docmarzec ok ok.indd - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy
download 
Reklamacja Transkrypt
marzec ok ok.indd - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy
$ERYWATYZACJA`ONLINEnWOZNACZANIUIBUPROFENUINAPROKSENU TECHNIK'#-3 `/NLINEnDERIVATIZATIONIN'#-3DETERMINATIONOFIBUPROFENANDNAPROXEN $RNFARM3AWOMIR+URKIEWICZDRHABNBIOL+RYSTYNA3TÃPIEÊ DRNBIOL!NNA$ZIERÃGA,ÃCZNARMGRFARM7IOLETTA3TEFANIK +ATEDRA!NALIZY)NSTRUMENTALNEJ +ATEDRAI:AKAD&ARMACJI3TOSOWANEJgLSKIEGO5NIWERSYTETU-EDYCZNEGOW+ATOWICACH 0RACÃWYKONANOW+ATEDRZE!NALIZY)NSTRUMENTALNEJgLSKIEGO5NIWERSYTETU-EDYCZNEGOW+ATOWICACH +IEROWNIK+ATEDRYDRHABNBIOL+RYSTYNA3TÃPIEÊ Streszczenie Oznaczanie poziomu niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ) w płynach ustrojowych ma istotne znaczenie, zarówno ze względów toksykologicznych, jak i farmakokinetycznych. Niezwykle ważna z punktu widzenia ochrony środowiska jest również analiza zawartości NLPZ w wodzie i ściekach. Jedną z metod stosowanych do oznaczania NLPZ w próbkach biologicznych i środowiskowych jest chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas. Technika GC/MS wymaga przeprowadzenia oznaczanych leków w ich lotne pochodne. Najczęściej w tym celu stosuje się derywatyzację do pochodnych sililowych. W prezentowanej pracy zastosowano nową metodę oznaczania ibuprofenu i naproksenu opartą na otrzymywaniu sililopochodnych bezpośrednio w gorącej komorze dozownika chromatografu gazowego (silanizacja „on-line”) oraz porównano skuteczność dwóch różnych odczynników silanizujących. N,O-bis-(trimetylosililo)trifluoroacetamid okazał się skuteczniejszym niż heksametylodisilazan czynnikiem derywatyzującym w odniesieniu do wybranych NLPZ. Wykazano, że derywatyzacja „on-line” jest równie wydajna jak klasyczna procedura derywatyzacji poprzedzająca analizę GC/MS. Pozwala natomiast znacznie skrócić czas przygotowania próbki do analizy, jest mniej pracochłonna i bardziej ekonomiczna. Abstract Monitoring of non-steroidal antiinflammatory drugs (NSAIDs) concentrations in body fluids is of importance for both toxicological and pharmacokinetic reasons. Analysis of the drug content in water and wastewater samples is also important for environmental protection. One of the methods used for NSAID determination in biological and environmental samples is gas chromatography coupled with mass spectrometry. The technique requires conversion of the analyzed drugs to their volatile derivatives, most frequently silyl derivatives. In the present study, the new method for determination of ibuprofen and naproxen by „on-line” derivatization to silyl derivatives directly in the hot injection port of the gas chromatograph was used, and efficiencies of two different derivatization agents were compared. N,O-bis-(trimethylsilyl)trifluoracetamide was found to be more effective derivatizing agent of selected NSAIDs than hexamethyldisilazane. The results indicate that the efficiency of „on-line” silylation is comparable to that of conventional derivatization procedure. The derivatization method used allows reducing amount of the sample required for a single analysis, is less laborious and more economical. Key-words: NSAIDs, GC/MS, “on-line” silylation Słowa kluczowe: NLPZ, GC/MS, silanizacja „on-line” ' Ö Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) są szeroko stosowane w terapii bólu i stanów zapalnych, a także jako środki przeciwgorączkowe. Leki te uznaje się za stosunkowo bezpieczne, niemniej ich długotrwałe stosowanie, zwłaszcza w wysokich dawkach, może prowadzić do wystąpienia wielu poważnych efektów ubocznych [1, 2]. Ponieważ NLPZ należą do najczęściej konsumowanych leków sprzedawanych bez recepty, ryzyko ich nadużywania lub przypadkowego przedawkowania jest wysokie. Co więcej, często ta sama substancja lecznicza jest składnikiem wielu preparatów, dostępnych w różnych postaciach farmaceutycznych, a współistniejące, choć nie zawsze zdiagnozowane, zabu- &ARMACEUTYCZNY 0RZEGLD.AUKOWY rzenia czynności wątroby lub nerek mogą prowadzić do zwiększenia stężenia we krwi aktywnej farmakologicznie frakcji leku. Oznaczanie poziomu NLPZ w płynach ustrojowych ma zatem istotne znaczenie, zarówno ze względów toksykologicznych, jak i farmakokinetycznych. Niezwykle ważna z punktu widzenia ochrony środowiska jest również analiza zawartości NLPZ w wodzie i ściekach [3]. Jedną z metod stosowanych oznaczania NLPZ w próbkach biologicznych i środowiskowych jest chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas (GC/MS). Technika ta wymaga wstępnego przeprowadzenia oznaczanych leków w ich mniej polarne, bardziej lotne pochodne. Najczęściej w tym celu stosuje się derywatyzację do pochodnych trimetylosilylowych lub tert-butylodimetylosilylowych [4, 5]. COPYRIGHT'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO )33. ¡¤°°U Celem pracy było opracowanie nowej metody oznaczania wybranych NLPZ, opartej na otrzymywaniu pochodnych trimetylosilylowych bezpośrednio w gorącej komorze dozownika chromatografu gazowego (silanizacja „on-line”). Poddano ocenie skuteczność dwóch różnych odczynników silanizujących w odniesieniu do naproksenu i ibuprofenu, a także porównano wydajność derywatyzacji „on-line” tych leków z wydajnością procedury prowadzonej klasyczną metodą „off-line”, poprzedzającą analizę GC/MS. - Rl-t¬luR |J¬ Procedurze silanizacji poddano roztwory wzorcowe zawierające różne stężenia naproksenu i ibuprofenu (Sigma-Aldrich) w dichlorometanie (Merck), oraz oktadekan (10 μg/ml), Sigma-Aldrich) jako wzorzec wewnętrzny. Jako odczynniki derywatyzujące zastosowano heksametylodisilazan (HMDS, Supelco) i N,O-bis-(trimetylosililo)trifluoroacetamid (BSTFA, Supelco). W celu otrzymania pochodnych sililowych metodą „off-line”, badane roztwory mieszano z odczynnikami derywatyzującymi w stosunku 1:1 (v/v), a następnie ogrzewano w 70°C przez 30, 60, 120 lub 180 min. Derywatyzację „on-line” prowadzono w dwóch wariantach. W wariancie I (bez wstępnego mieszania reagentów) do strzykawki o pojemności 5μl pobierano 1μl HMDS lub BSTFA, a następnie 1μl analizowanego roztworu i tak przygotowaną próbkę wprowadzano do dozownika chromatografu gazowego. W wariancie II do fiolki zawierającej 100μl analitu dodawano taką samą objętość HMDS lub BSTFA, dokładnie mieszano i 2μl próbki wprowadzano do portu dozownika w czasie nie dłuższym niż 1min. Analizy GC/MS wykonano stosując chromatograf gazowy HP5890 seria II sprzężony ze spektrometrem mas HP5989A. Rozdział chromatograficzny prowadzono na kolumnie kapilarnej HP5-MS (30m x 0,25mm x 0,25μm). Temperatura pieca chromatograficznego początkowo wynosiła 40ºC i utrzymywana była przez 1 min, po czym wzrastała do 220ºC z szybkością 20ºC/min, a następnie do 255°C z szybkością 10°C/min. Wykorzystano dozownik typu „split/splitless”, a jako gaz nośny zastosowano hel o ciśnieniu 15 psi. Temperatura linii transferowej wprowadzającej kolumnę chromatograficzną bezpośrednio do źródła jonów spektrometru mas wynosiła 230ºC. Analizowane związki jonizowano strumieniem elektronów o energii 70eV. Źródło jonów w spektrometrze utrzymywano w temperaturze 200ºC, a kwadrupol w 100ºC. Spektrometr pracował w trybie zbierania pełnego widma (full scan), monitorując masy 70-380 j.m.a. Do zbierania danych i obróbki widm używano oprogramowania ChemStation G1034C ver.C.02.00 (Hewlett Packard). Przy interpretacji widm masowych wykorzystano siódme wydanie biblioteki widm masowych Wiley. '¬ylplllAi|u}ªlRylR Niezwykle istotny dla wydajności procesu derywatyzacji NLPZ prowadzonej metodą „on-line” jest dobór odpowiedniej temperatury dozownika chromatografu gazowego. Jak wynika z ryciny 1, najkorzystniejsza temperatura silanizacji „on-line” przy użyciu BSTFA mieści się w zakresie 240-280°C. W wyższych temperaturach ilość otrzymanych COPYRIGHT'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO )33. ¬A 't¬ª RuR- ¥¬ J|®|ªylp- y- ª¬J-oy|²É lq-k yl®-Aoll7¥|\Ry¥ly-|pRy¥|ª-J®|yRouR |JÔ|yk kqlyRª|7RAy|²Al "|q-|ªlR®Aiyllp}ª®y|u-k ql®|ª-y|ª®aqÖJRuª®|A-ªRªyÖ ®yRa| ¬A ¤ |®J®l-t Ai|u- |a-]A®y¬ ulR®-y¬ l7¥|\Ry¥G y-|pRy¥ l ª®|A- ªRªyÖ ®yRa| | JR¬ª- ¬®-Aol |yk kqlyR ®R|ª-J®|yRo ®¬ ¥¸¬Al¥ " ª ®| ¬u-ql®|k ª-y¬Aiª-¥yp-Ai sililopochodnych maleje. Podobną tendencję obserwowano w przypadku zastosowania do silanizacji HMDS. Gdy reakcję derywatyzacji przy użyciu tego reagenta prowadzono w temperaturach wyższych niż 300°C, na chromatogramach pojawiały się dodatkowe produkty pochodzące z termicznej degradacji analizowanych NLPZ. Z powyższych względów do prowadzenia dalszych analiz wybrano temp. 270°C, zapewniającą z jednej strony satysfakcjonującą wydajność procesu derywatyzacji „on-line”, z drugiej zaś - termiczną stabilność uzyskiwanych pochodnych. Na rycinie 2 pokazano rozdział chromatograficzny silylowych pochodnych ibuprofenu i naproksenu uzyskanych metodą „on-line” w zoptymalizowanych warunkach. Tożsamość otrzymanych sililopochodnych potwierdzono metodą spektrometrii mas. Jak wynika z ryciny 3, wydajność silanizacji „on-line” prowadzonej w obecności HMDS zależała od sposobu wprowadzania próbki do komory dozownika i była wyraźnie wyższa po wstępnym wymieszaniu analizowanego roztworu i odczynnika derywatyzującego (wariant II silanizacji „on-line”, patrz: Materiały i metody). W przypadku BSTFA, fakt wymieszania reagentów poza komorą dozownika pozostawał bez wpływu na wydajność derywatyzacji „on-line”. Prawdopodobnym źródłem obserwowanych różnic jest wyż- &ARMACEUTYCZNY 0RZEGLD.AUKOWY ¡¤°°U ¬A¡|}ªy-ylRª¬J-oy|²Allq-yl®-Aol+|ª-J®|k yRouR |JÔ|ykqlyRª-l-y lG- ®F- Rl-t¬luR |J¬ l|\\kqlyR|q-|ªlR®Aiyllp}ª®y|u-ql®|ª-y|ª®aqÖk JRuª®|A-ªRªyÖ ®yRa| sza lotność i reaktywość BSTFA w porównaniu z HMDS. Jednak niezależnie od użytego odczynnika derywatyzującego, ilości sililopochodnych powstających bezpośrednio w komorze dozownika chromatografu gazowego i otrzymywanych „off-line” były porównywalne, co wskazuje, że metoda silanizacji „on-line” jest równie wydajna jak klasyczna procedura derywatyzacji poprzedzająca analizę GC/MS. Z danych przedstawionych na rycinie 4 wynika, że metoda silanizacji „on-line” może zostać wykorzystana do oznaczania ibuprofenu i naproksenu techniką GC/MS. Dla obu odczynników silanizujących osiągnięto satysfakcjonującą korelację liniową krzywych wzorcowych. Zastosowanie BSTFA powodowało zwiększenie czułości metody, zwłaszcza dla naproksenu. 'yl|pl Uzyskane wyniki wskazują, że BSTFA jest skuteczniejszym czynnikiem silanizującym w odniesieniu do wybranych NLPZ niż HMDS. Sililopochodne ibuprofenu i naproksenu otrzymywane przy użyciu BSTFA charakteryzuje większa stabilność termiczna, a metoda ich oznaczania jest bardziej czuła. Wykazano, że niezależnie od zastosowanego czynnika silanizującego, derywatyzacja prowadzona metodą „on-line ” jest równie wydajna jak tradycyjna procedura &ARMACEUTYCZNY 0RZEGLD.AUKOWY ¬A`®¬ªRp-ql7-A¬oyRJ||®y-A®-yl-l7¥|\Ry¥ly-k |pRy¥ RAiylpÔ ®®- ||ª-ylRulq-yl®-Aol|yk kqlyRª|7RAy|²Al l "|q-|ªlR®Aiyllp}ª ®y|u-ql®|ª-y|ª®aqÖJRuª®|A-ªRªyÖ ®yRa| derywatyzacji poprzedzająca analizę GC/MS i może zostać wykorzystana do oznaczania NLPZ. Silanizacja „on-line” pozwala na znaczne skrócenie czasu przygotowania próbki do analizy, jest mniej pracochłonna i bardziej ekonomiczna. l²ulRyylA ª| 1. Mehanna AS.: NSAIDs: Chemistry and Pharmacological Actions. Am J Pharm Educ 2003; 63: 1-7. 2. Lisowska B, Rell-Bakalarska M, Rutkowska-Sak L.: Niesteroidowe leki przeciwzapalne – blaski i cienie. Reumatologia 2006; 2: 106-111. 3. Kosjek T, Heath E, Krbavčič A.: Determination of non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAIDs) residues in water samples. Environ Int 2005; 31: 679-685. 4. Rodríguez I i wsp.:Determination of acidic drugs in sewage water by gas chromatography–mass spectrometry as tert-butyldimethylsilyl derivatives. J Chromatogr A 2003; 985: 265-274. 5. Farré M, Petrovic M, Barceló D.: Recently developed GC/MS and LC/MS methods for determining NSAIDs in water samples. Anal Bioanal Chem 2007; 387: 1203-1214. COPYRIGHT'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO )33.
