QUANTA LiteTM dsDNA

QUANTA Lite® GPA
(Gastric Parietal Cell Antibody)
ELISA
708765
Do diagnostyki in vitro
Złożoność CLIA: Wysoka
Przeznaczenie
Zestaw QUANTA LiteTM GPA (Gastric Parietal Cell Antibody, Przeciwciało przeciwko komórkom ściennym
żołądka) jest to test immunoenzymatyczny (ELISA) do półilościowego wykrywania przeciwciał klasy IgG
przeciwko (H+/K+) ATP-azie komórek ściennych żołądka w surowicy człowieka. Obecność przeciwciał
przeciwko (H+/K+) ATP-azie komórek ściennych żołądka, w połączeniu z objawami klinicznymi i innymi
badaniami laboratoryjnymi, może być stosowana w celu wsparcia diagnostyki stanów charakteryzujących się
podwyższonym poziomem przeciwciał przeciwko (H+/K+) ATP-azie komórek ściennych żołądka włączając w
to niedokrwistość złośliwą.
Podsumowanie i wyjaśnienie testu
Niedokrwistość złośliwa jest chorobą przewlekłą i stanowi ostatnie stadium przewlekłego
(autoimmunologicznego) zanikowego zapalenia błony śluzowej żołądka typu A. Przewlekłe zanikowe
zapalenie błony śluzowej żołądka typu A atakuje dno i trzon żołądka, a w typie B (nieautoimmunologicznym)
dochodzi do uszkodzenia jamy odźwiernikowej żołądka oraz jego dna i trzonu. Typ A choroby wiąże się z
występowaniem niedokrwistości złośliwej, natomiast typ B powiązany jest z infekcją drobnoustrojem
H. pylori1-3. Gdy przewlekłe zanikowe zapalenie błony śluzowej żołądka typu A postępuje w kierunku zaniku
komórek ściennych żołądka, wówczas komórki te, produkujące czynnik wewnętrzny oraz HCl, ulegają
zniszczeniu i zatrzymana zostaje produkcja czynnika wewnętrznego i HCl. Czynnik wewnętrzny jest
niezbędny do wchłaniania witaminy B12 z jelita a jego brak prowadzi do niedoboru witaminy B12 i
niedokrwistości megaloblastycznej. Zazwyczaj niedokrwistość złośliwa rozwija się powoli a proces
przekształcania się przewlekłego zanikowego zapalenia błony śluzowej żołądka w zanik komórek ściennych i
kliniczną postać niedokrwistości trwa 20-30 lat. Średni wiek pacjentów, u których diagnozuje się tę chorobę
wynosi 60 lat. Chociaż choroba ta często pozostaje nierozpoznana do chwili pojawienia się poważnych
objawów niedokrwistości lub innych objawów, to powodujące je wrzody żołądka można wykryć na kilka lat
przed jej rozwinięciem 3,4. U pacjentów z niedokrwistością złośliwą obserwuje się zwiększoną częstość
występowania chorób autoimmunologicznych, w tym autoimmunologicznego zapalenia tarczycy (choroba
Hashimoto), cukrzycy typu 1, choroby Addisona, choroby Gravesa-Basedowa oraz miastenii. U pacjentów z
niedokrwistością złośliwą ryzyko wystąpienia raka żołądka jest 3x większe a ryzyko wystąpienia rakowiaka
żołądka jest 13x większe 5.
Autoprzeciwciała przeciwko komórkom ściennym żołądka występują u około 90% pacjentów z
niedokrwistością złośliwą i około 30% krewnych pierwszego stopnia pacjentów z niedokrwistością złośliwą 13
. Przeciwciała przeciwko komórkom ściennym żołądka (GPA) wykrywa się zazwyczaj metodą
immunofluorescencji pośredniej (IFA) z zastosowaniem skrawków śluzówki żołądka gryzonia 2. Przeciwciała
przeciwko komórkom ściennym żołądka skierowane są przeciwko antygenowi związanemu z błoną
komórkową w kanaliku wydzielniczym i komórkach ściennych żołądka 6. Zidentyfikowano, że celem działania
GPA jest żołądkowa H+/K+ ATP-aza (żołądkowa pompa protonowa), która odpowiedzialna jest za
zakwaszanie światła żołądka 7-11. GPA wiąże się zarówno z podjednostką α jak i podjednostką β H+/K+ ATPazy 9.
Częstość występowania GPA zwiększa się wraz z wiekiem i wykryto je u 2,5% zdrowej populacji w wieku 3039 lat i 9,6% populacji w ósmej dekadzie życia 3. Niedawne badanie wykazało, że u pacjentów z cukrzycą
typu 1 jest duża częstość występowania GPA oraz towarzyszącej temu autoimmunologicznej choroby
żołądka, co stanowi silną przesłankę za tym, aby diabetyków z niedokrwistością i/lub objawami ze strony
przewodu pokarmowego badać na obecność GPA 12. Podwyższony poziom GPA stwierdzono u pacjentów z
chorobą tarczycy, niedokrwistością z niedoboru żelaza, łysieniem plackowatym i bielactwem nabytym 13,14.
Wykrywanie przeciwciał GPA metodą IFA jest pracochłonne, wymaga subiektywnej interpretacji wyników
przez wysoko przeszkolony personel i podlega zmienności jakości i powtarzalności ze względu na skrawki
tkankowe używane do produkcji preparatów IFA. W celu identyfikacji podjednostek α i β żołądkowej H+/K+
ATP-azy stanowiących cząsteczkowy cel działania przeciwciał przeciwko komórkom ściennym żołądka
skonstruowano czułe i swoiste testy ELISA wykrywające przeciwciała GPA 15. Zastosowanie testów ELISA
umożliwia otrzymanie ustandaryzowanych, powtarzalnych i obiektywnych wyników dla GPA.
Zasada badania
Oczyszczony antygen H+/K+ ATP-azy wyizolowany ze śluzówki świni wiąże się z dołkami płytki
polistyrenowej w warunkach, które zabezpieczają antygen w jego stanie natywnym. Wstępnie rozcieńczone
kontrole oraz surowice pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków, umożliwiając związanie wszelkich
występujących przeciwciał przeciwko H+/K+ ATP-azie z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka
jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciwludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem
związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po
wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność
pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy.
Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności
barwy, która powstaje w dołkach z próbką od pacjenta z barwą dołków kontrolnych.
1
Odczynniki
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta oczyszczonym antygenem H+/K+ ATP-azy (12-1
x 8 dołków), z uchwytem, w torebce foliowej zawierającej osuszacze
Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez ludzkich
przeciwciał przeciwko H+/K+ ATP-azie, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml
Słabo pozytywna kontrola GPA ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała
surowicy ludzkiej przeciwko H+/K+ ATP-azie, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml
Silnie pozytywna kontrola GPA ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała
surowicy ludzkiej przeciwko H+/K+ ATP-azie, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml
Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka – zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną
TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml
Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x – zabarwienie czerwone, zawiera sól
fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć
w sekcji Metody.
Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka – zabarwienie niebieskie,
zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml
Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml
Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka – bezbarwny, 10 ml
Ostrzeżenia
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w
rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka.
Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu
zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że nie
zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HbsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może
całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego
też względu słabo pozytywną kontrolę testu GPA ELISA, wysoko pozytywną kontrolę testu GPA
ELISA oraz kontrolę negatywną ELISA należy użytkować w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie
zakaźny.16
Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w
przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z
ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali.
Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie
dopuścić do gromadzenia się azydku.
Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być
toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych,
należy unikać kontaktu ze skórą i oczami.
Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania,
spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub
kontaktu ze skórą i oczami.
Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać
wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z
kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być
toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami.
Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony
osobistej.
Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i
lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów.
Środki ostrożności
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych in vitro.
Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować
osiągnięciem niespójnych wyników.
Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA
wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła.
Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi
urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w
stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest
potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się
w akceptowalnych limitach.
Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową
odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność
płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy
trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga
staranności i precyzji.
Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej.
Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i
osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania.
2
8.
9.
Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może
dać niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest
przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP.
Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym
czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji
chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem
spowoduje
degradację
koniugatu
HRP.
Po
użyciu
chemicznych
substancji
czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia.
Warunki przechowywania
1.
2.
3.
Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie zamrażać. Odczynniki są
trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami.
Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce
foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2–8°C.
Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2–8°C.
Pobieranie próbek
Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do
próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne
zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub
lipemicznej surowicy albo próbek.
Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A2 zaleca
następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej
niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury
2–8°C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy
zamrozić ją w temperaturze -20°C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą
zostać dobrze wymieszane.
Badanie
Dostarczone materiały
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Płytka z mikrodołkami GPA ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem
1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA
1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu GPA ELISA
1,2 ml wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu GPA ELISA
50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP
25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x
10 ml koniugatu przeciwciała IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG
10 ml chromogenu TMB
10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M
Wymagane materiały nie dołączone do zestawu
Mikropipety na 5, 100, 200–300 i 500 µl
Jednorazowe końcówki mikropipet
Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości
Woda destylowana lub dejonizowana
Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania
Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla
odczytów przy dwóch długościach fali)
Sposób przygotowania
Przed rozpoczęciem
1.
2.
3.
4.
Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20 - 26oC) i dobrze
wymieszać.
Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do
płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie
przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml
koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte.
Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2–8oC.
Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pochodzącej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl
rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od
przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli testu GPA ELISA, silnie pozytywnej
kontroli testu GPA ELISA i kontroli negatywnej ELISA.
Oznaczanie obecności lub braku przeciwciał przeciwko H+/K+ ATP-azie, z zastosowaniem jednostek
umownych wymaga dwóch dołków dla każdej z trzech kontroli i jednego lub dwóch dołków dla każdej
próbki od pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek.
3
Procedura badania
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE
DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20–26°C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w
uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i
dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną.
Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu GPA ELISA, silnie
pozytywnej kontroli testu GPA ELISA, kontroli negatywnej testu ELISA i rozcieńczone próbki
pochodzące od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na
równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki.
Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać 200–300 µl rozcieńczonego
buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie go odessać. Powtórzyć tę sekwencję
jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na
materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby
całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję
odsysania, jak w przypadku dodawania próbki.
Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z
zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych.
Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO
ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO Z POWROTEM
WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w
etapie 2.
Etap płukania: Powtórzyć etap 3.
Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w
temperaturze pokojowej.
do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas
dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać
płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków.
Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej
godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością
fali może być długość 620 nm.
Kontrola jakości
1.
2.
3.
4.
Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek
należy testować wraz ze słabo pozytywną kontrolą testu GPA ELISA, silnie pozytywną kontrolą testu
GPA ELISA i kontrolą negatywną ELISA.
Należy zauważyć, że ponieważ słabo pozytywna kontrola testu GPA ELISA, silnie pozytywna
kontrola testu GPA ELISA i kontrola negatywna testu ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie
będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek.
Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub
krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne
można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze
≤ - 20°C.
Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe
kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako
nieważne i powinno zostać powtórzone.
a.
Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu GPA ELISA musi być
większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu GPA ELISA,
która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej
ELISA.
b.
Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu GPA ELISA musi być
większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej negatywnej kontroli ELISA
nie może przekroczyć 0,2.
c.
Absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu GPA ELISA musi być
ponad dwukrotnie większa niż absorbancja kontroli negatywnej ELISA lub być większa niż
0,25.
d.
Kontrola negatywna testu ELISA i silnie pozytywna kontrola testu GPA ELISA mają za
zadanie wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Silnie pozytywna
kontrola testu GPA ELISA nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania.
e.
Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie
NCCLS C24-A.17
4
Obliczanie wyników
W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność
każdej próbki można następnie wyliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość
optyczną słabo pozytywnej kontroli testu GPA ELISA. Otrzymany wynik mnoży się przez liczbę jednostek
przypisanych do słabo pozytywnej kontroli testu GPA ELISA, którą można znaleźć na etykiecie.
Gęstość optyczna próbki
Wartość próbki =
(jednostki)
x słabo pozytywna
kontrola testu GPA ELISA
gęstość optyczna słabo pozytywnej kontroli testu GPA ELISA
(jednostki)
Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał
u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie
jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli
wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie
seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z
wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta.
Interpretacja wyników
Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w
populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium
powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji
pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami.
Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, niejednoznaczna lub pozytywna (wykryte
zostaje przeciwciało IgG przeciwko H+/K+ ATP-azie), zgodnie z poniższą tabelą.
Jednostki
0,0 - 20,0
20,1 – 24,9
≥ 25
Negatywna
Niejednoznaczne
Pozytywne
Niejednoznaczne próbki powinny zostać ponownie przebadane przed przedstawieniem wyników.
1.
2.
3.
4.
Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał przeciwko H+/K+ ATP-azie i sugeruje
możliwość wystąpienia niedokrwistości złośliwej lub chorób pokrewnych.
Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała przeciwko H+/K+ ATP-azie, lub że
ich poziom jest poniżej dolnej wartości granicznej badania.
Próbka z niejednoznacznym poziomem GPA nie może być oznaczona pod kątem statusu
przeciwciał. Jeśli wyniki nadal są niejednoznaczne po powtórzonym badaniu, wynik należy
zaraportować jako niejednoznaczny i/lub pobrać dodatkową próbkę.
Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: „Poniższe wyniki
otrzymano przy wykorzystaniu testu INOVA QUANTA LiteTM GPA ELISA. Nie można stosować
zamiennie wartości GPA uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów.
„Rząd wielkości poziomów raportowanego IgG nie może być skorelowany z mianem punktu
końcowego”.
Ograniczenia badania
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce
pochodzącej od pacjenta może powodować podwyższony poziom nieswoistego wiązania i wytwarzać
fałszywe pozytywne wyniki w tym badaniu.
Negatywny wynik testu na obecność przeciwciał przeciwko komórkom ściennym żołądka nie
wyklucza niedokrwistości złośliwej.
Negatywny wynik na obecność przeciwciał GPA nie wyklucza obecności przeciwciał GPA, ponieważ
stężenie przeciwciał może być poniżej granicy wykrywania dla tego testu.
Wynik pozytywny świadczy jedynie o występowaniu przeciwciał przeciwko H+/K+ ATP-azie i nie
koniecznie może wskazywać na chorobę autoimmunologiczną lub inną chorobę.
To badanie nie zostało zatwierdzone do stosowania w przypadku populacji dziecięcej.
Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami
serologicznymi.
Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica.
Spodziewane wartości
Zdolność testu QUANTA Lite® GPA ELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko H+/K+ ATP-azie oceniano
poprzez porównanie z dostępnym w handlu zestawem H+/K+ ATPase ELISA. Przeprowadzono również
porównanie wyników otrzymanych z zastosowaniem testu QUANTA Lite® GPA ELISA i testu pośredniej
immunofluorescencji z wykorzystaniem skrawków tkanki nerki/żołądka myszy.
Częstość występowania GPA w populacjach osób zdrowych rośnie wraz z wiekiem od około 2,5% w trzeciej
dekadzie życia do 9,6% w ósmej dekadzie. Występowanie GPA obserwowane jest częściej u kobiet niż u
mężczyzn. W przypadku mężczyzn w wieku poniżej 55 lat u 5,5% z nich występują GPA w porównaniu z
14,7% kobiet. W przypadku osób powyżej 55 roku życia GPA występowały u 9,2% mężczyzn i 22,3%
kobiet4.
5
Normalny zakres
Przy użyciu zestawu QUANTA Lite® GPA ELISA przebadano 210 próbek pochodzących od zdrowych osób
nie wykazujących żadnych objawów. Zakres wiekowy wynosił od 17 do 77 lat (mediana=32). Z tych 210
próbek, 154 (73,3%) pochodziło od mężczyzn a 56 (26,7%) od kobiet. Średnia wartość wynosiła 7,3
jednostki w zakresie od 1,3 do 84,1 jednostki. Dwie z 7 próbek zawierających GPA dało wynik pozytywny w
teście GPA IFA. Przy wyłączeniu 4 próbek dających wynik niejednoznaczny swoistość testu ustalono na
96,6% (199/206).
Swoistość i wrażliwość względna
Wyniki uzyskane dla 20 próbek pochodzących od pacjentów z niedokrwistością złośliwą badanych z
zastosowaniem testu QUANTA Lite® GPA ELISA i predykatowego zestawu GPA ELISA pokazano w tabeli
1. Porównanie wyników dla tych próbek uzyskanych z przy zastosowaniu metody IFA z wykorzystaniem
preparatów nerki/żołądka myszy przedstawiono w tabeli 2. W tabeli 3 przedstawiono porównanie wyników
dla 41 próbek uzyskanych z zastosowaniem QUANTA Lite® GPA ELISA i predykatowego zestawu GPA
ELISA.
Tabela 1: Wyniki dla próbek pochodzących od pacjentów z niedokrwistością złośliwą badanych przy użyciu
testu QUANTA Lite® GPA i predykatowego testu GPA ELISA
Wyniki QUANTA Lite® GPA ELISA
Predykatowy test GPA ELISA n=20
Pozyt. (15)
EQ (0)
Negat. (5)
Pozytywna
Pozyt. (14) 14
0
0
Niejednoznaczna
EQ (5)
1
0
4
Negatywny
Negat. (1) 0
0
1
Zgodność (przy wykluczeniu wyników niejednoznacznych): 100% (15/15)
Tabela 2: Wyniki dla próbek pochodzących od pacjentów z niedokrwistością złośliwą badanych przy użyciu
testu QUANTA Lite® GPA i testu ANA IFA (nerka/żołądek myszy)
Wyniki testu QUANTA Lite® GPA ELISA
Pozyt. (15)
EQ (0)
Negat. (5)
GPA IFA
N = 20
Pozytywna
Pozyt. (15)
15
0
0
Niejednoznaczna
EQ (0)
0
0
0
Negatywny
Negat. (5)
0
0
5
Zgodność: 100% (20/20)
Tabela 3: Wyniki dla próbek zgłoszonych do testu na obecność GPA, badanych przy użyciu testu QUANTA
Lite® GPA i predykatowego testu GPA ELISA
Wyniki testu QUANTA Lite® GPA ELISA
Predykatowy test GPA
ELISA
N=41
Pozyt. (19)
EQ (2)
Negat. (20)
Pozytywna
Pozyt. (22)
17
2
3
Niejednoznaczna
EQ (0)
0
0
0
Negatywny
Negat. (19)
2
0
17
Zgodność (przy wykluczeniu wyników niejednoznacznych): 89,7% (35/39)
Badanie reaktywności krzyżowej
Surowice pochodzące od pacjentów z przeciwciałami związanymi z chorobami autoimmunologicznymi i
zakaźnymi lub różnymi stanami klinicznymi włączając w to przeciwciała przeciwko H. pylori (7), peroksydazie
tarczycowej (5), antygenowi tarczycy M (5), antygenowi tarczycy T (4), beta-2 glikoproteinie (5), LKM-1 (5),
występujące w autoimmunologicznym zapaleniu wątroby typu 1 (14), antygenowi mitochondriów M2 (4)
badano pod kątem reaktywności krzyżowej przy użyciu testu QUANTA Lite® GPA ELISA. Jedna próbka H
.pylori i 2 próbki TPO dały w teście QUANTA Lite® GPA ELISA wynik pozytywny. Te 3 próbki dały z teście
GPA IFA wynik pozytywny.
Precyzja i powtarzalność
Wydajność w obrębie badania dla testu QUANTA Lite® GPA ELISA oceniano, testując 6 próbek po 9 razy
każdą. Podsumowane w tabeli 4 wyniki wskazują precyzję w obrębie badania.
Tabela 4: Wyniki w ramach badania QUANTA Lite® GPA ELISA
Próbka A
Próbka B
Próbka C
Próbka D
Jednostki średnie
40,7
93,4
35,4
58,3
SD
2,3
5,7
3,2
5,4
CV %
5,6
6,1
9,0
9,2
Próbka E
47,0
5,1
10,8
Próbka F
10,5
0,7
6,9
Wyniki pomiędzy badaniami oceniono, przeprowadzając dwukrotnie badanie panelu 5 próbek 2 razy dziennie
przez 3 dni.
Tabela 5: Wyniki pomiędzy badaniami QUANTA Lite® GPA ELISA
Próbka 1
Próbka 2
Próbka 3
Jednostki średnie
32,7
95,2
11,4
SD
1,61
2,25
0,37
CV %
4,9
2,4
3,2
6
Próbka 4
32,9
1,77
5,4
Próbka 5
5,9
0,42
7,1
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Gleeson PA and B-H Toh. Molecular Targets in Pernicious Anemia. Immunology Today 12(7): 233238, 1991.
Gleeson PA, Van Driel IR and B-H Toh. Parietal Cell Antibodies. In: Autoantibodies. Peter JB and Y
Shoenfeld, eds., Elsevier Science B.V. pp 600- 606, 1996.
Toh B-H, Van Driel IR and PA Gleeson. Pernicious Anemia. N. Eng. J. Med. 37(20): 1441-1448,
1997.
Lee GR. Pernicious Anemia and other causes of vitamin B12 (cobalamin) deficiency. In: Wintrobe’s
Clinical Hematology, 10th ed, Williams & Wilkins, pp 941-964, 1999.
Hsing AW, Hansson L-E, McLaughlin JK, et al. Pernicious anemia and subsequent cancer: a
population-based cohort study. Cancer 71:745-750, 1993.
Hoedemaeker PJ and S Ito. Ultrastructural localization of gastric parietal cell antigen with peroxidasecoupled antibody. Lab. Invest. 22:184-188, 1970.
Burman P, Mardh S, Norberg L and FA Karlsson. Parietal cell antibodies in pernicious anemia inhibit
H+/K+ -adenosine triphosphatase, the proton pump of the stomach. Gastroenterol. 96:14341438,1989.
Toh B-H, Gleeson PA, Simpson RJ, et al. The 60- to 90 kDa parietal cell autoantigen associated with
autoimmune gastritis is a β subunit of the gastric H+/K+ ATPase (proton pump). PNAS 87:64186422, 1990.
Callagham JM, Khan MA, Alderuccio F, Van Driel IR, Gleeson PA and B-H Toh. α and β subunits of
the gastric H+/K+ ATPase are concordantly targeted by parietal cell autoantibodies associated with
autoimmune gastritis. Autoimmun. 16:289-295, 1993.
Ma JY, Borch K and S Mardh. Human gastric H,K-adenosine triphosphatase β-subunit is a major
autoantigen in atrophic corpus gastritis. Expression of the recombinant human glycoprotein in insect
cells. Scand. J. Gastroenterol. 29:790-794, 1994.
Claeys D, Galler G, Appelmelk BJ, Negrini R and T Kirchner. The gastric H+/K+-ATPase is a major
autoantigen in chronic Helicobacter pylori gastritis with body mucosa atrophy. Gastroenterol.
115:340-347, 1998.
DeBlock CRM, DeLeeuw IH, Van Gaal LF and the Belgian Diabetes Registry. High prevalence of
manifestations of gastric autoimmunity in parietal cell antibody-positive type 1 (insulin-dependent)
diabetic patients. J. Clin. Endocrin. Metab. 84(1):4062-4067, 1999.
Mandry, RC, Ortiz LJ, Lugo-Somolinos A and JL Sanchez. Organ-specific autoantibodies in Vitiligo
patients and their relatives. Int. J. Dermatol. 35(1): 118-121, 1996.
Kumar B, Sharma VK and S Sehgal. Anti-smooth muscle and anti-parietal cell antibodies in Indians
with alopecia areata. Int. J. Dermatol. 34(8): 542-545, 1995.
Chuang JS, Callagham JM, Gleeson PA and B-H Toh. Diagnostic ELISA for parietal cell autoantibody
using tomato lectin-purified gastric H+/K+-ATPase (proton pump). Autoimmun. 12:1-7, 1992.
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National
Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) 93-8395).
National Committee for Clinical Laboratory Standards,1991. Internal Quality Control: Principles and
Definitions; Approved Guideline, NCCLS Document C24-A, Vol 11(6).
7
QUANTA Lite i INOVA Diagnostics, Inc. są zastrzeżonym znakiem handlowym firmy
Copyright 2011. Wszelkie prawa zastrzeżone©
Wyprodukowano przez:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
Stany Zjednoczone Ameryki
Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): 877-829-4745
Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): 00+ 1 858-805-7950
[email protected]
Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej:
Medical Technology Promedt Consulting GmbH
Altenhofstrasse 80
D-66386 St. Ingbert, Niemcy
Tel.: +49-6894-581020
Faks.: +49-6894-581021
www.mt-procons.com
628765POL
Sierpień 2011
Wersja 0
8