pobierz

Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 3, str. 493–499
PRACA ORYGINALNA – Original Article
MARIA KOZŁOWSKA-SKRZYPCZAK, EWA BEMBNISTA, MIECZYSŁAW KOMARNICKI
Ocena zawartości autologicznych prekursorów układu granulocytarnego
w przeszczepie jako miarodajna metoda określenia klonogennych zdolności komórek hematopoetycznych i ich przydatności do transplantacji
An evaluation of the usefulness of granulocyte-monocyte precursors number as a
sound method of determinate the clonogenic abilities of the hematopoietic cells
and their transplantation utility
Katedra i Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych Układu Krwiotwórczego w Poznaniu
Kierownik: Prof. dr hab. med. Mieczysław Komarnicki
STRESZCZENIE
Wiedza na temat zawartości komórek hematopoetycznych (k.h.) w przeszczepie jest niezwykle istotna do zakwalifikowania preparatu do transplantacji, a określenie wzrostu klonalnego prekursorów układu granulocytarnego (CFUGM) pozwala na ocenę klonogennych właściwości k.h. zawartych w przeszczepie. W badaniach własnych ocenie
poddano 93 preparaty k.h. uzyskanych z krwi chorych na choroby limfoproliferacyjne. Chorzy byli w wieku średnio
47 (22–67) lat. Preparat k.h. zamraŜano w programowany sposób. Do kaŜdego preparatu dołączano materiał kontrolny, który umieszczano w probówkach 1,8 ml i zamraŜano łącznie z preparatem przeznaczonym do transplantacji.
ZamroŜone komórki przechowywano w zbiorniku magazynowym w temperaturze –170oC. Ocenę wzrostu klonalnego CFU-GM oceniano stosując technikę hodowli in vitro. Analizę statystyczną przeprowadzono stosując program
STATISTICA. Na podstawie uzyskanej analizy w preparacie rozmroŜonym nie stwierdzono istotnych statystycznie
róŜnic w wydajności wzrostu klonalnego CFU-GM z materiału uzyskanego od chorych na szpiczaka mnogiego, chłoniaki ziarnicze i nieziarnicze (p=0,477). Liczba kolonii utworzonych przez CFU-GM była zbliŜona w trzech grupach
badanych chorych (p=0,480), przy czym najmniejszy rozrzut obserwowano w wynikach prób pochodzących od chorych na chłoniaka Hodgkina, a największy w preparatach od chorych na chłoniaki nieziarnicze. Wiek chorych nie
miał istotnego wpływu na wydajność wzrostu klonalnego CFU-GM (p=0,630).
SŁOWA KLUCZOWE: Transplantacja autologicznych komórek hematopoetycznych z krwi – Przeszczep – Prekursory
układu granulocytarno-monocytowego.
SUMMARY
The knowledge of the content of the hematopoietic stem cells in the graft is crucial to the process of qualifying the
preparations for a transplant, while determining the clonogenic growth of the granulocyte-monocyte precursors
(CFU-GM) enables the estimation of the clonogenic properties of the cells in a transplant. 93 product collection of the
hematopoietic cells separated from the blood of lymphoproliferative disorders patients have been assessed in our research. The average age of a patient was 47 (22–67) years. A control material has been placed in 1.8 ml test-tubes and
frozen together with each preparation assigned for transplantation. The frozen cells have been stored in a container at
–170oC. The clonogenic growth of CFU-GM has been assessed using an in vitro method. Statistical analysis has been
conducted using a program STATISTICA. Based on the obtained analysis, statistical differences in the clonogenic
growth efficiency of CFU-GM in material acquired from Multiple myeloma, Hodgkin’s disease and non-Hodgkin’s
lymphoma patients was not significant (p=0.478). The number of CFU-GM precursors in three groups of studied patients was similar (p=0.478), while the smallest and the highest scatter was observed in the results relating to the studied groups of Hodgkin’s disease and non-Hodgkin’s lymphoma patients, respectively. The age of the patients did
not have a significant impact on the clonogenic growth efficiency of CFU-GM (p=0.630).
KEY WORDS: Autologous peripheral blood stem cells transplantation – Graft – CFU-GM.
494
M. KOZŁOWSKA-SKRZYPCZAK i wsp.
WSTĘP
Transplantacja autologicznych komórek hematopoetycznych separowanych z krwi jest powszechnie
stosowaną metodą leczenia chorych z rozpoznaniem chorób limfoproliferacyjnych. Autologiczne komórki hematopoetyczne (k.h.) przeznaczone do transplantacji zwykle poddawane są zamraŜaniu w parach ciekłego azotu i do chwili przeszczepienia przechowywane w niskiej temperaturze. Na kaŜdym
etapie pozyskiwania komórek oraz preparatyki dochodzi do ich strat [1, 2]. Zawartość hematopoetycznych komórek macierzystych (h.k.m.) oraz ich bardziej dojrzałych prekursorów w przeszczepie uzaleŜniona jest od wielu czynników, w tym od rozpoznania choroby i stanu jej zaawansowania oraz warunków preparatyki, w tym sposobu zamraŜania i przechowywania. Ocena liczby k.h.m. w przeszczepie
jest niezwykle waŜna dla uzyskania rekonstytucji krwiotworzenia u chorych po wysokodawkowej terapii. Powszechnie stosowanymi do oceny przydatności materiału do przeszczepienia są cytofluorymetryczne oznaczenia zawartości komórek z antygenem CD34 oraz badanie Ŝywotności komórek po inkubacji z błękitem trypanu i cytometryczna metoda z wykorzystaniem 7-amino aktynomycyny D [3, 4, 5].
Ocena liczby ukierunkowanych prekursorów układu granulocytarno-monocytowego (colony forming
unit granulocyte-monocyte; CFU-GM) stosowana od dawna pozwala dodatkowo ocenić zdolności klonogenne komórek krwiotwórczych na podstawie kolonii wytworzonych w hodowli in vitro [6].
W badaniach własnych oceniono wartość materiału przeznaczonego do przeszczepienia na podstawie liczby kolonii utworzonych przez CFU-GM. Analizę prowadzono w rozmroŜonych próbach, wcześniej zamroŜonych i przechowywanych w parach ciekłego azotu. Badania wykonane, z co najmniej
dwutygodniowym wyprzedzeniem przed planowaną transplantacją umoŜliwiają ocenę klonogennych
właściwości h.k.m. Ocena taka wydaje się dawać bardziej miarodajne wyniki, pozwalające na odzwierciedlenie rzeczywistej liczby krwiotwórczych komórek w przeszczepie.
MATERIAŁY I METODY
Ocenie poddano 93 preparaty komórek z krwi uzyskanych metodą aferezy. Badany materiał pochodził od chorych na choroby limfoproliferacyjne: szpiczaka mnogiego (MM; 41 prób), chłoniaka
Hodgkina (HD; 20 prób), chłoniaka nieziarniczego (NHL; 32 próby). Średni wiek pacjentów w grupie
chorych na MM wynosił 55 (35–67) lat, na NHL 36 (22–62) lat, na HD 55 (24–58) lat.
Kolekcja i krioprezerwacja komórek
Wszyscy chorzy w celu skutecznej zbiórki komórek, przed jej rozpoczęciem, byli poddani terapii
mobilizacyjnej. Afereza komórek przeprowadzona została przy uŜyciu separatora (Cobe Spectra). Jako
antykoagulant zastosowano ACD. Uzyskany preparat zawieszono w stosunku 1:1 w medium RPMI
1640 (Gibco, Anglia) zawierającym 20% dwumetylosulfotlenek (WAK, Niemcy) oraz 20% autologiczną surowicę, a następnie poddano programowanej krioprezerwacji w parach ciekłego azotu przy
uŜyciu aparatu firmy Consarctic (Niemcy). Dla kaŜdego preparatu przygotowano materiał kontrolny,
który umieszczono w probówkach o pojemności 1,8 ml (Nunc, Dania) oraz zamroŜono łącznie z preparatem przeznaczonym do transplantacji. Przygotowane w ten sposób komórki przechowywano w zbiorniku Consarctic w atmosferze par ciekłego azotu (–170°C).
Izolacja komórek jednojądrowych oraz technika hodowli CFU-GM in vitro
W celu oceny wzrostu klonalnego komórek, przygotowany materiał kontrolny rozmroŜono w temp.
37°C a następnie zawieszono w stosunku 1:9 z medium RPMI 1640. Przygotowaną w ten sposób zawiesinę komórek nawarstwiano na Gradisol L (Aqua Medica, Polska), a następnie poddawano wirowaniu (400×g, 15 min, 18°C). Wyizolowane w ten sposób komórki jednojądrowe przepłukiwano dwu-
Ocena zawartości autologicznych prekursorów układu granulocytarnego
495
krotnie płynem RPMI 1640 (200×g, 15 min, 18°C). Ich Ŝywotność po inkubacji z błękitem trypanu
wynosiła średnio 81 (60–96)%. Liczbę komórek jądrowych oceniano przy uŜyciu analizatora hematologicznego ABX Micros. Przygotowano zawiesinę 105 komórek jednojądrowych zawieszano w półpłynnym podłoŜu MethoCult GF H 4534 (StemCell Technologies Inc., Kanada) oraz umieszczono w płaskodennej 96 dołkowej płytce mikrotitracyjnej (Nunc, Dania). Hodowlę ukierunkowanych prekursorów
układu granulocytarno-monoctowego in vitro poddano ocenie po 7–8 dniach inkubacji (37°C, 5%
CO2, 100% wilgotności). Za kolonie uznawano skupiska składające się z co najmniej 50 komórek (Rycina 1).
Ryc. 1. Obraz mikroskopowy kolonii utworzonej przez CFU-GM w hodowli in vitro
Fig. 1. Granulocyte-monocyte colony formed by CFU-GM
Analiza statystyczna
Analizę statystyczną przeprowadzono w Programie STATISTICA w oparciu o test KruscallaWalissa przy poziomie istotności p<0,05. Analizie poddano równieŜ zaleŜność wzrostu klonalnego
CFU-GM od wieku pacjentów. W tym celu wykorzystano test Manna-Whitneya, gdzie za poziom istotności uznano p<0,05.
WYNIKI
Badaniu poddano 93 preparaty od chorych w wieku średnio 47 (zakres 22–67) lat. Materiał komórkowy od chorych ≤ 35 lat obejmował 21 preparatów, natomiast od osób starszych w wieku > 35 lat
ocenie poddano 72 preparaty (Rycina 2). Wyniki analizy liczby CFU-GM w preparatach w zaleŜności
od wieku chorych nie róŜnią się istotnie (p=0,630). Zwraca uwagę brak istotnych róŜnic w wartości
mediany liczby kolonii granulocytarnych dla grupy w wieku ≤ 35 lat oraz > 35 lat oraz rozpiętość zakresów dla dwóch badanych grup wynoszące odpowiednio 26-357 oraz 11-604 (Tabela 1).
W badaniach własnych oceniono zdolność wzrostu klonalnego prekursorów granulocytarnomonocytowych w 93 próbach zawierających hematopoetyczne komórki separowane z krwi chorych
na szpiczaka mnogiego, chłoniaka Hodgkina i chłoniaki nieziarnicze. Liczba kolonii utworzonych przez
CFU-GM we wszystkich próbach była na poziomie mediany 166 (11–604) kolonii/105 komórek jedno-
M. KOZŁOWSKA-SKRZYPCZAK i wsp.
496
Ryc. 2. Zdolność wzrostu prekursorów granulocytarno-monocytowych w poszczególnych grupach wiekowych. Wyniki analizy
statystycznej
Fig. 2. The growth ability of granulocyte-monocyte progenitors in different age groups. Results of statistical analysis
Tabela 1. Wzrost klonalny prekursorów granulocytarno-monocytowych w grupach wiekowych. Wyniki analizy statystycznej
Table 1. The clonal growth of granulocyte-monocyte progenitors in different age groups. Results of statistical analysis
Wiek chorych
(lata)
≤ 35
> 35
* Mediana (zakres)
Liczba kolonii utworzonych
przez CFU-GM
/ 105 komórek
Wartość testu MannaWhitneya
(Z, przy poziomie istotności
p<0,05)
p
–0,48
0,63
157 (26–357)*
160 (11–604)
jądrowych. Wydajność wzrostu klonalnego u chorych na MM, HD i NHL została przedstawiona na
Rycinie 3. Uzyskane wyniki dla testu Kruskala-Walissa szacują p na poziomie 0,477, tym samym nie
stwierdzono istotnych statystycznie róŜnic w liczbie kolonii utworzonych przez CFU-GM z preparatów
z krwi chorych na MM, HD i NHL. Uzyskane w analizie statystycznej wyniki wskazują na zbliŜoną
liczebność kolonii, która obejmuje swoim zakresem 50% wyników dla kaŜdej grupy (Rycina 3, analiza
kwarteli 25–75%).
Mediany wzrostu klonalnego CFU-GM oraz zakresy dla prób MM, HD i NHL przedstawiono
w Tabeli 2. W grupie HD obserwowano najbardziej zbieŜne wyniki liczebności kolonii, natomiast w
preparatach pochodzących od osób chorych na NHL stwierdzono najszerszy zakres uzyskanych wartości. Wszystkie badane próby pod względem wydajności wzrostu klonalnego CFU-GM kwalifikują ma-
Ocena zawartości autologicznych prekursorów układu granulocytarnego
497
teriał do przeszczepienia u chorych leczonych za pomocą wysokodawkowej chemioterapii wspomaganej transplantacją h.k.m.
Ryc. 3. Ocena statystyczna wzrostu prekursorów układu granulocytarno-monocytowych w preparatach od chorych na szpiczaka mnogiego (MM), chłoniaka Hodgkina (HD) i chłoniaki nieziarnicze (NHL)
Fig. 3. Statistical estimation of granulocyte-monocyte precursors growth in lymphoproliferative disease: myeloma multiple
(MM), Hodgkin’s disease (HD) and non-Hodgkin’s lymphoma (NHL)
Tabela 2. Wzrost prekursorów granulocytarno-monocytowych (CFU-GM) w preparatach z krwi uzyskanych od chorych na
szpiczaka mnogiego (MM), chłoniaka Hodgkina (HD) i chłoniaki nieziarnicze (NHL). Wyniki analizy statystycznej
Table 2. The clonal growth of granulocyte-monocyte progenitors in lymphoproliferative disease: myeloma multiple (MM),
Hodgkin’s disease (HD) and non-Hodgkin’s lymphoma (NHL). Results of statistical analysis
Rozpoznanie
MM
HD
NHL
* Mediana (zakres)
Liczba kolonii utworzonych przez
CFU-GM
/ 105 komórek
Wartość testu Kruskala-Walissa
(H; przy poziomie istotności p<0,05)
p
1,48
0,48
150 (27–504)*
160 (17–319)
188 (11–604)
498
M. KOZŁOWSKA-SKRZYPCZAK i wsp.
OMÓWIENIE WYNIKÓW
Istotnym czynnikiem wpływającym na powodzenie transplantacji jest liczba przeszczepianych komórek zdolnych do samoodnowy i róŜnicowania. U ludzi, określenie minimalnej liczby h.k.m. niezbędnej dla odtworzenia hematopoezy po wysokodawkowej terapii i p.k.h. jest z oczywistych względów
niemoŜliwe. W praktyce, juŜ od ponad 30 lat zawartość komórek macierzystych w materiale przeszczepianym oceniana jest pośrednio liczbą prekursorów układu granulocytarnego w hodowli in vitro. Wybór
tej metody uzasadnia wykazana w doświadczalnych badaniach współzaleŜność ilościowa pomiędzy
liczbą komórek jednojądrowych i h.k.m. oraz CFU-GM, stosunkowo krótki czas hodowli oraz powtarzalność uzyskiwanych wyników [7]. W piśmiennictwie istnieje zgodność, Ŝe przeszczepienie małej
liczby CFU-GM autologicznego szpiku moŜe łączyć się z wydłuŜeniem czasu rekonstytucji krwiotworzenia [8, 9]. Dane z piśmiennictwa wskazują, Ŝe dla uzyskania efektywnej rekonstrukcji krwiotworzenia chory powinien otrzymać przeszczep o zawartości CFU-GM przynajmniej 1–1,5×105/kg m.c. [10].
Inni sugerują, Ŝe liczba tych komórek nie powinna być mniejsza niŜ 2×105/kg m.c. [11].
W badaniach własnych analizie poddano wyniki wzrostu klonalnego CFU-GM w preparatach z
krwi chorych w wieku ≤ 35 lat oraz > 35 lat. Stwierdzono brak istotnych róŜnic w liczbie prekursorów
układu granulocytarno-monocytowego pomiędzy tymi dwiema grupami preparatów. Być moŜe brak
róŜnic wynikał z niewielkiej liczby chorych w grupie do 35 lat. Dane z piśmiennictwa wskazują na
trudności w pozyskaniu wymaganej liczby komórek krwiotwórczych od chorych w starszym wieku
oraz zaleŜność wydajności aferezy od czasu trwania i intensywności wcześniej stosowanej terapii [12,
13].
Podjęcie decyzji o zakwalifikowaniu preparatu komórek hematopoetycznych do transplantacji musi
opierać się na wnikliwej jego analizie. Oparta jest ona zazwyczaj na liczbie prekursorów CD34+ oraz
Ŝywotności komórek zawartych w przeszczepie. Zastosowanie błękitu trypanu (BT) oraz 7-amino aktynomycyny D (7AAD) pozwala na ocenę wyłącznie Ŝywotności komórek krwiotwórczych, nie daje
wglądu w ich zdolność do róŜnicowania i podziału. Stosowane metody oceny jakości komórek, zwłaszcza po ich rozmroŜeniu powinny wiarygodnie odzwierciedlać ich właściwości in vivo, czyli procesy,
które mają miejsce w organizmie człowieka, po transplantacji. Dlatego tak istotne znaczenie wydają się
mieć analizy wzrostu klonalnego komórek krwiotwórczych, w tym CFU-GM [14, 15]. Celem badań
własnych była analiza wydajności klonalnej ukierunkowanych prekursorów układu granulocytarnomonocytowego w róŜnych chorobach limfoproliferacyjnych. Ocenie poddano zdolność wzrostu klonalnego CFU-GM z materiału z aferezy od chorych na szpiczaka mnogiego, chłoniaka Hodgkina i chłoniaki nieziarnicze. Na podstawie przeprowadzonych badań wykazano brak statystycznej róŜnicy w liczbie uzyskanych koloni granulocytarno-monocytowych pomiędzy próbami pochodzącymi od chorych na
MM, HD oraz NHL. Stwierdzono duŜą rozpiętość wyników. NajwyŜszą wartość mediany wzrostu
CFU-GM obserwowano w przypadku NHL i w tej grupie stwierdzono największy zakres liczebności
kolonii. Najbardziej jednorodną grupę pod względem wydajności wzrostu klonalnego CFU-GM stanowiły preparaty pobrane od chorych na HD. RóŜnice w liczbie CFU-GM w poszczególnych preparatach
mogą wynikać z niejednorodności chorych, w tym róŜnic w czasie trwania choroby, rodzaju zastosowanego leczenia poprzedzającego mobilizację. DuŜe rozproszenie uzyskanych wyników moŜe świadczyć
o niejednakowej odpowiedzi na zastosowaną terapię mobilizującą. MoŜe wynikać z róŜnic w programach zastosowanych chemioterapii przeprowadzonych w celu przemieszczenia komórek ze szpiku do
krwi. Przypuszczenia te znajdują potwierdzenie w piśmiennictwie dotyczącym m.in. chorych na szpiczaka mnogiego oraz chłoniaki [16].
Opierając się na doświadczeniach i praktyce własnej naleŜy podkreślić, Ŝe oznaczanie liczby CFUGM w przeszczepie jest pomocne zwłaszcza w przypadku uzyskania istotnych róŜnic w wynikach
oznaczeń Ŝywotności za pomocą błękitu trypanu i 7 AAD lub otrzymaniu niskich wartości tych parametrów. Ocena wydajności wzrostu klonalnego CFU-GM w preparacie przeznaczonym do transplantacji
Ocena zawartości autologicznych prekursorów układu granulocytarnego
499
wydaje się równieŜ istotna wówczas, gdy liczba autologicznych komórek CD34+ oscyluje wokół dolnej
granicy wymaganej do uzyskania pomyślnych wyników leczenia tj. 2×106 CD34+/kg masy ciała.
PIŚMIENNICTWO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Humpe A, Riggert J, Vehmeyer K, Troff C, Hiddemann W, Kohler M, Wormann B. Comparison of CD34+ cell numbers
and colony growth before and after cryopreservation of peripheral blond progenitur and stem cell harvests: influence of
priori chemotherapy. Transfusion 1997; 37: 1050-57.
Fietz T, Reufi B, Mucke C, Thiel E, Knauf WU. Flow cytometric CD34+ determination in stem cell transplantation: before or after cryopreservation of grafts? J Hematother Stem Cell Res 2002; 11: 429-35.
Xiao M, Dooley DC. Assessment of cell viability and apoptosis in human umbilical cord blood following storage. J Hematother Stem Cell Res 2003; 12: 115–22.
Allan DS, Keeney M, Howson-Jan K, Popma J, Weir K, Bhatia M, Sutherland DR, Chin-Yee IH. Number of viable
CD34+ cells reinfused predicts engraftment in autologous hematopoietic stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant 2002; 29: 967-72.
Serke S, Johnsen HE. A European reference protocol for quality assessment and clinical validation of autologous haematopoietic blood progenitor and stem cell grafts. Bone Marrow Transplant 2001; 27: 463-70.
Yang H, Acker JP, Cabuhat M, Letcher B, Larratt L, McGann LE. Association of post-thaw viable CD34+ cells and CFUGM with time to hematopoietic engraftment. Bone Marrow Transplant 2005; 35: 881-87.
Feugier P, Bensoussan D, Girard F. Hematologic recovery after autologous PBPC transplantation: importance of the
number of postthaw CD34+ cells. Transfusion 2003; 43: 878-84.
Spitzer G, Verma DS, Fischer R. The myeloid progenitor cell-its value in predicting hematopoietic recovery after autologous bone marrow transplantation.Blood. 1980; 55: 317-23.
Schwartzberg L, Birch R, Blanco R. Rapid and sustained hematopoietic reconstitution by peripheral blood stem cell infusion alone following high-dose chemotherapy. Bone Marrow Transplant 1993; 11: 369-74.
To LB. Assaying the CFU-GM in blood: correlation between cell dose and haemopoietic reconstitution. Bone Marrow
Transplant 1990; 5: 16-8.
Bender J, To LB, Schwartzberg LS. Defining a therapeutic dose of peripheral blood stem cells. J Hematother 1992; 1:
329-41.
Pusic I, Jiang SY, Landua S, Uy GL, Rettig MP, Cashen AF. Impact of mobilization and remobilization strategies on
achieving sufficient stem cell yields for autologous transplantation. Biol Blood Marrow Transplant 2008; 14: 1045-56.
Azuma E, Hirayama M, Yamamoto H, Komada Y. The role of donor age in naive T-cell recovery following allogeneic
hematopoietic stem cell transplantation: the younger the better. Leuk Lymphoma 2002; 43: 735-9.
Jansen EM, Hanks SG, Terry C, Akard LP, Thompson JM, Dugan MJ. Prediction of engraftment after autologous peripheral blood progenitor cell transplantation: CD34, colony-forming unit-granulocyte-macrophage, or both? Transfusion
2007; 47: 817-23.
Bacigalupo A, Piaggio G, Podesta M, Figari O, Benvenuto F, Sogno G. Influence of marrow CFU-GM content on engraftment and survival after allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant 1995; 15: 221-6.
Engelhardt M, Winkler J, Waller C, Lange W, Mertelsmann R, Henschler R. Blood progenitor cell (BPC) mobilization
studied in multiple myeloma, solid tumor and non-Hodgkin’s lymphoma patients after combination chemotherapy and GCSF. Bone Marrow Transplant 1997; 19: 529-37.
Praca wpłynęła do Redakcji 20.06.2011 r. i została zakwalifikowana do druku 29.06.2011 r.
Adres Autora:
Katedra i Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych Układu Krwiotwórczego
ul. Szamarzewskiego 84
60-569 Poznań
Adres mailowy: [email protected]