QUANTA LiteTM dsDNA

QUANTA Lite® RNP ELISA
708565
Do diagnostyki in vitro
Złożoność CLIA: Wysoka
Przeznaczenie
Test QUANTA LiteTM RNP ELISA to test immunoenzymatyczny (ELISA) do półilościowego wykrywania
przeciwciał przeciwko RNP w surowicy ludzkiej. Obecność przeciwciał przeciwko RNP może być stosowana
w połączeniu z objawami klinicznymi i innymi badaniami laboratoryjnymi, aby wspomóc diagnostykę tocznia
rumieniowatego układowego (SLE) i powiązanych chorób tkanki łącznej.
Podsumowanie i wyjaśnienie testu
Przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) występują w wielu różnych chorobach tkanki łącznej i jako takie stanowią
czuły cel badania przesiewowego.1 Pomimo tego, że badanie ANA jest doskonałym badaniem przesiewowym
dla SLE (wynik negatywny praktycznie wyklucza aktywne SLE)2, w żadnym wypadku nie jest to badanie
swoiste. Przeciwciała przeciwko antygenowi RNP występują nawet u 45% pacjentów z SLE i niektórymi
innymi chorobami tkanki łącznej.1,3 Obecność autoprzeciwciał przeciwko RNP wiąże się ze względnie
łagodnym przebiegiem choroby z niższą częstością występowania chorób nerek i ośrodkowego układu
nerwowego.4 Antygen RNP zawiera epitopy lub miejsca wiążące przeciwciała, które są unikalne dla RNP oraz
epitopy, które są pod względem immunologicznym identyczne z wolnym Sm.1 Ponieważ antygen RNP
powlekający fazę stałą w tym teście ma epitopy antygenowe Sm, podczas podawania wyników RNP należy
uwzględnić odpowiedź pacjenta na przeciwciała przeciwko Sm.
Do wykrywania przeciwciał przeciwko RNP stosowano wiele różnych metod, w tym podwójną dyfuzję
Ouchterlony i test aglutynacji pasywnej. Opracowano także użyteczne klinicznie testy ELISA do wykrywania
przeciwciał przeciwko RNP. Technika ELISA wykorzystywana w tych badaniach jest obiektywna, półilościowa
i może być dogodnie wykorzystywana do badania dużej liczby pacjentów.
Zasada badania
Oczyszczony kompleks antygenowy RNP/Sm wiąże się z dołkami płytek polistyrenowych w warunkach, które
zabezpieczają antygen w jego stanie natywnym. Wstępnie rozcieńczone kontrole i rozcieńczone surowice od
pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków, umożliwiając wszelkim obecnym przeciwciałom przeciwko
RNP lub Sm związanie się z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do
każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgG. Druga
inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z dowolnymi
przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich
niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu
bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać
ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w
dołkach z próbkami od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Podczas zgłaszania przeciwciał przeciwko RNP
należy zawsze uwzględnić udział przeciwciał przeciwko Sm w ogólnej reaktywności układu testu. Wyniki tego
testu wskazują na reaktywność z kompleksem RNP/Sm, a nie wyłącznie samym RNP.
Odczynniki
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta oczyszczonym metodą powinowactwa
kompleksem antygenowym RNP/Sm (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej
osuszacze
Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez ludzkich
przeciwciał przeciwko RNP, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml
Słabo pozytywna kontrola testu RNP ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała
surowicy ludzkiej przeciwko RNP, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml
Silnie pozytywna kontrola testu RNP ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała
surowicy ludzkiej przeciwko RNP, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml
Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka – zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną
TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml
Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x – zabarwienie czerwone, zawiera sól
fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć
w sekcji Metody.
Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka – zabarwienie niebieskie, zawiera
bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml
Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml
Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344 M, 1 fiolka – bezbarwny, 10 ml
Ostrzeżenia
1.
2.
OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (0,02% chloramfenikol) w
rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka.
Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu
zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że nie zawierają
przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie
zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego też
względu słabo pozytywną kontrolę testu RNP ELISA, silnie pozytywną kontrolę testu RNP ELISA i
kontrolę negatywną testu ELISA należy obsługiwać w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie
zakaźny.5
1
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w
przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z
ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli
do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie
dopuścić do gromadzenia się azydku.
Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być
toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych,
należy unikać kontaktu ze skórą i oczami.
Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania,
spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub
kontaktu ze skórą i oczami.
Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać
wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z
kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być
toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami.
Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych
przepisów w zakresie utylizacji odpadów.
Środki ostrożności
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro.
Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować
osiągnięciem niespójnych wyników.
Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA
wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła.
Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi
urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w
stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest
potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w
akceptowalnych limitach.
Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową
odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność
płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy
trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga
staranności i precyzji.
Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej.
Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i
osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania.
Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może dać
niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest
przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP.
Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem
lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych,
takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację
koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie
wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia.
Warunki przechowywania
1.
2.
3.
Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie zamrażać. Odczynniki są
trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami.
Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce
foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2–8°C.
Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2–8°C.
Pobieranie próbek
Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do
próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne
zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub
lipemicznej surowicy albo próbek.
Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument NCCLS H18-A2 zaleca następujące
warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin.
2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2–8°C. 3) Jeśli
badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w
temperaturze -20°C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze
wymieszane.
Badanie
Dostarczone materiały
1
1
1
1
Płytka z mikrodołkami RNP ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem
1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA
1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu RNP ELISA
1,2 ml wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu RNP ELISA
2
1
1
1
1
1
50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP
25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x
10 ml koniugatu przeciwciała IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG
10 ml chromogenu TMB
10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344 M
Wymagane materiały nie dołączone do zestawu
Mikropipety na 5, 100, 200–300 i 500 µl
Jednorazowe końcówki mikropipet
Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości
Woda destylowana lub dejonizowana
Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania
Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla
odczytów przy dwóch długościach fali)
Sposób przygotowania
Przed rozpoczęciem
1.
2.
3.
4.
Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20 - 26oC) i dobrze wymieszać.
Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do
płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie
przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml
koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte.
Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2–8oC.
Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pochodzącej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl
rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od
przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli testu RNP ELISA, silnie pozytywnej
kontroli testu RNP ELISA i kontroli negatywnej ELISA.
Ustalenie obecności lub nieobecności RNP z zastosowaniem arbitralnych jednostek wymaga dwóch
dołków dla każdej z trzech kontroli oraz jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki pacjenta.
Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek.
Procedura badania
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE
DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20–26°C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w
uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i
dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną.
Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu RNP ELISA, silnie
pozytywnej kontroli testu RNP ELISA, kontroli negatywnej testu ELISA i rozcieńczone próbki
pochodzące od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na
równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki.
Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Dodać 200–300 µl rozcieńczonego
buforu do płukania HRP do wszystkich dołków, a następnie odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze
dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale
pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie
opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w
przypadku dodawania próbki.
Do każdego dołka dodać 100 µl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z
zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych.
Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO
ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO WLEWAĆ
NIEUŻYTEGO KONIUGATU Z POWROTEM DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w
etapie 2.
Etap płukania: Powtórzyć etap 3.
Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w
temperaturze pokojowej.
Do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas
dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać
płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków.
Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej
godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością
fali może być długość 620 nm.
Kontrola jakości
1.
2.
Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek
należy testować wraz ze słabo pozytywną kontrolą testu RNP ELISA, silnie pozytywną kontrolą testu
RNP ELISA i kontrolą negatywną testu ELISA.
Należy zauważyć, że ponieważ słabo pozytywna kontrola testu RNP ELISA, wysoko pozytywna
kontrola testu RNP ELISA i kontrola negatywna testu ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie
będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek.
3
3.
4.
Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub
krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne
można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze < 20°C.
Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe
kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako
nieważne i powinno zostać powtórzone.
a.
Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu RNP ELISA musi być
większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu RNP ELISA,
która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej
ELISA.
b.
Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu RNP ELISA musi być
większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA nie
może przekroczyć 0,2.
c.
Absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu RNP ELISA musi być
ponad dwukrotnie większa niż absorbancja kontroli negatywnej testu ELISA lub większa niż
0,25, lecz nie większa niż 0,6.
d.
Kontrola negatywna testu ELISA i silnie pozytywna kontrola testu RNP ELISA mają za zadanie
wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Silnie pozytywna kontrola
testu RNP ELISA nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania.
e.
Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie
NCCLS C24-A.
Obliczanie wyników
W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność
każdej próbki można następnie wyliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość
optyczną słabo pozytywnej kontroli testu RNP ELISA. Otrzymany wynik mnoży się przez liczbę jednostek
przypisanych do słabo pozytywnej kontroli testu RNP ELISA, którą można znaleźć na etykiecie.
Gęstość optyczna próbki
Wartość próbki =
(jednostki)
x słabo pozytywna
kontrola testu RNP ELISA
gęstość optyczna słabo pozytywnej kontroli testu RNP ELISA
(jednostki)
Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał
u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie
jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli
wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie
seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z
wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta.
Interpretacja wyników
Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w
populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium
powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji
pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami.
Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, słabo pozytywna, średnio pozytywna lub silnie
pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą.
Jednostki
<20
20 – 39
40 – 80
>80
Negatywny
Słabo pozytywna
Średnio pozytywna
Silnie pozytywna
Wyniki tego testu przy braku jakichkolwiek innych danych powinny być zgłaszane raczej jako pozytywne (lub
negatywne) względem kompleksu Sm/RNP niż samego RNP. (patrz omówienie porównania wartości Sm i
RNP poniżej).
4
Porównanie wartości Sm i RNP
Wynik pozytywny w teście QUANTA Lite® RNP ELISA wskazuje na obecność przeciwciał reaktywnych z
kompleksem RNP/Sm, ale nie pozwala rozróżnić aktywności anty-Sm i anty-RNP. Firma INOVA sprzedaje
test QUANTA Lite® Sm ELISA przeznaczony do pomiaru aktywności przeciwciał Sm. Z tych dwóch
przeciwciał Sm ma większe znaczenie kliniczne i jest uznawane za marker SLE. Obecność Sm jest użyteczną
informacją dla lekarza niezależnie od tego czy, występuje samodzielnie lub w połączeniu z RNP. Jeżeli
obecne są przeciwciała przeciwko Sm, występowanie przeciwciał przeciwko RNP może nie być dla lekarza
kluczowe. W tych przypadkach wynik może być zgłaszany jako pozytywny dla przeciwciał Sm oraz
kompleksu Sm/RNP. Jeżeli pacjent ma pozytywny wynik przeciwciał przeciwko Sm, bardzo prawdopodobne
jest także występowanie przeciwciał przeciwko RNP i występowanie przeciwciał anty-Sm przy braku antyRNP jest rzadkie. W celu rozróżnienia ważne jest rozważenie reaktywności próbki w układzie w celu
oznaczenia samych przeciwciał przeciwko Sm. Po oznaczeniu aktywności przeciwciał przeciwko Sm można
wnioskować aktywność przeciwciał przeciwko RNP. Jeżeli próbka jest negatywna w teście Sm ELISA, ale
pozytywna w teście RNP ELISA, wówczas jej reaktywność jest spowodowana głównie lub wyłącznie
przeciwciałami przeciwko RNP i można ją zgłaszać bezpośrednio w jednostkach RNP. Jeżeli jednak
reaktywność w teście Sm ELISA jest równa reaktywności RNP, wówczas próbka jest przede wszystkim antySm. Pośrednia aktywność Sm większa od wartości granicznej, ale mniejsza niż 80% aktywności RNP
wskazuje, że próbka stanowi mieszaninę przeciwciał przeciwko Sm i RNP i powinna być zgłaszana jako
pozytywna dla obu przeciwciał. W każdym z tych przypadków aktywność RNP można oszacować odejmując
aktywność Sm powyżej wartości granicznej (tj. powyżej 20 jednostek) od całkowitego wyniku testu ELISA
RNP. Dla przykładu badanie próbki dające 35 jednostek w teście Sm ELISA i 115 jednostek w teście ELISA
RNP należy zgłosić jako 35 jednostek aktywności Sm i 100 jednostek (tj. 115 - 15) RNP. Oszacowanie
aktywności RNP w próbkach wykazujących wysoką aktywność w testach RNP i Sm może być trudne. Gdy
próbka jest silnie pozytywna (tj. powyżej 100 jednostek lub absorbancja powyżej 1,0) zarówno dla Sm jak i
RNP, odejmowanie aktywności Sm od RNP może fałszywie wskazywać wynik negatywny dla RNP. Próbki
silnie pozytywne (>100 jednostek) zarówno pod względem RNP oraz Sm zaleca się zbadać ponownie w
rozcieńczeniu 1/10 i 1/20 (w rozcieńczalniku do próbek) w celu ustalenia, czy aktywność RNP jest wyższa niż
Sm. Obliczenia muszą zostać przeprowadzone na tym samym rozcieńczeniu próbki pacjenta. Alternatywnie
próbkę można zbadać za pomocą innej techniki, takiej jak test podwójnej dyfuzji Ouchterlony.
Ograniczenia badania
1.
2.
3.
4.
Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce
pochodzącej od pacjenta może powodować podwyższony poziom nieswoistego wiązania i wytwarzać
fałszywe pozytywne wyniki w tym badaniu.
Nie u wszystkich pacjentów z SLE występują przeciwciała przeciwko RNP. Badania metodą
Ouchterlony wykazywały przeciwciała przeciwko RNP jedynie u 19% (20/105) pacjentów z SLE.
Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami
serologicznymi.
Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica.
Spodziewane wartości
Zdolność testu QUANTA Lite® RNP ELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko RNP oceniano przez
porównanie z dostępnymi w handlu testami podwójnej dyfuzji firmy INOVA Diagnostics, Inc. Wyniki testów
Ouchterlony oznaczano jako pozytywne, jeżeli występowały linie precypitatu identyczności i jako negatywne
jeżeli nie obserwowano żadnej linii lub obserwowano linię świadczącą o nieidentyczności. W teście ELISA
udział przeciwciał przeciwko Sm w reaktywności testu RNP dostosowano przez porównanie reaktywności w
teście QUANTA Lite® RNP ELISA z reaktywnością tej samej próbki w teście QUANTA Lite® Sm ELISA.
Normalny zakres
Wybrano sto jeden losowych próbek surowicy i zbadano je za pomocą testu RNP ELISA. Średnia populacji
próbki wyniosła 4,7 jednostki ze standardowym odchyleniem 1,1 jednostki. Zakres populacji wyniósł od 1,4 do
10,1 jednostek. Ta próba wykazała, że normalna średnia wynosi ponad 13 standardowych odchyleń poniżej
wartości granicznej.
Swoistość i czułość względna
W celu określenia względnej czułości i swoistości testu próbki od 223 pacjentów z dodatnim wynikiem ANA
zawierające przeciwciała przeciwko wielu różnym antygenom jądrowym zbadano zarówno za pomocą metody
Ouchterlony jak i ELISA. Zawsze w przypadku wystąpienia rozbieżności między wynikami testów Ouchterlony
i ELISA próbki badano ponownie za pomocą zatwierdzonej metody ELISA do wykrywania swoistych
przeciwciał przeciwko RNP, które mogą mieć miano poniżej granicy wykrywania techniki Ouchterlony.
Spośród 223 przetestowanych próbek 71 były pozytywne a 146 negatywne wg obu metod. Jedna z próbek
była pozytywna w teście Ouchterlony, ale negatywna w teście ELISA. Ta próbka była także negatywna w innej
dostępnej w handlu metodzie ELISA dla RNP. Ostatnich 5 próbek było pozytywnych wg ELISA ale
negatywnych wg badania Ouchterlony. Każda z tych próbek była także badana za pomocą innej dostępnej
procedury ELISA i jedna z pięciu wykazywała pozytywną reakcję z RNP, natomiast pozostałe cztery próbki
były negatywne. Wyniki testu RNP ELISA zebrano w tabeli poniżej i przyjęto, że jedna próbka pozytywna w
obu metodach ELISA jest reakcją prawdziwie pozytywną.
OT
+
-
INOVA
+
72
1
4
146
Wrażliwość względna
Swoistość względna
Skuteczność względna
5
98,6%
97,3%
97,8%
Precyzja i powtarzalność
Precyzja i powtarzalność badania zostały przebadane przez przeprowadzenie sześciu powtórzeń każdej silnie
pozytywnej i słabo pozytywnej próbki w sześciu oddzielnych badaniach. Średnia reakcyjność silnie
pozytywnych wynosiła 110,2 jednostki, a wartość średnia słabo pozytywnych wynosiła 33,8. Poniżej znajduje
się podsumowanie odchylenia standardowego oraz współczynnika zmienności dla każdej próbki.
Łącznie
W ramach serii
Pomiędzy seriami
Silnie pozytywna
SD
CV
5,3
4,9%
3,7
3,4%
4,8
4,4%
Słabo pozytywna
SD
CV
1,9
5,6%
1,6
4,9%
1,2
3,6%
6
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens(ANA): Their immunobiology and medicine.
Advances in Immunology 33: 167-239, 1982.
Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus
Erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: 1271-1277, 1982.
Reichlin M and Maddison PJ: Soluble tissue autoantibodies which precipitate with sera of
patients with connective tissue diseases. In: Immunopathology of the skin, 2nd ed(EH
Beutner,TP Chorzelski, SF Bean, eds)John Wiley and Sons, NY pp 351-362, 1979.
Reichlin M and Mattioli M.: Correlation of a precipitin reaction to an RNA protein antigen and
a low prevalence of nephritis in patients with systemic lupus erythematosus. N Eng J Med
286:908-911, 1972.
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease
Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition
7
NOVA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc.
Copyright 2011. Wszelkie prawa zastrzeżone©
Wyprodukowano przez:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
Stany Zjednoczone Ameryki
Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów
Zjednoczonych i Kanady):
877-829-4745
Pomoc techniczna (poza terenem Stanów
Zjednoczonych):
00+ 1 858-805-7950
[email protected]
Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii
Europejskiej:
Medical Technology Promedt Consulting GmbH
Altenhofstrasse 80
D-66386 St. Ingbert, Niemcy
Tel.: +49-6894-581020
Faks.: +49-6894-581021
www.mt-procons.com
628565POL
Luty 2011
Wersja 0
8