Ekspresja antygenu Fas i FasL na limfocytach T i B w przeroslych

Ekspresja antygenu Fas i FasL na limfocytach T i B
w przerosłych migdałkach gardłowych u dzieci
chorych na wysiękowe zapalenie ucha
Expression Fas and FasL antigen protein of lymphocytes T and B
in hypertrophied adenoid in children with otitis media with effusion
Beata Żelazowska-Rutkowska1, Jolanta Wysocka1, Karol Ratomski1, Bożena Skotnicka2,
Janusz Żak1, Małgorzata Mrugacz3
1Zakład
Laboratoryjnej Diagnostyki Pediatrycznej AM w Białymstoku
Kierownik: prof. dr hab. J. Wysocka
2Klinika Otolaryngologii Dziecięcej AM w Białymstoku
Kierownik: prof. dr hab. E. Hassmann-Poznańska
3Klinika Okulistyki Dziecięcej AM w Białymstoku
Kierownik: prof. dr hab. A. Bakunowicz-Łazarczyk
Summary
Introduction. Apoptosis of lymphocytes can be induced by different factors mainly however the activation of antigen
Fas (CD95) and his ligand FasL (CD95L) route. Apoptosis induced by Fas-FasL has large significance in elimination of
lymphocytes T in final phase immune response designate AICD (activation induced cell death). Lymphocytes B undergo
apoptosis induced by Fas-FasL in germinal center, which has special meaning in elimination of cells about low specificity
and weak affinity of receptor BCR ( B-cell antigen receptor). Aim of study. The aim of this study was evaluation of percentage of apoptotic lymphocytes and expression of Fas and FasL in CD4+, CD8+, CD19+ lymphocytes in hypertrophied
adenoid and hypertrophied adenoid and otitis media with effusion. Methods. CD4+ Fas+, CD8+Fas+, CD19+Fas+ CD4+
FasL+, CD8+FasL+, CD19+FasL+ cells subpopulation were identified using monoclonal antibodies and flow cytometry
method. Results. The percentage of lymphocytes CD4+ Fas+, CD8+Fas+, CD19+Fas+ was higher in hypertrophied
adenoid and otitis media with effusion compored to the control group. Their was no significant difference the percentage
CD4+ Fas+, CD8+Fas+, CD19+Fas+ CD4+ FasL+, CD8+FasL+, CD19+FasL+ in hypertrophied adenoid and otitis media
with effusion then the control group. The percentage of apoptotic lymphocytes was higher in hypertrophied adenoid and
otitis media with effusion compored to the control group. Conclusions. The susceptibility the individual subpopulation of
lymphocytes in hypertrophied adenoid seems to influence on change of relations of quantitative lymphocytes and upset
the immunological function of tonsils which can influence on course otitis media with effusion at children.
H as ł a i n d e ks owe : apoptoza, wysiękowe zapalenie ucha, cytometria przepływowa
Ke y w ord s : apoptosis, otitis media with effusion, flow cytometry
Otolaryngol Pol 2008; LXII (1): 59–64 © 2008 by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów – Chirurgów Głowy i Szyi
WSTĘP
Podczas odpowiedzi immunologicznej antygenowo-specyficzne limfocyty T i B ulegają
intensywnej proliferacji rozwijając swoje funkcje
efektorowi, jak wydzielanie przeciwciał, cytotoksyczność lub wytwarzanie cytokin. Aby ochronić własne tkanki przed uszkodzeniem przez te
mechanizmy, po zakończeniu odpowiedzi immunologicznej efektorowe aktywowane limfocyty są
Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.
Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1
59
B. Żelazowska-Rutkowska i inni
usuwane między innymi w procesie apoptozy [21,
27].
Apoptoza limfocytów może być indukowana
przez wiele czynników, jednak główną rolę w tej
indukcji pełni aktywacja receptora śmierci Fas
(CD95) przez jego ligand (CD95L). Proces apoptozy
zależny od CD95 zachodzi przy udziale dwóch różnych mechanizmów. W typie I droga aktywacji omija
mitochondria, a w typie II kontrolowanym przez
antyapoptotyczne białka należące do rodziny Bcl-2
dochodzi do aktywacji mitochondriów [1, 19].
Fas jest transmembranową glikoproteiną typu I
(50kDa) występującą konstytutywnie na powierzchni limfocytów, należącą do rodziny receptorów TNF
(tumor necrosis factor)/NGT (nerve growth factor).
FasL typ II transmembranowego białka (40kDa) nie
występuje na limfocytach spoczynkowych, ulega
on ekspresji podczas aktywacji limfocytów T i B i
komórek NK [6, 10].
Aktywowanie receptora Fas przez komplementarną cząsteczkę Fas ligand rozpoczyna wewnątrzkomórkowy szlak przemian. Po związaniu z ligandem dochodzi do oligomeryzacji cząsteczek receptora, a następnie sygnał przekazywany jest przez ich
wewnątrzcytoplazmatyczną część zwaną domeną
śmierci DD (death domain). Powoduje to aktywację
wielu białek adapterowych i powstania wielkocząsteczkowego kompleksu określanego mianem DISC
(death-inducing signaling complex). Służy on jako
platforma inicjacji enzymatycznego mechanizmu
apoptozy. Następnie dochodzi do wzajemnej proteolitycznej aktywacji cząsteczkowej kaspazy 8, która
uruchamia kolejne cząsteczki innych kaspaz inicjując całą kaskadę kaspaz aż do aktywacji efektorowej
kaspazy 3 [4, 11].
Apoptoza indukowana przez wiązanie Fas-FasL
ma największe znaczenie w eliminacji limfocytów
T w końcowej fazie odpowiedzi immunologicznej
nazywanej „śmiercią komórki indukowaną aktywacją” (AICD – activation induced cell death [1, 10,
12].
Limfocyty B ulegają apoptozie indukowanej przez
wiązanie Fas-FasL w ośrodkach rozmnażania, co ma
szczególne znaczenie w eliminacji komórek o niskiej
swoistości i słabym powinowactwie receptora BCR
[3, 8, 18, 25].
Celem pracy była ocena nasilenia apoptozy limfocytów w przerosłych migdałkach gardłowych u dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha trwające
ponad trzy miesiące przez ocenę odsetka limfocytów
apoptotycznych i limfocytów T (CD4+ i CD8+) i
B(CD19+) z ekspresją antygenu Fas i FasL.
60
MATERIAŁ I METODY
Grupę badaną stanowiło 42 dzieci w wieku od
1 do 17 r.ż. z przerostem migdałka gardłowego chorych na wysiękowe zapalenie ucha trwające ponad
3 miesiące. Z powodu braku postępów w leczeniu
dzieci te zakwalifikowano do zabiegu adenoidektomii. Grupę porównawczą stanowiło 40 dzieci obojga
płci w wieku od 1 do 17 r.ż. z przerostem migdałka
gardłowego, u których nie stwierdzono stanu zapalnego uszu.
Kwalifikację chorych oraz adenoidektomię przeprowadzono w Klinice Otolaryngologii Dziecięcej
Akademii Medycznej w Białymstoku.
Migdałki gardłowe natychmiast po adenoidektomii poddano mechanicznemu rozdrobnieniu w celu
uzyskania zawiesiny komórek, której gęstość oceniano w analizatorze hematologicznym Sysmex XT
2000i. Do analizy użyto zawiesiny komórek o gęstości 4-10 x103/ μl. Wyizolowane komórki jednojądrzaste w formie zawiesiny w PBS poddano znakowaniu
przeciwciałami monoklonalnymi. Przeprowadzono
znakowanie antygenów na powierzchni komórki,
dodając do 100 μl zawiesiny 10 μl przeciwciał
monoklonalnych (anty-CD4-FITC, anty-CD8-FITC,
anty-CD19-FITC, anty-CD95-PE, anty-CD95L-PE).
Następnie przeprowadzono 15 min. inkubację w
temp. pokojowej. Po inkubacji dodawano odczynniki lizujące erytrocyty i ponownie przeprowadzono
inkubacje. Komórki płukano PBS zawierającym 0,1%
azydku sodu i 1 % albuminy wołowej wirując przez
5 min. przy 2000 obr./min., a następnie poddawano
analizie cytometrycznej.
Po dokładnym wymieszaniu, próbki oceniano na
cytometrze przepływowym EPICS XL Coulter, wyposażonym w laser argonowy emitujący promieniowanie o długości fali 488 nm.
Oceniano również odsetek komórek apoptotycznych zestawem Apoptest.
Badane komórki płukano w PBS i zawieszano w
buforze w stężeniu 105–106 komórek/ml. Następnie do
96 μl zawiesiny komórek dodawano 1 μl AnneksynyV sprzężonej z fluoresceiną oraz 2,5 μl jodku propidyny (PI) i inkubowano przez 10 min w ciemności.
Po inkubacji do próby dodawano 250 μl buforu i
bezpośrednio mierzono fluorescencję komórek wykorzystując metodę cytometrii przepływowej.
We wczesnej fazie apoptozy na powierzchni
komórki dochodzi do utraty asymetrii fosfolipidów
błony komórkowej spowodowanej translokacją fosfatydyloseryny z wewnętrznej na zewnętrzną stronę
błony komórkowej. Zjawisko to jest charakterystyczne
Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1
Ekspresja antygenu Fas i FasL
dla procesu apoptozy, ale zachodzi również podczas
nekrozy komórki. Różnicując dwie formy śmierci
komórki można wykorzystać właściwości Anneksyny
V, białka, które w obecności jonów Ca2+i Mg2+ wiąże
się z fofadyloseryną i jednocześnie stosując jodek
propidyny, który wnika do wnętrza komórki, weryfikując integralność błony komórkowej [5, 15].
Jednoczesne dodanie Anneksyny V oraz jodku
propidyny pozwala różnicować populację komórek
żywych (nie barwiącym się żadnym flurochromem)
od komórek w początkowym stadium apoptozy
(barwiących się jedynie Anneksyny V) oraz komórek chłonących jodek propidyny i wiążących się z
Anneksyny V, czyli komórek martwiczych [2, 15].
Wyniki przeprowadzonych badań podano jako
procent pozytywnych komórek w poszczególnej próbie badanej. Różnice dla p<0,05 uznano za znamienne statystycznie.
WYNIKI
Odsetek limfocytów apoptotycznych w grupie
dzieci z przerostem migdałka gardłowego i wysiękowym zapaleniem ucha (WZU) wynosił średnio
3,60 ± 1,13% i był istotnie statystycznie wyższy,
p < 0,001 niż w grupie dzieci z przerostem migdałka gardłowego (PMG), który wynosił średnio 2,55
± 0,72%. W podgrupie dzieci młodszych grupy
badanej (WZU1) odsetek limfocytów apoptotycznych stanowił 3,35 ± 1,20% i był znamiennie
statystycznie wyższy niż w analogicznej podgrupie dzieci grupy porównawczej (PMG1 – 2,48 ±
0,71%), p<0,04. Wykazano różnice znamiennie
statystyczną, p < 0,004 między grupą WZU2 (3,85
± 0,73%) a podgrupą PMG2 (2,63 ± 0,74%).
Odsetek limfocytów CD4+CD95+ u grupie dzieci
z przerostem migdałka gardłowego i wysiękowym
zapaleniem ucha (WZU) wynosił średnio 68,01 ±
8,13% i był nieznacznie wyższy w porównaniu z
grupą dzieci z przerostem migdałka gardłowego
(PMG), gdzie wynosił 65,00 ± 4,31%. W grupie
badanej dzieci młodszych WZU1 stwierdzono statystycznie znamiennie wyższy, p < 0,05 odsetek
limfocytów CD4+CD95+, którego wartość wynosiła
69,22 ± 6,71% w porównaniu z podgrupą dzieci
młodszych grupy porównawczej (PMG1-64,71 ±
5,05%). Nieznacznie wyższe wartości odsetka limfocytów CD4+CD95+ obserwowano w podgrupie dzieci starszych grupy badanej (WZU2-66,20 ± 10,15%),
w porównaniu z podgrupą dzieci starszych grupy
porównawczej (PMG2-65,47 ± 6,28%).
Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1
Odsetek limfocytów CD8+CD95+ w grupie dzieci
z przerostem migdałka gardłowego i wysiękowym
zapaleniem ucha (WZU) wynosił średnio 33,24 ±
9,50%. Był on znamiennie statystycznie wyższy,
p < 0,05 względem grupy porównawczej (PMG28,01 ± 8,61%). W podgrupach dzieci młodszych i
dzieci starszych grupy badanej odsetek limfocytów
CD8+CD95+ był nieznacznie wyższy (WZU1-32,77
± 9,14%, WZU2-33,93 ± 10,67%) niż w analogicznych podgrupach grypy odniesienia (PMG1-29,27 ±
7,74%, PMG2-26,34 ± 9,87%), chociaż różnice te nie
były znamienne statystyczne.
Analiza statystyczna wykazała statystycznie znamiennie wyższy odsetek limfocytów CD19+CD95+,
p<0,02 w grupie badanej (WZU-24,98 ± 5,35%)
w porównaniu z grupą odniesienia (PMG-21,10 ±
4,25%). W podgrupie dzieci młodszych grupy badanej (WZU1) wartość ta wynosiła 23,73 ± 5,46% i była
wyższa niż w podgrupie dzieci młodszych grupy
porównawczej PMG1-21,19 ± 3,98%. W podgrupie
dzieci starszych grupy badanej WZU2 odsetek limfocytów CD19+CD95+ wynosił średnio 27,88 ± 4,83%
i był wyższy niż w podgrupie dzieci starszych grupy
porównawczej PMG2-22,44 ± 6,03%. Wykazano różnicę istotną statystycznie, p < 0,05 pomiędzy grupą
WZU2 a grupą PMG2.
Odsetek limfocytów CD4+CD95L+ w grupie dzieci z przerostem migdałka gardłowego i wysiękowym
zapaleniem ucha (WZU) wynosił średnio 2,85 ±
0,72% i był nieznacznie wyższy niż w grupie dzieci z przerostem migdałka gardłowego (PMG), który
wynosił średnio 2,70 ± 0,67%.W podgrupie dzieci
młodszych i dzieci starszych grupy badanej odsetek
limfocytów CD4+CD95L+ wynosił średnio (WZU13,03 ± 0,71%, WZU2-2,60 ± 0,71%) i był wyższy
niż w analogicznych podgrupach wiekowych dzieci
grupy odniesienia (PMG1-2,99 ± 0,62%, PMG2-2,32
± 0,55%). Wykazano różnice znamiennie statystyczną, p < 0,02 między grupą PMG1 a PMG2.
Odsetek limfocytów CD8+CD95L+ w grupie badanej wynosił średnio (WZU 2,89 ± 0,92%) i był zbliżony do grupy porównawczej (PMG-2,90 ± 0,32%).
W podgrupie dzieci młodszych grupy badanej WZU1
odsetek limfocytów CD8+CD95L+wynosił 3,00 ±
0,98% i był nieco wyższy niż w grupie porównawczej
dzieci młodszych PMG1-2,70 ± 0,95%. W podgrupie
dzieci starszych grupy badanej WZU2 odsetek limfocytów CD8+CD95L+ wynosił 2,72 ± 0,85% i był
nieco niższy niż w podgrupie dzieci starszych grupy
porównawczej PMG2 (3,19 ± 0,55%).
Wartość odsetka subpopulacji limfocytów
CD19+CD95L+ w grupie dzieci z przerostem mig-
61
B. Żelazowska-Rutkowska i inni
Tabela I. Odsetek limfocytów CD4+CD95+, CD8+CD95+, CD19+CD95+, CD4+CD95L+, CD8+CD95L+,
CD19+CD95L+ oraz limfocytów apoptotycznych w badanych migdałkach gardłowych dzieci z przerostem migdałka gardłowego i wysiękowym zapaleniem ucha (WZU) oraz z przerostem migdałka gardłowego (PMG).
Subpopulacja
limfocytów
X±SD
Grupa
badana (WZU)
Dzieci
młodsze (WZU1)
Dzieci
starsze (WZU2)
Grupa porównawcza PMG
Dzieci
młodsze (PMG1)
Dzieci
starsze (PMG2)
Analiza statystyczna:
CD4+CD95+ CD8+CD95+ CD19+CD95+ CD4+CD95L+ CD8+CD95L+ CD19+CD95+
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
68,01±8,13 33,24±9,50(2) 24,98±5,35(3)
2,85±0,72
2,89±0,92
5,53±0,91
3,60±1,13(6)
3,03±0,71
3,00±0,98
5,46±1,05
3,35±1,20(7)
66,20±10,15 33,93±10,67 27,88±4,83(4)
2,60±0,71
2,72±0,85
5,62±0,75
3,58±0,73(8)
65,00±4,31 28,01±8,61(2) 21,10±4,25(3)
2,70±0,67
2,90±0,32
5,08±1,04
2,55±0,72(6)
2,99±0,62(5)
2,70±0,95
5,19±0,78
2,48±0,71(7)
26,34±9,87 22,44±6,03(4) 2,32±0,55(5)
3,19±0,55
4,94±1,36
2,63±0,74(8)
69,22±6,71(1) 32,77±9,14
64,71±5,05(1) 29,27±7,74
65,47±6,28
23,73±5,46
21,19±3,98
CD4+CD95+
CD8+CD95+
CD19+CD95+
CD19+CD95+
CD4+CD95L+
AnnV
AnnV
AnnV
dałka gardłowego i wysiękowym zapaleniem ucha
(WZU) wynosiła 5,53 ± 0,91% i była nieznacznie
wyższa w porównaniu do grupy dzieci z przerostem
migdałka gardłowego (PMG-5,08 ± 1,04%). Różnica
ta nie były istotna statystycznie.
Nieco wyższe wartości odsetka limfocytów
CD19+CD95L+ stwierdzono w podgrupie dzieci
młodszych grupy badanej (WZU1-5,46 ± 1,05%)
w porównaniu z podgrupą dzieci młodszych grupy
odniesienia (PMG1- 5,19 ± 0,78%). W podgrupie
dzieci starszych (WZU2) średnia wartość limfocytów wynosiła 5,62 ± 0,75% i była wyższa niż w
podgrupie dzieci starszych PMG2-4,94 ± 1,36%
(tab. I).
DYSKUSJA
Apoptotycznej śmierci komórki towarzyszą zmiany strukturalne błony plazmatycznej polegające na
ekspozycji na jej powierzchni fosfatydyloseryny (PS
– phosphatidyloserine). W tym czasie nie dochodzi
do utraty integralności błony plazmatycznej [24].
Ekspozycja PS występuje bezpośrednio po rozpoczę-
62
AnnV (%)
1)WZU wzg. PMG
1
1
2)WZU wzg. PMG
3)WZU wzg. PMG
4)WZU wzg. PMG
2
2
5)PMG wzg. PMG
1
2
6)WZU wzg. PMG
7)WZU wzg. PMG
1
1
8)WZU wzg. PMG
2
2
p < 0,05
p < 0,05
p < 0,02
p < 0,05
p < 0,02
p < 0,001
p < 0,04
p < 0,004
ciu fazy wykonawczej apoptozy, wobec czego eksternalizacja PS jest uważana za „wczesny” objaw apoptozy [2, 5]. Ze względu na to, że ekspozycja PS występuje podczas apoptozy różnych rodzajów komórek
i że PS wykazuje powinowactwo do Anneksyny V,
zjawisko to zostało wykorzystane do wykrywania
komórek ulegających apoptozie [2, 24].
Nasilenie apoptozy limfocytów, mierzone odsetkiem komórek barwiących się Anneksyną V, było
większe w przerosłych migdałkach gardłowych dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha w porównaniu z grupą bez stanu zapalnego ucha. Podobnie
kształtowało się nasilenie apoptozy w podgrupach
wiekowych.
W dalszych badaniach oceniano odsetek limfocytów T (CD4+ i CD8+) oraz limfocytów B (CD19+)
wykazujących ekspresją receptora śmierci Fas i jego
liganda FasL.
Odsetek limfocytów T (CD4+) wykazujących
ekspresję Fas w grupie dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha był wyższy niż w grupie dzieci
bez stanu zapalnego ucha. Szczególnie wysoki
odsetek tych limfocytów był w podgrupie dzieci
młodszych i różnił się statystycznie znamiennie
Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1
Ekspresja antygenu Fas i FasL
w porównaniu z podgrupą dzieci młodszych bez
stanu zapalnego ucha.
Również odsetek limfocytów TCD8+ z ekspresją
Fas był statystycznie znamiennie wyższy w podgrupie dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha w
porównaniu z grupą odniesienia.
Natomiast odsetek limfocytów T (CD4+ i CD8+) z
ekspresją FasL był zbliżony w obu grupach badanych
i podgrupach wiekowych dzieci.
Czynniki wpływające na żywotność limfocytów T zmieniają się w zależności od typu i stanu,
w jakim znajdują się te komórki. Naiwne limfocyty
T nie wykazują ekspresji receptora Fas i umierają
zależnie od mechanizmu zależnego od Bcl-2/Bim
[12]. Głównym mechanizmem, od którego zależy
śmierć aktywowanych limfocytów T, są sygnały
docierające do nich przez powierzchniowy receptor Fas [1, 10, 12].
Limfocyty T, wśród których przeważają limfocyty CD4+, umiejscowione są głównie w przestrzeni międzygrudkowej migdałków. Po kontakcie
z komórkami prezentującymi antygen i interakcji różnych cząstek kostymulujących dochodzi
do pobudzenia i proliferacji limfocytów T [14].
Pobudzone limfocyty T wykazują ekspresję Fas [1],
który po połączeniu z FasL inicjuje proces apoptozy [1, 10, 12]. Proces ten zachodzi w końcowej fazie
odpowiedzi immunologicznej.
Z badań immunohistochemicznych Stratera i
wsp. [20] oraz Zakrzewskiej i wsp. [26] wynika,
że w migdałkach większość komórek wykazujących ekspresję mRNA CD95L była zlokalizowana
pod nabłonkiem krypt, a w nieco mniejszej ilości
komórki takie występowały w przestrzeni międzykomórkowej. Tateyama i wsp. [22] uważają, że
ważnym czynnikiem regulującym są limfocyty T
CD4+FasL+, gdyż limfocyty CD4+i CD8+ po kontakcie z nimi ulegały apoptozie.
Wyższy odsetek limfocytów T CD4+ i CD8+
wykazujących ekspresję receptora śmierci Fas w
przerosłych migdałkach gardłowych dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha może świadczyć o większym nasileniu apoptozy aktywowanych limfocytów, co z kolei może być przyczyną
zaburzonej lokalnej odpowiedzi immunologicznej
przerosłych migdałków gardłowych obejmującej
ucho środkowe.
Odsetek limfocytów B z ekspresją Fas w grupie badanej był statystycznie znamiennie wyższy
niż w grupie odniesienia. W podgrupach dzieci
młodszych odsetek ten był zbliżony, natomiast w
podgrupie dzieci starszych chorych na wysięko-
Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1
we zapalenie ucha był statystycznie znamiennie
wyższy niż w podgrupie dzieci starszych bez stanu
zapalnego ucha. Odsetek limfocytów B z ekspresją
FasL był zbliżony w obu grupach badanych i podgrupach wiekowych.
Nasilenie apoptozy limfocytów B ma znaczenie w odpowiedzi humoralnej [21] migdałków.
Decyzja pomiędzy śmiercią komórki a przeżyciem
jest podejmowana już we wczesnym okresie rozwoju limfocytów B [7]. W ośrodkach rozmnażania
apoptoza limfocytów B dotyczy komórek o niskiej
swoistości i brakiem powinowactwa receptora BCR
[18]. Limfocyty B w ośrodkach rozmnażania, szczególnie proliferujące centroblasty, wykazują fenotyp
charakterystyczny dla komórek wrażliwych na
apoptozę, mianowicie niską zawartość antyapoptotycznego Bcl-2 [13] i wysoką ekspresję cząsteczek
indukujących śmierć takich jak Fas, Bax, c-Myc i
p53 [7, 18]. Uważa się, że ponad 90% limfocytów
B w ośrodkach rozmnażania umiera w wyniku
apoptozy. Przeżywają jedynie te komórki, które
syntetyzują przeciwciała o wysokim powinowactwie i mogą się różnicować do komórek pamięci
lub komórek plazmatycznych [18].
Znacznie wyższy odsetek limfocytów B z ekspresją Fas w przerosłych migdałkach u dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha, zwłaszcza u
dzieci po 5 r.ż., wydaje się świadczyć o większym
nasileniu apoptozy tych limfocytów.
W migdałkach receptor Fas limfocytów B wiąże
się z FasL występującym na limfocytach T i B [9]
oraz na grudkowych komórkach dendrytycznych
[8, 20], głównie w strefie jasnej, gdzie zachodzi
selekcja centrocytów [25]. Chociaż komórki te pełnią raczej funkcję antyapoptotyczną wzmagają proliferację i różnicowanie limfocytów B w ośrodkach
rozmnażania [16]. Tsunoda i wsp. [23] uważają, że
w migdałkowych ośrodkach rozmnażania grudkowe komórki dendrytyczne są zdolne do regulacji
podatności limfocytów B na apoptozę. Wydaje się,
że odsetek limfocytów B z ekspresją FasL nie wpływa na nasilenie apoptozy limfocytów B u dzieci
chorych na wysiękowe zapalenie ucha, ponieważ
jest on zbliżony w obu grupach badanych i podgrupach wiekowych.
Prawidłowa funkcja immunologiczna migdałków gardłowych, które są źródłem komórek immunologicznie kompetentnych dla błon śluzowych
górnych dróg oddechowych, w tym ucha środkowego [17], zależy od wzajemnych stosunków ilościowych i jakościowych komórek biorących udział
w odpowiedzi immunologicznej.
63
B. Żelazowska-Rutkowska i inni
WNIOSKI
Jednym z ważnych procesów regulujących homeostazę migdałka gardłowego jest apoptoza. Podatność
poszczególnych subpopulacji limfocytów w przerosłych migdałkach gardłowych wydaje się wpływać
na zmianę stosunków ilościowych limfocytów, a tym
samym zaburzać funkcję immunologiczną migdałków, co może wpływać na przebieg wysiękowego
zapalenia ucha u dzieci.
PIŚMIENNICTWO
01. Baumann S, Krueger A, Kirchhoff S, Krammer PH. Regulation
of T cell apoptosis during the immune response. Curr Mol Med
2002; 2: 257–272.
02. Cornelissen M, Philippe J, De Sitter S, De Ridder L. Annexin
V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: an
electron microscopic evaluation. Apoptosis 2002; 7: 41–47.
03. Daniel PT, Oettinger U, Mapara YM, Bommert K, Bargou R,
Dorken B. Activation and activation-induced death of human
tonsillar B cells and Burkitt lymphoma cells: lack of CD95 (Fas/
APO-1) ligand expression and function. Eur J Immunol 1997;
27: 1029–1034.
04. Fadeel B, Orrenius S. Apoptosis: a basic biological phenomenon wide-ranging implications in human disease. J Intern Med
2005; 258: 479–517.
05. Gerbaulet A, Hartmann K, Mekori YA. Mast cell apoptosis.
Methods Mol Biol 2006; 315: 407–423.
06. Gupta S, Su H, Bi R, Agrawal S, Gollapudi S. Life and death
of lymphocytes: a role in immunesenescence. Immun Ageing
2005; 2: 12–26.
07. Guzman-Rojas L, Sims-Mourtada J, Rangel R, Martinez-Valdez
H. Life and death within germinal centres: a double – edged
sword. Immunology 2002; 107: 167–175.
08. Hur DY, Kim DJ, Kim S, Kim YY, Cho D, Lee DS, i wsp. Role of
follicular dendritic cells in the apoptosis in germinal center B
cells. Immunol Lett 2000; 72: 107–111.
09. Koopman G, Keehnen R M, Lindhout E, Zhou DF, de Groot
C, Pals ST. Germinal center B cells rescued from apoptosis by
CD40 ligation or attachment to follicular dendritic cells, but
not by engagement of surface immunoglobulin or adhesion
receptors, become resistant to CD95-induced apoptosis. Eur J
Immunol 1997; 27: 1–7.
10. Krueger A, Fas SC, Baumann S, Krammer PH. The role of CD95
in the regulation of peripheral T-cell apoptosis. Immunol Rev
2003; 193: 58–69.
11. Lavrik IN, Golks A, Krammer PH. Caspases: pharmacological
manipulation of cell death. J Clin Invest 2005; 115: 2665–
2672.
12. Marrack P, Kappler J. Control of T cell viability. Ann Rev
Immunol 2004, 22: 765–787.
13. Musiatowicz M, Hassmann-Poznańska E, Musiatowicz B,
Baltaziak M. The Bcl-2 protein expression in germinal cen-
64
ters of hypertrophied adenoids in children. Int J Pediatr
Otorhinolaryngol 2003; 67: 1369–1373.
14. Nave H, Gebert A, Pabst R. Morphology and immunology of
human paltine tonsil. Anat Embryol 2001; 204: 367–373.
15. Oancea M, Mazumder S, Crosby ME, Almasan A. Apoptosis
assays. Methods Mol Med 2006; 129: 279–290.
16. Park CS, Choi YS. How do follicular dendritic cells interact
intimately with B cells in germinal centre? Immunology 2005;
114: 2–10.
17. Rynnel-Dag B, gren K. The nasopharynx and the middle ear.
Inflammatory reactions in middle ear disease. Vaccine 2001;
19: S26–S31.
18. Sagaert X, De Wolf-Peeters C. Classification of B-cells according
to their differentiation status, their micro-anatomical localisation and their develpmental lineage. Immunol Lett 2003; 90:
179–186.
19. Scaffidi C, Schmitz I, Zha J, Korsmeyer SJ, Krammer PH, Peter
ME. Differential modulation of apoptosis sensitivity in CD95
type I and type II cells. J Biol Chem 1999; 374: 22532–22538.
20. Sräter J, Mariani SM, Walczak H, Rücker FG, Leithäuser F,
Krammer PH, i wsp. CD95 Ligand (CD95L) in normal human
lymphoid tissues. Am J Pathol 1999; 154: 193–201.
21. Strasser A, Bouilelet P. The control of apoptosis in lymphocyte
selection. Immunol Rev 2003; 193: 82–92.
22. Tateyama M, Oyaizu N, McCloskey TW, Than S, Pahwa S. CD4
lymphocytes are primed to express Fas ligand by CD4 cross-linking and contribute to CD8 T-cell apoptosis via Fas/FasL death
pathway. Blood 2000; 96: 195–202.
23. Tsunoda R, Heinen E, Sugai N, Follicular dendritic cells in vitro
modulate the expression of Fas and Bcl-2 on germinal center B
cells. Cell Tissue Res 2000, 299: 395–402.
24. Van Engeland M, Nieland LJW, Ramaekers FCS, Schutte B,
Reutelingsperger CPM. AnnexinV-affinity assay: a reviewe on
an apoptosis detection system based on phosphatidylserine
exposure. Cytometry 1998; 31: 1–9.
25. Verbeke CS, Wenthe U, Zengraf H. Fas ligand expression in the
germinal centre. J Pathol 1999, 189: 155–160.
26. Zakrzewska A, Kobos J, Gryczyńska D. Evaluation of CD25,
CD152, Fas-ligand expression in the adenoids of allergic and non-allergic children: a pilot study. Int J Pediatr
Otorhinolaryngol 2003; 67(suppl 1), S205–208.
27. Zhang N, Hartig H, Dzhagalov I, Draper D, He YW. The role of
apoptosis in the development and function of T lymphocytes.
Cell Res 2005; 15: 749–169.
Adres autora:
mgr Beata Żelazowska-Rutkowska
Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Pediatrycznej
AM w Białymstoku
ul. Waszyngtona 17
15-274 Białystok
tel: (085) 745 07 43
Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1