Fluorescencja krwi po wzbudzeniu porfirynowego pasma Soreta

Komentarze

Transkrypt

Fluorescencja krwi po wzbudzeniu porfirynowego pasma Soreta
Fluorescencja krwi po wzbudzeniu
porfirynowego pasma Soreta
Blood Fluorescence after Exitation at Phorfirins Soret Band
Grzegorz Głaczyński
Instytut Fizyki Uniwersytetu Jagiellońskiego
ul. Reymonta 4, 30-059 Kraków, Polska
Podziękowania
Pragnę serdecznie podziękować Panu Prof. Dr
Hab. Wojciechowi Gawlikowi za poświęcony czas,
zaangaŜowanie oraz moŜliwość prowadzenia badań
w tak
interesującym
obszarze
nauki,
jakim
jest
fotomedycyna. Panu Dr Krzysztofowi DzierŜędze za
Ŝyczliwą pomoc oraz wszystkim, którzy przyczynili się
do powstania niniejszej pracy.
Grzegorz Głaczyński
2
Spis treści:
1.
Wstęp........................................................................................................................6
1.1.
Motywacje.........................................................................................................7
1.2.
Cele ...................................................................................................................7
1.3.
Problematyka wstępna ......................................................................................7
2. Zastosowanie światła w biologii i medycynie........................................................8
2.1.
Fototerapia.........................................................................................................8
2.2.
Przykłady wykorzystania światła w medycynie ...............................................9
2.3.
Terapia fotodynamiczna..................................................................................11
2.4.
Diagnostyka fotodynamiczna..........................................................................12
2.5.
Fotochemiczne podstawy PDD i PDT ............................................................13
2.5.1.
Absorpcja ................................................................................................14
Transmitancja......................................................................................................14
Absorbancja.........................................................................................................14
2.5.2.
Fluorescencja...........................................................................................15
Wydajność kwantowa .........................................................................................16
Wygaszanie fluorescencji................................................................................16
2.5.3.
Przejścia bezpromieniste.........................................................................17
2.5.4.
Fosforescencja.........................................................................................18
2.5.5.
Wysokoreaktywne związki tlenowe........................................................19
II typ fotoreakcji..................................................................................................20
I typ fotoreakcji ...................................................................................................21
Tlen singletowy...................................................................................................23
Wydajność kwantowa tlenu singletowego ......................................................24
3. Fotouczulacze.........................................................................................................25
3.1.
Porfiryny i ich pochodne.................................................................................25
3.2.
Porfiryny .........................................................................................................25
3.2.1.
Porfiryny występujące w przyrodzie.......................................................26
3.2.2.
Porfiryny otrzymywane syntetycznie......................................................27
HpD .....................................................................................................................28
Photofrin II® ........................................................................................................28
3.2.3.
Kwas aminolewulinowy 5-ALA .............................................................29
3.3.
Pasma absorpcyjne porfiryn ............................................................................30
3.3.1.
Pasmo Soreta...........................................................................................31
3.3.2.
Pasmo Q ..................................................................................................31
3.4.
Cechy fotouczulaczy .......................................................................................32
3.5.
Zastosowanie...................................................................................................33
3.5.1.
Dawki ......................................................................................................33
3.5.2.
Efekty uboczne i przeciwwskazania .......................................................35
3.5.3.
Efektywność PDT i PDD ........................................................................35
3.6.
Krew................................................................................................................36
3.6.1.
Budowa ...................................................................................................36
3.6.2.
Znaczenie i funkcja krwi .........................................................................37
3.6.3.
Hemoglobina ...........................................................................................38
Hematoporfiryna .................................................................................................39
3.6.4.
Absorpcja i fluorescencja krwi................................................................39
4. Źródła światła ........................................................................................................43
3
4.1.
Znaczenie światła ............................................................................................43
4.2.
LED – diody elektroluminescencyjne.............................................................44
4.2.1.
Półprzewodniki .......................................................................................45
4.2.2.
Złącze pn .................................................................................................45
4.2.3.
Charakterystyka.......................................................................................46
4.2.4.
Właściwości ............................................................................................47
4.3.
Diody laserowe................................................................................................48
4.3.1.
Charakterystyka.......................................................................................48
4.5.
Porównanie LED z diodami laserowymi ........................................................49
4.6.
Diody elektroluminescencyjne 405 nm...........................................................50
4.6.1.
Widmo diody...........................................................................................50
4.6.2.
Moc diody ...............................................................................................52
4.6.3.
Jednorodność natęŜenia...........................................................................53
4.7.
Urologia – PDD...............................................................................................59
4.8.
Diody LED 740 nm .........................................................................................60
5. Aparatura i pomiar fluorescencji krwi ...............................................................62
5.1.
Widmo hemoglobiny – spektrometr SM520-USB..........................................62
5.2.
Aparatura pomiarowa......................................................................................64
5.2.1.
Kamera CCD...........................................................................................66
5.2.2.
Dane otrzymywane ze spektrometru .......................................................66
5.3.
Kalibracja układu pomiarowego .....................................................................67
5.3.1.
Kalibracja I – długości fali......................................................................68
5.3.2.
Kalibracja czułości kamery CCD............................................................71
5.3.3.
MONOSpectrometr - program do analizy danych ..................................75
5.4.
Fluorescencja krwi ..........................................................................................76
5.4.1.
Wpływ rozcieńczalnika na widmo fluorescencji ....................................78
Woda destylowana ..............................................................................................78
Krew grupy 0 Rh(-):........................................................................................78
Krew grupy 0 Rh(+):.......................................................................................79
Sól fizjologiczna..................................................................................................80
Krew grupy 0 Rh(-):........................................................................................80
Krew grupy 0 Rh(+):.......................................................................................81
PołoŜenie pików ..................................................................................................81
Amplitudy pików ................................................................................................86
5.4.2.
Wzbudzenie laserem o długości fali 415 nm ..........................................90
6. Podsumowanie .......................................................................................................93
6.2.
Wyniki i wnioski .............................................................................................93
6.3.
Ulepszenie aparatury.......................................................................................94
6.4.
Dalsze plany ....................................................................................................94
Literatura: ........................................................................................................................96
4
ABSTRAKT:
Niniejsza praca szczegółowo omawia procesy fizyko-chemiczne
problematyki związanej z diagnostyką fotodynamiczną (PDD) oraz
terapią fotodynamiczną (PDT). Zaznaczono w niej waŜną rolę
fotouczulaczy. Przedstawiono uogólnioną budowę i charakterystykę
barwników fotouczulających a takŜe powiązanie z krwią, której
podstawowym
składnikiem
jest
hem.
Proces
fluorescencji
zaprezentowano zarówno od strony teoretycznej jak i praktycznej.
Przedstawiono
widma
fluorescencji
krwi.
Przeanalizowano
zastosowania światła z zakresu widzialnego. Uwagę skupiono na
diodach elektroluminescencyjnych, które stosowano przy oświetlaniu
krwi. Przedstawiono równieŜ inne moŜliwości zastosowania diod LED
do celów diagnostycznych i terapeutycznych.
ABSTRACT:
Physical and chemical processes involved in Photodynamic Diagnosis
and Photynamic Theraphy have been described in details. Role of
photosensitizers has been
pointed out. General structure and
characterization of dyes and their connection with blood have been
presented in this work. Fluorescence was theoretically described and
observed fluorescence spectras of human blood were shown. Various
visible light sources from visible range and their possible applications
in PDD and PDT were analyzed. This work
was focused on
electroluminescence light – emitting diodes (LEDs), which were used
for blood excitation. Other possible use of LED’s as a light sources in
PDD and PDT had been discussed.
5
1. Wstęp
Obszar światła widzialnego był od zawsze szczególnie bliski człowiekowi.
Badania nad jego wpływem na organizmy Ŝywe prowadzone są od ponad stu lat.
Analizuje się interakcje promieniowania z materiałem biologicznym i substancjami
fotouczulającymi. Poszukiwania coraz lepszych fotouczulaczy wciąŜ trwają, a ich
zastosowanie, szczególnie w onkologii, moŜe zaowocować skuteczniejszą walką
z chorobami nowotworowymi. Światło widzialne nie penetruje jednak tkanek głęboko,
dlatego badania są skoncentrowane przede wszystkim na leczeniu i badaniu ich
powierzchniowych obszarów. Diagnostyka fotodynamiczna (PDD) pozwala natomiast
na obserwacje zmian w tkankach oraz związkach, które samoistnie są barwnikami
i wykazują
fluorescencję.
Równocześnie
daje
moŜliwość
badania
niektórych
biomolekuł, czy wręcz duŜych obszarów po wcześniejszym podaniu fotouczulacza.
Coraz powszechniejsze w medycynie jest zastosowanie laserów oraz róŜnego
rodzaju lamp oświetlających często wykorzystujących filtry spektralne. W niniejszej
pracy zwrócono uwagę na oświetlacze a takŜe zaproponowano inny ich rodzaj – jeszcze
mało popularne diody elektroluminescencyjne (LED). Cechują się one stosunkowo
dobrą monochromatycznością a jednocześnie niską ceną. Zastosowanie takich źródeł
światła
pozwoliłoby
na
szersze
rozpowszechnienie
diagnostyki
i
terapii
fotodynamicznej oraz dalszy rozwój tej dziedziny.
Stosowane w medycynie związki fotoczułe, dalej zwane barwnikami, są głównie
pochodnymi porfiryny. Idea ich zastosowania związana jest z badaniami nad
zaburzonym metabolizmem hemu, mogącym prowadzić do porfirii, choroby zwanej
inaczej „wampiryzmem” [1]. Dolegliwość ta polega na nadwraŜliwości chorych na
światło. Hem – elementarna część krwi jest głównym przedmiotem zainteresowania
w niniejszej pracy. W wyniku oświetlenia odpowiednim światłem obserwuje się
fluorescencję, która moŜe pozwolić na zauwaŜenie zmian międzyosobniczych, róŜnic
pomiędzy wieloma grupami krwi, a takŜe być moŜe pozwoli na wczesne diagnozowanie
róŜnych chorób. Krew przepływając przez cały organizm, jednocześnie ma kontakt
z obszarami patologicznymi, jeśli takowe występują. Wiedza, którą być moŜe uda się
zdobyć dzięki tym badaniom, pozwoliłaby na łatwą diagnostykę chorób.
6
1.1. Motywacje
Wykorzystanie wiedzy otrzymanej z analizowanych widm fluorescencyjnych
krwi do celów diagnostycznych moŜe zaowocować szybką techniką wykrywania zmian.
Natomiast zastosowanie tanich oświetlaczy zbudowanych z diod LED pozwoliłoby na
rozpowszechnienie tej metody. Coraz liczniej występujące zmiany nowotworowe
mogłyby być wykrywane wcześniej i dzięki temu skuteczniej leczone.
1.2. Cele
Problematyka związana z diagnostyką fotodynamiczną jest bardzo interesująca.
Badania
w
tym
kierunku
powinny
być
nieustannie
rozwijane,
a
wiedza
rozpowszechniana. Praca badawcza, która zaowocowała niniejszą pracą, wiązała się nie
tylko z pomiarem widm fluorescencji czy budowaniem układów optycznych,
oświetlaczy i ich charakterystyką ale teŜ próbami rozpowszechniania tej dziedziny
w coraz szerszych kręgach akademickich i nawiązywania współpracy i proponowania
ewentualnego zastosowania odpowiednich źródeł światła.
1.3. Problematyka wstępna
Krew, przedmiot zainteresowania w niniejszej pracy, składa się między innymi
z hematoporfiryny będącej naturalnym barwnikiem występującym w obrębie ludzkiego
organizmu. Cyrkuluje ona w ciele i dociera do wszystkich jego obszarów, równieŜ
patologicznych. Kontakt z chorymi miejscami moŜe wpływać na zmiany fluorescencji
krwi co było celem badań.
Obserwacja fluorescencji wymaga układu zbudowanego ze źródła światła
dopasowanego do pasm absorpcyjnych hemu. Tanim oświetlaczem jest dioda
elektroluminescencyjna. W tej pracy scharakteryzowano i opisano świecenie tego
obiektu. Kolejnym elementem jest spektrometr, który musi być wyposaŜony
w wystarczająco czuły detektor by móc rejestrować słabe widmo wyświetlane z krwi.
7
2. Zastosowanie światła w biologii i medycynie
2.1.
Fototerapia
KaŜdy spotkał się z określeniem „depresja zimowa”, która jest znana
w literaturze medycznej jako SAD (seasonal affective disorder) . Jest to zaburzenie,
będące formą depresji, najczęściej związane z niedostatkiem światła słonecznego.
Procesy fizjologiczne odpowiedzialne za ten stan nie są obecnie znane. Podejrzewa się
działanie melaniny, która prawdopodobnie wpływa na tzw. „zegar biologiczny”
organizmu ludzkiego. W okresie krótszego dnia powstaje zwiększona ilość melatoniny,
co prawdopodobnie jest odpowiedzialne za te stany depresyjne. Czasami wspomina się
o „odwróconym” SAD, który występuje w okresie letnim, dlatego SAD leczy się
niczym innym jak światłem. Naświetla się pacjenta przez okres ok. 30 minut światłem
50 krotnie mocniejszym, aniŜeli stosowanym do oświetlania pomieszczeń [2].
Znaczenie promieni słonecznych doceniane jest juŜ od czasów staroŜytnych.
Egipcjanie [3], nie bez powodów, czcili boga słońca – Ra, staroŜytni Grecy doceniali
biologiczną aktywność promieniowania słonecznego, rozumieli zarówno terapeutyczne
jak i szkodliwe jego działanie [4,5]. Im równieŜ zawdzięczamy określenie helioterapia,
czyli medyczne określenie światłolecznictwa - metody leczenia wykorzystującej
naświetlanie organizmu pacjenta światłem naturalnym.
Czasy nowoŜytne, a w szczególności koniec XIX wieku, to okres, w którym
rozpoczęto badania nad wpływem światła na tkanki biologiczne, jak i zastosowaniem
fotouczulaczy. W tym czasie wiedziano, Ŝe światło z zakresu ultrafioletu ma
właściwości
bakteriobójcze,
udowodniono
równieŜ,
Ŝe
ten
obszar
światła
odpowiedzialny jest za oparzenia oraz opaleniznę. Niels Ryberg Finsen z doskonałym
rezultatem leczył gruźlicę skórną wykorzystując lampę łukową (tzw. lampa Finsena).
XIX wiek przynosi juŜ pierwsze wzmianki o negatywnych interakcjach niektórych
podawanych pacjentom leków i roślin a światłem. W tym okresie Baumstark opisywał
negatywny wpływ światła na osoby chore na porfirię. Jean Prime opisuje wpływ światła
na osoby, którym podawano leki utworzone na bazie substancji fotouczulającej –
eozyny.
8
W 1900 roku Oscar Raab badał zachowanie drobnoustrojów pod wpływem
akrydyny jak i jej pochodnych przy naświetlaniu światłem słonecznym. Zaobserwował,
Ŝe badane pantofelki (Paramecium) giną, w przeciwieństwie do grupy kontrolnej, na
której nie stosował tego fotosensybilizatora. Badanie, po przeprowadzeniu setek
eksperymentów, doprowadziły go do wniosku, Ŝe na śmierć osobników bardziej
wpływała dawka światła aniŜeli stęŜenie fotouczulacza.
Niespełna dwa lata później, w 1902 r. zauwaŜono, Ŝe w reakcjach
fototoksycznych niezbędna jest obecność tlenu. W 1911 r. zauwaŜono fotodynamiczne
działanie hematoporfiryny. Natomiast w 1924 roku badania Polikarda wniosły waŜną
informację. ZauwaŜył on, Ŝe zmiany nowotworowe w postaci guzów, po oświetleniu
lampą Wooda (emitującą promieniowanie nadfioletowe), charakteryzują się silniejszą
czerwoną fluorescencją aniŜeli pozostałe obszary.
Kolejne lata badań przyniosły nowe odkrycia. W obszarach patologicznych
zauwaŜono większą ilość endogennych porfiryn, które wykazywały fotouczulenie na
światło z zakresu UV. Następowały pierwsze próby wykorzystania kumulacji
endogennych porfiryn w obszarach nowotworowych do celów diagnostycznych.
Aczkolwiek dopiero szersze wykorzystanie laserów i badania nad pochodnymi
hematoporfiryny (HpD - Hematoporphirin Derivatives) szerzej otwarło drogę rozwoju
fototerapii.
Właściwości lecznicze światła znane są od setek lat, ale obecny rozwój
technologiczny pozwala na szczegółowe badanie mechanizmów i procesów mających
wpływ na tkankę biologiczną pod wpływem kwantów światła. Poszukuje się równieŜ
optymalnych rozwiązań, by uzyskać najbardziej poŜądane efekty leczenia i diagnostyki
przy uŜyciu światła.
2.2.
Przykłady wykorzystania światła w medycynie
Terapia, jak i diagnostyka fotomedyczna nie są jedynymi moŜliwościami
oddziaływania kwantów promieniowania świetlnego z obiektami biologicznymi.
W zaleŜności od stosowanych gęstości mocy uzyskuje się róŜne efekty oddziaływań
światła laserowego z biomateriałami: fotochemiczne, fototermiczne, fotojonizacyjne,
fotodysocjacyjne
(polegające
na
rozerwaniu
biostymulacyjne (rys. 2.1.) [4,6,7] .
9
wiązań
chemicznych)
czy
Rys. 2. 1. Wpływ gęstości mocy i szerokości impulsu na ludzką tkankę [4,6].
Coraz powszechniejsze w medycynie jest zastosowanie laserów. Wśród wielu
dziedzin najczęściej stosuje się światło (bez wykorzystania fotouczulaczy) w:
2. Chirurgia, wykorzystującej głównie efekty termiczne. Zastosowanie
lasera w tej dziedzinie ma szereg zalet. Jest bezkontaktowe (nie wymaga
kontaktu z ciałem pacjenta), co wpływa na sterylność zabiegu. Wiązką
światła moŜna precyzyjnie manipulować selektywnie niszcząc obszary
wymagające leczenia. Przykłady:
°
chirurgia
refrakcyjna
–
operacje
okulistyczne:
modelowanie
soczewki, zbiegi na dnie oka, usuwanie jaskry
°
stomatologia – chirurgia tkanek miękkich i twardych jamy ustnej
°
usuwanie tkanek prostaty
°
ginekologia – sterylizacja
°
onkologia – usuwanie zmian nowotworowych
°
laryngologia – wycinanie migdałków
3. Światło lasera jest równieŜ wykorzystywane w dermatologii i kosmetyce.
Najczęstsze zastosowania to:
°
usuwanie przebarwień skórnych, blizn, tatuaŜy
°
usuwanie owłosienia – poprzez niszczenie cebulek włosa
°
„zgrzewanie” skóry – spajanie tkanek bez uŜycia szwów
°
leczenie trądziku
°
ablacja kosmetyczna – usuwanie zmarszczek
10
4. Właściwości
koagulacyjne
światła
znalazły
zastosowanie
pulmonologiczne – do leczenia guzów tarczycy, i podobnie jak
w laryngologii, zmian naczyniowych: naczyniaków, krwiaków, miejsc
krwawienia.
5. Fotomedyczne właściwości światła ultrafioletowego wykorzystywane są
w terapii Ŝółtaczki u noworodków, czy np. terapii łuszczycy.
°
Ŝółtaczka występująca wśród noworodków wynika z nadmiaru
bilirubiny w organizmie pacjenta. Promieniowanie z zakresu
425-475 nm jest absorbowane, a pochłonięta energia ma wpływ na
rozerwanie wiązań wodorowych w bilirubinie, co prowadzi do
prawidłowego usuwania jej z ciała pacjenta.
°
terapia leczenia łuszczycy, podobnie jak terapia fotodynamiczna,
wymaga substancji endogennej, którą aktywuje się światłem. Metoda
znana jest od długiego czasu. W pierwotnej formie stosowano
promieniowanie
UV
i
smołę,
którą
obecnie
zastępuje
się
8-methoxypsoralenem.
Współczesna literatura mówi równieŜ o efektach biostymulacyjnych światła
przy niskich gęstościach mocy (LLLT – low level laser therapy). Mechanizmy tego
procesu są wciąŜ słabo poznana, a efekty prezentowane w publikacjach poddawane
wątpliwościom [6,7,8].
2.3.
Terapia fotodynamiczna
Terapia fotodynamiczna PDT (photodynamic therapy) jest to metoda leczenia za
pomocą podawanych egzogennych fotouczulaczy i naświetlaniu światłem o określonej
długości fali, dostosowanym do pasm absorpcyjnych danego fotosensybilizatora.
W wyniku złoŜonych procesów fizyko-chemicznych w tkankach, którym został podany
zewnętrznie fotouczulacz po naświetleniu a zarazem zaabsorbowaniu odpowiedniej
energii przenoszonej przez kwant światła, następuje destrukcja komórek. Pozwala to na
selektywne niszczenie zmian patologicznych. Jest to tzw. reakcja fotocytotoksyczna [9].
Fotouczulacze, czyli pochodne związków porfirynowych, dobiera się tak, aby
gromadziły się w obszarach chorych, minimalizując w ten sposób ryzyko zniszczenia
obszarów zdrowych.
11
Największym obszarem zainteresowania cieszy się moŜliwość wykorzystania
PDT do leczenia zmian nowotworowych. Aktualne badania w tej dziedzinie koncentrują
się na znajdowaniu coraz bardziej selektywnie działających barwników (fotouczulaczy),
które nie będą powodowały szkody dla całego organizmu.
Wykorzystanie PDT do leczenia zmian nowotworowych pozwala na skuteczne
niszczenie obszarów patologicznych, gdyŜ właśnie tam występuje największe stęŜenie
fotosensybilizatora, przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonymi zdrowych
miejsc. Ograniczeniem jest moŜliwość naświetlania. Zmiany skórne w sposób łatwy
moŜna oświetlić. Problem pojawia się w momencie naświetlania wewnątrz organizmu.
W niektórych wypadkach moŜna stosować światłowody np. podczas zabiegów przy
uŜyciu endoskopów, czy naświetlać podczas operacji na „odsłoniętych” organach.
JednakŜe sporym problemem jest fakt wynikający z charakteru stosowanego światła –
penetruje tkanki na głębokości rzędu kilku milimetrów [4,6,7,9,10,11].
2.4.
Diagnostyka fotodynamiczna
Diagnostyka
fotodynamiczna
PDD
(photodynamic
diagnostyka fluorescencji FD (fluorescence diagnosis) [5]
diagnosis)
oraz
polega na określaniu
i obserwowaniu obszarów patologicznych – najczęściej zmian nowotworowych.
Podobnie jak PDT polega na podaniu fotouczulacza, który selektywnie trafia do
obszarów chorych i tam się kumuluje. Następnie oświetlając odpowiednim światłem,
dostrojonym do pasma absorpcji fotouczulacza, emitowany jest kwant światła o innej
długości fali. Fluorescencja ta pozwala na wyznaczenie obszarów zmienionych
chorobowo i jednocześnie pozwala na znajdowanie zarówno duŜych obszarów
patologicznych, jak i mikrorozsiewów, które często są niewidoczne przy świetle
dziennym. Dzięki PDD moŜna określić sposób leczenia, moŜe być to PDT albo inny
sposób usunięcia zmian nowotworowych np. chirurgiczny. WaŜnym aspektem,
poprawiającym czułość detekcji, jest inna długość fali fluorescencji uczulacza od
długości fali światła wzbudzającego.
12
2.5.
Fotochemiczne podstawy PDD i PDT
Najłatwiejszym sposobem opisu zjawisk towarzyszącym zarówno terapii jak
i diagnostyki
fotodynamicznej
jest
opis
z
wykorzystaniem
diagramu
Jabłońskiego (rys. 2.2.).
Rys. 2. 2. Diagram Jabłońskiego.
Oznaczenia na rysunku: S0, S1, S2 – stany singletowe; T1 – stan tripletowy; vr – bezpromieniste przejście;
ic – konwersja wewnętrzna, isc – przejście interkombinacyjne; qu – przejścia związane ze stratą energii
wskutek zderzeń; nr – relaksacja bezpromienista; FLUOR – fluorescencja, PHOS – fosforescencja
[5,12,15].
Po naświetleniu fotouczulacza odpowiednią energią, następuje przechwycenie
przez substancje fotoczułą kwantu światła. Cząsteczka przechodzi z podstawowego
stanu singletowego (S0) do wzbudzonego stanu singletowego (Sn). W przypadku
organicznych cząsteczek aromatycznych, czyli równieŜ fotouczulaczy, będących
najczęściej pochodnymi porfiryny, energia przejścia do wysokoenergetycznego stanu
singletowego (Sn) odpowiada długościom fali mniejszym aniŜeli 300 nm. Przejście
ze
stanu S0 do podstawowego wzbudzonego stanu singletowego odpowiada zakresowi 300
– 800 nm. Jak widać, obszar wykorzystywany w fototerapii jest obszarem światła
widzialnego, w takich przypadkach najwygodniej jest wyraŜać energię za pomocą
długości fali wyraŜonej w nm [4,9,12].
Energia zaabsorbowanych fotonów jest odwrotnie proporcjonalna do długości fali λ:
E=
hc
λ
,
gdzie:
stała Plancka wynosi h=6,625*10-36 [Js] oraz prędkość światła w próŜni c=3*108 [m/s]
13
2.5.1. Absorpcja
Absorpcja światła w fotouczulaczu jest związana z przejściem elektronu ze stanu
podstawowego (S0) do stanu wzbudzonego (Sn). Fotosensybilizatory mają szerokie
pasmo absorpcji wynikające z silnego rozszerzenia oscylacyjnego elektronów.
Energia wymagana do absorpcji, czyli wzbudzenia cząsteczki wynosi ∆Ε:
∆E = E (S n ) − E (S0 ) .
Efektywność absorpcji jest ściśle związana z dopasowaniem energii padającej
a pasmami absorpcji fotouczulacza. Im lepsze dopasowanie tym większa wydajność
zachodzącego procesu. Najlepsze efekty uzyskuje się przy stosowaniu (quasi)
monochromatycznego światła [5].
Transmitancja
W najprostszych przypadkach, kiedy tylko część natęŜenia światła padającego
(I0) zostaje pochłonięta, a część światła przechodzi dalej, mówimy o transmitancji
(lub współczynniku
transmisji
–
T).
MoŜe
ona
przyjmować
wartości
od
0 do 1.
Transmitancja określa się wyraŜeniem [10,13]:
T=
I
.
I0
Absorbancja
Charakteryzując światło pochłonięte wprowadza się wielkość absorbancji (A).
W prosty sposób jest powiązana z transmitancją [10,13]:
1
A = log   .
T 
14
2.5.2. Fluorescencja
Fluorescencję moŜna opisać za pomocą poniŜszych wzorów:
S0 + hν → S1
S1 → S0 + hν ,
gdzie S0,1 oznaczają odpowiednio stan podstawowy i pierwszy wzbudzony stan
singletowy, hν energię pochłoniętą i wyemitowaną.
Wzbudzone stany singletowe (Sn) są krótkoŜyciowe i po ok. 10-15 s przechodzą
do najniŜszego wzbudzonego stanu singletowego (S1) a stamtąd (ze stałą
czasową ~ 10-8 – 10-10 s) do stanu podstawowego. Takim przejściom moŜe towarzyszyć
fluorescencja, czyli emisja kwantów o określonej energii, lub bez promieniowania –
wskutek wewnętrznej konwersji.
Zjawisko
fluorescencji
jest
waŜne
z
punktu
widzenia
diagnostyki
fotodynamicznej. Emisja światła w obszarach zawierających wzbudzany fotouczulacz
pozwala na dobre zlokalizowanie i określenie słabo widocznych gołym okiem obszarów
zaatakowanych przez chorobę nowotworową.
Rys. 2. 3. Zwierciadlane odbicie emisji względem absorpcji oraz reguła Franka Condona [5,12-14].
Wiele fotouczulaczy wykazuje symetrie odbicia lustrzanego widma absorpcji względem fluorescencji (po
lewej). Reguła Franka Condona (po prawej) mówi, Ŝe przejścia związane ze zmianą stanu elektronu
cząsteczki są „pionowe”, tzn. pojawiają się bez zmian geometrycznych w atomie.
Długość
fali
wyemitowanego
światła
jest
dłuŜsza
od
długości
fali
zaabsorbowanej. Jest to tzw. przesunięcie stokesowskie. Ze względu na róŜnice
w długościach fali łatwiej moŜna zauwaŜyć obszary fotouczulone, wykazujące
fluorescencję [4,9,10,13,15].
15
Wydajność kwantowa
Wydajność kwantowa – jest to prawdopodobieństwo wystąpienia danego
procesu w stosunku do prawdopodobieństw wszystkich procesów zachodzących
w danym procesie. W najprostszym przypadku jest to stosunek energii kwantów
powstałych w wyniku fluorescencji do całkowitej energii podanej na układ.
Przejście fotouczulacza ze stanu wzbudzonego niekoniecznie musi być związane
z emisją kwantu światła w wyniku fluorescencji. Wydajność kwantowa przejścia
promienistego zaleŜy od kilku procesów:
o szybkości ffluor – przejścia promienistego S1S0
o konwersji wewnętrznej (internal conversion – ic) S1S0
o przejścia interkombinacyjnego (intersystem crossing – isc) S1T1
stała kinematyczna dla obu powyŜszych procesów równa jest ficisc
Wydajność kwantowa fluorescencji (Qfluor) wynosi:
Q fluor =
f fluor
f fluor + f icisc
.
Czas Ŝycia (τ) stanu wzbudzonego moŜna określić przez:
τ=
1
.
f fluor + f icisc
Wygaszanie fluorescencji
W przypadku zderzeń atomów fotouczulacza z inną cząsteczką, zwaną
wygaszaczem, naleŜy dodatkowo uwzględnić we wzorze na wydajność kwantową stałą
szybkości gaszenia (fq) oraz stęŜenie wygaszacza (q). Wzór na kwantową wydajność
fluorescencji przyjmie wówczas następującą postać:
Q fluor =
f fluor
f fluor + f icisc + f q q
16
.
Proces gaszenia fluorescencji prowadzi do zmniejszenia wydajności kwantowej
a jednocześnie skraca czas Ŝycia cząsteczki w stanie wzbudzonym. W obecności
wygaszacza wzór na czas Ŝycia wyraŜa się przez:
τ=
f fluor
1
.
+ f icisc + f q q
Gaszenie fluorescencji moŜe wynikać z dwóch procesów:
o zderzeń cząsteczki fotouczulacza z cząstkami wygaszaczy (tzw. dynamiczne
gaszenie)
o gaszenia statycznego wynikającego z zachodzących reakcji pomiędzy
fotouczulaczem i cząsteczkami wygaszacza prowadzących do utworzenia
róŜnych kompleksów [5,13,16,17]
Zjawisko
wygaszania często występuje w roztworach
w wyniku działania
rozpuszczalnika na fluoryzującą cząsteczką.
2.5.3. Przejścia bezpromieniste
Bezpromieniste przejścia pomiędzy wzbudzonym a podstawowym stanem
singletowym powodują zamianę pochłoniętej energii na ciepło. Proces ten jest
nieistotny zarówno dla PDD jak i PDT.
Cząsteczka fototuczulacza moŜe równieŜ tracić swoją energię wskutek konwersji
wewnętrznej wynikającej ze zderzeń z innym cząstkami. Działanie na cząsteczki
promieniowaniem elektromagnetycznym z zakresu podczerwieni moŜe wpływać na ich
ruch rotacyjny.
Rys. 2. 4. Przykłady zmian rotacji cząsteczek.
Natomiast bezpromieniste przejścia ze wzbudzonego stanu singletowego do
wzbudzonego stanu tripletowego (T1) o niŜszej energii, mają istotne znaczenie dla
terapii fotodynamicznej. Czas Ŝycia wzbudzonego stanu tripletowego jest znacznie
dłuŜszy aniŜeli czas Ŝycia stanu singletowego i jest rzędu 10-6 s. Przejściom tym
17
towarzyszy zmiana spinu elektronów. Kolejnym etapem transferu energii moŜe być
fosforescencja, lub istotniejszy dla PDT przekaz energii do sąsiadujących w pobliŜu
cząsteczek. Energia ze stanu tripletowego jest przekazywana innym cząsteczkom co
z kolei prowadzi do uszkodzenia otoczenia na skutek róŜnych procesów fizykochemicznych opisanych w dalszej części [10].
2.5.4. Fosforescencja
Fosforescencję schematycznie moŜna przedstawić za pomocą poniŜszego
równania:
isc
S0 + hν → S1 → T1 → S 0 + hν PHOS .
Rys. 2. 5. Przekaz energii – fosforescencja.
Rys. 2. 6. Bezpromieniste przejście pomiędzy stanami singletowymi i trypletowymi (po lewej).
Przesunięcie widma fosforescencji w kierunku większych długości fali względem absorpcji i
fluorescencji (niŜsze energie).
Cząsteczka przebywa w stanie trypletowym dłuŜej niŜ we wzbudzonym stanie singletowym – łatwiej traci
energię przechodząc bezpromieniście do stanu podstawowego na skutek zderzeń z innymi molekułami.
Przejścia o róŜnej multipletowości (interkombinacyjne) czyli T1 S0 są
formalnie zabronione, dlatego są mniej prawdopodobne, czyli charakteryzują się małą
wydajnością
kwantową
(prawdopodobieństwem
18
zajścia
tego
procesu).
Prawdopodobieństwo jest nieco wyŜsze, gdy róŜnice energetyczne pomiędzy tymi
stanami są niewielkie lub gdy stany nakładają się. Proces ten znany jest jako
fosforescencja – jest to jeden z rodzajów luminescencji. Obsadzenie poziomu
tripletowego bezpośrednio ze stanu podstawowego jest bardzo trudne, więc cząsteczka
najczęściej zostaje wzbudzona do pierwszego stanu singletowego S1 i z niego
przechodzi do stanu tripletowego. Z tego faktu wynika przesunięcie widma
fosforescencji w kierunku fal dłuŜszych względem widma absorpcji i widma
fluorescencji tej samej cząsteczki. Ze względu na małą wydajność kwantową, widma
fosforescencji są trudne do rejestracji i nie wykorzystuje się ich do diagnostyki
fotodynamicznej [4,9,13,17].
2.5.5. Wysokoreaktywne związki tlenowe
W terapii fotodynamicznej najwaŜniejszy jest przekaz energii ze wzbudzonych
stanów singletowych do stanu tripletowego. Fosforescencja w tym wypadku odgrywa
marginalne znaczenie.
Przejście interkombinacyjne, czyli przejście pomiędzy stanem singletowym (S1)
a stanem tripletowym (T1), moŜe prowadzić do transferu energii z fotouczulacza do
znajdujących się w otoczeniu cząstek. W zaleŜności od ich typu mówimy o I lub II typie
fotoreakcji, prowadzących do utworzenia wysokoreaktywnych związków tlenowych.
Rys. 2. 7. Schemat reakcji odpowiedzialnych za procesy cytotoksyczne – I oraz II typ fotoreakcji.
19
O typie reakcji decyduje głównie środowisko fotouczulacza, oraz stęŜenie tlenu.
Istotne jest równieŜ stęŜenie fotosensybilizatora. Utlenianie tkanek biologicznych
wynika głównie z procesów związanych z tlenem molekularnym i jest najistotniejsze
w procesie PDT. Według badań, obszary, w których natlenienie jest mniejsze niŜ 50%
źle odpowiadają na PDT.
Fotoreakcja II typu występuje przy duŜym stęŜeniu tlenu, ale moŜe mu
towarzyszyć w mniejszym stopniu fotoreakcja typu I. Ten z kolei przewaŜa
w momencie, gdy tlenu brakuje, dlatego często podczas terapii fotodynamicznej stosuje
się krótki czas naświetlania i powtarza się go co kilkanaście godzin. Cząsteczki tlenu
w tym okresie zostaną uzupełnione. Po wymianie energii fotouczulacza z sąsiedztwem,
powraca on do swego stanu początkowego, czyli jest względnie reaktywny. Proces ten
jednak nie zachodzi w sposób idealny. Działanie światła przyczynia się do
fotodegradacji fotouczulacza (photobleaching) [4,9,18].
II typ fotoreakcji
W środowisku utlenionym cząsteczki fotouczulacza, znajdujące się w stanie
tripletowym, najczęściej przekazują energię do sąsiadujących cząsteczek tlenu. Stanem
podstawowym tlenu jest stan tripletowy, więc transfer energii nie jest zabroniony
a multipletowość jest zachowana [15].
Proces oksydacji komórek związany jest głównie z niskimi, metastabilnymi
wzbudzonymi stanami singletowymi. Molekuła tlenu w takim stanie charakteryzuje się
długim czasem Ŝycia, co wpływa na tendencję do reagowania z innymi cząstkami
i utleniania tkanek biologicznych.
Tlen cząsteczkowy posiada nisko leŜące singletowe stany wzbudzone. Przejście
ze stanu podstawowego do stanu wzbudzonego wymaga jedynie 22,5 kcal/mol
(λ=1274 nm – bliska podczerwień). Ze względu na małą energię potrzebną do
wzbudzenia, reakcja ta w środowisku bogatym w tlen jest uprzywilejowana.
W terapii fotodynamicznej największy wpływ niszczący (cytotoksyczny) na
komórki ma tlen we wzbudzonym stanie singletowym 1O2. Wydajność cytotoksyczna
fotoreakcji I typu jest ściśle powiązana ze stęŜeniem tlenu w obszarze naświetlanym.
20
Rys. 2. 8. Schemat procesów zachodzących w II typie fotoreakcji.
Cząsteczka fotouczulacza (FS – fotosensybilizator) pochłania kwant energii
( hν ) i przechodzi do stanu wzbudzonego ( 3 FS * ).
hν + 1FS → 3 FS *
W I typie fotoreakcji energia zostaje przekazana do tlenu singletowego,
3
FS * + 3O2 → 1FS + 1O2
który oddziałuje z substratem organicznym (SUB) i powoduje przejście fotouczulacza
do formy podstawowej.
O2 + SUB → FS (0)
1
Wzbudzony tlen singletowy jest formą bardzo reaktywną. Jego obecność
prowadzi do mechanizmów utleniających, co z kolei prowadzi do obumierania
komórek. Cząsteczki fotouczulacza, które przekazały w ten sposób energię, przechodzą
do stanu podstawowego, mogą ponownie pochłaniać energię i przekazywać ją dalej wg.
wyŜej opisanego schematu.
Oprócz tlenu singletowego (znajdującego się w podstawowym stanie
tripletowym), w obrębie środowiska fotosensybilizatora mogą znajdować się inne
cząsteczki, dla których stanem podstawowym jest równieŜ stan tripletowy. Do
najczęściej
występujących
związków
występujących
w
podstawowym
stanie
tripletowym (poza O2) moŜna zaliczyć tlenek azotu oraz witaminę A [4,9].
I typ fotoreakcji
Mechanizm ten ma miejsce, gdy środowisko fotouczulacza jest ubogie w tlen
lub gdy jego stęŜenie gwałtownie spadło w wyniku fotoreakcji II typu. W reakcji
następuje transfer elektronu lub wodoru z fotosensybilizatora do elementów tkanki.
21
Powstają rodniki nadtlenkowe ( O2•
oraz
HO2• ), przyczyniające się do mechanizmów
oksydacyjnych biomolekuł, a w następstwie ich obumarcie.
Rys. 2. 9. Schemat procesów zachodzących w I typie fotoreakcji.
Cząsteczka fotouczulacza (FS – fotosensybilizator) pochłania kwant energii
( hν ) i przechodzi do stanu wzbudzonego ( 3 FS * ), co prowadzi do kolejnych procesów.
hν + 1FS → 3 FS *
Wymiana elektronu z substratem ( czyli tkanką, oznaczoną jako SUB) produkuje
utleniony substrat.
3
FS * + SUB → FS − + SUB +
Zredukowana o elektron molekuła fotouczulacza (FS-) reaguje z tlenem powodując
powstanie anionu nadtlenkowego O2-. Ten z kolei moŜe wytworzyć rodniki
hydroksylowe (OH*).
FS − + O2 → FS + O2−
Barwnik znajdujący się w stanie zbudzonym moŜe równieŜ reagować z rodnikami
nadtlenowymi O2*, generując aniony nadtlenkowe, a z nich z kolei moŜe powstać
rodnik hydroksylowy.
3
FS + + O2* → FS + + O2−
W procesie fotoreakcji I typu zostaje zniszczony substrat organiczny w wyniku
fotoutleniania. Proces fotoreakcji II typu ma jednakŜe większe znaczenie dla terapii
fotodynamicznej i planuje się ją tak, by obszar naświetlany był dobrze zaopatrzony
w tlen co daje lepsze efekty leczenia [4,6,9,18].
22
Tlen singletowy
Tlen singletowy, czyli bez niesparowanych elektronów, nie jest formą
podstawową, a wzbudzoną. Tlen singletowy jest bardzo reaktywny i silnie reaguje
z otoczeniem.
Forma singletowa oznaczana jest jako 1O2 , O :: O lub O = O . Natomiast
tripletowa przedstawiana jako 3O2 , • O • •O • lub • O − O • , gdzie kropka oznacza
elektron, kreska - dwa elektrony tworzące wiązanie.
Opisanie
własności
tlenu
molekularnego
wymaga
zastosowania
teorii
kwantowej. Konfiguracja tlenu atomowego to: OY (1s )89 (2s )89 (2 p x )8 (2 p y )8 (2 pz )89 ,
z czego wynika następujące obsadzenie orbitali tlenu w stanie podstawowym:
O2Y (1σ g ) 2 (1σ u ) 2 (2σ g ) 2 (2σ u ) 2 (3σ g )2 (1π u ) 4 (1π g )2 .
Właściwości
tlenu
wynikają
z obsadzenia sześciu elektronów na orbitalach π . Konfiguracja elektronowa stanu
o najniŜszej energii to: O2Y * (π x )89 (π y )89(π *x )8 (π *y )8 . Stan ten określany jest jako
3
Σ g G . Zgodnie z regułą Hunda, niesparowane elektrony występują na dwóch
antywiąŜących orbitalach i odpowiadają za właściwości paramagnetyczne.
Degeneracja orbitali, jednakowe spiny oraz liczby kwantowe elektronów, powodują, Ŝe
zgodnie z zasadą Pauliego muszą one zajmować osobne orbitale.
Po oddziaływaniu wzbudzonego fotouczulacza z O2, spin jednego elektronu
ulega odwróceniu, jednocześnie zmienia się jego liczba spinowa, co prowadzi do
generacji pary elektronowej na jednym orbitalu. Energia, która zostaje zaabsorbowana
powoduje destabilizację tlenu 1O2. Tlen singletowy 1O2 występuje jako spolaryzowany
dwubiegunowy jon. Krótki czas Ŝycia tlenu singletowego, powoduje, Ŝe uszkodzenia
w procesie utleniania z 1O2 występują jedynie w obszarze o grubości błony komórkowej
ok. 0,02 µm. MoŜna przyjąć, Ŝe jest to jedynie obszar, w którym znajduje się cząsteczka
fotosensybilizatora.
23
Rys. 2. 10. Schemat obsadzeń elektronów w stanie podstawowym (1) oraz wzbudzonym (2 i 3).
W stanie podstawowym dwa sparowane elektrony znajdują się na π g a w stanie
wzbudzonym oznaczane przez 1 ∆ g . Tlen ( 1 ∆ +g ) charakteryzuje się niŜszą energią. Do
wzbudzenia tlenu do tego stanu wymagana jest niewielka energia wynosząca 22,5
kcal/mol (0,98 eV). Stan o większej energii to 1 Σ +g . W tym stanie występują dwa
sparowane elektrony na dwóch róŜnych orbitalach π g . Energia potrzebna do tego
wzbudzenia wynosi 37,5 kcal/mol (1,63 eV). Stan o wyŜszej energii ( 1 Σ +g ) szybko
przechodzi do stanu 1 ∆ +g [9,13,15-17].
Wydajność kwantowa tlenu singletowego
Wydajność kwantowa singletowego tlenu (Q∆) jest waŜną własnością kaŜdego
fotouczulacza stosowanego w PDT. Wielkość ta zaleŜy od liczby molekuł
1
O2
wytwarzanych przez kaŜdy foton zaabsorbowany przez cząstkę fotouczulacza [13,15].
Q∆ = Qisc f isc S ∆ ,
gdzie:
o Qisc – wydajność kwantowa procesu przejścia interkombinacyjnego
o fisc – frakcja „uwięzionych” przez tlen singletowy stanów tripletowych
o S∆ – prawdopodobieństwo transferu energii z tripletowego stanu tlenu
molekularnego
Wszystkie pomiary Q∆ mówią o jakości fotoreakcji II typu [13,15].
24
3. Fotouczulacze
W diagnostyce i terapii fotodynamicznej najistotniejszą rolę odgrywają
fotouczulacze aktywowane światłem o charakterystycznej długości fali. Pozwalają na
rozpoznawanie
i
niszczenie
zmian
nowotworowych,
czy
innych
obszarów
chorobowych.
3.1.
Porfiryny i ich pochodne
Fotouczulacze uŜywane w diagnostyce i terapii fotodynamicznej to najczęściej
porfiryny, chloryny i bakteriochloryny oraz ich pochodne. Związki te cechują się
płaskimi cząstkami aromatycznymi i szkieletową budową, opartą na czterech
symetrycznie ułoŜonych pierścieniach pirolowych, połączonych naprzemiennie
pojedynczymi i podwójnymi wiązaniami pomiędzy atomami węgla [1,4,9,19].
Rys. 3. 1. Chemiczne struktury (od lewej): porfiryny, chloryny, bakteriochloryny [9] Posiadają
odpowiednio 22, 20 i 18 elektronów π, odpowiadających za sprzęŜanie pierścieni aromatycznych.
Coraz szersze są badania nad wykorzystaniem ftalocyjaniny i teksapiryny.
W teksapirynie występują trzy pierścienie pirolowe, natomiast pierścienie pirolowe we
ftalocyjaninie są połączone mostkami azotowymi.
3.2.
Porfiryny
Nazwa porfiryn pochodzi z greki: „ π o ρϕνρ oσ ”, co oznacza szkarłatne,
purpurowe. Charakteryzują się unikatowymi właściwościami optycznymi – są silnie
25
zabarwione – absorbują promieniowanie EM z zakresu widzialnego. Są waŜnym
elementem organizmów Ŝywych [1,3,19].
Rys. 3. 2. Trójwymiarowy schemat porfiryny.
Cząsteczki porfiryn są płaskie, a ich budowa opiera się na pierścieniach
atomowych zawierających cztery atomu azotu (N). Porfiryny są makrocyklicznymi
związkami, które zawierają jedynie wiązanie o hybrydyzacji sp2. Mogą tworzyć
kompleksy z jonami metali, umiejscowionymi w środku struktury cząsteczki. Jony
metali przejmują od atomów azotu pirolu pary elektronów [3,19]. W organizmie pirol
powstaje z dwóch cząsteczek kwasu δ-aminolewulinowego (patrz. rozdz. 3.1.4.).
Rys. 3. 3. Porfiryna: (od lewej) uproszczony wzór Fishera, asymetryczny typ III oraz struktura
chemiczna pirolu – elementarnej części związków z grupy porfirynoidów [19].
Wszystkie porfiryny zbudowane są z układu zwanego porfiną, która nie
występuje w przyrodzie w stanie wolnym, z róŜnymi podstawnikami bocznymi.
Wszystkie istotne w biologii porfiryny mają asymetrycznie rozmieszczone podstawniki
boczne typu III. Takie porfiryny nazywa się protoporfirynami IX [19].
3.2.1. Porfiryny występujące w przyrodzie
Porfiryny występują w organizmach Ŝywych, moŜna je równieŜ otrzymywać
sztucznie. Porfiryny mają zdolność do kompleksowego wiązania metali, co warunkuje
ich charakterystyczne właściwości [1]. Znalazło to odniesienie w nazewnictwie i z tego
26
powodu mówi się o nich jako metaloporfirynach [20]. Do najpopularniejszych
substancji wykazujących szkieletową budowę porfiryn moŜna zaliczyć witaminę B12,
chlorofil, urynoporfiryny, koproporfiryny i hem [3,19].
Rys. 3. 4. Wzory strukturalne: uroporfiryny III, koproporfiryny III oraz hemu (protoprfiryny III)
[wg. 3].
Przyłączenie Ŝelaza lub magnezu warunkuje przekształcenie porfiryny
odpowiednio do hemu lub chloryny do chlorofilu [19]. Bakteriochlorofil posiada w swej
strukturze posiada równieŜ magnez. W cząsteczce witaminy B12 występuje jon
kobaltu [1,20]. Chlorofil, który występuje we wszystkich roślinach zielonych zawiera
w swej strukturze jon magnezu. Jego obecność pozwala na absorpcję promieniowania
elektromagnetycznego z zakresu widzialnego a za razem reakcję fotosyntezy.
Pochłonięcie fotonów jest ściśle powiązane z obecnością w podwójnych wiązaniach
elektronów π [3]. Obecny rozwój technologiczny pozwala równieŜ na sztuczne
otrzymywanie tych związków.
3.2.2. Porfiryny otrzymywane syntetycznie
Porfiryny moŜna równieŜ syntetyzować w laboratoriach, uzyskując ich coraz to
lepsze właściwości optymalne do PDT i PDD. Substancje takie najczęściej nie
występują naturalnie w przyrodzie. Obecnie otrzymuje się wiele ich odmian opierając
się na pochodnych najprostszych porfiryn [3].
W zaleŜności od rodzaju syntezy podstawniki boczne mogą być jednakowe lub
róŜne. Podstawowy szkielet porfiryn syntetyzuje się w kilku etapach w reakcjach
pomiędzy aldehydami, pirolami lub analogicznymi prekursorami w środowisku
kwasowym i pod wpływem procesów oksydacji. Pierwszą zsyntetyzowaną porfiryną
27
była tetrafenyloporfiryna (TPP). Otrzymał ją w 1936 roku przez Rothmund. Od tamtego
czasu otrzymuje się coraz to nowsze i o lepsze substancje fotoczułe.
HpD
Praktycznie wszystkie fotouczulacze stosowane do tej pory bazują na budowie
porfiryn, chlorin, bakteriochloryn i ftalocyjanin. Pierwszym klinicznie zastosowanym
fotouczulaczem w terapii fotodynamicznej była pochodna hematoporfiryny (HpD)
opisana przez zespół Lipson’a w 1961 roku. WciąŜ stosuje się rozpuszczaną w wodzie
pochodną hematoporfiryny (HpD). Jej oczyszczona forma została skomercjalizowana
i sprzedawana jest pod nazwą „Photofrin II®” [3].
Badania nad właściwościami HpD określiły cechy, które idealny fotouczulacz
powinien spełniać. Udowodniono, Ŝe większa masa odpowiada za lepszą lokalizację
w komórkach nowotworowych, ale jednocześnie wiąŜe się to ze spadkiem wydajności
kwantowej tlenu singletowego [8,21].
Photofrin II®
Photofrin II® – fotouczulacz wytwarzany przez firmę QLT jako pierwszy [9,8]
uzyskał atest FDA i jest szeroko stosowany na świecie w terapii jak i diagnostyce
fotodynamicznej na świecie. Photofrin II® jest pochodną HpD Skutecznie stosuje się go
przy wielu typach nowotworów, jednakŜe nie przy wszystkich z takim samym efektem.
Charakteryzuje się długofalowym pasmem absorpcji przy czerwonym świetle
o długości fali λmax ~ 630 nm. Stosowane promieniowanie w tym obszarze pozwala na
fotouczulenie do głębokości ok. 5 mm. Ogranicza to zastosowanie tylko do leczenia
nowotworów osadzonych blisko powierzchni. Liczne badania przeprowadzane na tym
związku wykazały, Ŝe nie wywołuje on zmian mutagennych i nie jest toksyczny. MoŜna
go stosować wielokrotnie, gdyŜ nie ulega odporności wielolekowej. Optymalne warunki
do leczenia następują po 48 godzinach – wtedy następuje największa kumulacja
w nowotworze. Photofrin II® pozostaje w skórze pacjenta przez 4 do 8 tygodni, co
powoduje jego nadwraŜliwość na światło w tym okresie [4,17,22].
28
Rys. 3. 5. Wzór strukturalny Photofrin II® [wg. 8].
3.2.3. Kwas aminolewulinowy 5-ALA
Kwas aminolewulinowy (oznaczany jako ALA, lub 5-ALA) ma szczególne
znaczenie w syntezie porfiryn. Jego właściwości do endogennej syntezy protoporfiryny
wykorzystano na początku lat 90-tych [23]. Jest prekursorem w powstawaniu hemu –
występującego u wszystkich ssaków. Podanie kwasu delta aminolewulinowego
prowadzi do selektywnej akumulacji protoporfiryny IX (Pp IX). Jest ona równieŜ
niezbędna w procesie powstawania hemu. Schemat przedstawiono na rys. 3.6. Kwas
ALA powoduje nadmierne powstawanie Pp IX. Fakt ten jest wykorzystywany
w diagnostyce
i
terapii
fotodynamicznej.
Właściwości
fotouczulające
ALA
wykorzystywane są równieŜ w walce z chwastami i owadami. Zasada działania we
wszystkich tych przykładach jest analogiczna – powstające porfiryny są czułe na
światło. Naświetlanie odpowiednim światłem, dopasowanym do pasm absorpcji,
pozwala na detekcję (przy uŜyciu niebieskiego światła) lub niszczenie obszarów
o zwiększonym stęŜeniu Pp IX (czerwony obszar widma) (rys.3.7.) [21,24,25].
Rys. 3. 6. Schemat przedstawiający proces powstawania hemu. Po lewej widoczna jest cząsteczka
ALA. Podanie kwasu aminolewulinowego powoduje akumulacje Pp IX, co prowadzi do
nadwraŜliwości na światło [wg. 25].
29
Komórki nowotworowe zachowują się nieco odmiennie aniŜeli zdrowe.
Charakteryzują się inną aktywności enzymów związanych z syntezą Pp IX i hemu.
W komórkach nowotworowych obniŜona jest aktywność ferrochelatazy. Związane jest
to z większą kumulacją ALA i powstawaniem większej ilości Pp IX [25].
Zastosowanie ALA w onkologii jest dość duŜe – poświadcza to fakt, iŜ dostępny
jest gotowy lek oparty na tym kwasie – „Levulan®” [26]. Jest to naturalnie występujący
kwas w organizmie, przez co nie powoduje dodatkowych szkód. Diagnostyka
fotodynamiczna, która jest stosowana z wykorzystaniem ALA jest powszechna
w neurochirurgii czy urologii. Chirurgiczne usuwanie obszarów przy białym świetle
często prowadzi do usunięcia jedynie wyraźnie widocznego ogniska nowotworu, gdzie
występują miejsca martwicze. Zastosowanie światła niebieskiego pozwala na
uwidocznienie obszarów, gdzie pozornie nie występuje nowotwór. Usunięcie takich
miejsc pozwala na zatrzymanie rozwoju nowotworu i pozwala na uniknięcie nawrotów
choroby. Kwas aminolewulinowy idealnie nadaje się do takich celów, aczkolwiek
charakteryzuje się szybkim wybielaniem fluorescencji [25,26]. Ten niepoŜądany efekt
moŜna zniwelować poprzez stosowanie zamiennie światła niebieskiego (oznaczenie
zmian) oraz światła białego pozbawionego niebieskiej części widma (usunięcie zmian).
Wybielanie fluorescencji i jej wpływ na fototerapię jednakŜe nie jest w pełni
zrozumiany
[26].
Przydatne
okazuje
się
równieŜ
filtrowanie
obserwowanej
fluorescencji. „Wycina” się obszar światła, którym wzbudzana jest protoporfiryna IX
a obserwuje się jedynie obszar świecący w innych długościach fali [25]. Zastosowanie
fotouczulacza pozwala na obserwacje jam ciała, w których występują problemy
z diagnozowaniem nowotworów. Fototerapia z wykorzystaniem ALA znajduje
zastosowanie
w
walce
z
nowotworami
płuc,
mózgu,
Ŝołądka
i
pęcherza
moczowego [23].
3.3.
Pasma absorpcyjne porfiryn
Porfiryny, chloryny oraz bakteriochloryny mają odpowiednio 22, 20 i 18
elektronów π, odpowiadających za sprzęŜanie pierścieni aromatycznych. ZłoŜony układ
wiązań sprzęŜonych powoduje, Ŝe związki te dobrze absorbują światło z zakresu
widzialnego.
30
Związki z grupy porfirynoidów cechują się dwoma silnymi pasmami absorpcji:
o pasmem Soreta
o pasmem Q
3.3.1. Pasmo Soreta
Wszystkie związki z grupy porfiryn, niezaleŜnie od posiadanych podstawników
bocznych wykazują silną absorpcję w obszarze ~ 390 – 425 nm, zwanym pasmem
Soreta [20,25]. Obszar ten jest uŜywany jedynie dla celów diagnostycznych (PDD), co
wynika z charakteru tego światła. Promieniowanie o długości fali λ ~ 400 nm bardzo
słabo penetruje tkanki. Czasami zakres UV-Vis stosuje się do leczenia płaskich zmian
w śluzówce.
Rys. 3. 7. Schemat przedstawiający widmo absorpcyjne Protoporfiryny IX [wg. 25].
Większość roztworów porfiryn i ich pochodnych po naświetleniu światłem
nadfioletowym wykazują fluorescencje, o zwiększonej względem oświetlanej długości
fali (przesunięcie Stokesa). Wyświecają w czerwonym obszarze światła widzialnego.
Silna fluorescencja pojawia się nawet w przypadku śladowych ilości tych cząsteczek.
Zjawisko to wykorzystuje się np. w wykrywaniu porfirii – obserwuje się świecenie
uroporfiryn i koproporfiryn – metabolitantów pośrednich syntezy hemu [3,9,19,20,25].
3.3.2. Pasmo Q
W terapii fotodynamicznej wykorzystuje się obszar wykazujący głębsze
wnikanie w tkanki. Jest to obszar λ 600 – 800 nm, zwany pasmem Q. Pasma
31
absorpcyjne barwników stosowanych w PDT rozszczepione są na 3 – 4 składowe,
słabiej absorbujące niŜ pasmo Soreta. Najsilniejsze pasmo absorpcji dla porfiryn
przypada na λ ~ 630 nm, chloryn λ ~ 650 nm a bakteriochloryny λ ~ 710 nm.
Pochodne porfiryny znajdują zastosowanie w PDT, gdyŜ cechują się maksimum
absorpcji w obszarze światła o barwie czerwonej, są cząsteczkami występującymi
w przyrodzie. Niektóre są produkowane w organizmie człowieka. Wszystkie są
małotoksyczne dla ludzi. Posiadają duŜą wydajność kwantową produkcji tlenu
singletowego (Q∆) [3,9,19-21,25].
3.4.
Cechy fotouczulaczy
Wczesne badania nad HpD doprowadziły do ogólnych wniosków dotyczących
właściwości fotouczulaczy i wytycznych, do których naleŜy się stosować podczas ich
produkcji. Obecnie znanych i stosowanych jest wiele substancji fotouczulających.
Zanim zostaną dopuszczone do uŜytku, muszą spełniać warunki, które są sprawdzane
w testach klinicznych:
o selektywność kumulacji w tkankach chorych
o aktywność od 70 do 150 godzin po podaniu pacjentowi
o stosunkowo szybka usuwalność z organizmu (po ok. 150 godzinach)
o absorpcja w obszarze widma EM dobrze penetrującym tkanki (kilka –
kilkanaście mm),
a jednocześnie nienakładającym się na pasma absorpcji
naturalnie występujących w organizmie barwników czułych na światło
(tj. hemoglobina, melanina czy nawet woda)
o duŜa wydajność kwantowa produkcji tlenu singletowego – głównego czynnika
cytotoksycznego
o brak toksyczności dla organizmu pacjenta
Spełnienie wszystkich powyŜszych warunków jest niezwykle trudne. Związane
jest to z róŜną budową patologicznych tkanek i róŜnym ich oddziaływaniu z cząstkami
fotosensybilizatora.
Najczęściej prowadzone badania, związane z fotouczulaczami, wykonuje się
przy
uŜyciu
mikroskopii
fluorescencyjnej.
32
Analizuje
się
jednoskładnikowe,
luminescencyjne fotouczulacze. Okazuje się, Ŝe cząsteczki fotouczulacza są przyłączane
do jąder komórkowych, mitochondriów, lizosomów oraz membran plazmatycznych
w komórkach
nowotworowych,
co
daje
moŜliwości
stosowania
w onkologii [3,4,7-9,10,21].
3.5.
Zastosowanie
Wykazano, Ŝe terapia fotodynamiczna niszczy komórki rakowe, co wynika
z selektywnej kumulacji stosowanego fotouczulacza. Podczas takiej terapii powstają
równieŜ liczne skrzepy w naczyniach krwionośnych, co powoduje odcięcie dopływu
tlenu i substancji odŜywczych do komórek nowotworowych [9].
Zastosowanie światłowodów i przyrządów endoskopowych pozwala na
rozszerzenie PDT i PDD do badania i leczenia jam ciała. Obecnie występują coraz
bardziej wyspecjalizowane i specjalnie przystosowane do tych celów sondy medyczne.
Pozwalają na wykorzystanie fotosensybilizatorów przykładowo w: urologii, proktologii,
czy teŜ otolaryngologii [27].
fotouczulacze
Prekursory
Egzogenne
Tab. 1. Najczęściej stosowane fotouczulacze oraz zastosowanie (n= nowotwór) [5,8].
Fotouczulacz
Główny składnik
Photofrin®
HpD
Zastosowanie
o n. płuc
o n. pęcherza
o n. przełyku
Visudyne®
BPDMA
o zmiany naczyniowe
Foscan®
m-THPC
o n. jamy ustnej
Levulan®
5-ALA
Metvix®
m-ALA
o zmiany skórne
o n. pęcherza
o choroba Bowena
3.5.1. Dawki
W zaleŜności od obszarów leczonych i charakteru fotouczulacza wybiera się
odpowiedni sposób podawania. Dostarcza się go w formie pastylek, maści czy
33
roztworów dostarczanych doŜylnie, czy śródtkankowo. NajwaŜniejsze w całym procesie
jest dobranie stęŜenia barwnika oraz odczekania pewnej ilości czasu, aby nastąpiła jego
selektywna kumulacja [8,9]. W zaleŜności od rodzaju fotouczulacza czas akumulacji
w tkance wynosi od 30 min (BPD-MA) do 96 godzin (m-THPC) [4].
Przykładowo Photofrin II® podaje się w dawce 2 mg/kg ciała pacjenta, podczas gdy
inny barwnik (meta-tetrahydroksyfenylochloryna „Foscan®”) wymaga duŜo mniejszego
stęŜenia (0,1mg/kg) by uzyskać identyczny efekt terapeutyczny.
Jak juŜ wcześniej wspomniano, penetracja ciała wynika z podawanych energii
(długości fali). Teksapiryna lutetu („Lutex®”) stosowana do leczenia czerniaków,
wykazuje największa absorpcję na długości fali λ ~ 730 nm co pozwala na wnikanie
głębiej w tkanki [28].
W leczeniu onkologicznym podawane są duŜe dawki, małe w stanach zapalnych.
Skuteczność działania zaleŜy od wydajności kwantowej tlenu. Do niszczenia tkanek
wykorzystuje się światło o mocy 100 – 150 J/cm2 przy 100 – 200 mW/cm2 i duŜym
stęŜeniu fotouczulacza. Stany zapalne leczy się oświetlając 10 J/cm2 przy 40 mW/cm2
i małym stęŜeniu fotouczulacza.
Kwas aminolewulinowy (ALA) podaje się zazwyczaj na dwa sposoby: 60mg/kg
doustnie lub 30mg/kg doŜylnie. Od czasu podania fotosensybilizatora do momentu
badania/leczenia zazwyczaj oczekuje się mniej niŜ 6 godzin. Leczenie glejaków przy
podaniu tego fotouczulacza i częstego naświetlania pozwala na usunięcie zmian
nowotworowych do 1,4 cm w głąb tkanki [23,25].
Rys. 3. 8. Etapy terapii fotodynamicznej [5].
34
3.5.2. Efekty uboczne i przeciwwskazania
Po podaniu substancji fotouczulającej skóra jest nadwraŜliwa na światło. Pacjent
po PDD czy PDT przez pewien okres czasu musi unikać nadmiernego kontaktu
z promieniowaniem słonecznym. Przykładowo dla Photofrin II® ochrona skóry i oczu
musi trwać od 4 do 8 tygodni, pulytin, czyli etiopuryna cyny – 7 dni. Efekty uboczne
poza oczywistym fotouczuleniem są nieznaczne [25]. Przyjmowanie Photofrin II®
powoduje podobne, rzadko występujące dolegliwości, jak i w przypadku stosowania
jakiegokolwiek środka farmakologicznego np. bóle głowy czy nudności [29-31].
3.5.3. Efektywność PDT i PDD
Diagnostyka fotodynamiczna nie niszczy zmian nowotworowych, ale pozwala
na lepsze odnalezienie ognisk jak i mikrorozsiewów nie widocznych gołym okiem
[23,25]. Metoda ta pozwala na usunięcie obszarów chorych i zminimalizowanie
nawrotów, dzięki usunięciu obszarów, w którym proces nowotworowy dopiero się
rozwija. Metoda ta niejednokrotnie potrafi być czulsza aniŜeli inne metody badania
duŜych powierzchni i wykrywa nawet wczesne zmiany patologiczne [23,32]. Co więcej
pozwala na weryfikację – czy obszary wyglądające podejrzanie „na oko” faktycznie
zawierają tkankę nowotworową [23]. Po PDD moŜna kierować na dalsze etapy leczenia.
Tab. 2. Efekty PDT [3,4,9]
pierwotne (komórkowe)
o uszkodzenie błon komórkowych
wtórne (naczyniowe)
o zakrzepica naczyń w obszarach
nowotworowych
o uwolnienie enzymów
o zwęŜenie naczyń tętniczek
lizosomalnych
o uszkodzenia lizosomalne
zdrowych tkanek
o uszkodzenie organelli
o obrzęk tkanek
komórkowych
o uszkodzenia mitochondrialne
o liza wewnątrzkomórkowa
35
Terapia fotodynamiczna przynosi zadawalające efekty w wielu dziedzinach.
Najczęściej pozwala na wydłuŜenie Ŝycia pacjenta. Stosuje się ją równieŜ w cięŜkich do
wyleczenia przypadkach jako środek uśmierzający ból (niszczenie obszarów chorych,
bez całkowitej moŜliwości usunięcia tkanek zmienionych chorobowo). Najczęściej
podawane w literaturze dane mówią o dwukrotnym przedłuŜonym czasie Ŝycia
pacjentów [23,25]. MoŜliwe jest równieŜ całkowite wyleczenie, ale co waŜniejsze
leczenie powierzchownych zmian w jamach ciała nie wymaga zabiegów na otwartym
ciele pacjenta, co pozwala na uniknięcie komplikacji z tym procesem związanych [23].
W tabeli.2. podano najwaŜniejsze procesy PDT odpowiedzialne za niszczenie tkanek
nowotworowych.
3.6.
Krew
Krew jest to złoŜony układ róŜnych komórek. Obiega cały ustrój organizmu
docierając do wszystkich narządów ciała, równieŜ miejsc chorych (jeśli występują).
Takie oddziaływanie moŜe mieć wpływ na jej zmianę w budowie czy właściwościach.
Krew nie jest fotouczulaczem, ale niektóre jej składniki są barwnikami i cechują się
silnymi pasmami absorpcyjnymi. Pierwsze z badań nad fotouczulaczami opierały się
właśnie na jej podstawowym składniku (hem – występujący w erytrocytach).
3.6.1. Budowa
Krew to wysoko wyspecjalizowana tkanka łączna, obiegająca cały organizm.
Występuje w stanie płynnym i u dorosłego człowieka zajmuje 5 – 5,5 l.
55 – 60 % objętości stanowi płynne osocze o Ŝółtawym zabarwieniu (wynikający
z obecności bilirubiny – powstałej z rozpadu hemu), resztę stanowią elementy
morfotyczne:
o czerwone krwinki (erytrocyty)
o białe krwinki (leukocyty)
o płytki krwi (trombocyty) [33]
36
Czerwone krwinki (RBC – red blood cells) dostarczają tlen do komórek
i odprowadzają dwutlenek węgla. Erytrocyty dzięki obecności hemu są silnie
zabarwione na czerwono, są pozbawione jądra, i mają charakterystyczny dwuwklęsły
kształt. Erytrocyty Ŝyją do 120 dni, po czym są zastępowane nowo powstałymi
krwinkami. Białe krwinki odpowiedzialne są za system immunologiczny organizmu.
Natomiast trombocyty, będące fragmentami komórek odgrywają waŜną rolę
w procesach krzepnięcia krwi.
WaŜnym elementem są zestawy antygenów występujących na powierzchni krwi.
Odpowiedzialne są one za odpowiedz układu odpornościowego. Najczęściej się mówi
o nich jako o grupach krwi.
Najistotniejsze dla medycyny są grupy:
o AB 0
o Rh - antygeny C, c, D, E, e
o Kell - antygen K [33]
Rys. 3. 9. Zdjęcie czerwonych krwinek krwi wykonanych na AFM, po prawej widoczna
wizualizacja 3D [34].
3.6.2. Znaczenie i funkcja krwi
Krew krąŜy po całym organizmie, dociera do wszystkich elementów ciała,
pełniąc następujące funkcje:
o wymiana gazów – dostarcza tlen, odprowadza dwutlenek węgla
o dostarczanie substancji odŜywczych, witamin
o transport hormonów
37
o przenoszenie substancji zbędnych lub szkodliwych do narządów
wydalniczych
o regulacja temperatury ciała
o wyrównanie ciśnienia
o warunkowanie stałego pH w organizmie
o spełnianie funkcji immunologicznych
3.6.3. Hemoglobina
Niektóre funkcjonalnie aktywne białka mają budowę opartą o porfiryny
z kompleksowym wiązaniem z metalem [1]. Tak jest w przypadku niezbędnej do Ŝycia
hemoglobiny znajdującej się w erytrocytach. Jest to białko nie będące enzymem.
Przenosi tlen, nie katalizując Ŝadnej reakcji chemicznej. Pomimo tego faktu, zbudowana
jest podobnie jak enzymy. Jest to tzw. „honorowy enzym” [13].
Rys. 3. 10. Schemat przedstawiający transport tlenu przez erytrocyty.
Hemoglobina jest tetramerem złoŜonym z podjednostek α i β. KaŜda
podjednostka zawiera hem, będący grupą aktywną. Atom Ŝelaza Fe (II) znajdujący się
w hematoporfirynie wiąŜe w sposób odwracalny tlen bez zmiany wartościowości.
Cztery podjednostki hemu są ułoŜone symetrycznie tworząc sferyczną cząstkę
o niewielkich wymiarach. Budowa taka pozwala na gęste „upakowanie” hemoglobiny
w erytrocytach. StęŜenie hemoglobiny w czerwonych krwinkach wynosi około 30%
i pozwala na wychwycenie wystarczającej ilości tlenu dla potrzeb tkanek.
38
Hematoporfiryna
śelazoprotoporfiryna inaczej określana jako hematoporfiryna czy krócej hem, to
podstawowy budulec wszystkich hemoprotein w obrębie organizmu (hemoglobina,
mioglobina, cytochromy, katalaza, peroksydaza). Budowa białka jest podobna, róŜnice
występują w obrębie łańcucha polipeptydowego lub wartościowości jonu Ŝelaza. Hem
jest to niebiałkowa część hemoglobiny zawierająca w swym centrum Ŝelazo [1].
Podstawową strukturą jest szkielet porfirynowy, utworzony z czterech pierścieni
pirolowych. Ustawienia podstawników bocznych mogą być róŜne, ale tylko jeden
z izomerów jest określany jako Protoporfiryna IX – obecna w Ŝywych organizmach.
Funkcje biologiczne hemu wiąŜą się ściśle z obecnością Ŝelaza [3]. śelazo Fe2+
występuje
w
hemoglobinie
(Hb),
oksyhemoglobinie
(HbO2),
mioglobinie
i oksymioglobinie. Jon Ŝelazowy Fe3+ moŜna spotkać w methemoglobinie, katalazie
i peroksydazie. śelazo zmieniające swą wartościowość pomiędzy Fe2+ a Fe3+ występuje
w cytochromach, co się wiąŜe z funkcją tego białka [1,19].
Hem jest związany z wieloma procesami komórkowymi takimi jak transport
tlenu (hemoglobina), procesy oddechowe (oksydazy cytochromowe), homeostazę
naczyniową, detoksyzację (cytochrom P450) i śmierć komórkową (cytochrom c).
3.6.4. Absorpcja i fluorescencja krwi
Procesy absorpcyjne odgrywają istotną rolę w fotomedycynie. Najbardziej
absorbujące molekuły w tkankach ssaków to oksy- oraz deoksy hemoglobina, melanina,
mioglobina oraz woda. Na rys. 3.11. przedstawiono widmo absorpcyjne dla tych
cząstek. W obrębie długości fali od 600 nm do 1000 nm widoczny jest wyraźny spadek
absorpcji – jest to tzw. „okno terapeutyczne”. Wnikanie w głąb tkanki w tym obszarze
jest duŜe [5].
39
Rys. 3. 11. Absorbenty w tkankach biologicznych z zaznaczonym „oknem
terapeutycznym” [wg. 35].
Prawie wszystkie wyŜej wymienione tkanki biologiczne wykazują fluorescencję,
jeśli wzbudzi się je odpowiednim światłem dopasowanym do pasma absorpcyjnego,
zazwyczaj z zakresu UV czy teŜ z zakresu światła widzialnego.
Fluorescencja jest obserwowana w aminokwasach: fenyloalaninie, tyrozynie,
tryptofanie, proteinach: kolagenie oraz elastynie, witaminach: B2 i B6 a takŜe
porfirynach: hematoporfirynach (HpD) i protoporfirynach IX [5].
Rys. 3. 12. Widmo absorbcji i flurescencji PPIX [wg. 5].
Hematoporfiryna (HpD) ma maksimum absorpcji na długości 405 nm,
a najintensywniejszy pik emisyjny obserwuje się na długości 610 nm [5].
NajwaŜniejszą porfiryną występującą u ssaków jest hem. Wszystkie porfiryny, których
budowa jest oparta na kształcie cząsteczki hemu, cechują się maksimum absorpcyjnym
40
przy 400 nm i silną fluorescencją w okolicach 635 nm, zaleŜną od otoczenia cząsteczki
i pH środowiska. Hem stanowi elementarną część hemoglobiny – charakteryzującą się
fluorescencją. Białko to, będące barwnikiem zawierającym Ŝelazo w swej strukturze
obecne jest we krwi. Cechuje się wysoką absorpcją w zakresie światła widzialnego. Jest
to najsilniej absorbująca tkanka u człowieka, aczkolwiek jej stęŜenie jest róŜne
w obrębie ciała i w niektórych rejonach jest bardzo małe [5,36].
Wiązanie tlenu przez hemoglobinę wiąŜe się ze zmianami strukturalnymi i kształtem
cząsteczki,
a
jednocześnie
wpływa
na
róŜnice
w
pasmach
absorpcyjnych
oksyhemoglobiny (HbO2) i deoksyhemoglobiny (Hb) [36]. Te róŜnice mogą być
wykorzystywane przy badaniu nasycenia tlenem.
Oksyhemoglobina wykazuje największą absorpcję przy 414 nm i słabszą przy
542 i 577 nm. W deoksyhemglobinie pasmo absorpcyjne jest przesunięte o około 30 nm
i wynosi 433 nm oraz słabsze na 556
nm. Nie występuje drugi słaby pik jak
w oksyhemoglobinie, natomiast pojawia się inny na długości 760 nm [5,36].
Rys. 3. 13. Widmo absorpcyjne oksy- i deoksy- hemoglobiny [wg. 37].
Zmianom nowotworowym często towarzyszą zmiany natury hematologicznej.
Często występuje niedobór jednego lub kilku elementów morfotycznych krwi [38].
Okazuje się, iŜ szybki proces namnaŜania komórek nowotworowych wpływa na
zmniejszenie się ilości tlenu w obszarach patologicznych a zarazem powstania
środowiska kwasowego wskutek wytwarzania kwasu mlekowego.
Komórki krwi obiegają cały ustrój organizmu, więc mają styczność z wszystkimi
obszarami ciała, zarówno zdrowymi jak i chorymi. Aktualnie prowadzone badania
41
wskazują, iŜ moŜliwe jest badanie zmian nowotworowych na podstawie fluorescencji
krwi pełnej jak i odpowiednio spreparowanej [32]. Często stosuje się preparatykę
polegającą na maskowaniu jonów Ŝelaza z hemu poprzez działanie odpowiednimi
substancjami (np. EDTA, aceton) [35,39]. Badania fluorescencji prowadzi się
oświetlając próbki długościami fali z zakresu pasma Soreta, najczęściej są to długości
376 nm, 400, 405 nm , 417 nm, 457 nm [32,39,40]. Niektóre pomiary sugerują
podobieństwo fluorescencji krwi z farmakologicznym środkiem Photofrin II® [32].
W niektórych pracach zwrócono uwagę na moŜliwość wpływu światła wzbudzającego
na uwalnianie z erytrocytów PPIX, która (protoporfiryna IX) posiada najsilniejsze
pasmo absorpcyjne w okolicach 405 nm [41].
42
4. Źródła światła
Właściwości lecznicze światła są znane od wieków. Początkowe metody
fotomedycyny związane były wyłącznie ze światłem słonecznym, które w duŜym
przybliŜeniu moŜna traktować jako ciało idealnie czarne. Wprowadzenie technik
laserowych, światłowodów i generalnie sztucznie otrzymywanego światła pozwoliło na
rozwój PDT i PDD. Lasery bardzo szybko znalazły zastosowanie w medycynie [6,7,26].
Rozpowszechnione szeroko są równieŜ lampy z filtrami wydzielającymi odpowiedni
obszar spektralny [23,26].
4.1. Znaczenie światła
W terapii i diagnostyce fotodynamicznej stosuje się sztucznie wytworzone
światło. Do oświetlania duŜych powierzchni stosuje się zazwyczaj niekoherentne źródła
jak np. lampy z filtrami. W innych przypadkach wykorzystuje się światło spójne
np. laserowe, które przy zastosowaniu światłowodu moŜna wprowadzić do jam ciała
[4,26]. Celem niniejszej pracy jest zwrócenie uwagi na nieco mniej popularny rodzaj
oświetlacza – diody LED. Są one łatwiej dostępne, producenci oferują szeroką gamę
długości fali. Posiadają one quasi monochromatyczne widmo (ok. 25 nm, nawet
5-10 nm [26]), które moŜna wykorzystać w PDD czy PDT [10]. Światło, które uzyskuje
się z diod LED niestety jest silnie rozbieŜne, co praktycznie uniemoŜliwia pracę
z zastosowaniem światłowodów do leczenia wewnątrz jam ciała.
Efekty, jakie uzyskuje się przy PDT i PDD ściśle zaleŜą od długości fali, która
róŜnie penetruje tkankę (rys. 4.1.). Transmisja w UV wynosi ok. 2 mm, natomiast
w obszarze bliskiej podczerwieni wzrasta do kilkunastu milimetrów [4,9]. Pomimo tak
płytkiej penetracji terapia czy diagnostyka fotodynamiczna w niektórych wypadkach
wydaje się być najkorzystniejsza dla pacjenta. Odsłonięte obszary nie stwarzają
problemu, a inne moŜna oświetlić poprzez dostarczenie światła przez jamy ciała, czy
nawet do wnętrza tkanki światłowodami w igle iniekcyjnej. Stosowanie światła
z zakresu UV w szczególności poniŜej 390 nm nie jest zalecane ze względu na jego
mutagenne właściwości [5].
43
Kolejnym waŜnym problemem jest jednorodność podawanego światła. Tkanki
naleŜy naświetlać równomiernie, aby uzyskany efekt był taki sam w całym leczonym
obszarze.
Rys. 4. 1. Głębokość penetracji tkanki w zaleŜności od długości fali λ. [wg. 4] (po lewej) oraz
transmisja światła przez skórę, dla róŜnych długości fal. [wg. 42] (po prawej).
Rys. 4. 2. Oddziaływanie światła z tkanką [wg. 4-6].
4.2. LED – diody elektroluminescencyjne
Diody elektroluminescencyjne (LED – eng. light-emitting diode) mogą być
z łatwością wykorzystane w PDT jak i PDD (wykonanie takich diod nie jest
skomplikowane, co przekłada się na ich stosunkowo niską cenę). Ponadto bardzo łatwo
moŜne je obsługiwać co dodaje im jeszcze większego znaczenia. KaŜdy LED
zbudowany jest z półprzewodnika, a od jego składu zaleŜy długość emitowanej fali.
44
4.2.1. Półprzewodniki
Rozwiązując równanie Schrödingera z potencjałem periodycznym moŜna
wytłumaczyć strukturę pasmową półprzewodników. W rozwiązaniu otrzymuje się
funkcje Blocha. Rozwiązanie to prowadzi do takiej zaleŜności energii od wektora
falowego, Ŝe moŜna wyróŜnić poziomy energetyczne w strukturze całego kryształu. Są
to pasmo podstawowe (walencyjne), na którym znajdują się elektrony walencyjne
pierwiastków
budujących
półprzewodnik.
Następnie
moŜna
wyróŜnić
pasmo
zabronione – nie mogą w nim się znajdować elektrony, oraz pasmo przewodzenia
w którym elektrony występują jako swobodne nośniki ładunku.
4.2.2. Złącze pn
W przypadku złączenia dwóch półprzewodników róŜnego typu powstaje złącze
pn. W takim złączu poziomy Fermiego wyrównują się, gdy na dane warstwy nie działa
Ŝadne napięcie zewnętrzne. Przejście nośników prądu odbywa się na róŜnych
poziomach energetycznych – wzdłuŜ linii poziomych. W przypadku róŜnych
koncentracji elektronów, po obu stronach złącza na tym samym poziomie, popłynie
prąd dyfuzyjny proporcjonalny do tej róŜnicy koncentracji. Po utworzeniu złącza
z warstw P i N w pierwszej chwili następuje przepływ nadmiaru elektronów ze strefy
N do P oraz nadmiaru dziur ze strefy P do N.
Istnieją dwa sposoby polaryzacji złącza pn: w kierunku przewodzenia oraz
w kierunku zaporowym. W pierwszym przypadku do półprzewodnika typu n podłącza
się napięcie ujemne a do typu p napięcie dodatnie. Powoduje to zwęŜenie się bariery
zaporowej co prowadzi do wzrostu prądu dyfuzyjnego, natomiast prąd unoszenia
nośników mniejszościowych pozostanie bez zmian.
Polaryzację w kierunku zaporowym uzyskuje się poprzez przyłoŜenie napięcia
w odwrotny sposób do opisanego powyŜej. W takim przypadku warstwa zaporowa
zostaje poszerzona i prąd dyfuzyjny nie płynie, natomiast prąd unoszenia jest
znikomy [7,10].
45
4.2.3. Charakterystyka
Znając właściwości polaryzacyjne złącza pn, moŜna omówić budowę diod LED.
Głównym jej elementem jest złącze pn wykonane z półprzewodnika spolaryzowane
w kierunku przewodzenia. W wyniku rekombinacji elektronu z dziurą następuje emisja
kwantu światła. Dobór odpowiednich materiałów półprzewodnika pozwala na
uzyskiwanie róŜnych długości fali w praktycznie całym zakresie widma oraz zakresie
podczerwieni.
Rys. 4. 3. Zdjęcie diody – wyraźnie widoczny obszar aktywny LED.
Wydajność diod elektroluminescencyjnych zwykle jest bardzo dobra i często jest
zbliŜona do 100%. Nie wszystkie fotony wydostają się jednak na zewnątrz struktury
półprzewodnika,
dlatego
mówimy o
wydajności
zewnętrznej,
która
wynika
z konstrukcji LED. Straty wynikają z reabsorpcji (z której wynika powstanie nowej pary
elektron – dziura) i odbicia na granicy ośrodków powietrze i półprzewodnik.
Rys. 4. 4. Od lewej: budowa LED ze zminimalizowaną reabsorpcją; obudowa diody –
minimalizacja strat wskutek odbicia Fresnela i całkowitego wewnętrzego odbicia [wg. 10].
Specjalna konstrukcja diody pozwala na zmniejszenie tych strat. Zmniejszając
drogę fotonów minimalizuje się reabsorpcję. Dokonuje się tego poprzez zmniejszenie
warstwy p, a z faktu, iŜ ruchliwość dziur jest mniejsza aniŜeli elektronów, generacja par
elektron – dziura ma miejsce w obszarze typu p. Wiadomo, Ŝe tzw. straty fresnelowskie
związane ze złym dopasowaniem współczynników załamania róŜnych materiałów
46
diody są duŜe. Spadek wydajności związany z odbiciem rozwiązany jest przez
wykorzystanie dodatkowej warstwy plastyku w postaci kapsułki. Wprowadzony
dodatkowy współczynnik załamania jest zbliŜony do współczynnika przewodników.
Efekt związany z całkowitym wewnętrznym odbiciem jest korygowany poprzez kształt
kopuły. Większość wyemitowanego światła
pada pod kątem mniejszym niŜ kąt
całkowitego wewnętrznego odbicia [7,10].
4.2.4. Właściwości
Diody LED są dobrym i przede wszystkim łatwo dostępnym źródłem
promieniowania quasi monochromatycznego. Mają szerokie zastosowanie w wielu
urządzeniach. Obecne moŜliwości pozwalają na tworzenie diod o wielu barwach, nawet
i światła białego. Są małe, łatwe w uŜyciu, wytrzymałe na zmiany temperatury
i czynniki zewnętrzne. Nie pochłaniają duŜej ilości prądu. Moce, które moŜna z nich
uzyskać nie są być moŜe największe, aczkolwiek moŜna to kompensować poprzez
zastosowanie ich większej liczby. Masowa produkcja LED wpływa na ich atrakcyjną
cenę. Wadą jest niekoherencja ich światła, ale w PDT czy PDD nie odgrywa to
znaczącej roli, tak długo jak nie wymagane jest stosowanie światłowodów. Prace nad
nowymi materiałami do tworzenia diod pozwalają na uzyskanie coraz lepszej
koherencji [7,10,26].
Rys. 4. 5. Schematyczne oznaczenie diody LED (po lewej) oraz zaleŜność mocy diody w funkcji
prądu [wg. 10].
NajwaŜniejsze właściwości:
o długi czas odpowiedzi
o qasi monochromatyczność (~30 nm)
o liniowa zaleŜność mocy od prądu
o moŜliwość produkcji LED o róŜnych długościach fali (zakres widzialny + IR)
47
o atrakcyjna cena
o brak spójności
o łatwe w obsłudze
o nie wymagają „duŜego” zasilania
o odporne na zniszczenia
o długi czas pracy
o potrafią pracować przez wiele lat bez strat na jakości światła [7,10,26]
4.3. Diody laserowe
Dioda
laserowa
w
swej
budowie
przypomina
heterozłączową
diodę
elektroluminescencyjną [10]. RóŜnica pomiędzy nimi wynika ze sposobu powstawania
światła na złączu pn. LED wykorzystuje emisję spontaniczną, natomiast w dioda
laserowych fotony powstają w skutek emisji wymuszonej.
MoŜliwość wykorzystania takich diod jest nieco większa w PDT i PDD, aniŜeli LED.
Światło, które emitują moŜna wprowadzić do światłowodu, a dzięki temu, Ŝe cechują
się zazwyczaj większą mocą moŜna je wykorzystywać przy badaniu słabej
fluorescencji. Wadą jest mniejszy zakres dostępnych długości fali niŜ dla LEDów.
4.3.1. Charakterystyka
Inwersję obsadzeń w diodach laserowych uzyskuje się poprzez duŜą
koncentrację elektronów i dziur w obszarze aktywnym. Takie rozwiązanie techniczne
otrzymuje się poprzez zastosowanie półprzewodnika zdegenerowanego, w którym
domieszkowanie jest bardzo wysokie. Przy zastosowaniu duŜego prądu występuje
nadmiar nośników większościowych w obszarze aktywnym – występuje inwersja
obsadzeń, czyli moŜliwość akcji laserowej.
Praca diody laserowej jest ściśle związana z przyłoŜonym prądem:
o małe prądy – mała inwersja obsadzeń – szerokopasmowa emisja spontaniczna
o prąd graniczny – inwersja obsadzeń większa, dominuje emisja wymuszona
o duŜe prądy – właściwa praca lasera – generacja światła o szerokości linii nie
większej niŜ 3 - 5 nm
48
Rys. 4. 6. Dioda krawędziowa [wg. 10].
Dioda laserowa w swej budowie przypomina diodę krawędziową (o podwójnej
strukturze heterozłączowej). Wnęka rezonansowa uzyskana jest z wypolerowanych
końców diody, działających jak zwierciadła. Dzięki całkowitemu wewnętrznemu
odbiciu w warstwie aktywnej uzyskuje się akcję laserową.
Wiązka wyjściowa nie jest dobrze skolimowana (80 x 150) lecz jest to lepsza
kolimacja aniŜeli w przypadku diody elektroluminescencyjnej [7,10,26].
4.5. Porównanie LED z diodami laserowymi
Znaczącą cechą diod elektroluminescencyjnych (LED) jest przede wszystkim
cena, która jest niŜsza o około 10 - 100 razy aniŜeli diody laserowej (czasami jeszcze
niŜsza w zaleŜności od długości fali). Kolejną waŜną cechą jest fakt, iŜ LEDy moŜna
zakupić z praktycznie dowolną długością fali, w przeciwieństwie do diod laserowych.
Są małe, nie niszczą się łatwo, są teŜ wytrzymałe na zmiany temperatury,
wilgotność etc. Charakteryzuje je teŜ łatwa moŜliwość wymiany i budowania układu jak
i zasilania. Oczywiście moce w przypadku diod laserowych mogą być wyŜsze choć to
nie jest regułą. LEDy nie posiadają tak dobrej monochromatyczności jak diody
laserowe – aczkolwiek dobre LEDy mają szerokość spektralną ok. 20 – 30 nm co
w większości przypadków jest zadowalające. LEDy nie mają „dobrej” wiązki jeŜeli
potrzebna
jest
kolimacja
czy
zastosowanie
koherencja) [6,7,10,26,43].
49
światłowodów
(zła
Tab. 3. Zestawienie cech diod elektroluminescencyjnych i laserowych.
LED
dioda laserowa
o
duŜy zakres długości fali
o
10-cio krotnie droŜsze (lub więcej)
o
tanie
o
mały wybór długości fali
o
wytrzymałość na warunki zewnętrzne
o
moŜliwość wykorzystania
o
łatwość instalacji i zasilania (baterie)
o
moce rzędu 10 -150 mW [26]
o
czasami większa moc
o
słaba monochromatyczność (10-30 nm)
o
lepsza koherencja i
światłowodów
[26]
monochromatyczność
o
zła koherencja
o
większa moc
o
moŜliwość budowania układów (tanich)
o
wymaga bardziej złoŜonych układów
o
szeroka wiązka odpowiednia do
o
większy pobór mocy
naświetlania duŜych obszarów
4.6. Diody elektroluminescencyjne 405 nm
Najsilniejsze pasma absorpcyjne większości fotouczulaczy, o budowie opartej na
budowie hemu, występują w okolicach 400 nm, czyli w obszarze pasma Soreta.
Pochodne hematorfiryny, czy PPIX, posiadają najsilniejsze pasmo na długości 405 nm.
Do badań nad fluorescencją najlepiej nadaje się ten zakres światła, pomimo, Ŝe
penetruje tkanki na bardzo niewielkie głębokości, ale luminescencja po wzbudzeniu tym
światłem jest najsilniejsza. Do PDD moŜna wykorzystać diody elektroluminescencyjne.
Pomiary wykonano przy uŜyciu diody LED model RLU405-9-30 firmy Roithner. Jest
to dioda emitująca światło z zakresu ultrafioletu. Jej obszar aktywny oparty jest na
GaN [43]. PoniŜej przedstawiono charakterystykę tej diody. Wszystkie pomiary
wykonywano przy zasilaniu 30 mA i 4 V.
4.6.1. Widmo diody
Przy uŜyciu spektrometru zbudowanego z przestrajalnej siatki dyfrakcyjnej
MONOCHROMATOR DK480 1/2m firmy Spectral Products oraz kamery CCD -
50
SPECTRA VIDEO CAMERA zmierzono widmo diody LED. Następnie dopasowano
funkcję Gaussa do otrzymanego widma.
6000
5000
Model: Gauss
NatęŜenie [j.u.]
Chi^2/DoF
= 19796.51457
R^2
= 0.98228
4000
y0 =
xc =
w=
A=
1200.61 ± 3.21
403.43 ± 0.02
11.09 ± 0.04
51815 ± 174
3000
2000
1000
360
380
400
420
440
Długość fali λ [nm]
Rys. 4. 7. Widmo diody LED405 nm wraz z dopasowaniem funkcji Gaussa.
Parametry dopasowania funkcji Gaussa:
y = y0 +
A
w π /2
−2
( x − xc )2
e
w2
y0 =
1200,61 ± 3,21
xc =
403,43 ± 0,02
w=
11,09 ± 0,04
A=
51815 ± 174
Z dopasowania funkcji Gaussa widać, iŜ maksimum mocy nie przypada na
długość 405 nm a 403 nm (parametr „xc”). Natomiast szerokość połówkowa wynosi ok.
11 nm (parametr „w”). Taka szerokość połówkowa widma diody LED jest idealna do
badań biologicznych, poniewaŜ substancje fotoczułe mają stosunkowo szerokie pasma
absorpcyjne, które mogą się zmieniać w zaleŜności od warunków zewnętrznych.
51
4.6.2. Moc diody
W następnym kroku zmierzono moc diody. Wykorzystano do tego celu miernik
mocy firmy FIELDMASTER * COHERENT model FM. Zmierzono moc pojedynczej
diody (wg. danych producenta ~9 – 12 mW) zgodnie ze schematem przedstawionym na
rys. 4.8. w odległościach od 9 mm do 50 mm.
Rys. 4. 8. Sposób pomiaru mocy diody LED, h – odpowiada odległości pomiędzy miernikiem
a diodą elektroluminescencyjną.
300
250
-2
y = a*x
Moc [µW]
200
Chi^2/DoF
= 202.56987
R^2
= 0.97356
a=
150
23755 ± 651
100
50
0
0
10
20
30
40
50
PołoŜenie [mm]
Rys. 4. 9. Spadek mocy przypadający na powierzchnię 1 mm2 wraz z odległością dla pojedynczej
diody oraz dopasowanie funkcji y=ax-2.
Wyniki przedstawiono na rys. 4.9. Pokazują one, iŜ moc diody w dobrym
przybliŜeniu zmienia się jak funkcja 1/x2, gdzie x oznacza odległość. Takie zachowanie
pozwala przybliŜać diodę elektroluminescencyjną do punktowego źródła światła, które
charakteryzuje się właśnie taką zaleŜnością. Dodatkowo, pomiar ten pozwala na
wyznaczenie dawki mocy stosowanej podczas pomiarów.
52
4.6.3. Jednorodność natęŜenia
W
celu
zmierzenia
jednorodności
natęŜenia
światła
z
diody
elektroluminescencyjnej wykonano serię zdjęć światła padającego na matówkę przy
róŜnych odległościach. Ideę pomiaru przedstawiono schematycznie na rys. 4.11.
PrzyłoŜenie miarki do matówki pozwoliło na przeliczenie wartości pikseli na
rzeczywiste wymiary obrazów. Wszystkie analizowane zdjęcia wykonano aparatem
fotograficznym HP Photosmart 320. Zdjęcia, które otrzymano wymagały obróbki
w innych programach. Aby przedstawić rozkład natęŜenia w jednym kierunku wiązki
np. poziomym, naleŜało uśrednić w pionie wartości pikseli a następnie moŜliwe było
przedstawienie wyników w postaci wykresów. Przeliczenia te moŜliwe są jedynie dla
obrazów przedstawianych w skali szarości. Do obróbki wykorzystano program ImageJ,
który pozwala na scałkowanie obszaru, oraz Origin 7,5 umoŜliwiającego przedstawianie
i kalibracje obrazów.
Rys. 4. 10. Zdjęcie światła pochącego od diody LED padającego na matówkę wykonane aparatem
fotograficznym HP Photosmart 320.
Rys. 4. 11. Schemat przedstawiający pomiary jednorodności padającego światła, odległość
pomiędzy matówką a aparatem fotograficznym (HP Photosmart 320) b = 14 cm.
53
Tab. 4. Wykresy natęŜenia światła padającego na matówkę; odległość a= 0 cm.
Odległość pomiędzy źródłem światła a matówką wynosiła: a= 0 cm. Dioda była
przytknięta do matówki.
NatęŜenie [j.u.]
70
60
Model: Gauss
50
Chi^2/DoF
= 6.1816
R^2
= 0.98159
40
y0 =
xc =
w=
A=
30
5.92061 ± 0.0828
46.88621 ± 0.0332
16.51401 ± 0.07482
1160.08577 ± 5.43432
20
10
0
0
20
40
60
80
100
PołoŜenie [mm]
NatęŜenie – wykres po scałkowaniu obszaru
NatęŜenie – wykres trójwymiarowy.
zdjęcia w kierunku wertykalnym.
Zdjęcie obrazu matówki wraz z wymiarami
NatęŜenie - kontury o takich samych
obszaru.
poziomach jasności
Parametry dopasowania funkcji Gaussa do wykresów natęŜenia dla a=0 cm.
y = y0 +
A
w π /2
−2
( x − xc )2
e
w2
y0 =
5,92 ± 0,08
xc =
46,89 ± 0,03
w=
16,5 ± 0,1
A=
1160 ± 5
54
Tab. 5. Wykresy natęŜenia światła padającego na matówkę; odległość a= 1 cm.
Odległość pomiędzy matówką a źródłem światła (diodą LED) wynosiła a=1 cm.
90
80
Model: Gauss
NatęŜenie [j.u.]
70
Chi^2/DoF
= 5.06364
R^2
= 0.99105
60
50
y0 =
xc =
w=
A=
40
5.75677 ± 0.07656
47.24536 ± 0.02396
17.37039 ± 0.05456
1569.49841 ± 5.15375
30
20
10
0
0
20
40
60
80
100
PołoŜenie [mm]
NatęŜenie – wykres po scałkowaniu obszaru
NatęŜenie – wykres trójwymiarowy.
zdjęcia w kierunku wertykalnym.
Zdjęcie obrazu matówki wraz z wymiarami
NatęŜenie - kontury o takich samych
obszaru.
poziomach jasności
Parametry dopasowania funkcji Gaussa do wykresów natęŜenia dla a=1 cm.
y = y0 +
A
w π /2
−2
( x − xc )2
e
w2
y0 =
5,76 ± 0,08
xc =
47,25 ± 0,02
w=
17,37 ± 0,05
A=
1569 ± 5
55
Tab. 6. Wykresy natęŜenia światła padającego na matówkę; odległość a= 2,5 cm.
Odległość pomiędzy matówką a źródłem światła (diodą LED) wynosiła a=2,5 cm.
100
Model: Gauss
NatęŜenie [j.u.]
80
Chi^2/DoF
= 3.21068
R^2
= 0.9958
60
y0 =
xc =
w=
A=
40
2.71044 ± 0.06134
48.9845 ± 0.01655
17.61008 ± 0.0378
1846.88117 ± 4.15764
20
0
0
20
40
60
80
100
PołoŜenie [mm]
NatęŜenie – wykres po scałkowaniu obszaru
NatęŜenie – wykres trójwymiarowy.
zdjęcia w kierunku wertykalnym.
Zdjęcie obrazu matówki wraz z wymiarami
NatęŜenie - kontury o takich samych
obszaru.
poziomach jasności
Parametry dopasowania funkcji Gaussa do wykresów natęŜenia dla a=2,5 cm.
y = y0 +
A
w π /2
−2
( x − xc )2
e
w2
y0 =
2,71 ± 0,06
xc =
48,98 ± 0,02
w=
17,61 ± 0,04
A=
1846 ± 4
56
Tab. 7. Wykresy natęŜenia światła padającego na matówkę; odległość a= 5 cm.
Odległość pomiędzy matówką a źródłem światła (diodą LED) wynosiła a=5 cm.
100
Model: Gauss
Chi^2/DoF
= 2.40605
R^2
= 0.99793
NatęŜenie [j.u.]
80
y0 =
xc =
w=
A=
60
2.02626 ± 0.05904
43.90682 ± 0.01334
21.30204 ± 0.03217
2639.35082 ± 4.40062
40
20
0
0
20
40
60
80
100
PołoŜenie [mm]
NatęŜenie – wykres po scałkowaniu obszaru
NatęŜenie – wykres trójwymiarowy.
zdjęcia w kierunku wertykalnym.
Zdjęcie obrazu matówki wraz z wymiarami
NatęŜenie - kontury o takich samych
obszaru.
poziomach jasności
Parametry dopasowania funkcji Gaussa do wykresów natęŜenia dla a=5 cm.
y = y0 +
A
w π /2
−2
( x − xc )2
e
w2
y0 =
2,03 ± 0,06
xc =
43,91 ± 0,01
w=
21,30 ± 0,03
A=
2639 ± 4
57
Tab. 8. Wykresy natęŜenia światła padającego na matówkę; odległość a=7,5 cm.
Odległość pomiędzy matówką a źródłem światła (diodą LED) wynosiła a=7,5 cm.
120
Model: Gauss
100
Chi^2/DoF
= 2.02395
R^2
= 0.99857
NatęŜenie [j.u.]
80
y0 =
xc =
w=
A=
60
1.26506 ± 0.06228
46.41871 ± 0.01233
25.17662 ± 0.0322
3364.51529 ± 5.04719
40
20
0
0
20
40
60
80
100
PołoŜenie [mm]
NatęŜenie – wykres po scałkowaniu obszaru
NatęŜenie – wykres trójwymiarowy.
zdjęcia w kierunku wertykalnym.
Zdjęcie obrazu matówki wraz z wymiarami
NatęŜenie - kontury o takich samych
obszaru.
poziomach jasności
Parametry dopasowania funkcji Gaussa do wykresów natęŜenia dla a=7,5 cm.
y = y0 +
A
w π /2
−2
( x − xc )2
e
w2
y0 =
1,27 ± 0,06
xc =
46,42 ± 0,01
w=
25,18 ± 0,03
A=
3364 ± 5
58
W tabelach powyŜej przedstawiono wykresy natęŜenia. Przedstawiono równieŜ
dopasowanie funkcji Gaussa.
Analizując parametry dopasowania moŜna zauwaŜyć
zmianę szerokości połówkowej wraz z odległością pomiędzy źródłem światła
a matówką. ZaleŜność tę przedstawiono na poniŜszym wykresie.
Szerokość połówkowa w [mm]
26
24
22
20
18
16
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
PołoŜenie [cm]
Rys. 4. 12. Wykres zaleŜności szerokości połówkowej od odległości matówka – źródło światła.
Niejednorodności widoczne na wykresach zamieszczonych w tab. 4. oraz 5. nie
przenoszą się na większe odległości. Natomiast szerokości połówkowe zwiększają się
wraz z oddalaniem od źródła, a całość profilu natęŜenia staje się bardziej jednorodna –
co jest widoczne na wykresach trójwymiarowych. NatęŜenie, które obserwowano nie
zaleŜy od kształtu obszaru aktywnego diody LED.
4.7. Urologia – PDD
Przedstawiona
i
scharakteryzowana
w
poprzednim
rozdziale
dioda
elektroluminescencyjna o długości fali ~ 405 nm idealnie nadaje się do diagnostyki
fotodynamicznej. Zastosowanie układu wielu takich diod dałoby moŜliwość
wytworzenia
źródła
światła
równie
silnego
jak
lamp
z
filtrem.
Dobra
monochromatyczność, którą cechują się opisywane diody dałaby lepszy efekt
diagnostyczny niŜ stosowane lampy. Wąskie pasmo absorpcyjne substancji fotoczułych
pochłaniałoby praktycznie całe światło pochodzące z diod. Nie występowałaby potrzeba
odfiltrowywania widma z obszaru nie wpływającego na fluorescencję. Co więcej
59
wąskie widmo otrzymywane z diod lepiej nadaje się do diagnostyki, bowiem
fluorescencja obszarów z fotouczulaczem zaleŜy tylko od ilości energii dopasowanej do
pasma absorpcyjnego, kaŜda inna długość fali nie daje efektu luminescencji więc jest
zwyczajnie tracona lub wywołuje niepoŜądane skutki uboczne – np. nagrzewanie
tkanki. Pozwala to równieŜ na dostarczanie mniejszej dawki energii przy jednoczesnym
otrzymaniu takiego samego efektu diagnostycznego.
PoniŜej przedstawiono zdjęcia z zabiegu elektrokoagulacji, podczas którego stosowano
kwas 5-ALA do fotouczulenia obszarów zmienionych nowotworowo w celu łatwiejszej
ich lokalizacji. Kwas aminolewulinowy fotouczula po okresie 1 godziny, natomiast
pozostaje aktywny w organizmie przez około 8 godzin.
Grupie Prof. Dr Hab. Zygmunta Dobrowolskiego (Katedra Urologii CM UJ),
zajmującej się PDD z wykorzystaniem 5-ALA, zaproponowano wymianę stosowanej
lampy (STORZ D-Light) z filtrem na układ diod LED.
Rys. 4. 13. Zdjęcia z zabiegu usunięcia nowotworu z pęcherza moczowego przeprowadzanego
w Klinice Urologii Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie. Nowotwór o średnicy ok. 2 cm.
Po prawej obszar diagnozowany PDD po podaniu ALA, po lewej widoczny jest sposób usuwania
obszarów nowotworowych w świetle białym (endoskopowa elektrokoagulacja).
4.8. Diody LED 740 nm
Bakteriochloryny i ich pochodne są moŜliwymi do zastosowań w PDT
fotouczulaczami [8]. Grupa badawcza Prof. Dr Hab. GraŜyny Stochel (Zespół Chemii
Koordynacyjnej i Bionieorganicznej) przy Uniwersytecie Jagiellońskim zajmuje się
badaniem i charakteryzowaniem ich właściwości, jak równieŜ modyfikowaniem by
wykazywały jeszcze lepsze właściwości do zastosowań w PDT. Do pomiarów
niezbędne jest zastosowanie źródeł światła dopasowanych do pasm absorpcyjnych.
60
Zaproponowano, jako oświetlacz, matrycę diod LED. Są one idealnym źródłem do
terapii
fotodynamicznej.
Bakteriochloryny,
nad
którymi
prowadzono
badania
wykazywały maksimum absorpcyjne na długości fali λmax ~ 740 nm. Aby uzyskać
najlepszy efekt i móc interpretować wyniki naleŜy dobrze scharakteryzować źródło
światła: długość fali, szerokość połówkową, sposób rozchodzenia się światła a takŜe
jego jednorodność podczas oświetlania. Bakteriochloryny, na których prowadzone są
badania, umieszczane są w specjalnych kuwetach pozwalających na oświetlanie
jednocześnie 96 próbek (rys. 4.14.). Kuweta ta pozwala na umieszczenie po 12 próbek
w 8 rzędach. KaŜdy obszar z pojedynczą próbką zajmuje 37,18 mm2.
Rys. 4. 14. Schemat kuwety stosowanej do badań nad bakteriochlorynami.
Do pomiarów wykorzystano diody ELD-740-524 firmy Roithner. Na stronie
producenta dostępna jest ogólna charakterystyka diod [43]. Są one małe (9 x 5,3 x
6 mm) i lekkie (0,33 g), nie wymagają duŜego zasilania, cechują się mocą 10 mW
[wg. 43] i małym kątem rozchodzenia się wiązki (200). Właściwości te pozwalają na
zbudowanie matrycy diod idealnie oświetlających ww. kuwetę.
Przeprowadzono analizy spektralne, natęŜenia i mocy diod. W niniejszej pracy
nie przedstawiono szczegółowych analiz. Z badań wynika, Ŝe światło pochodzące
z diod LED nadaje się do badań na obiektach, które muszą być względnie jednorodnie
oświetlane mocami ok. 10 mW. Do badań nad bakteriochlorynami przy uŜyciu diod
zaproponowano układ, w którym moŜna by było umieścić tyle samo diod co komórek
kuwety (na rys.4.15. widoczny jest prototyp z czterema diodami).
Rys. 4. 15. Schemat układu do naświetlania kuwety oraz zdjęcie prototypu.
61
5. Aparatura i pomiar fluorescencji krwi
Głównym celem prowadzonych badań było wykonanie urządzenia do pomiaru
fluorescencji krwi, opanowania metodyki i optymalizacji warunków pomiarowych.
Badania te nie były skierowane na rejestrowanie widm róŜnych rodzajów próbek, tylko
na dobranie dogodnych warunków i znalezienie najlepszych rozwiązań technicznych
dotyczących samego procesu pomiarowego. Być moŜe rozwinięcie tej metody pozwoli
na wyznaczenie szerszych i bardziej ogólnych wniosków dotyczących procesów
zachodzących przy wzbudzaniu krwi i dzięki temu na badanie zmian patologicznych we
krwi wzbudzanej światłem z diod, a analizowane widma fluorescencji wyznaczą łatwą
i dogodną metodę diagnostyczną.
5.1. Widmo hemoglobiny – spektrometr SM520-USB
Pomiar słabej fluorescencji krwi po oświetleniu diodą LED o charakterystycznej
długości 405 nm wymaga skonstruowania odpowiednio czułej aparatury pomiarowej.
Zastosowanie spektrometrów o niskiej czułości powoduje, Ŝe widma są nieczytelne
a stosunek sygnału do szumu jest bardzo mały. PoniŜej przedstawiono schemat układu,
z którym mierzono fluorescencję hemoglobiny. Zastosowano spektrometr firmy
Spectral Products SM520-USB. Urządzenie to pozwoliło na zarejestrowanie widma
jedynie w przypadku przedstawionym na schemacie – światło z diody musiało
przechodzić przez kuwetę. Interpretacja tak zmierzonej fluorescencji jest niezmiernie
trudna, wiąŜe się bowiem z procesem absorpcji i rozpraszania światła, w wyniku czego
kształt widma fluorescencji moŜe być znacznie zniekształcony przez te procesy.
62
Rys. 5. 1. Zdjęcie kuwety z krwią po oświetleniu światłem z diody LED 405 nm – widoczna jest
czerwona fluorescencja.
Rys. 5. 2. Schemat pomiaru widm transmisji hemoglobiny przy wykorzystaniu spektrometru
SM520 USB.
24000
22000
NatęŜenie [j.u.]
20000
18000
16000
14000
12000
10000
8000
6000
Widmo hemoglobiny
0
500
1000
1500
2000
Długość fali [px]
Rys. 5. 3. Widmo transmisji hemoglobiny zmierzone na spektrometrze firmy Spektral Products –
model SM520 USB.
Przedstawione powyŜej widmo nie zostało wykalibrowane ze względu na zbyt niską
spektralną czułość spektrometru. W związku z trudnościami w interpretacji
i moŜliwości otrzymania niewiarygodnego widma nie korzystano z tego spektrometru.
W celu dokładnego mierzenia fluorescencji powinno się moŜliwie eliminować procesy
reabsorpcji dlatego teŜ zbudowano w tym celu inny układ pomiarowy.
63
5.2. Aparatura pomiarowa
Najbardziej
czasochłonnym
zajęciem,
podczas
pracy
badawczej,
było
zbudowanie układu wystarczająco czułego, aby był w stanie rejestrować słabe widma
fluorescencji. W celu zmierzenia fluorescencji zbudowano układ pomiarowy zgodny ze
schematem przedstawionym na rysunku 5.4. Fluorescencja, po oświetleniu kuwety
zawierającej krew, diodą LED∗ dostrojoną do pasma absorpcyjnego krwi, jest bardzo
słaba i wymaga silnego skupiania oraz dokładnego doprowadzenia do spektrometru.
W tym celu wykorzystano układ soczewek o duŜej średnicy i krótkich ogniskowych, co
pozwoliło na zebranie duŜej liczby fotonów (rys. 5.4.).
Rys. 5. 4. Schemat układu pomiarowego oraz kalibracyjnego. Zaznaczono obrotowe lusterko
wykorzystywane przy kalibracji lampą ZnHgCd oraz lampą wolframową jak i do skupiania
światła z oświetlanej diodą kuwety.
UŜyty w tym układzie spektrometr jest to zaadoptowany monochromator SP-2
firmy Carl Zeiss zmodyfikowany do funkcji jakie pełni spektrometr. ZaleŜało nam na
rejestracji szerokiego zakresu widma. W tym celu w oryginalnym monochromatorze
wykonano dwie modyfikacje. Pierwsza polegała na usunięciu szczeliny wyjściowej,
∗
RLU405-9-30 firmy Roithner zasilanie: 30 mA i 4 V
64
a następnie
odtworzeniu
obrazu
na
kamerze
CCD
przy
uŜyciu
soczewki
achromatycznej. Brak szczeliny wyjściowej powoduje, Ŝe obraz wydostający się na
zewnątrz obejmuje szeroki zakres widma, a nie – jak w przypadku samego
monochromatora – wąskiego wybranego przedziału długości fal. Drugą modyfikacją
było wprowadzenie do monochromatora pryzmatu. Dzięki temu nie są widoczne piki
z wyŜszych rzędów dyfrakcji (tzw. duchy), które mogłyby zniekształcać widmo,
w przypadku stosowania siatki dyfrakcyjnej. Zastosowano pryzmat kwarcowy –
pozwalający (dzięki małej dyspersji w zakresie VIS) na rejestrację szerszego zakresu
niŜ pryzmat szklany.
Rys. 5. 5. Zdjęcie przedstawiające monochromator SP-2 firmy Carl Zeiss.
W układ pomiarowy wbudowano obrotowe lusterko tak, aby moŜliwe było
wykorzystanie róŜnych lamp w celu kalibracji układu, zachowując takie same drogi
optyczne.
Rys. 5. 6. Zdjęcie układu pomiarowego wykonanego zgodnie z opisanym schematem.
65
5.2.1. Kamera CCD
Światło wychodzące ze spektrometru było odwzorowywane za pomocą
soczewki achromatycznej na kamerze CCD – SPECTRA VIDEO CAMERA.
Matryce CCD (ang. charge coupled devices) są obecnie najczęściej stosowanym
układem do rejestracji obrazów. Zbudowane są z duŜej liczby półprzewodnikowych
elementów fotoczułych oraz elementów bramkujących elektrony wytworzone pod
wpływem padających fotonów. Całość jest sterowana elektronicznie i przesyłana do
innego urządzenia – najczęściej komputera [10,44].
Rys. 5. 7. Program PixelView obsługujący kamerę CCD oraz wykres natęŜenia (po prawej).
Kamera CCD, którą wykorzystywano w czasie pomiarów sterowana jest programem
PixelView, dostarczonym przez firmę Spectra Video wraz z kamerą, który pozwala na
rejestrację obrazów jak i dobór czasu ekspozycji zdjęć.
5.2.2. Dane otrzymywane ze spektrometru
Z programu PixelView otrzymuje się dane w postaci obrazów w formacie „.tif”.
Są to obiekty o wymiarach 1024 na 1024 pikseli wynikające z rozmiarów matrycy
kamery CCD. Program co prawda pozwala na przedstawianie widm w postaci
wykresów, ale nie pozwala na ich eksport. Otrzymane pliki w formacie *.tif wymagają
obróbki w programach obliczających natęŜenie scałkowane w pionie względem całości
(1024 px) lub w określonym obszarze. Na taką analizę pozwala przykładowo program
ImageJ na licencji GNU (General Public License). Tak opracowane obiekty moŜna
zapisać jako pliki tekstowe zawierające w dwóch kolumnach informacje o połoŜeniu
66
w pikselach oraz scałkowanym natęŜeniu w kierunku wertykalnym. Tif’y uzyskane
z oświetlenia kamery CCD posiadają zbyteczną informację o wymiarach.
W celu
usunięcia zbędnych informacji z plików TIF najlepiej przekonwertować je do plików
o rozszerzeniu BMP, które w swej strukturze nie posiadają tzw. „tagów", przenoszących
dodatkową informację o pliku.
Istnieje wiele darmowych oprogramowań dających moŜliwość zamiany pomiędzy
wcześniej wspomnianym formatami na wielu plikach jednocześnie. Sama zamiana nie
jest czasochłonna.
Rys. 5. 8. Fluorescencja krwi – obraz z kamery CCD.
Otrzymane
bitmapy
moŜna
przekształcić
na
widmo.
Uzyskane
pliki
jednocześnie nie są powiązane w Ŝaden sposób z długością fali. Długość fali związana
z kierunkiem horyzontalnym obrazów jest wyraŜana w wartościach pikseli [px]
i wymaga kalibracji aby mogła być wraŜana w nm.
Pliki graficzne prezentujące przestrzenne rozkłady światła wychodzącego ze
spektrometru, wnoszą informację o natęŜeniu światła docierającego do kamery
o odpowiedniej długości fali za pomocą odcieni szarości. Oświetlenie, kaŜdego piksela
jest zapisywana jako wartość z zakresu 0 – 255. NatęŜenia prezentowane w dalszej
części posiadają większe wartości, co wynika z całkowania obszaru w kierunku Y.
5.3. Kalibracja układu pomiarowego
Obrazy otrzymywane na kamerze CCD wymagają dwóch kalibracji:
o
kalibracji długości fali
o
kalibracji natęŜenia
67
PoniŜej przedstawiono schemat wykonania kalibracji (rys. 5.9.). WaŜnym
etapem jest odjęcie „prądu ciemnego” czyli szumu, który powstaje na kamerze CCD
i jest zaleŜny od temperatury, w której pracuje kamera. Nie uwzględnienie tego efektu
zniekształca kształt otrzymywanych widm. Wszystkie kalibracje wykonano po
scałkowaniu w pionie zdjęć z kamery CCD, tak by istniała moŜliwość prezentowania
wyników w postaci wykresów. Kalibracje wykonano przy zastosowaniu układu
pomiarowego przedstawionego na rys. 5.4. W celu kalibracji długości fali uŜyto lampę
ZnHgCd, natomiast do kalibracji natęŜenia widm, czyli czułości kamery w funkcji
długości fali zastosowano lampę z wstęgą wolframową.
Rys. 5. 9. Schemat przedstawiający etapy kalibracji widma fluorescencji.
5.3.1. Kalibracja I – długości fali
Prezentowanie wyników w postaci wykresów wymaga posiadania wiedzy na
temat obszaru obejmowanego przez kamerę CCD. Do tej kalibracji uŜyto lampy
ZnHgCd o znanych charakterystycznych liniach emisyjnych. Zarejestrowano widmo tej
lampy a następnie scałkowano wartości kolumny otrzymane ze zdjęcia i wyrysowano je
dla poszczególnych kolumn. Na koniec naleŜało dopasować do otrzymanych pików
odpowiadające im długości fal [45]. Dopasowane do odpowiednich pików długości fali
przedstawiono na rys. 5.11. a dane zestawiono w tab.9.
68
Rys. 5. 10. Obraz widma lampy ZnHgCd rejestrowany przez kamerę CCD.
N atęŜenie [j.u.]
691
16000
644
14000
5000
708
734
NatęŜenie [j.u.]
12000
82 0
10000
546
50
100
150
200
250
300
350
D ługość fali [n m ]
8000
508
6000
579
4000
577
481
636
2000
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Długość fali [px]
Rys. 5. 11. Wykres przedstawiający charakterystyczne linie dla lampy ZnHgCd mierzone przez
kamerę CCD. W ramce przedstawiono obszar niŜszych długości fali ze słabo widocznymi liniami.
Tab. 9. Punkty dopasowane do charakterystycznych linii lampy ZnHgCd.
PołoŜenie na
Długość
Pierwiastek
kamerze CCD [px]
fali [nm]
983
481,053
Zn
836
508,5822
Cd
680
546,075
Hg
573
577,21
Zn
564
579,067
Hg
408
636,234
Zn
388
643,847
Cd
287
690,752
Hg
252
708,19
Hg
205
734,567
Cd
74
820,0309
Cd
69
Po przypisaniu odpowiednich linii charakterystycznych lampy do punktów
pomiarowych dopasowano funkcję będącą rozwinięciem szeregu Taylora funkcji 1/x,
będącą charakterystyczną cechą dla spektrometrów wyposaŜonych w pryzmat. Na
rysunku 5.12. przedstawiono parametry dopasowania funkcji. Taka kalibracja daje
moŜliwość przedstawiania wykresów
zaleŜności od długości
fali wyraŜonej
w nanometrach.
Parametry dopasowania wielmianu:
2
3
4
5
Y = A + B1*X + B2*X + B3*X + B4*X + B5*X
850
Punkty kalibracyjne
Dopasowanie wielomianu
800
-----------------------------------------------------------A=
878,33167 ± 1,78007
B1 = -0,84401 ± 0,0318
B2 = 7,95087E-4 ± 1,77412E-4
B3 = -5,27452E-7 ± 4,16522E-7
B4 = 2,04843E-10 ± 4,32712E-10
B5 = -2,85181E-14 ± 1,64048E-13
------------------------------------------------------------
Długość fali [nm]
750
700
650
600
R-Square(COD)
SD
N
P
-----------------------------------------------------------0,99999
0,44166
11
<0.0001
------------------------------------------------------------
550
500
450
0
200
400
600
800
1000
Długość fali [px]
Rys. 5. 12. Wykres zaleŜności połoŜenia linii z lampy ZnHgCd mierzonych przez kamere wraz
z dopasowaniem funkcji do odpowiadających im długościom fali.
Do punktów podanych w tabeli 9. dopasowano wielomian:
Y = A + B1*X + B2 *X 2 + B3 *X 3 + B4 *X 4 + B5 *X 5
Parametry dopasowania:
A = 878,09734 ± 6,11828
B1 = -0,83916 ± 0,10928
B2 = 7,66675*10-4 ± 6,09781*10-4
B3 = -4,60461*10-7 ± 1,43163*10-6
B4 = 1,36705*10-10 ± 1,48727*10-9
B5 = -3,55331*10-15 ± 5,63847*10-13
70
5.3.2. Kalibracja czułości kamery CCD
Kolejnym krokiem w procesie kalibracji jest znalezienie czułości kamery CCD.
W tym celu najlepiej uŜyć lampy z włóknem wolframowym o ciągłym i dobrze
scharakteryzowanym widmie. Idea kalibracji polega na zarejestrowaniu obrazu przez
lampę CCD oraz odpowiednim przyrównaniu do jej właściwego kształtu czułości
zaleŜnej od długości fali.
Rys. 5. 13. Zdjęcie z kamery CCD obrazu lampy z włóknem wolframowym.
Czułość kamery jest to charakterystyczna cecha kamer CCD, zaleŜy ona od długości
fali. Zazwyczaj kamery są w stanie rejestrować widmo z zakresu ~300 – 1100 nm,
jednakŜe nie rejestrują świtała o kaŜdej długości fali w takim samym stopniu.
Maksimum czułości przewaŜnie przypada dla 650 nm.
Czułość kamery moŜna wyznaczyć za pomocą wzorów a następnie numerycznie
przekształcać otrzymane obrazy ze znormalizowanym natęŜeniem:
I wolf ( λ ) = Wwolf ( λ ) * CCCD ( λ )
CCCD ( λ ) =
I fluor ( λ ) = W fluor ( λ ) * CCCD ( λ )
W fluor ( λ ) =
 I fluor ( λ ) 
*W
λ
W fluor ( λ ) = 
 I ( λ )  wolf ( )
 wolf

71
I wolf ( λ )
Wwolf ( λ )
I fluor ( λ )
CCCD ( λ )
Gdzie: I odpowiada natęŜeniu zaleŜnemu od długości fali rejestrowanemu przez kamerę
CCD; W odpowiada właściwemu kształtowi natęŜenia od długości fali; C jest
zaleŜnością czułości kamery CCD w funkcji długości fali.
Na rysunku poniŜej przedstawiono kształt widma otrzymanego z lampy
z włóknem wolframowym na kamerze CCD.
180000
160000
NatęŜenie Iwolf(λ) [j.u.]
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
-20000
400
500
600
700
800
900
Długość fali [nm]
Rys. 5. 14. Wykres natęŜenia otrzymany na kamerze CCD z lampy wolframowej firmy OSRAM (po
odjęciu prądu ciemnego).
W celu wyznaczenia kalibracji niezbędna jest informacja o rzeczywistym kształcie
widma lampy niezaleŜnym od czułości kamery. W tym celu wykorzystano wcześniejszą
kalibrację lampy [dr Krzysztof DzierŜęga informacje prywatne]. Warunki pracy lampy
podczas naszych badań były takie same jak podczas tej kalibracji. W tab. 10.
przedstawiono jej parametry.
Tab. 10. Parametry kalibracji lampy z wstęgą wolframową firmy OSRAM [dr Krzysztof DzierŜęga
informacje prywatne].
Długość fali [nm] NatęŜenie [j.u.]
450
46,965
500
89,726
550
135,485
600
180,285
650
221,052
700
255,6
750
285
800
298,32
900
313,09
72
350
Wwolf(λ)
Widmo lampy ze wstęgą wolframową
firmy OSRAM
300
Punkty znane z kalibracji
Dopasownanie wielomianu
NatęŜenie [j.u.]
250
Parametry dopasowania wielomianu:
2
3
4
Y = A + B1*X + B2*X + B3*X + B4*X
200
-----------------------------------------------------------A=
1401,26461 ± 131,52612
B1 = -10,19755 ± 0,90431
B2 = 0,02536 ± 0,00226
B3 = -2,461E-5 ± 2,43803E-6
B4 = 8,36698E-9 ± 9,59582E-10
------------------------------------------------------------
150
100
50
R-Square(COD)
SD
N
P
-----------------------------------------------------------0,99991
1,43578
11
<0.0001
------------------------------------------------------------
0
300
400
500
600
700
800
900
Długość falin [nm]
Rys. 5. 15. Charakterystyka lampy wolframowej firmy OSRAM zastosowanej do kalibracji układu
oraz dopasowanie funkcji. Na podstawie danych z 1990 roku [Tab.10].
Do punktów podanych w tabeli 10. dopasowano wielomian postaci:
Y = A + B1*X + B2 *X 2 + B3 *X 3 + B4 *X 4
A=
1401,26461 ± 131,52612
B1 =
-10,19755 ± 0,90431
B2 =
0,02536 ± 0,00226
B3 =
-2,461*10-5 ± 2,43803*10-6
B4 =
8,36698*10-9 ± 9,59582*10-10
Ostatnim etapem tej kalibracji jest wyznaczenie czułości kamery CCD z zaleŜności:
CCCD ( λ ) =
I wolf ( λ )
Wwolf ( λ )
PowyŜej przedstawiono wszystkie etapy analizy prowadzące do wyznaczenia czułości.
PoniŜej przedstawiono wykres zaleŜności czułości omawianej kamery CCD od długości
fali. Długość fali nie została przekalibrowania do nanometrów. Taki proces pozwala na
73
wprowadzenie wartości krzywej czułości do napisanego programu unikając
niepotrzebnych informacji, które mogłyby (numerycznie) wprowadzać błędy.
800
700
Czułość C(λ) [j.u.]
600
500
400
300
200
100
0
-100
0
200
400
600
800
1000
1200
Długość fali [px]
Rys. 5. 16. Czułość kamery CCD w zaleŜności od długości fali.
Kalibracja wymaga równieŜ odjęcia od rejestrowanych obrazów fluorescencji sygnałów
szumu. W tym celu dopasowano funkcję analityczną do widma szumu. Wielomian,
który otrzymano pozwala na szybką i poprawną analizę wyników. Podobnie jak
i w funkcji dopasowania czułości widmo analizowano w zaleŜności od połoŜenia
wyraŜonego w pikselach.
123000
Parametry dopasowania wielomianu:
2
3
4
5
Y = A + B1*X + B2*X + B3*X + B4*X + B5*X
Dane pomiarowe
Dopasowanie wilomianu
122000
-----------------------------------------------------------A=
121843,86152 ± 54,63307
B1 = -45,15607 ± 1,06194
B2 = 0,14295 ± 0,00635
B3 = -2,49903E-4 ± 1,56262E-5
B4 = 2,29865E-7 ± 1,67509E-8
B5 = -8,22153E-11 ± 6,49196E-12
------------------------------------------------------------
121000
NatęŜenie [j.u.]
120000
119000
118000
117000
R-Square(COD)
SD
N
P
-----------------------------------------------------------0,95695
273,88514
1020 <0.0001
------------------------------------------------------------
116000
115000
114000
0
200
400
600
800
1000
Dlugość fali [px]
Rys. 5. 17. Dopasowanie kształtu do prądu ciemnego.
Wyraźnie widoczne jest, iŜ amplituda prądu ciemnego jest zaleŜna od długości fali.
Centralna część analizowanego obszaru wykazuje niŜsze natęŜenie o ok. 10% aniŜeli
skrajne długości fali. MoŜe to wynikać z warunków otoczenia, w którym prowadzono
74
badania, pomimo wyciemnienia aparatury (praca monitora, zasilaczy, które równieŜ
emitowały światło).
Parametry dopasowania wielomianu postaci:
Y = A + B1*X + B2 *X 2 + B3 *X 3 + B4 *X 4 + B5 *X 5
A=
121843,86152 ± 54,63307
B1 =
-45,15607 ± 1,06194
B2 =
0,14295 ± 0,00635
B3 =
-2,49903*10-4 ± 1,56262*10-5
B4 =
2,29865*10-7 ± 1,67509*10-8
B5 =
-8,22153*10-11 ± 6,49196*10-12
5.3.3. MONOSpectrometr - program do analizy danych
Widma otrzymywane z programu PixelView z zastosowaniem układu
pomiarowego przedstawionego na rys. 5.4. nie dają w łatwy sposób wyników, które
moŜna przedstawić za pomocą wykresów. Wymagane jest całkowanie obszaru obrazów
z kamery w kierunku pionowym, a takŜe dwuetapowa kalibracja omówiona wcześniej.
Kalibracja czułości oraz konieczność odejmowania szumu od sygnałów fluorescencji
powoduje, Ŝe wyznaczanie danych jest czasochłonne. W celu przyspieszenia procesu
obróbki danych napisano program „MONOSpectrometr”, opierający się o dane
otrzymane z kalibracji (przedstawione w poprzednich częściach rozdziału).
Na
rys.
5.18.
przedstawiono
interface
programu
MONOSpectrometr
wykorzystywanego do analizy danych. Program ten daje moŜliwość:
o kalibracji długości fali
o normalizacji natęŜenia uwzględniającego czułość kamery
75
Rys. 5. 18. Interface programu MONOSpectrometr. Program dający moŜliwość wyboru obszaru
całkowania w kierunku pionowym, kalibracji długości fali oraz natęŜenia (uwzględnienie czułości
kamery).
5.4. Fluorescencja krwi
NajwaŜniejszym elementem pracy badawczej było zbudowanie układu
pomiarowego w celu rejestracji widma fluorescencji krwi oraz obserwacji zmian
kształtów widma przy róŜnych warunkach pomiarowych. Kalibracje lampami
wykonano przed rozpoczęciem pomiarów zgodnie z opisem z rozdziału 5.2.
W poniŜszej części układ pomiarowy był zredukowany do postaci przedstawionej na
rys. 5.19, a wyniki przedstawione są juŜ po kalibracji zarówno długości fali jak
i czułości kamery CCD. Przedstawione widma powstały w wyniku całkowania obszaru
zdjęcia z kamery CCD wzdłuŜ kolumn. ZauwaŜono, Ŝe dobór wielkości „okna”
całkowania wpływa na kształt widm (rys.5.18. czerwone linie poziome). W celu
przedstawienia fluorescencji całkowano wszystkie zdjęcia w tym samym obszarze
(250 px), aby wyniki mogły być wzajemnie porównywane.
76
Rys. 5. 19. Schemat układu pomiarowego fluorescencji krwi, F1,2,3 – oznacza soczewki, F4 to
soczewka achromatyczna.
Zmierzono
fluorescencję
dwóch
rodzajów
krwi
otrzymanych
z Uniwersyteckiego Szpitala Dziecięcego w Krakowie:
°
koncentrat krwinek czerwonych grupa 0 Rh(–) napromienioną dawką 25 Gy1
°
koncentrat krwinek czerwonych grupa 0 Rh(+) napromienioną dawką 25 Gy2
Koncentrat krwinek czerwonych, na którym prowadzono badania to krew pełna
po usunięciu większości osocza. Zawiera krwinki czerwone oraz krwinki płytkowe
i leukocyty [38]. Przechowywano je w preparacie antykrzepliwym (CPD wraz z Adsol).
Substancje te pozwalają na przechowywanie krwinek do 42 dni od daty pobrania [46].
Koncentrat krwinek został napromieniowany promieniowaniem jonizującym o dawce
25 Gy. Procedura taka zapobiega potransfuzyjnym odrzutom [38]. Napromieniowany
koncentrat krwinek moŜna stosować u wszystkich osób, a napromieniowanie nie
uszkadza znacząco erytrocytów [38].
Wykresy poniŜej przedstawiają widma fluorescencyjne dla opisanych powyŜej
próbek bez zastosowania rozcieńczalnika. Widma te nie róŜnią się znacząco od siebie.
Ich maksima występują na tych samych długościach fali. Nieznaczne zmiany amplitudy
mogą wynikać z róŜnicy warunków zewnętrznych najprawdopodobniej z róŜnego
poziomu tła od światła rozproszonego na 405 nm.
1
2
Fluorescencję mierzono 61 dni po pobraniu krwi
Fluorescencję mierzono 56 dni po pobraniu krwi
77
10
10
Krew grupy 0 Rh-
Krew grupy 0 Rh+
8
NatęŜenie [j.u.]
NatęŜenie [j.u.]
8
6
4
6
4
2
2
0
450
500
550
600
650
700
750
800
850
0
450
900
Długość fali [nm]
500
550
600
650
700
750
800
850
900
Długość fali [nm]
Rys. 5. 20. Widmo fluorescencji krwi grupy 0
Rh(-).
Rys. 5. 21. Widmo fluorescencji krwi grupy 0
Rh(+).
5.4.1. Wpływ rozcieńczalnika na widmo fluorescencji
Podczas budowy układu pomiarowego i optymalizacji parametrów aparatury
zauwaŜono, Ŝe rozcieńczanie wodą destylowaną silnie wpływa na widma fluorescencji
krwi. Proces ten wydał się bardzo interesujący i w tym kierunku poprowadzono
badania. Zmierzono wpływ rozcieńczalnika na widmo fluorescencji krwi. UŜyto w tym
celu wody destylowanej oraz soli fizjologicznej (firmy BAXTER TERPOL∗).
Fluorescencja krwi ma widoczne silne dwa maksima zarówno dla krwi grupy 0 Rh(-)
jak i 0 Rh(+). W kolejnych częściach rozdziału zwrócono uwagę na ich połoŜenia jak
i amplitudy.
Woda destylowana
Zmierzono wpływ wody destylowanej na widmo fluorescencji krwi. Zmierzono
obie wcześniej wspomniane grupy krwi. Przedstawiono wyniki w sposób zbiorczy, aby
moŜna było od razu zauwaŜyć duŜe róŜnice w kształcie i natęŜeniu.
Krew grupy 0 Rh(-):
∗
Sól fizjologiczna firmy BAXTER TERPOL Sp. z o.o.
Wytwórca: Polfa-Lublin s.a.
Natrium Chloratum 0,9% inj., 9 mg/ml, roztw. do wlewu doŜylnego 500 ml
Skład: Chlorek sodu 9,0 g, Osmolarność płynu wynosi 308 mosmol/l, Woda do wstrzykiwań do 1000,0
ml, 1000 ml roztworu zawiera 154 mmol (154 mEq) Na+ i 154 mmol (154 mEq) Cl
78
Stosunek objętościowy:
KREW:H2O
1:0
2:1
3:1
4:1
5:1
NatęŜenie [j.u.]
8
6
Stosunek objętościowy:
KREW:H2O
4,5
100%
67%
75%
80%
83%
4
2
4,0
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
1:20
3,5
3,0
NatęŜenie [j.u.]
10
2,5
2,0
50%
33%
25%
20%
17%
9%
5%
1,5
1,0
0,5
0
0,0
-2
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
450
500
550
600
650
Długość fali [nm]
Rys. 5. 22. Widmo fluorescencji krwi grupy 0
Rh(–) z H2O przy róŜnych stęŜeniach.
800
850
900
100%
83%
80%
75%
67%
50%
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
1:20
1:1
10
NatęŜenie [j.u.]
3:1
20
Stosunek objętościowy:
KREW:H2O
15
1:0
5:1
4:1
3:1
2:1
1:1
1:1
2:1
NatęŜenie [j.u.]
750
Rys. 5. 23. Widmo fluorescencji krwi grupy 0
Rh(–) z H2O przy róŜnych stęŜeniach.
Stosunek objętościowy:
KREW:H2O
30
700
Długość fali [nm]
4:1
10
33%
25%
20%
17%
9%
5%
50%
5
5:1
0
1:0
0
450
500
550
600
650
700
750
800
850
450
900
500
550
600
650
700
750
800
850
900
Długość fali [nm]
Długość fali [nm]
Rys. 5. 24. Wykres przedstawiający kształ
widma fluorescencji krwigrupy 0 Rh(-) dla
róŜnych stosunków objętościowych krew: H2O.
Rys. 5. 25. Wykres przedstawiający kształ widma
fluorescencji krwigrupy 0 Rh(-) dla róŜnych
stosunków objętościowych krew: H2O.
Krew grupy 0 Rh(+):
Stosunek objętościowy:
KREW:H2O
1:0
2:1
3:1
4:1
5:1
NatęŜenie [j.u.]
8
6
Stosunek objętościowy:
KREW:H2O
4,5
4,0
100%
67%
75%
80%
83%
4
2
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
3,5
3,0
NatęŜenie [j.u.]
10
2,5
2,0
50%
33%
25%
20%
17%
9%
1,5
1,0
0,5
0
0,0
-2
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
450
500
Długość fali [nm]
550
600
650
700
750
800
850
900
Długość fali [nm]
Rys. 5. 26. Widmo fluorescencji krwi grupy 0
Rh(+) z H2O przy róŜnych stęŜeniach.
Rys. 5. 27. Widmo fluorescencji krwi grupy 0
Rh(+) z H2O przy róŜnych stęŜeniach.
Kształt powyŜej przedstawionych widm z
wodą destylowaną jako
rozcieńczalnikiem jest do siebie bardzo zbliŜony dla obu grup krwi. Widoczna jest
79
natomiast zmiana kształtu i natęŜenia dla fluorescencji przy zmianie stęŜenia z wodą.
Woda prawdopodobnie jest wygaszaczem co wpływa na amplitudę i kształt widma.
Szczególnie widoczne jest to w przypadku rozcieńczenia 1:1 gdzie fluorescencja
praktycznie zanika.
Woda destylowana ma równieŜ duŜy wpływ na hemolizę, czyli przechodzenie
hemoglobiny
do
osocza
krwi,
wywołane
zniszczeniem
błony
komórkowej
erytrocytów [47,48]. MoŜliwe, iŜ ten fakt wpływa na kształt widm fluorescencji.
Sól fizjologiczna
PoniŜsze wykresy przedstawiają zestawienie wielu widm fluorescencji krwi
grupy 0 Rh(-) dla róŜnych stęŜeń rozcieńczalnika będącego solą fizjologiczną.
Amplitudy pików nieznacznie się między sobą róŜnią, a ich kształt się zmienia.
Krew grupy 0 Rh(-):
Stosunek objętościowy:
KREW:Sól fizjologiczna
14
12
8
6
4
8
4
2
0
0
500
550
600
650
700
750
800
850
-2
450
900
500
Długość fali [nm]
Rys. 5. 28. Widmo fluorescencji krwi grupy 0
Rh(–) z rozcieńczalnikiem przy róŜnych
stęŜeniach.
50%
33%
25%
20%
17%
9%
6
2
-2
450
1:1
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
10
NatęŜenie [j.u.]
NatęŜenie [j.u.]
12
1:0
2:1
3:1
4:1
5:1
10
Stosunek objętościowy:
KREW:Sól fizjologiczna
14
550
600
650
700
750
800
850
900
Długość fali [nm]
Rys. 5. 29. Widmo fluorescencji krwi grupy 0
Rh(–) z rozcieńczalnikiem przy róŜnych
stęŜeniach.
Na kolejnych rysunkach przedstawiono indywidualne kształty wybranych widm
fluorescencji krwi dla róŜnych stęŜeń rozcieńczalnika.
80
Stosunek objętościowy:
KREW:Sól fizjologiczna
NatęŜenie [j.u.]
1:0
5:1
4:1
3:1
2:1
1:1
1:1
50
2:1
40
3:1
30
20
4:1
10
5:1
100%
83%
80%
75%
67%
50%
1:0
0
450
500
550
600
650
700
750
800
850
Stosunek objętościowy:
KREW:Sól fizjologiczna
60
NatęŜenie [j.u.]
60
50
1:1
40
1:10
30
1:5
20
1:4
10
1:3
0
1:2
450
900
500
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
1:1
550
600
650
700
750
800
850
33%
25%
20%
17%
9%
50%
900
Długość fali [nm]
Długość fali [nm]
Rys. 5. 30. Wykres przedstawiający kształt widma
fluorescencji krwi grupy 0 Rh(-) dla róŜnych
stosunków objętościowych krew : sól fizjologiczna.
Rys. 5. 31. Wykres przedstawiający kształt
widma fluorescencji krwi grupy 0 Rh(-) dla
róŜnych stosunków objętościowych krew : sól
fizjologiczna.
Krew grupy 0 Rh(+):
Analogicznie przedstawiono wyniki dla krwi grupy 0 Rh(+).
8
100%
67%
80%
83%
50%
1:2
1:3
1:4
1:5
1:10
10
6
4
2
8
33%
25%
20%
17%
9%
6
4
2
0
0
-2
-2
450
Stosunek objętościowy:
KREW:Sól fizjologiczna
12
NatęŜenie [j.u.]
1:0
2:1
4:1
5:1
1:1
10
NatęŜenie [j.u.]
14
Stosunek objętościowy:
KREW:Sól fizjologiczna
12
500
550
600
650
700
750
800
850
450
900
Rys. 5. 32. Widmo fluorescencji krwi grupy 0
Rh(+) z rozcieńczalnikiem przy róŜnych
stęŜeniach.
500
550
600
650
700
750
800
850
900
Długość fali [nm]
Długość fali [nm]
Rys. 5. 33. Widmo fluorescencji krwi grupy 0
Rh(+) z rozcieńczalnikiem przy róŜnych
stęŜeniach.
PołoŜenie pików
Analizując widma przedstawione w poprzedniej części moŜna zauwaŜyć, iŜ
moŜna w nich wyróŜnić dwa charakterystyczne maksima, które znajdują się na
podobnych długościach fali. PoniŜej przedstawiono połoŜenia tych pików otrzymane
poprzez dopasowanie dwóch funkcji Gaussa do otrzymanych widm.
81
14
Dopasowanie podwójnej funkcji Gaussa
y=y0 + (A/(w*sqrt(PI/2)))*exp(-2*((x-xc)/w)^2)
12
Chi^2/DoF
= 0.37783
R^2
= 0.97749
NatęŜenie [j.u.]
10
y0
xc1
w1
A1
xc2
w2
A2
8
6
1.49327
633.74159
41.18366
334.61165
693.88435
96.03162
1209.05011
±0.14103
±0.40865
±1.67017
±34.96638
±1.83558
±3.74253
±68.22137
4
2
0
Krew grupy 0 Rh(-)
StęŜenie 50% z solą fizjologiczną (1:1)
-2
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
Długość fali [nm]
Rys. 5. 34. Widmo fluorescencji krwi grupy 0 Rh(-) wraz z dopasowaniem dwóch funkcji Gaussa.
Krew grupy 0 Rh(+)
Krew grupy 0 Rh(-)
Tab. 11. PołoŜenia pików z dopasowania dwóch funkcji Gaussa – stęŜenia krwi z wodą destylowaną
– zestawienie dla obu grup krwi.
StęŜenie z rozcieńczalnikiem
PołoŜenie pierwszego piku PołoŜenie drugiego piku
Krew:woda
[%]
1:20
1:10
1:5
1:4
1:3
1:2
1:1
2:1
3:1
4:1
5:1
1:0
1:10
1:5
1:4
1:3
1:2
1:1
2:1
3:1
4:1
5:1
1:0
5%
9%
17%
20%
25%
33%
50%
67%
75%
80%
83%
100%
9%
17%
20%
25%
33%
50%
67%
75%
80%
83%
100%
624,9
630,8
633,8
632,3
633,7
627,9
622,9
634,3
635,9
635,2
635,3
631,5
629,9
628,7
627,0
628,6
622,7
600,4
608,0
620,1
630,8
635,8
633,8
82
695,2
699,7
717,7
706,9
730,7
701,1
714,9
693,2
695,5
697,4
691,1
693,9
700,7
693,4
711,1
717,7
731,9
722,1
707,8
701,4
700,5
699,4
695,2
740
Rozcieńczalnik : H2O
0 Rh(-)
0 Rh(-)
0 Rh(+)
0 Rh(+)
720
Długość fali [nm]
700
680
PołoŜenie drugiego piku
660
PołoŜenie pierwszego piku
640
620
600
0
20
40
60
80
100
StęŜenie [%]
Rys. 5. 35. Wykres zaleŜności połoŜenia pików od stęŜenia krwi z wodą – zestawienie dla obu grup
krwi.
W kolejnym kroku uśredniono wartości połoŜeń maksimów:
°
Pierwszy pik: 628,0 ± 8,8 nm
°
Drugi pik: 705,2 ± 12,1 nm
Krew grupy 0 Rh(+)
Krew grupy 0 Rh(-)
Tab. 12. PołoŜenia pików z dopasowania dwóch funkcji Gaussa – stęŜenia krwi z solą fizjologiczną
– zestawienie dla obu grup krwi.
StęŜenie z rozcieńczalnikiem
PołoŜenie pierwszego piku PołoŜenie drugiego piku
Krew:sól fizjologiczna [%]
1:10
1:5
1:4
1:3
1:2
1:1
2:1
3:1
4:1
5:1
1:0
1:10
1:5
1:4
1:3
1:2
1:1
2:1
4:1
5:1
1:0
9%
17%
20%
25%
33%
50%
67%
75%
80%
83%
100%
9%
17%
20%
25%
33%
50%
67%
80%
83%
100%
634,1
635,6
635,1
635,4
637,9
636,4
634,6
643,8
636,4
635,8
634,7
630,3
634,7
642,7
634,7
638,0
632,9
632,5
635,8
638,8
633,3
83
683,8
687,3
686,9
685,5
693,1
693,6
687,1
702,5
691,1
690,0
693,6
687,7
693,4
695,9
696,5
698,4
691,8
692,9
698,7
692,7
695,8
Rozcieńczalnik : sól fizjologiczna
0 Rh(-)
0 Rh(-)
0 Rh(+)
0 Rh(+)
700
690
Długość fali [nm]
680
PołoŜenie drugiego piku
670
660
650
PołoŜenie pierwszego piku
640
630
0
20
40
60
80
100
StęŜenie [%]
Rys. 5. 36. Wykres zaleŜności połoŜenia pików od stęŜenia krwi z solą fizjologiczną – zestawienie dla
obu grup krwi.
W kolejnym kroku uśredniono wartości połoŜeń maksimów:
°
Pierwszy pik: 635,9 ± 3,1 nm
°
Drugi pik: 692,3 ± 4,7 nm
Widmo stęŜenia 3:1 z solą fizjologiczną dla krwi grupy 0 Rh(+) wykluczono
z analiz, gdyŜ wynik był zaburzony przez błąd systematyczny. Prawdopodobnie kuweta
była nierównomiernie ustawiona, lub na ściance pojawiły się jakieś zabrudzenia, które
mogły zwiększyć poziom tła od linii wzbudzenia (tzw. „ogon” od źródła światła
405 nm) i mocno zniekształciły kształt widma.
Widoczne jest, Ŝe połoŜenia pików w przypadku rozcieńczania w soli fizjologicznej
pokrywają się w granicy błędu. Występują nieznaczne odchylenia. Natomiast przy
zastosowanie jako rozcieńczalnika wody destylowanej, powoduje większy rozrzut
w połoŜeniach pików. Widać, iŜ połoŜenia dwóch omawianych pików są do siebie
zbliŜone we wszystkich analizowanych widmach. Na niewielkie rozbieŜności moŜe
wpływać dopasowanie dwóch funkcji Gaussa (w programie Origin 7,5), które
w przypadku bardzo słabych widm (jak stęŜenie 1:1 z wodą) mogą nie być dokładne.
Widma otrzymane po rozcieńczeniu z wodą wykazywały mniejsze natęŜenie i były
zniekształcane przez szum. Mogło to równieŜ wpłynąć na niedokładne dopasowania
dwóch funkcji Gaussa.
84
PoniŜej przedstawiono w sposób zbiorczy połoŜenia obu pików dla wszystkich
omawianych widm:
740
PołoŜenie drugiego piku
pierwszy pik (0 Rh(-) -> woda)
drugi pik (0 Rh(-) -> woda)
pierwszy pik (0 Rh(+) -> woda)
drugi pik (0 Rh(+) -> woda)
pierwszy pik (0 Rh(-) -> sól fizj.)
drugi pik (0 Rh(-) -> sól fizj.)
pierwszy pik (0 Rh(+) -> sól fizj.)
drugi pik (0 Rh(+) -> sól fizj.)
720
Długość fali [nm]
700
680
660
640
620
600
PołoŜenie pierwszego piku
0
20
40
60
80
100
StęŜenie [%]
Rys. 5. 37. Wykres zaleŜności połoŜenia pików od stęŜenia krwi z rozcieńczalnikami dla obu grup
krwi.
Widać, iŜ połoŜenia pików dla obu rozcieńczalników pokrywają się (po
uwzględnieniu odchylenia standardowego) z wyjątkiem drugiego piku z H2O.
Dopasowanie dwóch funkcji Gaussa dobrze przewiduje zachowanie się widma
w przypadku gdy widmo składa się z dwóch nachodzących na siebie pików. Jest to
przybliŜenie, które pozwala przybliŜać zachowanie się układu. Widmo fluorescencji
krwi moŜe posiadać większą liczbę nakładających się wzajemnie pików, gdyŜ po
wzbudzeniu moŜe następować sekwencja przejść elektronowo – oscylacyjnych,
generujących dodatkowe składowe widma. Struktura moŜe wynikać z poziomów
oscylacyjnych czy teŜ ich populacji. PrzybliŜenie, które zastosowano pozwala na
uproszczenia i dalsze ilościowe analizy widm.
Z powyŜszych analiz wynika, iŜ widma posiadają charakterystyczne dwa piki.
Pierwsze maksimum przypada na długość ~635 nm dla wszystkich badanych próbek.
Badany koncentrat krwinek czerwonych, zawiera erytrocyty. MoŜliwe jest, iŜ widmo,
które jest obserwowane powstaje w wyniku uzyskiwania silnie fotoczułej substancji
endogennej protoporfiryny IX [41], będącej podstawą budowy hemu a za razem
hemoglobiny (obecnej w erytrocytach). PPIX ma najsilniejszy pik fluorescencji właśnie
w okolicach 635 nm a maksimum absorpcji przypada na długość 405 nm – czyli
85
dokładnie tam, gdzie naszą krew wzbudzaliśmy, stąd przypuszczenie, które musi być
potwierdzone szeregiem szczegółowych badań. MoŜliwe równieŜ, Ŝe inny składnik,
np. stosowany do utrwalania krwi (jak CPD czy Adsol) wpływa np. na maskowanie
jonów Ŝelaza i wpływa znacząco na kształt i połoŜenie maksimów fluorescencji.
Amplitudy pików
Zmiany kształtu widm fluorescencji dla krwi moŜna najlepiej zauwaŜyć poprzez
zestawienie amplitud na charakterystycznych długościach fali. Z dopasowań dwóch
funkcji Gaussa do widm fluorescencji otrzymano połoŜenia dwóch maksimów.
Uśredniono wartości połoŜeń pików i na wyznaczonych długościach fali analizowano
amplitudy. PoniŜej przedstawiono widmo krwi, na którym naniesiono punkty,
w których mierzono amplitudy. Oprócz wcześniej wspomnianych połoŜeń dwóch
maksimów, zmierzono równieŜ amplitudy na „zboczach” pasma fluorescencji krwi jak
i częściach centralnych widm.
Najbardziej interesujące są jednakŜe długości fali (B) 635,9 oraz (C) 692,3 nm.
Otrzymano je z dopasowań dwóch funkcji Gaussa dla pomiarów fluorescencji krwi
w zaleŜności od stęŜenia w soli fizjologicznej. Próby analizy amplitud widm na innych
długościach fali nie dały bardziej regularnych zaleŜności, więc nie przedstawione ich
w niniejszej pracy.
T
10
C
T = 575 nm
E = 605 nm
A = 628 nm
B = 636 nm
F = 665 nm
C = 692 nm
D = 706 nm
G = 740 nm
740 nm
665 nm
G
605 nm
6
Krew grupy 0 Rh(-)
StęŜenie : 100%
D
E
8
NatęŜenie [j.u.]
A B
F
4
450
500
550
600
700
706 nm
636 nm
650
692 nm
0
628 nm
575 nm
2
750
800
850
900
Długość fali [nm]
Rys. 5. 38. Widmo fluorescencji krwi grupy 0 Rh(-) z zaznaczonymi punktami, w których
analizowano amplitudy.
86
Tab. 13. PołoŜenia długości fali, dla których analizowano amplitudy widm.
Oznaczenie: Długość fali
T
575 nm
wartość przyjęta za stały poziom tła
E
605 nm
krótkofalowe zbocze pasma fluorescencji
A
628 nm
B
636 nm
F
665 nm
C
692 nm
D
706 nm
G
740 nm
I PIK
średnia dla rozcieńczania z wodą destylowaną
średnia dla rozcieńczania z solą fizjologiczną
centralna część widma
II PIK
średnia dla rozcieńczania z solą fizjologiczną
średnia dla rozcieńczania z wodą destylowaną
długofalowe zbocze pasma fluorescencji
Amplitudy pików dla obu grup krwi oraz róŜnych rozcieńczalników
przedstawiono w tab. 14 – 17. Zestawiono w nich równieŜ róŜne stosunki amplitud.
Skupiono uwagę na amplitudy na długościach fali (B) 635,9 oraz (C) 692,3 nm. PoniŜej
(rys. 5.39. i 5.40.) przedstawiono stosunki amplitud na wcześniej wspomnianych
długościach fal po odjęciu amplitudy pochodzącej od tła (T) 575 nm zgodnie z wzorem
40
35
30
25
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
-40
-45
-50
0 Rh(-) rozcieńczalnik: woda
0 Rh(+) rozcieńczalnik: woda
0
20
40
60
80
Stosunek amplitud pików (B-C)/(B-T) [%]
Stosunek amplitud pików (B-C)/(B-T) [%]
(B-C)/(B-T).
0 Rh(-) rozcieńczalnik: sól fizjologiczna
0 Rh(+) rozcieńczalnik: sól fizjologiczna
30
20
10
0
-10
0
100
20
40
60
80
100
StęŜenie [%]
StęŜenie [%]
Rys. 5. 39. Stosunki amplitud (B-C)/(B-T) w
zaleŜności od stęŜenia z wodą – zestawienie dla
dwóch grup krwi.
40
Rys. 5. 40. Stosunki amplitud (B-C)/(B-T) w
zaleŜności od stęŜenia z solą fizjologiczną –
zestawienie dla dwóch grup krwi.
W kolejnej części przedstawiono stosunki amplitud (B-T)/(C-T) badanych
widm. Zestawiając z powyŜej przedstawionym sposobem analizy, wydaję się lepszym
zastosowaniem przedstawianie stosunków (B-T)/(C-T), czyli amplitud I do II piku po
odjęciu od nich tła. Wykazują one mniejszy rozrzut, przez co wyraźniej widoczne są
zaleŜności między badanymi próbkami.
87
160
Krew grupy 0 Rh(-) rozcieńczalnik : woda
Krew grupy 0 Rh(+) rozcieńczalnik : woda
140
Stosunek amplitud pików (B-T)/(C-T) [%]
Stosunek amplitud pików (B-T)/(C-T) [%]
150
130
120
110
100
90
80
70
Krew grupy 0 Rh(-) rozcieńczalnik : sól fizjologiczna
Krew grupy 0 Rh(+) rozcieńczalnik : sól fizjologiczna
150
140
130
120
110
100
90
60
0
20
40
60
80
100
0
20
40
Rys. 5. 41. Stosunki amplitud (B-T)/(C-T) w
zaleŜności od stęŜenia z wodą – zestawienie dla
dwóch grup krwi.
80
100
Rys. 5. 42. Stosunki amplitud (B-T)/(C-T) w
zaleŜności od stęŜenia z solą fizjologiczną –
zestawienie dla dwóch grup krwi.
2
3
Y =191,6315-4,10322 X+0,06312 X -3,17097E-4 X
2
3
Y =177,91728-4,26285 X+0,06953 X -3,56062E-4 X
160
Stosunek amplitud pików (B-T)/(C-T) [%]
60
StęŜenie [%]
StęŜenie [%]
150
140
130
0 Rh(-)
120
110
0 Rh(+)
100
90
Rozcieńczalnik : Sól fizjologiczna
0
20
40
60
80
100
StęŜenie [%]
Rys. 5. 43. Stosunki amplitud (B-T)/(C-T) w zaleŜności od stęŜenia z solą fizjologiczną – zestawienie
dla dwóch grup krwi wraz z krzywymi aproksymującymi dane.
Punkty odpowiednich stosunków amplitud w przypadku rozcieńczania z solą
fizjologiczną wykazują pewną róŜnicę względem siebie w zaleŜności od czynnika Rh.
Statystycznie, gdyby wszystkie punkty były wymieszane (wykazywały większy rozrzut)
nie moŜna by było mówić o jakimkolwiek związku (jak w przypadku rozcieńczania
z wodą destylowaną). JednakŜe, w przypadku tak małej ilości próbek nie moŜna
określić błędu pomiarowego, co nie pozwala na jednoznaczną odpowiedź dotyczącą
korelacji z czynnikiem Rh.
PoniŜej (rys. 5.44.) przedstawiono wykres zaleŜności pomiędzy stęŜeniem
a stosunkiem
amplitud
(C-T)/(B-T) wraz
88
z
aproksymowanymi
wielomianami
przybliŜającymi tą zaleŜność. Widać charakterystyczną zbieŜność do punktów
odpowiadającym maksymalne i minimalne stęŜenie krwi.
2
Stosunek amplitud pików (B-T)/(C-T) [%]
3
Y =185,13328-4,22345 X+0,06745 X -3,44241E-4 X
2
3
Y =166,90774-3,75301 X+0,04735 X -1,71454E-4 X
160
150
140
130
120
110
sól fizjologiczna
100
90
80
70
woda destylowana
60
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
StęŜenie [%]
Rys. 5. 44. Stosunki amplitud (B-T)/(C-T) w zaleŜności od stęŜenia z wodą destylowaną oraz solą
fizjologiczną – zestawienie dla dwóch grup krwi wraz z krzywymi aproksymującymi dane.
Na wykresach widoczne jest, iŜ wraz ze wzrostem stęŜenia (krwi
w rozcieńczalniku), stosunki amplitud zbiegają się do punktu odpowiadającemu nie
rozcieńczonej krwi (100%). Podobnie jest w przypadku zwiększania ilości
rozcieńczalnika, im mniejsze stęŜenie krwi, tym bardziej stosunki amplitud zbiegają się
do jednego punku odpowiadającemu widmu samego rozcieńczalnika (który nie
wykazuje fluorescencji). Wyraźnie widoczne jest, iŜ woda destylowana inaczej
oddziałuje z krwią aniŜeli sól fizjologiczna. Wyraźna róŜnica pomiędzy widmami od
tych rozcieńczalników jest bardzo interesująca i wymaga dalszych badań, które określą
jakie procesy są za nie odpowiedzialne.
Widma fluorescencji krwi, które przedstawiono w poprzednich częściach są
trudne do interpretacji, dlatego zaproponowano analizę amplitud na pewnych
charakterystycznych długościach fali. SłuŜyło to poprawieniu „kontrastu” w wynikach
i jak moŜna zauwaŜyć z przedstawionych wykresów, wykazują większą regularność i są
mniej podatne na szumy widoczne na samych widmach.
Przedstawione powyŜej analizy wydają się być poprawne, ale brak odniesień
w literaturze, powoduje, iŜ wiąŜą się z tym wielkie trudności. Nie ma „standardów”,
które pozwoliłyby na jednoznaczny sposób analiz. Brakuje równieŜ odniesień do
89
porównania samego kształtu widm. Literatura związana z fluorescencją krwi jest bardzo
uboga, a co się z tym wiąŜe, sposób pomiaru i przedstawiania wyników (np. badanie
połoŜeń pików, czy amplitud) nie jest ściśle określony. Dopiero rozszerzone pomiary
widm fluorescencji uwzględniające szereg kombinacji róŜnorodnych próbek jak
i rozcieńczalników być moŜe pozwoli wyznaczyć najłatwiejszą i najbardziej dogodną
metodę analiz. Niniejsza praca przedstawia jedna z wielu moŜliwości reprezentacji
pomiaru widm fluorescencji, aczkolwiek najwaŜniejszym elementem niniejszej pracy
było znalezienie sposobu rejestracji widm.
5.4.2. Wzbudzenie laserem o długości fali 415 nm
Oksyhemoglobina, która występuje we krwi wykazuje największą absorpcję
przy 414 nm [37], jednakŜe pomimo zastosowania światła laserowego o długości
415 nm nie obserwowano fluorescencji. Pasmo absorpcyjne oksyhemoglobiny na
414 nm nie jest bardzo wąskie, więc przy wzbudzaniu 415 nm proces absorpcji mógł
zajść. Doświadczenie pokazuje, Ŝe dana próbka nie fluoryzuje. MoŜliwe, jednak, Ŝe
badana próbka nie posiadała oksyhemoglobiny albo jej stęŜenie było zbyt niskie, aby
obserwować jakiekolwiek efekty. MoŜliwe jest równieŜ, iŜ aparatura pomiarowa nie
była wystarczająco czuła. Schemat pomiarowy przedstawiono na rys. 5.45.
Rys. 5. 45. Schemat oświetlania krwi za pomocą lasera o długości fali 415 nm. Nie obserwowano
fluorescencji.
90
StęŜenie z
rozcieńczalnikiem
Krew : rozcieńczalnik
[%]
1:10
9%
1:5
17%
1:4
20%
1:3
25%
1:2
33%
1:1
50%
2:1
67%
3:1
75%
4:1
80%
5:1
83%
1:0
100%
T
575,0
nm
1,2
1,1
0,1
0,3
1,4
1,2
1,1
1,0
0,2
1,2
1,1
E
605,0
nm
2,6
1,9
1,8
1,8
1,9
1,5
1,4
1,5
1,7
1,9
4,1
A
628,0
nm
3,5
2,5
2,4
2,2
2,1
1,7
1,7
2,0
2,6
3,2
7,5
B
635,9
nm
3,7
2,6
2,5
2,3
2,2
1,7
1,8
2,3
3,0
3,6
8,2
F
665,0
nm
3,4
2,6
2,5
2,4
2,6
1,8
1,9
2,4
3,4
4,1
8,6
C
692,3
nm
3,0
2,6
2,5
2,5
2,1
1,9
2,1
2,8
3,8
4,6
8,9
D
705,7
nm
2,8
2,5
2,5
2,5
2,2
2,0
2,1
2,8
3,9
4,7
8,7
G
740,0
nm
2,0
1,0
2,0
2,1
1,9
1,8
1,8
2,2
3,0
3,5
5,9
144%
99%
96%
86%
86%
59%
58%
52%
66%
58%
85%
140%
102%
100%
91%
106%
74%
69%
74%
78%
71%
91%
28,4%
2,0%
-0,4%
-9,9%
5,3%
-36,0%
-45,6%
-35,4%
-28,0%
-40,7%
-9,9%
(B-C)/(B-T)
32,5%
29,1%
23,9%
5,1%
1,5%
-11,8%
-32,2%
-24,4%
-18,6%
-15,5%
-1,6%
-3,8%
158%
143%
134%
105%
101%
78%
54%
75%
72%
75%
94%
89%
(A-T)/(D-T)
(B-C)/(B-T)
(A-T)/(D-T)
(B-T)/(C-T)
T
E
A
B
F
C
D
StęŜenie z
G
575,0 605,0 628,0 635,9 665,0 692,3 705,7 740,0 (B-T)/(C-T)
rozcieńczalnikiem
nm
nm
nm
nm
nm
nm
nm
nm
Krew : rozcieńczalnik
[%]
1:20
5%
1,2
2,7
3,3
3,2
2,9
2,6
2,5
1,9
148%
1:10
9%
1,3
2,8
3,7
3,8
3,5
3,1
3,0
2,3
141%
1:5
17%
1,5
2,7
3,5
3,6
3,5
3,1
3,0
2,4
131%
1:4
20%
1,3
2,1
2,6
2,7
2,7
2,6
2,5
2,1
105%
1:3
25%
1,4
2,1
2,6
2,7
2,7
2,7
2,6
2,1
102%
1:2
33%
1,4
2,0
2,3
2,4
2,5
2,5
2,5
2,2
89%
1:1
50%
1,4
1,7
1,9
2,0
2,1
2,2
2,3
2,1
76%
2:1
67%
1,4
2,2
3,2
3,4
3,7
3,9
3,8
2,9
80%
3:1
75%
1,6
2,7
4,4
5,0
5,4
5,6
5,6
4,1
84%
4:1
80%
1,7
3,1
5,1
5,7
6,1
6,3
6,3
4,6
87%
5:1
83%
1,0
3,8
7,8
8,7
9,1
8,8
8,2
5,2
98%
1:0
100%
0,3
4,1
8,2
9,1
9,3
9,4
9,2
6,2
96%
Tab. 14. Zestawienie amplitud fluorescencji na róŜnych długościach fali dla krwi grupy 0 Rh(-) dla róŜnych stęŜeń z H2O.
Tab. 15. Zestawienie amplitud fluorescencji na róŜnych długościach fali dla krwi grupy 0 Rh(-) dla róŜnych stęŜeń z H2O.
Krew grupy 0 Rh(-)
Rozcieńczalnik : H2O
Krew grupy 0 Rh(+)
Rozcieńczalnik : H2O
StęŜenie z
rozcieńczalnikiem
Krew : rozcieńczalnik
[%]
1:10
9%
1:5
17%
1:4
20%
1:3
25%
1:2
33%
1:1
50%
2:1
67%
4:1
80%
5:1
83%
1:0
100%
T
575,0
nm
1,1
0,9
1,6
0,5
1,1
1,2
1,5
1,2
1,5
1,2
E
605,0
nm
5,7
7,0
6,3
4,5
4,5
5,1
4,9
4,0
5,7
3,9
A
628,0
nm
8,7
11,7
11,0
8,5
8,6
9,6
8,8
7,3
10,4
7,5
92
B
635,9
nm
9,0
12,3
11,6
9,2
9,3
10,4
9,5
8,0
11,8
8,1
F
665,0
nm
8,0
11,7
11,3
9,3
9,6
10,6
9,8
8,5
11,5
8,7
C
692,3
nm
6,6
9,9
10,1
8,8
9,4
10,5
9,8
8,7
11,1
8,8
D
705,7
nm
6,0
8,9
9,5
8,3
9,2
10,0
9,5
8,5
10,6
8,7
G
740,0
nm
6,8
5,5
6,3
5,5
6,1
6,6
6,2
6,7
7,0
5,8
(A-T)/(D-T)
153%
135%
120%
103%
93%
95%
91%
84%
98%
85%
(B-T)/(C-T)
145%
127%
117%
105%
99%
99%
97%
90%
107%
91%
T
StęŜenie z
E
A
B
F
C
D
G
575,0 605,0 628,0 635,9 665,0 692,3 705,7 740,0 (B-T)/(C-T)
rozcieńczalnikiem
(A-T)/(D-T)
nm
nm
nm
nm
nm
nm
nm
nm
Krew : rozcieńczalnik
[%]
1:10
9%
1,4
6,4
9,0
9,2
7,9
6,3
5,7
3,5
159%
176%
1:5
17%
1,5
7,3
11,8
12,2
11,1
9,2
8,4
5,2
139%
150%
1:4
20%
1,3
7,2
12,2
12,7
11,9
10,0
9,2
5,6
132%
138%
1:3
25%
1,3
6,3
10,7
11,4
10,7
9,3
8,5
5,0
126%
131%
1:2
33%
1,4
6,3
11,7
12,4
12,2
11,3
10,6
6,8
111%
112%
1:1
50%
1,3
6,3
11,5
12,3
12,4
11,8
11,2
7,3
105%
103%
2:1
67%
1,3
5,6
10,0
10,7
10,7
10,2
9,6
5,9
107%
104%
3:1
75%
1,3
5,5
10,4
11,2
11,6
11,2
10,7
7,3
100%
97%
4:1
80%
1,4
6,4
12,0
12,7
12,8
12,1
11,4
7,3
106%
106%
5:1
83%
1,3
6,6
12,1
13,0
12,9
12,2
11,5
7,2
107%
106%
1:0
100%
0,8
4,1
8,3
9,1
9,3
9,5
9,2
6,2
95%
90%
Tab. 17. Zestawienie amplitud fluorescencji na róŜnych długościach fali dla krwi grupy 0 Rh(+) dla róŜnych stęŜeń z solą fizjologiczną.
Tab. 16. Zestawienie amplitud fluorescencji na róŜnych długościach fali dla krwi grupy 0 Rh(-) dla róŜnych stęŜeń z solą fizjologiczną.
Krew grupy 0 Rh(-)
Rozcieńczalnik : sól
fizjologiczna
Krew grupy 0 Rh(+)
Rozcieńczalnik : sól
fizjologiczna
30,8%
21,2%
14,7%
5,0%
-0,8%
-1,1%
-3,4%
-10,9%
6,7%
-10,2%
(B-C)/(B-T)
37,3%
27,8%
24,2%
20,8%
10,2%
4,9%
6,2%
0,3%
5,5%
6,9%
-5,4%
(B-C)/(B-T)
6. Podsumowanie
NajwaŜniejszą częścią pracy zawartej w tym opracowaniu było zbudowanie
układu pomiarowego, który pozwoliłby na rejestracje widm fluorescencji krwi
i znalezieniu odpowiednich parametrów pomiarowych, tak by moŜna było w dalszym
etapie prowadzić ilościowe badania w tej niezbyt jeszcze popularnej tematyce. Testem
poprawności aparatury było zmierzenie widm fluorescencji krwi przy wykorzystaniu
dwóch prostych i łatwo dostępnych rozcieńczalników – wody destylowanej
(„niszczącej” widma”) oraz soli fizjologicznej (nie wpływającej tak destruktywnie na
widma fluorescencji). Trudno sprecyzować, jaki wpływ mają te substancje na
zachowanie się molekuł, ale uzyskane wyniki wykazują wyraźne zaleŜności od
stosowanych rozcieńczalników.
6.2. Wyniki i wnioski
Dzięki zastosowaniu bardziej czułej aparatury udało się zarejestrować słabe
widmo fluorescencji krwi. Wiązało się to jednakŜe z dodatkowymi trudnościami –
wymagało zarówno kalibracji spektralnej jak i wyznaczenia czułości kamery CCD
w zaleŜności od długości fali. Natomiast zastosowanie diod LED do badań wymagało
ich wcześniejszego scharakteryzowania, zbadania pasma, w którym emitują światło,
a takŜe rozkładu mocy jak i natęŜenia w zaleŜności od odległości. Następnie
przeanalizowano dwie grupy krwi 0 Rh(-) oraz 0 Rh(+). Badano wpływ
rozcieńczalników (wody destylowanej i soli fizjologicznej) przy róŜnych stęŜeniach na
widma fluorescencji. ZauwaŜono ich duŜy wpływ na kształt widm, w których moŜna
obserwować dwa charakterystyczne maksima połoŜone w paśmie Q na długościach fali
~635 nm i
~692 nm. Zbadano równieŜ amplitudy na wcześniej wspomnianych
długościach fali i zestawiono je dla wszystkich badanych próbek. Przedstawiono
analizę, która wydawała się być najlepsza. Brak odniesień w literaturze, powoduje, iŜ
badania oraz interpretacje są bardzo trudne, a odpowiedź na pytanie, jakie elementy
badanej próbki krwi fluoryzują, jest praktycznie niemoŜliwe. Wymaga to dalszych
bardzo szerokich i szczegółowych badań. Analiza, którą przedstawiono, wydaje się być
słuszna, aczkolwiek dopiero rozszerzone badania, uwzględniające większą i bardziej
róŜnorodną ilość próbek być moŜe pozwoli na precyzyjniejszą analizę, a za razem
zaowocuje łatwym w obsłudze narzędziem diagnostycznym.
6.3. Ulepszenie aparatury
Najtrudniejszym elementem pracy przedstawionej w pracy było zbudowanie
układu pomiarowego. Podczas licznych modyfikacji dobierano coraz to lepsze warunki
pracy, w których otrzymywano widma fluorescencji krwi. W trakcie prowadzenia badań
zauwaŜono, iŜ w układzie pomiarowym naleŜy wprowadzić kilka ulepszeń, które
pozwoliłyby na dokładniejsze prowadzenie pomiarów. W pierwszej kolejności naleŜy
bardziej ustabilizować uchwyt utrzymujący kuwetę, w taki sposób, aby nawet
w minimalnym stopniu nie zmieniało się jej połoŜenie. WaŜne jest równieŜ jeszcze
dokładniejsze wyciemnienie aparatury. Przypuszczalnie nawet najmniejsze zabrudzenia
kuwety mogą negatywnie wpływać na kształt widm, na co naleŜy zwrócić szczególną
uwagę, a co wiąŜe się z potrzebą przygotowywania próbek w pomieszczeniu (albo jego
najbliŜszym sąsiedztwie) w którym wykonywane są pomiary. Wyeliminuje to
zabrudzenia, które mogą powstawać podczas przenoszenia kuwet z krwią.
6.4. Dalsze plany
Literatura związana z fluorescencją krwi jest bardzo uboga, w związku z tym
powstaje wiele moŜliwości jak i nasuwa się wiele pytań dotyczących zjawiska
fluorescencji krwi. Badania takie mogą mieć szerokie zastosowanie w PDD.
NajwaŜniejszym elementem jest zwiększenie i rozszerzenie badań dotyczących
pomiaru fluorescencji krwi. Zwiększenie ilości próbek pozwoli na uzyskanie lepszej
statystyki, a wyniki będą bardziej wiarygodne i będzie moŜna wywnioskować
o charakterze fluorescencji, a takŜe moŜliwościach zastosowań diagnostycznych.
W ciągu najbliŜszych badań naleŜałoby zbadać zmiany fluorescencji krwi
w zaleŜności od róŜnych grup krwi, sprawdzić wyniki fluorescencji krwi osób z anemią,
94
z róŜnymi zmianami chorobowymi równieŜ nowotworowymi, które oparte były np. na
badaniach
histopatologicznych.
WaŜnym
elementem
jest
równieŜ
wpływ
przechowywania krwi, zmian zaleŜnych od temperatury, substancji utrwalających czy
antykrzepliwych. Przyjmowanie leków przez osoby od których pobrano krew powinno
być uwzględniane podczas badań i naleŜy zwrócić na ten aspekt szczególną uwagę,
gdyŜ moŜliwe, iŜ takie substancje silnie wpływają na widma fluorescencji [32].
Następnie moŜna sprawdzić wpływ substancji powodujących niedobór Ŝelaza (czyli
przypuszczalnie większą ilość PPIX we krwi) takie jak zatrucia ołowiem.
Badania moŜna równieŜ prowadzić przy wzbudzaniu róŜnymi długościami fali
z zakresu pasma Soreta, moŜna teŜ oświetlić kuwetę pod róŜnymi kątami a za razem
badać procesy reabsorpcji promieniowania.
95
Literatura:
[1]
Gudowska-Nowak E., Demitologizacja symboli, czyli o wampirach,
nanorurkach i tajemnicach porfiryn, Instytut Fizyki UJ, FOTON 93, Lato 2006,
str. 22-29
[2]
Encyclopedia of Medicine by Robert Scott Dinsmoor
http://www.findarticles.com/p/articles/mi_g2601
[3]
Kral V., Kralova J., Kaplanek R., Briza T., Martasek P., Quo vadis porphyrin
chemistry?, Physiol. Res. 55 (Suppl. 2): S3-S26, 2006
[4]
Podbielska H., Sieroń A., Stręk W., Diagnostyka i terapia fotodynamiczna,
Wyd. Med. Urban & Partner, Wrocław 2004
[5]
Gabrecht T., Clinical Fluorescence Spectroscopy and Imaging for the Detection
of Early Carcinoma by Autofluorescence Bronchoscopy and the Study of the
Protoporphyrin IX Pharmacokinetics in the Endometrium, Universität Bielefeld,
Allemagne et de nationalité allemande, Lausanne, EPFL 2006, chapter 1, p.1-22
[6]
Gawlik W., Zastosowanie światła laserowego w diagnostyce i terapii, w
„Fizyczne metody diagnostyki medycznej i terapii” p. red. Hrynkiewicza, A.Z. i
Rokity, E., PWN, 2000, Warszawa, str. 157-184
[7]
Ziętek B., Optoelektronika, Uniwersytet Mikołaja Kopernika.Toruń, Wydaw.
UMK, 2004
[8]
Allison R. R., Downie G. H., Xin-Hua Hu, Childs JH C., Cuenca R., Sibata C.
H., Photodiagnosis and Photodynamic Therapy (2004) Photosensitizers in
clinical PDT, Photodiagnosis and PhotodynamicTherapy (2004) p. 27-34
[9]
Graczykowa A., Fotodynamiczna metoda rozpoznawania i leczenia
nowotworów, w „Biocybernetyka i inŜynieria biomedyczna t. 9 – Fizyka
medyczna” p. red. Nałęcza M., red. tomu Pawlicki G., Polska Akademia Nauk.,
Wa-wa : Akademicka Oficyna Wydawnicza EXIT, 2002. rozdz. 10.4., str.
471-510
[10]
Booth K., Hill. S., Optoelektronika, Wa-wa : Wydaw. Komunikacji i Łączności,
2001
[11]
Spears R., Serur J., Shropshire D., Paulin S., Fluorescence of Experimental
Atheromatous Plaques with Hematoporphyrin Derivative, J. Clin. Invest.,
96
The American Society for Clinical Investigation, Inc., Volume 71,
February 1983, p. 395-399
[12]
Whittaker A. G., Mount A. R., Chemia fizyczna - Krótkie Wykłady, Wa-wa,
PWN, 2003, str. 261-267
[13]
Jóźwiak Z., Bartosz G., Biofizyka - wybrane zagadnienia wraz z ćwiczeniami,
PWN, Wa-wa 2005
[14]
Hames B. D., Hooper N. M., Houghton J. D., Biochemia – Krótkie wykłady, Wawa, PWN, 2000, str. 44-51
[15]
Grossweiner L. I., Singlet Oxygen: Generation and Properties, Internet
Photochemistry & Photobiology
http://www.photobiology.com/educational/len2/singox.html
[16]
Yamaguchi Sh., Sasaki Y., Spectroscopic determination of very low quantum
yield of singlet oxygen formation photosensitized by industrial dyes, Journal of
Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 142 (2001), p. 47-50
[17]
Bilski P., Chignell C.F., Optimization of a pulse laser spectrometer for the
measurement of the kinetics of singlet oxygen O2(1g) decay in solution, Journal
of Biochemical and Biophysical Methods, Volume 33, Number 2, 15 November
1996, p. 73-80(8)
[18]
Dougherty T. J., Gomer Ch. J., Henderson B. W., Jori G., Kessel D., Korbelik
M., Moan J., Peng Q., PhotodynamicTherapy, Journal of the National Cancer
Institute, Vol.90, No.12, June17, 1998, p. 889-904
[19]
Balcerzyk A., Chemia medyczna, p. red. śak I.; Katowice : Śląska Akademia
Medyczna, 2001. rozdz 17.
[20]
Dargiewicz-Nowicka J., Radzki S., Chemi- i biosensory optyczne
wykorzystujące porfiryny, Acta Bio-Optica et Infomatica Medica, Vol. 8, 2002,
s. 119-131
[21]
Centre for Photobiology and Photodynamic Therapy website at Leeds
University, Types of Photosensitisers,
http://www.bmb.leeds.ac.uk/pdt/individualPs.htm
[22]
Kramer-Marek G, Serpa C., Szurk A., Widel M., Sochanik A., Snietura M., Kus
P., Nunes R. M. D., Arnaut L. G., Ratuszna A., Spectroscopic properties and
photodynamic effects of new lipophilic porphyrin derivatives: Efficacy,
localisation and cell death pathways., J. Photochem. and Photobiol. B: Biol.
2006, Vol. 84, p. 1-14.
97
[23]
Lipiński M.I., Jeromin L.M., Fotodynamiczna diagnostyka i terapia
nowotworów pęcherza moczowego, Klinika Urologii z Pracownią Liotrypsji
Uniwersytetu Medycznego w Łodzi str. 131 - 137
[24]
Gustafsson U., Palsson S., Svanberg S., Compact fiber-optic fluorosensor using
a continuous - wave violet diode laser and an integrated spectrometer, Review
of Scientific Instrumenst Vol. 71, No. 8, August 2000, p. 3004-3006
[25]
Grieb P., Kwas 5-aminolewulinowy (ALA) i jego zastosowania w neurochirurgii,
Neurologia i Neurochirurgia Polska 2004; 38, 3: str. 201-207
[26]
Brancaleon L, Moseley H., Laser and non-laser light sources for photodynamic
therapy, Lasers Med Sci 2002, p. 173-186
[27]
CEZAR - INTERNATIONAL GROUP, Photons Technology Division:
informacje o sondach medycznych: www.cezarint.pl/pl/photonic/sondamed.htm
[28]
Whela H. T., Buchmannla E. V. , Whelan N. T., Turnerla S. G., Cevenini V.,
Stinson H., Ignatius R., Martin T., Cwiklinski J., MeyerIc G. A., Hodgson B.,
Gould L., Kanel M., Chen G., Caviness J., Light Emitting Diode Medical
Applications From Deep Space to Deep Sea, Space Technology and
Applications International Forum 2001,
[29]
Drug Information Online http://www.drugs.com/cons/photofrin.html
[30]
Mayo Clinic: http://www.mayoclinic.com/health/drug-information/DR601139
[31]
RxList The Internet Drug List
http://www.rxlist.com/cgi/generic/photofrin_ad.htm
[32]
Masilamani V., Al-Zahrani K., Al-Salhi M., Al-Diab A., Al-Ageily M., Cancer
diagnosis by autofluorescence of blood components, Journal of Luminescence
109 (2004), p. 143-154
[33]
Silva D. P, Blood and blood cells, Universidade Fernando Pessoa:
http://www2.ufp.pt/~pedros/qfisio/blood.htm
[34]
Howland R., Benatar L., STM/AFM Mikroskopy ze skanującą sondą - elementy
teorii i praktyki, tłum. M. Woźniak, Warszawa 2002
[35]
Boulnois J. L., Photophysical processes in recent medical laser developments: A
review, Lasers in Medical Science 1(1), p.47-66 (1986)
[36]
Eker Ch., Optical characterization of tissue for medical diagnostics, Doctoral
Thesis, Department of Physics, Lund Institute of Technology, October 1999,
p.28-29
98
[37]
Prahl S., Optical Absorption of Hemoglobin, Oregon Medical Laser Center:
http://omlc.ogi.edu/spectra/hemoglobin/summary.html
[38]
Łętowska M., Rosiek A., Komórkowe składniki krwi w onkologii, Onkologia w
praktyce klinicznej 2006, tom 2, nr 1, str. 7-10
[39]
Karthikeyan K., Masilamani V., Govindasamy S., Spectrofluorimetric Detection
of DMBA-Induced Mouse Skin Carcinoma; Pathology Oncology Research; Vol
5, No 1, 1999, p. 46-48
[40]
LAN X., Gao Sh., Peng Ch., LIU Y., NI X., Fluorometic Determination of
Whole Blood With Various Excitation Wavelenths, Proceedings of SPIE
Vol. 5254, p. 336-340
[41]
Kaestner L., A.Juzeniene, Moan J., Erythrocytes-the'houseelves'of
photodynamictherapy, Photochem.Photobiol.Sci., 2004, 3, p. 981–989
[42]
Płachta A., Medyczne zastosowania promieniowania laserowego w
niskoenergetycznej terapii laserowej. Instytut Fizyki UJ
[43]
Informacje o produktach firmy Roithner http://www.roithner-laser.com/
[44]
Gawlik W., Spektroskopia optyczna UV/VIS, w: Fizyczne metody w biologii,
medycynie i ochronie środowiska, p. red. Hrynkiewicz A.Z., Rokita E., PWN,
1999. str. 188-221
[45]
NIST Atomic Spectra Database Lines Data
http://physics.nist.gov/cgi-bin/ASD/lines1.pl
[46]
Hemotransfuzja, autohemotransfuzja i hemodulucja sterowana w zastosowaniu
klinicznym, pod redakcja naukową: prof. dr hab. n. med. Zygmunta
Antoszewskiego, dr hab. n. med. Janusza Skalskiego i dr n. med. Dariusza
Maciejewskiego, Katowice 2000, str. 23-35
[47]
Stryer L., Biochemia, PWN, Wa-wa 2003, str. 177
[48]
Małyszko J., Zespół niewyrównania i pierwszego uŜycia dializatora, hemoliza,
Problemy Lekarskie 2006; 45, 3: 122–123
99

Podobne dokumenty