materiały

Skrining ze środowiska naturalnego: selekcja promieniowców zdolnych do produkcji
antybiotyków. Testowanie zdolności do syntezy antybiotyków przez wyselekcjonowane
szczepy promieniowców
I tydzień (ćwiczenie 1)
Materiał: próbka gleby
Przygotowanie materiału: próbkę gleby (200 g) zmieszać z 5 g węglanu wapnia, inkubować
przez 7 dni w temperaturze 26°C. W takich warunkach następuje zahamowanie wzrostu
grzybów, a wypromowanie wzrostu promieniowców (gleby obojętne lub alkaliczne o
stosunkowo niskim uwodnieniu). Przesuszenie gleby dodatkowo powoduje zmniejszenie
ilości bakterii nieprzetrwalnikujących.
II tydzień (ćwiczenie 2)
Cel ćwiczenia: izolacja drobnoustrojów glebowych wytwarzających antybiotyki
Odczynniki i podłoża:
Agar z glicerolem, argininą i solami mineralnymi (AGS)
chlorowodorek argininy
1,0 g
glicerol
12,5 g
K2HPO4
1,0 g
NaCl
1,0 g
MgSO4
0,5 g
Fe2(SO4)3
0,01 g
CuSO4
1 mg
ZnSO4
1 mg
MnSO4
1 mg
agar
15,0 g
woda
do 1000 ml
pH=6,9-7,1.
Po sterylizacji dodać nystatynę (końcowe stężenie ok. 50 μg/ml).
Agar z wyciągiem glebowym i ekstraktem drożdżowym (YS)
wyciąg glebowy
1000 ml
ekstrakt drożdżowy
1,0 g
agar
20,0 g
Po sterylizacji dodać nystatynę (końcowe stężenie ok. 50 μg/ml).
0,9% NaCl
0,1% roztwór Tween 80 w soli fizjologicznej
1
Wykonanie:
1. Przygotować wyciąg glebowy (10 g gleby wytrząsać w 90 ml soli fizjologicznej z
dodatkiem Tweenu przez około 30 minut, odstawić na 1 minutę do opadnięcia większych
cząstek).
2. Przygotować szereg 10-krotnych rozcieńczeń w soli fizjologicznej (10-2–10-5) – po 1 ml
rozcieńczenia na 9 ml soli fizjologicznej. Wyciąg glebowy traktować jako rozcieńczenie
10-1.
3. Wykonać posiew powierzchniowy (mazany) na agarze po 0,1 ml każdego z rozcieńczeń.
Inkubować hodowle przez 7 dni w temperaturze 28°C.
Ryc. Schemat wykonania szeregu rozcieńczeń wyciągu glebowego.
Wyniki:
Określić liczbę kolonii (CFU – colony forming units) wyrosłych na agarze przy
poszczególnych rozcieńczeniach wyciągu glebowego i opisać morfologię obserwowanych
grzybni – wygląd, kolor, wielkość, powierzchnia itp.
2
Tabela. Wyniki obserwacji (morfologia i liczba CFU)
Rozcieńczenie wyciągu glebowego
agar glebowy (YS)
10-2
10-3
10-4
10-5
liczba kolonii
morfologia kolonii
agar AGS
liczba kolonii
morfologia kolonii
Wnioski:
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………...
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
III tydzień (ćwiczenie 3)
Cel ćwiczenia: Uzyskanie czystych szczepów promieniowców glebowych i analiza ich
antagonizmów wobec wzorcowych szczepów patogennych bakterii i/lub grzybów.
Podłoża:
PDA (potato-dextrose agar):
wyciąg ziemniaczany
500 ml (z 300 g ziemniaków)
glukoza
20,0 g
agar
15,0 g
woda
do 1000 ml
3
Wykonanie: Wybrane kolonie promieniowców wyizolowane z gleby (ćwiczenie 2.)
przeszczepić na płytki z agarem ziemniacznym (PDA). Inkubować przez 7 dni w temp. 28°C.
IV tydzień (ćwiczenie 4)
Podłoża:
Agar wysiewny Penassay (Grove & Randall Antibiotic Agar No 1):
glukoza
1,0 g
wyciąg mięsny
1,5 g
pepton kazeinowy
4,0 g
pepton mięsny
6,0 g
wyciąg drożdżowy
3,0 g
agar
15,0 g
woda
do 1000 ml; pH=6,5
Wykonanie: Po 7 dniach wysiać ezą wybrane szczepy (z poprzedniego ćwiczenia) na szalki z
podłożem wysiewnym do badania aktywności antybiotycznej (Penassay agar). Posiew
wykonać w postaci dwóch linii wzdłuż szalki. Inkubować przez 7 dni w temp. 28°C.
V tydzień (ćwiczenie 4 – kontynuacja: odczyt i analiza wyników całego eksperymentu)
Materiał: szczepy wzorcowe Bacillus cereus, Candida albicans, Escherichia coli
Wykonanie: Po 7 dniach nanieść na płytki z agarem wysiewnym kolonie wybranych
drobnoustrojów wzorcowych dokładnie wzdłuż uprzednio narysowanych linii prostopadłych
do linii wysiewu testowanych szczepów promieniowców. Linie nie mogą stykać się
bezpośrednio z wyrosłymi koloniami promieniowców. Płytki inkubować przez 48 godzin w
temp. 37°C, a następnie dokonać oceny zdolności badanych szczepów promieniowców do
hamowania wzrostu drobnoustrojów wzorcowych.
Opisać swoją płytkę z naniesionymi szczepami promieniowców i szczepów testowych
4
Ryc. Schemat opisu płytki z agarem Penassay
Wyniki:
Tabela. Analiza antagonizmów – ocena występowania i wielkości stref zahamowania wzrostu
wzorcowych szczepów patogennych
wielkość stref zahamowania wzrostu [mm]
B. cereus
C. albicans
E. coli
szczep 1.
szczep 2.
Na podstawie powyższej analizy oszacować potencjał wyizolowanych szczepów
promieniowców glebowych do produkcji substancji o charakterze antybiotycznym:
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
5