Monoclonal Mouse

MultiMix™
Triple-Colour Reagent
Anti-Human CD2/FITC
Anti-Human CD34/RPE
Anti-Human CD5/APC
Nr kat. TC666
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Odczynnik TC666 przeznaczony jest do stosowania w cytometrii przepływowej. Odczynnik jest przeznaczony
do stosowania w identyfikacji komórek wykazujących ekspresję CD2, CD34 i CD5. CD2 to uniwersalny antygen
komórek T obecny praktycznie we wszystkich prawidłowych limfocytach T. CD2 jest markerem przydatnym
w ocenie nowotworów limfoidalnych, a jego ekspresję wykazuje większość komórek chłoniaków i białaczek
prekursorowych i pograsiczych. W niektórych populacjach nowotworowych komórek T, np. w chłoniakowych
komórkach T krwi obwodowej, mogą występować zaburzenia polegające na delecji CD2 (1). Ekspresję CD34
wykazują wczesne macierzyste komórki krwiotwórcze, komórki progenitorowe, a także komórki śródbłonka.
Przeciwciała skierowane przeciwko CD34 można wykorzystać do określania ilości i oczyszczania
macierzystych komórek krwiotwórczych/komórek progenitorowych na potrzeby przeszczepów i w celach
badawczych (2-7). CD34 jest użytecznym markerem komórek macierzystych i komórek progenitorowych,
przydatnym również do klasyfikacji białaczek (3, 5, 6). CD5 obecny jest we wszystkich dojrzałych komórkach T
i prawie wszystkich tymocytach. Jest obecny również w niewielkiej podpopulacji prawidłowych i nowotworowych
komórek B. Interpretacji wyniku - z uwzględnieniem kontekstu klinicznego oraz wyników innych metod
diagnostycznych - powinien dokonać specjalista o udokumentowanych kwalifikacjach.
Dostarczany odczynnik
TC666 składa się z trzech specjalnie dobranych przeciwciał fluorescencyjnych:
Przeciwciała monoklonalne mysie skierowane przeciwko ludzkiemu CD2, klon MT910, sprzężone z izomerem 1
izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC).
Przeciwciała monoklonalne mysie skierowane przeciwko ludzkiemu CD34, klon BIRMA-K3, sprzężone
z R-fikoerytryną (RPE).
Przeciwciała monoklonalne mysie skierowane przeciwko ludzkiemu CD5, klon DK23, sprzężone
z allofikocyjaniną (APC).
Trzy koniugaty w TC666 wytworzono z oczyszczonych mysich przeciwciał monoklonalnych izotypu IgG1 kappa.
Odczynnik TC666 dostarczany jest w postaci ciekłej w buforze zawierającym 1% albuminy surowicy wołowej
(BSA) oraz 15 mmol/L NaN3, pH 7,2. Każda fiolka zawiera koniugat na 50 testów (20 µL koniugatu dla
leukocytów, w ilości do 106, z prawidłowej ludzkiej krwi obwodowej).
Swoistość
Przeciwciała anty-CD2, UCHT1, opisano podczas warsztatów Second, Third and Fourth International
Workshops and Conferences on Human Leucocyte Differentiation Antigens (2., 3. i 4. międzynarodowe
warsztaty i konferencja na temat antygenów różnicujących ludzkie leukocyty), a ich reaktywność z CD2 została
potwierdzona przez wiele laboratoriów (8).
Przeciwciała anty-CD34, BIRMA-K3, opisano podczas warsztatów Sixth International Workshop and
Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens (6. międzynarodowe warsztaty i konferencja na temat
antygenów różnicujących ludzkie leukocyty), a ich reaktywność z CD34 i epitopem klasy III została
potwierdzona przez różne laboratoria (2).
W przypadku stosowania cytometrii przepływowej do komórek „kożuszka” (warstwy włóknika i leukocytów
w górnej części skrzepu) krwi obwodowej oraz bramkowanych populacji limfocytów, przeciwciało anty-CD5,
DK23, znakuje limfocyty T. Swoistość Anty-CD5, DK23, odpowiada opublikowanej dla przeciwciała CD5 Leu-1
(9).
Środki ostrożności
1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych Użytkowników.
2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. Stężenie
NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN 3
z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe
azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika używać dużych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć
gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej.
3. Podobnie jak w przypadku każdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, należy stosować
odpowiednie procedury postępowania.
Przechowywanie
(111899-002)
Przechowywać w ciemności, w temperaturze 2–8°C. Nie stosować po upływie terminu ważności podanego na
opakowaniu. Jeżeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niż podane na wkładce informacyjnej do
opakowania, Użytkownik powinien je zweryfikować. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących
o niestabilności tego produktu. Dlatego równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów,
należy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego
nie można wyjaśnić różnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z odczynnikiem,
należy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
TC666/PL/OKJ/03.12.04 s.1/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
Wykonanie odczynu
1.
Przenieść 100 µL krwi z dodatkiem środka przeciwzakrzepowego (EDTA) do probówki polistyrenowej
o wymiarach 12 mm x 75 mm.
2.
Dodać 20 µL TC666 i ostrożnie wymieszać mieszadłem wibracyjnym.
3.
Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze 2–8 °C lub przez 15–30 minut
w temperaturze pokojowej (20–25°C).
4.
Dodać do probówki 100 µL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent A (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej,
w ciemnym pomieszczeniu.
5.
Dodać do probówki 1 mL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent B (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej,
w ciemnym pomieszczeniu.
6.
Odwirować probówkę przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odciągnąć supernatant i odrzucić go,
pozostawiając w probówce około 50 µL cieczy.
7.
Dodać do probówki 2 mL odczynnika PBS (nr kat. Dako S3024) i odtworzyć zawiesinę za pomocą mieszadła
wibracyjnego.
8.
Powtórzyć etap 6.
9.
Odtworzyć zawiesinę komórek w odpowiednim płynie do cytometrii przepływowej, np. 0,3 mL PBS.
10.
Poddać próbkę analizie w cytometrze przepływowym lub przechowywać do analizy w ciemności
i temperaturze 2–8°C. Próbki powinny zostać poddane analizie przed upływem 24 godzin od barwienia.
Należy pamiętać, że koniugaty fluorochromowe są wrażliwe na światło, w związku z czym w trakcie wykonywania
odczynu i do wykonania analizy próbki powinny być chronione przed światłem.
Uwagi dotyczące procedury
Etap 1: Opcjonalnie do każdego pomiaru można dołączyć odpowiednie dodatnie i ujemne próbki kontrolne w celu
weryfikacji odczynnika i przygotowania próbek.
Etap 2: Zalecana objętość koniugatu jest jedynie wartością orientacyjną. Optymalne warunki barwienia mogą się
zmieniać w zależności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i powinny być określone indywidualnie w
każdym laboratorium.
Uwzględnienie probówki z odczynnikiem kontrolnym jest opcjonalne. Odczynnik kontrolny powinien być
dopasowany do izotypów i fluorochromów sprzężonego przeciwciała. Zalecanym trójbarwnym odczynnikiem
kontrolnym dla TC666 jest odczynnik Dako o numerze kat. X0978.
Etapy 4 i 5: Jeśli używany jest inny odczynnik do lizy komórek, należy przy jego doborze kierować się
poniższymi zaleceniami. Należy zauważyć, że jeśli alternatywny odczynnik do lizy nie zawiera utrwalacza
(np. Dako EasyLyse™, nr kat. S2364) PBS w kroku 9 powinien zawierać 1% paraformaldehydu, chyba że
próbka zostanie przeanalizowana w czasie zalecanym dla odczynnika do lizy.
Etap 10: W przypadku niektórych chorób można oczekiwać nieprawidłowej ilości komórek, w których zachodzi
ekspresja antygenu docelowego, lub nieprawidłowego poziomu ekspresji antygenu. Może to wywołać zmianę
wzorca odczynu. Do przeprowadzenia właściwej analizy konieczna jest znajomość prawidłowego wzorca ekspresji
antygenu oraz jego związków z ekspresją innych istotnych antygenów.
Odczynniki wielobarwne lepiej niż jednobarwne nadają się do kompleksowej analizy próbek w cytometrii
przepływowej. W analizach wielobarwnych szczególne znaczenie ma odpowiedni dobór kompensacji koloru. Dzięki
minimalnemu nakładaniu się pasm emisyjnych fluorochromów FITC, RPE i APC, ich połączenie umożliwia
wyjątkowo łatwą analizę.
Piśmiennictwo
(111899-002)
1.
Leong A, Cooper K, Leong F. Manual of diagnostic antibodies for immunohistology; London: Oxford
University Press; 1999. p. 45-6.
2.
Nishio H, Tada J, Hashiyama M, Hirn J, Ingles-Esteve J, Suda T. MC7. CD34 workshop panel report. In:
Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors.
Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 6th International Workshop
and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan. New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p.
974-84.
3.
Civin CI, Trischmann TM, Fackler MJ, Bernstein ID, Bühring HJ, Campos L, et al. M7.1. Report on the
CD34 cluster workshop. In: Knapp W, Dörken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt RE, Stein H, et al.,
editors. Leukocyte typing IV. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 4th International
Workshop and Conference; 1989 Feb 21-25; Vienna, Austria. Oxford, New York, Tokyo: Oxford
University Press; 1989. p. 818-25.
4.
Höffkes H-G, Lowe JA, Pedersen RO, Schmidkte G, McDonald DF. BIRMA-K3, a new monoclonal
antibody for CD34 immunophenotyping and stem and progenitor cell assay. J Hematother 1996;5:261-70.
5.
Civin CI, Strauss LC, Fackler MJ, Trischmann TM, Wiley JM, Loken MR. Positive stem cell selection basic science. Prog Clin Biol Res 1990;333:387-402.
6.
Krause DS, Fackler MJ, Civin CI, May WS. CD34: structure, biology, and clinical utility (review). Blood
1996;87:1-13.
7.
Campos L, Guyotat D, Archimbaud E, Devaux Y, Treille D, Larese A, et al. Surface marker expression in
adult acute myeloid leukaemia: correlations with initial characteristics, morphology and response to
therapy. Br J Haematol 1989;72:161-6.
8.
Dörken B, Möller P, Pezzutto A, Schwartz-Albiez R, Moldenhauer G. B3. B-cell antigens: CD20. In:
Knapp W, Dörken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt RE, Stein H, et al., editors. Leucocyte typing IV.
White cell differentiation antigens. Proceedings of the 4th International Workshop and Conference; 1989
Feb 21-25; Vienna, Austria. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1989. p 46-8.
TC666/PL/OKJ/03.12.04 s.2/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
9.
Stein H, Lennert K, Feller AC, Mason DY. Immunohistological analysis of human lymphoma: correlation
of histological and immunological categories. Adv Cancer Res 1984;42:67-147.
Objaśnienie symboli
Numer katalogowy
W
y
d
i
a
r
g
ó
b
n
m
o
s
e
t
d
y
k
y
i
c
i
n
z
n
v
y
i
t
d
r
Temperatura przechowywania
o
o
Chronić przed słońcem (patrz
s
e
k
c
j
a
n
t
.
p
r
z
e
c
h
o
w
y
w
a
n
i
a
Zużyć przed
Producent
)
Sprawdzić w instrukcji
N
s
(111899-002)
t
o
s
o
w
a
n
i
u
m
e
r
s
e
r
i
i
a
TC666/PL/OKJ/03.12.04 s.3/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17