INŻYNIERIA BIAŁKA

Ćwiczenie 9
Sonikacja komórek bakteryjnych i oczyszczanie białka BLG B przy pomocy chromatografii
jonowymiennej
Roztwory wykorzystywane do oczyszczania białka:
A. 50 mM bufor fosforanowy pH 6.5
B. 50 mM bufor fosforanowy pH 6.5 + 1 M NaCl
C. 100 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) w izopropanolu
Bufor do przygotowania próbek do SDS-PAGE:
a. bufor obciążający do SDS-PAGE (0.5 M Tris-HCl pH 6.8, 10% glicerol, 2% SDS, 5% βmerkaptoetanol, 0.05% błękit bromofenolowy)
Sonikacja komórek E.coli i oczyszczanie białka BLG B (β-laktoglobuliny):
1. osad z hodowli bakteryjnej rozmrozić na lodzie, a następnie zawiesić w buforze A +1 mM
PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) w stosunku: 20 ml buforu na 1.5 g hodowli
bakteryjnej,
2. zawiesinę komórek sonikować 6 x 40 s, cały czas trzymając próbkę na lodzie, aby nie
dopuścić do wzrostu temperatury;
3. zwirować zawiesinę po sonikacji, wirówka laboratoryjna 3K30 (Sigma), (30 min., 30 000xg,
4 C),
4. zrównoważyć kolumnę XK 16/20 (GE Healthcare Life Sciencies) wypełnioną 10 ml złoża
Fractogel EMD TMAE (S) (Merck) poprzez przemycie jej buforem A, 5 x objętość
kolumny, przepływ 3.0 ml/min.; do rozdziału jest wykorzystywana pompa Econo Gradient
Pump (Bio-Rad);
5. nadsącz uzyskany po wirowaniu nałożyć na zrównoważoną kolumnę, prędkość przepływu
3.0 ml/min; równocześnie zbierać przebicie;
6. odmyć słabo związane białka (bufor A, 5 x objętość kolumny), przepływ 3.0 ml/min.;
7. elucja związanych ze złożem białek przy pomocy mieszaniny buforów A i B (liniowy
gradient NaCl), prędkość przepływu 3.0 ml/min. Równocześnie zbierać frakcje po 2 ml za
pomocą kolektora frakcji, model 2128 (Bio-Rad);
8. po rozdziale kolumnę przemyć wodą miliporowaną, prędkość przepływu 3.0 ml/min. Jeżeli
kolumna przez dłuższy czas nie będzie wykorzystywana pozostawić ją w 20% etanolu;
9. rozdział prowadzić w temperaturze pokojowej, ale zastosowane bufory powinny mieć
temperaturę 4 C;
1
10. przygotować próbki do elektroforezy białkowej (SDS-PAGE) mieszając je w stosunku 1:4
(10 μl frakcji po rozdziale i 40 μl buforu) z buforem obciążającym, a następnie wstawić do
termobloku o temp. 95˚C na 5 min. Tak przygotowane próbki przechowywać w 4 C do
następnych ćwiczeń z elektroforezy białkowej.
11. otrzymane po rozdziale frakcje zawierające białko przenieść do -80 C.
Zagadnienia do sprawozdania (sprawozdanie obejmuje materiał z ćw. 9, 10, 11):
A. Proszę wymienić zalety i wady poniższych metod dezintegracji komórek bakteryjnych:
a. homogenizacja,
b. liza enzymatyczna.
B. Na dotychczasowych zajęciach, do oczyszczania DNA plazmidowego wykorzystywano
metodę lizy alkalicznej lub oczyszczanie na kolumienkach wypełnionych złożem
krzemionkowym. Proszę zaproponować, w jaki sposób można oczyścić DNA wykorzystując
chromatografię jonowymienną;
C. Chromatogram przedstawia oczyszczania aminotransferazy asparaginowej i dehydrogenazy
jabłczanowej na kolumnie wypełnionej CM-Sephadexem o pH 6.8 (CM - gr.
karboksymetylowa). Linia przerywana: absorbancja przy 280 nm; kółka: aktywność
aminotransferazy asparaginowej; trójkąty: aktywność dehydrogenazy jabłczanowej.
Wstępnie oczyszczony ekstrakt białkowy zawierający oba enzymy wprowadzono do
kolumny wypełnionej CM-Sephadex i zastosowano elucję gradientową. Który z enzymów –
aminotransferaza czy dehydrogenaza, jest bardziej zasadowy? Jakiego wyniku należałoby
się spodziewać, gdyby oba białka poddano chromatografii jonowymiennej na DEAEcelulozie przy pH 6.8 (DEAE – gr. dietyloaminoetylowa)?
2