Sposób modyfikacjiadsorbentów krzemionkowych, zwłaszcza do

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11)185869
(21) Numer zgłoszenia:
(13) B1
321283
(51) IntCl7
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
(54)
(22) Data zgłoszenia:
B01J 20/10
B01J 20/30
B01D 15/08
21.07.1997
Sposób modyfikacjiadsorbentów krzemionkowych,
zwłaszcza do chromatograficznej separacji sterydów i ich pochodnych
(73) Uprawniony z patentu:
Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Toruń, PL
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
01.02.1999 BUP 03/99
(72) Twórcy wynalazku:
Bogusław Buszewski, Toruń, PL
M.Renata Gadzała-Kopciuch, Toruń, PL
Iwona Cedrowska, Warszawa, PL
(45) o udzieleniu patentu ogłoszono:
28.08.2003 WUP 08/03
(74) Pełnomocnik:
Kowalski Piotr,
Uniwersytet Mikołaja Kopernika
PL
185869
B1
(57)1
. Sposób modyfikacji adsorbentów krzemionkowych,
zwłaszcza do chromatograficznej separacji sterydów i ich
pochodnych, znamienny tym, że adsorbent krzemionkowy
ogrzewa się pod próżnią w temperaturze 130-195°C aż do
usunięcia zaadsorbowanej wody, po czym chłodzi do temperatury 110°C ± 10°C i poddaje reakcji ze stechiometryczną
ilością oktadecylotrichlorosilanu (C18), cyjanopropylodimetylochlorosilanu (-CN), fenylopropylodimetylochlorosilan (-Ph)
i bezwodnej morfoliny w temperaturze 80-125°C przez
okres 8 do 24 godzin, a następnie chłodzi do temperatury
pokojowej, przemywa rozpuszczalnikami organicznymi i suszy, po czym tak uzyskany sorbent ogrzewa się pod próżnią
w temperaturze 100 do 140°C, korzystnie 125°C, przez
okres 6 do 12 godzin, chłodzi do temperatury 80 do 120°C
i poddaje reakcji z oktylometylodimetoksysilanem (C8) oraz
γ-aminopropylotrietoksysilanem (-NH2) przez okres 12 do
24 godzin, a następnie ochładza się do temperatury pokojowej, przemywa rozpuszczalnikami organicznymi, przenosi
na folię aluminiową i suszy w temperaturze 40 do 80°C.
Schemat
Sposób modyfikacji adsorbentów krzemionkowych, zwłaszcza
do chromatograficznej separacji sterydów i ich pochodnych
Zastrzeżenia
patentowe
1. Sposób modyfikacji adsorbentów krzemionkowych, zwłaszcza do chromatograficznej
separacji sterydów i ich pochodnych, znamienny tym, że adsorbent krzemionkowy ogrzewa się
pod próżnią w temperaturze 130-195°C aż do usunięcia zaadsorbowanej wody, po czym chłodzi
do temperatury 110°C ± 10°C i poddaje reakcji ze stechiometryczną ilością oktadecylotrichlorosilanu (C18), cyjanopropylodimetylochlorosilanu (-CN), fenylopropylodimetylochlorosilan (-Ph)
i bezwodnej morfoliny w temperaturze 80-125°C przez okres 8 do 24 godzin, a następnie chłodzi do temperatury pokojowej, przemywa rozpuszczalnikami organicznymi i suszy, po czym tak
uzyskany sorbent ogrzewa się pod próżnią w temperaturze 100 do 140°C, korzystnie 125°C,
przez okres 6 do 12 godzin, chłodzi do temperatury 80 do 120°C i poddaje reakcji z oktylometylodimetoksysilanem (C8) oraz γ-aminopropylotrietoksysilanem (-NH2) przez okres 12 do
24 godzin, a następnie ochładza się do temperatury pokojowej, przemywa rozpuszczalnikami
organicznymi, przenosi na folię aluminiową i suszy w temperaturze 40 do 80°C.
2. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że jako rozpuszczalniki organiczne
stosuje się kolejno toluen, metanol i heksan.
* * *
Przedmiotem wynalazku jest sposób modyfikacji adsorbentów krzemionkowych,
zwłaszcza do chromatograficznej separacji sterydów i ich pochodnych.
Jednym z najważniejszych parametrów chromatograficznych, stanowiących miarę oddziaływań analitu w stosunku do fazy stacjonarnej i składników fazy ruchomej jest selektywność. Najczęściej parametr ten wyrażany jest eksperymentalnie za pomocą retencji względnej
oraz rozdzielczości. Oba te parametry ściśle ze sobą korelują i określają w sposób jednoznaczny procesy przebiegające w trakcie separacji. Zmiana jednego z tych czynników bezpośrednio wpływa na zmianę selektywności w stosunku do analitu lub mieszaniny. Dlatego tez
w nowoczesnej chromatografii i technikach jej pokrewnych: ekstrakcji w układzie ciecz-ciało
stałe, sączeniu membranowym na stałych dyskach czy kapilarnej elektroforezie, będącej
reprezentantem technik elektromigracyjnych, selektywność układu uzyskiwana jest coraz
częściej poprzez zmianę charakteru powierzchni. Oznacza to, że konieczne jest poszukiwanie
nowych typów faz stacjonarnych w stosunku do natury chemicznej i budowy analitów. Ze
względu na zbyt duże powinowactwo do fazy stacjonarnej i fazy ruchomej, wiele substancji
polarnych występujących w układach naturalnych nie jest możliwe rozdzielić czy wyizolować
selektywnie. Stąd w literaturze coraz częściej pojawiają się informacje, że do separacji leków
zawierających chiralny atom węgla (dwa stereoizomery -R i -S) stosuje się cyklodekstrynową
fazę chiralną (D.W, Armstrong i współ., Anal. Chem., 62 (1990) 332; Z. Chilmończyk i J. Cybulski, Acta Poloniae Pharmaceutica, 50 (1993) 87) lub fazę zawierającą również chiralne
specyficzne centrum aktywne typu Pirkla (J. Bojarski, Chem. Anal. 42 (1997) 193). W innych
przypadkach do separacji wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych zawierających w swojej cząsteczce π elektrony - proponuje się stosowanie faz arylowych zawierających
również π elektrony, dzięki czemu oddziaływania typu π ... π są dominującymi (K. Jinno
i współ., J. Chromatogr., 517(1990) 193).
Sytuacja zmienia się drastycznie, gdy mamy do czynienia z separacją związków zawierających więcej niż jedno centrum aktywne i oddziaływania, w trakcie procesu separacyjnego,
idą w odmiennym kierunku. W rezultacie uzyskiwanie zadowalających wyników jest niemożliwe, a oznaczane substancje eluują w postaci jednego pasma. Inną miarą selektywności
procesu jest kolejność eluowanych pasm lub czas samego procesu separacyjnego. Czas i ko--
185 869
3
lejność eluowania pasm wiąże się z możliwością przebywania analitów na kolumnie, a więc
dłuższym oddziaływaniem z miejscami aktywnymi zlokalizowanymi w lub na grupach funkcyjnych. Znane są fazy stacjonarne do chromatografii, które zawierała organiczny film związany chemicznie do powierzchni stałego nośnika szkło, kwarc, żel krzemionkowy, tlenki glinu, tytan, cyrkon, węgle porowate czy różne polimery porowate. Fazy te stosowane są wybiórczo w zależności od charakteru analitu i ze względów sferycznych możliwe jest istnienie
jednej lub dwu grup funkcyjnych na powierzchni nośnika jak C18 i C3, C18 i -CN, C18 i -NH2.
Ze względu na specyficzne oddziaływania i ogólnie panujące trudności - preparatyka tych faz
(wiązane do powierzchni nośnika poprzez kreowanie wiązania siloksanowego albo karbosiloksanowego) jest trudna i w literaturze fachowej poza opracowaniem Fischera i Jandery
(J. Chromatogr. A, 684 (1994) 77) i B W. Kinga (2nd International Symposium on Pharamceutical and Biomedical Analysis, York, UK, April 4-7, 1990, Book Abstract p. 198) nie znajduje się odniesień.
Niedogodnością znanych sposobów modyfikacji adsorbentów do chromatograficznej separacji sterydów i ich pochodnych jest duże zużycie drogich superczystych rozpuszczalników.
Natomiast adsorbenty uzyskiwane tymi sposobami mają długi czas retencji i uniemożliwiają
wyodrębnienie sterydów i ich pochodnych w formie czystej.
Celem wynalazku jest opracowanie sposobu modyfikacji adsorbentów krzemionkowych
umożliwiającego uzyskanie na ich powierzchni zmieszanej fazy stacjonarnej zawierającej
w swojej strukturze grupy hydroksylowe (-OH), C18 i C8, ugrupowania fenylowe (Ph), cyjanowe (-CN) i aminowe (-NH2).
Sposobem według wynalazku adsorbent krzemionkowy ogrzewa się pod próżnią 103 Pa
w temperaturze 130-195°C aż do usunięcia zaadsorbowanej wody, po czym chłodzi do
temperatur 110°C ± 10°C i dozując poddaje reakcji ze stechiometryczną ilością oktadecylotrichlorosilanu (C18), 3-cyjanopropylodimetylochlorosilanu (-CN), fenylopropy-lodimetylochlorosilanu (-Ph) oraz bezwodnej morfoliny stanowiącej aktywator i neutralizator wydzielającego się kwasu solnego. Reakcję prowadzi się przez okres 8-24 godzin, korzystnie 12 godzin. Tak uzyskaną mieszaninę reakcyjną chłodzi się do temperatury pokojowej i przemywa
rozpuszczalnikami organicznymi kolejno toluenem, metanolem i heksanem, następnie suszy
w suszarce w temperaturze 60°C ± 10°C przez okres 6 godzin. W drugim etapie tak uzyskany
sorbent ogrzewa się pod próżnią 10-3 Pa do temperatury 80 -140°C, korzystnie 125°C przez
okres 6-12 godzin, po czym chłodzi do temperatury 100-120°C i poddaje reakcji z oktylodimetylochlorosilanem (C8) i γ-aminoproplotrietoksysilanem (-NH2) przez okres 12-24 godzin.
Następnie mieszaninę reakcyjną ochładza się do temperatury pokojowej, przemywa rozpuszczalnikami organicznymi kolejno toluenem, metanolem i heksanem. Tak uzyskany adsorbent przenosi się na folię aluminiową i suszy w suszarce w temperaturze 40 do 80°C, korzystnie 70°C.
Strukturę tak uformowanej fazy MIX przedstawia schemat.
Dzięki tak przeprowadzonej modyfikacji powierzchni krzemionkowego nośnika uzyskuje
się zmieszaną fazę stacjonarną zawierającą w swojej strukturze grupy hydroksylowe (-OH),
C18 i C8, ugrupowania fenylowe (-Ph), cyjanowe (-CN) i aminowe (-NH2) o odtwarzalnej
kontrolowanej powierzchni i ściśle zdefiniowanych miejscach aktywnych.
Sposób według wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładzie wykonania nie
ograniczając jego zakresu ochrony.
Przykład
5 g adsorbenta umieszczono w reaktorze szklanym uniemożliwiającym kontakt z otoczeniem. Zawartość reaktora ogrzewa się w temperaturze 170°C pod próżnią 10-3 Pa przez
okres 8 h celem usunięcia fizycznie zaadsorbowanej wody. Następnie temperaturę reaktora
obniża się do 110°C ± 10°C i przez specjalny dozownik porcjami wprowadza się 1,5 ml oktadecylotrichlorosilanu (C18), 1,5 ml 3-cyjanopropylodimetylochlorosilanu (-CN), 1,2 ml fenylopropylodimetylochlorosilanu (-Ph) oraz 1,2 ml osuszonej, bezwodnej morfoliny stanowiącej
neutralizator wydzielającego się kwasu solnego. Reakcję prowadzi się przez okres 12 godzin.
Po tym czasie reaktor ochładza się do temperatury pokojowej i jego zawartość przemywa kolejno: 50 ml toluenu, 75 ml metanolu i 50 ml heksanu. Proces ten przeprowadza się na lejku
typu Schotta o gradacji oczek 4G. Przemyty sorbent osusza się w suszarce w temperaturze
4
185 869
60°C ± 10°C przez okres 6 godzin. Po tym czasie uzyskany adsorbent w wyniku modyfikacji
w I-szym etapie umieszcza się w reaktorze i poddaje ogrzewaniu w temp. 125°C ± 10°C pod
próżnią 10° Pa przez okres 8 godzin. Następnie temperaturę obniża się do 105°C ± 10°C i podaje
porcjami przez specjalny dozownik 1,5 ml oktylometylodimetoksysilan (C8) i 1,5 ml γ-aminopropylotrietoksysilanu. Zawartość reaktora poddało się reakcji przez 12 godzin. Po tym czasie
mieszaninę reakcyjną ochładza się do temperatury pokojowej i przenosi się na lejek ze spiekiem
Schotta o porowatości G4. Następnie adsorbent przemywa się kolejno 50 ml toluenu, 100 ml metanolu i 50 ml heksanu. Tak spreparowany adsorbent przenosi się na folię aluminiową i suszy
w suszarce w temperaturze 70°C.
Na każdym etapie uzyskany adsorbent poddaje się kontroli za pomocą analizy elementarnej na zawartość węgla i azotu. Wyniki kontroli przedstawia tabela 1.
T a b e l a 1.
Sorbent
Typ grupy funkcyjnej
Etap I
C18, CN, Ph
Etap II
C18, C8, pH, CN, NH2
PN[%]
P c [%]
12.6 ± 1.2
0.91 ±0.15
14.95 ± 1.5
1.42 ± 0.3
Zmodyfikowany adsorbent umieszczono w kolumnie chromatograficznej o rozmiarach
125 x 4.6 mm i testowano w warunkach hydroorganicznych metanol-woda o stężeniu 60-40%
za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Jako substancje testowe zastosowano bronopol, uracyl, acetofenon, benzen, toluen. Przyrównanie danych retencyjnych,
współczynnika pojemnościowego (k') i retencji względnej (α ), określanej jako miara selektywności dla konwencjonalnych kolumn zawierających grupy funkcyjne -NH2, -CN, -Ph, C18
w stosunku do zmodyfikowanego adsorbenta krzemionkowego MIX przedstawia tabela 2.
T a b e l a 2.
Numer
piku
-NH2
Substancja
k'
-CN
α
k'
-Ph
α
k'
Mix
C18
α
k'
k’
α
α
1
Uracil
-
-
0.39
-
0.34
-
0.77
-
0.15
2.27
2
Bronopol
-
-
0.45
1.16
0.49
1.47
0.90
1.17
0.34
3.27
3
Acetofenon
-
-
0.58
1.29
0.80
1.64
1.75
1.94
1.10
1.56
4
Benzen
-
-
0.67
1.16
1.02
1.28
2.72
1.55
1.71
1.92
5
Toluen
-
-
0.96
1.42
1.58
1.55
4.46
1.64
3.28
1.91
Adsorbenty krzemionkowe MIX zmodyfikowane sposobem według wynalazku mają zastosowanie złaszcza do alfa, beta separacji N-(1,1-dimetylethylu)3-oxo(5α ,17β)-aza-androst1-ene-17-carboxamidu (finasterydu), leku z grupy cytostatyków o charakterze polarnym od
jego metabolitu N-metylofinasterydu.
Celem określenia czystości od spreparowanego finasterydu dokonano separacji tego leku od N-metylofinasterydu na kolumnie z konwencjonalną fazą C18, co ilustruje fig. 1 rysunku
i fazą MIX według wynalazku, której wykres pasm przedstawia fig. 2.
Separację przeprowadzono na kolumnie o wymiarach 125 x 4,6 mm I.D. stosując jako
fazę ruchomą: THF + MeOH + H2O + TFA (30/5/65/0,025 % v/v), przy przepływie 1 ml/min.
Do identyfikacji związków zastosowano detektor UV/Vis (λ = 254 nm).
Jak uwidoczniono na fig. 1 i fig. 2 rysunku czas elucji finasterydu wynosił tR = 14,275
min, zaś selektywność względem alfa N-metylofinasterydu α = 1,26. Uzyskanie takich wartości zapewnia bardzo dobrą rozdzielczość pasm, a w konsekwencji oczyszczenie preparatywne
finasterydu.
185 869
185 869
Schemat
Fig.1
Fig.2
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.
Cena 2,00 zł.