Przeciwciało Monoclonal Rabbit Anti

Przeciwciało Monoclonal Rabbit
Anti-Human
Estrogen Receptor α
Clone SP1
Nr kat. M3634
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciała Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α (ER α) antibody, Clone SP1, moŜna uŜywać w
immunohistochemii, w półilościowej detekcji ludzkiego receptora estrogenowego w utrwalonych w formalinie,
zatopionych w parafinie skrawkach tkankowych ludzkiego raka sutka. Informacje uzyskane po przeprowadzeniu
testu, o którym mowa w niniejszym dokumencie, mogą ułatwić ocenę prawdopodobieństwa odpowiedzi na leczenie
oraz rokowania i leczenia pacjentów z rakiem sutka.
Interpretacja kliniczna dodatniego lub ujemnego odczynu powinna być uzupełniona przez badania morfologiczne i
histologiczne oraz wykonywanie odpowiednich prób kontrolnych. Ocena wyniku musi przebiegać z uwzględnieniem
historii choroby pacjenta i wyników innych badań diagnostycznych przez wykwalifikowanego patologa.
Synonimy antygenu
ER α
Podsumowanie
i wyjaśnienie
Receptory steroidowe wykazują wysokie powinowactwo i swoistość dla ligandów. Ludzki receptor estrogenowy (ER)
jest białkiem dimerycznym o masie 65 kDa, zlokalizowanym najczęściej na błonie jądra komórkowego. NaleŜy do
klasy białek o działaniu trans – pobudzających transkrypcję przez wiązanie z określonymi elementami DNA,
określanymi równieŜ jako elementy odpowiedzi hormonalnej. PoniewaŜ po związaniu białka następuje indukcja
receptora ER i stymulacja transkrypcji, receptor estrogenowy określa się mianem indukowalnego czynnika
pobudzającego (1, 2).
W badaniach z ubiegłych lat wykazano korelację stanu receptora estrogenowego ER z wynikami przypadków
nieleczonych (np. prognozowanie dobrze zróŜnicowanego inwazyjnego raka sutka) i odpowiedzią na leczenie
antyhormonalne, np. leczenie tamoksifenem. Stwierdzono, Ŝe estrogeny przede wszystkim koncentrowały się w
narządach docelowych estrogenu zwierząt i ludzkim raku sutka oraz udokumentowano w stopniu dobrym mitogenny
wpływ estrogenu za pośrednictwem receptora estrogenowego ER. Na podstawie badań mechanizmu biologicznego
wzrostu raka sutka stwierdzono, Ŝe szybkość wzrostu zaleŜy od obecności estrogenu lub progesteronu oddzielnie
lub razem w większości wystąpień raka sutka (2). Tak więc stan receptora estrogenowego w przypadku raka sutka
jest uwaŜany za potwierdzony czynnik prognostyczny podczas postępowania z pacjentami w leczeniu
antyhormonalnym (2, 3).
Zobacz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące
części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem,
3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie
problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody.
Odczynnik
dostarczony
Królicze przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci płynnej jako nadsącz hodowli komórkowej,
zawierającej 0,015 mol/L azydku sodu.
Klon: SP1
StęŜenie króliczych lg [mg/L]:Patrz: informacja podana na etykiecie fiolki.
StęŜenie białek w róŜnych partiach moŜe się róŜnić bez wpływu na rozcieńczenie optymalne. W celu zapewnienia
jednolitości odczynów immunohistochemicznych wykonywanych przy uŜyciu róŜnych partii produktu, miano kaŜdej
partii jest porównywane i dostosowywane do partii referencyjnej.
Immunogen
Syntetyczny peptyd otrzymany z końca C ludzkiego receptora estrogenowego α.
Swoistość
W testach Western blot lizatu komórek MCF-7 przeciwciało znakuje duŜe pasmo 67 kDa odpowiadające oczekiwanej
masie cząsteczkowej ER α (4).
Środki ostroŜności
1.
Do stosowania przez wyszkolony personel.
2.
Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3) w czystej postaci. Azydek sodu,
zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z
elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków
metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji.
3.
Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł‚ biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
Przechowywanie
(118782-002)
4.
W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5.
Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
Przechowywać w temperaturze 2–8 °C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na opakowaniu. Jeśli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie
warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem
próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego
wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem
z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
307002PL_002 p. 1/4
Przygotowanie
próbek
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Skrawki parafinowe: Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania skrawków zatapianych w parafinie,
utrwalonych formaliną.
Wymagane jest poddanie odparafinowanych skrawków tkankowych cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER).
Optymalne wyniki uzyskuje się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŜyciu HIER z zastosowaniem roztworu Dako
EnVisionTM FLEX Target Retrieval Solution, High pH (10x) (nr kat. K8000/K8004/K8010).W trakcie przygotowywania
oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć.
Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków tkankowych, które zostały
odparafinowane, zalecany jest odczynnik Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera
Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link.
Dla aparatów PT Link naleŜy stosować następujące parametry: Temperatura wstępnego ogrzewania: 65 °C;
temperatura i czas odmaskowania antygenu: 97 °C prz ez 20 (±1) minut; schłodzić do 65 °C. Wyj ąć statyw na
szkiełka ze zbiornika PT i natychmiast zanurzyć szkiełka w słoju/zbiorniku (np. PT Link Rinse Station, nr kat. PT109)
wypełnionym rozcieńczonym, doprowadzonym do temperatury pokojowej buforem EnVisionTM FLEX Wash Buffer
(10X) (nr kat. K8000/K8010). Zostawić szkiełka w buforze płuczącym na 1-5 minut.
Procedura barwienia
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Rozcieńczanie: Przeciwciała Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone SP1 moŜna stosować w rozcieńczeniu
1:200 na poddanych wstępnej obróbce utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinieskrawkach przy
20-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej. Zalecane jest rozcieńczanie przeciwciał w odczynniku Dako
Antibody Diluent (nr kat. S0809). Są to jednak wyłącznie wytyczne. Optymalne warunki mogą się zmieniać w
zaleŜności od rodzaju materiału i sposobów jego przygotowania i powinny być określone indywidualnie w kaŜdym
laboratorium. Zalecana kontrola ujemna to odczynnik Dako Negative Control, Rabbit Immunoglobulin Fraction (SolidPhase Absorbed) (nr kat. X0936), rozcieńczony do takiego samego stęŜenia białek, co przeciwciało główne. O ile nie
potwierdzono stabilności rozcieńczonych przeciwciał i kontroli ujemnej w rzeczywistej procedurze wykonania
odczynu, zaleca się rozcieńczenie tych odczynników bezpośrednio przed uŜyciem. Wraz z próbkami od pacjentów
powinny być oznaczane kontrole ujemne.
Wraz z próbkami od pacjentów powinny być oznaczane dodatnie i ujemne kontrole tkankowe. Dodatnia kontrola
tkankowa powinna obejmować łagodne zmiany na szyjce macicy, natomiast we wszystkich dodatnich preparatach
komórki powinny wskazywać odczyn reakcji taki jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka działania”.
Swoisty odczyn powinien być widoczny w jądrach większości komórek w warstwie podstawowej nabłonka płaskiego.
Wizualizacja: Dako EnVisionTM FLEX, High pH (nr kat. K8000/K8010) jest zalecany przy 20-minutowej inkubacji w
temperaturze pokojowej. Postępować zgodnie z procedurą dostarczoną z wybranymi systemami do wizualizacji.
Automatyzacja: Przeciwciała dobrze nadają się do wykonywania odczynów immunohistochemicznych w systemach
zautomatyzowanych takich, jak Dako Autostainer, Autostainer Plus oraz Autostainer Link.
Interpretacja
wybarwienia
Przeciwciała dają odczyn jądrowy. Występujące niekiedy barwienie cytoplazmy uwaŜa się za nieswoisty odczyn tła.
Dodatni wynik badania definiuje się jako odczyn jądrowy w ≥1% komórek nowotworowych (5).
Ograniczenia swoiste
dla opisywanego
produktu
1. Wyniki fałszywie ujemne mogą być spowodowane procesem stopniowego rozkładu antygenu w tkankach. JeŜeli
próbki przechowywano w temperaturze pokojowej, powinny być poddane barwieniu w ciągu 2 miesięcy od
osadzenia preparatów tkankowych na szkiełkach (6).
2. W celu uzyskania optymalnych, powtarzalnych wyników, w preparatach utrwalanych standardowo (w obojętnej
buforowanej formalinie) i zatapianych w parafinie naleŜy zastosować odmaskowanie antygenu białka ER.
3. Nie przeprowadzono weryfikacji stosowania Dako Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone SP1 na tkankach
utrwalanych środkami innymi niŜ formalina.
Charakterystyka
działania
Precyzja: Do badań zgromadzono seryjne skrawki z kaŜdego z trzech róŜnych, utrwalonych w formalinie i
zatopionych w parafinie bloków raka sutka. Badanie przeprowadzono w następujący sposób:
Precyzja w obrębie serii: Zgodnie ze standardowym protokołem EnVisionTM FLEX, High pH, za pomocą Monoclonal
Rabbit Anti-Human ER α, Clone SP1 wykonano barwienie trzech preparatów z kaŜdego bloku tkankowego.
Jednocześnie, jeden preparat z kaŜdego bloku został poddany barwieniu kontrolą ujemną.
Precyzja między seriami: Przeprowadzając barwienie jednego preparatu z kaŜdego bloku tkankowego, powyŜszą
procedurę powtarzano przez dodatkowe dwa dni. Jednocześnie, jeden preparat z kaŜdego bloku został poddany
barwieniu kontrolą ujemną.
Eksperymenty określające precyzję przy stosowaniu przeciwciał Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone SP1
dały wyniki spójne z uzyskanymi w badaniach określających precyzję w serii i pomiędzy seriami. W trakcie badania
utrzymywano identyczne wyniki testu a pomiędzy seriami testów odczynniki przechowywano w temperaturze 2-8 °C.
Odtwarzalność między laboratoriami: Badania i ocenę odtwarzalności między laboratoriami przeprowadzono w
trzech, róŜnych lokalizacjach. Piętnaście próbek raka sutka (5 ujemnych (0% odczynu jądrowego w komórkach
nowotworowych), 1 słabo dodatnia (1-9% odczynu jądrowego w komórkach nowotworowych) i 9 dodatnich (>10%
odczynu jądrowego w komórkach nowotworowych)) zostało wybarwionych przeciwciałami Monoclonal Rabbit AntiHuman ER α, Clone SP1 i ocenionych w trzech lokalizacjach. Ocenę przeprowadzono z uŜyciem metody opisanej
przez Diaz et al. Pomiędzy parą porównawczą kaŜdej lokalizacji uzyskano całkowitą zgodność równą 100% (95%
C.I.: 78,2 – 100%).
Tkanki prawidłowe: Tabela 1 zawiera podsumowanie immunoreaktywności ER α w zalecanym panelu tkanek
prawidłowych. Wszystkie tkanki były utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie oraz wybarwione przeciwciałami
Anti-Human Estrogen Receptor α (ER α), Clone SP1 zgodnie z instrukcjami zamieszczonymi w ulotce dołączonej
do opakowania.
(118782-002)
307002PL_002 p. 2/4
Tabela 1: Podsumowanie immunoreaktywności ER α tkanek prawidłowych (7)
Rodzaj tkanki
(liczba testowanych przypadków)
Składniki komórkowe dające dodatni odczyn
Nadnercza (3)
(0/3)
Szpik kostny (3)
(0/3)
Gruczoły sutkowe (2)
(2/2) Nabłonek przewodowy
Mózg/móŜdŜek (2)
(0/2)
Mózg/mózgowie (3)
(0/3)
Szyjka macicy (2)
(1/2) Błona śluzowa (nabłonek płaski) i zrąb
Szyjka macicy (2)
(1/2) Warstwa podśluzówkowa
Jelito grube (2)
(0/2)
Przełyk (3)
(0/3)
Serce (3)
(0/3)
Nerki (3)
(0/3)
Wątroba (3)
(0/3)
Płuca (3)
(0/3)
Komórki międzybłonka (2)
(0/2)
Nerwy obwodowe (2)
(0/2)
Jajniki (2)
(1/2) Zrąb
Trzustka (3)
(0/3)
Przytarczyce (3)
(0/3)
Przysadka mózgowa (3)
(0/3)
Gruczoł krokowy (2)
(0/2)
Ślinianki (3)
(0/3)
Mięśnie szkieletowe (3)
(0/3)
Skóra (3)
(0/3)
Jelito cienkie (3)
(0/3)
Śledziona (3)
(0/3)
śołądek (3)
(0/3)
Jądra (3)
(0/3)
Grasica (3)
(0/3)
Tarczyca (2)
(0/2)
Migdałki (3)
(0/3)
Macica (2)
(2/2) Nabłonek gruczołowy śluzówki macicy, zrąb
i mięśniówka macicy
Tkanki nieprawidłowe: Badania utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie skrawków tkankowych raka sutka
wykazały, Ŝe przeciwciała anty-ER α, Clone SP1, są uŜyteczne w prezentacji statusu ER α. Do określenia
dodatniego/ujemnego statusu ER przyjęto punkt odcięcia na poziomie ≥1% komórek dodatnich (9). Bezpośrednie
badania porównawcze przeciwciał anty-ER α, Clone SP1 i anty-ER, Clone 1D5 przeprowadzono na utrwalonych w
formalinie, zatopionych w formalinie mikromacierzach tkankowych, zawierających 272 próbki raka sutka oraz 119
raków sutka. W badaniu mikromacierzy tkankowej, odsetek wyników dodatnich dla SP1 wyniósł 78,68% w
porównaniu do 69,85% dla 1D5. W całym badaniu próbek raka sutka uzyskano odsetek wyników dodatnich równy
84,03% dla SP1 i 78,15% dla 1D5 (8). Istnieją doniesienia wskazujące, Ŝe uŜycie przeciwciał anty-ER α, Clone SP1
pozwala na uzyskanie informacji prognostycznych odnośnie odpowiedzi na terapię hormonalną (9).
Porównanie metod: Badanie przeprowadzono w dwóch lokalizacjach. Badanie ER α, SP1 przeprowadzono przy
uŜyciu EnVisionTM FLEX i oceniono z wykorzystaniem metody opisanej przez Diaz et al, a badanie ER 1D5/2-123
przeprowadzono przy uŜyciu ER/PR pharmDx™ Kit i oceniono na podstawie wytycznych dotyczących
przeprowadzania oceny Allred, zamieszczonych w ulotce dołączonej do opakowania. Dane uzyskane w wyniku
porównania metod przedstawiono w Tabelach 2 i 3.
Tabela 2: Zgodność w lokalizacji badania 1
Składnik ER ER/PR pharmDx
ER Clone SP1
Dodatni
Ujemny
Razem
69
6
75
Ujemny
0
34
34
Razem
69
40
109
Dodatni
Współczynnik zgodności wyników dodatnich = (69)/(69+0) = 69/69 = 1,0, przy przedziale ufności 95%, w zakresie
0,9479 - 1,0.
Współczynnik zgodności wyników ujemnych = (34)/(6+34) = 34/40 = 0,85, przy przedziale ufności 95%, w zakresie
0,7016 - 0,9429.
Całkowity współczynnik zgodności = (69+34)/(69+6+0+34) = 103/109 = 0,9449, przy przedziale ufności 95%,
w zakresie 0,8840 - 0,9795.
(118782-002)
307002PL_002 p. 3/4
Tabela 3: Zgodność w lokalizacji badania 2
Składnik ER ER/PR pharmDx
ER Clone SP1
Dodatni
Ujemny
Dodatni
27
1
Razem
28
Ujemny
7
84
91
Razem
34
85
119
Współczynnik zgodności wyników dodatnich = (27)/(27+7) = 27/34 = 0,7941, przy przedziale ufności 95%,
w zakresie 0,6210 - 0,9130.
Współczynnik zgodności wyników ujemnych = (84)/(1+84) = 84/85 = 0,9882, przy przedziale ufności 95%,
w zakresie 0,9362 - 0,9997.
Całkowity współczynnik zgodności = (27+84)/(27+1+7+84) = 111/119 = 0,9328, przy przedziale ufności 95%,
w zakresie 0,8718 - 0,9705.
Parametry kliniczne: Do określenia parametrów klinicznych działania przeciwciał Dako Monoclonal Rabbit AntiHuman Estrogen Receptor α (ER α), Clone SP1 wykorzystano badanie opublikowane w Journal of Clinical Oncology
. Status receptora estrogenowego oceniono na podstawie pobranych od pacjentów, utrwalonych w formalinie i
zatopionych w parafinie 4150 próbek raka sutka, z uŜyciem przeciwciał anty-ER α, Clone SP1 i anty-ER α, Clone
1D5. Do określenia dodatniego/ujemnego statusu ER przyjęto punkt odcięcia na poziomie ≥1% komórek dodatnich.
Współczynnik wyników dodatnich dla SP1 wyniósł 69,5% w porównaniu do 63,1% dla 1D5. Średnia waŜona
współczynnika dziesięcioletniego przeŜycia raka sutka (BCSS) w przypadku odsetka barwienia jądrowego komórek
nowotworowych na poziomie nie mniej niŜ 1% jest równa 76,5% (95% C.I.: 73,9- 79,0%) a w przypadku odsetka
barwienia jądrowego komórek nowotworowych na poziomie poniŜej 1% jest równa 65% (95% C.I.: 62-68%) (9).
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Kumar V, Green S, Stack G, Berry M, Jin J-R, Chambon P. Functional domains of the human estrogen receptor.
Cell 1987;51:941-951.
Elledge RM, Fuqua SAW. Ch. 31: Estrogen and Progesterone Receptors. Diseases of the Breast. Harris et al.
eds., Lippencott Williams & Wilkins 2000; 471-485.
Fitzgibbons FK, Page DL, Weaver D, Thor AD, Allred DC, Clark GM, Ruby SG, O’Malley F, Simpson JF,
Connolly JL, Hayes DF, Edge SB, Lichter A, Schnitt SJ. Prognostic factors in breast cancer: College of
American Pathologists consensus statement 1999. Arch Pathol Lab Med 2000; 124:966-978.
Huang Z, Zhu W, Szekeres G, Xia H. Development of new rabbit monoclonal antibody to estrogen receptor
immunohistochemical assessment on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Appl Immunohistochem
Mol Morphol 2005;91-95.
Diaz LK, Sneige N. Estrogen receptor analysis for breast cancer: current issues and keys to increasing testing
accuracy. Adv Anat Pathol. 2005 Jan;12(1):10-9. Review.
Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry;
Approved guideline. Approved guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5)-CLSI, 940 west Valley Road,
Suite 1400. Wayne, PA 19087-1898 USA 1999
M3634 IHC003-149 Report on file.
Treaba DO, Hing AW, Goldstein LC, Barry TS, Kandalaft P, Gilks CB, Nielsen TO, Gown AM. Significantly
improved sensitivity for ER detection in breast cancer using a new rabbit monoclonal anti-ER antibody (SP1).
Modern Pathology 2005; 18, suppl.1,pag 53A
Cheang MCU, Treaba DO, Speers CH, Olivotto IA, Bajdik CD, Chia SK, Goldstein LC, Gelmon KA, Huntsmann
D, Gilks CB, Nielsen TO, Gown AM. Immunohistochemical detection using the new rabbit monoclonal antibody
SP1 of estrogen receptor in breast cancer is superior to mouse monoclonal antibody 1D5 in predicting survival.
J Clin Oncol 2006;24:5637-5644.
Wydanie 05/09
(118782-002)
307002PL_002 p. 4/4