na podłożu przygotowanym na bazie melasy. Ponadto, szczep P-1 wykazywał zdolność do rozkładu n-heksadekanu, surowej ropy naftowej oraz jej frakcji destylacyjnych A5 i P3. Produkowany przez niego biosurfaktant był mieszaniną mono- i di- ramnolipidu, z przewagą kongeneru di-ramnolipidowego. Podczas wzrostu na podłożu melasowym szczep ten przeprowadzał również efektywną emulsyfikację cykloheksanu, oleju silnikowego oraz n-heksadekanu. Do doświadczenia bioaugmentacyjnego wykorzystano 2 spośród testowanych szczepów - Bacillus subtilis T’-1 oraz Pseudomonas sp. P-1. Zastosowanie rifampicynoopornych, spontanicznych mutantów tych szczepów umożliwiło monitorowanie ich przeżywalności w inokulowanej glebie. Eksperyment prowadzony był w warunkach laboratoryjnych przez 91 dni w następujących układach badawczych: 1) gleba inokulowana szczepem T’-1, 2) gleba inokulowana szczepem P-1, 3) gleba inokulowana konsorcjum złożonym ze szczepów T’-1 oraz P-1, 4) gleba kontrolna, do której zamiast zawiesiny bakterii wprowadzano sterylną sól fizjologiczną. Po jego zakończeniu stwierdzono istotne statystycznie (P<0,05) ubytki węglowodorów we wszystkich bioaugmentowanych glebach, jednakże w glebie traktowanej mieszaniną szczepów P-1+T’-1 uzyskano trzykrotnie wyższy ubytek tych związków, w porównaniu z glebami inokulowanymi pojedynczymi szczepami. Wykazano również, że wszystkie szczepy, introdukowane zarówno pojedynczo, jak i w postaci konsorcjum, przeżywały w glebie przez cały okres trwania doświadczenia. W następnym etapie badań oceniano wpływ szczepów T’-1, P-1 oraz ich konsorcjum na mikroflorę autochtoniczną zamieszkującą oczyszczaną glebę. Wpływ tych bakterii na zmiany w liczbie kopii genu 16S rRNA oraz genu kodującego hydroksylazy alkanowe (alkB) badano z zastosowaniem metody łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (ang. real-time PCR). Wykazano, że inokulacja gleby tymi szczepami prowadziła do statystycznie istotnego (P<0,05) zwiększenia liczby kopii genu 16S rRNA w 1 i 7 dniu trwania doświadczenia, w porównaniu z glebą niebioaugmentowaną. W dniu 42 nie odnotowano istotnych statystycznie (P<0,05) zmian w ilości kopii tego genu pomiędzy badanymi glebami, natomiast po zakończonym eksperymencie statystycznie istotny (P<0,05) wzrost kopii tego genu, w porównaniu do pozostałych układów badawczych, oszacowano w glebie traktowanej szczepem P-1. Liczba kopii genu alkB była natomiast istotnie statystycznie (P<0,05) większa w bioaugmentowanych glebach, w porównaniu do kontroli, przez cały okres trwania doświadczenia. Wpływ wprowadzanych bakterii na ogólną bioróżnorodność bakterii oraz bioróżnorodność bakterii zdolnych do rozkładu węglowodorów alifatycznych oceniano metodą elektroforezy w gradiencie czynnika denaturującego (DGGE, ang. denaturing gradient gel electrophoresis). Zależności pomiędzy uzyskanymi profilami DGGE analizowano konstruując drzewa filogenetyczne metodą średnich połączeń (UPGMA, ang. unweighted pair group with mathematical averages). Zaobserwowano, że wprowadzenie bakterii do skażonej gleby zmieniło zarówno ogólną bioróżnorodność genetyczną zespołów bakterii jak i bioróżnorodność genetyczną zespołów rozkładających węglowodory w tej glebie. Zmiany w strukturze zespołów mikroorganizmów autochtonicznych zachodzące w czasie prowadzonego doświadczenia badano metodą analizy fosfolipidowych kwasów tłuszczowych (PLFA, ang. phospholipid fatty acid) izolowanych bezpośrednio z gleby. Wykazano, że wprowadzenie bakterii, zarówno pojedynczych szczepów jak i ich konsorcjum, powodowało krótkotrwałe zmiany w ilości kwasów tłuszczowych charakterystycznych dla bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Najwyraźniejsze zmiany, polegające na istotnym statystycznie (P<0,05) wzroście zawartości wszystkich analizowanych kwasów we wszystkich bioaugmentowanych glebach obserwowano 7 dni po rozpoczęciu doświadczenia. Po zakończonym eksperymencie w glebach traktowanych szczepami T’-1 oraz T’-1+P-1 nie odnotowano istotnych statystycznie (P<0,05) zmian w zawartości analizowanych kwasów w porównaniu do gleby nietraktowanej bakteriami. Natomiast w glebie bioaugmentowanej szczepem P-1 w 91 dniu obserwowano statystycznie (P<0,05) niższy, w porównaniu do kontroli, poziom kwasów charakterystycznych dla bakterii Gram-dodatnich. Zmiany w bioróżnorodności metabolicznej zespołów mikroorganizmów oceniono na podstawie analizy profili metabolizowania substratów wzrostowych przez zespoły mikroorganizmów (CLPPs, ang. community-level physiological profiles) występujące w badanej glebie. CLPPs wyznaczono przy użyciu płytek EcoPlates™ i systemu BIOLOG. Zaobserwowano, że na początku doświadczenia analizowane gleby różniły się substratami, których rozkład stanowił największy udział w ogólnej degradacji węgla. W kolejnych tygodniach doświadczenia obserwowano wzrastające podobieństwo pomiędzy profilami metabolicznymi uzyskanymi dla gleb traktowanych bakteriami T’-1, P-1 oraz T’-1+P-1. Po zakończonym doświadczeniu podobne substraty były preferencyjnie metabolizowane przez mikroorganizmy występujące w glebie poddanej procesowi bioaugmentacji. Ponadto,w bioaugmentowanych glebach w 1 i 91 dniu doświadczenia obserwowano wyższą, w porównaniu do kontroli, aktywność metaboliczną zespołów mikroorganizmów autochtonicznych. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że bioaugmentacja gleby skażonej związkami ropopochodnymi szczepami bakterii Bacillus subtilis T’-1, Pseudomonas sp. P-1 lub ich konsorcjum T’-1+P-1 prowadziła do zmian w genetycznej i metabolicznej bioróżnorodności bakterii, dzięki którym efektywność procesu bioremediacji była większa.