Protokół Produktu Płeć

"DNA-GDAŃSK II" s.c.
Al. Zwycięstwa 96/98, 81-451 GDYNIA
tel/fax: (0-58) 735 11 67
e-mail [email protected]
internet: http://www.dnagda.com
2008-02-27
Protokół Produktu
Zestaw diagnostyczny PCR
Płeć - XY
do oznaczania płci człowieka
(na 50 reakcji, włączając w to kontrole)
Oznaczenie oparte jest na amplifikacji fragmentu genu
amelogeniny, który charakteryzuje się polimorfizmem w
zależności od lokalizacji na chromosomach płciowych X i Y.
Wielkości amplifikowanych fragmentów w przypadku DNA
mężczyzny wynoszą 977 oraz 788 pz, w przypadku DNA
kobiety 977 pz.
ZALECANA POLIMERAZA
Zalecane jest użycie bezpłatnie do zestawu dołączonej polimerazy
termostabilnej Hypernova (DNA-Gdańsk).
ZESTAW O PRZEDŁUŻONEJ TRWAŁOŚCI.
W tym zestawie deoksynukleotydy dostarczane są osobno.
Trwałość deoksynukleotydów przechowywanych w temp. -20 °C
gwarantowana jest na pół roku.
Gwarancja na ZESTAW O PRZEDŁUŻONEJ TRWAŁOŚCI wynosi pół roku.
Przechowywanie zestawu
» Master mix należy przechowywać w temp. -20°C. Po odmrożeniu
probówkę można przechowywać w lodówce (+4°C).
» Deoksynukleotydy należy przechowywać w temp. -20°C i rozmrażać
tylko bezpośrednio przed użyciem.
» Polimerazę termostabilną należy przechowywać w temp. -20°C. Można
transportować w temp. pokojowej.
» Matrycowe DNA należy przechowywać w lodówce (+4°C) do pół roku.
W wypadku przechowywania przez dłuższy okres zalecane jest
przechowywanie w temp. -20°C, ale należy unikać częstego zamrażania
i rozmrażania próbki.
» Wzorzec masowy DNA można przechowywać w temp. pokojowej lub
lodówce (+4°C) przez kilka dni. W wypadku przechowywania przez
dłuższy okres zalecane jest przechowywanie w temp. -20°C, ale należy
unikać częstego zamrażania i rozmrażania preparatu.
Skład zestawu
» 5 probówek Master mix
(każda na 10 reakcji; zawiera primery, oraz składniki buforu do PCR)
» 5 probówek mieszaniny dNTPs 8mM (każda na 10 reakcji)
» Polimeraza termostabilna Hypernova (DNA-Gdańsk)
» kontrole pozytywne: DNA kobiety i DNA mężczyzny
(na 10 amplifikacji każda; pakowane oddzielnie)
» Marker wielkości DNA M600-1000 (DNA-Gdańsk)
o wielkościach fragmentów: 600, 700, 800, 900, 1000 pz
(probówka z zawartością na 10 ścieżek elektroforetycznych)
I. Izolacja DNA do reakcji PCR
Polecamy zestaw do izolacji DNA: Sherlock AX lub Blood Mini (dostępne
w ofercie naszej firmy; IK17, IK174, IK12, IK125).
II. Przygotowanie reakcji PCR
(protokół na jedno oznaczenie)
Należy pamiętać o zwirowaniu probówek z odczynnikami po rozmrożeniu,
tak aby całość mieszaniny znalazła się na dnie probówki !!!
» Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej dla 1 próbki
42,5 µl master mix
5,0 µl mieszaniny dNTPs
2,0 µl DNA (otrzymanego wg protokołu pkt. I)
0,5 µl polimerazy termostabilnej Hypernova
» Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej kontroli pozytywnej
42,5 µl master mix
5,0 µl mieszaniny dNTPs
2,0 µl DNA kontroli pozytywnej
0,5 µl polimerazy termostabilnej Hypernova
» Warunki amplifikacji
2 min 94°C (wstępna denaturacja)
60 s 94°C (denaturacja)
⎫
120 s 58°C (dołączanie primerów) ⎬ ×40 cykli
90 s 72°C (elongacja)
⎭
2 min 72°C (wydłużanie końcowe)
Uwagi:
» Należy pamiętać o wykonaniu kontroli pozytywnych dla każdej serii
badań.
» Wskazane jest wykonanie kontroli negatywnej dla każdej serii badań.
Układ jest bardzo czuły, ale przez to niezmiernie wrażliwy na
kontaminacje.
» W przypadku większej ilości oznaczeń należy pomnożyć ilości µl
składników master mix, deoksynukleotydów i polimerazy przez liczbę
wykonywanych prób plus jedna. Np.: dla 9 próbek (8 próbek
klinicznych i 1 probówka kontroli pozytywnej) należy przygotować
mieszaninę reakcyjną w następujący sposób:
do probówki Eppendorfa dodać:
42,5 µl x 10 (9+1) = 425 µl master mixu
5,0 µl x 10 (9+1) = 50 µl mieszaniny 8mM dNTPs
0,5 µl × 10 (9+1) = 5 µl polimerazy Hypernova
wymieszać
tipsem,
rozporcjować
po
48
µl
do
9
wcześniej
przygotowanych probówek reakcyjnych.
» Można zastosować każdy rodzaj komercyjnie dostępnej termostabilnej
polimerazy, jednakże rekomendowana jest polimeraza Hypernova
produkowana przez firmę DNA-Gdańsk.
III. Detekcja produktów amplifikacji
»
1)
2)
3)
Próbki:
2 µl barwnika i 10 µl markera DNA M600-1000
3 µl barwnika i 10-20 µl mieszaniny reakcyjnej PCR badanej próbki
3 µl barwnika i 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR kontroli pozytywnej
DNA kobiety
4) 3 µl barwnika i 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR kontroli pozytywnej
DNA mężczyzny
» 1,5 % żel agarozowy, standardowe warunki elektroforezy
Wyniki testu:
obecność w żelu produktów reakcji PCR o wielkościach:
- 788 i 977 par zasad: mężczyzna
- 977 par zasad: kobieta