Manual ćw 3 - ATRINBIOTECH

„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia -ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
____________________________________________________________________________________
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
____________________________________________________________________________________________________________________
ĆWICZENIE 3. Oznaczanie p-chlorofenolu w glebie (cz. A)
Chlorofenole (pochodne fenoli) należą do związków mających niebezpieczny wpływ
na środowisko naturalne. Mogą powstawać w procesach technologicznych w
zakładach przemysłowych, w których występują związki chloru i fenole.
Chlorofenole mogą powstawać także przy stosowaniu chloru do dezynfekcji wody i
ścieków. Ze względu na właściwości toksyczne - zostały wpisane na priorytetową
listę zanieczyszczeń, zarówno przez Amerykańską Agencję Ochrony Środowiska
(U.S. EPA), jak i Unię Europejską. Chlorofenole mogą przedostawać się do
środowiska naturalnego (wód powierzchniowych, podziemnych, gleby) wraz ze
Cl
ściekami przemysłowymi z przemysłu chemicznego, z produkcji tworzyw sztucznych
i barwników, z zakładów przeróbki ropy naftowej, zakładów produkujących środki ochrony
roślin.
p-Chlorofenol (4-chlorofenol, 4-chloro-1-hydroksybenzen) w postaci par wchłania się
łatwo w drogach oddechowych. Wchłaniany jest również przez skórę i w przewodzie
pokarmowym, co może prowadzić do zatruć. Działa toksycznie głównie na układ nerwowy, a
wyniki badań na zwierzętach ujawniły również toksyczny jego wpływ na narządy wewnętrzne.
U ludzi obserwowano ostre i przewlekłe zatrucia 4-chlorofenolem z objawami głównie ze strony
ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. Po wchłonięciu do organizmu p-chlorofenol
jest metabolizowany i wydalany w ciągu 24 h z moczem w postaci glikuronianów i
eterosiarczanów. Stała szybkości wydalania u królików wynosiła 0,41/h.
OH
Cel:
Celem ćwiczenia jest ekstrakcja p-chlorofenolu z zakwaszonej próbki gleby metanolem.
Zatężenie próbki metodą SPE. Analiza chromatograficzna HPLC, w połączeniu z detektorem
spektrofotometrycznym UV. Oznaczenie zawartości p-chlorofenolu w glebie.
Materiał do analizy:
Próbki gleby.
Wykonanie:
Etap I –
przygotowanie roztworu wzorcowego:
W kolbie miarowej o poj. 50 ml umieszczamy 100,0 mg p-chlorofenolu i uzupełniamy do kreski
mieszaniną acetonitryl - woda (9:1 v/v) (roztwór 1ml = 2mg p-CF). Pobrać 1,00 ml
sporządzonego roztworu i rozcieńczyć go w kolbie miarowej na 100 ml (roztwór wzorcowy
roboczy: …………….mg/litr p-chlorofenolu)
Etap II –
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
1
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia -ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
____________________________________________________________________________________
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
____________________________________________________________________________________________________________________
przygotowanie próbki:
do plastikowej próbówki wirówkowej o poj. 50ml dodać:
- 10 g gleby (odważonej  0,05g)
- 2-3 krople 10% roztworu kwasu solnego
- 30 ml metanolu (czystość do HPLC),
Zamknąć probówkę i wytrząsać ręcznie przez około 10 min. Następnie umieścić probówkę w
wirówce i przy prędkości 3-4 tyś. obr/min wirować przez 10 min. Odwirowany ekstrakt
przenieść (uważając aby nie dostał się osad, lub przelewać przez lejek z sączkiem) do zlewki na
50 ml i dodać 15 ml wody (czystość do HPLC).
Powtórzyć to samo sporządzając próbkę z wzorcem wewnętrznym dodając na etapie dodawania
kwasu solnego, 2 ml wzorca (roztwór wzorcowy roboczy).
kondycjonowanie kolumienki (kolumienka C-18/3 ml/500 mg):
po zamocowaniu kolumienki w aparacie do sączenia próżniowego, przemyć kolumienkę 3 ml
metanolu (czystość do HPLC), następnie 3 ml mieszaniny woda - metanol (15:30 v/v);
rozdział:
powoli przepuścić 1/3 całości otrzymanego roztworu badanej próbki przez kolumienkę,
regulując przepływ próżnią;
przemycie kolumienki:
przemyć 1 ml mieszaniną woda – metanol (9:1 v/v), suszyć 5 min pod próżnią;
Ważne: Należy pamiętać, iż od chwili rozpoczęcia etapu kondycjonowania złoża sorbentu nie
można dopuścić do jego wyschnięcia. W przeciwnym przypadku procedurę należy rozpocząć od
nowa. Przed ostatnim etapem elucji analitów ze złoża należy upewnić się, czy jest ono suche,
jeśli nie - wysuszyć.
elucja:
przemyć 4x1 ml mieszaniną acetonitryl - woda (9:1 v/v), przesącz zbierać do małego naczynka
(probówki na 5ml).
Pobrać 1,5 ml próbki do naczynka chromatograficznego, szczelnie zamknąć, opisać próbkę i
pozostawić w chłodnym miejscu (np. lodówce) do następnych ćwiczeń.
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
2
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia -ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
____________________________________________________________________________________
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
____________________________________________________________________________________________________________________
ĆWICZENIE 3. Oznaczanie p-chlorofenolu w glebie (cz. B)
Materiał do analizy:
zatężony ekstrakt uzyskany z części A.
Wykonanie:
Warunki rozdzielania, detekcji i kalibracji HPLC
 Ustawić skład eluent: acetonitryl:metanol:1% kwas octowy (35:5:60%), natężenie
przepływu fazy ruchomej -1ml/min.
 Ustabilizować warunki rozdzielania (stabilna linia podstawowa detektora UV-VIS
długość fali 280 nm, powierzchnia sorpcyjna kolumny „zrównoważona” ze stosowanym
eluentem).
 Po ustabilizowaniu warunków rozdzielania wprowadzić do pętli zaworu dozującego co
najmniej 50 mikrolitrów próbki. Po stwierdzeniu gotowości systemu rejestracji i
przetwarzania danych wprowadzić próbkę do kolumny. Obserwować przebieg
rozdzielania, kontrolować prawidłowość pracy aparatu, zanotować warunki rozdzielania
i detekcji a także wyjaśnić z prowadzącym ewentualne wątpliwości.
 Po zarejestrowaniu chromatogramu, odczytać czas retencji i powierzchnie piku dla
badanego związku.
 W wyżej opisany sposób wykonać analizę chromatograficzną dla sporządzonego
roztworu kalibracyjnego (wzorzec zewnętrzny – pobrać 50 μl roztworu wzorcowego
roboczego). Zarejestrować chromatogramy i wyznaczyć czas retencji dla substancji z
roztworu kalibracyjnego.
 W identycznych jak wcześniej warunkach, które stosowano podczas kalibracji HPLC,
zadozować do kolumny roztwór próbki badanej o nieznanym stężeniu oraz w kolejnym
etapie próbki z wzorcem wewnętrznym.
 Zarejestrować chromatogram i odczytać powierzchnie piku oznaczanej substancji w
analizowanej próbce ekstraktu z wzorcem wewnętrznym i bez wzorca.
Opracowanie wyników:
Sprawozdanie przygotowuje się według osobnego załącznika do ćwiczeń z HPLC.
UWAGA: sprawozdanie powinno być już wydrukowane na zajęcia gdyż będzie ono wypełniane
w trakcie trwania ćwiczeń części B i oddawane po jego zakończeniu.
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
3