zborník - Katedra fyziologie zivocichov
Transkrypt
zborník - Katedra fyziologie zivocichov
SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA KATEDRA FYZIOLÓGIE ŽIVOČÍCHOV VII. CELOSLOVENSKÝ SEMINÁR Z FYZIOLÓGIE ŽIVOČÍCHOV 23. - 24. mája 2007, Topolčianky, Nitra - Slovenská republika SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA KATEDRA FYZIOLÓGIE ŽIVOČÍCHOV ZBORNÍK z vedeckého seminára s medzinárodnou účasťou VII. CELOSLOVENSKÝ SEMINÁR Z FYZIOLÓGIE ŽIVOČÍCHOV 23.-24. mája 2007 Topolčianky, Nitra, Slovenská republika Redakčná rada: Ing. Adriana Kolesárová, PhD doc. MVDr. Peter Massányi,PhD. doc. Ing. Norbert Lukáč, PhD. Schválil rektor Slovenskej poľnohospodárskej univerzity v Nitre dňa 7.5.2007 ako zborník za vedeckého seminára s medzinárodnou účasťou ISBN 978-80-8069-886-7 Vedecký výbor: prof. Ing. Jozef Bulla, DrSc. Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre SR prof. MVDr.László Bárdos, Ph.D. Szent István University, Budapest, Hungary doc. MVDr. Viera Cigánková, PhD. Univerzita veterinárneho lekárstva, Košice, SR prof. MVDr., Ing. Pavel Jelínek, DrSc. Mendělevova univerzita poľnohospodárstva a lesníctva v Brne, Česká republika prof. Ing. Jaroslav Kováčik, Ph.D. Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre SR prof. MVDr. Imrich Maraček, DrSc. Univerzita veterinárneho lekárstva, Košice, SR prof. MVDr. Juraj Pivko, DrSc. Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre SR Dr. Robert Stawarz, Ph.D. Pedagogical University, Krakow, Poland doc. Ing. Miroslav Valent, Ph.D. West Virginia University, Morgantown, USA prof. dr. hab. Wladyslaw Zamachowski, Ph.D. Pedagogical University, Krakow, Poland prof. RNDr. Michal Zeman, DrSc. Univerzita Komenského, Bratislava, SR Organizačný výbor: prof. Ing. Jaroslav Kováčik, PhD. doc. MVDr. Peter Massányi, PhD. Ing. Adriana Kolesárová, PhD. doc. Ing. Norbert Lukáč, PhD. Ing. Marcela Capcarová, PhD. Ing. Anna Kalafová. Ing. Jiřina Kročková Ing. Monika Schneidgenová Ing. Peter Čupka Alena Balážová Viera Bösel Recenzenti: prof. Ing. Jaroslav Kováčik, PhD. prof. MVDr. Juraj Pivko, DrSc. doc. MVDr. Peter Massányi, PhD. Dr. Robert Stawarz, PhD. Dr. Grzegorz Formicki, PhD. RNDr. Janka Drábeková, PhD. Ing. Miroslav Juráček, PhD. VPLYV HYPODYNAMIE NA OBLIČKY JAPONSKÝCH PREPELÍC (COTURNIX COTURNIX JAPONICA) EFFECT OF HYPODYNAMY ON THE KIDNEYS OF JAPANESE QUAILS (COTURNIX COTURNIX JAPONICA) Almášiová, V., Cigánková, V., Holovská, K., Zibrín, M. Katedra anatómie, histológie a fyziológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva Košice Abstract The aim of present study was to observe the influence of simulated weightlessness on the structure and ultrastructure of kidneys of Japanese quails reared under the conditions of experimental long-term hypodynamy. Hypodynamy is a method to simulate weightlessness in the earth laboratory conditions. Two days after hatching the quails were suspended in special shirts below the ceiling of a cage so their feet did not touch the floor. They could consume food and water ad libitum. Experimental animals were sacrificed after 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, and 63 d of hypodynamy. Animals of the same age, hatched at the same time, and fed the same diet were used as controls. The samples of kidney were fixed and routinely processed for light (LM) and transmission electron microscopy (TEM). It has been found that at short-term hypodynamy (7–21 days) there is not a more pronounced damage of the kidney structure. Due to long-term hypodynamy (28–63 days) there are some morphological changes in the proximal and distal tubular cells as well as in collecting ducts. However, the structure of renal corpuscles was not damaged. Key words: microgravity, kidney, morphology, Japanese quails Úvod Pokroky v kozmickom výskume a pravdepodobnosť budúcich dlhotrvajúcich pobytov v kozme vyvolávajú záujem o ich účinky na človeka a zvieratá. Kozmické experimenty sú náročné a drahé, preto sa častejšie využívajú modelové pokusy. Jednou z metód imitujúcich stav beztiaže na Zemi v laboratórnych podmienkach je hypodynamia [15]. U vtákov sa používajú špeciálne košieľky zo sieťoviny, pomocou ktorých sú zvieratá zavesené na strope klietky tak, aby sa nemohli dotýkať podlahy, avšak aby mohli prijímať krmivo a vodu ad libitum [7]. Veľmi vhodným aviárnym biologickým objektom na študovanie vplyvu hypodynamie je Japonská prepelica. Je to vták s nízkou hmotnosťou tela, vysokou produkčnou a reprodukčnou schopnosťou, krátkym individuálnym vývojom, dobrou toleranciou na stiesnené podmienky a adaptabilitou na mikrogravitáciu [8, 17]. Zároveň má slúžiť ako nevyhnutný heterotrofný článok v uzavretom umelom ekosystéme kozmických lodí 5 na zabezpečenie produkcie živočíšnych bielkovín pre kozmonautov a vytvoriť psychologicky príjemnejšie prostredie pri dlhodobých pobytoch v kozme [1]. Materiál a metodika Experimenty boli robené na Ústave biochémie a genetiky živočíchov SAV v Ivanke pri Dunaji. Kurčatá japonských prepelíc oboch pohlaví neselektovanej línie na hypodynamiu dva dni po vyliahnutí boli premiestnené do špeciálnych klietok a zavesené do košieľok zo sieťoviny tak, aby sa nemohli dotýkať podlahy, avšak aby mohli prijímať krmivo a vodu ad libitum. Prepelice toho istého veku a rovnako kŕmené slúžili ako kontrolné. Hneď po usmrtení zvierat sme odobrali excízy z obličiek pokusných a kontrolných prepelíc na 7., 14., 21., 28. 35., 42., 49., 56. a 63. deň pokusu. Tkanivo sme spracovali na svetelnú (SM) a transmisnú elektrónovú mikroskopiu (TEM). Vzorky na SM sme spracovali rutinnou metódou fixáciou vo formaldehyde a zaliatím do parafínu. Excízy na TEM sme fixovali v 3% glutaraldehyde v kakodylátovom pufri, postfixovali 1% OsO4, odvodnili v acetóne a zaliali do Durcupanu. Ultratenké rezy kontrastované uranylaceátom a citrátom olovnatým sme pozorovali a fotografovali TEM Tesla BS 500. Histologické preparáty ofarbené H-E a polotenké rezy ofarbené toluidínovou modrou sme pozorovali svetelným mikroskopom Jenamed. Výsledky Pri krátkodobej (7 až 21 dňovej) hypodynamii nedochádza k výraznejšiemu poškodeniu štruktúry obličiek. Ich mikroskopický a submikroskopický obraz je v podstate rovnaký ako u kontrolných prepelíc. SM sme v kôrovej časti lalôčikov pozorovali početné obličkové telieska nepravidelného tvaru a v dreni lalôčikov väčšie, menej početné okrúhle obličkové telieska. TEM sme v kortikálnych aj medulárnych obličkových telieskach pozorovali glomeruly na povrchu ktorých boli podocyty. Tieto bunky mali veľké oválne jadro a obsahovali pomerne málo cytoplazmatických organel. Ich výbežky trabekuly a menšie pedikuly medzi ktorými sa nachádzali štrbinky neboli porušené. Bazálna membrána bola tenká a súvislá. Fenestrované krvné kapiláry, ktoré sú súčasťou filtračno-štrbinovej membrány nejavili nijaké známky poškodenia ich štruktúry. Kanáliky proximálneho segmentu, v ktorých prebieha tubulárna rezorpcia predstavujú najdlhšie úseky močového kanálika. Tvorili ich bunky cylindrického tvaru, ktoré v SM mali výrazne acidofilnú cytoplazmu a na apikálnom povrchu mali súvislý kefkovitý lem. Kanáliky 6 mali nepravidelný štrbinovitý lúmen a bočné hranice buniek boli málo zreteľné. Obsahovali typické tyčinkovité mitochondrie, ktoré bunkám dávali jemne prúžkovaný vzhľad. V TEM mali stredne elektróndenznú cytoplazmu a okrúhle jadro s difúzne rozptýleným chromatínom a výrazným jadierkom sa nachádzalo v bazálnej časti bunky. V cytoplazme obsahovali početné veľké mitochondrie pretiahleho tvaru s mitochondriovými kristami, ktoré boli orientované kolmo na bazálnu membránu. Bazálna membrána vytvárala početné invaginácie, ktoré zväčšujú jej povrch a sú dôležité pri zahusťovaní moču. Golgiho komplex tvorený cisternami a váčikmi bol uložený supranukleárne. V cytoplazme sa nachádzali aj cisterny granulovaného endoplazmatického retikula a lyzozómy. Na apikálnom povrchu buniek bolo veľké množstvo vysokých tenkých, paralelne usporiadaných mikroklkov. Početné pinocytárne váčiky, ktoré boli prítomné v cytoplazme svedčia o veľkej endocytóznej aktivite týchto buniek. Kanáliky distálneho segmentu tvorili bunky kubického tvaru. Lúmen distálnych kanálikov bol oproti lúmenu proximálnych kanálikov väčší. V SM mali bunky distálneho segmentu stredne acidofilnú cytoplazmu a na ich apikálnom povrchu sa nachádzali iba ojedinelé mikroklky. Mitochondrie usporiadané do stĺpcov podmieňujú pásikovaný vzhľad bazálnej časti týchto buniek. Hranice medzi bunkami boli zretelnejšie ako v proximálnom kanáliku. V TEM mali bunky stredne elektróndenznú cytoplazmu, jadro okrúhleho tvaru s difúzne rozptýleným chromatínom a výrazným jadierkom sa nachádzalo uložené v apikálnej časti bunky. Typické boli aj dlhé tyčinkovité mitochondrie a bunková membrána, ktorá v bazálnej časti buniek vytvárala početné hlboké invaginácie. O nižšej aktivite endocytózy týchto buniek svedčí aj prítomnosť ojedinelých pinocytárnych vezikúl a lyzozómov. Henleova slučka spája proximálny a distálny stočený kanálik a jej dĺžka sa líši podľa typu nefrónu. Kôrové nefróny majú iba krátky kanálik vystlaný jednou vrstvou plochých buniek, kým dreňové nefróny majú dlhú Henleovu slučku pokračujúcu smerom do drene lalôčika a vracajúcu sa opäť do kôry lalôčika. Preto sa nazýva častejšie medulárnou slučkou a je zložená z tenkého a hrubého segmentu. Intermediárne nefróny majú medulárnu slučku krátku. Bunky tenkého segmentu boli dlaždicovitého tvaru a mali okrúhle alebo oválne centrálne uložené jadro. Na apikálnej časti buniek sa nachádzali ojedinelé krátke nepravidelné mikroklky. V cytoplazme boli roztrúsené malé mitochondrie, granulované endoplazmatické retikulum a voľné ribozómy. Bazálna membrána netvorila interdigitáciíe a prstovité výbežky. Bunky hrubého segmentu mali podobnú štruktúru, len boli tvorené vyššími bunkami. 7 Distálny kanálik ústi do zberacích kanálikov ktoré prebiehajú medzi jednotlivými lalôčikami, vytvárajú medulárny konus a ústia do močovodu. V SM boli bunky zberacích kanálikov svetloružovo sfarbené, výrazne ohraničené a kupolovite vyčnievali do lúmenu. V TEM sme pozorovali, že stenu zberacích kanálikov tvorili dva typy buniek, svetlé a tmavé. Svetlé viacpočetné bunky kubického tvaru mali pomerne veľké centrálne uložené jadro a v cytoplazme obsahovali málo cytoplazmatických organel. Pomerne malé mitochondrie boli orientované rôznym smerom a bazálna membrána nevytvárala záhyby. Na apikálnom povrchu sa nachádzali len ojedinelé malé mikroklky. Tmavé ojedinelé bunky obsahovali viac mitochondrií a vezikúl a na povrchu mali vyššie mikroklky. V obličkách prepelíc pri dlhodobej (28 až 63 dňovej) hypodynamii sme SM nepozorovali výraznejšie morfologické zmeny. Avšak TEM sme zistili nasledovné zmeny: V proximálnych kanálikoch sa nachádzali dva typy buniek. Svetlé bunky s elektrónlucentnou cytoplazmou a tmavé bunky s elektróndenznou cytoplazmou. Svetlé bunky mali okrúhle jadro s difúzne rozptýleným chromatínom a v cytoplazme obsahovali početné mitochondrie oválneho tvaru s mitochondriovými kristami. V niektorých bunkách sa nachádzali mierne dilatované mitochondrie a početné svetlé vakuoly s obsahom vločkovitého materiálu. Na apikálnom povrchu boli mikroklky bez výraznejších známok poškodenia. Tmavé bunky mali elektróndenznú cytoplazmu a obsahovali dlhé tyčinkovité mitochondrie s tenkými kristami a menšie vakuoly. Mali výrazne tmavé scvrknuté jadro. Mikroklky na apikálnom povrchu týchto buniek boli tmavé so zastretou štruktúrou. Niektoré mikroklky vytvárali závitnicové štruktúry. V obličkách pokusných zvierat na 63. deň hypodynamie niektoré proximálne kanáliky obsahovali len tmavé bunky. U pokusných prepelíc sa v cytoplazme apikálnej časti buniek distálneho kanálika nachádzal vločkovitý materiál. Na 42. až 63. deň hypodynamie sme v cytoplazme zberacích kanálikov pozorovali veľké svetlé vakuoly, ostatné organely nejavili známky poškodenia. Diskusia Renálne funkcie, ako metabolizmus vody a solí sú v podmienkach mikrogravitácie extrémne zaťažené, pretože telové tekutiny lokalizované v nižších oblastiach tela sa presúvajú smerom ku hlave a do hrudnej oblasti „blood shift“[14, 15]. Je zvláštne, že počas skorých fáz simulovaných experimentov napríklad u „bed rest“ a „water immersion“ bola zaznamenaná zvýšená diuréza [2, 15, 18], ale v priebehu reálnych letov do kozmu bola diuréza naopak znížená [6, 12, 13, 14]. Vysvetlením môže byť skutočnosť, že na organizmus pri kozmickom lete významne vplýva stres a ten aktiváciou sympatika zapríčiní zvýšenie hladín 8 glukokortikoidov a katecholamínov, ktoré sekundárne cestou konstrikcie obličkových ciev znížia diurézu [6]. Kostra a svalstvo, ktoré zabezpečujú podpornú funkciu organizmu, reagujú na mikrogravitáciu atrofiou svalstva končatín a osteoporózou [21, 22]. U ľudí, ktorí absolvovali pobyt v kozme, sa v dôsledku zvýšenej rezorbcie kostného tkaniva zistilo aj riziko tvorby močových kameňov. K ich tvorbe významne prispieva saturácia moča soľami Ca (hyperkalciúria), pokles obsahu citrátov v moči, redukcia objemu a zmena pH moča [19, 20]. Pri dlhodobých kozmických letoch ako aj pri dlhotrvajúcich modelových pokusoch nastávajú zmeny vodno- elektrolytovej rovnováhy, exkrécia Na a diuréza klesá, naopak exkrécia Ca a produkcia ADH a hormónov zahrnutých v RAAS (renín-angiotenzín-aldosterón-systém) stúpa [12]. Viacerí autori zistili morfologické zmeny v dôsledku mikrogravitácie v kozme a hypodynamie na Zemi aj v obličkách potkanov. Počas kozmického letu sa ich obličky, ale aj pľúca, srdce a nadobličky značne zväčšili [10, 11]. Už po 1 hodine po zavesení potkanov za chvost došlo medzi proximálnymi kanálikmi k rozšíreniu intersticiálnych priestorov [16]. Štruktúru a ultraštruktúru obličiek dospelých japonských prepelíc, ktoré boli 7 dní v kozme študovali Cigánková a kol. a Kočišová a kol. [3, 9]. Prepelice rovnakého veku odchované v laboratóriu slúžili ako kontrola. Autori zistili, že krátkodobá mikrogravitácia nemá nepriaznivý dôsledok na štruktúru, ani funkciu obličiek [3, 9]. Cigánková a kol. [4, 5] zistili morfologické zmeny aj v nadobličkách japonských prepelíc, ktoré sa vyliahli na orbitálnej stanici MIR. Zmeny mali podobný charakter aký je známy pri strese. Svedčí to o tom, že už aj krátkodobý pobyt v kozme má nepriaznivý vplyv na organizmus kurčiat japonských prepelíc. Zistené zmeny sú autormi považované za reverzibilné [6, 15]. Mikrogravitácia v kozme a hypodynamia na Zemi zapríčinila zvýšenie koncentácie katecholamínov a kortikosteroidov v krvnej plazme japonských prepelíc, naopak koncentrácia estradiolu v krvnej plazme prudko klesla [6, 8]. Záver Z našich pozorovaní môžeme usúdiť, že krátkodobá (7 až 21 dňová) hypodynamia nespôsobuje v obličkách japonských prepelíc výraznejšie morfologické zmeny. Vplyvom dlhodobej (28 až 63 dňovej) hypodynamie vznikajú morfologické zmeny v bunkách proximálnych a distálnych kanálikov ako aj v bunkách zberacích kanálikov. Štruktúra obličkových teliesok nebola poškodená. Zmeny pokladáme za reverzibilné a pripisujeme ich 9 skôr regulačnému pôsobeniu obličiek v rámci adaptácie na hypodynamiu ako poruchám funkcie nefrónov. Pokusy dokázali, že japonské prepelice žijúce v nepriaznivých podmienkach hypodynamie rástli, vyvíjali sa a dosiahli produkčný vek. Práca bola finančne podporená Grantovou agentúrou VEGA 1/3495/06 Literatúra 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. Boďa K.: Kozmická biológia. Gravitačná fyziológia. Vydavateľstvo SAV, Košice, 1984, s. 9-22. Baisch F.J.: Head down tilt combined with breathing assistance by the „Iron lung“. A new simulation model for cardiovascular deconditioning, skin and kidney function in weightlessness. J. Gravit. Physiol. 2002, 9,1, 67-68. Cigánková V., Kočišová J., Boďa K., Tomajková E., Dadasheva O. A.: Morphological changes in tissue of the testes and kidneys in Japanese quail exposed to microgravity. Acta Vet., Brno, 1993, 62, 69-71. Cigánková V., Lenhardt Ľ., Zibrín M., Kočišová J., Tomajková E., Komorová T., Sabo V., Boďa K., Dadasheva O.A., Guryeva T.S.: Histological changes in the adrenal glands of newly hatched Japanese quail chicks during a short stay on the orbital station Mir. Folia Veter., 2001, 45, 1, Suppl., 36-40. Cigánková V., Zibrín M., Kočišová J., Tomajková E., Sabo V., Boďa K., Dadasheva, O.A., Guryeva, T.S.: Morphological changes in the adrenals of Japanese quail chickens hatched out in microgravity. Aviakosm. Ekolog. Med., 2002, 36, 5, 29-32. Christensen N.J., Drummer C., Norsk P.: Renal and sympathorenal responses in space. Am. J. Kidney Dis. 2001, 38, 3, 679-683. Juráni M.., Výboh P., Lamošová D., Barošková Ž., Somogyiová E., Boďa K., Gažo M.: The effect of a 90- day hypodynamy on the neurohumoral system, egg laying and metabolism of proteins in Japanese quail. Physiologist 1983, 26, 6, 145-148. Juráni M., Boďa K., Výboh P., Zeman M., Lamošová D., Somogyová E., Košťál Ľ., Baumgartner J.: An endocrine response to short-term hypodynamy in Japanese quail selected for resistance to hypodynamy. Physiologist, 1991, 34, 129-131. Kočišová J., Cigánková V., Marcaník J., Boďa K., Tomajková E., Dadasheva O.A., Sabo V.: Ultrastructural and histochemical changes in tissues of Japanese quails exposed to 7- days microgravity. In: Current Trends in Cosmic Biology and Medicine, (Eds.) Boďa, Baranov, Slovak Academy of Science, Ivanka pri Dunaji, 1991, pp.201-208. Miyake M., Yamasaki M., Hazama A., Nielsen S., Shimizu T.: Effect of microgravity on organ development of the neonatal rat. Biol. Sci. Space 2004, 18, 3, 126-127. Miyake M., Yamasaki M., Hazama A., Nielsen S., Shimizu T.: Effect of microgravity on organ development of the neonatal rat. Biol. Sci. Space 2004, 18, 3, 126-127. Morukov B.V., Noskov V.B., Larina I.M., Natochin I.V.: The water-salt balance and renal function in space flights and in model experiments. Ross. Fiziol. Zh. Sechenova 2003, 89, 3, 356-367. Norsk P., Christensen N.J., Bie P., Gabrielsen A., Heer M., Drummer C.: Unexpected renal responses in space 2000, Lancet. 356, 1577-1578. Norsk P.: Cardiovascular and fluid volume control in humans in space. 2005, Curr. Pharm. Biotechnol., 6, 4, 325-330. Planel H.: Space and Life. An Introduction to Space Biology and Medicine. Gravity and Weightlessness CRC Press, Boca Raton-London-New York-Washington, D.C., 2004, p. 27-34. Pettis C.R., Drake M., Witten M.L., Truitt J., Braun E., Lindberg K., McNeil G., Hall J.N.: Early renal changes in 45 degrees HDT rats. Acta Astronaut. 2002, 50, 6, 393-398. Škrobánek P., Hrbatá M., Baranovská M., Juráni M.: Growth of Japanese quail chicks in simulated weightlessness. Acta Vet. (Brno), 2004, 73, 157-164. Wang T.J., Wade C. E : Renal function of rats in response to 37 days of HDT. J. Gravit. Physiol. 2001, 8, 2, 85-89. Whitson P.A., Pietrzyk R.A., Morukov B.V., Sams C.F.: The risk of renal stone formation during and after long duration space flight. Nephron 2001, 89, 3, 264-270. Zerwekh J.E.: Nutrition and renal stone disease in space. Nutrition 2002, 18, 10, 857-863. Zibrín M., Cigánková V., Kočišová J., Tomajková E., Komorová T., Lenhardt Ľ., Sabo V., Boďa K., Dadasheva O.A., Guryeva T.A.: The structure of some tissues and organs of Japanese quail hatched on the orbital space station “Mir”. Folia Vet., 2001, 45, Suppl., 17-22. Zibrín M., Boďa K., Cigánková V., Kočišová J., Tomajková E., Komorová T., Sabo V., Pivko J.: Long – term experimental hypodynamy affects the structure of spongy bone and osteoclasts in Japanese quail. Acta Vet. (Brno), 2003, 72, 143-149. 10 Viera Almášiová, MVDr., Univerzita veterinárskeho lekárstva, Ústav histológie a embryológie, Komenského 73, 041 81 Košice, e-mail: [email protected] THE EFFECT OF INCLUDING FABA BEAN IN THE DIET AND HEN’S AGE ON EGGS ALBUMIN QUALITY AL-Sardary Sardar Y. T. - Abas. Kamaran Abduljalil Animal Department, Agricultural College, Salahaddin University- Iraq Abstract The aim of this experiment was to study the influence of field beans (FB) and also birds’ age on some albumin parameters of commercial layers. Seven different experimental diets (Raw Faba Beans “RFB” 10%, 20% and 30% compared with Roasted Faba Beans “RoFB” 10%, 20% and 30%) and both groups compared with commercial layers’ diet labeled control (C). The experiment was performed in a seven group laying test with 3 replicates, with a total number of 630 birds aged 43 weeks. The control group and six trial groups were enclosed in 3 floor caged batteries. To test the effect of the birds’ age on the albumin quality, 28 days during the experiment period (P) were observed. For the feeding we used a feed mixture of wheat, barley, soybean meal, RFB or RoFB, vegetable fat with an addition of minerals, vitamins and enzymes. The influence of the diet and ages on Haugh Unit (HU), Albumin Index (AI) and Albumin Percentage (AP) were studied. HU increased significantly with including RFB and RoFB in the diet compared with C. And the values were increased linear with increasing RoFB levels. AI also increased generally, and the values were significant at the level of 10% and 20% for both RFB and RoFB groups compared with C. But was insignificant at the level of 30% for both RFB and RoFB groups. HU decreased with the increasing of the bird’s age but AI and AP increased significantly by advanced ages of the bird. Key words: vicia faba, Layers, Haugh Unit, Albumin Index, Albumin Percentage. Introduction The use of legumes as sources of protein for the animal feed industry is expected to increase further in the near future. Rising incomes in the Asian region are increasing the demand for meat products, and hence the requirement for animal feeds. There have been changes in public perception and some unfortunate developments, such as the consequences of ‘mad cow’ disease (i.e. bovine spongiform encephalopathy or BSE) in UK. This has resulted in many poultry feed industries either choosing to, or being banned from, using 11 animal by-products as a source of protein (Farrell, 1997). Single source of plant protein is not comfortable to provide the exact amino acids required for all animals. It is, therefore, preferable to include a range of protein sources in diet formulations, each complementing the other (Hanburya, 2000). The feeding value of the egg and marketing interest depending on the inner egg quality, which are the physical characteristics like Haugh Unit, Albumin index and Yolk index (Card and Nesheim,1971). Eggs inner composition affected by the food, birds’ age, strain, seasons and storage (Panda,1998). Prochaska et al (1996) observed a significant increase in albumin weight by increasing lysine content of layers diet. Silversides and Scott (2001) pointed out that the diet dos not affected the HU values. But Mateos and Puchal (1982) found that including faba bean in the diet increased significantly (p ≤ 0.05) the HU value. In addition the HU value increased with increasing of faba bean content in layers diet. Mateos and Puchal (1982) and Robblee et al (1977) pointed out significant results by consuming diets containing 10%, 20% and 30% of RFB, and HU increased progressively. Also Campbll et al (1980) found an increase in HU in groups consumed diet with 25.5% RFB compared with control. And Mateos and Puchal (1982) observed a significant increase in HU in groups consumed diets containing 55% RFB. But in other experiment Mateos and Puchal (1982) observed that diets containing 4%, 8% and12% RFB has not affected HU value. In general HU value will decrease by increasing birds age ( Austic and Nesheim,1990: Solomn,1997: Lapao et al, 1999: Tharrington, 1999). While AI value increase with advanced ages of the bird. Silversides (1994) demonstrated that total albumin content in the egg increase with the advanced ages of the bird But not significant (Lee and Garlich, 1992: Hussein et al,1993). And the AP decreased significantly (Anderson et al, 1978: Fletcher et al, 1981and 1983: Haq et al,1996: Silversides and Scott, 2001). While Rossi and Pompei (1995) and Al-haweizy (2002) observed a significant increase in AP with increasing birds age. Materials and methods The experiment was carried out within the Erbil poultry project, and the laboratory analysis in the nutrition laboratory of the Agriculture College of the University of Salahaddin. The study comprised the determination of the effects of using 10%, 20% and 30% of RFB and the same levels of RoFB compared with the control group, and the effect of the birds age, 12 with commercial Hy-Line®W98 layers, on Haugh Unit (HU), Albumin index (AI) and Albumin Percentage (AP) were studied. 630 hens aged 43 weeks were used. The birds were housed in automatic controlled housings in 3 floor caged batteries (45×40×45 cm) for each cage. And they were distributed randomly into seven groups, each group comprised 90 birds distributed in 18 cages (3 replications × 6 cages × 5 birds) where feed with different feed mixtures as illustrated in (table 1). The experiment period was 140 days. Diets were fed to birds ad libitum, and at the end of the week remaining diets were collected and weighed to determine the daily feed consumption for each replication. The daily light period was 17 hours with light density 10 lux. Heating temperature was (126°c – 130oc) for the toasting of the fb seeds. Chemical analyses of the seeds were carried out according to a.o.a.c. 1975. Moisture was 7.08%, crude protein was 23.5%, crude fat was 1.0%, crude fiber was 7.72%, and ash was 3.7%. Statistical analyses were carried out by a factorial experiment conducted in c.r.d, with the model equation yijk = µ + ti + pj + eijk. Analyzed results and compared means by the duncan multiple range test (duncan, 1955), on a probability level of 5%. Results and discussion Significant lower value of HU observed in the control group compared to the other groups (table 2). This is could be attributed to the contribution of FB content in the other groups diet. Due to the effect of contribution of FB proteins, which are rich in lysine amino acid ( Prochska et al,1996), and contribute in the structure of the Ovomucin protein, which is responsible on the frim of the albumin (Tossant and Latshow,1999). In the other hand HU value decreased with increasing RFB level in the diet and the opposed with RoFB. This is could be attribute to the effect of the heat treatment, which may be reduce ANFs effects, thus lead to the best utilization of lysine amino acid by the intestine mucosal, and due to the protein degradation. Insignificant depression observed with the increasing of birds ages during the first four periods. And values were significantly higher than P5 (table 3). This is could be attributed to the depression of feed efficiency during the last periods of birds age (Davidson, 1973: Klieste,1976: Scott et al,1982).These results confirm the results obtained by (Canningham et al, 1960: Izat,1985: Silversides and Scott,2001). AI values were higher in all treatments compared to the control (table 1). But T3 and T6 were insignificantly higher than the control. And also the values in T1, T2 and T3 are higher 13 insignificantly than T4, T5 and T6. this is attributed to the improving in the utilization of the protein included in the diet due to the low level of ANFs in these diets, but with increasing the content of the FB the AI value will decrease. A relative increase of AI was observed with the increase of bird’s age. These results conformable to (Canningham et al,1960: Izat, 1985: Lapao et al, 1999: AL-Haweizy, 2002). AP values in the treatments containing RFB or RoFB were higher than control, and tend to be higher in which treatments contained RoFB in the diet. This is attributed to the improving of utilization of protein content of the diet. AP increased significantly with advanced ages of the bird. This is attributed to the increase of eggs weight (Ahn et al,1997), in addition decreasing of egg yolk (Rose, 1997). Values in P3, P4 and P5 were significantly higher than P1 and P2. This is attributed to the increase of androgen and progesterone hormones with the increase of birds age, which affecting the secretion of the albumin in to the oviduct. Conclusions There is possibility to including the Faba Bean seed as raw or toasted at 10 % level in layers diet to obtain higher quality of table eggs for consumption, and also obtain a safely products by feeding hens, diets without animal protein sources. The age of the hen doesn’t affect the eggs albumin quality in generally and tend to be better by advanced ages of the bird particularly during our experiment period. Table 2 The effect of the treatments on Haugh Unit, Albumin Index and Albumin Percentage. Treatments Albumin characters Haugh Unit Albumin Index percentage Control 78.87±0.82c 41.9±1.7cd 63.28±0.29cd T1 83.16±0.61a 48.2±1.5a 63.17±0.23cd T2 83.26±0.71a 49.28±1.5a 64.38±0.22a T3 81.73±091ab 45.43±1.8bcd 63.32±0.23cd T4 81.08±0.90b 46.6±1.7ab 63.95±0.22ab T5 83.43±0.91a 45.4±1.8ac 63.58±0.29bc T6 83.67±0.87a 45.1±1.9ad 63.51±0.25bd 14 Table 3 The effect of bird’s age on Haugh Unit, Albumin Index and Albumin Percentage. Periods in weeks Albumin Characteristics Haugh unit Albumin index a 38.28±1.1 percentage d 61.96±0.21c P1 (43-46) 83.57±0.72 P2 (47-50) 82.15±0.73ac 51.2±1.4a 62.96±0.27b P3 (51-54) 82.93±0.71ab 46.0±1.5bc 64.11±0.41a P4 (55-58) 81.53±0.66ad 46.7±1.2ac 64.52±0.12a P5 (59-62) 80.67±0.70bcd 47.7±1.5ab 64.35±0.13a Numbers with small letters means, differences are significant ( P ≤ 0.05). Table 1 Compositions %, and calculated chemical analyses of the diets. Treatments Feed staffs % T1 T2 T3 T4 T5 T6 Cont. Broad bean % 10 20 30 10 20 30 0.0 SBM 44%* 10.985 6.618 2.252 10.985 6.618 2.252 15.347 Wheat 11.833 20.636 29.444 11.833 20.636 29.444 3.260 Barley 55.240 40.714 26.188 55.240 40.714 26.188 69.518 Vegetable Fat 0.800 0.800 0.800 0.800 0.800 0.800 0.800 Methionine 0.138 0.171 0.203 0.138 0.171 0.203 0.106 Lysine 0.122 0.127 0.132 0.122 0.127 0.132 0.117 Limestone 9.291 9.278 9.265 9.291 9.278 9.265 9.303 Di Cali Pho** 1.017 1.055 1.094 1.017 1.055 1.094 0.979 Salt 0.375 0.375 0.374 0.375 0.375 0.374 0.376 [Cx-Layer]*** 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 Avienzyme**** 0.080 0.080 0.080 0.080 0.080 0.080 0.080 Choline Chloride 0.044 0.069 0.093 0.044 0.069 0.093 0.039 Minerals***** 0.050 0.050 0.050 0.050 0.050 0.050 0.050 Calculated Chemical analyses of diets MJ, ME/Kg Diet 10.76 10.76 10.76 10.76 10.76 10.76 10.76 Crud Protein % 15.19 15.19 15.19 15.19 15.19 15.19 15.19 15 Crud Fiber% 5.503 5.308 5.144 5.503 5.308 5.144 5.608 Calcium % 3.700 3.700 3.700 3.700 3.700 3.700 3.700 Phosphorus% 0.350 0.350 0.350 0.350 0.350 0.350 0.350 Lysine5 0.800 0.800 0.800 0.800 0.800 0.800 0.800 Methionine+Cystin% 0.58 0.580 0.580 0.580 0.580 0.58 0.580 Sodium 0.170 0.170 0.170 0.170 0.170 0.170 0.170 ME / CP 0.708 0.708 0.708 0.708 0.708 0.708 0.708 *Soy bean meal ** Di Calcium Phosphate ***Vitamin Complex, K3, E, Biotin, Pantothenic acid, Niacin, Folic acid, B12, B6, B2, B1, D3, A **** Xylanase, β-Glucanase ***** Mineral Complex, Cu, Fe, I, Mn, Si VPLYV EXPERIMENTÁLNEHO PODANIA NIKLU NA KVALITU BIELKA A HMOTNOSŤ KONZUMNÝCH VAJEC EFFECT OF EXPERIMENTAL ADMINISTRATION OF NICKEL ON EGG ALBUMEN QUALITY AND EGG WEIGHT OF MARKET EGGS Arpášová, H., Massányi, P., Capcarová, M., Kolesárová, A., Kalafová, A. Slovenská poľnohospodárska univerzita Abstrakt The experiment was implemented on the efficient Isabrown laying hens producing brown shell eggs. We used 53 weeks old hens. The hens were fed by the standard feed mixture HYD – 10. Animals accepted fodder ad libitum. Hens (n=20) were divided into four groups (K, E1, E2, E3). Experimental hens (5 in each group) received nickel (NiCl2) per os in drinking water for 28 days. In control group K hens taked drinking water without additions, in experimental groups was supplement in the drinking water nickel (NiCl2) in different concentrations. In experimental group E1 in concentration 0.02g.l-1, in experimental group E2 in concentration 0.2g.l-1 and in experimental group E3 in concentration 2g.l-1. In all groups laying hens accepted drinking water ad libitum. The experiment lasted 28 days. The following efficiency indexes were monitored, namely egg weight, albumen weight, index of albumen, percentage and the Haugh units of the albumen. The greatest differences during experiment were achieved between control group C and experimental group E3 with the highest concentration 2 g.l-1 NiCl2. Different in values in the other groups with low concentrations NiCl2 weren´t so bold in comparison with control group. The egg weight was in order groups: 16 62.27; 59.11; 64.90; 50.97g. Statistically significant differences were achieved among the following combinations of the groups: very high significant difference (P≤0.001) between control group and experimental group E3, between experimental groups E3 and E2 respectively E3 and E1; high significant difference (P≤0.01) between experimental groups E1 and E2. Different between control group and experimental group E3, between experimental groups E3 and E2 respectively E3 and E1 were statistically very high significant (P≤0.001) for albumen weight. Statistically high significant difference (P≤0.01) was observed between experimental groups E2 and E1 and significant difference (P≤0.05) was observed between control group and experimental group E2. Different between control group and experimental group E2 respectively experimental groups E3 and E2 were statistically significant (P≤0.05) for percentage albumen from egg weight. By evaluation of Index albumen and Haugh units were found no significant differences between control and experimental groups (P>0.05). Úvod Stopové prvky ako kadmium, olovo, chróm, nikel, ortuť, arzén majú na živý organizmus toxický efekt a sú často považované za kontaminanty (He et al. 2005). Nikel je toxický prvok, zlúčeniny dvojmocného niklu sú karcinogénne ako pre ľudí tak aj pre zvieratá. (Prokeš et al. 2005). Nikel sa zúčastňuje pri tvorbe krvi a ovplyvňuje hladinu inzulínu v krvi. Najviac ho obsahuje pečeň a perie, je považovaný za slabý karcinogén. Je známe, že môže určitým spôsobom ovplyvniť DNA (Matkar et al. 2006). Výsledky práce Martinez, Diaz (1996) ukázali, že doplnok vysokých dávok Ni a Mn signifikantne zvyšujú obsah hemoglobínu v krvi a tiež pH. Jeho toxická dávka je pomerne vysoká a prejavuje sa nechutenstvom, znížením úžitkovosti a vyššou mortalitou. Toxicita niklu vyvoláva veľký záujem kvôli rozšírenému výskytu Ni v prostredí. Možným vysvetlením ako Ni spôsobuje poškodenie a smrť buniek, je peroxidácia lipidov a tvorba reaktívnych foriem kyslíka. V experimentoch sa už po 1 hodine od aplikácie Ni ľudským lymfocytom zistila zvýšená tvorba hydroxylových radikálov, čo hrá úlohu pri oxidatívnom poškodení ľudských lymfocytov akútnym účinkom niklu (Chang-Yu Chen et al. 2003). Potrava s nízkym obsahom niklu, menej ako 0,1 mg.kg-1 sušiny, vedie k symptómom deficiencie. Na nikel sa môže vytvoriť alergia, vonkajšie vystavovanie sa zliatinám niklu môže spôsobiť zápaly kože – dermatitídy. Experiment so štyrmi druhmi zvierat ukázal, že vystavovanie sa niklu vedie k poruchám v metabolizme horčíka a predovšetkým zinku (Anke et al. 1995). Výsledky experimentu autorov Kpomblekou et al. (2002), ktorí skúmali vzorky podstielky brojlerových kurčiat ukázali širokú variabilitu koncentrácie minerálií, pri nikle bol rozsah 0,2-25,1 mg.kg-1. Wilson et al. (2001) skúmali vo svojich pokusoch efekt niklu v dávkach 0; 25; 50; 75; 100 a 17 150 mg.kg-1 na pevnosť kostí a úžitkové parametre kohútov broilerového typu ustajnených na hlbokej podstielke a v klietkach. Štandardná kŕmna zmes v tomto experimente bola obohatená o 25 mg niklu na kg krmiva. Nikel nemal významný efekt na živú hmotnosť brojlerových kurčiat v klietkach ani na podstielke, neovplyvnil ani pevnosť holennej kosti u kurčiat, podobne merateľná hustota kostí nebola niklom ovplyvnená. Fakayode et al. (2003) analyzovali obsah ťažkých kovov vo vajciach sliepok. Autori našli silné pozitívne korelácie medzi hladinami kovov v krmive a vo vajciach, priemerné koncentrácie niklu vo vajciach boli 0,03 mg.kg-1. Meluzzi et al. (1996) sledovali transfér ťažkých kovov (Cr, Ni, Pb) do vajca, ťažké kovy boli podávané sliepkam perorálne, krmivom obohateným troma rozdielnymi dávkami, nižšou, zhodnou a vyššou ako je prípustná hranica pre každý kov. Pre nikel boli dávky 100, 300 a 500 ppm ako NiSO4. Koncentrácie niklu boli v širokom rozpätí, od 71 do 964 ppb pre bielok, 196 – 259 ppb pre žĺtok a 115 – 345 ppb pre škrupinu. Hladina niklu vo vajciach sa zvyšovala predlžovaním pokusu z 30 na 75 dní. Podiel olova transferovaného do jedlých častí vajca bol v porovnaní s niklom vyšší. Znáška a kvalita vajec boli ťažkými kovmi signifikantne negatívne ovplyvnené. Materiál a metodika Do experimentu bolo zaradených 20 nosníc znáškového hybrida Isabrown vo veku 53 týždňov. Pokusné nosnice boli ustajnené v konvenčnej trojetážovej klietkovej batérii, kŕmené boli ad libitum, kompletnou kŕmnou zmesou pre chov nosníc na produkciu konzumných vajec HYD – 10. Sliepky boli rozdelené do 4 skupín, do všetkých skupín boli vybraté sliepky s približne rovnakou živou hmotnosťou. V kontrolnej skupine zvieratá prijímali pitnú vodu bez akýchkoľvek prídavkov, v pokusných skupinách bol do pitnej vody pridaný nikel vo forme NiCl2 v rôznych koncentráciách. V pokusnej skupine P1 v koncentrácii 0,02 g.l-1, v pokusnej skupine P2 v koncentrácii 0,2 g.l-1 a v pokusnej skupine P3 v koncentrácii 2 g.l-1. Vo všetkých skupinách prijímali sliepky pitnú vodu ad libitum. Sledované ukazovatele : hmotnosť vajec, hmotnosť bielka, percentuálny podiel bielka, index bielka, Haughove jednotky bielka. V závere pokusu bola uskutočnená kompletná analýza vajec, analyzovali sme po 15 vajec z každej skupiny. V skupine P1 s najvyššou koncentráciou niklu bol počet vajec nižší, nakoľko vplyvom vysokej dávky sa u väčšiny sliepok v skupine znáška zastavila, prípadne znášali neštandardné vajcia. Rozdiely medzi jednotlivými ukazovateľmi v rámci pozorovaných skupín sme testovali jednofaktorovou analýzou variancie jednostupňového triedenia. Výsledky jednofaktorovej analýzy variancie boli doplnené Scheffeho testom. Pokus trval 28 dní. 18 Výsledky a diskusia Zmeny hmotnosti vajec sú uvedené v tabuľke 1 a obr. 1. Hmotnosť vajec v jednotlivých skupinách sa v priebehu pokusu najvýraznejšie menila v tretej pokusnej skupine P3, v ktorej bol zaznamenaný najvýraznejší pokles hmotností. V kontrolnej skupine K bola hmotnosť 62,27 g, v tretej pokusnej skupine P3 s koncentráciou niklu 2 g.l-1 bol výrazný pokles v porovnaní s kontrolnou skupinou aj s ďalšími pokusnými skupinami, hmotnosť analyzovaných vajec dosiahla len 50,97 g, v pokusnej skupine P2 bola zaznamenaná hmotnosť 64,90 g a v pokusnej skupine P1 bola hmotnosť vajec 59,11 g. Tieto výsledky sa zhodujú s výsledkami autorského kolektívu Meluzzi et al. (1996), ktorí podobne zaznamenali štatisticky významne negatívne ovplyvnenie znášky, hmotnosti vajec aj ich kvality ťažkými kovmi. Pri štatistickom vyhodnotení boli zaevidované veľmi vysoko významné rozdiely (P≤0,001) medzi skupinami K : P3; P3 : P2; P3 : P1 a vysoko významné rozdiely (P≤0,01) medzi skupinami P1 : P2. Najnižšia hmotnosť bielka (tab. 2, obr. 2) bola v tretej pokusnej skupine P3, čo súvisí s najvýraznejším poklesom hmotnosti celých vyprodukovaných vajec v tejto skupine spôsobeným najvyššou koncentráciou niklu v tejto skupine (2,0 g.l-1). Rozdiely hmotností bielkov vajec v ostatných skupinách s nižšími koncentráciami NiCl2 neboli tak výrazné v porovnaní s kontrolnou skupinou. Pri štatistickom vyhodnotení boli zaevidované veľmi vysoko významné rozdiely (P≤0,001) medzi skupinami K : P3; P3 : P2; P3 : P1, vysoko významné rozdiely (P≤0,01) medzi skupinami P2 : P1 a významné rozdiely (P≤0,05) medzi skupinami P2 : K. V percentuálnom podiele bielka (tab. 2, obr. 3) boli výsledky v poradí skupín: 61,81; 63,15; 64,67; 61,63 %. Ako vyplýva z obrázku a z tabuľkových hodnôt, v percentuálnom podiele bielka z hmotnosti celého vajca boli hodnoty v pokusnej skupine P3 s najvyššou koncentráciou niklu takmer zhodné s kontrolnou skupinou, vyšší percentuálny podiel bielka z hmotnosti celého vajca bol v skupinách P2 (64,67 %) a P1 (63,15%) čomu zodpovedá aj vyhodnotenie štatistickej významnosti rozdielov, ktoré boli významné ((P≤0,05) len medzi skupinami P2 : K a P2 : P3. V indexe bielka (tab. 2, obr. 4) boli hodnoty veľmi vyrovnané (86,94; 85,50; 86,78; 84,67), medzi všetkými kombináciami skupín bol rozdiel štatisticky nevýznamný (P>0,05). Podobne v Haughových jednotkách (83,61; 82,02; 81,23; 80,19 HJ) bola najvyššia hodnota v kontrolnej skupine, v ostatných skupinách sa hodnota znižovala so zvyšujúcou sa 19 koncentráciou NiCl2 v skupine. Rozdiel medzi skupinami bo štatisticky nevýznamný (P>0,05) (tab.2, obr. 5). Tabuľka 1 - Zmeny hmotnosti vajec (g) počas experimentu SKUPINA UKAZOVATEĽ Hmotnosť vajca (g) K P1(0,02 g.l-1) P2 (0,2 g.l-1) P3 (2 g.l-1) x 62,26 59,11 64,90 50,97* SD 4,85 2,45 3,94 3,03 CV 7,79 4,14 6,07 5,95 min 55,5 54,0 56,8 47,5 max 70,8 64,1 73,1 56,5 Hmotnosť vajca: *P≤0,01 (P1 – P2); P≤0,001 (P3 – K, P1, P2) Obrázok 1 – Dynamika zmien hmotnosti vajec hmotnosť vaj ec (g) 80 60 40 20 0 K P1 P2 P3 Obrázok 2 – Dynamika zmien hmotnosti bielka hmotnosť bielka (g) 50 40 30 20 10 0 K P1 P2 P3 20 Tabuľka 2 - Zmeny ukazovateľov kvality bielka počas experimentu Skupina Ukazovateľ K P1 (0,02 g.l-1) P2 (0,2 g.l-1) P3 (2 g.l-1) x 38,47 37,34 42,05* 31,43* SD 2,87 2,08 4,31 2,33 CV 7,46 5,58 10,24 7,41 min 35,0 34,2 34,9 29,2 max 43,7 42,2 50,4 35,7 Hmotnosť bielka (g) Percentuálny podiel bielka (%) x 61,81 63,15 64,67* 61,63* SD 1,36 1,58 3,45 1,68 CV 2,20 2,51 5,34 2,73 min 59,46 59,59 59,56 58,75 max 64,58 65,83 72,78 63,58 x 86,94 85,50 86,78 84,67 SD 12,84 22,40 22,41 27,48 CV 14,77 26,20 25,83 32,45 min 64,86 55,55 55,53 47,06 max 106,87 128,57 130,95 136,36 Index bielka Haughove jednotky (HJ) x 83,61 82,02 81,23 80,19 SD 5,05 10,15 9,43 10,83 CV 6,04 12,37 11,60 13,50 min 73,06 69,36 65,79 64,17 max 90,24 95,27 93,28 97,53 Hmotnosť bielka: *P≤0,05 (P2 – K); P≤0,01 (P2 – P1); P≤0,001 (P3 – K, P1, P2) Percentuálny podiel bielka: *P≤0,05 (P2 – K, P3) Obrázok 3 – Dynamika zmien percentuálneho podielu bielka per centuálny podiel bielka (%) 65 64 63 62 61 60 K P1 P2 P3 21 Obrázok 4 – Dynamika zmien indexu bielka index bielka 87 86 85 84 83 K P1 P2 P3 Haughove jednotky (HJ) Obrázok 5 – Dynamika zmien Haughových jednotiek bielka 84 83 82 81 80 79 78 K P1 P2 P3 Záver V priebehu experimentu bol sledovaný vplyv prídavku niklu (NiCl2) v rôznych koncentráciách (0,02 g.l-1, 0,2 g.l-1 a 2 g.l-1) na zmeny hmotnosti vajec a ukazovateľov kvality bielka sliepok hnedo vaječného znáškového hybrida Isabrown. Najvýraznejšie rozdiely v priebehu pokusu boli zaznamenané u hmotnosti vajec ale aj u ukazovateľov kvality bielka medzi kontrolnou skupinou K a pokusnou skupinou P3 s najvyššou koncentráciou niklu (2 g.l-1). Rozdiely v hodnotách v ostatných skupinách s nižšími koncentráciami NiCl2 neboli tak výrazné v porovnaní s kontrolnou skupinou. V indexe bielka a v Haughových jednotkách boli hodnoty v skupine s vysokou koncentráciou niklu nižšie, avšak rozdiel medzi všetkými kombináciami skupín bol štatisticky nevýznamný (P>0,05). 22 Literatúra ANKE, M. – ANGELOW, L. – GLEI, M. – MULLER, M. – ILLING, H. 1995. The biologial importance of nickel in the food-chain. In Fresenius Journal of Analytical Chemistry. vol. 352, 1995, num. 92 - 96 FAKAYODE, S. O. – OLU – OWOLABI, I. B. 2003. Trace metal content and estimated daily human intake from chicken eggs in Ibadan, In Archives of Enviremantal Health, vol. 58, 2003, num. 4, p. 245 – 251 HE, Z. L. – YANG, X. E. – STOFFELLA, P. J. 2005. Trace elements in agroecosystems and impacts on the environment In Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. vol 19, 2005, num. 2 – 3, p. 125 - 140 CHANG-YU CHEN - YI-FEN WANG - YU-HWAN LIN - SHU-FANG YEN 2003. Nickel-induced oxidative stress and effect of antioxidants in human lymphocytes. In Arch. Toxicol., 77, 2003, 123-130. KPOMBLEKOU, A. K. – ANKUMAH, R.O. – AJWA, H.A. 2002. Trace and nontrace element contents of broiler litter. In Communications in Soil Science and Plant Analysis 33, 2002, (11-12): 1799-1811. MARTINEZ, D. A. – DIAZ, G. J. 1996. In Effect of graded levels of dietary nickel and manganese on blood haemoglobin content and pulmonary hypertension in broiler chickens. In Avian Patology, vol. 25, 1996, num. 3, p. 537 - 549 MATKAR, J. J. – WRISCHNIK, L. A. – JONES, P. R. – HELTMAN – BLUMBERG, V. 2006. Two closely related nickel complexes have different effects on DNA damage and cell variability. In Biochem Biophys, Res Commun, roč. 343, 2006 č. 3, s. 754 - 761 MELUZZI, A. – SIMONCINI, F. – SIRRI, F. – VANDI, L. – GIORDANI, G. 1996. Feeding hens diets supplemented with heavy metals (chromium, nickel and lead). In Archiv fúr Geglugelkunde, vol. 60, 1996, num. 3, p. 119 - 125 PROKEŠ, J. et al. Základy toxikologie. Praha : Galen, 2005. ISBN 80 – 7262 – 301 -X. 247 s. WILSON, J. H. – WILSON, E, J. - RUSZLER, P. L 2001. Dietary nickel improves bale broiler (Gallus domesticus) bone strength. In Biological Trace Element Research, vol. 83, 2001, num. 3, p. 239 - 249 DISTRIBÚCIA NIKLU V ORGANIZME POTKANA PO EXPERIMENTÁLNOM PODÁVANÍ DISTRIBUTION OF NICKEL IN THE ORGANISM OF RATS AFTER AN EXPERIMENTAL ADMINISTRATION Bábiková, L.1, Toman, R.1, Golian, J.2, Massányi, P.3, Hluchý, S.1, Lukáč, N.3, Šiška, B.2 1Katedra veterinárskych disciplín, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov, SPU Nitra 2Katedra hygieny a bezpečnosti potravín, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, SPU Nitra 3Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, SPU Nitra Abstract The aim of this study was to evaluate the distribution of nickel chloride in the organism of rats after an experimental administration. The rats were given nickel chloride in a different concentrations. The first part of the study (group A and group P) was carried out on male rats (n=10) which were injected (i.p.) with nickel chloride at a single dose of 25 mg.kg-1 and 35 mg.kg-1 b.wt., respectively, and killed 48 hours after the nickel administration. In the second part of research (group B) 10 rats males were orally dosed with 100 mg.l-1 in drinking water during three months. Ten males served as the control group (K) without the nickel administration. The samples of kidney, muscle (m. quadriceps femoris), liver and testis were taken for the nickel analysis. The highest concentration of nickel was detected in the kidney 23 after an intraperitoneal administration of 35 mg.kg-1 of nickel chloride. The difference between the group P and the control one was significant (p < 0.001). The nickel level in the kidney were significantly higher in group A when compared to the group B (2.48 ± 0.83 mg.kg-1 and 0.24 ± 0.14 mg.kg-1, respectively). The differences in liver nickel concentration in all experimental groups were insignificant. The analysis of nickel concentration in the muscle tissue showed the significant decrease from 1.18 ± 0.79 mg.kg-1 in group K to 0.20 ± 0.12 mg.kg-1 in group B. In the testis, the nickel concentration was highest in group P (0.61 ± 0.19 mg.kg-1) in comparison to the control (K) and experimental group B (0.22 ± 0.19 mg.kg-1 and 0.22 ± 0.17 mg.kg-1, respectively). These differences were statistically significant (p < 0.05). These findings indicate that the acute administration of nickel chloride causes the highest increase in the level of the metal in kidney. Úvod Nikel (Ni) je biogénny, esenciálny prvok, ktorý pri vyšších koncentráciách vyvoláva vznik kontaktnej alergickej dermatitídy (Menne, 1994). Nikel je látkou, ktorá sa síce vstrebáva vo veľmi malom množstve, ale aj z tohto množstva sa asi 70 % vylúči močom. Má významnú úlohu v biologickom systéme, ako je enzýmová aktivita, hormonálna kontrola a tiež v RNA, DNA a v proteínovej štruktúre, ako aj v ich funkciách. Pandey a Srivastava (2000) uvádzajú, že hypersenzitivita niklu spôsobuje astmu, zápal spojiviek a ďalšie zápalové reakcie. Medzi symptómy vyvolané akútnym pôsobením niklu patrí nedostatočnosť adrenalínu, hyperglykémia, toxicita pečene a taktiež sa môže vyvinúť poškodenie obličiek. Diwan et al. (1992) poukazujú na schopnosť prenikania Ni placentou a na následné poruchy v obličkách vyvíjajúceho sa plodu. Kakela et al. (1999) uvádzajú, že v semenníkoch potkanov dochádza po perorálnom podávaní Ni k zmenšeniu semenotvorných kanálikov a k zníženiu počtu spermatogónií. Cieľom našej práce bolo zistiť akumuláciu niklu v jednotlivých orgánoch po experimentálnom podaní rôznych dávok niklu. Materiál a metodika V pokuse sme použili samcov laboratórnych potkanov línie Wistar, ktorých sme rozdelili do 1 kontrolnej skupiny (bez podania niklu) a 3 pokusných skupín. Do každej skupiny bolo zaradených 10 pokusných zvierat. Pokusné skupiny sme rozdelili na 1 skupinu s dlhodobým perorálnym podávaním (B) a 2 skupiny s jednorazovým podaním niklu (A, P). V dlhodobom pokuse (skupina B) sme podávali chlorid nikelnatý v dávke 100 mg.l-1 v pitnej vode počas 24 troch mesiacov. Pokusným zvieratám v skupine A a P sme aplikovali nikel vo forme NiCl2 v jednorazovej intraperitoneálnej dávke 25 mg.kg-1 ž.h. (skupina A) a 35 mg.kg-1 ž.h. (skupina P). Zvieratá boli individuálne umiestené v plastových nádobách s neobmedzeným prístupom k vode a ku krmivu. Počas každého experimentu boli v pokusnom zariadení (SK PC 50004) dodržiavané základné nároky na životné podmienky (teplota 20 – 22 °C, vlhkosť 55 ± 10 %, 12 hodinový svetelný režim). Po 48 hodinách (skupina A a P) a 90 dňoch (skupina B) experimentu sme zvieratá bezbolestne usmrtili a odobrali sme vzorky obličiek, pečene, semenníka a svalu (m. quadriceps femoris) na stanovenie obsahu niklu. Podobne sme postupovali aj u kontrolnej skupiny. Obsah niklu v tkanivách sa stanovil použitím elektrotermálneho atómového absorbčného spektrofotometra Varian SpectrAA 20 BQ,GTA 96 (EL s.r.o., Spišská Nová Ves). Pre získané údaje sme vypočítali základné štatisticko-variačné hodnoty a rozdiely medzi skupinami sme otestovali Scheffeho testom. Výsledky Výsledky analýz vzoriek obličiek, pečene, semenníka a svalu sú zhrnuté v tabuľkách 1 až 4. Analýzou vzoriek tkanív sme zistili, že najväčšie množstvo niklu sa nachádzalo v obličke. Priemerný obsah niklu v obličke bol 9,71 mg.kg-1 v skupine P, ktorej bola podaná jednorázová dávka 35 mg.kg-1. Tento rozdiel porovnaní s kontrolnou skupinou bol vysoko štatisticky preukazný P < 0,001. Taktiež porovnanie obsahu Ni v obličke v skupine A a P navzájom a porovnanie medzi skupinou P a skupinou B ukázalo štatisticky preukazné rozdiely. V skupine A s jednorázovým podaním niklu 25 mg.kg-1 sme v porovnaní s kontrolnou skupinou samcov potkanov zaznamenali štatisticky preukazný nárast koncentrácie niklu o 2,31 mg.kg-1 oproti kontrole. Obsah niklu v obličke potkana laboratórneho (mg.kg-1) Tabuľka 1 Skupina x±s Preukaznosť rozdielov K 0,17 ± 0,12 A 2,48 ± 0,83 A:K* B 0,24 ± 0,14 - P 9,71 ± 4,45 P:A***, P:B***, P:K*** *P < 0,05, ***P < 0,001, -P > 0,05 25 Ako vidno z tabuľky 2, analýzou vzoriek svaloviny sme zistili, že kumulácia niklu vo všetkých pokusných skupinách bola nižšia ako v kontrolnej skupine. Významný pokles hladiny niklu sme zaznamenali v dlhodobom pokuse na 0,20 mg.kg-1 oproti kontrolným 1,18 mg.kg-1. Tento pokles bol štatisticky preukazný (P < 0,01). Pokles o 0,89 mg.kg-1 niklu oproti kontrole bol v akútnej skupine P. V porovnaní s kontrolnou skupinou bol tento rozdiel štatisticky preukazný. Porovnanie experimentálnych skupín neukázalo žiadnu štatistickú preukaznosť. Obsah niklu vo svale potkana laboratórneho (mg.kg-1) Tabuľka 2 Skupina x±s Preukaznosť rozdielov K 1,18 ± 0,79 K:P*, K:B** A 0,83 ± 0,42 - B 0,20 ± 0,12 - P 0,29 ± 0,09 - *P < 0,05, **P < 0,01, -P > 0,05 Najnižšie množstvo niklu sme zaznamenali v pečeni (tabuľka 3). Nepatrné zvýšenie množstva niklu bolo v skupine P (0,54 mg.kg-1), čo oproti kontrole činilo rozdiel 0,04 mg.kg-1. Avšak tento rozdiel nebol štatisticky preukazný. V ostatných skupinách bola koncentrácia niklu nižšia oproti kontrole. Obsah niklu v pečeni potkana laboratórneho (mg.kg-1) Tabuľka 3 Skupina x±s Preukaznosť rozdielov K 0,50 ± 0,34 A 0,29 ± 0,16 - B 0,30 ± 0,21 - P 0,54 ± 0,20 - - P > 0,05 Obsah niklu v semenníku je udané v tabuľke 4. Pri porovnaní rozdielov medzi skupinami sme zistili, že podanie jednorázovej dávky 35 mg.kg-1 ž.h. spôsobilo štatisticky preukazný nárast 26 obsahu Ni v sememenníkoh (P < 0,05). Rozdiel v priemerných hodnotách medzi skupinou P a kontrolnou skupinou bol 0,39 mg.kg-1. Rozdiel medzi skupinou P a B bol taktiež štatisticky preukazný. Zvýšená hladina niklu ale bola pozorovaná v akútnej skupine P v porovnaní v chronickom experimente. Obsah niklu v semenníku potkana laboratórneho (mg.kg-1) Tabuľka 4 Skupina x±s Preukaznosť rozdielov K 0,22 ± 0,19 A 0,38 ± 0,25 - B 0,22 ± 0,17 - P 0,61 ± 0,19 P:B*, P:K* *P < 0,05, -P> 0,05 Diskusia Mimoriadne senzitívne na koncentrácie cudzorodých látok z parenchymatóznych orgánov sú predovšetkým pečeň, oblička a pohlavné žľazy, ktoré už pri nízkej dávke vykazujú štrukturálne zmeny alebo funkčné poruchy (Jančová et al., 1999). V obličkách pokusných samcov, ktorým sme podali intraperitoneálne nikel (25 mg.kg-1 a 35 mg.kg-1), sme zistili štatisticky preukazný nárast hladiny niklu o 2,31 mg.kg-1 (pri dávke 25 mg.kg-1) a o 9,54 mg.kg-1 (35 mg.kg-1). Ishimatsu et al. (1995) poukazujú na fakt, že po 24 hodinách sa vstrebáva 10 – 34 % z jednorazovej dávky zlúčenín niklu podaných perorálnym spôsobom. Najvyššie koncentrácie zaznamenali v obličke, pľúcach a najnižšie hodnoty v pečeni. Autori uvádzajú, že v obličkách sa nachádza 80 – 90 % z celkového množstva niklu, ktoré sa v organizme akumulovalo. Autori ďalej uvádzajú, že transfer a distribúcia zlúčenín niklu aplikovaných perorálnym spôsobom veľmi úzko súvisí s rozpustnosťou zlúčenín niklu, ktorá klesá v nasledovnom poradí: [Ni(NO3)2 > NiCl2 > NiSO4] >> [NiS > Ni3S2] > NiO. V závere svojej práce konštatujú, že rozpustnosť zlúčenín niklu je najdôležitejším faktorom, od ktorého závisí škodlivý účinok niklu na živočíšny organizmus. Počas dlhodobého pokusu sme zaznamenali nižšie hodnoty niklu v obličke. Naše výsledky nekorešpondujú s výsledkami, ktoré uvádza Severa et al. (1995). Počas aplikácie sulfátu niklu perorálnym spôsobom zistili najvyššie koncentrácie niklu v pečeni. U samcov hladiny niklu klesali v poradí pečeň > oblička > krv (sérum, plazma) > sérum > plazma > semenníky. U samíc poradie tvorilo: pečeň > oblička = krv = sérum = plazma > moč > vaječníky. V našom experimente sme zaznamenali v akútnom pokuse iba nepatrné zvýšenie hladiny niklu 27 v pečeni po podaní dávky 35 mg.kg-1 ž.h. Avšak tento rozdiel nebol štatisticky preukazný. V ostatných skupinách bola koncentrácia niklu nižšia oproti kontrole. Na druhej strane sú naše výsledky totožné s výsledkami autorov, ktorí po aplikácii 0,1 % roztoku NiS (223,5 mg Ni.l-1) uvádzajú najvyššie hodnoty v obličke, nižšie v semenníkoch, v pľúcach = v mozgu, v slezine a najnižšie hodnoty udávajú v pečeni Obone et al. (1999). Svalové tkanivo je neodmysliteľnou súčasťou ľudskej výživy. Z tohto hľadiska je dôležité sledovať obsah xenobiotík vo svaloch. Na druhej strane však svalovina nepredstavuje veľké riziko z hľadiska ovplyvnenia zdravia konzumentov, pretože sa nevyznačuje vysokou schopnosťou bioakumulácie kovov (Gašparík et al., 2003; Sharma et al., 1982; Massadeh a Al – Safi, 2005). V našom experimente sme zaznamenali významný pokles hladiny niklu v dlhodobom pokuse na 0,20 mg.kg-1 oproti kontrolným 1,18 mg.kg-1. Tento pokles bol štatisticky preukazný (P < 0,01). Rovnako aj dávka niklu 35 mg.kg-1 spôsobila pokles koncentrácie vo svalovine pokusných zvierat v porovnaní s kontrolnými, ktorý bol taktiež štatisticky preukazný. Toman et al. (2000) porovnávali hladiny kovov vo vybraných svalov oviec, kde zaznamenali, že najvyššia hladina niklu bola v stehnovom svale 0,470 mg.kg-1, vo veľkom bedrovci, poloblanitom a trojhlavom ramennom svale sa hodnoty niklu pohybovali v rozmedzí 0,410 – 0,460 mg.kg-1. Svobodová et al. (2002) sledovali obsah Cd, Pb, Cr, Ni a Cu vo svalovine kapra. Namerané hodnoty sa pohybovali pod povolenou hranicou hygienického limitu, ktorú udáva tamojšia legislatíva okrem niklu. Obsah niklu bol nad 0,5 mg.kg-1. Severa et al. (1995) a Obone et al. (1999) poukazujú na to, že semenníky patria medzi orgány v ktorých nedochádza k vysokej kumulácii niklu. Na rozdiel od týchto tvrdení Sunderman et al. (1985) vo svojom experimente zaznamenali v semenníkoch vyššiu kumuláciu niklu ako v pečeni. Nami dosiahnuté výsledky sú v súlade s tvrdeniami týchto autorov, pretože akútne pôsobenie niklu vyvolalo zvýšenú kumuláciu tohto kovu v semenníku, pričom jeho hladina sa pohybovala od 0,22 – 0,61 mg.kg-1 v závislosti od dávky a spôsobu podania. Záver Na základe uvedených výsledkov získaných metódou atómovej absorpčnej spektrofotometrie, možno konštatovať, že najvýraznejšie zmeny v hladine niklu v sledovaných orgánov spôsobila dávka 35 mg Ni2+.kg-1 podaných intraperitoneálne, pričom k najvyššej akumulácii dochádzalo v obličkách, menej vo svalovine, v semenníkoch a najmenšia kumulácia bola zaznamenaná v pečeni experimentálnyích zvierat. 28 Literatúra DIWAN, B.A. – KASPRZAK, K.S. – RICE, J.M. 1992. Transplacental carcinogenic effect of nickel(II) acetate in the renal cortex, renal pelvis and adenohypophysis in F344/NCr rats. In: Carcinogenesis, roč. 13, 1992, s. 1351 – 1357. GAŠPARÍK, J. - MASSÁNYI, P. - SLAMEČKA, J. - FABIŠ, M. - JURČÍK, R. 2003. Concentration of selected metals in liver, kidney and muscle of the red deer (Cervus elaphus). In: Risk factors of food chain III. Proceeding Book of III - rd International Scientific Conference. [CD - ROM]. Nitra : SPU, 2003, s. 27-29. ISBN 80-8069-282-3. ISHIMATSU, S. – KAWAMOTO, T. – MATSUNO, K. – KODAMA, Y. 1995. Distribution of various nickel compounds in rat organs after oral administration. In: Biol Trace Elem Res, roč. 49, 1995, s 43 – 52. JANČOVÁ , A. – LIGAČ, S. – MASSÁNYI, P. – UHRÍN, V. 1999. Morphological analysis of testes and epididymides in Apodemus sylvaticus and Apodemus flavicollis (M u r i d a e), In: Slovenský Veterinárny časopis, roč. 24, 1999, s. 152 – 156. KAKELA, R. - KAKELA, A. - HYVARINEN, H. 1999. Effects of nickel chloride on reproduction of the rat and possible antagonistic role of selenium. In: Comp. Biochem. Physiol., roč. 123, 1999, s. 27 - 37. MASSADEH, A. M. - Al-SAFI, S. 2005. Analysis of cadmium and lead: their immunosppressive effects and distribution in various organs of mice. In: Biol. Trace. Elem. Res., roč. 108, 2005, s. 279-286. MENNE. T. 1994: Quantitative aspects of nickel dermatitis: Sensitization and eliciting threshold concentrations, In: Sci. Total Environ., roč. 148, 1994, s. 275-281. OBONE,E. – CHAKRABARTI, S.K. – BAI, C. – MALICK, M.A. – LAMONTAGNE, L. – SUBRAMANIAN, K.S. 1999. Toxicity and bioaccumulation of nickel sulfate in Sprague- Dawley rats following 13 weeks of subchronic exposure. In: J. Toxicol. Environ. Health. A. roč. 57. 1999. s. 379-401. PANDEY,R. – SRIVASTAVA,S.P. 2000. Spermatotoxic effects of nickel in mice. In: Bull. Environ. Cintám. Toxicol., roč. 64, 2000, s. 161- 167. SEVERA. J, - VYSKOČIL, A. - FIALA, Z. - ČÍŽKOVÁ, M.1995. Distribution of nickel in body fluids and organs of rats chronically exposed to nickel sulphate. In: Hum Exp Toxicol. roč.14. 1995.s.955-998. SHARMA, R. P. - STREET, J. C. - SHUPE, J. L. - BOUCIER, D. R. 1982. Accumulation and depletion of cadmium and lead in tissues and milk of lactating cows fed small amounts of these metals. In. J. Dairy. Sci., roč. 65, 1982, s. 972-979. SUNDERMAN FW. JR. – MARZOUK, A. – CRISOSTOMO, MC. – WEATHERBY, DR. 1985. Electrothermal atomic absorption spectrophotometry of nickel in tissue homogenates. In: Ann. Clin. Lab. Sci., roč. 15, 1985, str. 299 – 307. SVOBODOVÁ, Z. – ZLABEK, V. – CELECHOVSKA,O. – RANDAK, T.- MACHOVA, J. – KOLÁROVÁ, J. – JANOUSKOVA, D. 2002. Content of metals in tissues of marketable common carp and in bottom sediments of selected ponds of South and West Bohemia. In: Czech Journal Anim Scien, roč. 47, 2002, str. 339 – 350. TOMAN, R. – MASSÁNYI, P. – TATARUCH, F. – SLAMEČKA, J. – JURČÍK, R. – SALAGOVÁ, Z. – NAĎ, P. – ČUBOŇ, J. 2000. Ťažké kovy v organizme suchozemských živočíchov. In: Rizikové faktory potravového reťazca človeka, Nitra: GARMOND, 2000, s. 43 – 51. ISBN 80 – 7137 – 796 – 1. Práca bola finančne podporená grantom VEGA MS SR 1/2417/05 a 1/3475/06. Lenka Bábiková Ing., Katedra veterinárskych disciplín, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov, SPU Nitra, e- mail: [email protected] ÚLOHA TRANSKRIPČNÉHO FAKTORA P53 A HORMÓNU GHRELÍN V KONTROLE FUNKCIÍ OVARIÁLNYCH BUNIEK OŠÍPANÝCH THE ROLE OF TRANSCRIPTION FACTOR p53 AND HORMONE GHRELIN IN CONTROL OF PORCINE OVARIAN CELL FUCTIONS Benčo, A., 1 Sirotkin, A. V.1,2 Konstantin the Philosophe University, Department of Zoology and Antropology, Tr. A. Hlinku 1, 949 01, Nitra, Slovakia 2 Slovak Agricultural Research Centre, Research Institute of Animal Production, Department of Genetics and Reproduction, Hlohovská 2, 949 92 Nitra, Slovakia 1 29 Abstract The aim of our in vitro experiments was to examine (1) the role of transcription factor p53 in control of apoptosis, proliferation and secretory activity of porcine ovarian cells, (2) the role of ghrelin in control of these processes in porcine ovarian cells, (3) the role of p53 in mediating ghrelin effects on porcine ovary. Transfection of porcine cells with cDNA construct for transcription factor p53 decreased ASK-1, Bax, PGF and increased PCNA, OT and PGE2. We have study (1) effect of additions of hormone ghrelin on occurrence of apoptosis (expression ASK-1, Bax) proliferation (expression of PCNA) and release of hormones (prostaglandin F, oxytocin and prostaglandin E2) in cultured porcine ovarian granulosa cells, (2) effects of transfection of porcine ovarian granulosa cells with cDNA construct on these processes. It was observed, that ghrelin inhibits expression of ASK-1, Bax did not affect expression of PCNA, increased prostaglandin F, oxytocin and PGE2 release by porcine cells. Moreover, transfection of porcine cells with p53 cDNA construct reversed effect of ghrelin on ASK-1 from inhibitory to stimulatory, did not affect influence of ghrelin on Bax, convert ghrelin PCNA from zero effect to inhibitory, did not affect ghrelin on prostaglandin F, turn ghrelin oxytocine from stimulatory to inhibitory in porcine ovaries. The obtained results suggests that p53 is regulator of apoptosis, proliferation and secretion, hormone ghrelin is involved in control of porcine ovarian functions, it can be inhibitor of apoptosis, and stimulator of hormone secretion. The opposite effects of ghrelin on normal cells and cells with overexpression of p53 indicates that these transcription factor could be potencial mediator of ghrelin action on the porcine ovary. Úvod Moderné biotechnológie vyžadujú nové regulátory, ktoré sú efektívnejšie, účinnejšie a majú menšie vedľajšie účinky ako farmakologické preparáty. Nové trendy smerujú k regulácií ovariálnych fukcií vplyvom hormonálnych regulátorov a vnútrobunkových mediátoroch ich účinku. Mimobunkové a vnútrobunkové signálne dráhy regulujúce fenomény proliferácie a sekrécie v ovariálnych apoptózy, bunkách ošípaných a ľudí sú ešte veľmi slabo preskúmané. Vplyvy p53 na apoptózu a proliferáciu sú v ováriách čiastočne preskúmané. Máme poznatky o tom, že transkripčný faktor p53 môže stimulovať apoptózu v makrofágoch (Matas et al., 2004), inhibuje proliferáciu v leiomyómových bunkách u ľudí (Hsieh et al., 2004) a reguluje sekréciu IGF (Grimberg et al., 2006). Úplne neznáme sú vplyvy p53 na sekréciu PGE, OT a 30 PGF v ováriách ošípaných. Súčasné poznatky naznačujú, že hormón ghrelín reguluje reprodukciu u zvierat aj u ľudí na úrovni hypotalamo-hypofyzárneho systému a gonád. (Mazzochi a kol. 2004) uvádza, že ghrelín zvyšuje bazálnu sekréciu GH u ošípaných (Estienne a kol. 2005) a stimuluje expresiu hypotalamickej AMP- aktivovanej proteín kinázy. (Lee a kol. 2005). Ghrelín v ovariálnych bunkách králikov stimuluje proliferáciu (Pivko a kol. 2003) a znižuje výskyt apoptózy v granulóznych bunkách ľudí a kurčiat (Sirotkin a kol. 2006). Úloha niektorých hormónov napríklad žalúdočného hormónu ghrelínu, proteínkináz a traskripčných faktorov v regulácií ovariálnych funkcií nie je celkom známa a absolútne neznáme je, či hormón ghrelín účinkuje cez transripčný faktor (p53). Na rozdiel od účinku ghrelínu na ovariálne bunky človeka a vtákov, v ovariálnych bunkách ošípaných nie je dostatočne preskúmaný vplyv ghrelínu na apoptózu, proliferáciu, expresiu vybraných kináz, transkripčných faktorov a neznáme sú jeho vplyvy na sekréciu vybraných hormónov. Intracelulárne mediátory účinku ghrelínu na ovariálne bunky nie sú tiež dobre preskúmané. Materiál a metodika Ovariálne granulózne bunky z vaječníkov ošípaných plemena biela ušľachtilá boli získané z bitúnku Dunajská Streda. Ošípané vo veku 200-220 dní boli na konci puberty pričom jedince boli v necyklujúcej fáze. Po aspirácii folikulárne granulózne bunky z folikulov boli rozsuspendované v roztoku Ham’s F–12 (Bio Whittaker,Vervies,Belgium), odstredené (10 min./x 200g) a kultivované v médiu DMEM/F-12 (Bio Whittaker) doplneného 15%-ným bovinným fetálnym sérom-FCS (FCS; Gibco, Paisley, Škótsko) a 1% antibiotikom - antimykotikom (Gibco BRL,Grand Island, USA). Suspenzia buniek bola následne rozpipetovaná do kultivačných komôrok- chamber-slides (Nange Nunc International, Naperville,USA) po 200 ml a kultivovaná do vytvorenia monovrstvy cca 5-7 dní pri 5% CO2 , pri 38°C. Po vytvorení monovrstvy bola kontrolná skupina granulóznych buniek podrobená transfekcií za použitia transfekčného reagentu Roti Fect (Karlsruhe, Carl Roth, Nemecko) génovou konštrukciou pre EGFP (Clontech, Palo Alto, Canada) , druhá skupina buniek bola transfekovaná génovými konštrukciami pre EGFP + p53 (veľkosť inzertu 55 kb, klonovacie miesto 5΄- HpaI, klonovacie miesto 3΄- XhoI, typ vektora-Mammalian expression,Lentiviral,RNAi,Cre/Lox) . K obidvom skupinám buniek sme pridávali hormón ghrelín (Peptides International, Louiseville, USA) v dávkach 0 (kontrolná skupina), 1, 10, 100 31 ng / ml . Po pridaní prídavkov sme bunky kultivovali 2 dni. Po kultivácii sme bunky zafixovali v 4 % paraformaldehyde pre imunocytochemickú analýzu. Prítomnosť ASK-1, Bax a PCNA v bunkách sme analyzovali imunocytochemickou metódou podľa Osborna a Isenberga (1994). Použili sme primárne protilátky proti ASK-1, Bax a PCNA (Santa Cruz Inc.,Santa Cruz,USA). Vizualizáciu naviazanej protilátky sme uskutočnili pomocou sekundárnej protilátky- monoklonálna protilátka myší IgG1 označenej peroxidázou (BD Biosciences Pharmingen,USA). Peroxidáza pri reakcií s DAB substrátom (Behringer,MannheimGmbH,SRN) dala hnedé zafarbenie v mieste lokalizácie skúmaného antigénu. Percentá zafarbených buniek boli spočítané pod svetelným mikroskopom a vyhodnotené. Hormóny prostaglandín F, oxytocín a prostaglandín E2 secernované granulóznymi bunkami boli analyzované vlastnými RIA systémami Prof. J. Kotwicom (Institute of Animal Reproduction and Food Research, Olsztyn-Kortowo, Poľsko). PCNA akumulácia bola analyzovaná metódou Western blotting. Preukaznosť rozdielov medzi skupinami zistené pomocou imunocytochémie a RIA sme vyhodnotili Student t testom použitím štatistického softwaru Sigma Plot 9.0 (Systat Software, GmbH, Erkhart, Nemecko). Výsledky U ošípaných sme hodnotili metódou imunocytochémia ASK-1, Bax a PCNA a metódou RIA sme hodnotili uvolňovanie PGE, OT a PGE2. Granulózne bunky získané z ovárií ošípaných obsahovali skúmané markery ASK-1, Bax, PCNA a granulózne bunky vyprodukovali určité množstvá hormónov prostaglandínu F, oxytocínu a prostaglandínu E2. Imunocytochémia ukázala, že hormón ghrelín znižoval % granulóznych buniek obsahujúcich proapoptotickú kinázu ASK-1, (Obr.3), % buniek obsahujúcich proapoptotický peptid Bax (Obr.4) a neovplyvňoval % buniek obsahujúcich proliferačný jadrový antigén PCNA (Obr.5), naopak Western blotting ukázal zvyšovanie akumulácie PCNA v bunkách po pridaní ghrelínu (Obr.6). RIA ukázala, že tento hormón zvyšoval sekréciu prostaglandínu F, oxytocínu a prostaglandínu E2. (Obr.7, 8, 9). Overexpresia transkripčného faktora p53 znižovala expresiu apoptotických peptidov ASK-1 (Obr.3), Bax (Obr.4), stimulovala expresiu PCNA (Obr.5), inhibovala sekréciu PGF (Obr.7), stimulovala vylučovanie OT (Obr.8) a PGE2 (Obr.9). Uspešnosť transfekcie buniek cDNA pre markerový EGFP a p53 dokazujú obrázky (Obr. 1,2) získané metódou imunocytochémia. Overexpresia p53 modifikovala inhibičný vplyv ghrelínu na stimulačný pre ASK-1 (Obr.3) nemenila účinok ghrelínu pre Bax (Obr.4), menila nulový efekt ghrelínu na inhibičný 32 vzhľadom na PCNA (Obr.5), menila stimulačný účinok ghrelínu pre OT na inhibičný (Obr.8) a nemenila účinok ghrelínu na PGF (Obr.7) a na PGE2 (Obr.9). Obr.1. Expresia zeleno fluoreskujúceho Obr.2. Expresia transkripčného faktora proteínu EGFP v granulóznych bunkách p53 v granulóznych bunkách ošípaných ošípaných Obr.3. Vplyv ghrelínu na expresiu Obr.4. Vplyv ghrelínu na expresiu ASK-1 v kultivovaných granulóznych Bax v kultivovaných granulóznych bunkách ošípaných bez (kontrola) a po bunkách ošípaných bez (kontrola) a po c DNA transfekcií génovou konštrukciou transfekcií c DNA génovou konštrukciou pre p53 (imunocytochémia) pre p53 (imunocytochémia) * 100 overexpresia p53 * % buniek obsahujúcich Bax % buniek obsahujúcich ASK-1 100 80 * 60 kontrola 40 * 20 0 0 1 10 100 80 60 * * 40 overexpresia p53 * * * 20 0 0 1 10 ∗- * kontrola 100 pridaná dávka ghrelínu -ng /ml média signifikantné rozdiely v porovnaní s kontrolou (bez pridaná dávka ghrelínu -ng /ml média ∗ - Pozri Obr.3 prídavkov) (p<0,05). Hodnoty ukazujú priemer ± smerodajnú odchýlku Hodnoty 1, 10, 100 ng/ml boli porovnávané s kontrolou 0 ng/ml Obr.5. Vplyv ghrelínu na expresiu Obr.6 Expresia proliferačného jadrového PCNA v kultivovaných granulóznych antigénu PCNA po pridaní ghrelínu bunkách ošípaných bez (kontrola) a po bez transfekcie p53 (vľavo) a po transfekcií transfekcií c DNA génovou konštrukciou cDNA génovou konštrukciou pre p53 (vpravo) pre p53 (imunocytochémia) (Western blotting) 33 % buniek obsahujúcich PCNA 100 overexpresia p53 * 80 * 60 40 * 20 0 1 10 100 0 1 10 100 0 kontrola 0 1 10 Pridaná dávka ghrelínu (ng/ml média) 100 Pridaná dávka ghrelínu (ng/ml média) pridaná dávka ghrelínu -ng /ml média + transfekcia s p53 ∗ - Pozri Obr.3 Obr.7. Vplyv ghrelínu na sekréciu Obr.8. Vplyv ghrelínu na sekréciu PGF v kultivovaných granulóznych OT v kultivovaných granulóznych bunkách ošípaných bez (kontrola) a po bunkách ošípaných bez (kontrola) a po transfekcií c DNA génovou konštrukciou transfekcií c DNA génovou konštrukciou pre p53 (RIA) 220 200 180 6 * 160 140 * 120 kontrola 100 * * * 80 60 20 overexpresia p53 * 40 Vylučovanie OT (ng / 10 buniek/deň) 6 Vylučovanie PGF (ng / 10 buniek/deň) pre p53 (RIA) 140 120 overexpresia p53 100 * * kontrola 80 * 60 40 20 * * * 0 1 10 100 pridaná dávka ghrelínu -ng /ml média 0 1 10 100 pridaná dávka ghrelínu -ng /ml média ∗ - Pozri Obr.3 ∗ - Pozri Obr.3 Obr.9. Vplyv ghrelínu na sekréciu PGE2 v kultivovaných granulóznych bunkách ošípaných bez (kontrola) a po transfekcií c DNA génovou konštrukciou 6 Vylučovanie PGE2 (ng / 10 buniek/deň) pre p53 (RIA) 350 overexpresia p53 * 300 * 250 * 200 * ∗ - Pozri Obr.3 150 100 kontrola 50 0 1 10 100 pridaná dávka ghrelínu -ng /ml média 34 Diskusia Ako prví sme zistili, že transfekcia s p53 znižovala expresiu ASK-1 a Bax. Medzi Bax a p53 existuje korelácia v stimulovaní apoptózy v granulóznych bunkách ľudí, čo opisujú (Choi a kol. 2004). Transfekcia s p53 zvyšovala expresiu PCNA, znižovala vylučovanie PGF, a naopak zvyšovala vylučovanie PGE2 a OT u ošípaných. Tieto pozorovania demonštrujú, že transkripčný faktor p53 je zainteresovaný v inhibícií apoptózy, stimulácií proliferácie a uvolňovaní hormónov ovariálnymi bunkami. Počas výskumov sme zistili, že ghrelín znižuje % buniek obsahujúcich ASK-1 a Bax, v granulóznych bunkách vaječníkov ošípaných a tým pravdepodobne znižuje ich apoptózu. Nezhodujeme sa s pozorovaniami Sirotkina a kol. (2006), ktorí pozorovali stimulačný vplyv ghrelínu na apoptózu u kurčiat. Zistili sme, že ghrelín neovplyvňuje proliferáciu v granulóznych bunkách ošípaných. Naše výsledky sa nezhodujú s pozorovaniami Pivka a kol. (2003), ktorý opisuje stimulačný vplyv ghrelínu na proliferáciu ovariálnych buniek králikov. Rozdiely vo výsledkoch budú pravdepodobne spôsobené druhovou špecifitou a rozdielnymi vplyvmi ghrelínu na rôzne živočíšne druhy. Ghrelín mal v našom prípade stimulačný účinok na hormóny ovárií – oxytocín, prostaglandín F, a PGE2. Originálne sú údaje o schopnosti transfekcie s p53 modifikovať efekty hormónu ghrelínu v ováriách ošípaných na vybrané markery. Výsledky nášho výskumu svedčia o schopnosti regulácie apoptózy, proliferácie a sekrécie transkripčným faktorom p53. Modifikačné efekty p53 voči peptidovému hormónu ghrelínu po transfekcií s p53, svedčia o tom, že p53 môže byť potencionálnym sprostredkovateľom účinku ghrelínu na ováriá ošípaných. Hormón ghrelín môže regulovať ovariálnu apoptózu a sekréciu u ošípaných. Pravdepodobne sme prví, ktorí sme zistili účinok ghrelínu na proapoptotickú kinázu - ASK-1 u uvedeného živočíšneho druhu. Záver (1) p53 môže byť zapojený do regulácie sekrécie) ovariálnych funkcií (proliferácie, apoptózy, (2) Hormón ghrelín je zapojený do regulácie ovariálnych funkcií (apoptózy a sekrécie) u ošípaných (3) p53 môže byť sprostredkovateľom účinku ghrelínu na ováriá u ošípaných (4) Nie je vylúčené, že ASK-1 kináza môže byť sprostredkovateľom účinku ghrelínu na ovariálne funkcie ošípaných 35 Liteeratúra ESTIENNE, M.J.- BARB, C.R. (2005): The control of adenohypophysial hormone secretion by amino acids and peptides in swine., Domest Anim Endocrinol. 29(1), 34-42 GRIMBERG, A.- COLEMAN, C.M.-SHI, Z.-BURNS, T.F.-MACLACHAN, T.K.-WANG, W.-EL-REIRY, W.S. (2006): Insulin-like growth factor binding protein-2 is a novel mediator of p53 inhibition of insulin-like growth factor signaling. Cancer Biol Ther. 5(10), 1408-14 HSIEH, Y.Y.-CHANG, C.C.-HSU, C.W.-LIN, C.S. (2004): Gene transfection with p53 and p21 inhibit cell proliferation, collagen type I, leukemia inhibitory factor, and tumor necrosis factor-alpha expression in leiomyoma cells. Fertil Steril. 81(6), 1665-70 CHOI, D.-HWANG, S.- LEE, E.-YOON, S.-YOON, B.K.-BEE, D. (2004) Expression of mitochondriadependent apoptosis genes (p53, Bax, and Bcl-2) in rat granulosa cells during follicular development, 11(5), 3117 LEE, W.J.- KOH, E.H.- WON, J.C.- KIM, M.S.-PARK, J.Y.- LEE, K.U. (2005): Obesity: the role of hypothalamic AMP-activated protein kinase in body weight regulation. Int J Biochem Cell Biol. 37(11),2254-9. MATAS, D.-MILYAVSKY, M.-SHATS, I.-NISSIM, L.-GOLDFINGER, N.-ROTTER, V.: (2004) p53 is regulator of macrophage differentiation. Cell Death Differ. 11(4), 458-67. MAZZOCHI, G.- NERI, G.- RUCINSKI, M.- REBUFFAT, P.- SPINAZZI, R.- MALENDOWICZ, L.K.NUSSDORFER G.G. (2004): Ghrelin enhances the growth of cultured human adrenal zona glomerulosa cells by exerting MAPK-mediated proliferogenic and antiapoptotic effects. Peptides, 25(8),1269-77. OSBORN, M.- ISENBERG, S.: (1994) Immunocytochemistry of frozen and paraffin tissue sections. Cell Biology.A Laboratory Handbook. New York: Academic Press, vol. 2 367 s. PIVKO, J. (2003) :Regulation and evaluation of ovarian funktion and embryogenesis in normal and transgenic animals in vitro and in vivo.Journal of Pharm Animal science., 26(6), 20-21 SIROTKIN, A.V.-GROSSMANN, R.-MARIA-PEON, M.T.-ROA, J.-TENA-SEMPERE, M.-KLEIN, S. (2006): Novel expression and funktional role of ghrelin in chicken ovary. 26;257-258, 15-25 Kontaktná adresa: RNDr. Andrej Benčo, Katedra zoológie a antropológie, FPV UKF v Nitre, Nábrežie mládeže 91, 949 01 Nitra, e-mail:[email protected] h.doc., RNDr. Alexander V. Sirotkin, PhD., DrSc., SCPV, VÚŽV Nitra, Hlohovská 2, 949 92 Nitra, e-mail: [email protected] VPLYV PROBIOTIKA BONVITAL NA ÚŽITKOVÉ PARAMETRE VÝKRMOVÝCH OŠÍPANÝCH THE EFFECT OF THE PROBIOTIC BONVITAL ON PRODUCTION PARAMETERS IN FATTENING PIGS Bindas, Ľ., Vajda, V., Maskaľová, I. Katedra výživy, dietetiky a chovu zvierat, UVL Košice Abstract Results of the feeding experiment conducted on 94 fattening pigs, based on supplementation of their diet with probiotic preparation Bonvital at a dose of 4.4 x 105 CFU/kg mixed feed (3.27- 5.68 x 105 CFU/kg) during 103 – day fattening period up to the slaughter grade, confirmed positive influence of this preparation on growth intensity, feed conversion and significantly higher slaughter weight. The fattening pigs in experimental group reached slaughter weight of 108.6± 10,3 kg while those in the control group weighed 101.9± 11,3 kg, the difference 6.7kg (P<0.01). The experimental group reaching mean weight gain 707.8 36 g/day and control group 639.8 g/day, the difference 68 g,i.e.10,6%. The feed consumption per kilogram weight was in the experimental group 3.39 kg compared to the control 3.75 kg.The feed consuption per kg weight gain in the control group was higher by 0.36 kg, which amounts to 11,6%. Keywords :fattening pigs; probiotic; nutrition; growth intensity; conversion of feed Úvod a literárny prehľad V poslednom období mimoriadne narastá záujem o využívanie prípravkov na báze prirodzených komponentov, pozitívne ovplyvňujúcich produkčné zdravie zvierat bez negatívneho účinku na zdravie konzumenta a životné prostredie. Uvedené podmienky veľmi dobré spĺňajú probiotika. Salminen a kol.,(1998) definuje probiotika ako živé mikrobiálne kŕmne prídavky, ktoré sú prospešné pre zdravie. Podľa Ouwehanda a kol. (2002) by v definícii nemalo byť slovo živý lebo pozitívny vplyv na zdravie majú tiež inaktivované bunky mikroorganizmov alebo len časť bunečných štruktúr hlavne baktérii a kvasiniek. Probiotika pomáhajú udržiavať rovnováhu ekosystému tráviaceho traktu, majú inhibičný účinok voči patogénom, optimalizačný vplyv na tráviace procesy, imunostimulačný efekt, antitumorovú a anticholesterolovú aktivitu. Bomba (2005). Inhibičný efekt probiotík voči patogénnom môže byť sprostredkovaný kompetíciou o receptory na črevnej sliznici, kompetíciou o živiny, produkciou antibakteriálnych látok a stimuláciou imunity Freter (1992) Zvýšenie intenzity rastu a zlepšenie konverzie krmiva u odstavčiat po zaradení do kŕmnej dávky probiotika Lactiferm (Enterococcus faecium M 74 ) zaznamenali Herzig a kol. (2003). Významné sú tiež poznatky pôsobenia probiotika u starších ošípaných. Marcin a kol. (1999) v pokuse so 60 výkrmovými ošípanými ( s počiatočnou priemernou hmotnosťou 22, 98 kg) počas celého výkrmového obdobia sledovali vplyv probiotického kmeňa Enterococcus facium ( 5. 109 baktérií v g preparátu), ktorý bol aplikovaný v množstve 150 g. t-1 krmiva, na intenzitu rastu a konverziu krmiva. Zaradenie probiotického kmeňa Enterococcus facium pri mierne vyššej intenzite rastu počas celého výkrmu sa prezentovalo o 8% nižšou spotrebou krmiva na kg prírastku. Pozitívne účinky probiotika na úžitkové parametre u výkrmových ošípaných pozorovali Hong a kol. (2002). Zaradenie probiotického komplexu ( Pichia anomala ST, Galactomyces geotrichum SR 59, Thiobacillus sp.) do kŕmnej dávky výkrmovým ošípaným signifikantne zvýšilo stráviteľnosť sušiny a dusíka, priemerné denné prírastky a znížilo exkréciu dusíka. V našom experimente sme sa zamerali na sledovanie vplyvu 37 probiotika Bonvital s aktívnou zložkou Enterococcus faecium DSM 7134 v kŕmnej dávke výkrmových ošípaných na zdravotný stav, rastovú intenzitu , príjem a konverziu krmiva. Materiál a metodika Do experimentu bolo zaradených 96 prasiat v dobrom zdravotnom stave. Prasatá boli rozdelené do dvoch skupín. V pokusnej skupine 48 prasiat v 4 ustajňovacích boxoch po 12 kusov o priemernej počiatočnej hmotnosti 35,7 kg ± 3,1. V kontrolnej skupine 48 prasiat v 4 ustajňovacích boxoch po 12 kusov o priemernej počiatočnej hmotnosti 36,0 kg ± 2,6 bolo umiestnené v inej hale s rovnakou technológiou. Použité krmivá a kŕmenie : Kontrolná skupina: 30 hmotnostných dielov bielkovinový koncentrát, 70 hmotnostných dielov šrotovaná kukurica, 248 hmotnostných dielov voda, kŕmenie tekutým krmivom s obsahom sušiny 22,8 %, ad libitum. Pokusná skupina:– kŕmna dávka a kŕmenie rovnaké ako v kontrolnej skupine, ale do diéty zamiešaný Bonvital v dávke 100g/t kŕmnej zmesi, koncentrácia Enterococcus fecium DSM 7134 1 x 10 10 CFU/ g produktu, 1,32 x 105 CFU/ kg krmiva, kŕmenie ad libitum. Denná dávka bola podľa rastu v týždňových intervaloch upravovaná. Spotreba krmív bola podľa skupín v halách evidovaná. Odber vzoriek a vyšetrenia: Z kŕmnych zmesí boli odobraté priemerné vzorky. Analytické metódy: stanovenie sušiny, dusíkatých látok, hrubého tuku, vlákniny, popola, škrobu podľa príslušných ustanovení Výnosu MP SR zo 7. októbra 1997, číslo 1497/4 –100 „O úradnom odbere vzoriek a laboratórnom skúšaní a hodnotení krmív“. Stanovenie aminokyselín po kyslej hydrolýze, sírnych aminokyselín po oxidácii na automatickom analyzátore aminokyselín. Ustajnenie : na roštovej podlahe z plastov bez podstielky. Ustajňovacie priestory boli temperované na teplotu 270 C s poklesom na 200 C ku koncu experimentu. Váženie zvierat : na začiatku experimentu a v mesačných intervaloch do ukončenia kŕmneho pokusu, spolu štyri individuálne váženia. Zdravotný stav: bol sledovaný denne ošetrovateľským personálom a veterinárnym lekárom. Štatistické vyhodnotenie : Studentov t- test. Výsledky a diskusia: Výsledky vyšetrenia použitých krmív vo výžive výkrmových ošípaných sú v tabuľke 1. Pri hodnotení použitých kŕmnych dávok v experimente sme zistili minimálne nutričné rozdiely medzi pokusnými skupinami. Kŕmne dávky analyticky stanovenou koncentráciu živín a energie odpovedali požiadavkám pre výkrmové ošípané. 38 Tabuľka 1. Výsledky nutričnej analýzy kŕmnych dávok pre výkrmové ošípané Ukazovatele Kontrolná Pokusná 766,6 766,1 142,8 143,9 29,1 29,8 34,3 33,7 49,8 51,4 510,6 507,3 9,22 8,96 Metionín + cystín, g. kg 5,42 5,5 Metabolizovateľná energia MJ. kg-1 11,5 11,5 -1 Sušina, g. kg. N – látky, g. kg-1 -1 Vláknina, g. kg -1 Hrubý tuk, g. kg -1 Popol, g. kg -1 BNLV, g. kg Lyzín, g. kg-1 -1 Výsledky vplyvu probiotického prípravku Bonvital na intenzitu rastu vo výkrme ošípaných sú v tabuľke 2 Tabuľka 2 Vplyv probiotického prípravku Bonvital na rastové parametre výkrmových ošípaných Ukazovatele Kontrolná skupina počet Pokusná skupina Øhmotnosť Ø denné kg prírastky g počet Øhmotnosť Ø denné kg prírastky g 0 deň 48 36,0±2,6 - 48 35,7±3,1 - 30. deň 48 56,2±7,7 651,6 47 58,8±7,3 745,2 60.deň 47 75,9±8,3 681,1 47 79,5±8,3 713,8 103. deň 47 101,9±11,3 604,1 47 108,6±10,4 676,2 prírastok 65,9 639,8 72,9 707,8 Pri hodnotení rastovej intenzity rýchlejší rast bol pozorovaný v pokusnej skupine, čo možno dokumentovať vyššími priemernými prírastkami vo všetkých sledovaných fázach. Najvýraznejší vplyv probiotického prípravku Bonvital na intenzitu rastu sme pozorovali v prvom mesiaci výkrmu. Pokusná skupina v tejto fáze výkrmu dosahovala priemernú hmotnosť 58,8±7,3 kg a kontrolná skupina 56,2±7,7 kg, rozdiel bol 2,6 kg resp.4,6%. Priemerný denný prírastok za sledované obdobie bol v skupine výkrmových ošípaných s prídavkom Bonvital 745,2 g/deň a kontrolná skupina 651,6 g/deň, rozdiel bol 93,6 g resp. 14,4%. Tendencia rýchlejšieho rastu pokračovala aj v druhej fáze výkrmu 31 – 60 dní, pri priemernej hmotnosti v pokusnej 79,5±8,2 oproti 75,9±8,2 kg v kontrolnej skupine, rozdiel narástol oproti prvej fáze na 3,6 kg so štatistickou významnosťou P<0,05. Pokusná skupina výkrmových ošípaných v tejto fáze dosiahla priemerný denný prírastok 713,8g/deň 39 a kontrolná 681,1g/deň rozdiel 32,7g resp.4,7%. Rozdiel v intenzite rastu medzi pokusnou a kontrolnou skupinou výkrmových ošípaných sa vo finálnej fáze v porovnaní s predchádzajúcou ešte zvýšil. V tretej fáze 61 – 103 dní výkrmu priemerný prírastok v pokusne skupine bol 676,2g/deň oproti kontrolnej 604,1g, rozdiel 72,1 g resp.12 %, takmer dosahoval výšku najvýraznejšieho rozdielu v prvej fáze výkrmu. Vyššiu priemernú finálnu hmotnosť 108,6±10,3 kg, pri vyrovnanej počiatočnej hmotnosti, dosiahli počas 103 dňového výkrmového obdobia ošípané ktorých diéty boli obohatené probiotickým prípravkom Bonvital v porovnaní s kontrolnou skupinou 101,9 kg, rozdiel 6,7 kg resp.6,6%, štatisticky vysoko významnou preukaznosťou P<0,01. Za celé sledované výkrmové obdobie ošípané pokusnej skupiny vytvorili priemerný celkový prírastok 72,9 kg a v kontrolnej 65,9 kg, rozdiel 7 kg resp.10,6%. Výsledky vplyvu probiotického prípravku Bonvital v prvej fáze výkrmu ošípaných na priemerný denný príjem krmiva, konverziu krmiva, dusíkatých látok a metabolizovateľnej energie na úrovni kŕmnych boxov sú uvedené v tabuľke 3 Tabuľka 3 Vplyv probiotického prípravku Bonvital na príjem krmiva, konverziu krmiva, N – látok a energie v prvom mesiaci výkrmu ošípaných Ukazovatele Kontrolná skupina Pokusná skupina n - 48 n - 47 Ø denný príjem krmiva v kg 1,79 1,79 Konverzia krmiva, kg/kg 2,75 2,40 Konverzia N – látok g/kg 395,73 342,7 Konverzia ME 31,63 27,6 MJ/kg Pri hodnotení úspešnosti rastu je dôležitá spotreba krmiva na kg prírastku, konverzia dusíkatých látok a energie. Najvýraznejší rozdiel v prospech pokusnej skupiny bol v prvom mesiaci výkrmu, čo je v zhode aj najvyšším rozdielom v intenzite rastu medzi skupinami. Výkrmové ošípané v hodnotenom období potrebovali na vytvorenie kg prírastku 2,40 kg krmiva, kontrolná skupina 2,75 kg, rozdiel 0,35 kg, resp. 12,7%. Spotreba dusíkatých látok na kg prírastku v pokusnej skupine bola 342,7g v kontrolnej 395,73g, rozdiel 53,03g resp. 13,4%. Podobná je tendencia pri hodnotení konverzie energie, pokusná skupina 27,6, kontrolná 31,63 MJ ME/kg, rozdiel 4,03 MJ, resp.12,7%. 40 Tabuľka 4 Vplyv probiotického prípravku Bonvital na príjem krmiva, konverziu krmiva, N – látok a energie v druhom mesiaci výkrmu ošípaných Ukazovatele Kontrolná skupina Pokusná skupina n - 47 n - 47 Ø denný príjem krmiva v kg 2,47 2,47 Konverzia krmiva, kg/kg 3,63 3,46 Konverzia N – látok g/kg 518,36 497,89 Konverzia ME 41,75 39,79 MJ/kg Lepšie využitie krmiva na tvorbu prírastku, i keď s menším rozdielom sme pozorovali aj v druhom mesiaci výkrmu ošípaných. Zaradenie probiotika do diéty ošípaných znížilo spotrebu krmiva /kg prírastku na 3,46 kg v porovnaní s kontrolnou skupinou 3,63 kg, rozdiel 0,17 kg, resp.4,7%. Transformácia dusíkatých látok krmiva na priemerný prírastok hmotnosti v pokusnej skupine ošípaných bola 497,89g/kg a v kontrolnej 518,36g/kg, rozdiel 20,47g resp. 4%. Spotreba energie v pokusnej skupine 39,79MJ ME/kg, v kontrolnej o 1,96 MJ viac 41,75 MJ ME/kg, rozdiel 4,7%. Tabuľka 5 Vplyv probiotického prípravku Bonvital na príjem krmiva, konverziu krmiva, N – látok a energie vo finálnej fáze výkrmu ošípaných Ukazovatele Kontrolná skupina Pokusná skupina n - 47 n - 47 Ø denný príjem krmiva v kg 2,79 2,79 Konverzia krmiva, kg/kg 4,62 4,13 Konverzia N – látok g/kg 659,74 594,31 Konverzia ME 53,13 47,50 MJ/kg Vysoký rozdiel v intenzite rastu výkrmových ošípaných vo finálnej fáze je v zhode s výrazným rozdielom medzi skupinami tiež v konverzii krmiva. Pokusná skupina ošípaných potrebovala na tvorbu kg prírastku 4,13 kg, kontrolná 4,62 kg , rozdiel 0,49kg, resp. 10,6%. Podobná situácia je pri hodnotení konverzie dusíkatých látok, pokusná skupina 594,31g/kg, kontrolná o 65,43g viac t.j. 659,74g/kg, rozdiel 10%. Aj spotreba energie na tvorbu prírastku bola vyššia v kontrolnej skupine 53,15MJ/kg a v pokusnej o 5,63MJ menej t.j. 47,50MJ/kg, rozdiel 10,6%. 41 Tabuľka 6 Vplyv probiotického prípravku Bonvital na príjem krmiva, konverziu krmiva, N – látok a energie za celé obdobie výkrmu ošípaných Ukazovatele Kontrolná skupina Pokusná skupina n - 47 n - 47 Ø denný príjem krmiva v kg 2,39 2,39 Konverzia krmiva, kg/kg 3,75 3,39 Konverzia N – látok g/kg 535,5 487,8 Konverzia ME 43,13 38,99 MJ/kg Vyššia konverzia krmiva v pokusnej skupine s prídavkom Bonvital bola aj za celé obdobie výkrmu ošípaných, keď priemerná spotreba krmiva na kg prírastku bola 3,39 kg a v kontrolnej skupine o 0,36 kg na kilogram prírastku vyššia 3,75kg, rozdiel v percentách 9,6%. Podobný účinok probiotika v kŕmnej dávke výkrmových ošípaných bol zaznamenaný aj pri hodnotení využitia dusíkatých látok a energie na tvorbu prírastku, pokusná skupina dusíkaté látky 487,8g/kg a kontrolná 535,5g/kg, rozdiel 47,7 g resp.8,9%, spotreba energie pokusná skupina 38,99 MJ ME/kg a kontrolná 43,13 MJ ME/kg, rozdiel 4,14 MJ, resp. 9,6%. Záver Pri fortifikácii kompletných kŕmnych zmesí pre výkrmové ošípané probiotickým prípravkom Bonvital sme zistili: • vyššiu finálnu hmotnosť výkrmových ošípaných s prídavkom Bonvital o 6,7 kg, priemerná hmotnosť pokusnej skupiny 108,6kg, kontrolnej 101,9 kg, P<0,01 • priemerný prírastok za 103dňové obdobie pri pokusnej skupine 707,8 g/deň a pri kontrolnej 639,8 g/deň, rozdiel 10,6% • najvýraznejší vplyv prípravku Bonvital u odstavčiat v prvom mesiaci experimentu, pokusná skupina dosiahla priemerný denný prírastok 745,2g/deň a kontrolná 651,6g/deň, rozdiel bol 93,6 g resp. 14,4%. • lepšiu konverziu krmiva počas celého výkrmového obdobia, v pokusnej skupine, spotreba krmiva na kilogram prírastku bola 3,39kg a v kontrolnej 3,75kg, rozdiel 0,36kg, resp.9,6% • podobný účinok probiotika v kŕmnej dávke výkrmových ošípaných bol zaznamenaný aj pri hodnotení využitia dusíkatých látok a energie na tvorbu prírastku, pokusná skupina dusíkaté látky 487,8g/kg a kontrolná 535,5g/kg, rozdiel 47,7 g resp.8,9%, 42 spotreba energie pokusná skupina 38,99 MJ ME/kg a kontrolná 43,13 MJ ME/kg, rozdiel 4,14 MJ, resp. 9,6%. Literatúra 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. BOMBA, A., KAŠTEĽ, R., GANCARČÍKOVÁ, S., NEMCOVÁ, R., HERICH, R., ČÍŽEK, M. 1996 : The effect of lactobacilli inoculation on organic acid levels in the mucosal film and the small intestine contents in gnotobiotic pigs. Berl. Munch.Tierztl. Wschr., 109, pp. 428 – 430 BOMBA, A. 2005 : Gnotobiotické zvieratá v probiotickom výskume. Doktorská dizertačná práca, UVL Košice, pp.92 FRETER,R.1992: Factors affecting the microecology o the gut.Probiotics, The Scientific Basis, Chapman and Hall, London, pp.111 – 114 HERZIG, I., GOPFERT, E., PISARIKOVA, B., STRAKOVA, E. 2003 : Testing of growth promoting and protective activity of the probiotic Lactiferm in weaned piglets. Acta Veterinaria Brno, 72, 3, pp. 331 - 338 HONG, J. W., KIM, I. H., KWON, O. S., KIM, J. H., MIN, B. J., LEE, W. B. 2002 : Effects of dietary probiotics supplementation on growth performance and fecal gas emission in nursing and finishing pigs. J. Anim. Sci. and Technol., 44, 3, pp. 305 - 314 MARCIN, A., VALIGA, J., MOLNÁROVÁ, I., IVANKO, Š. 1999 : Vplyv Enterococcus faecium M – 74 na produkčné, ekonomické a zdravotné ukazovatele u výkrmových ošípaných. Zborník z vedeckej konferencie “Zdravie a choroby zvierat”, diel: “Výživa a zdravie zvierat”, Košice, 8. – 9. September 1999, pp. 135 - 139 OUWEHAND, A., SALMINE, S. 2000 : Probiotics, are they save for everybody? Proceedings : The Prospects of probiotics in prevention and therapy of diseases of young. Hight Tatras, Slovak republic, 11 – 14 October 2000, pp. 25 - 27 SALMINEN, S., OUWEHAND,A.C., ISOLAURI, E. 1998: Clinical aplication of probiotic bacteria. Int.Daiory J. 8, pp.563 - 572 Práca bola realizovaná za podpory firmy Lactosan Starterkulturen GmbH & Co KG, Rakúsko Kontaktná adresa: MVDr. Ľubor Bindas, PhD., Prof.MVDr.V.Vajda, PhD., MVDr.I.Maskaľová Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, 041 81 Košice VYUŽITIE GENOMIKY VO VÝSKUME FYZIOLOGICKÉHO POZADIA EKONOMICKY VÝZNAMNÝCH VLASTNOSTÍ HOSPODÁRSKYCH ZVIERAT THE USE OF GENOMICS IN THE RESEARCH OF PHYSIOLOGICAL BACKGROUND OF ECONOMICALLY IMPORTANT FARM ANIMALS TRAITS Bulla, J. Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva SPU v Nitre Abstract Genomics in livestock has been concentrating on the construction of genome maps and their use for the mapping of monogenic and quantitative trait loci. Most traits of economic importance in farm animals are complex in that they are polygenic and influenced by nongenetic environmental factors. Large single gene effects can be detected as segregating QTLs (quantitative trait loci) with genetic markers. In recent years, subsequent positional cloning 43 efforts have led to the elucidation of the causal mutation for several genetic diseases, metabolic variation but also monogenic factors affecting muscle mass, meat quality and ovulation rate in different livestock species. In several cases, unexpected or previously unknown genes have been detected. Physiological evidence is however very preliminary especially for the elucidation of pleiotropic effect and for quantitative traits. Experiments studying metabolic control of production characteristics can be designed to capitalize on the existence of genes and its functional variants. Key words: genomics, physiology, livestock, traits 44 45 46 47 VPLYV HYPODYNAMIE NA ŠTRUKTÚRU A FUNKCIU ENTEROCYTOV DUODENA JAPONSKÝCH PREPELÍC EFFECT OF HYPODYNAMY ON STRUCTURE AND FUNCTION OF DUODENAL ENTEROCYTES OF JAPANESE QUAILS Cigánková, V., Almášiová, V., Holovská, K., Lenhardt Ľ., Škrobánek P*., Zibrín, M. Department of Anatomy, Histology and Physiology University of Veterinary Medicine, Košice *Institute of Animal Biochemistry and Genetics, SAS, Ivanka pri Dunaji Abstract The effect of hypodynamy on the structure, ultrastructure, and enzymatic activity of the duodenal enterocytes of Japanese quail (Coturnix coturnix japonica) was studied. On the second day after hatching, 42 chicks were placed in individual slings suspended by a flexible metal device in such a manner that their legs could not touch the floor. Feed and water was provided ad libitum. Experimental animals were killed at 5, 7, 14, 21, 28, 35, and 42 d of age. The birds of control group were kept under standard conditions on the floor. The samples of the duodenum were routinely processed for light microscopy (LM) and transmission electron microscopy (TEM), and alkaline phosphatase (AP) activity was determined. Morphological changes in enterocytes of chicks reared under hypodynamy from day 2 after hatching were observed on days 5 and 7 of age. LM showed that the apical ends of intestinal villi contained clumps of necrotizing enterocytes which were more numerous compared to the control. TEM revealed loss of microvilli and changes in both the nucleus and cytoplasm in these cells. Besides considerable damage to mitochondria, they exhibited also typical vesiculation of cytoplasm and damaged intercellular junctions. From day 14 to 42 of age morphological changes were less pronounced. On day 7 of age, the activity of AP in the microvilli of duodenal enterocytes of experimental chicks was increased in comparison with the control (P<0.001). On day 14 of the experiment, AP in the investigated structures showed only a slight increase (P<0.05) and on day 21 was also slightly increased (P<0.01). On days 28, 35, and 42 of age, no significant differences in the activity of AP were observed. Hypodynamy acted as a stress factor on Japanese quail, which was stronger at the beginning of the experiment. Animals gradually adapted to the respective conditions. Our results show that Japanese quail chicks are capable of feed consumption and feed conversion under conditions of hypodynamy. Key words: microgravity, histology, enterocytes, Japanese quail 48 Introduction Japanese quail (Coturnix coturnix japonica) is a useful type of bird which is considered prospective for the space programme and, at the same time, is a very suitable object for model experiments (Boďa, 1997). Evolutionary processes responsible for shaping of bodies of terrestrial animals were affected by earth gravitation. Both the skeleton and muscle systems, responsible for body support, had adjusted to the gravitation forces. These systems respond to microgravity by atrophy of the muscles of limbs, osteoporosis, and reproductive disorders (Cigánková et al. 1993, 2001a, 2001b, 2005; Kočišová et al. 2002; Škrobánek et al. 2005; Zibrín et al. 2003, 2005). Hypodynamy is a method which simulates microgravity in space. Overall, hypodynamy has a negative effect on organism of Japanese quails. It induces changes in their behaviour and causes marked decrease in their body weight (Škrobánek et al. 2003). Škrobánek et al. (2004) observed the influence of long-term hypodynamy on body weight, consumption of feed and growth of limbs of Japanese quail chicks. The authors observed that 56-d hypodynamy caused a 14-34% decrease in body weight compared to the control, decrease in consumption of feed, and shortening the exposed limbs. Already short-term hypodynamy caused stress resulting in adrenal hypertrophy but in case of long lasting hypodynamy, gradual adaptation to the related stress was observed (Cigánková et al 2005). The aim of the present study was to observe the influence of simulated weightlessness on the structure and enzymatic activity of duodenal enterocytes of Japanese quail chicks kept under hypodynamy conditions. Material and Methods The experiment was carried out at the Institute of Animal Biochemistry and Genetics of SAS in Ivanka pri Dunaji. Forty-two female, newly hatched Japanese quail chicks were used in the study. On the second day after hatching, chicks of the experimental group were exposed to hypodynamy. Hypodynamy is a simulation of weightlessness where birds are placed in individual slings suspended by a flexible metal device in such a manner that their legs cannot touch the floor. However, chicks may move about freely by moving their wings. At the same time, the chicks of control group were placed in rearing box. The birds of experimental and control groups were kept in the respective conditions until 42 d of age in a windowless poultry room with controlled ventilation. The lighting in the rearing room was left on continuously. A commercial starter mash HYD-13 and water were available ad libitum. The feed was granular and contained 260 g/kg protein and 11.5 MJ metabolizing energy/kg. Immediately after killing on days 5, 7, 14, 21, 28, 35, and 42 of age, parts of the duodenum of 49 experimental chicks were removed in parallel with those of control. Each group consisted of 6 birds. Samples of the duodenum were processed for light microscopy (LM), transmission electron microscopy (TEM), and determination of alkaline phosphatase (AP) activity. Samples of the duodenum for LM were processed routinely. They were fixed in 4% neutral formaldehyde, embedded in paraffin, and the sections were stained with haematoxylin-eosin. Excisions for TEM were fixed by immersion in 3% glutaraldehyde, postfixed in 1% OsO4, dehydrated in acetone and propylene oxide, and embedded in Durcupan ACM. The ultrathin sections were examined in the electron microscope Tesla BS 500. The samples of the duodenum were frozen in liquid nitrogen vapours. AP activity was demonstrated using a modified simultaneous azo–coupling method. The enzyme activity was analysed cytophotometrically with a Vickers M 85a microdensitometer. Statistical evaluation of the results was carried out by one way analysis of variance (ANOVA). The significance of differences between the control and experimental animals was determined by Tukey test. Results LM and TEM observations In lm examination, experimental chicks, aged 5 days, showed morphological changes in the apical ends of duodenal villi. Enterocytes and goblet cells showed signs of necrotization. These cells occurred in groups by 2-5 and had darker cytoplasm. Using an electron microscope, the changes were found in the nuclei and cytoplasm of the enterocytes. Their cytoplasm was electrodense and nuclei were pycnotic with dilated perinuclear space. Also cisternae of smooth and rough endoplasmic reticulum were markedly dilated and mitochondrial outer membrane and cristae were damaged. Vesiculation of cytoplasm was observed. Microvilli were damaged and their number was significantly reduced. The intercellular junctions were disturbed and the damaged enterocytes and goblet cells sloughed off. The enterocytes, which lined the remaining surface of intestinal villi, showed signs of slight damage. Their cytoplasm was vacuolized. Control chicks of the same age showed less frequent necrotization of cells of intestinal epithelium in comparison with experimental birds. The apical ends of intestinal villi in control chicks contained only sporadic necrotizing enterocytes and goblet cells. Structure of the enterocytes was not damaged and their submicroscopic structure indicated normal absorption. On day 7, the structure of duodenal epithelium in experimental chicks was similar to that observed on day 5 of age. Some enterocytes showed signs of damage and were 50 necrotized. Loss of microvilli was observed on the apical surface of necrotizing cells. The cytoplasm contained numerous vesicles and damaged mitochondria. On day 14 of age, the number of necrotizing cells in the apical zone of intestinal villi in experimental chicks was lower. Vacuoles in the cytoplasm of necrotizing enterocytes coalesced and were filled with flocculated matter. Loss of microvilli on the apical surface of enterocytes was observed. On days 21–42 of age, the microscopic and submicroscopic structure of the duodenal epithelium in experimental animals was normal. No significant morphological differences in comparison with the control were observed. Enterocytes appeared as tall, slender, and columnar cells which set on the basement membrane. On their free apical surface, there were tall finger-like extensions of cell membrane – microvilli that formed a brush border. Enterocytes had markedly polarized cytoplasm. Numerous longitudinal mitochondria, cisternae of rough and smooth endoplasmic reticulum, free ribosomes, lysosomes, and microtubules were found electronmicroscopically in the enterocyte cytoplasm. Golgi complex was usually located supranuclearly. The basal part of enterocytes contained only a few cellular organelles. The lateral walls of enterocytes were connected by zonula occludens, zonula adhaerens, macula adhaerens, nexus, and interdigitations. Microvilli on the free apical surface of enterocytes formed long slender finger-like extensions, which were surrounded by a compact plasmalemma. Their inside was formed by homogenous cytoplasm with microfilaments arranged into fascicles. The free surface of microvilli was covered with delicate fibrous caruncles embedded into small glycoprotein layer which formed glycocalyx. A narrow margin of the cytoplasm close under the base of microvilli did not contain almost any organelles, except for microfilaments. Goblet cells were monocellular glands, which were individually scattered between enterocytes and produced mucus. In the narrowed basal part, they surrounded nucleus and cytoplasm with sporadic mitochondria, cisternae of endoplasmic reticulum, and Golgi complex. Their apical part was filled with mucus droplets which fused and covered with mucus the intestinal mucosa. The intestinal epithelium contained also interspersed endocrinal cells and sporadic lymphocytes. Histochemical analysis. On day 7, we observed that the activity of AP in the microvillous zone of duodenal enterocytes of experimental chicks was increased in comparison with the control (P<0.001). On day 14, in the experimental group, AP in the investigated structures showed only a slight increase (P<0.05) and on day 21 was also slightly increased (P<0.01). On days 28, 35, and 42 of age no significant differences in the activity of AP were observed. 51 Discussion The microscopic and submicroscopic structure of the enterocytes of the small intestine of Japanese quails, hatched on the orbital station MIR, was studied (Cigánková et al 2001a). After their return to the earth, the animals were 4-5 d old. In some enterocytes of the dudodenum and jejunum significant morphological changes were found. In the LM, the damaged enterocytes appeared as dark cells. TEM studies confirmed the finding of these “dead” cells. In the same animals, an increased activity of alkaline phosphatase, localized in microvilli, was found in all intestinal villi in both observed parts of the small intestine. These morphological and histochemical findings suggested that it was due to decreased feed intake. In conclusion, it may be accepted that morphological changes in enterocytes did not arise due to the direct effects of microgravity but due to reduced feed intake and they were considered reversible. Our investigations revealed that the most pronounced morphological changes in enterocytes of experimental Japanese quails were observed on days 5 and 7 of age. Observations under a light microscope showed that clumps of necrotizing enterocytes were present on apical ends of intestinal villi and they were more pronounced in comparison with the control. TEM allowed us to observe loss of microvilli and marked changes in the nuclei and cytoplasm of the necrotising cells. However, also the ultrastructure of the remaining enterocytes indicated that the stress related to suspending the chickens by means of special jackets resulted in a decreased feed intake shortly after such handling. On day 14 to 42 of age, the findings in enterocytes of the duodenum and jejunum of experimental chicks differed less from those in the control chicks and the morphological picture was disturbed only slightly. By histochemical analysis on day 7 of age, we detected only slightly increased activity of alkaline phosphatase in duodenal enterocytes of experimental quails in comparison with the control. This indicated an adaptation of the enzyme localized in the small intestine in the microvilli as a response to the limited feed intake for its better utilization. Results of our observations agree with the findings in the small intestine epithelium in Japanese quail hatched in a spacecraft (Cigánková et al 2001a). The Japanese quail chicks hatched at the orbital station MIR, similarly to those exposed to hypodynamy, were subjected to intensive stress. This is supported by the structure of the adrenals of quail exposed to spacecraft conditions (Cigánková et al 2001b) and those exposed to long-term hypodynamy (Cigánková et al 2005). We presume that the increased number of necrotizing enterocytes in Japanese quail observed at the beginning of the experiment was the consequence of insufficient feed intake. 52 Lower intake of feed and hypodynamy-induced atrophy of muscles resulted in decreased body weight of quail chicks. Acknowledgments: This work was supported by the Grant Agency for Science of Slovak Republic VEGA 1/ 3495/ 06. References 1. 2. Boďa K.: Cosmic biology and veterinary medicine. Slov Vet J 1997, 22, 125-126. Cigánková V., Kočišová J., Boďa K., Tomajková E., Dadasheva O.A.: Morphological changes in tissue of the testes and kidneys in Japanese quail exposed to microgravity. Acta Vet (Brno) 1993, 62, Suppl.6, 69-71. 3. Cigánková V., Zibrín M., Kočišová J., Sabo V., Boďa K., Dadasheva O.A., Gurieva T.S.: Histological changes in the adrenal glands of newly hatched Japanese quail chicks during a short stay on the orbital station MIR. Folia Vet 2001 b, 45, 36-40. 4. Cigánková V., Lenhardt Ľ., Zibrín M., Kočišová J., Tomajková E., Komorová T., Sabo V., Boďa K., Dadasheva O.A., Gurieva T.S.: Morphological changes in the small intestine of Japanese quail chicks hatched under the conditions of microgravity. Folia Vet 2001 a, 45, 27-31. 5. Cigánková V., Zibrín M., Boďa K., Holovská K.: Effect of long-term experimental hypodynamy on the adrenal glands of Japanese quails: An ultrastructural study. Bull Vet Inst Pulawy 2005, 49, 449-453. 6. Kočišová J., Cigánková V., Zibrín M., Tomajková E., Sabo V., Boďa K., Dadasheva O.A., Gurieva T.S.: Morphological study of gastrocnemius muscle in Japanese quail chicks hatched out in space flight. Aviakosm Ekolog Med 2002, 36, 6-9. 7. Škrobánek P., Hrančová M.: Adaptability of Japanese quail chicks to conditions of simulated weightlessness. Acta Vet (Brno) 2003, 2, 347-351. 8. Škrobánek P., Hrbatá M., Baranovská M., Juráni M.: Growth of Japanese quail chicks in simulated weightlessness. Acta Vet Brno 2004, 73, 157-164. 9. Škrobánek P., Baranovská M., Juráni M., Šárniková B.: Influence of simulated microgravity on leg bone development in Japanese quail chicks. Acta Vet (Brno) 2005, 74, 475-481. 10. Zibrín M., Boďa K., Cigánková V., Kočišová J., Komorová T., Tomajková E., Sabo V., Pivko J.: Long-term experimental hypodynamy affects the structure of spongy bone and osteoclasts in Japanese quail. Acta Vet (Brno) 2003, 72, 143-149. 11. Zibrín M., Cigánková V., Kočišová J., Tomajková E., Komorová T., Boďa K., Weismann P., Dadasheva O.A., Gurieva T.S.: Effect of short-term space flight on structure of liver, lungs, bone and bone marrow of Japanese quail hatched on orbital station Mir. Acta Vet (Brno), 2005, 74, 167-174 Viera Cigánková, Doc. MVDr.,Univerzita veterinárskeho lekárstva, Ústav histológie a embryológie, Komenského 73, 041 81 Košice, e-mail: [email protected] KVANTITATÍVNE HODNOTENIE OBLIČIEK APODEMUS FLAVICOLIS Z EKOSYSTÉMOV V NOVÁKOCH QUANTITATIVE ANALYSIS OF KIDNEYS OF APODEMUS FLAVICOLIS FROM ECOSYSTEMS IN NOVAKY 1 Drábeková, J., 2Jančová, A., 3Massányi, P., 3Lukáč, N. 1Katedra matematiky, Fakulta ekonomiky a manažmentu, SPU Nitra zoológie a antropológie, Fakulta prírodných vied, UKF Nitra 3Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, SPU Nitra 2Katedra Abstract This work presents histological analysis of kidney tissue. We evaluated microscopical kidney structures of species Apodemus flavicolis (Muridae, Rodentia). Samples for histological 53 preparations were taken from adult individuals, which were in a very good physical condition and sexual active. They come from ecosystems that are situated close to thermal power station Novaky. For quantitative analysis morphometrical image analyzer softwer (Micro Image ver. 4.0) was used according to micromorphological criteria. The diameter of renal corpuscle, glomeruli, Bowman’s capsule, tubules as well as height of tubular epithelium, surface of tubules and lumen, perimeter of tubules and lumen were evaluated. The differences between male and female in quantitative analysis were statistical significant (P<0.05). Úvod Početné populácie drobných zemných cicavcov sú významnými zložkami takmer všetkých pevninských ekosystémov. Považujú sa za vhodných bioindikátorov antropogénneho zaťaženia krajiny pretože pomocou nich môžeme odhaliť a monitorovať rôzne ekotoxikologické poruchy. Ich vhodnosť dokazuje skutočnosť, že škodliviny na ne pôsobia podobne ako na človeka a domáce zvieratá, ale chorobné príznaky sú pri týchto živočíchoch veľmi skoro a ľahko pozorovateľné. Apodemus flavicolis z čeľade Muridae (Rodentia) je fylogeneticky mladým organizmom a z toho vyplývajú aj jeho možné citlivé reakcie na rôzne druhy noxií v životnom prostredí. V článku sa zaoberáme mikroskopickou stavbou obličiek, ktoré patria medzi mimoriadne senzitívne orgány na kumuláciu cudzorodých látok a ovplyvnenie ich štruktúry môže mať za následok renálne dysfunkcie až zlyhanie základných procesov fyziológie močovej sústavy. Materiál a metodika Obličky z ktorých boli odobraté vzorky na histologické analýzy pochádzajú z adultných, sexuálne aktívnych jedincov Apodemus flavicolis, ktoré boli vo veľmi dobrej telesnej kondícii. Boli získané z ekosystémov v blízkosti tepelnej elektrárne v Novákoch pomocou štandardných teriologických metód a postupov. Vzorky z obličiek sa fixovali v 10% formole, následne sa odvodnili vzostupným radom alkoholov (70%, 80%, 96%, 100%), presýtili benzénom a zaliali do parafínu. Zaliate bločky sa následne narezali na sánkovom mikroskope a rezy hrubé 10 µm boli farbené hematoxylínom a eozínom (Vacek, 1974). Z preparátov sa zhotovili mikrofotografie (Olympus, Provis Ax, Japan) a tie sme na základe mikromorfologických kritérií kvantitatívne zhodnotili (Weibel et al., 1966). Pri týchto analýzach bol využitý softwér Micro Image ver. 4.0. Zisťovali sme priemer glomerulov, Bowmanovho púzdra, priemer obličkového telieska, priemer tubulov, výšku epitelu tubulov, plochu tubulov, obvod tubulov, plochu lumenu tubulov, obvod lumenu tubulov. Zo získaných 54 hodnôt sme vypočítali základné variačno-štatistické ukazovatele (aritmetický priemer x , x , minimum xmin , maximum x max , smerodajnú odchýlku ± s , variačný koeficient vk ) medián ~ využitím PC programu Excel. Korelačné koeficienty a štatistickú preukaznosť výsledkov sme zisťovali pomocou analýzy rozptylu a programu SAS 9.1. Výsledky a diskusia Na zhotovených mikrofotografiách sme pozorovali základnú stavebnú a funkčnú jednotku obličky, nefrón (nephonum), a intrarenálne vývodné močové cesty. Obličkové telieska (corpusculum renis) boli zložené z Bowmanovho puzdra (capsula glomerula) a klbka navzájom anastomozujúcich kapilár (glomerulum). Ďalšia časť nefrónu, močový kanálik (tubulus renis) bol tvorený jednou vrstvou epitelových buniek. V rámci kvantitatívneho morfometrického hodnotenia sme pomocou softwéru zisťovali priemer jednotlivých častí obličkového telieska. Hodnotili sme 11 meraní obličkového telieska u samíc a 12 meraní obličkového telieska u samcov druhu Apodemus flavicolis. Údaje sú zaznamenané v tabuľke 1. Vzhľadom na fakt, že obličkové telieska nemali guľovitý tvar, pri meraní priemeru jednotlivých častí obličkového telieska udávame v tabuľke 1 menší aj väčší priemer eliptického tvaru glomerula, Bowmanovho puzdra aj celého obličkového telieska. Tabuľka 1: Základné matematicko-štatistické údaje (µm) jednotlivých častí obličkového telieska u oboch pohlaví sledovaného druhu Apodemus flavicolis . Glom 1 Glom 2 BowP 1 BowP 2 ObT 1 ObT 2 34.39 33.7 41.75 44 3.99 3.9 5.15 5.2 41.71 42.6 49.32 51.8 25 27.6 3.1 3.6 31.8 34.7 41.3 5.46 48.4 6.50 4.8 0.63 6.8 0.87 52.1 6.92 57.2 7.34 15.89 15.56 15.71 16.97 16.60 14.88 41.01 42.95 48.73 50.2 5.79 5.4 8.3 8.1 52.43 53.55 60.42 62.35 28 32.4 3.7 4.2 38.5 44.1 49.4 6.08 62.1 8.43 8.5 1.35 14.4 2.61 64.8 7.67 73.3 8.37 14.83 17.30 23.24 31.39 14.63 13.85 samice x ~ x xmin x max ±s vk samce x ~ x xmin x max ±s vk Glom 1 – menší priemer glomerula, Glom 2 – väčší priemer glomerula, BowP 1 – menší priemer Bowmanovho puzdra, BowP 2 – väčší priemer Bowmanovho puzdra, ObT 1 – menší priemer obličkového telieska, ObT 2 – väčší priemer obličkového telieska 55 Hodnoty priemeru glomerula sa u samíc pohybovali v rozmedzí 34,39 µm až 41,75 µm a u samcov v rozmedzí 41,01 µm až 48,73 µm. Jančová et al. (1999, 2001) udáva oveľa väčšie priemery glomerulov obličiek u druhu Apodemus sylvaticus. Ich namerané hodnoty sa pohybovali od 63,365 µm až 73,370 µm. Druh Apodemus flavicolis vykazoval pri ich meraniach väčšiu variabilitu a priemer glomerulov bol v rozpätí 46,690 µm až 80,04 µm. Ich skúmané druhy pochádzali z lesných a močiarnych ekosystémov v Mochovciach. Lukáč et al. (2004, 2006) pozorovali vplyv experimentálneho podania olova na štruktúru obličiek laboratórnych myší. Uvádzajú, že kontrolná skupina myší mala priemer glomerulov 50,58 ± 9,45 µm. V experimentálnych skupinách sa priemer glomerulov pohyboval v intervale od 51,80 µm až 53,73 µm. My sme takéto väčšie hodnoty namerali len pri niektorých samcoch druhu Apodemus flavicolis (tabuľka 1). Najväčší priemer obličkového telieska sme namerali 73,30 µm, čo je porovnateľná hodnota s údajmi, ktoré zistil Lukáč et al. (2004, 2006). Avšak všetky ostatné hodnoty sú menšie ako údaje popisované v prácach spomínaných autorov. Vplyv olova na štruktúru obličiek potkanov skúmali tiež Massányi et al. (2006). Vo svojej práci uvádzajú, že po experimentálnom podaní olova sa štatisticky preukazne zvýšil priemer obličkového telieska, glomerula aj Bowmanovho puzdra. Všetky ich zistené údaje majú vyššie hodnoty ako tie ktoré sme namerali. Lukáč et al. (2006) skúmali tiež vplyv ortuti na štruktúru obličiek potkanov a zistili signifikantne nižšie hodnoty priemerov obličkového telieska aj glomerula v experimentálnej skupine. Udávajú však až dvojnásobne vyššie hodnoty morfometrických meraní ako sú nami zistené hodnoty. Pri kvantitatívnom analyzovaní obličiek sme hodnotili aj močové kanáliky. Zamerali sme sa prevažne na ich proximálny segment. Merali sme 100 kanálikov u samíc a 100 kanálikov u samcov druhu Apodemus flavicolis. Údaje sú zaznamenané v tabuľke 2. Vzhľadom na oválny tvar kanálikov v tabuľke 2 udávame menší aj väčší priemer kanálikov. Keďže sme pozorovali rôznu výšku epitelu v rámci jedného kanálika udávame v tabuľke tiež menšiu aj väčšiu výšku epitelu. Hodnoty priemeru močových kanálikov sa u samíc pohybovala v rozmedzí od 22,55 µm až 31,75 µm a u samcov od 30,06 µm až 46,57 µm. Tieto hodnoty sú nižšie ako hodnoty, ktoré namerali Lukáč et al. (2004, 2006) u laboratórnych myší (61,34 µm až 61,78 µm) či v kontrolnej alebo experimentálnej skupine. Taktiež morfometrické merania močových kanálikov potkanov, ktoré robili Lukáč et al. (2006) resp. Massányi et al. (2006) dosahujú vyššie hodnoty. S prácami spomínaných autorov by sa dala porovnávať len výška epitelu tubulov u samcov (tabuľka 2), ktorá dosahuje nimi zistené hodnoty. 56 Tabuľka 2: Základné matematicko-štatistické údaje (µm) sledovaných častí obličkového kanálika u oboch pohlaví druhu Apodemus flavicolis. PT1 PT2 VE1 VE2 plochaT obvodT plochaL obvodL x ~ x 22.55 31.75 8.44 9.68 563.87 85.54 60.17 29.22 22.2 31.1 8.35 9.6 535.7 83.15 41.8 27.4 xmin 15.6 19.7 4.4 4.6 285.3 60 7.07 11.4 x max 32.4 53.1 13.5 14.2 1172.3 140.3 271.1 66.7 ±s 3.66 7.08 1.57 1.67 186.60 15.25 54.14 11.59 vk 16.22 22.31 18.62 17.23 33.09 17.83 89.99 39.65 x ~ x 30.06 46.57 10.3 11.85 1114.02 120.81 191.06 51.77 29.8 43.7 10.15 11.6 1056.5 115.6 154.15 47.7 xmin 17.6 28.1 6.1 6.9 530.1 83.5 11.5 17.8 x max 38.9 83.8 18.8 22.4 2223.2 194.2 687.6 137.9 ±s 3.98 11.85 1.86 2.21 376.74 22.76 145.14 19.95 vk 13.23 25.44 18.09 18.66 33.82 18.84 75.96 38.53 samice samce PT 1 – menší priemer tubulov, PT 2 – väčší priemer tubulov, VE 1 – menšia výška epitelu, VE 2 – väčšia výška epitelu, plochaT – plocha tubulov, obvodT – obvod tubulov, plochaL – plocha lumenu, obvodL – obvod lumenu Vzhľadom na porovnateľné vyššie hodnoty, ktoré nám vychádzali u samcov (tabuľka 1, tabuľka 2), sme tieto údaje podrobili analýze rozptylu, testom mnohonásobného porovnania (Duncanov, Scheffeho), a zistili sme že rozdiely medzi pohlavím sú na hladine α = 0,05 štatisticky preukazné. Táto štatistická významnosť bola potvrdená pri všetkých skúmaných údajoch. Strednú závislosť medzi získanými morfometrickými hodnotami a pohlavím nám potvrdili aj štatisticky signifikantné korelačné koeficienty (Pearsonov, Spearmanov). Sú to však prvotné výsledky a na sformulovanie záverov treba v morfometrickej analýze obličiek drobných zemných cicavcov pochádzajúcich z oblastí s rôznym emisným zaťažením naďalej pokračovať. Práca je podporovaná projektmi VEGA 1/2364/05, VEGA 1/2417/05, CGA UKF VI/2/2006, APVV-0299-06. 57 Literatúra Jančová, A., Ligač, S., Massányi, P., Uhrín, V., 1999. Morfologická analýza semenníkov a prisemenníkov ryšavky Apodemus sylvaticus a Apodemus flavicolis (Muridae). Slovenský veterinársky časopis, 24, 3: 152-156. Jančová, A., Massányi, P., Uhrín, V., 2001. Morfometrická analýza obličiek Apodemus sylvaticus a Apodemus flavicolis. Zborník „Nové poznatky v morfológii“, 39. kongres Slovenskej anatomickej spoločnosti s medzinárodnou účasťou, Martin, 78-79. Lukáč, N., Massányi, P., Toman, R., Sládečka, A., 2004. Štrukturálne zmeny obličiek myší po experimentálnom podaní olova. Zborník z konferencie „Rizikové faktory potravového reťazca IV“, SPU, Nitra, 155-159. Lukáč, N., Massányi, P., Toman, R., Trandžík, J., Capcarová, M. Stawarz, R., Cigánková, V., Jakabová, D., Kožáková, I., Forgács, Z., Somosy, Z., 2006. Prejavy toxicity olova a ortuti. In: Kováčik, J., et al.: Biologické aspekty zvyšovania kvality surovín a potravín živočíšneho pôvodu. Vedecká monografia, SPU, Nitra, 145-155. Massányi, P., Lukáč, N., Makarevich, A.V., Chrenek, P., Forgacs, Z., Zakrewski, M., Stawarz, R., Toman, R., Lazor, P., Flesarova, S., 2006. Lead-induced alterations in rat kidneys and testes in vivo. Journal of Enviromental Science and Health Part A 41, 1-6. Vacek, Z., 1974. Histológia a histologická technika. Martin, Osveta, s.388. Weibel, E.R., Kistler, G.S., Scherle, W.F., 1966. Practical stereological methods for morphometric cytology. J. Cell Biol., 30, 23-38. Kontaktná adresa: RNDr. Janka Drábeková, PhD.,Katedra matematiky FEM SPU, Tr.A.Hlinku 2, 949 76 Nitra, email: [email protected] RNDr. Alena Jančová, PhD., Katedra zoológie a antropológie FPV UKF, Nábrežie mládeže 91, 949 01 Nitra, email: [email protected] EFFECT OF GRADED LEVELS OF MYCOTOXIN ON CLINICAL PLASMA CHARACTERISTICS IN CHICKS Faixová , Z.1, Faix, Š.2 1University of Veterinary Medicine in Košice, Košice, Slovak Republic 2Institute of Animal Physiology Slovak Academy of Sciences, Košice, Slovak Republic Abstract An experiment was conducted to investigate the effect of different doses of deoxynivalenol (DON) on plasma indices of broiler chickens. Forty- two, 1-d old male broiler chicks were fed 1 of 3 diets containing DON for 42 d. The diets included (1) control (0.2 ppm DON); (2) low level of DON (1 ppm DON) and high level of DON (3 ppm DON). The administration of 1 ppm DON to the diet altered total protein, triglycerides, free glycerol and potassium levels. Dietary inclusion of 3 ppm DON resulted in altered calcium, potassium, total protein, triglycerides, free glycerol levels and AST activity. No biochemical parameter, however, responded to increased DON concentration in the diet. The feeding of DON-containing diets did not significantly alter plasma chloride, cholesterol and albumin levels or AST, ALP and LDH activities. It was concluded that both levels of DON in the diets tested significantly affected protein and lipid metabolism in broiler chicks. Key words: chicken, deoxynivalenol, mycotoxin, plasma indices 58 In this study we were interested in deoxynivalenol (DON, vomitoxin), a trichothecene toxin which occurs regularly throughout the world, with possible high contamination levels in cereal grain from various countries. Many studies describe the adverse effects of DON on animal and human health. Indeed, in domestic or laboratory animals, large doses of DON caused feed refusal, decreased weight gain, vomiting, gastrointestinal and dermal irritation and immunological alterations. Lower doses of DON have been shown to provoke elevation of serum IgA level and are also known to affect cell-mediated and humoral immunity in several animal species. The sensitivity to DON varies considerably between species. Trichothecenes are wellknown inhibitors of protein synthesis. They also cause apoptosis both in vitro and in vivo in various organs. Trichothecenes are also shown to interfere with the metabolism of membrane phospholipids and to increase liver lipid peroxides in vivo (9). In addition, some trichothecenes are shown to alter the activity of serotonin in the central nervous system, which is known to be involved in the regulation of food intake. The aim of this study was to determine the effect of different doses of DON on biochemical variables of growing broiler chickens. Material and Methods Forty-two, 1-d-old male broiler chicks were randomly distributed into 3 groups of 14 chicks in each one. The diets were formulated to meet all nutritional specifications of starter, grower, and finisher broiler chickens. The three diets included control (0.2 ppm DON) and experimental (1 and 3 ppm DON). Chicks were fed the diets from the day of hatch to 42 d of age. Dietary contents of DON were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry. All experimental procedures with animals were in accordance with European Guidelines for care and use of animal for research purpose and they were approved by a local ethic committee. The results are expressed as mean ± S.E.M. Statistical significance was evaluated by ANOVA test. Results and discussion In this experiment, diet containing 1 and 3 ppm of DON were given to growing broiler chickens for 6 wk. The deoxynivalenol treatment in both doses significantly decreased plasma level of total protein of chicks. 59 Our results are consistent with those of Kubena et al. (8) and Bergsjø et al. (2) Later Mikami et al. (1) examined the toxicity of DON to porcine hepatocytes. Authors reported that DON reduced albumin secretion from hepatocytes into the medium due to the loss of hepatocytes by apoptosis and also due to the inhibition of protein synthesis. DON has also been reported to reduce serum albumin level in growing piglets fed a diets containing 8.6 mg/kg mycotoxin for 36 days (3). The toxicity of DON in both concentrations tested was expressed through decreased plasma triglycerides and free glycerol in broiler chickens. These findings are in agreement with the previous reports of Kubena et al. (7). On the other hand, Accensi et al. (1) reported that DON in low concentrations (0, 280, 560 or 840 µg/kg of feed) did no alter the performance of weanling piglets on potassium, chloride, calcium, cholesterol, triglycerides, alkaline phosphatase, aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase and lactate dehydrogenase. DON has also been reported to increase liver triglycerides and total liver lipid in White Lerghorn hens fed a diet containing 0.25 or 0.70 ppm DON for 86 or 135 days (5). Dietary inclusion of 3 ppm DON resulted in increased plasma alanine aminotransferase, indication liver damage. DON has also been reported to increase activities of AST, LDH and gamma GTP in broiler chicks fed DON at 15 mg/kg, indicating possible tissue damage and leakage of the enzymes into the blood (6). In the present study, plasma calcium increased in birds fed diet containing 3 ppm DON. Plasma calcium, however, was not affected by 1 ppm DON diet. Previous data of Bergsjø et al. (2) reported a significant decrease in serum calcium and phosphorus in growing pigs fed a diet containing 3.5 mg/kg DON. DON has also been reported to induce weak hypocalcaemia in rats fed 1 mg/kg DON for 6 months, suggesting that calcium metabolism disorders during chronic action of mycotoxin could be partially associated with secondary vitamin D deficiency (11). Recently Gouze et al. (5) reported that electrolytes in plasma appeared to be insensitive to a 4-week exposure to low DON in mice. The discrepancy between these results and our data could be due to a number of factors, including sensitivity to DON between species, DON concentration, DON source, animal genetics, sex and nutritional status, contamination of feed by other mycotoxin. Our results showed that no biochemical parameter responded to increased DON concentration in the diets. 60 Table 1 Effect of dietary inclusion of deoxynivalenol on clinical plasma characteristics in growing broiler chickens Item Control 0.2 ppm DON 1 ppm DON 3 ppm DON Chloride (mmol/l) 104.3 ± 4.88 104.50 ± 3.88 114.40 ± 4.36 Calcium (mmol/l) 2.17 ± 0.07a 1.86 ± 0.19b 3.36 ± 0.34ab Magnesium (mmol/l) 0.86 ± 0.05bc 1.50 ± 0.08ab 0.34 ± 0.01ac Potassium (mmol/l) 12.01 ± 1.04ab 5.87 ± 0.22a 4.56 ± 0.58b Alkaline phosphatase (µkat/l) 8.06 ± 0.81 10.05 ± 0.05 10.72 ± 0.12 aminotransferase 0.25 ± 0.02b 0.22 ± 0.03a 0.47 ± 0.00ab aminotransferase 2.01 ± 0.16 2.15 ± 0.14 2.12 ± 0.09 dehydrogenase 2.99 ± 0.12 3.02 ± 0.38 2.88 ± 0.43 Alanine (µkat/l) Aspartate (µkat/l) Lactate (µkat/l) Total protein (g/l) 39.11 ± 1.52ab 27.04 ± 1.74a 27.59 ± 1.92b Albumin (g/l) 16.12 ± 0.46 15.60 ± 0.09 15.21 ± 0.32 Cholesterol (mmol/l) 4.08 ± 0.19 3.54 ± 0.19 3.80 ± 0.34 Triglycerides (mmol/l) 1.02 ± 0.06ab 0.36 ± 0.04a 0.34 ± 0.02b Free glycerol (mmol/l) 0.91 ± 0.06ab 0.27 ± 0.04a 0.23 ± 0.02b Values are mean ± S.E.M., n = 14. Significant differences within a row are indicated by using the same superscript letter, P<0.01. Conclusion These data demonstrate that both doses of DON in the diets (1 and 3 ppm) significantly affected protein and lipid metabolism in broiler chicks. Moreover, under field conditions with additional stress factors, the toxicity of DON could be altered to adversely affect the health and performance of poultry. Acknowledgments This work was partially supported by the grants VEGA No 1/2443/5 and APVT 51004804. 61 References 1. Accensi F., Pinton P., Gallu P., Abella-Bourges N., Guelfi J.F., Grosjean F., Oswald I.P.: Ingestion of low doses of deoxynivalenol does not affect hematological, biochemical, or immune responses of piglets. J Anim Sci 2006, 84, 1935-1942. 2. Bergsjø B., Langseth W., Nafstad I., Jansen J.H., Larsen H.J.S.: The effects of naturally deoxynivalenolcontaminated oats on the clinical conditions, blood parameters, performance and carcass composition of growing pigs. Vet Res Commun 1993, 17, 283-294. 3. Doll S, Dänicke S., Valenta H., Flachowsky G.: In vitro studies on the evaluation of mycotoxin detoxifying agents for their efficacy on deoxynivalenol and zearalenone. Arch Anim Nutr 2004, 58, 311-324. 4. Farnworth E.R., Hamilton R.M., Thompson B.K., Trenholm H.L.: Liver lipid levels in White Leghorn hens fed diets that contained wheat contaminated by deoxynivalenol (vomitoxin). Poult Sci 1983, 62, 832-836. 5. Gouze M.E., Laffitte J., Rouimi P., Loiseau N., Oswald I.P. et al.: Effect of various doses of deoxynivalenol on liver xenobiotic metabolizing enzymes in mice. Food Chem Toxicol 2006, 44, 476-483. 6. Kubena L.F., Edrington T.S., Harvey R.B., Buckley S.A., Phillips T.D. et al.: Individual and combined effects of fuminissin B1 present in Fusarium moniliforme culture material and T-2 toxin or deoxynivalenol on broiler chicks. Pult Sci 1997, 76, 1230-1247. 7. Kubena L.F., Harvey R.B., Corrier D.E., Huff W.E., Phillips T.D.: Effect of feeding deoxynivalenol (DON, vomitoxin) contaminated wheat to female White Leghorn chickens from day old through egg production. Poult Sci 1987, 67, 253-260. 8. Kubena L.F., Huff W.F., Harvey R.B., Corrier D.E., Phillips T.D. et al: Influence of ochratoxin A and deoxynivalenol on growing broiler chicks. Poult Sci 1988, 67, 253-260. 9. Mezes M., Barta M., Nagy G.: Comparative investigation on the effect of T-2 mycotoxin on lipid peroxidation and antioxidant status in different poultry species. Res Vet Sci 1999, 66, 19-23. 10. Mikami O., Yamamoto S., Yamanaka N., Nakajima Y.: Porcine hepatocytes apoptosis and reduction of albumin secretion induced by deoxynivalenol. Toxicol 2004, 15, 241-249. 11. Sergeev I.N., Piliia N.M., Kuzmina E.E., Avreneva L.I., Kravchenko L.V., Spirichev V.B., Tuteľian V.A.: Calcium and vitamin D metabolism and enzymes of xenobiotic metabolism during chronic action of mycotoxins. Vopr Pitan 1990, 5, 25-30. LEPTÍN AKO REGULÁTOR FUNKCIÍ BOVINNÝCH VAJCOVODOV IN VITRO LEPTIN AS A REGULATOR OF BOVINE OVIDUCTAL FUNCTIONS IN VITRO Fazekašová, J. 1, 2, Makarevič, A.V.1, Sirotkin, A. V. 1, Bulla, J. 1, 2 1 Slovenské 2 centrum poľnohospodárskeho výskumu , Nitra Katedra fyziológie živočíchov, FBP SPU Nitra Abstract The aim of this study was to examine effects of hormone leptin on apoptosis and proliferation and secretory activity of cultured fragments of bovine oviducts, as well as compare it with effects of well-known mitogen – insulin-like growth factor I (IGF-I). Effects of leptin on the expression of pro-apoptotic peptides (Bax, caspase-3), anti-apoptotic peptide (Bcl 2) and proliferation peptide (PCNA) were analyzed using Western-blotting, and the release of IGF-I by cultured oviductal fragments was measured using radioimmunoassay (RIA). Leptin stimulated IGF-I release at all doses added. Leptin when given at low dose (1ng/ml) leptin, like to IGF-I, stimulated the expression of anti-apoptotic peptide Bcl2. Leptin at higher (10, 100 ng/ml) concentrations decreased PCNA- content and stimulated the 62 expression of pro-apoptotic peptides – Bax and caspase-3. IGF-I has an opposite effect on these substances. The mainly opposite effects of leptin and IGF-I on apoptosis and proliferation assume an existence of feedback interrelationships between these substances. It is not excluded, that leptin and IGF-I are antagonists in control of oviductal functions. This finding suggests different biological roles of leptin and IGF-I in the oviduct. Key words: oviduct, proliferation, apoptosis, leptin, IGF-I Úvod Vajcovod je dôležitým orgánom reprodukčnej sústavy, v ktorom sa uskutočňujú procesy kapacitácie spermií, oplodnenia oocytu a delenia embrya. Vhodné prostredie pre tieto procesy vytvára tekutina vajcovodu, ktorej zložky pochádzajú z cirkulačného systému, a taktiež sú syntetizované bunkami vajcovodu. Epitel vajcovodu obsahuje sekrečné žľazové a riasinkové bunky (kinocílie), ktoré sú zapojené v transporte oocytov, spermií a raných embryí, pokiaľ čo sekrečné produkty sú významné pre vytvorenie optimálneho prostredia (Leese a kol., 2001). Bunky vajcovodu produkujú množstvo rozličných látok, ktoré majú vplyv na kontrakciu, proliferáciu, apoptózu a vývoj embrya (Yeung a kol., 2002), ďalej produkujú endokrinné/parakrinné signálne látky vrátane ovariálnych steroidov (Wollenhaupt a kol., 2002), prostaglandínov F2 alpha a PGE2 (Harper, 1998), oxidu dusnatého (NO) (PerezMartiney a kol., 1997), rastových faktorov (Makarevich a Sirotkin, 1997) a cytokínov (Wijayagunawardane a kol., 2003). Tieto faktory môžu ovplyvňovať delenie a diferenciáciu buniek embrya a iné zmeny v epitely vajcovodu. Leptín je dôležitou látkou, ktorá môže ovplyvňovať funkcie reprodukčných organov samíc, vrátane vajcovodu. Primárnym zdrojom leptínu je tukové tkanivo, predovšetkým biele adipocyty. Má preukázateľný vplyv na regulátory reprodukcie na úrovni hypotalamu a adenohypofýzy (Swain a kol., 2004). Zatiaľ čo vplyv leptínu na ováriá je dobre dokumentovaný (Chehab a kol., 1996), jeho efekty na vajcovod nie sú preskúmané. Cieľom tejto štúdie bolo zistiť efekty leptínu na apoptotické a proliferačné procesy vo fragmentoch bovinných vajcovodov in vitro a porovnať ich s efektmi známeho mitogénu – inzulínu podobného rastového faktoru I (IGF-I), ktorý je taktiež regulátorom sekrécie a antiaptotickým faktorom. Materiál a metodika Vajcovody v periovulačnej fáze pohlavného cyklu boli odobraté od kráv (Holstein, vo veku 23 mesiacov, n = 10) porazených na bitúnku a očistené od tukového a svalového 63 tkaniva. Z takto izolovaných vajcovodov sa v sterilných podmienkach izolovali fragmenty vajcovodov, ktoré sa použili na založenie primárnej kultúry v 24- dierových platničkách (Nunclon Surface, Nunc, Roskilde, Dánsko) a v Chamber slides (Nunclon Surface, Nunc, Roskilde, Dánsko). Kultivácia prebehla v sterilnom médiu DMEM/F12 + 20 % FCS (BioWhittaker™, Verviers, Belgium) + 1% antibiotikum-antimykotikum (Sigma, St. Louis, Mo, USA). Po dvoch dňoch kultivácie sa médium vymenilo za médium s prídavkami leptínu (Peptides International, Luisville, USA) a IGF-I (Dr.A.P.F.Parlow, NHPP, Torrance, USA) v koncentráciách 1, 10, 100 ng/ml média a kultivácia trvala tri dni v CO2 inkubátore pri 38,50C. Bol študovaný vplyv prídavkov leptínu a IGF-I na expresiu pro-apoptotických peptidov (Bax, kaspáza-3), anti-apoptotického peptidu (Bcl2) a proliferačného peptidu (PCNA) a na vylučovanie IGF-I kultúrou fragmentov vajcovodov kráv. Vylučovanie leptínu a IGF-I fragmentmi vajcovodov do média sme analyzovali metódou rádioimunoanalýzy. Expresiu proliferačných peptidov (PCNA, Bax, Bcl2) (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz , USA) v bunkových lyzátoch bol analyzovaný pomocou elektroforézy a Westernblottingu (Leammli, 1970). Výsledky boli spracované a vyhodnotené bežnými štatistickými metódami pomocou programu Sigma Plot 9.0 (Systat Sofware, Inc., Point Richmond, CA, USA ). Výsledky Leptín v našich pokusoch stimuloval sekréciu IGF- I v kultúre in vitro (Obr. 1), pričom jeho efekt bol závislý od koncentrácie. Najvyššia stimulácia bola dosiahnutá po pridaní 100 ng/ml média. 180 * * 160 * Vylučovanie IGF-I, ng/ml 140 120 100 80 60 40 20 0 0 1 10 100 Koncentrácia leptínu, ng/ml Obr. 1. Vplyv leptínu na vylučovanie IGF-I fragmentmi vajcovodov kráv Hodnoty v grafe: priemer ± chyba strednej hodnoty preukazné rozdiely (p<0,05) v porovnaní s kontrolou bez prídavku leptínu * 64 Leptín podaný pri všetkých koncentráciách (1, 10, 100 ng/ml) stimuloval expresiu anti-apoptotického peptidu Bcl2. Vyššie koncentrácie leptínu (10, 100 ng/ml) zvyšovali expresiu pro-apoptotického peptidu Bax, zatiaľ čo najnižšia koncentrácia (1 ng/ml) neovplyvnila expresiu daného peptidu. Percento proliferujúcich (PCNA-pozitívnych) buniek bolo účinkom leptínu pri najvyššej koncentrácii (100 ng/ml) znížené, čím sa potvrdil inhibičný efekt leptínu na proliferáciu buniek. Percento proliferujúcich buniek pri nižších koncentráciách (1, 10 ng/ml) sa výrazne nezmenilo v porovnaní s kontrolou. Leptín pri nižších koncentráciách (1 ng/ml) stimuloval expresiu kaspázy-3 a pri vyšších koncentráciách leptínu (10, 100 ng/ml) neboli pozorované zmeny v porovnaní s kontrolou. IGF-I podaný pri všetkých koncentráciách (1, 10, 100 ng/ml) stimuloval expresiu antiapoptotického peptidu Bcl2. Inhibičný účinok IGF-I na expresiu Bax bol pozorovateľný len pri nižších koncentráciách (1 ng/ml), vyššie koncentrácie IGF-I (10, 100 ng/ml) neovplyvňovali expresiu Bax v porovnaní s kontrolou. IGF-I naopak redukoval pri vyšších koncentráciách (10, 100 ng/ml) akumuláciu frakcie zodpovedajúcej kaspáze-3, pričom pri najnižšej koncentrácii (1ng/ml) nebola pozorovaná zmena v expresii kaspázy-3 v porovnaní s kontrolou . Vplyv oboch biologicky aktívnych látok znázorňujú tabuľky č. 1 a 2. Tabuľka č. 1: Vplyv leptínu na apoptotické a proliferačné peptidy Látka Analytická metóda Charakter vplyvu LEPTÍN Bax WB + Bcl 2 WB + PCNA WB - Kaspáza-3 WB + Vysvetlivky: WB- Western- blotting, „+“- stimulácia, „-„ - inhibícia Tabuľka č. 2: Vplyv IGF-I na apoptotické a proliferačné peptidy Látka Analytická metóda Charakter vplyvu IGF-I Bax WB - Bcl 2 WB + Kaspáza-3 WB - 65 Diskusia IGF-I je známy svojimi stimulačnými účinkami na sekréciu a proliferáciu buniek a preimplantačný vývoj embryí. IGF-I potláča apoptózu a zvyšuje počet proliferujúcich sa buniek v embryách kráv (Makarevich a Markkula, 2002). IGF- I vylučovaný do vajcovodovej tekutiny môže účinkovať ako parakrinný regulátor skorého embryonálneho delenia. Ovplyvňuje metabolizmus a rast buniek vajcovodu, prenos vnútrobunkových signálov (Buhi a kol., 1996). IGF-I je zapojený do procesov reprodukčnej sústavy. Má vplyv na dozrievanie a selekciu folikulov a podporuje proliferáciu a diferenciáciu granulóznych buniek. Zvyšuje biosyntézu a sekréciu progesterónu a estrogénu v granulóznych bunkách hovädzieho dobytka a ľudí, sekréciu androgénov buniek z vaječníkov. Stimuluje jadrové dozrievanie oocytov ošípaných. Aktivuje proliferáciu a brzdí apoptózu v kumulárnych bunkách obklopujúcich oocyty. Všeobecne má proliferačné a antiapoptické účinky, stimuluje sekréciu a generačné funkcie ovárií (Sirotkin et al., 2004). Leptín pôsobí ako modulátor rôznych reprodukčných funkcií vrátane vývinu ranného embrya u cicavcov (Buhi a kol.,1996). O vplyve leptínu na vajcovod existujú len nepatrné poznatky (Wollenhaupt a kol., 2002). Receptory pre leptín boli dokázané vo vajcovode niektorých živočíšnych druhov vrátane človeka (Liu a kol., 2003), myší a krysy (Tartaglia, 1997). Z toho vyplýva, že leptín môže ovplyvňovať vajcovod cez špecifické receptory a to buď autokrinným alebo parakrinným spôsobom. Predpokladáme, že leptín sa môže dostavať do vajcovodu z krvného obehu. Napriek tomu u ošípaných bolo dokázané, že leptín sa produkuje vajcovodom, stimuluje dozrievanie oocytov in vitro a má vplyv na vývin embryí do štádia blastocysty (Craig a kol., 2005). V našich pokusoch sme potvrdili vplyv leptínu pri všetkých dávkach na sekréciu IGF-I bunkami vajcovodu. Výsledky našich výskumov sú prvými poznatkami o účinku leptínu na sekréciu IGF-I vo vajcovode kráv. Leptín v našich experimentoch znižoval akumuláciu proliferačného markera PCNA a zvyšoval expresiu apoptotických peptidov (Bax a kaspáza-3) v bunkách, čím sa potvrdil modulačný vplyv tohto hormónu. Nakoľko proliferačný antigén PCNA sa objavuje v S fáze bunkového cyklu (Makarevich a kol., 2002), môžeme predpokladať úlohu leptínu v regulácii bunkového cyklu. Záver Nakoľko vplyvy leptínu a IGF-I sa navzájom odlišujú vo vzťahu k procesom apoptózy a proliferácie, predpokladáme že tieto dve látky môžu mať rôzny biologický význam vo 66 vajcovode. Naše pozorovania potvrdzujú stimulačný vplyv leptínu na sekréciu IGF-I a na proliferáciu buniek vajcovodu. Zvýšená koncentrácia leptínu inhibuje proliferáciu a stimuluje expresiu pro-apoptotických látok, ale stimuluje vylučovanie IGF-I, ktorý ovplyvňuje opačne expresiu týchto peptidov. Tieto protichodné efekty leptínu a IGF-I na apoptózu a proliferáciu predpokladajú existenciu mechanizmu spätnej väzby medzi týmito látkami. To znamená, že zvýšená koncentrácia IGF-I pod vplyvom leptínu začína ovplyvňovať vajcovod cestou potláčania apoptózy a stimulácie proliferačného potenciálu. Nie je vylúčené že tieto biologicky aktívne látky môžu byť antagonistami v efektoch na funkcie vajcovodu. Literatúra 1. BUHI, W., ALVARES, I. M., CHOI, I., CLEAVER, B. D., SIMMEN, F.A.1996. Molecular cloning and characterization of an estrogen- dependent porcine oviductal secretory glycoprotein. Biol Reprod. 55:13051314. 2. CRAIG, J. A., ZHU, H., DYCE, P. W., WEN, L., LI, J. 2005. Leptin enhances porcine preimplantation embryo development in vitro. Mol Cell Endocrinol 229: 141-147. 3. CHEHAB, F.F., LIM, M.E., LU, R. 1996. Correction of the sterility defect of homozygous obese female mice by treatment with the human recombinant leptin. Nat Genet, 12: 318-320. 4. HARPER, M. J. K., 1998. Gamete and zygote transport. Physiol. Reprod. Raven Press, New York, USA, pp. 103- 104. 5. LEESE, HJ., TAY, JI., REISCHEL, J., DOWNING, SJ., 2001 Formation of Fallopian tubal fluid: role of a neglected epithelium. Reproduction 121 339-346. 6. LIU, L. L., QIAO, J., WANG, Y. Z., CHEN, Y. J., GAO, Y. Q. 2003. Expression of leptin and leptin receptor system in woman reproductive organs. Zhonghua Yi Xue Za Zhi 83: 666- 668. 7. LEAMMLI, U.K.1970. Nature 277, 680-8. 8. MAKAREVICH, A. V., MARKKULA, M., 2002. Apoptosis and cell proliferation potential of bovine embryos stimulated with insulin-like growth factor I during in vitro maturation and Culture. Biol. Reprod. 66, 386-392. 9. MAKAREVICH, A. V., SIROTKIN, A. V., 1997. The involvement of the GH/IGF-I axis in the regulation of secretory activity by bovine oviduct epithelial cells, Animal Reproduction Science 48: 197-207. 10. MAKAREVICH, A. V., SIROTKIN, A. V., CHRENEK, P., BULLA, J. 2002. Effect of EGF on steroid and cyclic nukleotide section proliferation and ERK- related MAP- kinase in culture rabbit granulose. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 110: 124-129. 11. PEREZ- MARTINEZ, S., FRANCHI, A. M., SUBURO, A., HERRERO, B., GOIN, J. C., OSHIMA, H., GIMENO, M.A.F., 1997. Several isoforms of nitric oxide synthase are present in the rat oviduct. Biocell 21:215- 223. 12. SIROTKIN, A.V., SANISLO, P., SCHAEFFER, H.-J., FLORKOVIČOVÁ, I., KOTWICA, J., BULLA, J., HETÉNYI, L. 2004 Thrombopoietin regulates proliferation, apoptosis, secretory activity and intracellular messengers in porcine ovarian follicular cells: involvement of protein kinase A. Journal of Endocrinology 183, 595-604 13.SWAIN, J.E., DUNN, R.L., MCCONNEL, D., MARTINEZ, J.G., SMITH, G.D. (2004): Direct effects of leptin on mouse reproductive function: Regulation of follicular, oocyte and embryo development. Biology of Reproduction 71, 1446-1452. 14. TARTAGLIA, L.A. 1997. The leptin receptor. J Biol Chem 272:6093-6096. 15. WIJAYAGUNAWARDANE, M. P. M., MIYAMOTO, A., GABLER, KILLIAN, G., 2003. Tumor Necrosis Factor α in the bovine oviduct during the estrous cycle: Messenger RNA expression and effect on secretion of prostaglandins, endothelin- 1, and angiotensin II. Biol. Reprod. 69: 1341- 1346. 16. WOLLENHAUPT, K., TOMEK,W., BRUSSOV, K.P., TIEMANN,U., VIERGUTZ, T., SCHNEIDER, F., NURNBERG, G. 2002. Effects of ovarian steroids and epidermal growth (EGF) on expression and bioactivation of specific regulators of transcription and translation in oviductal tissue in pigs. Reprod. and Fertil. 35:588-644. 17. YEUNG, W. S. B. , LEE, K. F., XU, J. S., 2002. The oviduct and development of pre- implantation embryo. Reprod Med. Rev. 10:21- 44. 67 Kontaktná adresa: Ing. Jana Fazekašová, Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, SPU Nitra, Tr. A. Hlinku 2. [email protected] MVDr. Alexander V. Makarevič, CSc., SCPV Nitra, [email protected] CAROTENOID ABSORPTION IN LAYING HENS Gregosits, B., Kerti, A., Szabó, Cs., Bárdos, L. Szent István University, School of Agricultural and Environmental Sciences, Department of Animal Physiology and Health, 2103 Gödöllő, Hungary (www.mkk.szie.hu/dep/aeet) Abstract In the present study the effects following a large dose (20ppm) of ß-carotene (BC), lutein (LU) and lycopene (LY) supplementations (192.3 mg ß-carotene 10.4%; 357 mg Lutein CWS/S-TG 5.6%; 384.6 mg Redivivo lycopene 5% DSM NUTRITIONAL PRODUCTS) both when given separately (20ppm) and together (20-20-20ppm, ∑20ppm) on LU+zeaxanthin, ßcryptoxanthin, LY, BC, tocopherol, retinol and retinyl palmitate absorption were investigated in laying hens. Serial blood samples were taken at 6 hourly intervals before the supplementation and for up to 48h post-dosing and analyzed with rpHPLC for the carotenoid and retinoid levels. In cases of all the three applied carotenoids (BC, LU and LY) supplemented both separately and combined the concentration of the respective carotenoid significantly increased in response to the high-carotenoid intake. The response curves occurred maximally over the 6-12 hours after doses. The plasma appearance of LY in order of magnitude was weaker (near the baseline) although the dosages were identical (20ppm), in contrast with BC and LU. When the combined carotenoid doses were (∑20ppm) applied, the smaller individual supplementation (6.6ppm/each) resulted greater increase in the plasma concentrations in case of all three carotenoids. Our data confirm an interactions between LU, LY and BC when given in a combined dose in the concentrations of plasma carotenoids, namely the non polar carotenoid (LY) worsened the effectiveness of the other two oxycarotenoids (LU and zeaxanthin). Introduction Carotenoids are synthesized in plants and in certain microorganisms such as some bacteria, algae, and fungi. Animals are unable to synthesize carotenoids de novo, they rely upon the diet as the source of these compounds. Carotenoids are a group of dyes that are widespread in nature and responsible for the yellow/orange/red/purple colors of many fruits, flowers, birds, insects, and marine animals. Over 600 carotenoids have been isolated from natural sources, but only about 60 of them are detected in the human diet and no more than 20 of them in 68 human blood and/or tissues. Among them ß-carotene (BC), α-carotene, lycopene (LY), lutein (LU) and β-cryptoxanthin are the five most prominent carotenoids present in the human body (DURING & HARRISON 2004). The role of dietary carotenoids in health and disease has attracted increasing interest at the moment, and numerous investigations are currently in progress to clear up the benefits of these compounds in the diet. Most of the detectable carotenoids (LU, zeaxanthin, cryptoxanthin, alfa-carotene, all-trans-BC, 13-cis-BC, and four geometric isomers of LY (l5-cis-, 13-cis-, 9-cis-, and all-trans-LY) of human plasma can be increased by moderate alterations in diet within a short time (15-d periods), although the extent of the plasma response may be related to the baseline carotenoid concentrations (YEUM ET AL. 1996). In the present study the effects following a large dose of BC, LU and LY supplementations both when given separately and together on LU+zeaxanthin, ß-cryptoxanthin, LY, BC, tocopherol, retinol and retinyl palmitate absorption were investigated in laying hens. Material and Methods The study was designed to provide detailed information by using a 48 h sampling period and a distinct dosing (20ppm, 20-20-20ppm, ∑20ppm) of single dose consumption of different carotenoids (192.3 mg ß-carotene 10.4%; 357 mg Lutein CWS/S-TG 5.6%; 384.6 mg Redivivo lycopene 5% these supplements made by; DSM NUTRITIONAL PRODUCTS) delivered to laying hens (Bovans Nera) in a well-standardized system. Responses of carotenoids and retinoids after a separate 20ppm BC/LU/LY dose were compared with those after a dose of 20ppm BC combined with 20ppm LY and 20ppm LU or with 6.6ppm BC combined with 6.6ppm LY and 6.6ppm LU. The water soluble carotenoid preparations were mixed with oil in 1:1 ratio. The suspensions were provided with blow out pipette to the crop. After single oral doses the animals were provided with feed and water ad libitum. The supplementation was derived from the average daily feed consumption of laying hens corresponding to the literature. Serial blood samples were taken at 6 hourly intervals before the supplementation (zero time when the single dose was given) and for up to 48h post-dosing. Plasma was separated and subsequently analyzed with rpHPLC for the carotenoid and retinoid levels (KERTI & BÁRDOS 2006). The administered compounds as well as other carotenoids (three oxy-carotenoids (LU, zeaxanthin, and ß-cryptoxanthin), and the hydrocarbon carotenoids (BC and LY), and retinol and its palmitate-ester were separated by using a C18 column. 69 Result and Discussion In cases of all the three applied carotenoids (BC, LU and LY) supplemented both separately and combined the concentration of the respective carotenoid significantly increased in response to the high-carotenoid intake (Fig. 1.). The elevations of carotenoid levels related to the different nature of the carotenoid compound (polarity, i.e. solubility) which resulted the proportion of the incorporation into portomicrons. Contrary to the literature where the kinetics of the hydrocarbon carotene BC and the oxycarotenoid LU in plasma are distinct, in our experiment the plasma appearance of all carotenoids were monophasic, probably due to the occasional blood sampling appointments (6h versus the hourly in human studies). 120 ug/L A 100 LU 300 BC ug/L LY 60 ppm LU BC B 250 LY 60 ppm 20 ppm 20 ppm 80 200 60 150 40 100 20 50 0 0 0 6 12 18 24 30 36 42 48 h 12 LU ug/L BC C 10 0 6 12 18 24 36 42 25 48 h LU ug/L BC D LY 60 ppm 30 20 LY 60 ppm 20 ppm 20 ppm 8 15 6 10 4 5 2 0 0 0 6 12 18 24 30 36 42 48 h 0 6 Figure 12 18 24 30 36 42 48 h 1. Carotenoid and retinoid profiles of blood in laying hens A: lutein, B: ß-carotene, C: lycopene, D: retinyl palmitate We observed a greater postprandial appearance of BC than of LU. The response curves in the plasma for carotenoids occurred maximally over the 6-12 hours after doses. The plasma appearance of LU developed with an increase at 12 h postdosing, while of BC and LY 70 at 6 h, and followed by a gradual decline until concentrations reached baseline at the last measurement at 48 h. The values of BC and LU after reaching a maximum level gradually returned to the baseline in absence of additional supplies. The plasma appearance of LY in order of magnitude was weaker (near the baseline) although the dosages were identical (20ppm), in contrast with BC and LU. This slightest polar compound (LY) probably has a distinct transport mechanism in the blood, which consequence its slower elevation and disappearance from the plasma. When the combined carotenoid doses were (∑20ppm) applied, the smaller individual supplementation (6.6ppm/each) resulted greater increase in the plasma concentrations in case of all three carotenoids. In case of larger doses (3x20ppm) the odds are that competition might be occurred for the binding proteins of mucosa cells and/or saturation of absorptive mechanism. Not all investigated carotenoids have provitamin A activity. This was confirmed by the results, that only the BC supplementation called forth significant increases in retinyl palmitate plasma concentrations both at separate and combined doses. This was the result of the effective dioxygenase activity and esterification processes in the mucosa (BC → RAL → ROL → RYL). Conclusion The concentrations of carotenoids in plasma and tissue are often taken as an index of absorption. Serum carotenoid concentrations depend on intestinal absorption as well as on tissue uptake and release of carotenoids, doubtless mainly reflect the immediate dietary carotenoid intake. Only few studies to date have directly measured intestinal carotenoid absorption in fowls. The differences among carotenoids in lipoprotein transport and tissue uptake and their activity as provitamin-A results that these measurements do not reflect carotenoid absorption accurately. Our data confirm an interactions between LU, LY and BC when given in a combined dose in the concentrations of plasma carotenoids, namely the non polar carotenoid (LY) worsened the effectiveness of the other two oxycarotenoids (LU and zeaxanthin). Our results showed a significant decrease in the LU and zeaxanthin responses when mixed doses were given. 71 Literature 1. During A., Harrison E. H.: Intestinal absorption and metabolism of carotenoids: insights from cell culture. Arch Biochem Biophys. 2004. 430: 77–88. 2. Kerti A., Bárdos L.: Simultaneous analyses of retinoids (retinol, retinyl palmitate), carotenoids (lutein, zeaxanthin, ß-cryptoxanthin, lycopene, ß-carotene) and vitamin E with rpHPLC (in Hungarian). MLDT 53. Nagygyűlése, Szeged, 2006. In: Klinikai és Kísérletes Laboratóriumi Medicina, Szeged, 2006. 32S: p. 106. 3. Yeum K. J., Booth S. L., Sadowski J. A., Liu C., Tang G., Krinsky N. I., Russell R. M.: Human plasma carotenoid response to the ingestion of controlled diets high in fruits and vegetables. Am J Clin Nutr. 1996. 64: 594-602. Contact address: Szent István University, School of Agricultural and Environmental Sciences, Department of Animal Physiology and Health, 2103 Gödöllő, Hungary Email address: [email protected] HODNOTENIE SÉROVÝCH KONCENTRÁCIÍ VYBRANÝCH BIOCHEMICKÝCH UKAZOVATEĽOV NUTRIČNÉHO A ZDRAVOTNÉHO STAVU K ÚROVNI ŽIVOTNÉHO ŠTÝLU SLOVENSKEJ POPULÁCIE EVALUATION OF SERUM CONCENTRATIONS OF SELECTED BIOCHEMICAL MARKERS OF HEALTH AND NUTRITION TO THE LEVEL OF LIFESTYLE OF SLOVAK POPULATION Harasník V.¹, Slivková J², Marcinková M², Čižmárová M¹ ¹ ) Katedra výživy ľudí, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov SPU v Nitre, SR ² ) Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva SPU v Nitre, SR Abstract This study focused on identification of biochemical indicators of nutrition and health status of selected groups in Slovak population. This project was carried out in all Slovak areas in July, 2004. 687 respondents took part in it (46.90 % men and 53.10 % women, respectively). Their average age was 45.2 ± 9.2 years. The most important life-style factors are insufficient physical activity, some bad aspects of nutrition and smoking. The high incidence of obesity, unfavourable blood pressure values in men and worse lipid metabolism indicators in men are the most severe factors from the objective examinations. Values of all these biochemical indicators worsen with age. Only women and men from youngest groups had all their examination results within normal limits. The worst results from objective examinations with the highest average number of risk factors were found in persons with elementary education only and respondents who come from countryside, in smokers, and in physicially non-active and obese persons. Key words: Nutrition, Health status, Life-style, Biochemical indicators, Serum concentration 72 Úvod Zhoršovanie zdravotného stavu populácie a nárast civilizačných ochorení viedli k skúmaniu príčin, ktoré spôsobovali zdravotné komplikácie v organizme človeka. Viaceré výskumy zamerané na sledovanie biomarkerov nutričného a zdravotného stavu, ktoré sú odrazom aplikácie životného štýlu potvrdili závislosť zdravia od kvality výživy a jej realizovania. V duchu najnovších poznatkov v oblasti humánnej výživy sa javí potreba dôsledne sledovať množstvo ako aj skladbu prijímanej potravy s prihliadnutím na vek, pohlavie, chorobu, fyzické zaťaženie, a rovnako aj rozmanitosť a pomer znášanlivosti jednotlivých druhov prijímaných potravín. Žiadúcou by sa mala stať orientácia na zdraviuprotektívne potravinové zložky a aplikácia pohybových aktivít (Daniška et al., 2006). Materiál a metodika Predkladaný projekt sa uskutočnil v rámci série zdravotno-preventívnych výskumných akcií, sledujúcich konkrétne ukazovatele zdravotného stavu (formou biochemického vyšetrenia), najmä vo vzťahu k stravovacím návykom a životnému štýlu u vybranej časti slovenskej populácie. Prebiehal v rokoch 2004-07 na celom území SR. Celkovo sa na projekte zúčastnilo 687 respondentov (mužov bolo 46,9 % a žien 53,1 %). Priemerný vek bol 45,2 ± 9,2 rokov (muži 44,5 ± 9,3; ženy 45,8 ± 10,1; P = 0,078), vekové rozpätie bolo 18-75 rokov. Prevahu mali ľudia so stredoškolským vzdelaním a tiež respondenti pochádzajúci z miest. Nutričná analýza: Príjem energie a nutrientov bol kalkulovaný z dotazníkov sledujúcich spotrebu jednotlivých potravín a potravinových skupín. Frekvencia konzumácie bola vyjadrená kategóriami: nikdy, n-krát denne, týždenne, mesačne a ročne. Antropometrické meranie: Body mass index (BMI) sme kalkulovali ako pomer hmotnosti v kg a výšky vyjadrenej v m². Obvod pása a bokov (pre určenie WHR-indexu a stanovenie typu obezity) sme merali pásovým meradlom (v cm) a krvný tlak ortuťovým tlakomerom. Biochemické vyšetrenia: Kompletný lipidový profil ako aj hladiny glukózy v krvnom sére, boli určované automatickým analyzátorom OLYMPUS AU 640 (Japan), štandardnými laboratórnymi metódami. Kapilárna krv respondentov bola poskytnutá dobrovoľne, oboberaná bola nalačno. Analýza životného štýlu: Sledovali sme najmä príjem alkoholu, fajčenie a podiel telesných aktivít. 73 Výsledky a diskusia Hodnotením BMI (index telesnej hmotnosti) sme zistili, že až 58,7 % respondentov (61,8 % mužov a 55,9 % žien) malo hodnotu BMI vyššiu ako 25 (v pásme nadhmotnosti ich bolo 40,9 % a v pásme obezity 17,6 %), čo je v porovnaní s monitoringom konaným v rámci projektu CINDI (1998) pokles o 4,2 %. Aj v porovnaní so štúdiou Jurkovičovej (2005) na vzorke 15097 osôb, sme zistili pokles, a to takmer o 5,0 %. Z porovnania podľa pohlavia malo nadhmotnosť 45,9 % mužov a 36,7 % žien (P < 0,0001); obezitu malo 15,8 % mužov a až 19,2 % žien (P < 0,01). Priemerné hodnoty WHR-indexu (tab. 1) boli v prípade žien a rovnako mužov pod hranicou rizikových hodnôt (u žien 0,9 a viac; u mužov 1,0 a viac). Priemerné hodnoty tlaku krvi na úrovni 133,8 / 82,4 mmHg (u mužov 139,1 / 84,6 a u žien 131, 7 / 81,5 mmHg) indikujú signifikantne horšie postavenie mužov v sledovanom súbore (P < 0,0001). Optimálne hodnoty TK (120/80 mm Hg) malo len 30,2 % osôb. Z faktorov životného štýlu sme sa zamerali najmä na príjem alkoholu, fajčenie, čas venovaný pohybovým aktivitám a niektorým stravovacím zvyklostiam. V sledovanom súbore fajčilo 25,8 % respondentov (31, 4 % mužov a 20,1 % žien; P < 0,01). Najviac fajčiarov bolo vo vekovej skupine do 30 rokov (42,6 %). Konzumáciu alkoholu maximálne 1-krát týždenne (najčastejšie uvádzaný objem bol 0,5 dl), uviedlo až 72,1 % všetkých respondentov (častejšie mužov; P < 0,05). U majoritnej časti respondentov prevládalo v spotrebe pivo, pred vínom a destilátmi. Alkohol bol u väčšiny respondentov konzumovaný mimo jedla. Primeranej mimopracovnej fyzickej aktivite (t.j. minimálne 2-3 hodiny týždenne) sa venovalo len 29,6 % respondentov, s väčším podielom mužov (35,7 %) ako žien (24,8 %). Najvyššiu telesnú aktivitu udávali osoby mladších vekových skupín, a to ako muži tak aj ženy (až 70,3 % z celkového počtu malo menej ako 40 rokov). Takmer ½ všetkých respondentov sa nevenuje žiadnym telesným aktivitám (signifikantne častejšie najmä ženy; P < 0,0001), ako dôvod uvádzali nedostatok času. 74 Charakteristika súboru ( x ± s ) Tabuľka 1 muži Ženy spolu n = 322 n = 365 n = 687 vek (roky) 44,5 ± 9,3 45,8 ± 10,1 45,2 ± 9,2 telesná hmotnosť (kg) 82,9 ± 6,8 69,7 ± 7,3 - telesná výška (cm) 177,6 ± 9,1 165,8 ± 6,7 - obvod pásu (cm) 94,5 ± 8,4 83,7 ± 8,2 89,1 ± 8,3 obvod bokov (cm) 103,8 ± 5,6 104,1 ± 6,4 104,0 ± 5,7 BMI (kg.m-2) 26,9 ± 4,3 25,8 ± 4,7 26,3 ± 4,5 WHR (pás/boky) 0,92 ± 0,11 0,82 ± 0,13 0,87 ± 0,10 Údaje o respondentoch Vybrané ukazovatele nutričného a zdravotného stavu (koncentrácie) Tabuľka 2 Vybrané ukazovatele spolu (n = 687) (mmol/l) Priemerné hodnoty sérových koncentrácií ukazovateľov Celkový cholesterol 4,92 ± 0,98 5,06 ± 0,91 4,81 ± 1,01 0,0017 HDL-cholesterol 1,41 ± 0,53 1,32 ± 0,47 1,53 ± 0,42 0,0001 LDL-cholesterol 2,95 ± 0,92 2,98 ± 0,95 2,91 ± 0,87 0,2135 Triglyceridy (TG) 1,39 ± 0,77 1,56 ± 0,71 1,23 ± 0,84 0,0001 Glukóza (glykémia) 4,98 ± 1,04 4,83 ± 1,06 5,15 ± 1,02 0,0486 muži (n = 322) ženy (n = 365) P-value Celkovo horšie majú všetky priemerné hodnoty tukových látok v krvi muži, ženy majú oproti tomu vyššiu hladinu glukózy, ktorá však ešte stále zodpovedá normálnym hodnotám (tab. 2). Všeobecne nepriaznivé hodnoty sledovaných biochemických ukazovateľov majú respondenti s nedostatočnou alebo žiadnou telesnou aktivitou, rovnako tak sa medzi nimi vyskytuje aj vyšší počet respondentov so zvýšeným tlakom krvi a nadhmotnosťou, resp. obezitou. Uvedené zistenia identifikujú starších respondentov (t.j. nad 55 rokov) a prevažne mužov ako rizikovú skupinu, čo nám potvrdzujú okrem sérových koncentrácii niektorých ukazovateľov aj hodnoty BMI stúpajúce s vekom. Aj v porovnaní s výsledkami viacerých autorov ako Kajaba et al. (2001) alebo Ginter (2003), musíme konštatovať stúpajúci trend nadhmotnosti a obezity (najmä vo vekovej skupine 55 a viac ročných) v slovenskej populácii. Výsledky objektívnych vyšetrení mali horšie respondenti s nižším stupňom vzdelania. 75 Vybrané ukazovatele nutričného a zdravotného stavu (%- ný podiel) Tabuľka 3 Vybrané ukazovatele spolu (n = 687) (mmol/l; %) Percentuálny (%) podiel respondentov k ukazovateľom TCH ≥ 5,2 mmol/l 32,5 34,1 30,7 0,2981 HDL-CH < 1,0 mmol/l 12,7 16,2 8,4 0,0001 LDL-CH ≤ 3,4 mmol/l 34,0 35,9 32,3 0,2214 TG > 1,9 mmol/l 18,1 26,8 10,6 0,0001 Glu > 6,0 mmol/l 37,6 33,4 42,5 0,0056 muži (n = 322) ženy (n = 365) P-value U väčšiny sledovaných biomarkerov sa celkové priemerné hodnoty nachádzajú v pásme normálnych hodnôt, resp. v pásme tesne nad optimom. S výnimkou glukózy, sme štatisticky signifikantné rozdiely v neprospech mužov zistili pri hodnotení sérových koncentrácii HDLcholesterolu a triglyceridov (tab. 3). Zistené rozdiely pri sledovaných biochemických ukazovateľoch sa v najvyššej vekovej skupine postupne zbližujú, znižuje sa hodnota BMI ako aj podiel obéznych (a to najmä u mužov), pričom hodnoty krvného tlaku ostávajú nemenné, resp. sa len mierne zvyšujú (zvlášť u liečených hypertonikov, ktorí predpísanú farmakoterapiu nedodržujú). Hladiny glukózy ostávajú konštantné aj v najvyšších vekových kategóriách, napriek tomu, že počet diagnostikovaných na diabetes 2. typu sa s pribúdajúcim vekom zvýšil. Parametre, ktoré sme v tejto štúdii sledovali (lipidový profil a glykémia), sú odrazom konzumácie konkrétnych druhov potravín. Hodnotením stavu výživy sme v sledovanej skupine respondentov zistili zvýšený príjem saturovaných mastných kyselín, ktorých zdrojom boli najmä mäsové výrobky a bravčové mäso, v menšej miere aj tučné mliečne produkty; naopak úplne nedostatočný bol príjem polynenasýtených mastných kyselín radu n-3, ktorých zdrojom sú najmä ryby. Rovnako nedostatočný bol i príjem strukovín. Väčšina respondentov preferovala tiež tzv. biele pečivo s nižším obsahom vlákniny a balastných látok, čoho nepriaznivú skutočnosť znásobuje deficit príjmu čerstvého ovocia a zeleniny (situácia je lepšia len medzi ženami nižších vekových skupín). Prílohy k jedlám ako sú zemiaky, cestoviny alebo ryža, sú čo do počtu spotrebovaných porcií v rámci jedného týždňa konzumované takmer optimálne, potvrdil sa aj efekt substitúcie (striedanie príloh v strave); zdraviu nevhodným je však veľký objem týchto porcií (príloh), skonzumovaných v jedinom chode (viac ako 200 gramov). 76 Pitný režim môžme hodnotiť ako nedostatočný najmä u starších respondentov (nad 55 rokov), ktorí prijímajú menej ako 2 litre tekutín za deň, ale tiež u respondentov mladších (do 30 rokov), z dôvodu preferencie sladených nealkoholických nápojov v ich pitnom režime. Zistili sme tiež nadmieru spotreby kuchynskej soli u tretiny respondentov (najmä u mužov stredného veku) a častejší konzum sladkostí u nadpolovičnej väčšiny respondentov (najmä u žien), podobné výsledky zistili aj Kajaba et al. (2001). Záver Prezentované výsledky sú príspevkom k sledovaniu stravovacích zvyklostí a zdravotného stavu slovenskej populácie. Z faktorov životného štýlu vystupuje do popredia nedostatočná fyzická aktivita (najmä u žien) a vysoký výskyt fajčenia (najmä u mužov). Z objektívnych vyšetrení sa ako najzávažnejší javí vysoký výskyt nadhmotnosti a obezity rovnako u mužov ako aj žien a tiež vysoké hodnoty tlaku krvi u mužov. Sledovanú skupinu respondentov vystihujú nasledovné charakteristiky: - horšie ukazovatele lipidového profilu u mužov (↓ HDL-cholesterol a ↑ triglyceridy), - totálny cholesterol má vyššiu priemernú hladinu v celom súbore (je však stále v norme), - v kategórii rizikových hladín majú väčšie zastúpenie muži (najmä u triglyceridov), - priemerná hladina glukózy je vyššia u žien (prevládajú ženy starších vekových skupín), - hodnoty väčšiny ukazovateľov sa zhoršujú s pribúdajúcim vekom, rapídnejšie u mužov, - všetky vyšetrenia v norme majú respondenti v zastúpení najmladšej vekovej kategórie, - najhoršie výsledky vyšetrení sa zistili u osôb so základným vzdelaním a u obéznych, - obecne horšie výsledky objektívnych vyšetrení mali aj fajčiari a osoby žijúce na vidieku, - ukazovatele nutričného a zdravotného stavu boli vôbec najhoršie u fyzicky inaktívnych. Práca bola riešená s podporou projektu VEGA 1/2321/05. 77 Literatúra 1. DANIŠKA, J., CHLEBO, P., HARASNÍK, V., ŠRAMKOVÁ, K. 2006. Stravovacie zvyklosti slovenskej populácie a ich dopad na zdravotný stav. In: Výživa a zdraví 2006: Výživa - základní nástroj prevence. Celostátní konference s mezinárodní účastí, Teplice 19.-21. září 2006. Krajská hygienická stanice a Zdravotní ústav se sídlem v Ústí nad Labem, 2006. s. 66-74. 2. GINTER, E. 2003. Priepasť medzi zdravotným stavom obyvateľov SR a Západom sa na rozhraní XX. – XXI. storočia prehlbuje. In: Med Monitor, 2003, 2, s. 14-16. 3. JURKOVIČOVÁ, J. 2005. Vieme zdravo žiť? Bratislava: Univerzita Komenského v Bratislave, 2005. 166 s. ISBN 80-223-2132-X. 4. KAJABA, I., ONDREJKA, J., KALÁČ, J., NAGY, L. Vývoj prevalencie obezity u dospelých obyvateľov Slovenska. In: Životné podmienky a zdravie. Bratislava, NCPZ, 2001, s. 240-245. Kontaktná adresa: Mgr. Viliam Harasník, Katedra výživy ľudí, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov, SPU v Nitre, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovenská republika; Email: [email protected] SLEDOVANIE STAVU VÝŽIVY A VYBRANÝCH BIOMARKEROV ZDRAVIA VO VZŤAHU KU KARDIOVASKULÁRNEMU RIZIKU MEDZI VYBRANÝMI SKUPINAMI OBYVATEĽSTVA SR ASSESSMENT OF NUTRITIONAL STATUS AND CHOSEN BIOMARKERS IN RELATION TO CARDIOVASCULAR RISKS AMONG SELECTED POPULATION IN THE SLOVAC REPUBLIC Harasník V.¹, Marcinková M.², Slivková J.², Čižmárová M.¹ ¹ ) Katedra výživy ľudí, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov SPU v Nitre, SR ² ) Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva SPU v Nitre, SR Abstract This work analysed nutritional habits and some health biomarkers of cardiovascular prevention among selected groups of Slovak population. The examined group was constituted of 817 respondents (41.90 % men and 58.10 % women respectively). Their average age was 48.70 ± 9.91 years. The „nutritional” health is entirely dependent on cardio-protective foods. Orientation on this intake of optimal composition, is associated with significantly reduced values of risk parameters for atherosclerosis in nutrition- rationalist group (total cholesterol, LDL-cholesterol, triacylglycerols, atherogenic index, saturated fatty acids, high glucose) and significantly higher values of antiatherogenic substances (fatty acids from n-3 range, HDLcholesterol, vitamins C and E). Thus, rational diet is very necessary to fully support human health and primary prevention of nutrition associated cardiovascular diseases. The worth results from objective examinations were found in persons with the elementary education and subjects, who lived in cities, in non-smokers, physicially active and apparently lustily lived persons. Key words: Nutritional habits, Health status, Biomarkers, Cardiovascular diseases, Life-style 78 Úvod Nesprávne stravovacie návyky a životospráva sú príčinou nárastajúceho kardiovaskulárneho rizika v slovenskej populácii, zväčša ako dôsledok ich dlhodobej expozície a to nielen v posledných rokoch. Vplyv výživy na zdravotný stav a výskyt kardiovaskulárnych ochorení na mortalitu ľudí je všeobecne uznávaný. Správna výživa realizovaná orientáciou na kardio-protektívne potravinové varianty je rozhodujúcim predpokladom optimálneho vývoja organizmu a základnou podmienkou prevencie civilizačných ochorení, ktoré postihujú rozsiahle skupiny obyvateľov. Racionálna výživa v kombinácii s dostatočnou telesnou aktivitou, sú zaručene úspešnou alternatívou, ako možno svoj zdravotný stav zlepšiť, a postarať sa o lepšiu kvalitu života (Avdičová et al., 1999). Materiál a metodika Predkladaná štúdia je príspevkom v rámci série zdravotno-preventívnych výskumných akcií, sledujúcich vybrané ukazovatele životného štýlu (prostredníctvom biochemického skríningu) najmä vo vzťahu k zdraviu a stravovacím zvyklostiam u vybranej časti slovenskej populácie. Prebiehala v rokoch 2004-07 na celom území SR. Celkovo sa na sledovaní zúčastnilo 817 respondentov (mužov bolo 41,9 % a žien 58,1 %). Priemerný vek bol 48,7 ± 9,91 rokov (u mužov 47,6 ± 10,2 rokov, u žien 49,5 ± 9,6 rokov; P = 0,069), vekové rozpätie bolo 18 až 95 rokov (tab. 1). Prevahu mali ľudia so stredoškolským vzdelaním a respondenti pochádzajúci z miest. Charakteristika súboru ( x ± s ) Tabuľka 1 Údaje o respondentoch muži (n = 342) ženy (n = 475) spolu (n = 817) vek (roky) 47,6 ± 10,24 49,5 ± 9,67 48,7 ± 9,91 telesná hmotnosť (kg) 83,2 ± 6,3 69,8 ± 8,3 - telesná výška (cm) 177,8 ± 9,5 165,9 ± 6,7 - obvod pásu (cm) 94,9 ± 10,1 83,7 ± 8,4 89,5 ± 8,2 obvod bokov (cm) 104,1 ± 6,4 104,3 ± 5,2 104,2 ± 5,7 BMI (kg.m-2) 27,1 ± 5,3 25,9 ± 4,8 26,5 ± 4,9 WHR (pás/boky) 0,92 ± 0,14 0,83 ± 0,11 0,88 ± 0,10 Nutričná analýza: Príjem energie a nutrientov bol kalkulovaný z dotazníkov sledujúcich spotrebu jednotlivých potravín a potravinových skupín. Frekvencia konzumácie bola vyjadrená kategóriami: nikdy, n-krát denne, týždenne, mesačne a ročne. 79 Antropometrické meranie: Body mass index (BMI) sme kalkulovali ako pomer hmotnosti v kg a výšky vyjadrenej v m². Obvod pása a bokov (pre určenie WHR-indexu a stanovenie typu obezity) sme merali pásovým meradlom (v cm) a krvný tlak ortuťovým tlakomerom. Biochemické vyšetrenia: Kompletný lipidový profil ako aj hladiny glukózy v krvnom sére, boli určované automatickým analyzátorom OLYMPUS AU 640 (Japan), štandardnými laboratórnymi metódami. Kapilárna krv respondentov bola poskytnutá dobrovoľne, oboberaná bola nalačno. Analýza životného štýlu: Sledovali sme najmä konzum alkoholu, fajčenie a podiel telesných aktivít. Výsledky a diskusia Sledovaním stravovacích zvyklostí sme zistili, že respondenti uprednostňujú mäso, najmä hydinové (muži ako aj ženy). Až 48,5 % zo všetkých respondentov konzumovalo mäso vo frekvencii 4-5-krát do týždňa (väčšinou muži). Ryby prijímalo 26,1 % respondentov s frekvenciou 1-krát týždenne. Konzumáciu zabíjačkových špecialít a mäsových výrobkov uviedla takmer ½ všetkých respondentov s frekvenciou aspoň 2-3-krát do týždňa. Najčastejšou technologickou úpravou mäsa v sledovanej populácii bolo dusenie pred varením, pečením a vyprážaním. Spotreba vajec zodpovedala odporúčaniam (1-3-krát týždenne). Mlieko a mliečne výrobky (obzvlášť zakysané mlieko, jogurty a syry) konzumovala v najčastejšie udávanej frekvencii 2-3-krát týždenne, viac ako ½ všetkých respondentov. Denná konzumácia mlieka je nedostatočná. Mlieko nekonzumuje vôbec 32,4 % a mliečne výrobky 11,3 % respondentov. Podľa obsahu tuku až ⅔ všetkých respondentov preferovalo konzum netučného mlieka a mliečnych výrobkov. Konzumácia tukov spadá do racionálnej normy, napriek tomu, že bola pomerne častá (vo frekvencii 4-5-krát týždenne). V príjme respondentov prevládali rastlinné oleje, pred maslom a margarínmi; nasýtené mastné kyseliny v potrave respondentov pochádzali najmä z mäsových výrobkov a bravčového mäsa. Pri výbere pečiva viac ako polovica respondentov (58,1 %) uprednostňovala biele pred celozrnným, resp. tmavým pečivom. Sladké jedlá ako aj sladkosti konzumovalo 46,3 % zo všetkých respondentov s frekvenciou aspoň 2-3-krát týždenne (častejšie ženy). V príjme príloh k jedlám, prevládala u sledovaných osôb ryža, s frekvenciou 2-3-krát do týždňa, pred cestovinami a zemiakmi. Konzumácia strukovín bola absolútne nedostatočná. Nadpolovičná väčšina respondentov ich prijíma len 1-2-krát za mesiac a tretina z nich 1-krát týždenne. Zelenina ako aj ovocie je v dennej 80 konzumácii sledovaných subjektov nedostatková, iba 34,5 % (najmä žien) konzumuje aspoň 1 porciu denne (optimálne je prijímať až 5 porcií denne). V pitnom režime respondentov prevládali minerálne vody (58,2 %) pred čajmi. Zistili sme tiež, že väčšina mužov ako aj žien, prijíma 2 až 2,5 l tekutín denne. Nedostatočný pitný režim sme zistili pri 27,8 % z celkového počtu respondentov (ich spotreba bola nižšia ako 1,5 l tekutín za deň). Väčšina respondentov (54,6 %) konzumuje kávu 1-2-krát denne (najmä ženy). Sladenie pokrmov preferuje 53,1 % všetkých respondentov (najmä žien); solenie pokrmov preferuje až 61,2 % respondentov (najmä mužov). Alternatívne spôsoby výživy aplikuje 7,4 % všetkých respondentov (častejšie ženy). Stanovením BMI (index telesnej hmotnosti) sme zistili, že v pásme nadhmotnosti sa nachádza 41,2 % osôb (46,5 % mužov a 36,8 % žien) a v pásme obezity 17,5 % respondentov (15,6 % mužov a 19,3 % žien), čo je v porovnaní s monitoringom konaným v rámci projektu CINDI (1999), pokles o 4,2 % (tab. 2). Pri nadhmotnosti a obezite spolu, sme porovnaním mužov a žien zistili štatisticky signifikantný rozdiel (P < 0,0001). Priemerné hodnoty WHRindexu boli v prípade mužov ako aj žien pod hranicou rizikových hodnôt (u žien 0,9; u mužov 1,0). Niektoré biomarkery zdravotného stavu a životného štýlu (podiel osôb v %) Tabuľka 2 Biomarkery zdravia a spolu (n = 817) muži (n = 342) ženy (n = 475) P-value životného štýlu % n % n % n Nadhmotnosť podľa BMI 41,2 336 46,5 159 36,8 177 0,0001 Obezita podľa BMI 17,5 143 15,6 52 19,3 91 0,1261 TK systol. (≥ 140 mmHg) 31,9 261 38,2 131 27,4 130 0,0001 TK diastol. (≥ 90 mmHg) 27,3 223 34,1 117 22,5 106 0,0035 Príjem alkoholu (> 1-x/td) 28,4 231 47,9 165 13,9 66 0,0001 Fajčenie (pravidelné) 25,9 212 31,8 109 21,7 103 0,0001 Nedostatočná fyz. aktivita 59,7 488 52,5 180 64,8 308 0,0001 Rizikové hodnoty krvného tlaku (≥ 140,0/90,0 mmHg), malo po odmeraní systolického tlaku až 38,2 % mužov a 27,4 % žien; pri diastolickom tlak to bolo 34,1 % mužov a 22,5 % žien. V oboch prípadoch sme zistili štatisticky signifikantné rozdiely v neprospech mužov. Optimálne hodnoty TK (≤ 120/80 mm Hg) malo len 31,3 % zo všetkých respondentov (vyššie zastúpenie mali ženy). 81 Z faktorov životného štýlu sme sledovali predovšetkým príjem alkoholu, fajčenie a telesnú aktivitu. Konzumáciu alkoholu vo frekvencii viac ako 1-krát týždenne (pri najčastejšie uvádzanom objeme 0,5 dl), sme zistili u 28,4 % respondentov (štatisticky vysoko významne častejšie v prospech mužov; P < 0,0001). Medzi jednotlivými druhmi alkoholických nápojov prevládalo pivo pred vínom a destilátmi. V sledovanom súbore bolo 25,9 % fajčiarov (31, 8 % mužov a 21,7 % žien; P < 0,0001). Najvyšší počet fajčiacich osôb sa nachádzal vo vekovej skupine do 30 rokov (43,1 %). Pri porovnaní so štúdiou Jurkovičovej (2005), sme zistili až 5,8 %-ný nárast počtu fajčiacich osôb. Nedostatočnú alebo žiadnu telesnú aktivitu sme zistili u 59,7 % respondentov (vysoko signifikantne častejšie ju udávali ženy → 64,8 % vs 52,5 %). Telesná aktivita klesala s pribúdajúcim vekom, rapídnejšie však až po 55 roku života, a to rovnako u mužov ako aj u žien. Primeranú mimopracovnú telesnú záťaž (v trvaní minimálne 2-3 hodiny týždenne), sme zistili u 29,6 % osôb (s vyšším zastúpením mužov). Zo sledovaných biochemických ukazovateľov, sa priemerné hodnoty nachádzajú v pásmach normálnych hodnôt. S výnimkou LDL-cholesterolu a glykémie sú však vysoko významné rozdiely vo výskyte nepriaznivých hodnôt v neprospech mužov. Rovnako index aterogenity (TCH/HDL-CH) majú muži horší nielen v celom súbore, ale takisto naprieč spektrom všetkých vekových skupín s výnimkou najnižšej (< 30 rokov). Vybrané ukazovatele nutričného a zdravotného stavu (koncentrácie) Tabuľka 3 Vybrané ukazovatele spolu (n = 817) (mmol/l) Priemerné hodnoty sérových koncentrácií ukazovateľov Celkový cholesterol 4,91 ± 0,99 5,02 ± 0,98 4,83 ± 1,02 0,0316 HDL-cholesterol 1,46 ± 0,53 1,34 ± 0,46 1,55 ± 0,43 0,0001 LDL-cholesterol 2,95 ± 0,87 2,97 ± 0,90 2,93 ± 0,89 0,4027 TCH/HDL-cholesterol 3,45 ± 1,49 3,68 ± 1,52 3,28 ± 1,41 0,0001 Triglyceridy (TG) 1,37 ± 0,68 1,54 ± 0,73 1,25 ± 0,67 0,0001 Glukóza (glykémia) 5,02 ± 1,02 4,96 ± 1,01 5,06 ± 1,03 0,0895 muži (n = 342) ženy (n = 475) P-value Priemerné hodnoty ukazovateľov, ktoré možno definovať ako kľúčové pri kardiovaskulárnom riziku (HDL-cholesterol, triglyceridy), sú štatisticky vysoko významne 82 nepriaznivejšie pre mužov; v kombinácii s nedostatočnou pohybovou aktivitou predstavujú vysoké riziko vzniku KVO (tab. 3). Optimálny príjem a racionálna skladba konzumovaných potravín (najmä tukov a cukrov) sú aspekty, ktoré sa odzrkadľujú v priaznivých lipidových a glykemických parametroch. Respondenti orientujúci sa na kardio-protektívne potravinové varianty vo výžive, majú preukazne nižšie hodnoty rizikových faktorov aterosklerózy (celkový cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceridy, saturované mastné kyseliny ako i aterogenný index) a významne vyšší obsah látok s antisklerotickým účinkom (HDL-cholesterol, polynenasýtené mastné kyseliny z radu n-3 a vitamíny C a E). Odhadli sme tiež pokles mortality na ischemickú chorobu srdca (ICHS) z poklesu sérového cholesterolu u viac ako 55ročných respondentov stravujúcich sa racionálne. Gerová et al. (1999) uvádzajú, že pri poklese celkového cholesterolu o 1,2 mmol/l je kardiovaskulárne riziko redukované až o 47 %, ak celkový cholesterol poklesne o 0,6 mmol/l, znamená to pokles rizika o 26 %. Hoci priemerné hodnoty lipidových parametrov v našej štúdii nenaznačujú kardiovaskulárne riziko, ktoré by sme mohli kvalifikovať ako vysoké, je správne predchádzať možným komplikáciám zaradením takých potravín do svojho jedálnička, ktoré hodnoty lipidových parametrov udržujú na optimálnej úrovni (napr. morské ryby s obsahom PUFA radu n-3), a to v rámci primárnej prevencie. Mastné kyseliny radu n-3 pôsobia ochranne v prípade arytmie, majú hypolipidemické vlastnosti s účinkom na triglyceridy a LDLcholesterol, a ako prekurzory prostaglandínov a leukotriénov majú antitrombotické ako aj protizápalové vlastnosti, inhibujú syntézu cytokínov a stimulujú endotelom derivovaný oxid dusnatý. Suplementácia n-3 mastnými kyselinami spolu so zaradením významného množstva pohybových aktivít u respondentov s kardiovasulárnym rizikom, znížila mieru mortality v nedávno spracovanej štúdii Danišku et al. (2006) o takmer 30 %, a riziko náhlej smrti až o 45 %. Koncentrácie sérových lipidov sú primárnym ukazovateľom rizika vzniku kardiovaskulárnych ochorení. Dyslipidémia, ktorú sme zistili najmä u mužov stredného veku, patrí spolu s hypertenziou a fajčením k hlavným ovplyvniteľným rizikovým faktorom; Avdičová et al. (1999) k nim zaraďujú aj pohybovú aktivitu, ktorú charakterizujú ako hlavný regulátor kardiovaskulárnych komplikácií, priamo korelujúcich s narastajúcou hmotnosťou. Samotná prítomnosť obezity môže byť zodpovedná za väčšie riziko než je determinované sumáciou ostatných rizikových faktorov. 83 Zvýšené sérové koncentrácie glukózy, ktoré sme zistili u menšieho podielu sledovaných osôb, predstavujú taktiež rizikové faktory pre kardiovaskulárne ochorenia (hyperinzulinémia, aterogenná dyslipidémia, hypertenzia, abdominálna obezita, atď). Vo výžive väčšiny vyšetrených respondentov boli obsiahnuté sacharidy s vysokým glykemickým indexom, produkujúce ich rýchlu absorpciu a tým tiež nerovnomerné postprandiálne píky krvnej glukózy, ako aj horšiu udržateľnosť inzulínovej senzitivity. S rizikom asociované hodnoty glykémie (≥ 6,2 mmol/l) sa vyskytli u 8,9 % subjektov (najmä pri ženách stredného veku). Strava bohatá na komplexné sacharidy s nízkym glykemickým indexom a vysokým obsahom vlákniny (zelenina a ovocie) je vhodnou ale aj žiadúcou alternatívou. Významný efekt na metabolizmus sacharidov a lipidov má rozpustná vláknina a aj tzv. antinutrienty (fytáty, lektíny), ktoré redukujú stupeň digescie škrobov, čím splošťujú postprandiálnu glykémiu. Záver Na základe výsledkov získaných zo sledovania stravovavích zvyklostí a zdravotného stavu vybraných skupín obyvateľov sr vo vzťahu k riziku vzniku kvo konštatujeme, že z jednotlivých parametrov hodnotenia kardiovaskulárneho rizika, vystupujú do popredia nepriaznivé ukazovatele lipidového profilu (hodnoty hdl-cholesterolu a triglyceridov u mužov) ale i zvýšenej koncentrácie glukózy v krvi (u žien stredného veku) a to aj napriek tomu, že celkové priemerné hodnoty týchto indikátorov boli v norme. Medzi respondentmi prevládala tiež nedostatočná fyzická aktivita (najmä u žien), vysoký výskyt fajčenia (najmä u mužov), vysoký výskyt nadhmotnosti a obezity (u oboch pohlaví) a vysoký výskyt hypertenzie (najmä u mužov). Zistené boli aj nasledovné nutričné profily: - príjem potravy s vyšším obsahom tuku (bravčové mäso, mäsové výrobky, zabíjačky), - nízky príjem rýb a zároveň zdraviu protektívnych, omega-3 mastných kyselín, - celkovo nedostatočná konzumácia strukovín (a tým aj rastlinných bielkovín), - uprednostňovanie bieleho pečiva pred celozrnným, rovnako u mužov ako aj u žien, - nízky príjem mlieka a mliečnych výrobkov, orientácia na tučné mliečne produkty (muži) - veľmi nízka konzumácia ovocia a zeleniny (má byť 3-5 porcií za deň) a vlákniny, - preferencia sladkostí u žien a častejšie používanie kuchynskej soli u mužov, - nízky objem denne prijatých tekutín najmä u starších osôb (odporúča sa aspoň 2,5 l) Práca bola riešená s podporou projektu VEGA 1/2321/05. 84 Literatúra 1. AVDIČOVÁ, M., et al. Prevalencia rizikových faktorov srdcovo-cievnych ochorení v skríningu programu CINDI. In: Vybrané informácie zo zdravotníckej štatistiky o vývoji ochorení obehovej sústavy v SR. Bratislava, ŠZÚ SR, 1999; s. 95-108. 2. DANIŠKA, J., CHLEBO, P., HARASNÍK, V., ŠRAMKOVÁ, K. 2006. Stravovacie zvyklosti slovenskej populácie a ich dopad na zdravotný stav. In: Výživa a zdraví 2006: Výživa - základní nástroj prevence. Celostátní konference s mezinárodní účastí, Teplice 19.-21. září 2006. Krajská hygienická stanice a Zdravotní ústav se sídlem v Ústí nad Labem, 2006. s. 66-74. 3. GEROVÁ, Z., PANÁKOVÁ, I., MATUŠKOVÁ, M. Risk factors of the cardiovascular diseases. In: Bratislavské lekárske Listy, 1999; vol. 100, no. 5, p. 231-237. 4. JURKOVIČOVÁ, J. 2005. Vieme zdravo žiť? Bratislava: Univerzita Komenského v Bratislave, 2005. 166 s. ISBN 80-223-2132-X. Kontaktná adresa: Mgr. Viliam Harasník, Katedra výživy ľudí, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov, SPU v Nitre, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovenská republika; Email: [email protected] VPLYV PROBIOTICKÉHO PREPARÁTU NA TVORBU TUKU V TELE KURČIAT EFFECT OF PROBIOTIC PREPARATION ON PRODUCTION OF FAT IN BODY OF CHICKENS Haščík, P1., Bobko, M.1, Kačániová, M.2, Čuboň, J.1, Kulíšek, V.3, Pavličová, S.4 1Katedra hodnotenia a spracovania živočíšnych produktov, 2Katedra mikrobiológie, 3Katedra veterinárskych disciplín, 4Katedra hygieny a bezpečnosti potravín SPU Nitra Abstract Probiotic preparation at base Enterococcus faecium with content of spore 2,0.1010 cfu.g-1 and it’s application 6.6 ml for two weeks of it’s feeder and 3.7 ml into water at the feeders chicken ROSS 308 gained up dynamic weight at the age of 42 days ( end of feeding ) about +111.00 g at ♀ (P≤0.01) and about +185.00 g at ♂ (P≤0.001). At the same time there was an increase of slaughtered chicken body after handling up to + 157.22 g at ♂ (P≤0.001) and about 80.36g at ♀ (P≤0.05) in experimental group . Abdominal fat fraction has encreased in experimental group within both sexes about / up to 0.24 % at ♂ and about 0.48 % by little chickens, but without statistic differencies (P≥0,05). Stomach fat volume probiotic preparation did not affect and a heart volume fat was just a little higher in experimental group, but again without statistic differencies (P≥0,05). After the evaluation of total inward fat from JOT we can state it’s slight increase within the probiotic group at both sexes ( +0.18 % ♂, + 0.39 % ♀). A slight increase of inward fat in the group that was applicated probiotic preparation on the bacteria base Enterococcus faecium does not have a negative impact to Ekonomy production of chicken poultry meat, but on the other hand it has a possitive influence on achieve utility and therefore there might be an increasement for rentability of poultry meat production. 85 Úvod Kvalitatívnu hodnotu mäsa výkrmových kurčiat môže významne ovplyvniť genotyp zvierat, výživa, vek a ďalšie činitele prostredia (Haščík et al., 2005). Pre vlastnú výživu brojlerových kurčiat sa používajú kompletné kŕmne zmesi často obohacované v poslednom období o prídavok probiotických preparátov, ktoré sú často do kŕmnych zmesí pridávané ako možná náhrada za vyraďované živočíšne múčky, antibiotické preparáty, respektíve kokcidiostatiká z hľadiska novej legislatívy, ktorá je daná zákonmi a nariadeniami Európskej únie, ako aj za účelom zlepšenia zdravotného stavu, znižovania mortality, lepšieho využitia živín z krmiva s následnou správnou dosahovanou jatočnou hodnotou zvieraťa ako to vo svojich prácach popisujú Nahashon et al. (1992), Kumprecht a Zobač (1998), resp. Haščík et al. (2004). Okrem zaraďovania probiotických preparátov do výživy hydiny ako aj iných monogastrických a polygastrických zvierat pokračuje neustále intenzívne šľachtenie v oblasti hydiny zamerané na skracovanie doby výkrmu pri zachovaní hmotnosti produkovaných kurčiat ako aj kvality mäsa (Henderson, 1981), pričom s intenzívnym rastom kurčiat sa však zvyšuje aj ukladanie tukových zásob v tele a tukové väzivo sa ukladá nielen v podkoží, medzi svalmi, vo svaloch a orgánoch, ale aj v brušnej dutine ako abdominálny tuk. Zatiaľ, čo priemerný podiel podkožného a najmä intramuskulárneho tuku zlepšuje kvalitu hydinového mäsa, nadbytočný podkožný ako aj brušný tuk je nežiaduci a v tele brojlerových kurčiat sa v priemere nachádza 1,98 % vo forme výstelkového tuku, 0,66 % žalúdkového tuku, 0,50 % črevného tuku a spolu 3,14 % vnútorného tuku (Horváthová a Lagin, 1985). Podobne aj Csuka (1988), Horovský et al.(1990) a Uhrín et al. (1993) konštatujú, že z tukových zásob brojlerových kurčiat sa najväčšia pozornosť venuje depotom v brušnej dutine, nakoľko tento tuk predstavuje 1-4 % z telesnej hmotnosti kurčiat, pričom Okáľ et al. (1976) upozorňujú, že v trupe hydiny môže byť aj viac tuku a to od 2 do 5 %, kým v mäse je jeho obsah od 0,5 do 1,5 %. V konečnom dôsledku a z hľadiska viacerých literárnych zdrojov sa dá vysloviť názor, že tukovému väzivu pri šľachtení hydiny sa nevenovala patričná pozornosť a tak súčasne s ostatnými vlastnosťami, ktoré možno považovať za pozitívne sa menili aj genetické dispozície pre zvýšenú tvorbu a ukladanie tuku v organizme a to ako brušného, tak i celotelového, pričom tuk v takejto forme je nežiaduci pre konzumenta aj spracovateľa hydiny a tak sa stáva odpadovým produktom, ktorý spôsobuje problémy pri čistení a opracovaní hydiny (Csuka, 1988). 86 V nadväznosti na uvedené literárne zdroje, bolo cieľom nášho experimentu na výkrmových kurčatách hybridnej kombinácie ROSS 308 vyhodnotiť podiel tukov v jatočne opracovanom tele kurčiat, ktoré boli kŕmené rovnakými komerčne vyrábanými kompletnými kŕmnymi zmesami, respektíve do pokusnej skupiny cez vodu bol pridávaný probiotický preparát na báze Enterococcus faecium s obsahom 2,0.1010 KTJ.g-1 . Materiál a metódy Experiment sme realizovali na testačnej stanici hydiny Katedry hydinárstva a malých hospodárskych zvierat, pri fakulte Agrobiológie a potravinových zdrojov Slovenskej poľnohospodárskej univerzity v Nitre na výkrmových kurčatách hybridnej kombinácie ROSS 308. V pokuse boli vytvorené dve skupiny zvierat, kontrolná (K) a pokusná (P), do ktorých bolo zaradených po 100 ks výkrmových kurčiat. Vlastný výkrm brojlerových kurčiat v oboch pokusoch trval 42 dní. Kurčatá boli kŕmené systémom ad libidum rovnakou štartérovou KKZ HYD-01 (sypká forma) do 21. dňa veku a od 22. dňa do 42. dňa výkrmu KKZ HYD-02 (granulovaná forma). Pokusnej skupine bol pridávaný probiotický preparát na báze Enterococcus faecium s obsahom 2,0.1010 KTJ.g-1 do vody v množstve 6,6 ml do 2. týždňa výkrmu a 3,7 ml do konca výkrmu (42 dní). Na konci výkrmu bolo z každej skupiny experimentu vybratých po 30 ks kurčiat na jatočný rozbor, ktorý sa uskutočnil na Katedre hodnotenia a spracovania živočíšnych produktov pri FBP SPU Nitra, spolu s následným sledovaním základných hodnôt (živá hmotnosť, hmotnosť jatočne opracovaného tela bez abdominálneho tuku) a podielom vnútorných tukov zo živej hmotnosti a z JOT (žalúdkový, srdcový a abdominálny tuk), resp, celkového vnútorného tuku. Dosiahnuté výsledky boli štatisticky spracované pomocou štatistického programu SAS, kde boli vypočítané základné štatistické charakteristiky (aritmetický priemer, smerodajná odchýlka, koeficient variability) a na určenie preukaznosti rozdielov medzi sledovanými skupinami bol použitý t-test. 87 Tabuľka 1 Pohlavie Základné ukazovatele jatočných kurčiat (g) Skupina Živá hmotnosť sx v x sx v 44,64 2,62 1206,12a 33,18 2,77 43,82 2,42 1286,48b+ 52,95 4,12 33,22 1,79 1300,08a 50,17 3,86 43,56 2,99 x sliepočky Kontrolná 1701,00a Pokusná kohútiky 1812,00b++ Kontrolná 1857,40a Pokusná +++ 2042,00b Hmotnosť JOT 31,14 +++ 1,53 1457,30b Pozn: Priemerné hodnoty v tom istom stĺpci podľa pohlavia a pokusu, po ktorých nasledujú rôzne písmená sú preukazne rozlišné ( + P≤0,05, ++ P≤0,01, +++P≤0,001) (t-test ) Tabuľka 2 Pohlavie Zastúpenie vnútorných tukov z jatočne opracovaného tela kurčiat (%) Skupina abdominálny tuk x sx žalúdkový tuk v x sx v srdcový tuk x v sx sliepočky Kontrolná 1,39a 0,68 48,79 0,69a 0,41 59,53 0,04a 0,04 101,3 Pokusná kohútiky 1,87a 0,34 18,05 0,59a 0,21 35,38 0,06a 0,02 39,12 Kontrolná 1,35a 0,41 305,2 0,65a 0,16 24,32 0,02a 0,01 47,51 Pokusná Tabuľka 3 1,59a 0,68 43,02 0,59a 0,18 30,61 0,03a 0,01 43,85 Zastúpenie vnútorného tuku z jatočne opracovaného tela (%) Pohlavie Skupina x sx v Sliepočky Kontrolná 2,13a 0,77 36,29 Pokusná 2,52a 0,32 12,76 Kontrolná 2,03a 0,31 15,47 Pokusná 2,21a 0,70 31,86 kohútiky Výsledky a diskusia Priemerná živá hmotnosť sliepočiek brojlerových kurčiat hybridnej kombinácie ROSS 3O8 bola nižšia v kontrolnej skupine (1701,00 g) a vyššia v pokusnej skupine s prídavkom probiotického preparátu do vody (1812,00 g). Podobná tendencia sa zaznamenala aj u kohútikov, kde v kontrolnej skupine bola vo veku 42 dní živá hmotnosť 1857,40 g a v pokusnej skupine 2042,00 g. Pri štatistickom porovnaní výsledkov v rámci pohlavia medzi 88 skupinami sa zaznamenali preukazné rozdiely u kohútikov (P≤0,001) a u sliepočiek (P≤0,01) v prospech pokusných skupín, t.j. s prídavkom probiotického preparátu (tabuľka 1). Zistené priemerné hodnoty živej hmotnosti kurčiat oboch pohlaví v našich pokusoch sú nižšie ako uvádza Rychlá a Řezníček (2000) resp. Benková (2001), ktorých porážková hmotnosť bola v priemere 2240,0 a 2083,5 g a podobne nižšie ako uvádzajú Straková et al. (2002), ktorí zistili priemernú hmotnosť kurčiat ROSS 308 po 42. dňoch výkrmu u sliepočiek 2360 g a u kohútikov 2700 g. Z hľadiska hmotnosti jatočne opracovaného tela (JOT) bez abdominálneho tuku bola podobná tendencia ako pri živej hmotnosti v prospech pokusnej skupiny, kde u sliepočiek boli hodnoty (kontrola – 1206,12 g : pokusná -1286,48 g) a u kohútikov (kontrola -1300,08 g : pokusná – 1457,03 g), čo sa prejavilo aj štatisticky preukazne(P≤0,05 u sliepočiek, resp. P≤0,001 u kohútikov). Pri vyhodnocovaní podielu jednotlivých tukov z JOT (tabuľka 2,3) sme zistili tendenciu vyššieho ukladania abdominálneho tuku u oboch pohlaví v skupine s prídavkom probiotického preparátu, ale bez štatisticky preukazných rozdielov (P≥0,05). Nami dosiahnuté hodnoty abdominálneho tuku z JOT sú v súlade s výsledkami Uhrína et al. (1993) , Křížkovej et al. (1995), ktorí deklarujú hodnoty abdominálneho tuku z JOT na úrovni % resp. s Laginom (1985), ktorí zistil 1,5-3 u sliepok 2,75 a u kohútov 3,04 %-ný podiel výstelkového tuku z JOT. Nižšie hodnoty tvorby abdominálneho tuku pod 1 % zistila vo svojich pokusoch Angelovičová (1997), ktorá ale pre výkrm kurčiat použila zníženú úroveň metabolizovateľnej energie v kŕmnych zmesiach. Pri porovnaní podielu abdominálneho tuku z JOT z hľadiska pohlavia sa v 1. pokuse potvrdila tendencia vyššieho ukladania tuku u sliepočiek ako u kohútikov a podobné výsledky zaznamenali aj Becker et al. (1979), resp. Gyles et al. (1982). V súvislosti s tvorbou abdominálneho tuku si je nutné uvedomiť, že tento tuk pre samotného konzumenta je stratou, nakoľko pri spracovaní hydiny je len prekážkou a pre samotného konzumenta v potravinovom reťazci je prakticky nevyužiteľný. Hodnoty podielu žalúdočného tuku z JOT vo všetkých nami sledovaných skupinách boli nižšie od 0,59 % (sliepočky a kohúty pokusnej skupiny) po 0,69 % (sliepočky –kontrolnej skupiny) v porovnaní s hodnotami, ktoré dosiahli vo svojom pokuse Horváthová a Lagin (1985) 1,02 % resp. Lagin (1989) 0,99 % u sliepočiek a 1,44 % u kohútov. Probiotický preparát svojím účinkom nevplýval na zvyšovanie žalúdočného tuku u výkrmových kurčiat ROSS 308. Z pohľadu štatistického sa medzi skupinami a pohlavím nedosiahli štatisticky preukazné rozdiely (P≥0,05). 89 Pri hodnotení obsahu vnútorného tuku sa často zabúda, že časť tuku je lokalizovaná aj na srdci, ktoré tvorí jednu z jedlých častí vnútornosti hydiny pre kulinárske účely, kde hodnoty v nami preverovaných pokusoch sa dosiahli od 0,02 % (kohútiky – kontrolná až 0,06 (sliepočky – pokusná skupina). Zo štatistického hľadiska sa medzi skupinami podľa pohlavia v tomto ukazovateli nezistili štatisticky významné rozdiely (P≥0,05). Záver Z výsledkov experimentu vyplýva, že probiotický preparát na báze Enterococcus faecium s obsahom 2,0.1010 KTJ.g-1 pridávaný do vody svojim účinkom zvýšil tak živú hmotnosť na konci výkrmu ako aj hmotnosť JOT. Pri vyhodnotení podielu vnútorných tukov z JOT sa zistila tendencia vyššieho ukladania tukov u pokusnej skupiny oproti kontrolným skupinám u oboch pohlaví. Pri vyhodnotení podielu abdominálneho tuku z JOT u brojlerových kurčiat ROSS 308, ktorý sa v posledných desaťročiach rapídne zvýšil a predstavuje ekonomickú stratu a na druhej strane zhoršuje aj opracovanie brojlerov, resp. zvyšuje množstvo jatočného odpadu a v konečnom dôsledku vplýva aj na jatočnú výťažnosť sa potvrdzuje tendencia zvýšenej tvorby abdominálneho tuku pri použití probiotík cez vodu, čo môže vplývať na dietetiku hydinového mäsa konzumovaného spoločne s abdominálnym tukom. Zároveň si ale musíme uvedomiť, že probiotické preparáty v prevažnej miere pozitívne ovplyvňujú dosahovanú úžitkovosť, čo v konečnom dôsledku len pri malom náraste abdominálneho tuku neprináša žiadne ekonomický straty, práve naopak pre samotných výrobcov väčší finančný zisk Literatúra Angelovičová, M. 1997. Vplyv nízkobielkovinových tukovaných kŕmnych zmesí na živú hmotnosť a vybrané ukazovatele jatočnej kvality výkrmových kurčiat. In: Poľnohospodárstvo, roč. 43, 1997, č.10, s. 764–771. Becker, W. A. – Spenger, J. V. – Mirosh, J. A. – Verstrafe. 1979. Heritabilities and genetic correlation of live and carcass weights and abdominal fat in female broilers. In: Poult. Sci., vol. 58, 1979, p. 1035. Benková, J. 2001. Analýza jatočnej kvality a nutričnej hodnoty genofondu importovaných kurčiat do SR v roku 2001. In: Správa za účelovú činnosť. Nitra, VUŽV, SCHŠH Ivánka pri Dunaji, 2001, s. 1–16. Csuka, J. 1988. K problematike pretučnenia brojlerov. In: Hydina, roč. 30, 1988, č.1–2, s. 33–38. Gyles, N. R – Maeza, A. – Goodwin, T. L. 1982. Regression of abdominal fat in broilers on abdominal fat in spet parents. In: Polt. Sci., vol. LXI, 1982, p. 1809–1814. Haščík, P. – Čuboň, J. – Vagač, V. 2004. Hodnotenie senzorickej kvality hydinového mäsa vplyvom probiotického prepaáru IMB 52. In: Maso, roč. 15, 2004, č.1, s.62–65. Haščík, P. – Čuboň, J: - Horniaková, E. – Krivánek, L. – Kulíšek, V. 2005. Vzťah medzi aplikáciou probiotického preparátu a množstvom abdominálného tuku u výkrmových kurčiat. In: Agriculture (Poľnohospodárstvo), roč. 51, 2005, č. 11, s. 574 – 579, ISSN 0551 – 3677. Henderson, M. 1981. UK broiler industry needs to change direction. In: Poult. Int., vol. 20, 1981, no. 12, p.116–118. Horovský, Š. – Kočiová, Z. – Kočí, Š. 1990. Výživársko-technologické aspekty pretučnenia brojlerov. In: Hydina, roč. XXXI, 1990, č. 5–6, s. 112–116. 90 Horváthová, V. – Lagin, L. 1985. Technologická a nutričná hodnota brojlerových kurčiat hybrida Slovgal. In: Živočíšna výroba, roč. LVIII, 1985, č. 8, s. 761–768. Křížková, E. – Čermák, B. – Kadlec, J. - Lád F. 1995. Zhodnocení podílu jednotlivých partií drůbežího masa po porážce. In: Aktuální problémy zdraví, růstu a produkce drůbeže, České Budějovice Scientific Pedagogoc Publishing, 1995, s. 139–140, ISBN 80–85645–15–7. Kumprecht, I. – Zobač, P. 1998. Účinek probiotických praparátů na bázi Sacharomyces cerevisiae a Enterococcus ve směsích s rozdílnou hladinou vitamínů skupiny B na úžitkovost kuřecích brojlerů. In: Czech. J. Animm.Sci., roč. 43, 1998, s. 63–70. Lagin, L. 1989. Jatočná hodnota kurčiat kombinácie Hybro. In: Živ.výroba, roč. LXII, 1989, č. 7, s.655–662. Nahashon, S. N. – Nakaue, H. S. – Mirosh, L.W. 1992. Effect of direct-feed microbilas on nutritient retention and production parameters of laying pullets. In: Poult. Scien., vol. 71, 1992, no. 1, p. 111. Okáľ, A. – Buriánková, J. – Greser, E. – Matušovičová, E. 1976. Technológia hydinárskeho priemyslu. Bratislava: Príroda, 1976, 302 s. Rychlá, J. – Řezníček, M. 2000. Vyhodnocení výkrmu brojlerů v Roštenicích. In: Náš chov, roč. LX, 2000, č. 11, s. 35–36. Straková, E. – Suchý, P. – Pažout, V. 2002. Efekt výkrmu brojlerových kuřat do vyššího věku a hmotnosti. In: Technologické systémy v chovu drůbeže (sbor. z mezin. konfer.), Brno, MZLU, 2002, s. 165–168, ISBN 80– 7157–579–8. Uhrín, V. – Horváthová, V. – Horniaková, E. – Chmelničná, Ľ. – Bulla, J. 1993: Kvalita hydinového mäsa. In: Acta Zootechnica, Nitra, VŠP, 1993, 111 s., ISBN–80–7137–124–6. Kontaktná adresa::Ing. Peter Haščík, PhD. Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Katedra hodnotenia a spracovania živočíšnych produktov. Tr.A.Hlinku 2, 949 76 Nitra, email: [email protected] FOTOINDUKOVATEĽNÁ EXPRESIA KURACIEHO PERIOD GÉNU V EPIFÝZE. PHOTOINDUCIBLE EXPRESSION OF CHICKEN PERIOD GENE IN THE PINEAL GLAND. Herichová I.1, Monošíková J.1, Zeman M.1,2 1 2 Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Univerzita Komenského v Bratislave, Bratislava Ústav biochémie a genetiky živočíchov, SAV, Ivanka pri Dunaji Abstract The pineal gland is a key component of the avian circadian system. Besides its capacity to generate oscillations, the avian pineal gland is able to synchronize to external light-dark cycles and generate an output signal – melatonin. The aim of our work was to study responsivnes of embryonic pineal gland to external light pulses. We measured expression of clock gene per2 in 19-day old embryos by real time PCR after 3h lasting light pulse. We conclude that per2 has capacity to mediate information about external light:dark cycle already on day 19 of development but this ability is limited to the phase of day when per2 expression is highest. 91 Úvod Epifýza patrí spolu s retinou a hypotalamom ku kľúčovým komponentom aviárneho cirkadiánneho systému (Cassone a Menaker, 1984). Okrem kapacity generovať oscilácie je tiež schopná nasynchronizovať sa na externý svetelný režim pomocou funkčných fotoreceptorov a generovať výstupný signál (Takahashi a kol., 1989). Činnosť biologických hodín je na molekulárnej úrovni determinová rytmickou expresiou tzv. hodinových génov, ktorých delécia spôsobuje disrupciu rytmického profilu aktivity v konštantných podmienkach. U vtákov je funkčný model činnosti cirkadiánneho pacemakera založený na spätnoväzobnej slučke tvorenej hodinovými génmi per2, per3, cry1 a cry2 a transkripčnými faktormi CLOCK a BMAL1 (alebo ich funkčnými homológmi). Proteínové produkty hodinových génov per2-3 a cry1-2 inhibujú transkripciu svojej vlastnej mRNA interferenciou s komplexom stimulačne pôsobiacich transkripčných faktorov CLOCK:BMAL1. Transkripčné faktory CLOCK a BMAL1 naopak indukujú expresiu hodinových génev prostredníctvom väzby na E-box v ich promotori (Okano a kol., 2001). Kurací per2 gén je v epifýze exprimovaný už od 18. dňa embryonálneho vývinu, ale rytmické zmeny vykazuje len ak sú embryá vystavené svetelnému režimu, nie v konštantnej tme (Okabayashi a kol., 2003). Na druhej strane naše výsledky ukazujú, že kuracia embryonálna epifýza je schopná nasynchronizovať sa na svetelný aj teplený režim (Zeman a kol., 1999; Zeman a kol., 2004) a generovať rytmus melatonínu aj po expozícii embyrí konštantým podmienkam (Zeman a kol., 1999). Jediný kompletný svetelný cyklus po vyliahnutí stačí na demonštrovanie rytmickej syntézy melatonínu v epifýze čerstvo vyliahnutých kurčiat (Zeman a kol., 1999). Tieto pozorovania predpokladajú prítomnosť funkčného pacemakera v mozgu kurčiat už na konci embryonálneho vývinu. Funkčný oscilátor implicitne predpokladá prítomnosť rytmickej expresie hodinového génu per2, ktorý patrí medzi kľúčové komponenty molekulárnehoh oscilátora. Za účelom štúdia ontogenézy kuracieho epifyzárneho oscilátora sme charakterizovali expresiu per2 génu v epifýze 19-dňových embryí počas 24 hodinového cyklu v synchronizovaných podmienkach aj konštantnej tme a testovali sme indukovateľnosť expresie per2 génu svetelnými pulzami v tmavej aj subjektívnej svetlej fáze dňa. Materiál a metódika V pokusoch sme použili 66 násadových vajec brojlerových kurčiat, ktoré boli inkubované v liahniach (Bios Sedlčany, ČR) s automatickým otáčaním. Inkubačná teplota bola udržiavaná v rozsahu 37,5 ± 0,2 ºC a vlhkosť 50 – 60 %. Počas inkubácie boli embryá vystavené 92 svetelnému režimu svetlo (L) : tma (D) 12:12, ktorý bol kontrolovaný automaticky a intenzita osvetlenia na úrovni vajec bola v rozsahu 140 – 200 lux. Odbery vzoriek boli robené pravidelne počas 24h v 4 hodinových intervaloch so začiatkom v čase ZT 14 (ZT – Zeitgeber time; ZT0 je definovaný ako začiatok svetlej fázy dňa). Svetelné pulzy sa uskutočnili v čase ZT 3-6 a ZT 15-18. Svetelné pulzy počas svetlej fázy dňa sa realizovali na skupine embryí, ktoré boli po skončení pravidelnej tmavej fázy dňa vystavené konštantnej tme. V tmavej fáze 24h cyklu sme odbery uskutočnili pri matnom červenom svetle. Vzorky tkanív boli uložené pri –80 oC až do izolácie celkovej RNA. Celková RNA bola izolovaná pomocou Tri-reagentu (MRC, USA) (Chomczynski a Sacchi, 1987). Epifýzy boli izolované individuálne a po homogenizovácii v 350 µl Trireagentu bola RNA vyzrážaná v prítomnosti koprecipitantu GlycoBlue (Ambion, USA). Ostatné kroky izolácie prebiehali podľa pokynov dodávateľa Tri-reagentu. Na kontrolu integrity RNA sme použili 1 % agarózový gél obsahujúci MOPS a formaldehyd. Gél bol vizualizovaný pomocou systému Gel Doc XR (Bio-Rad, USA) a záznam gélu bol uložený v digitálnej forme. Syntéza cdna bola urobená pomocou kitu improm-ii reverse transcription system (promega, usa) s použitím oligo(dt)15 a 1 µg celkovej rna. Rna s primermi sme denaturovali 5 minút pri 75 °c. Reakčná zmes pozostávala z nasledujúcich zložiek: 1 x reakčný pufor, 2 µl 25 mm mgcl2, 1µl 10 mm dntps, 0,5 µl rnasin ribonukleázový inhibítor, 1 µl reverznej transkriptázy. Po 5 minútovej inkubácii pri 25 oc, prebiehal prepis pri 42 oc 60 minút. Na záver sme reverznú transkriptázu tepelne inaktivovali 15 minútovou inkubáciou vzoriek pri 70 o c. Prepísaná cdna bola uložená do kvantifikácie pri –18 oc. Expresiu per2 génu sme analyzovali pomocou real time PCR s použitím špecifických primerov. Signál sme normalizovali vzhľadom na expresiu konštitutívne exprimovaného génu kódujúceho proteín S17. Sekvencie primerov boli: s17 (X07257) sense primer 5’ACACCCGTCTGGGCAACGAC-3’, antisense primer 5’-CCCGCTGGATGCGCTTCATC3’ (Dragon et al., 2002); for cPer2 (AF246956) sense primer 5’- ACCTAAAGGAAGGCCTGGTG-3’, antisense primer 5’-CGCTGAGTAGCTTGCTTGTG3’. Na kvantifikáciu sme použili 0,5-2,0 µl cDNA a QuantiTect SYBR Green PCR Kit (QIAGEN, Germany). Intenzita signálu počas amplifikácie v 20 µl reakčnej zmesi sa hodnotila na prístroji ABI PRISM® 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, USA). Podmienky PCR boli: 95°C, 15 min a následne 50 cyklov pri teplotách 93 94°C, 15 s; 47.5 - 55 °C, 30 s a 72°C, 30 s. Špeckosť reakcie a molekulová veľkosť amplifikovaného produktu bola zistená pomocou analýzy teploty topenie, ktorá sa uskutočnila ako posledný krok po ukončení amplifikácii v cykleri a elektroforetickým rozdelením produktu na 2% agarózovom géli. Na normalizáciu možných nepresnotí v pipetovaní reakčného mixu bola použitá fluorescenčná referenčná farbička ROX, ktorá je súčasťou kitu a slúži ako interný štandard merania. Rytmicita denného profilu expresie per2 génu bola posudzovaná kosínovorovou analýzou, ktorá pomocou analýzy variancie testuje ako najlepšie nafitovaná kosínusová krivka koreluje s exprimentálnymi dátami (Nelsom et al., 1979; Klemfus and Clopton, 1993). Účinnosť svetelných pulzov bola posudzovaná pomocou nepárového t-testu. Výsledky Expresia per2 v epifýze 19-dňového kuracieho embrya vykazovala singifikantný rytmus aj v synchronizovaných podmienkach, aj v konštantnej tme. V konštantnej tme však stredná hodnota rytmu bola signifikantne znížená oproti hodnotám nameraným v podmienkach svetelného režimu. Aplikácia svetelného pulzu počas subjektívnej svetlej fázy dňa spôsobila signifikantné zvýšenie expresie per2 génu v epifýze (32,08±4,18 vs. 71,54±6,53 per2/s17 mRNA). Na druhej strane svetelný pulz nemal vplyv na expresiu per2 génu počas tmavej fázy dňa. Diskusia Naše výsledky potvrdili, že aviárny cirkadiánny systém sa vyvýja a je čiastočne funkčný už počas embryonálneho vývinu. Rytmická expresia per2 génu vykazuje vrchol na začiatku svetlej fázy dňa u 19-dňových embryií, podobne ako to bolo dokázané u vyliahnnutých kurčiat (Doi a kol., 2001). Rozdiel medzi embryonálnym a postembryonálnym vývinovým štádiom je, že v konštantných podmienkach rytmus epxresie per2 génu u 19-dňových embryí perzistuje so zásadne zníženou amplitúdou. Postnatálne aplikovaný svetelný pulz dokáže indukovať expresiu hodinového génu per2 v aviárnej epifýze počas svetlej a tmavej fázy dňa (Yoshimura a kol., 2000). U 19-dňových kurčiat je svetelný pulz efektívny len v tej fáze dňa, kedy expresia per2 génu vykazuje svoje maximum. Predpokladáme, že na kompletný priamy a synchronizujúci účinok svetelného pulzu na aviárny cirkadiánny systém je potrebná aktivita ďalších komponentov molekulového oscilátora. Na kompletnú analýzu ontogenézy aviárneho epifyzárneho ocilátora budú 94 zamerané ďalšie experimentálne práce našej skupiny. Záver Naše výsledky demonštrujú, že hodinový gén per2 je rytmicky exprimovaný už počas embryonálneho vývinu. Rytmická expresia per2 génu perzistuje v konštantných podmienkach, aj keď so zníženou amplitúdou. Indukovateľnosť expresie per2 génu svetlom je u 19-dňových embryí už vyvinutá, ale je obmedzená na tú fázu dňa, ktorú oscilátor vníma ako subjektívnu svetlú fázu. Predpokladáme, že na indukovateľnosť expresie per2 génu počas tmavej tázy dňa je potrebná aktivita ďalšieho komponentu oscilátora, ktorý v tomto ontogenetickom štádiu ešte nie je vyvinutý. Naše výsledky implikujú, že epifyzárny aviárny cirkadiánny pacemaker sa vyvíja postupne, pričom aj v tých vývinových štádiách, počas ktorých nie sú aktívne všetky jeho komponenty, je schopný plniť viaceré fyziologické funkcie a synchronizovať svoju činnosť s vonkajšími podmienkami prostredia. Poďakovanie Táto práca bola podporená grantami APVV-20-022704, VEGA 1/4343/07, VEGA 1/4328/07. Literatúra Cassone V.M., Menaker M.: Is the avian circadian system a neuroendocrine loop? J Comp Physiol. 156: 145152, 1984 Chomczynski P, Sacchi N: Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction. Anal Biochem. 162: 156-159, 1987 Doi M, Nakajima Y, Okano T, Fukada Y. Light-induced phase-delay of the chicken pineal circadian clock is associated with the induction of cE4bp4, a potential transcriptional repressor of cPer2 gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 98: 8089-80, 2001 Dragon S, Offenhauser N, Baumann R.: cAMP and in vivo hypoxia induce tob, ifr1, and fos expression in erythroid cells of the chick embryo. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282: R1219-1226, 2002 Klemfuss H, Clopton PL: Seeking tau: a comparison of six methods. J Interdisciplinary Cycle Res. 24: 1-16, 1993 Nelson W, Tong YL, Lee JK, Halberg F: Methods for cosinor-rhythmometry. Chronobiologia 6: 305-323, 1979 Okabayashi N, Yasuo S, Watanabe M, Namikawa T, Ebihara S, Yoshimura T.: Ontogeny of circadian clock gene expression in the pineal and the suprachiasmatic nucleus of chick embryo. Brain Res. 990: 231-234, 2003 Okano T, Yamamoto K, Okano K, Hirota T, Kasahara T, Sasaki M, Takanaka Y, Fukada Y. Chicken pineal clock genes: implication of BMAL2 as a bidirectional regulator in circadian clock oscillation. Genes Cells. 6: 825-836, 2001 Takahashi JS, Murakami N, Nikaido SS, Pratt BL, Robertson LM. The avian pineal, a vertebrate model system of the circadian oscillator: cellular regulation of circadian rhythms by light, second messengers, and macromolecular synthesis. Recent Prog Horm Res. 45: 279-348, 1989 Yoshimura T, Suzuki Y, Makino E, Suzuki T, Kuroiwa A, Matsuda Y, Namikawa T, Ebihara S. Molecular analysis of avian circadian clock genes. Brain Res Mol Brain Res. 78: 207-215, 2000 Zeman M, Gwinner E, Herichova I, Lamosova D, Kost'al L. Perinatal development of circadian melatonin production in domestic chicks. J Pineal Res. 26:28-34, 1999 Zeman, M., Pavlik, P., Lamosova, D., Herichova, I., Gwinner, E. Entrainment of rhythmic melatonin production by light and temperature in the chick embryo. Avian Poult Biol Rev. 15: 197-204, 2004 95 Kontaktná adresa:Prof. RNDr. Michal Zeman, DrSc., Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave, Mlynská dolina B-2, 842 15 Bratislava ODCHÝLKY HEMATOLOGICKÝCH A BIOCHEMICKÝCH PARAMETROV PRI SÉROLOGICKY POZITÍVNYCH PRASNICIACH NA E. INTESTINALIS ALTERATION OF HAEMATOLOGICAL AND BIOCHEMICAL PARAMETERS IN SEROLOGICAL POSITIVE SOWS OF E. INTESTINALIS Hisira, V.1, Kováč, G1., Lešník, F.1,2, Novotný, J.1, Petrovová, E.1, Farkašová, Z.1, Link, R.1 1Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, Košice , 2Ústav živočíšné fyziologie a genetiky AV ČR, Liběchov Abstrakt V tomto experimente sme sledovali zmeny vybraných hematologických (erytrocyty, hemoglobín, hematokrit, stredný objem erytrocytov, leukocyty) a biochemických parametrov (celkové bielkoviny, albumín, kreatinín, urea) pri prasniciach sérologicky pozitívnych na E. intestinalis. Tieto hodnoty sme porovnali s fyziologickými hodnotami. Na základe získaných výsledkov sme zaznamenali odchýlky od fyziologického rozpätia v dvoch parametroch pri hematologickom profile a v jednom parametri biochemického profilu. Abstract In our experiment we determined changes haematological (erytrocytes, hemoglobin, hematocrit, MCV, leucocytes) and biochemical parameters (total proteins, albumin, creatinine, urea) in serological positive sows for E. intestinalis. This values we compared with physiological values. On the base of aquired results we determine considerable divergance in two parameters of haematological profile and one parameter of biochemical profile. Úvod Encephalitozoon spp. sú obligátne intacelulárne, sporoforné parazity patriace do kmeňa Microspora, s aktívnou metabolickou fázou v hostiteľskej bunke. Prvýkrát boli opísané pred viac ako 100 rokmi. V súčasnosti je známych 143 rodov a viac ako 1200 druhov (Canning a Hollister, 1992). Prirodzená infekcia bola zdokumentovaná pri protozoách, článkonožcoch, hmyze, obojživelníkoch, vtákoch a cicavcoch (Valenčáková, 2005). Okrem toho bola potvrdená prítomnosť tohto parazita aj vo vodných zdrojoch (Dowd a i, 1998). 96 Druhým najčastejšie sa vyskytujúcim druhom je Encephalitozoon intestinalis, ktorý v hostiteľskom organizme postihuje tráviaci trakt vo forme enteritídy a chronickej hnačky, respiratórny vo forme bronchitídy a rinitídy, urogenitálny vo forme nefritídy, žlčové cesty vo forme cholangitídy a cholecystitídy a kostnú dreň (Cali a i., 1991, 1993; Orestein a i., 1992; Field a i., 1993). V roku 1998 Bornay a iní opísali tohto parazita aj vo vzorkách trusu niektorých druhov zvierat ako sú svine, psy, hovädzí dobytok, kozy a somáre, čím sa poukázal ich možný zoonotický pôvod. Materiál a metodika Do pokusu sme zaradili 5 prasníc vo veku 4 rokov, jeden mesiac po pôrode z chovu v Zemplínskej Teplici. Krv sme odoberali z očného splavu. Sérum sa získalo centrifugáciou pri 3000 ot/min. Hematologické prarametre - erytrocyty (Er), hemoglobín (Hb), hematokrit (Hk), stredný objem erytrocytov (MCV), leukocyty (Leu) sme stanovovali v krvi pomocou prístroja Serono 150 Plus (Switzerland). Biochemické parametre - celkové bielkoviny (CB), albumín (Alb), kreatinín (Creat), urea (U), sme stanovovali v sére pomocou biochemického fotokolorimetrického analyzátora ALIZE (Lisabio, France). Výsledky a diskusia Hematologické parametre Pri sérologicky pozitívnych prasniciach sme zaznamenali v hematologických ukazovateľoch zmeny. Zaznamenali sme znížené množstvo erytrocytov v jednom prípade (20%) a zníženú hladinu hemoglobínu v dvoch prípadoch (40%). Anémia spôsobená znížením počtu erytrocytov má rôznu etiológiu: nadmerné straty krvi (posthemoragická), hemolytická anémia pri infekčných ochoreniach, pri otravách, pri autohemolýze, pri puerperálnej, paroxyzmálnej hemoglobinémii, pri hypoplastickej anémii pri nedostatku krvotvorných látok, pri ionizujúcom žiarení, pri aplikácii cytostatík alebo liečiv 97 inhibujúcich funkciu kostnej drene, pri niektorých orgánových a infekčných ochoreniach (Vrzgula a i., 1990). Hemoglobín je hlavnou súčasťou erytrocytov. Hladiny hemoglobínu kolíšu za normálnych okolností v závislosti od veku, pohlavia, nadmorskej výšky, stavu kŕmenia a ustajnenia (Slanina a i., 1993). Príčinou poklesu hodnôt hemoglobínu (hypochrómie) je predovšetkým nedostatočný príjem minerálnych látok, ktoré sú dôležité pri tvorbe hému a krvotvorbe, kde sa najväčšia časť rezorbovaného železa nachádza v štruktúre hemoglobínu. Medzi ďalšie príčiny hypochrómie patria: anémie, hydrémie, hemoglobínúrie, urémie, výživa deficitná na bielkoviny, aminokyseliny, vitamíny, chronické ochorenia tráviacej a dýchacej sústavy, chronické parazitózy a otravy (Vrzgula a i., 1990). Tab. č. 1 Hematologické parametre v krvi sérologicky pozitívnych prasníc. Hk LC 5,0 – 8,0 T.l-1 10 – 14 g.dl-1 0,32 – 0,42 l.l-1 11 – 18 G.l-1 50 – 68 f.l-1 910p 4,89 9,8 0,32 14,0 63,5 723p 6,53 10,2 0,36 17,1 67,2 696p 7,6 11,3 0,25 11,8 57,3 752p 5,08 10,8 0,41 15,4 62,3 011p 6,29 9,0 0,35 16,5 56,1 Zníž. 20% 40% - - - Er Hb MCV Biochemické parametre Pri hladine urei sme zaznamenali v krvnom sére jednej prasnice vzostup nameranej hodnoty v porovnaní s fyziologickými hodnotami. Urea je koncovým produktom katabolizmu bielkovín. Jej vylučovanie ovplyvňuje okrem glomerulárnej filtrácie aj tubulová sekrécia. Pri glomerulonefrítíde je prvá fáza charakterizovaná polygakysúriou a následne táto prechádza do dizúrie (Ferenčík a i, 2000). U psov infikovaných ďalším mikrosporidiálnym druhom E. cuniculi Botha a i. (1986) potvrdili progresívne ireverzibilné ochorenie po biopsii obličiek. V tom čase objavil zmeny aj v hladinách kreatinínu a urei v krvnom sére pozitívnych psov. Práve na začiatku ochorenia 98 boli tieto hladiny znížené. Vývojom ochorenia zaznamenal mierny nárast hladín týchto parametrov. U sérologicky pozitívnych psov na prítomnosť protilátok proti E. cuniculi zaznamenal McInnes a Stewart (1991) zvýšenú koncentráciu urei. Tab. č. 1 Biochemické parametre v krvi sérologicky pozitívnych prasníc. CB Albumín Kreatinín Urea 70 - 90 g.l-1 35 - 45 g.l-1 141 - 239 µmol.l-1 2,5 - 5,8 µmol.l-1 910p 80,4 42,5 169,9 4,13 723p 78,9 42,4 180,4 5,03 696p 83,2 45,4 154,0 6,9 752p 82,2 40,6 172,5 4,14 011p 77,4 41,4 133,3 4,2 Zvýš. - - - 20% Záver V našom pokuse nami namerané hodnoty jednotlivých parametrov (Er, Hb) hematologického profilu, napriek tomu, že sú znížené nepriamo súvisia s črevnou encefalitozoonózou, spôsobenou E. intestinalis. Naopak pokles hladiny urei nám preukazuje prítomnosť tohto ochorenia pri týchto zvieratách. Literatúra 1. Bornay-Llinares, F. J., Da Silva, A. J., Moura, H., Schwartz, D. A., Visvesvara, G. S., Pieniazek, N. J., CruzLopez, A., Hernandez-Jauregui, P., Guerrero, J., Enriquez, F. J. 1998 Immunologic, microscopic, and molecular evidence of Encephalitozoon intestinalis (Septata intestinalis) infection in mammals other than humans. J Infect Dis. 178:820–826. 2. Botha, W.S., Dormehl, I.C., Goosen, D.J. 1986. Evaluation of kidney funcion in dogs suffering from canine encephalitozoonosis by standard clinical phatological and rathioparmaceutical techniques. Journal of the South African Veterinary Association. 57:79-86. 3. Cali, A., Orenstein, J. M., Kotler, D. P., Owen, R. L. 1991. A comparison of two microsporidian parasites in enterocytes of AIDS patients with chronic diarrhea. J. Protozool 38: 96-98. 4. Dowd, S. E., Gerba, C. P., Pepper, I. L. 1998. Confirmation of the human pathogenic microsporidia Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, and Vittaforma corneae in water. Appl. Environ. Microbiol. 64:3332-3335. 5. Ferenčík, M., Škárka, B., Novák, M., Turecký, L. 2000. Biochémia. Slovak academic press. Bratislava. 794795, 856. 6. Field, A. S., Hing, M. C., Marriott, D. J. 1993. Small intestinal microsporidiosis in HIV infected patients in Sydney, Australia. In Abstract 1st Workshop on Microsporidiosis and Cryptosporidiosis in Immunodeficient Patients, Ceske Budejovice, Czech Republic. 7. Hollister, W. S., Canning, E. U. 1987. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antibodies to Encephalitozoon cuniculi and its use in determination of infections in man. Parasitology. 94 :209– 219. 99 8. McInnes E. F., Stewart C. G. 1991. The pathology of subclinical infection of Encephalitozoon cuniculi in canine dams producing pups with overt encephalitozoonosis. J. S. Afr. Vet. Med. Assoc. 62:51-54. 9. Orenstein, J. M., Dieterich, D. T., Kotler, D. P. 1992. Systemic dissemination by a newly recognized intestinal microsporidia species in AIDS. AIDS. 6(10):1143–1150. 10. Slanina, Ľ., Dvořák, R., Bartko, P., Hofírek, B., Lehocký, J., Zendulka, I. 1993. Veterinárna klinická diagnostika vnútorných chorôb. Príroda. Bratislava. 314-315. 11. Valenčáková, A. 2005. Encephalitozoonosis. Vet. Nov. 31:93-98. 12. Vrzgula, L., Alijev, A.A., Barej, W., Bartko, P., Bouda, J., Dvořák, R., Garbašanski, P., Illek, J., Jagoš, P., Karsai, F., Kóňa, E., Kováč., G., Nedková, L., Sokol, J., Sova, Z., Schäfer, M. 1990. Poruchy látkového metabolizmu hospodárskych zvierat a ich prevencia. Príroda. Bratislava. 168-170, 470. ULTRAŠTRUKTÚRA M. GASTROCNEMIUS U JAPONSKÝCH PREPELÍC POČAS HYPODYNAMIE SIMULUJÚCEJ MIKROGRAVITÁCIU V KOZME THE ULTRASTRUCTURE OF M. GASTROCNEMIUS IN JAPANESE QUAILS UNDER HYPODYNAMY SIMULATING MICROGRAVITY IN SPACE Holovská, K.,Kočišová, J., Cigánková, V., Almášiová, V.,Tomajková, E.,Škrobánek,P*., Zibrín, M. Katedra normálnej anatómia, histológie a fyziológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva , Košice *Institute of Animal Biochemistry and Genetics, SAS, Ivanka pri Dunaji Abstract Hypodynamy is one of the models simulating weightlessness in space. We studied the effect of long-term hypodynamy of Japanese quails on ultrastructure of skeletal muscle (m. gastrocnemius) since hatching up to 126 days. Three days after hatching the quails were suspended in the special shirts so their feet did not touch the floor. They could consume food and water ad libitum. Experimental and control animals were killed after 14, 28, 42, 56 and 126 days of hypodynamy. The most extensive morphological changes were found in the m. gastrocnemius after 14 days of hypodynamy. Internal structure of mitochondria was altered and they accumulated on the larger areas. After 28 days of hypodynamy we observed the occurrence of giant mitochondria. After 42 days of hypodynamy sarcoplasmic reticulum were dilated, mitochondria were vacuolised and after 126 days of hypodynamy vacuolised mitochondrial matrix and preserved sarcomeres were found. Key words: hypodynamy, m. gastrocnemius, ultrastructure, Japanese quail. Úvod Experimenty s hypodynamiou slúžia ako pokračovanie našich štúdií vplyvu beztiaže na organizmus japonskej prepelice. Tieto štúdie smerujú k vytvoreniu uzavretého ekologického systému, ktorý by zabezpečil dlhodobý pobyt v kozmických podmienkach. Cieľom je, aby vyliahnuté japonské prepelice v podmienkach kozmickej lode dosiahli dospelosť a boli schopné reprodukcie. Keďže kozmické experimenty sú náročné a najmä 100 drahé, hľadajú sa modelové pokusy na Zemi. Jedným z modelov je hypodynamia. Spolu s Ústavom genetiky živočíchov a biochémie SAV v Ivanke pri Bratislave už dlhšie sledujeme ako hypodynamia ovplyvňuje štruktúru orgánov prepelíc. Materiál a metodika Japonské prepelice (Coturnix coturnix japonica) boli vystavené pôsobeniu hypodynamie 14, 28, 42, 56 a 126 dní [15]. M. gastrocnemius bol odobratý z kontrolných a hypodynamii vystavených prepelíc pre transmisnú elektrónovú mikroskopiu. Tkanivo sme fixovali v 3% glutaraldehyde, 1%OsO4, oba v 0,15 mol.dm-3 kakodylátový tlmivý roztok pH 7,2 a zaliali do durkupanu. Ultratenké rezy sme študovali a fotografovali v transmisnom elektrónovom mikroskope Tesla 500. Výsledky Pre štúdium sme použili m. gastrocnemius. V skupine experimentálnych zvierat, ktoré boli 14 dní v hypodynamických podmienkach sme pozorovali v porovnaní s kontrolnou skupinou najmä zmeny na mitochondriách. Zmeny sa týkali ich počtu, veľkosti a štruktúry. Zmenená bola nielen ich vnútorná štruktúra, ale hromadili sa aj na väčších plochách. Intermyofibriálne priestory boli rozšírené, sarkoméry sa vyznačovali nepravidelnosťou a v sarkoplazme sa objavovali tukové kvapky. Vývoj zmien bol pozorovaný aj v ďalšej skupine experimentálnych zvierat, ktoré boli vyvesené 28 dní. Mitochondrie sa spájali do gigantických mitochondrií a tie často presahovali dĺžku jednej sarkoméry. Intermyofibriálne priestory boli rozšírené, vyplnené nakopenými mitochondriami a tukovými kvapkami. Pozorovali sme nevýrazné hranice medzi I a A pruhmi v sarkomére. Z línie mali nerovný priebeh. V skupine 42 dňových hypodynamických prepelíc sme okrem zmien nachádzajúcich sa v predchádzajúcich skupinách pozorovali dilatované sarkoplazmatické retikulum ako aj vakuolizované mitochondriové kristy. M. gastrocnemius po 56 dňovom vplyve hypodynamie v elektrónovom mikroskope mal podobný morfologický obraz ako v predchádzajúcej skupine. Pridružili sa zmeny v priebehu Z línií, ktoré boli často prerušované alebo mali nerovný priebeh. V poslednej skupine prepelíc, ktoré žili v podmienkach hypodynamie 126 dní, sme pozorovali široké intermyofibriálne priestory, vakuolizovaný mitochondrialný matrix. Sarkoméry zostali zachované. 101 Diskusia Hypodynamia a mikrogravitácia majú výrazný vplyv na človeka a experimentálne zvieratá, najmä na kostrovú svalovinu a kosti. Svaly zvierat výrazne atrofujú, čo vedie k úbytku svalovej hmoty o 30% [11], u japonských prepelíc o 14% [14]. V prvej etape dochádza k mobilizácii energetických rezerv, čo sa prejavilo zmenou v myónoch m. gastrocnemius už po 14 dňoch hypodynamie. Najviac boli postihnuté mitochondrie, ktoré boli väčšie a hromadili sa. V sarkoplazme sa objavili tukové kvapky. Uvedené zmeny sú morfologickým prejavom prvej etapy adaptácie na hypodynamiu. Pre 28 deň hypodynamie sú charakteristické gigantické mitochondrie a nevýrazné hranice medzi I a A pásmi v sarkomére. Na 42 deň hypodynamie sme pozorovali dilatovaný sarkotubulárny aparát a vakuolizované mitochondriové kristy. Po 126 dňovej hypodynamii priestory medzi myofibrilami boli široké, čo pravdepodobne súvisí s celkovým úbytkom svalovej hmoty. Po 56 a 126 dňoch hypodynamie je poškodenie myónov menej výrazné. Preto predpokladáme, že zmeny sú ďalšími morfologickými prejavmi adaptácie a pravdepodobne sú reverzibilné. Je veľa prác študujúcich bezváhový stav v laboratórnych podmienkach. Zmeny, ktoré opísali mnohí autori, poukazujú na zníženú funkciu orgánov s následným poklesom rôznych syntetických procesov. Svalová atrofia je sprievodným znakom bezváhového stavu [15]. Jakowska a kol. [5] pri morfometrickom vyšetrení satelitných buniek v m. gastrocnemius zistili zmenšenie objemu Golgiho aparátu a granulovaného endoplazmatického retikula ako aj zníženie počtu ribozómov. Zmenené boli aj jadrá, kde došlo k relatívnemu zmenšeniu objemu heterochromatínu. Tieto nálezy poukazujú na zredukovanú aktivitu týchto buniek. Zmeny boli aj v kapilárnej sieti imobilizovaných svalov. Endotel ciev bol veľmi tenký a nesúvislý [10], jadrá mali nepravidelný tvar s kondenzovaným chromatínom [13]. Dlhodobá hypodynamia vo všeobecnosti má nepriaznivý účinok na japonské prepelice. Spôsobuje zníženie hmotnosti prepelíc až o 14% [12] na čom sa výrazne podieľa pokles svalovej hmoty. V konečnej fáze dochádza k deštrukcii svalových bielkovín a tým k úbytku svalového objemu [9]. Mnohé experimenty demonštrujú, že imobilizácia u zvierat zahrňuje metabolické, funkčné a štrukturálne zmeny v kostrovej svalovine [6, 1]. Aj naše experimenty poukazujú na to, že hypodynamia spôsobuje štrukturálne zmeny buniek tkanív a orgánov [2, 16, 17, 8]. Ale aj napriek tomu sú prepelice schopné adaptácie a existencie v experimentálnych podmienkach hypodynamie ako aj v kozmických podmienkach beztiaže [ 7, 4, 3]. 102 Záver Vplyv hypodynamie bol sledovaný u 14, 28, 42, 56 a 126 dňových japonských prepelíc. Hypodynamia japonských prepelíc bola vypracovaná na UBGŽ v Ivánke pri Dunaji ako model pre sledovanie vplyvu beztiaže v podmienkach na Zemi. Zistili sme, že najrozsiahlejšie morfologické zmeny v m. gastrocnemius boli po 14. dňoch hypodynamie. V ďalšom období hypodynamie zmeny ktoré nastali v mitochondriách a myofibrilách boli rôzneho rozsahu. V období 56 a 126 dňovej hypodynamie prepelíc boli zmeny v sledovanom tkanive menej výrazné. Domnievame sa, že pozorované morfologické zmeny sú prejavom adaptácie na hypodynamiu a predpokladáme, že všetky nami zistené zmeny v m. gastrocnemius sú reverzibilné. Práca vznikla v rámci grantu 1/3495/06, ktorý finančne podporila VEGA MŠ SR Literatúra 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. BOOTH, F. (1977): Time course of muscular atrophy during immobilization of hindlimbs in rats. J. Appl. Physiol., 43, 656-661. CIGÁNKOVÁ, V., - LENHARDT, Ľ., - ZIBRÍN, M.,- KOČIŠOVÁ, J.,- TOMAJKOVÁ, E.,KOMOROVÁ, T.,- SABO, V.,- BOĎA, K.,- DADASHEVA, O. A.,- GURYEVA, T. S. (2001): Morphological changes in the small intestine of Japanese quail chicks hatched under the conditions of microgravitation. Folia Vet., 45, 27-31. DADASHEVA, O. A., - GURYEVA, T. S.,- SABO, V.,- BOĎA, K.,- KOČIŠOVÁ, J. (2001): Research into the morphology of Japanese quail chicks hatched under conditions of microgravity. Folia Vet., 45, 12-16. GURYEVA, T. S., - DADASHEVA, O. A.,- MELESHKO, G. I.,- SHEPELEV, YE. YA., BOĎA, K.,SABO, V. (1993): The quail embryonic development under the conditions of weightlessness. Acta Vet. Brno, 62, 25-30. JANKOWSKA, E.,- BARANSKA, V.,- BARAN, W. (1996): Morfometric ultrastructural evaluation of satellite cells in musculus gastrocnemius and musculus latissimus dorsi anterior of rats subjected to 7 day hypokinesia. Folia Morphol., 55, 21-29. JASPER, R. S., - HENRIKSEN, E. J.,- SATARUG, S.,- TISCHLER, M. E. (1989): Effects of stretching and disuse on amino acids in muscles of rat limbs. Metabolism., 38, 303-310. JURÁNI, M., - VÝBOH, P., - LAMOŠOVÁ, D.,- BAREŠKOVÁ, Ž.,- SOMOGYOVÁ, E.,- BOĎA, K.,- SABO, V. (1983): The effect of a 90-day hypodynamia on the neurohumoral system, egg laying and metabolism of protein in Japanese quail. Physiologist , 26, 145-148. KOČIŠOVÁ, J., - CIGÁNKOVÁ, V., - ZIBRÍN, M., - TOMAJKOVÁ, E.,- LENHARDT, Ľ.,- SABO, V.,- BOĎA, K.,- DADASHEVA, O.A.,- GURYEVA, T.S. (2001): The morphological picture of m. gastrocnemius in Japanese quail chicks hatched on the orbital station “Mir”. Folia Vet., 32-35. LEBEDEVA, Z. N., - MEDNIKOVA, E. I.,- GURYEVA, T. S.,- DADASHEVA, O.,TRESVATSKAYA, N.A.,- KALIUZHNAYA, M.V. (1998): Effect of hypodynamia on the organism of Japanese quail. Folia Vet., 42, 53-56. OKI, S.,- DESAKI, J.,- MATSUDA, Y.,- OKUMURA, H.,-SHIBATA, T. (1995): Capillaries with fenestrae in the rat soleus muscle after experimental limb immobilization. J. Electron Microsc., 44, 307310. PLANEL, H., (2004): Space and life. Press LLC, London. SABO, V., - CHRAPPA, V., - BOĎA, K. (1998): Effect of long-term (84-days) hypodynamy on the efficiency of Japanese quails. Folia Vet., 42, Supplementum 1: 59-62. SMITH, H. K., - MAXWELL, L.,-MARTYN, J. A., - BASS, J. J. (2000): Nuclear DNA fragmentation and morphological alterations in adult rabbit skeletal muscle after short-term immobilization. Cell Tissue Res., 302, 235-241. ŠKROBÁNEK, P., - HRBATÁ, M., - BARANOVSKÁ, M.,- JURÁNI, M. (2004): Growth of Japanese quail chicks in simulated weightlessness. Acta Vet. Brno, 73, 157-164. 103 15. TADA O., - YOKOGOSHI H. (2002): Effect of different dietary protein composition on skeletal muscle atrophy by suspension hypokinesia/hypodynamia in rats. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 48, 115-119. 16. ZIBRÍN, M.,- CIGÁNKOVÁ, V.,- KOČIŠOVÁ, J.,- TOMAJKOVÁ, E.,- KOMOROVÁ, T.,LENHARDT, Ľ.,- PÁLENÍK, L.,- SABO, V.,- BOĎA, K.,- DADASHEVA,- O. A., GURYEVA, T. S. (2001): The structure of some tissues and organs of Japanese quail chicks hatched on the orbital space station “Mir”. Folia Vet., 45, 17-22. 17. ZIBRÍN, M., - BOĎA, K.,- CIGÁNKOVÁ, V.,- KOČIŠOVÁ, J.,- TOMAJKOVÁ, E.,- KOMOROVÁ, T.,- SABO, V.,- PIVKO, J. (2003):Long term experimental hypodynamy affects the structure of spongy bone and osteoclasts in Japanese quail. Acta Vet. Brno, 72, 143-149. Kontaktná adresa: Katarína Holovská, MVDr.,.Univerzita veterinárskeho lekárstva, Ústav histológie a embryológie, Komenského 73, 041 81 Košice, e-mail: [email protected] OVERENIE ÚČINKU HOMEOPATÍK NA NIEKTORÉ FYZIOLOGICKÉ UKAZOVATELE U ODSTAVČIAT VERIFICATION OF HOMEOPATHICS EFFECT ON SELECTED PHYSIOLOGICAL PARAMETERS IN WEANED PIGLETS Húska M., Link R., Buleca J., Dudríková E. II. interná klinika, UVL v Košiciach, Komenského 73, 04181 Košice, SR Abstract The benefit of homeopatics is that no residues persist in organism in comparison to classic therapeutics. This fact positively acts at health creation not only in animals but also in humans. We applied homeopatics in post weaning piglets as prevention to diarrheic syndrome occurrence. Preparation PVB Diarrhées is veterinary homeopathic specialty from Boiron company that is used for diarrhea treatment and prevents complications like weight loosing, chronic enterocolitis and hepatitis. Experiment was realized in ŠPP in Zem. Teplica on 28 piglets. Each swine was applied 2 ml of solution per orally in period since 3 days before weaning to 70 days after weaning. Kľúčové slová: homeopatiká, ošípané, metabolizmus, diarhoický syndróm Úvod Homeopatia je umenie medicíny založené na základe podobnosti. Jej zakladateľom bol nemecký lekár a chemik Samuel Hahnemann. Uplatňoval zákon podobnosti, ktorý spočíva na poznatku, že každá látka, ktorá je schopná v merateľných koncentráciách vyvolať u zdravého jedinca určité príznaky choroby, je potom aj schopná v nekonečne malých dávkach tieto príznaky potlačiť (Ramakrishnan a Coulterová 2005). Výhodou homeopatie je, že na rozdiel od klasických terapeutík homeopatiká nezanechávajú v organizme reziduá, čo sa pozitívne odráža na tvorbe zdravia nielen zvierat , ale aj ľudí (Lockie, 2002,). Odskúšali sme 104 homeopatiká pri odstave prasiat ako prevenciu vzniku diarhoického syndrómu. Liek PVB Diarrhées je veterinárna homeopatická špecialita firmy Boiron, ktorý sa používa na liečenie hnačkových stavov a zabraňuje komplikáciám typu chudnutie, chronické enterokolitídy a žltačka. Materiál a metodika Pokus bol realizovaný na ŠPP v Zemplínskej Teplici. Do pokusu bolo náhodným výberom vybratých 28 prasiat krížencov plemena Slovenská biela ušľachtilá 75% a Landras 25%, približne rovnakej hmotnosti a rovnakého veku. Každé zviera bolo opatrené identifikačným číslom, a boli rozdelené do skupín A1, A2, B1, a B2. Experiment spočíval v dennom podávaní homeopatických roztokov ošípaným 3 dni pred odstavom až 70 dní po odstave. Skupine A1 bol podaný prípravok Boiron 69 110 šarža SL 133 58, B1 - prípravok Boiron 69110 šarža SL 133 58, 2 ml na kus jeden krát denne, prvé 3 dni individuálne pomocou dávkovacej pumpy, potom potencovaný v 100 ml vody, aplikovaný v potrave. Kontrolným skupinám A2, B2 bolo podávané placebo v množstve 2 ml, prvé tri dni individuálne pomocou dávkovacej pumpy, potom aplikovaný v potrave. Váženie odstavčiat sa vykonávalo 3 krát, vo veku 5, 7 a 9 týždňov. Krv sa odoberala v deň odstavu, 14 a 28 dní po odstave, zo sinus ophtalmicus. Táto bola následne spracovaná v laboratóriu II. Internej kliniky UVL v Košiciach. Výsledky a diskusia Homeopatické prípravky neovplyvnili hodnoty zložiek hematologického profilu (tab.č.1). Leukocyty (Lc) tvoria bielu krvnú zložku hematologického profilu, sú základným komponentom lymfoidného a imunologického systému (Issautier, M.N., Calvet, H., 1993). Pri experimente sa hodnoty zinku (tab.č.2) pohybovali hlboko pod spodnou referenčnou hodnotou pri všetkých odberoch vo všetkých skupinách. Metabolizmus zinku (Zn) súvisí s metabolizmom vitamínov A, D, B1 a B6 (Vrzgula a kol., 1990). Poruchy energetického metabolizmu (tab.č.3) patria medzi najzávažnejšie produkčné choroby. Príčiny týchto porúch sú v úzkom vzťahu s kŕmnym režimom a inými etiopatogenetickými faktormi, ako sú choroby gastrointestinálneho traktu, parazity, poruchy funkčnej činnosti pečene, obličiek a centrálnej nervovej sústavy (Ammerman C. B. a kol., 1998). 105 Analýzou výsledkov enzymatického a hepatálneho profilu v sére odstavčiat (tab.č.4) sme zistili, že aktivita AST mala vo väčšine prípadov klesajúcu tendenciu. AST sa nachádza predovšetkým v bunkách pečene, srdcového svalu a je lokalizovaný tak v cytoplazme, ako aj v mitochondriách. ALT je cytoplazmatický enzým, lokalizovaný najmä v hepatocytoch. Aktivita tohto enzýmu v sére odstavčiat mala v skupinách, kde boli podávané homeopatické prípravky, teda v skupinách A1 a B1, klesajúcu, respektíve ustálenú hladinu. Namerané hodnoty však boli v hornej hranici RH, alebo ju mierne prekračovali. Hodnoty GGT, enzýmu viazaného na bunkové membrány, sa zvyšujú pri enteritídach (Košťálová a Siveková, 1993). ALP sa vyskytuje takmer vo všetkých orgánoch a tkanivách, i v erytrocytoch a leukocytoch. Hladiny ALP sa počas celého experimentu pohybovala vo fyziologickom rozpätí, výnimku tvorí skupina A1 v druhom odbere, kde nameraná hodnota bola nižšia ako je udávaná RH 1,9 µkat/l. Hladina ALP sa zvyšuje pri zápalových črevných ochoreniach a malabsorpčnom syndróme. LDH sa nachádza hlavne vo svalovine, pečeňových bunkách a obličkách. Vo všetkých odberoch a vo všetkých skupinách aktivita tohto enzýmu výrazne prekračovala hornú hranicu RH, čo naznačuje zvýšenú stresovú záťaž u odstavčiat. Celkový bilirubín (Bi) vo väčšine odberov prekračovala hornú hranicu 5,13 µmol/l. Analýza výsledkov dusíkatého a bielkovinového profilu v sére odstavčiat (tab.č.5) ukázala, že koncetrácia CB nedosahovala referenčné hodnoty 70 – 90 g/l. Počas celého experimentu pretrvávala mierna hypoproteinémia. Nedostatok bielkovín v kŕmnej dávke, resp. pri ich syntéze má za následok zníženie úžitkovosti, zhoršenie obranných reakcií organizmu, poruchy v procese trávenia (tab.č.6), endokrinného a nervového systému, stresu. Ich deficit je spôsobený nedostatočným prísunom stráviteľných dusíkatých látok, celkového množstva a kvality v kŕmnej dávke (Fehse a kol., 2000). Na zdravotný stav zvierat majú vplyv faktory prostredia pri chronických zápaloch v jednotlivých chovoch. sú to faktory vonkajšieho prostredia, technológia ustajnenia a kŕmenia, hygiena pôrodu, technológia dojenia, regionalizácia podľa chovateľských podmienok, stresové faktory. Nie menej významné faktory vnútorného prostredia, metabolické poruchy a orgánové poruchy(Straw a kol. 2003) Záver Záverom experimentu bolo overenie teórie biochemicko – homeopatickej regulácie metabolizmu, ktorého výsledkom je súhrn analýz látkového metabolizmu a homeostázy 106 u odstavčiat po perorálnej aplikácii homeopatických prípravkov BOIRON 69110 Sainte-FoyLés-Lyon šarža SL 133 58 a 133 59 a porovnanie so skupinami kontrolných odstavčiat. Zistili sme že prípravky: • neovplyvnili hematologický profil, zvýšené hladiny Lc vo všetkých odberoch a skupinách poukazujú na zvýšenú aktivitu imunitného systému • neovplyvnili mikro a makrominerálny profil, počas celého experimentu pretrvávala výrazná hypozinkémia vo všetkých skupinách a odberoch, čo bolo zapríčinené deficitom prísunu zinku v kŕmnej dávke • neovplyvnili energetický profil, koncentráciu glukózy a TCH • enzymatický a hepatálny profil bol v skupinách A1 a B1 vyrovnanejší a ustálenejší, čo pozitívne ovplyvnilo celkový zdravotný stav • neovplyvnili dusíkatý a bielkovinový profil • priaznivo ovplyvnili zdravotný stav v skupinách A1 a B1, kde nedošlo k úhynom a zabránili výskytu diarrhoického syndrómu; v skupinách A2 a B2 došlo k výskytu hnačiek a úhynu v skupine B2 • priaznivo ovplyvnili hmotnostné prírastky v skupinách A1 a B1 Homeopatický liek je nositeľom informácie, ktorej prenesenie do organizmu navodí stimuláciu vlastných obranných mechanizmov. Pre predstavu je možné homeopatický liek prirovnať ku katalyzátoru, alebo ku špecifickému imunomodulátoru (Busserová a kol., 2006). Tým by mohol byť vysvetlený účinok homeopatického prípravku na odstavčatá bez výrazného vplyvu na metabolický profil. Dosiahnuté výsledky poukazujú na priaznivý vplyv podávania testovaných homeopatických prípravkov na zdravotný stav odstavčiat a odporúčame ich pre praktické využitie vo farmových chovoch ako alternatívnu náhradu suplementácie medikovaných kŕmnych zmesí antibiotikami, chemoterapeutikami a sulfonamidmi. Literatúra AMMERMAN, C. B., HENRY, P. R., LEWIS, A. J.: Supplemental organically – bound mineral compounds in livestock nutrition. In: Recent Advances in Animal Nutrition, 1998, 67 – 91 BUSSEROVÁ, M., CHEFDEVILLE, F., COUSIN, J.M., DESOBEAU, P., LAMBERT, J., MARCKEL, J., MOUGUEZOVÁ.: Homeopatické memento- Od symptómu k Materii medike, CEDH INTERNATONAL, ISBN 80-969483-9-3,2006, 220-230. DEMARQUE, D.: Homeopatie, Experimentální medicína.Nakladatelsví Boiron,2005, ISBN 2-95216-008-2, 273-299 FEHSE, R., CLOSE, W. H.: The effect of the addition of organic trace elements on the performance of a hyperprolific sow herd. In: Biotechnology in the Feed Industry. Edited by T. P. Lyons and K. A. Jaques. Nottingham University Press, Nottingham, 2000, 309 – 325 107 ISSAUTIER, M.N., CALVET, H.: Veterinární homeopatická terapie, Editions BOIRON, nakladatelství VODNÁŘ, 1993, ISBN 80-85255-28-6, 274-305 KOŠŤÁLOVÁ, D., SIVEKOVÁ, D.: Homeopatia a prírodné liečivá, Homeopatiká rastlinného a živočíšneho pôvodu. Príroda, Bratislava, 1993, ISBN 80-07-00524-2, 207-223 RAMAKRISHNAN, A.,U., COULTEROVÁ, C., R.: Homeopatický přístup k léčbě rakoviny. Alternativa, 2005, ISBN 80-85993-99-6, 22-35 STRAW, B., E., D´ALLAIRE, S., MENGELING, W., L., TAYLOR, D., J.: Choroby ošípaných, Nemoci prasat, Hajko & Hajková, Bratislava,2003, ISBN 80-88700-58-2 LOCKIE, A.: Encyklopédia homeopatie, Perfekt, 2002, 45 - 66 VRZGULA, L.a kol.: Poruchy látkového metabolizmu hospodárskych zvierat a ich prevencia,1990,169– 198 Experiment bol realizovaný za pomoci grantových agentúr: VEGA pod číslom 1/3487/06 a APVV 20-06 tab. č.1 Štatistické výsledky hematologického profilu A1 – A2 a < 0,05 Hb Ec Hk Lc Štatistické výsledky makro a mikrominerálneho profilu tab. č 2 MCV 1. odber + + + - - 2. odber - - - - - 3. odber - - - + - B1 – B2 a < 0,05 Hb Ec Hk Lc MCV 1. odber - - - - - 2. odber - - - + - 3. odber - - - + - Štatistické výsledky energetického profilu A1 - A2 a < 0,05 Ca Mg P Na K Fe Zn 1. odber - - - - - + - 2. odber - - - - - - - 3. odber - - - - - - - Zn B1 – B2 a < 0,05 Ca Mg P Na K Fe 1. odber - - - - - + - 2. odber - - - - - - - 3. odber - - - - - - - Štatistické výsledky enzymatického profilu tab.č.3 tab.č.4 A1 – A2 a < 0,05 Gluk TCH 1. odber - - 2. odber - A1 – A2 a < 0,05 AST ALT GGT ALP LDH Bi 1. odber - - - - - + 2. odber + - - + - - 3. odber + + - + - + B1 – B2 a < 0,05 AST ALT GGT ALP LDH Bi - 3. odber - - B1- B2 a < 0,05 Gluk TCH 1. odber - - 2. odber - - 1. odber - - + - - - - 2. odber - - + + + + 3. odber + - + + - - 3. odber - tab.č.5 tab.č.6 Štatistické výsledky bielkovinového profilu A1 – A2 a < 0,05 CIg CB Alb Creat Urea 1. odber - - - - - Výskyt hnaciek a úhyn odstavciat A1 A2 B1 B2 hnacka ks 2 4 3 5 2. odber - - - - - 3. odber - - - - - hnacka % 28,5 57,0 42,8 71,4 B1 – B2 a < 0,05 CIg CB Alb Creat Urea úhyn ks 0 0 0 1 1. odber + - - - - úhyn % 0 0 0 14,3 2. odber - - - - - 3. odber - - - - - 108 DIAGNOSTIKA DEDIČNÉHO OCHORENIA POLYCYSTICKÉHO OCHORENIA OBLIČIEK /PKD/ U MAČIEK DNA TESTOM NA SLOVENSKU. DIAGNISTICS OF HEREDITAR DISEASE – FELINE POLYCYSTIC KIDNEY DISEASE USING DNA TEST IN SLOVAKI Jakabová D.1, Židek R.1, Trandžík J.1, Rajtarová K.1, Massányi P.2, Haško M.1, Kozlík P.1, Buleca J. Jr.3, Ryba Š.1 Štátny plemenársky ústav SR, Nitra, 2 Slovenská poľnohospodárska univerzita, Nitra, 3 Univerzita veterinárneho lekárstva, Košice 1 Abstract: Feline polycystic kidney disease (PKD) is autosomal dominant disease,that causes the formation of fluid-filled renal cysts, often leading to renal failure. That disease is most diagnosed by ultrasound, but 98% accurate is after approximately 10 month of age. A genetic test for feline PKD will provide breeders with an efficient and accurate means to selectively breed their cats and remove PKD from the population. PKD is most common in the Persian breed and breeds that are related to Persians or have used them in their breeding programs. In our report, feline PKD1 gene was screened for transversion C>A, causing a stop codon (OPA) in exon 29 (Lyons et al., 2004), in Slovak different breeds of cats. This mutation has identified in the heterozygous state in 23 affected cats, including Persian and Exotic breeds. The causative mutation has not observed in SBI, SIB, BRI breeds. Úvod: Vo veterinárnej literatúre sa ochorenie PKD spomína približne už 30 rokov, pričom sa charakterizuje ako pomalé progresívne ireverzibilné dedičné ochorenie obličiek, s autozomálne dominantným typom dedičnosti. Podstatou tohto ochorenia je zväčšenie obličiek s následnou renálnou dysfunkciou (Eaton et al.,1997). Mnohopočetné cysty sú detegované už od narodenia a ich pomalý rast spôsobuje zväčšenie obličiek a postupne redukuje ich funkciu. Cysty majú rôzny tvar a veľkosť, a to od 1 mm až po 1 cm. Čím je postihnuté zviera staršie, tým rastie počet cýst aj ich veľkosť. Cysty sa môžu vyskytovať nielen v obličkách, ale v iných orgánoch, hlavne v maternici a v pečeni. Klinické príznaky PKD sú nešpecifické – je to poväčšine depresia, anorexia alebo inapetencia, polyúria, polydypsia a strata hmotnosti. Najskoršia diagnostika ultrasonografickým vyšetrením je možná vo veku 7 týždňov, nakoľko sú však cysty veľmi malé, môže byť nepresná (Beck, 2001). 109 K eliminácií PKD prispieva skorá diagnostika postihnutých jedincov. Majitelia mačiek, hlavne perských a exotických ale i plemien, kde bolo povolené prikríženie perzských mačiek, ako sú britské mačky, kartúzske, burmily, birmy, ragdoll, cornish rex, devon rex (Eaton et al., 1997), by mali byť informovaný o dedičnosti tohoto ochorenia a postupnom nástupe príznakov. Toto ochorenie sa môže objaviť objaviť i u iných plemien, ale tu je už nižšie riziko výskytu PKD. Keďže postihnutá mačka môže žiť roky bez akýchkoľvek problémov jedinou spoľahlivou metódou diagnostiky sa stáva DNA test. Materiál a metódy: V našej analýze sme vyšetrili 122 jedincov patriace k plemenám exotické, perzské, sibírske a birma. DNA sme izolovali z periférnej krvi pomocou Wizard kitu (Promega). PCR reakciu sme uskutočňovali pomocou primerových sekvencií (Lyons et al., 2004) a cykléra (PTC 200). Amplifikačný produkt o dĺžke 559 bp sme štiepili restrikčnou endonukleázou MLY 1 po dobu 4 hodín pri teplote 370C, ktorý sa v prítomnosti tranzverzie (mutácie) štiepi na dva fragmenty o dĺžke 316 a 243 bp (Obr.1). Obr.1 Rozdelenie PCR produktov na 2% agarózovom géli štiepených restrikčnou endonukleázou MLY 1 1 2 3 4 5 6 7 1, 7 100 bp veľkostný štandard 2, 3 N/n – postihnutý jedinec fragmenty (559, 316, 243 bp) 4, 5, 6 N/N – zdravý jedinec fragment neštiepený 559 bp Fragmenty sme následne separovali na 2% agarózovom géli farbenom Gold View (SBS Genetech). Ako pozitívna vzorka nám slúžila DNA od postihnutého zvieraťa ochorením PKD. 110 Výsledky a diskusia V našej práci sme optimalizovali metódu DNA testu pre vyšetrenie ochorenia PKD v našom laboratóriu. Pri skríningu plemien mačiek EXO, PER, SIB, SBI, BRI na dané ochorenie, a to o počte 122 jedincov sme detegovali prítomnosť uvedeného ochorenia u 23 jedincov plemien EXO a PER (tab.1). V našej práci sme potvrdili, že uvedené ochorenie sa vyskytuje predovšetkým u týchto plemien podobne ako opisujú výskyt PKD aj iní autori (Barthez et al., 2003, DiBartola, 2000, Beck et al.,2001, Barrs et al., 2001). Uvedená metóda DNA testu môže slúžiť na diagnostické účely a tak zabezpečiť účinnú selekciu postihnutých zvierat už v ranom štádiu, ktoré sú využívané v plemenitbe. Preto základom eliminácie je nezaraďovanie takýchto jedincov do chovu, prípadne ich kastrácia alebo sterilizácia. Tab. 1 Prehľad počtu postihnutých jedincov PKD (genotyp N/n) a zdravých jedincov (genotyp N/N) v závislosti od plemena. Plemená sú označené systémom EMS. Plemeno mačiek Výsledok DNA testu Počet jedincov EXO (Exotická) Exotic N/N 24 EXO (Exotická) Exotic N/n 8 BRI (Britská) British Shorthair N/N 5 BRI (Britská) British Shorthair N/n 0 PER (Perzská) Persian N/N 62 PER (Perzská) Persian N/n 15 SBI (Birma) Sacred Birman N/N 2 SBI (Birma) Sacred Birman N/n 0 SIB (Sibírska) Siberian N/N 6 SIB (Sibírska) Siberian N/n 0 Zoznam literatúry: Barrs V.R., Gunew M. (2001): Prevalence of autosomal dominant polycystic kidney disease in Persian cats and related –breeds in Sydney and Brisbane. Austr Vet 79, 257-259. Barthez P.Y., Rivier P., Begon D. (2003): Prevalence of polycystic kidney disease in Persian and Persian related cats in France. J. Feline Med Surg 5, 345-347. Beck C., Lavelle R.B.(2001): Feline polycystic kidney disease in Persian and the other cats. A prospective study using ultrasonography. Aust Vet J 79, 181-184 DiBartola S.(2000): Autosomal dominant polycystic kidney disease. Proceedings of the 18 th Annual Veterinary Internal Medical Forum of the American College of Veterinary Internal Medicine, 438-440. Eaton K.A., Biller D.S., DiBartola S.P., Radin M.J., Wellman M.L. (1997): Autosomal dominant polycystic kidney disease in Persian and Persian –cross cats. Vet Pathol 34, 117-126. 111 Lyons A. L., Biller D.S., Erdman C.A., Lipinski M.J., Young A.E., Roe B.A., Qin B., Grahn R.A.(2004): Feline polycystic kidney disease mutation identified in PKD1, J.Am.Soc. Nephrol 15, 2548- 2555. Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy č.APVV-20-063205 ŤAŽKÉ KOVY A ŠTRUKTÚRA SEMENNÍKOV A MATERNICE APODEMUS FLAVICOLLIS Z OBLASTI JADROVEJ ELEKTRÁRNE HEAVY METALS AND STRUCTURE OF TESTES AND UTERUS OF APODEMUS FLAVICOLLIS FROM AREA OF NUCLEAR POWER STATION 1 Jančová, A., 2Massányi, P., 3Drábeková, J. 1Katedra zoológie a antropológie, UKF, Nábrežie Mládeže 91, 949 01 Nitra, [email protected] fyziológie živočíchov, SPU, Tr. A. Hlinku 2, 949 01 Nitra 3Katedra matematiky, SPU, Tr. A. Hlinku 2, 949 01 Nitra 2Katedra Abstract In testes and uterus of individuals Apodemus flavicollis coming from vicinity of nuclear power station Mochovce there was an AAS method used to discover relatively low average concentrations of Cu, Fe, Mn, Zn and Cd. Copper, zinc and cadmium were accumulated in higher level in testes when compared with uterus. The levels of iron and manganese were higher in uterus. Microscopically picture of testes showed normally formed structures without pathological changes, what was also confirmed by quantitative morphometric analysis. Relative volume of epithelium of Apodemus flavicollis is 67.552 %, lumen was 24.688 % and stroma 7.760 %. The tubular diameter was 142.5 µm. An average number of sperm elements on the surface of the sample 10 000 µm2 was 90.53. In the yellow-necked mouse the relative volume of the endometrium is 61.5045 % and of the myometrium 38.4955 %, the stroma forms the highest relative volume (83.515%). The relative volume of surface epithelium is 13.651% and glandular epithelium forms 2.834%. The results of analysis indicate that vicinity of nuclear power station Mochovce is not highly contaminated with heavy metals and it is not risky for health condition of small mammals. Key words: heavy metals, cadmium, copper, iron, manganese, zinc, Apodemus flavicollis, testes, uterus 112 Úvod Účinky ťažkých kovov na drobné cicavce boli študované v rozličných situáciách. Laboratórne experimenty realizovali KRAMÁROVÁ et al. (2000), LUKÁČ et al. (2004). Jedince z prostredia so silným priemyselným znečistením analyzovali GDULA-ARGASIŃSKA et al. (2004), DAMEK-POPRAWA & SAWICKA-KAPUSTA (2004), JANČOVÁ et al. (2006). Množstvo prác je zo sídelných aglomerácií, pre ktoré je charakteristická vysoká záťaž emisiami z dopravy (IERADI et al., 1996; KOMARNICKI, 2000). Pre lepšie poznanie a pochopenie vplyvu ťažkých kovov na biologické systémy je potrebné získať čo najviac informácií o ich pohyblivosti a akumulácii v konkrétnych ekosystémoch. Dôležitou súčasťou skúmania vplyvu emisií na živočíšny organizmus je aj patologicko-anatomické a histologické posúdenie zmien parenchymatóznych orgánov (GÁLOVÁ et al., 2001). Najmä obličky, pečeň a pohlavné orgány, sú mimoriadne senzitívne a už pri určitej záťaži a nízkej toxicite vykazujú štruktúrne zmeny alebo funkčné poruchy. Cieľom práce je zistiť koncentrácie ťažkých kovov v orgánoch Apodemus flavicollis a vykonať kvantitatívnu analýzu mikroskopickej štruktúry semenníkov a maternice. Materiál a metodika Analyzované vzorky boli odobraté zo semenníkov a maternice ryšavky žltohrdlej (Apodemus flavicollis, Rodentia). Jedince boli získané pomocou teriologických metód z lesného prostredia v blízkosti Jadrovej elektrárne Mochovce. Boli adultné, v dobrej telesnej kondícii a neboli pozorované žiadne chorobné procesy ani patologicko-anatomické zmeny. Koncentrácie Cu, Fe, Mn, Zn a Cd boli stanovené pomocou metódy atómovej absorpčnej spektrofotometrie. Koncentrácie jednotlivých prvkov boli prepočítané a vyjadrené v mg.kg-1. Histologické preparáty boli zhodnotené subjektívne a následne kvantitatívne pomocou mikrofotografií, s využitím morfometrických metód (UHRÍN & KULÍŠEK, 1980). V semenníkoch sme zhodnotili relatívny objem (%) semenotvorného epitelu, lumenu a intersticiálneho väziva, priemer semenotvorných kanálikov a počet spermatogénnych elementov na jednotke plochy. V maternici sme kvantifikovali relatívny objem (%) endometria a myometria a v endometriu relatívny objem (%) epitelu, žliaz a väziva. Zo získaných kvantitatívnych hodnôt sme vypočítali základné variačno-štatistické ukazovatele a určili korelačné koeficienty. 113 Výsledky Koncentrácia medi, železa, mangánu, zinku a kadmia v semenníkoch a maternici Apodemus flavicollis z oblasti Jadrovej elektrárne Mochovce je uvedená v tab. 1. Najvyššie hladiny akumulácie boli zistené pri železe. Koncentrácie kadmia a mangánu boli nízke. Meď, zinok a kadmium sa vo väčšej miere akumulovali v semenníkoch v porovnaní s maternicou. Hladiny železa a mangánu boli vyššie v maternici. Subjektívnym posúdením mikroskopických preparátov semenníkov A. flavicollis sme pozorovali normálne utváraný semenotvorný epitel, obsahujúci všetky vývojové štádiá pohlavných buniek. Kanáliky boli oválne, na ich stenách neboli pozorované žiadne zmeny. Tab. 1 Koncentrácia vybraných prvkov v semenníkoch a v maternici A. flavicollis Orgán Prvok Cu (mg.kg-1) Fe (mg.kg-1) Mn (mg.kg-1) Zn (mg.kg-1) Cd (mg.kg-1) 3,9413 239,2250 0,0013 77,4903 0,0090 sd 3,4672 80,6869 0,0005 72,2332 0,0034 min 0,0440 168,6000 0,0010 39,6300 0,0040 max 8,4870 355,0000 0,0020 185,800 0,0110 med 3,6170 216,6500 0,0010 42,2655 0,0105 0,0077 471,7333 0,0103 51,6000 0,0077 sd 0,0015 287,8126 0,0162 27,7230 0,0015 min 0,0060 221,8000 0,0010 29,4500 0,0060 max 0,0090 786,4000 0,0290 82,6900 0,0090 med 0,0080 407,0000 0,0010 42,6600 0,0080 Semenníky Maternica x - priemerná hodnota; sd - smerodajná odchýlka; min – minimálna nameraná hodnota; max – maximálna nameraná hodnota; med – medián Priestor medzi kanálikmi vypĺňalo úzke intersticiálne tkanivo, v ktorom sa nachádzali krvné cievy rôznej veľkosti. V semenníku A. flavicollis je zárodočný epitel zastúpený 67,552 %, lumen 24,688 % a väzivo 7,760 % (tab. 2). Priemer semenotvorných kanálikov bol 142,5 µm. Priemerný počet spermatogénnych elementov na ploche preparátu 10 000 µm2 bol 90,53. 114 Tab. 2 Relatívny objem zárodočného epitelu, väziva a lumenu v semenníkoch A. flavicollis x ±s v% Epitel (%) 76,903 4,912 6,389 Väzivo (%) 8,311 1,573 18,909 Lumen (%) 14,786 5,985 40,434 Priemer kanálika (µm) 142,500 30,525 22,569 x – priemer, ±s – smerodajná odchýlka, v% - variačný koeficient Zaznamenali sme silný negatívny korelačný vzťah medzi relatívnym objemom zárodočného epitelu a lumenom kanálikov A. flavicollis (-0,904). Znamená to, že zväčšovaním objemu epitelu sa zmenšuje objem lumenu. Epitel a väzivo sú v silnom negatívnom vzťahu a lumen s väzivom v slabom pozitívnom korelačnom vzťahu (tab. 3). Tab. 3 Korelačné koeficienty medzi epitelom, lumenom, väzivom a priemerom kanálikov semenníkov A. flavicollis Epitel Epitel Lumen Väzivo ∅ kanálika 1,000 -0,904 -0,591 0,758 1,000 0,191 -0,564 1,000 -0,677 Lumen Väzivo ∅ kanálika 1,000 Medzi priemerom lumenu kanálika a zárodočným epitelom A. flavicollis existuje silná pozitívna korelačná závislosť (0,758). Medzi priemerom kanálika a väzivom je silný negatívny vzťah (-0,677), čiže zvýšením priemeru kanálika sa podstatne zníži jeho väzivo. Silne negatívne závislý je vzťah medzi priemerom kanálika semenníka a jeho lumenom (0,564), zvýšením priemeru sa zníži jeho lumen. Tab. 4 Percentuálne zastúpenie hlavných zložiek maternice A. flavicollis x ±s v% Endometrium (%) 61,5045 7,172 11,661 Myometrium (%) 38,4955 7,172 18,631 Epitel endometria (%) 13,651 4,875 35,710 Žľazy endometria (%) 2,834 1,121 39,572 Väzivo endometria (%) 83,515 5,996 7,179 x – priemer, ±s – smerodajná odchýlka, v% - variačný koeficient 115 Stenu maternice tvorilo normálne formované endometrium a myometrium. Na povrchu endometria sa nachádzal povrchový epitel. V riedkom väzive sa vyskytovali maternicové žľazy. Endometrium tvorilo 61,5045 % a myometrium 38,4955 % (tab. 4). V endometriu sme rozlíšili tri zložky: povrchový epitel, väzivo a žľazy. Najvýraznejšie zastúpenie malo väzivo (83,515%), nasledoval epitel (13,651%) a najnižší podiel mali žľazy (2,834%). Diskusia Hladiny kovov, ktoré boli zistené v samčích aj samičích pohlavných orgánoch Apodemus flavicollis sú pomerne nízke. Stopové množstvá vysoko rizikového prvku kadmia (0,0090 mg.kg-1; 0077 mg.kg-1) svedčia o nízkej kontaminácii oblasti týmto xenobiotikom. V orgánoch a v tele drobných zemných cicavcov rodov Apodemus, Clethrionomys, Microtus, Peromyscus sa priemerné koncentrácie Zn pohybujú v intervale 22,1 – 309 mg.kg-1 a priemerné koncentrácie Cu v intervale 0,4 – 23,7 mg.kg-1 (ŠUMBERA et al., 2003). Priemerná koncentrácia Zn v semenníkoch (77,4903 mg.kg-1) a aj v maternici (51,600 mg.kg-1) ryšavky žltohrdlej sa nachádza v blízkosti spodnej hranice publikovaného intervalu. Koncentrácia Cu v semenníkoch dosiahla opäť nízku hodnotu (3,9413 mg.kg-1) a v maternici to bolo len stopové množstvo (0,0077 mg.kg-1). V oblasti so silne narušenými zložkami životného prostredia boli v semenníkoch a v maternici A. flavicollis zistené vyššie hladiny Fe (259,143 mg.kg-1; 618,5 mg.kg-1) a aj Mn (0,171 mg.kg-1; 2,272 mg.kg-1) (JANČOVÁ et al., 2006). Mikroskopický obraz semenníkov a maternice ukázal neporušené štruktúry. Neboli pozorované žiadne patologické procesy a kvantitatívne ukazovatele korešpondujú s prácami viacerých autorov. BÁBIKOVÁ et al. (2006) pre potkany línie Wistar uvádzajú, že semenotvorný epitel tvoril 72,50 %, lúmen kanálika 11,49 % a inresticiálne väzivo 16,03 %. Podľa TOMANA et al. (2006) je relatívny objem semenotvorného epitelu potkanov 77,49 %, myší 79,95 % a chrčkov 72,48 %. Relatívny objem semenotvorného epitelu laboratórnych myší je 89,13 %, interstícium 10,87 % a priemer kanálikov 272,06 µm (LUKÁČ et al., 2006). MASSÁNYI et al. (1997) uvádzajú, že počas roku sa relatívny objem semenotvorného epitelu zajaca poľného pohyboval v rozmedzí 57,34 - 73,38 %, väziva od 6,33% do 34,03% a lumenu od 8,63 % do 24,16 %, v závislosti od mesiaca (sezóny), t.j. pohlavnej aktivity. Priemer semenotvorných kanálikov chrčkov je 166,24 µm (TOMAN et al., 2006), holandských králikov 196 – 206 µm (PAUFLER & FOOTE, 1969), potkana 253,6 µm (MASSÁNYI et al., 1991), králika 118,69 µm (TOMAN, 1994). Z toho vyplýva, že priemer 116 výrazne kolíše v závislosti od druhu, ale že existuje i veľká vnútrodruhová variabilita. V epiteli lišiaka obyčajného sa nachádza v priemere 49,37 ± 6,73 spermatogénnych buniek na 10 000 µm2 (MASSÁNYI et al., 1996b). MASSÁNYI (1996a) zistil u králikov nasledujúce zastúpenie: endometrium 48,73 % a myometrium 51,27 %. Epitel endometria predstavoval 5,87 %, žľazy 5,78 % a väzivo 88,35 %. U zajaca poľného endometrium formuje stenu maternice v rozmedzí 22,86 % - 43,05 % a myometrium 56,95 % - 77,14 % (MASSÁNYI & TOMAN, 1997). Analýza endometria ukázala, že povrchový epitel sa pohybuje v rozmedzí 3,06 - 9,45 %, žľazový epitel 8,55 - 35,4 % a najvýraznejšie je zastúpené väzivo tvoriace 61,32 - 88,39 % relatívneho objemu endometria. Záver V semenníkoch a maternici jedincov Apodemus flavicollis pochádzajúcich z okolia Jadrovej elektrárne Mochovce boli pomocou metódy AAS zistené pomerne nízke priemerné koncentrácie Cu, Fe, Mn, Zn a Cd. Meď, zinok a kadmium sa vo väčšej miere akumulovali v semenníkoch v porovnaní s maternicou. Hladiny železa a mangánu boli vyššie v maternici. Mikroskopický obraz semenníkov aj maternice ukázal normálne formované štruktúry, bez patologických zmien, čo potvrdila i kvantitatívna morfometrická analýza. Výsledky analýz naznačujú, že okolie Jadrovej elektrárne Mochovce nie je vysoko kontaminované ťažkými kovmi a nie je zdravotne rizikové pre drobné cicavce. Poďakovanie Práca bola finančne podporená grantovým projektom VEGA 1/2364/05 a CGA VI/2/2006. Literatúra BÁBIKOVÁ, L., TOMAN, R., HLUCHÝ, S., MASSÁNYI, P., LUKÁČ, N., GOLIAN, J., ŠIŠKA, B., 2006: Rizikové faktory potravového reťazca. SPU Nitra, 42 – 44. DAMEK-POPRAWA, M., SAWICKA-KAPUSTA, K., 2004: Environmental Research 96, 72 – 78. GÁLOVÁ, J., UHRÍN, V., PIVKO, J., PAVLÍK, V., GALLO, M., 2001: Zb. prác z medzinárodnej vedeckej konf. „Rizikové faktory potravového reťazca“. SPU Nitra, s. 34-36. GDULA-ARGASIŃSKA, J., APPLETON, J., SAWICKA-KAPUSTA, K., SPENCE, B., 2004: Environmental Pollution 131, 71 – 79. IERADI, L.A., CRISTALDI, M., MASCANZONI, D., CARDARELLI, E., GROSSI, R., CAMPANELLA, L., 1996: Environmental Pollution 92, 3, 323 – 328. JANČOVÁ, A., MASSÁNYI, P., NAĎ, P., KORÉNEKOVÁ, B., SKALICKÁ, M., DRÁBEKOVÁ, J., BALÁŽ, I., 2006: Ekológia 25, 1, 19 – 26. KOMARNICKI, G.J.K., 2000: Chemosphere 41, 1593 – 1602. KRAMÁROVÁ, M., MASSÁNYI, P., RENON, P., TOMAN, R., KOVÁČIK, J., 2000: Slov. Vet. čas., 25, 2: 108 – 110. LUKÁČ, N., BÁRDOS, L., MASSÁNYI, P., KRAMÁROVÁ, M., BULLA, J., TOMAN, R., STAWARZ, R., FORMICKI, G., 2006: Procs. Trace Elements in the Food Chain, Budapest, 384 – 388. 117 LUKÁČ, N., MASSÁNYI, P., TOMAN, R., SLÁDEČKA, A., 2004: Rizikové faktory potravového reťazca IV. Nitra: SPU, s. 155 – 159. MASSÁNYI, P., 1996a: VŠP Nitra, 70. MASSÁNYI, P., HLUCHÝ, S., LUKÁČ, N., SLAMEČKA, J., JURČÍK, R., 1996b: Chov zveri v meniacich sa spoločenských a ekologických podmienkach. Nitra VÚŽV, s. 259 - 261. MASSÁNYI, P., JANOVIČOVÁ, O., BAKITOVÁ, Ľ., PAŠKA, J., TOMAN, R., 1991: Poľnohospodárstvo, 37, 9 - 10, s. 830 - 848. MASSÁNYI, P., LUKÁČ, N., HLUCHÝ, S., SLAMEČKA, J., JURČÍK, R., 1997: Acta Sc. Nat. Brno, 31, 3 - 4, s. 60 - 66. MASSÁNYI, P., TOMAN, R., 1997: Záverečná správa, VÚŽV Nitra. PAUFLER, S.K., FOOTE, R.H., 1969: J. Reprod. Fert., 19, 309 – 319. ŠUMBERA, R., BARUŠ, V., TENORA, F., 2003: Folia Zool. 52, 2: 149 – 153. TOMAN, R., 1994: DDP, VŠP, Nitra, 153s. TOMAN, R., MASSÁNYI, P., LUKÁČ, N., BÁBIKOVÁ, L., CAPCAROVÁ, M., 2006: Rizikové faktory potravového reťazca. SPU Nitra, 311 – 317. UHRÍN, V., KULÍŠEK, V., 1980: Živočíšna výroba, 25,s. 935-942. Kontaktná adresa: RNDr. Alena Jančová, PhD., Katedra zoológie a antropológie, Nábrežie Mládeže 91, FPV UKF, 949 01 Nitra INDUKCIA ESTRU OVIEC KOMBINÁCIOU FLUOROGESTÓN ACETÁTU A EKVINNÉHO CHORIOVÉHO GONADOTROPÍNU V ANESTRICKEJ SEZÓNE INDUCTION OF OESTRUS IN ANOESTROUS EWES WITH COMBINATION FLUOROGESTONE ACETATE AND EQUINE CHORION GONADOTROPHINE Jankurová, J., Vlčková, R., Maraček, I., Halagan, J. Ústav fyziológie Katedry normálnej anatómie, histológie a fyziológie, UVL Košice Abstract In our study we followed the effect of combination Fluorogeston acetate (FGA) and differ doses of Equine chorion gonadotrophine (eCG) for induction of oestrus in anoestrous ewes. Blood samples (n=10) were taken to determine concentrations of hormones (progesterone, P4 and estradiol 17ß, E2). Every of experimental ewes were subsequently induced to oestrus with 40 mg of FGA per head/13 days (intravaginal sponges). After 8 days, we taken blood sampling and next five ewes (group 1) were treated with 500 IU eCG per head and to other five ewes (group 2) with 1000 IU eCG per head. Seven days after application of eCG blood samples were taken again to determine concentrations of P4 and E2 using RIA methods. There was no significance changes in hormones concentrations determined in blood samples in group 1 before even after treatment. Concentration of P4 was significantly decreased (P<0.05) and E2 was significantly increased (P<0.001) in group 2. From our results follow, that the combination of FGA and eCG can stimulate secretion of gonadotrophin and ovulation in anestrous ewes. 118 Úvod V súčasnej dobe sú najaktuálnejšie biotechnické metódy cielené na ovplyvnenie pohlavného cyklu. Stimuláciou a reguláciou nástupu a priebehu ruje (estru), spresnením doby ovulácie, vyvolaním superovulácie je možné (a) získať väčší počet embryí od geneticky najkvalitnejších jedincov (transfer embryí), (b) regulovať pohlavie potomstva, včasné zistenie výsledkov inseminácie, (c) riadenie nástupu a priebehu pôrodu, vedenie puerpéria a prevencia vzniku popôrodných komplikácií. Efektom týchto metód je zaistenie vyššej plodnosti a natality. K dosiahnutiu cieľa sa v praxi využívajú prirodzené metódy synchronizácie a indukcie estru (napr. vplyv barana - „ram effect“) (8), či farmakologické, aplikácia vhodnej dávky prípravkov na báze jednak progestagénov (2), jednak prostaglandínov. Prípadne je možné využiť aj vzájomnú kombináciu vplyvu barana a syntetického prípravku GnRH v určitej fáze reprodukčného cyklu samíc. Na základe získaných poznatkov a skúseností sa neustále rozvíjajú a zdokonaľujú tak, aby sa dosiahol maximálny efekt pri minimalizácii zásahov a použitia syntetických stimulačných prípravkov na báze steroidov bez narušenia úžitkových vlastností. Metódy riadenej reprodukcie nachádzajú čoraz väčšie uplatnenie aj pre plemená oviec chovaných v regiónoch Slovenska. Cieľom našej práce bolo overiť a porovnať vplyv Fluorogestón acetátu (FGA, syntetický gestagén) v kombinácii s rôznymi dávkami extrahypofýzového choriového gonadotropínu zo séra žrebných kobýl (500 IU, 1000 IU eCG) na hladiny progesterónu a 17βestradiolu pri indukcii estru oviec počas anestrickej sezóny. Materiál a metodika Do experimentu počas anestrickej sezóny (máj – jún) sme zaradili 10 oviec, u ktorých sme vykonali synchronizáciu a indukciu k estru pomocou intravaginálnych polyuretánových tampónov s obsahom 40 mg fluorogestón acetátu na kus (Chrono-gest, Intervet International B.V. Boxmeer, Holandsko ) po dobu 13-tich dní. Na 8. deň, ešte počas trvania účinku FGA v tampónoch, sme zvieratá rozdelili do dvoch skupín, 1. skupine bola aplikovaná intramuskulárne (i. m.) dávka 1000 IU (2 ml)/ks eCG, 2. skupine i.m. dávka 500 IU (1 ml) eCG/ks (Sergon, a.u.v., Bioveta a.s., Ivanovice na Hané, ČR). Vzorky krvi sme odobrali pred samotnou instiláciou tampónov (0. deň pokusu), pred aplikáciou eCG (8. deň pokusu) a po všetkých vykonaných zásahoch (15. deň pokusu). Krv sme centrifugovali pri otáčkach 2000 × g a pri teplote 4 °C po dobu 15-tich minút. Získané sérum bolo zmrazené do ďalšieho spracovania. Koncentrácie hormónov (progesterónu – P4 a 17β-estradiolu – E2 sme stanovili v krvnom sére oviec rádioimunologickou analýzou komerčnou súpravou RIA Progesterone, 119 RIA Estradiol (Immunotech Sa, Beckman Coulter Company, Marseille Cedex, France). Získané výsledky sme spracovali a štatisticky vyhodnotili Studentovým t-testom. Výsledky Analýza výsledkov prvej pokusnej skupiny nám ukázala, že došlo k zvýšeniu koncentrácií progesterónu v krvnom sére oviec na 8. deň od aplikácie intravaginálnych tampónov ale aj na 15. deň pokusu, teda 7 dní po podaní 1000 IU eCG. Tieto zmeny však boli nesignifikantné. U druhej skupiny ošetrenej kombináciou FGA a 500 IU eCG sme zaznamenali na 8. deň po aplikácii FGA nesignifikantný vzostup hladín progesterónu, štatisticky významný pokles však vykazoval P4 7 dní po podaní eCG (15. deň) (Graf 1). Koncentrácie estradiolu u prvej skupiny nevykazovali 8. deň od aplikácie tampónov výrazný vzostup v porovnaní s 0. dňom, kontrolným odberom. Došlo k nemu až 7 dní po podaní 1000 IU eCG, zmeny opäť nevykazovali signifikanciu. U druhej skupiny sme 8 dní po aplikácii FGA zaznamenali nevýrazný pokles hladín estradiolu oproti koncentráciám zisteným v 0. deň, pred samotnou aplikáciou tampónov. Signifikantný nárast hladín E2 sme zistili po 7. dňoch od podania 500 IU eCG (Graf 2). Graf 1 Hladiny progesterónu po ošetrení oviec kombináciou: FGA a 1000 IU eCG (1. sk) a FGA a 500 IU eCG (2. sk) ng/ml P4 3,5 3 1.sk 2.sk * P < 0,05 * 2,5 2 1,5 * 1 0,5 0 0. de ň 8. deň 15. de ň dni pokusu Graf 2 Hladiny estradiolu po ošetrení oviec kombináciou: FGA a 1000 IU eCG (1. sk) a FGA a 500 IU eCG (2. sk) 120 E2 pg/ml 160 1.sk 2.sk 140 * P < 0,001 * 120 * 100 80 60 40 20 0 0. deň 8. deň 15. deň dni pokusu Diskusia Pre ovce v našich klimatických podmienkach je charakteristická pohlavná sezónnosť, pričom fertilná ruja sa vyskytuje koncom leta a začiatkom jesene. zvolených Aplikácia vhodne prípravkov na synchronizáciu a indukciu ruje umožňuje u oviec vyvolať plnohodnotnú ruju takmer počas celého roka. Túto skutočnosť skrátenia anestrickej sezóny využíva čoraz viac chovateľov. Metódy na báze progestagénov využívajú účinok progesterónu prípadne jeho analógov, kde stupeň získanej synchronizácie a interval medzi skončením ošetrenia a začiatkom ruje závisí od použitého farmaka (3). Podávanie progestínov alebo látok blokujúcich produkciu GnRH (hypofýzové inhibítory) pracuje na princípe blokovania produkcie FSH a oddialenia dozrievania folikulov, ruje a ovulácie skôr než prebehne regresia periodického žltého telieska – predlžovanie luteálnej fázy cyklu. Pohlavný cyklus je dočasne a reverzibilne potlačený a po prerušení medikácie sa uvoľní jeho blokujúci účinok na hypotalamo – hypofýzovo – ovariálny systém a cyklus pokračuje. Progestagény môžu byť aplikované v rôznej forme – vaginálne tampóny, implantáty a pod., rôznymi spôsobmi – intravaginálne, intramuskulárne (i.m.), subkutánne (s.c.) a v rôznych dávkach (1, 5, 6, 7). Výhodou polyuretánových tampónov je ich ľahká aplikácia a poskytujú nám spoľahlivé výsledky po prirodzenom pripúšťaní alebo umelej inseminácii (9). Po ich odstránení je vhodná injekcia eCG, ktorého dávka musí byť prispôsobená plemenu, váhe, sezóne, stádu, veku a fyziologickému stavu zvierat. O gonadotropínoch je známe, že indukujú ovuláciu anestrických oviec. Tá však obyčajne nie je sprevádzaná estrom- rujou. Ak ošetreniu predchádza podanie progesterónu, ovulácia je sprevádzaná estrom. V praxi sa 121 zaužívala vhodná kombinácia tampónov po dobu 12 - 13 dní a injekčné podanie eCG, počas anestrickej sezóny vo vyššej dávke (400 – 600 IU) v porovnaní s dávkou počas chovnej sezóny (300 – 500 IU) (3, 4). Nami dosiahnuté výsledky sú v súlade s literárnymi údajmi, ktoré uvádzajú ako vhodnú i nami použitú dávku 500 IU eCG (7) . Po aplikácii tejto kombinácie dochádza k štatisticky významným dynamickým zmenám koncentrácií sledovaných hormónov v krvnom sére oviec. Pokles P4 (regresia CL) stimuluje sekréciu E2 a rast folikulov, odstránením negatívnej spätnej väzby vplyvu P4 na hypotalamus nastáva znovu uvoľnenie GnRH vo vyšších amplitúdach, čo spôsobí uvoľnenie FSH a LH vo vyšších koncentráciách a podporí sa vývoj folikulov. Stúpa produkcia E2, pri dosiahnutí jeho prahovej úrovne nasleduje uvoľnenie veľkého množstva LH (LH pík) a nasleduje plnohodnotná ovulácia. Koncentrácie E2 v krvi rastú krátko pred ovuláciou, detekcia estrogénov je preto cenným indikátorom prebiehajúcich cyklov ruje. Estrogény kontrolujú nástup preovulačného píku LH, po ktorom nasleduje ovulácia. Záver Naše čiastkové výsledky poukazujú na to, že pri súčasnej aplikácii tampónov s FGA a podávania eCG v určitom časovom intervale dochádza k vzostupu hladín 17β-estradiolu v krvnom sére oviec. Táto skutočnosť súvisí so stimuláciou nástupu náboru antrálnych, terciárnych folikulov na trajektóriu rastu, keďže eCG má podobný účinok ako FSH. Rozdielna dávka eCG mala za následok, že pri podaní vyššej dávky eCG (1000 IU) bol zaznamenaný výrazný vzostup hladín progesterónu ako dôsledok luteinizácie i 17β-estradiolu z novej vlny rastúcich folikulov. Literatúra 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. BARI, F. – KHALID, M. – OLF, B. – HARESIGN, W. – MURRAY, A. – MERREL, B., 2001. The repeatability of superovulatory response and embryo recovery in sheep. Theriogenology, 56 (1): 147 – 155. BOSCOS, C. M., SAMARTZI, F. C., DELLIS, S., ROGGE, A., STEFANAKIS, A., 2002. Use of progestagen-gonadotrophin treatments in estrus synchronization of sheep. In: Theriogenology, 58, (7), 1261 – 1272. COGNIE, Y., 1990. Current technologies for synchronization and artificial insemination of sheep. In: Reproductive physiology of merino sheep Eds.: C.M. Oldham, G.B. Martin and I.W. Purvis, University of Western Australia, p. 207. EVANS, G. – MAXWELL, W. M. C., 1987. Salamon`s artificial insemination of sheep and goats. Sydney: Butterworth. GODFREY, R. W. – COLLINS, J. R. – HANSLEY, E. L. – WHEATON, J. E., 1999. Estrus synchronization and arteficial insemination of hair ewes in the tropics. Theriogenology, 51: 985 – 997. HARESIGN, W., 1992. Manipulation of reproduction in sheep. J. Reprod. Fertil., Suppl. 45: 127 – 139. HENDERSON, D. C. and ROBINSON, J. J., 2000. The reproductive cycle and its manipulatuion. In: Martin W.B., Aitken I.D.: Diseases of sheep. 3rd ed. Oxford: Blackwell Scientific Publications. UNGERFELD, R., 2005. Sixty years of the ram effect (1944 – 2004): How have we learned what we know about it. J. Anim. and Vet. Advances, 4 (8): 716 – 718. 122 9. WILDEUS, S., 1999. Current conceps in synchronization of estrus: Sheep and goats. Proceedings of the American Society of Animal Science. Kontaktná adresa: Mgr. Jana Jankurová, Ústav fyziológie KNAHF, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, 041 81 Košice Práca bola podporená grantom VEGA 1/0612/03 a projektom aplikovaného výskumu AV 4/0113/06 HISTOLOGICAL FINDINGS IN THE ADRENAL GLANDS FROM SLAUGHTERED CATTLE Jelinek, F., a* Konecny, R. b Veterinary Histopathological Laboratory, Sojovicka 16, 197 00 Prague 9, Czech Republic Department of Anatomy and Physiology of Farm Animals, Faculty of Agriculture, University of South Bohemia in Ceske Budejovice, Czech Republic a b * Correspoding author. Tel. +420 286 851 765; fax: +420 286 851 765. E-mail address: [email protected] Abstract Adrenal glands from healthy slaughtered cattle, 13 bulls, 10 heifers and 10 cows, were examined by means of histology and immunohistochemistry.. The samples were fixed in 10% bufferd formalin, processed by common parafin technique and sections were stained with haematoxylin and eosine. Presence of S100 protein, chromogranin A and synaptophysin was studied in duplicate sections by means of immunoperoxidase method. The following findings were recorded: Unequal thickness of connective capsule and nodular formations of zona glomerulosa, eosinophilic granules in the cells of zona glomerulosa, globoid arrangement of zona fasciculata, strips and nests of cortical tissue in the medulla, mutual interlace of superficial and deep zones of the medulla, growth of cortical or medullary cells into the wall of blood vessels in the medulla and focal infiltrates composed of lymphocytes or granulocytes. Cortical cells and noradrenergic cells in the medulla expressed positivity for S100 protein. Both adrenergic and noradrenergic cells in the medulla were positive for synaptophysin. Majority of the cells in the cortex and noradrenergic cells in the medulla displayed positivity for chromogranin. Keywords: Bovine, adrenal glands, histology, immunohistochemistry Acknowledgement: This work was partially supported by a Grant Agency of the Czech Republic, No. 523/03/H076 and by MSM Agency, No. 6007665806. 123 MINERÁLNY PROFIL KRÁLIKOV PO EXPERIMENTÁLNEM PODANÍ NIKLU A ZINKU MINERAL PROFILE IN RABBITS AFTER AN EXPERIMENTAL NICKEL AND ZINC ADMINISTRATION Kalafová, A., Kováčik, J., *Jurčík, R., Lukáč, N., Massányi, P., Capcarová, M.,Schneidgenová, M., Čupka, P. Katedra fyziológie živočíchov, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, * Výskumný ústav živočíšnej výroby SCPV v Nitre, Abstract In this study the effect of selected trace elements – nickel and zinc, on serum mineral profile of rabbit was studies. Adult females (Californian and New Zeland white breed, n=25) were fed ad libitum with different concentration of nickel and/or combination with zinc. In first group (P1; n=5) animals were fed with granular feed mixture with addition of 17.5 g NiCl2 per 100 kg of mixture and second group (P2; n=5) with 35 g NiCl2 per 100 kg of mixture. In group P3 (n=5) animals were fed with mixture containing 17.5 g NiCl2 and 30 g ZnCl2, and in group P4 (n=5) 35 g NiCl2 and 30 g ZnCl2 per 100 kg of mixture. All results were compared with control group (n=5). After experimental period (90 days) concentration of serum mineral elements (sodium, potassium, chlorides, calcium, phosphorus, magnesium) was detected. The level of sodium was similar in all groups reaching 142.70 – 159.80 mmol.l-1. The highest potassium level was in group P3, but the differences were not significant (4.75 – 5.25 mmol.l-1). Average concentration of chlorides was 106.34 – 110.45 mmol.l-1. Phosphorus level was very similar in all groups (1.32 – 3.74 mmol.l-1) with the highest level in group P4. Calcium concentration was lower in control group (3.12 ± 0.36 mmol.l-1) in comparison with other groups where the values reached 3.23 – 3.49 mmol.l-1. During 90 days of experiment a significantly higher (P <0.05) calcium concetration was detected in group P4 in comparison with control. The average level of magnesium was in control group 1.03 mmol.l-1, P1-1.15 mmol.l-1, P2-1.13 mmol.l-1, P3-1.06 mmol.l-1 and in P4-1.17 mmol.l-1. Úvod V poslednom období sa stále väčšia pozornosť sústreďuje na štúdium prítomnosti a vplyvu kontaminujúcich látok v potravinách. Chemizáciou poľnohospodárstva a nástupom veľkovýroby v potravinárstve sa rozšírilo množstvo látok znečisťujúcich potraviny, ktoré negatívne ovplyvňujú ľudský organizmus. Najnebezpečnejšie sú tie, ktoré majú toxické 124 účinky. K vstupu najdôležitejších toxických prvkov do potravinového reťazca prispieva celý rad antropogénnych i prirodzených zdrojov (Naď et al., 2005). Ťažké kovy sa do potravín dostávajú rôznymi cestami, podobne ako ďalšie kontaminanty. Sú považované za chemické kontaminanty potravín, pričom prítomnosť niektorých z nich v potravinách môže byť výsledkom bioakumulácie geneticky vlastnej určitým rastlinným alebo živočíšnym organizmom (Kováč a Šuhaj, 1996). Nikel je esenciálny ťažký prvok. Hlavnými zdrojmi niklu sú pitná voda a potraviny. Fyziologická úloha niklu v organizme sa prejavuje v procesoch, kde pôsobí ako kofaktor v metaloenzýmoch alebo metaloproteínoch, ktorý uľahčuje črevnú absorpciu železa (Fay et al., 2003). Zlúčeniny dvojmocného niklu sú kancerogénne ako pre zvieratá, tak aj pre ľudí (Prokeš et al., 2005). Toxicita niklu vyvoláva veľký záujem kvôli rozšírenému výskytu niklu v prostredí. Možným vysvetlením ako nikel spôsobuje poškodenie a smrť buniek, je peroxidácia lipidov a tvorba reaktívnych foriem kyslíka. V experimentoch sa už po 1. hodine od aplikácie niklu ľudským lymfocytom zistila zvýšená tvorba hydroxylových radikálov, čo hrá úlohu pri oxidatívnom poškodení ľudských lymfocytov akútnym účinkom niklu (Chang-Yo et al., 2003). Funakoshi et al. (1997) zistili, že príjem niklu hepatocytmi sa deje procesmi transportu vápníkovými kanálmi. Nikel poškodzuje však aj ďalšie orgány – najmä obličky, pečeň, srdce a pľúca (Das a Dasgupta, 2000) a kumuluje sa v pečeni a v obličkách (Koréneková et al., 2000). Zaznamenali sa však aj účinky na pohlavný systém najmä samcov. Zinok plní v organizme veľa rozličných funkcií. Patrí medzi esenciálne prvky pre všetky druhy žijúcich organizmov . Nachádza sa v rôznych formách. Stimuluje a aktivizuje približne 100 enzýmov. Zinok je nenahraditeľným prvkom nachádzajúci sa v každej bunke (Sandstead, 1994; Solomons, 1998). Zohráva kľúčovú úlohu v procesoch aktivácie transkripcie, proliferácie buniek, neovaskularizácie, apoptóze a vírusovej infekcii. Je známe, že nedostatok zinku v bunkových kultúrach indukuje apoptózu v bunkách transformovaných vírusom, bunky s príjmom zinku zostávajú neovplyvnené infektom. Zinkové metaloproteíny sú užitočné preventíva pri prenosných vírusových ochoreniach (Fernandez–Pol, 2001). Cieľom práce bolo stanoviť prípadné rozdielnosti v minerálnom profile králikov po experimentálnom podávaní niklu resp. zinku. 125 Materiál a metodika V experimente bolo použitých 25 samíc králika domáceho línie Kalifornský a Novozélandský biely (SCPV – VUŽV, Nitra) o hmotnosti 3,5 – 4,0 kg vo veku 4 mesiace, ktoré boli rozdelené do piatich skupín (P1, P2, P3, P4, K). V prvej skupine (P1) zvieratá (n=5) dostávali nikel (NiCl2, Reachem) v dávke 17,5 g NiCl2.100 kg-1 (KZ) po dobu 90 dní. V druhej skupine (P2) zvieratá (n=5) dostávali dvojnásobnú dávku niklu v rovnakom časovom období. V ďalšej skupine (P3) sme podávali piatim samiciam nikel v dávke 17,5 g NiCl2.100 kg-1 v kombinácii so zinkom v koncentrácii 30 g ZnCl2 (ZnCl2, Reachem) po dobu 90 dní. V poslednej pokusnej skupine (P4) zvieratá (n=5) prijímali krmivo s prímesou niklu (35 g NiCl2.100 kg-1 KZ) a zinku (30 g ZnCl2.100 kg-1 KZ) po dobu 90 dní. Na porovnanie výsledkov sme zostavili skupinu piatich samíc (K – kontrolná skupina), ktorá prijímala rovnakú kŕmnu zmes (KKV1) ale bez pridania niklu a zinku. Všetky zvieratá boli umiestnené v klimatizovaných halách, v jednopodlažných individuálnych kovových klietkach typizovaných rozmerov. Voda bola k dispozícii z automatických napájačiek. Zvieratám bola v pravidelných mesačných intervaloch odoberaná krv z vena auricularis centralis. Zo vzoriek krvi sme separovali krvné sérum centrifugáciou pri otáčkach 3000/min. po dobu 30 minút. V krvnom sére sme stanovili sodík, draslík, chloridy, vápnik, fosfor, horčík. Minerálne parametre boli zisťované použitím automatického klinického analyzátora Microlab 300 (Vital Scientific, Holandsko). Výsledky a diskusia V pokuse sme sledovali a hodnotili koncentrácie minerálnych prvkov (sodíka, draslíka, chloridov, vápnika, fosforu a horčíka) v krvnom sére králikov – samíc. Množstvo sodíka sa v kontrolnej skupine pohybovalo v rozmedzí od 142,70 mmol.l-1 do159,80 mmol.l-1 s priemernou hodnotou 147,05 mmol.l-1. V pokusných skupinách sa hodnoty pohybovali v rámci referenčných noriem (Merc & Co., 2006 ). Najvyššia priemerná hodnota draslíka sa zistila v P3 skupine (17,5 g NiCl2 a 30 g ZnCl2). V ostatných skupinách boli hodnoty nižšie a pohybovali sa v rámci referenčných noriem. Pri porovnávaní priemerných hladín chloridov, v kontrolnej skupine a pokusných skupinách bola v rozmedzí od 106,34 mmol.l-1 do 110,45 mmol.l-1. Priemerná hladina vápnika bola najnižšia v kontrolnej skupine 3,12 mmol.l-1, v ostatných skupinách sa pohybovala od 3,23 mmol.l-1 do 3,49 mmol.l-1. 126 Obsah fosforu v skupine bez prídavku niklu bol v rozmedzí od 1,32 mmol.l-1 - 3,74 mmol.l-1. Najvyššia priemerná hodnota bola nameraná v skupine P4 (2,30 mmol.l-1). Množstvo horčíka v krvnom sére králikov v jednotlivých skupinách bol K - 1,03 mmol.l-1, P1 - 1,15 mmol.l-1, P2 - 1,13 mmol.l-1, P3 - 1,06 mmol.l-1, P4 - 1,17 mmol.l-1. Tab. Základné štatistické ukazovatele minerálneho profilu králikov (x. ± SD) K Na (mmol.l-1) K (mmol.l-1) Cl (mmol.l-1) Ca (mmol.l-1) P (mmol.l-1) Mg (mmol.l-1) P1 P2 P3 P4 (17,5g NiCl2) (35 g NiCl2) (17,5g NiCl2 a 30g ZnCl2) (35 g NiCl2 a 30 g ZnCl2) 147,05±6,68 145,87±2,96 147,86±5,99 145,80±3,45 145,66±4,79 4,76±0,46 4,96±0,61 4,75±0,48 5,25±0,31 5,12±0,39 106,98±5,78 107,55±5,47 108,7±4,93 110,45±3,73 106,34±3,87 3,12±0,36 3,23±0,39 3,25±0,33 3,29±0,47 3,49±0,37* 1,95±0,62 1,89±0,35 2,01±0,45 2,01±0,58 2,30±0,74 1,03±0,17 1,15±0,35 1,13±0,39 1,06±0,25 1,17±0,33 * P<0,05 (K vs. P4) Po troch mesiacoch (90 dňoch) pokusu sme zistili štatisticky preukazný rozdiel(P <0,05) v sérovej koncentrácii vápnika medzi kontrolnou skupinou a skupinou P4. V ostatných ukazovateľoch minerálneho profile (sodík, draslík, chloridy, fosfor, horčík) neboli zistené štatisticky preukazné rozdiely medzi skupinami. Korelačná analýza nám ukázala vysokú negatívnu koreláciu medzi draslíkom a chloridmi v skupine P3 (r = - 0,81), vysokú pozitívnu koreláciu (r = 0,79) v skupine P3 medzi fosforom a chloridmi. V skupine P3 vysokú negatívnu koreláciu (r = - 0,86) medzi sodíkom a vápnikom. Vysoká pozitívna korelácia bola zistená v skupine P2 medzi vápnikom a draslíkom (r = 0,71), v skupineP1 medzi fosforom a chloridmi (r = 0,70), v kontrolnej skupine medzi horčíkom a chloridmi (r = 0,72) a medzi sodíkom a chloridmi (r = 0,83) v skupine P4. Výsledky nášho pokusu poukazujú na nesignifikantné rozdiely pri hodnotení sodíka, draslíka, chloridov, fosforu a horčíka medzi kontrolnou skupinou a pokusnými skupinami. Signifikantné zmeny (P<0,05) boli zistené pri hladine vápnika medzi kontrolnou skupinou a skupinou P4. Toman et al. (1995) pri podávaní nízkych dávok kadmia dospeli k podobným 127 výsledkom. Pri podávaní kadmia do pitnej vody bažantov (Toman et al., 2004) zistili štatisticky preukazný pokles hladiny fosforu, vápnika, sodíka, horčíka v krvnej plazme, zatiaľ čo hladina draslíka sa mierne zvýšila v pokusnej skupine. Massányi et al. (2001) po experimentálnom podaní kadmia pri porovnaní priemerných hladín horčíka, chloridov, sodíka a draslíka z krvi králikov nezistili žiadne signifikantné rozdiely. Záver Stopové prvky sú dôležité v nízkych koncentráciách pre rastliny a niektoré sú dôležité aj živočíchy. Rizikové stopové prvky, ku ktorým patrí aj nikel a zinok, sú často považované za kontaminanty. V priebehu pokusu sme sledovali vplyv samotného niklu a niklu v kombinácii so zinkom na ukazovatele minerálneho profilu. Pri porovnávaní hladiny minerálnych prvkov sodíka, draslíka, chloridov, fosforu a horčíka sme nezistili štatisticky preukazné rozdiely medzi skupinami. Zistili sme štatisticky preukazný rozdiel (P<0,05) pri hladine vápnika medzi kontrolnou a pokusnou skupinou P4 (35 g NiCl2 a 30 g ZnCl2 .100 kg-1 KZ). Práca bola podporená projektami APVV-0299-06 a VEGA 1/2417/05. Literatúra DAS,K. K., DASGUPTA, S. 2000. Effect of nickel on testicular nucleic acid contretrations of rats on protein restriction. In Biol. Trace Elem. Res., roč.73, 2000, č.2,s. 175-180. FAY, M., WILBUR, S., ABADIN, H., a kol. 2003. Toxicological profile for nickel. In ATSDR. U. S. Department of the health and human services. 2003, p. 39. FERNANDEZ-POL, J. A., HAMILTON, P. D. AND KLOS, D. J. 2001. Essential viral and cellular and iron containing metalloproteins as targets for novel antiviral and anticancer agents: implications for prevention and therapy of viral diseases and cancer. In Anti. Cancer Res., 2001, vol. 21, p. 931–957 FUNAKOSHI, T:, INOUE, T., SHIMADA, H., et al. 1997. The machanism of nickel uptake by rat primary hepatocyte cultures: role of calcium channels. In Toxicology, vol. 124, 1997, no.1, p. 21-26. CHANG, Y. CH., YI-FEN, W., YU-HWAN, L., SHU-FANG Y. 2003. Nickel-induced oxidative stress and effect of antioxidants in human lymphocytes. In Arch. Toxicol., roč. 77, 2003, č. 3, s. 123-130. KORÉNEKOVÁ, B., SKALICKÁ, M., NAĎ, P., MAKÓOVÁ, Z. 2000. In Mutual relationship of Cd and Zn after application of sodium humate in broilers . 2000. In Biologia (Bratislava), roč. 55, 2000, č. 8, 59-62. KOVÁČ, M., SUHAJ, M. 1996. Prírodné toxikanty a antinutričné látky v potravinách, VÚP, Bratislava, 1996, s. 140. MASSANYI, P., TOMAN, R., KOVÁČIK, J. 2001. Zmeny niektorých parametrov minerálneho, energetického, enzymatického a dusíkového profilu a kumulácia kadmia u králikov po experimentálním podaní kadmia. In Beseda I. et al.: Aktuálne problémy kontaminácie životného prostredia z hradiska toxikologie a ekotoxikológie. FEE TU Zvolen,2 s. 197 . ISBN 80-2280980-2. Merc & Co., 2006 ., Inc. Whitehouse Station, NJ USA, All Rights Reserved. Publisher in educational pertnership with Merial ttd.) NAĎ, P., SKALICKÁ, M., KORENEKOVÁ, B., MARŠALKOVÁ, S., PISTL, J., ŠUTIAKOVÁ, I., CIGÁNKOVÁ, V. 2005. Eliminácia účinku ťažkých kovov na kvalitu živočišných produktov a zdravie hospodárských zvierat . Kvalita, bezpečnosť a funkčnosť primárnych potravinových zdrojov, Piešťany: VÚRV, 2005, s. 59-61. ISBN 80-8879-41-7. PROKEŠ, J. et al. Základy toxikologie. Praha: Galen, 2005. ISBN 80-7262-301-X. s. 247. SANDSTEAD, H. H.1994. Understanding zinc: recent observations and interpretations. In J. Lab. Clin. Med., vol. 124, 1994, p. 322–327. 128 SOLOMONS, N. W., Mild human zinc deficiency produces an imbalance between cell-mediated and humoral immunity. In Nutr. Rev., vol. 56, 1998, p. 27–28. TOMAN, R., SLAMEČKA, J., MASSANYI, P., ŠEBOVÁ, K., TATARUCH, F., JURČÍK, R.1995. Vplyv opakovaného podávania nízkých dávok Cd 2+ na spermiogenezu, biochemické zložky krvnej plazmy a jeho kumuláciu v organizme zajaca poľného. In Folia Venatoria, 1995,č. 25, s.77-82. TOMAN, R., HLUCHÝ, S., MASSÁNYI, P., BÁBIKOVÁ, L.2004. Zmeny koncentrácie minerálních látok krvnej plazmy bažantov po podaní kadmia v pitnej vode. In Acta fytotechnica et zootechnica.2004, č.4, s. 90-92. ÚLOHA VYBRANÝCH BIOLOGICKY AKTÍVNYCH LÁTOK V POHLAVNOM DOSPIEVANÍ PRASNIČIEK THE ROLE OF SOME BIOLOGICAL ACTIVE SUBSTANCES IN REGULATION OF PORCINE SEXUAL MATURATION Kolesárová A., Sirotkin A.1, Capcarová M., Massányi, P., Lukáč N., Kováčik J. Katedra fyziológie živočíchov, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, 2Ústav genetiky a reprodukcie HZ, Výskumný ústav živočíšnej výroby SCPV v Nitre, E-mail: [email protected] Abstract The aim of our experiments was to study the influence of level of progesterone (P4), insulin-like growth factor I (IGF-I), IGF-binding proteins-3 (IGFBP-3) in blood plasma and the release of these substances by porcine ovarian granulosa cells cultured in vitro on sexual maturation. Besides the role of IGF-I, oxytocin (OT), cAMP and intracellular messengers in the control of ovarian function and sexual maturation was studied in pigs. Gilts were divided in two groups according to the sexual maturation (sexually immature gilts and sexually mature gilts). We determined the basal secretions of substances by granulosa cells, isolated from immature and preovulatory ovaries, together with the effect of treatment by IGF-I (10 ng/ml), OT (100 ng/ml and dbcAMP (10 µg/ml) during culture. The following products were assayed in plasma, cell culture medium and cells using RIA, Western-immunoblotting and immunocytochemistry: P4, IGF-I, IGFBP-3, IGFBP-4, protein kinases A (PKA) and G (PKG), phosphotyrosine (PhT), ERK1,2 related MAP kinase, CREB1 and proliferation-associated (PCNA, CDC2/p34, cyclin B1), apoptotic (Bax) and antiapoptotic (Bcl-2) peptides. It was observed, that sexual maturation of gilts is associated with an increase in the production of P4, IGF-I, IGFBP-3 in both blood plasma. There were also increases in content of IGFBP-3 and the expression of PCNA, CDC2/p34, Bcl-2, Bax, PKA, CREB1, PhT and decreases in the presence of IGFBP-4, cyclin B1, PKG and ERK1,2 in cultured granulosa cells. In both groups of animals, dbcAMP increased the secretion of P4 and IGF-I and the expression of ERK1,2 and PKG and decreased the content of IGFBP-3, IGFBP-4 and the expression of PKA in cultured granulosa cells. In immature animals, dbcAMP stimulated PCNA, 129 CDC2/p34 and inhibited cyclin B1, Bcl-2, Bax, CREB1 and PhT, whilst in mature animals effect was opposite. In both groups, IGF-I increased the content of P4, IGFBP-3 and the expression of PCNA but decreased the expression of CDC2/p34 and PhT. IGF-I induced the production of IGFBP-4 and the expression of Bax, PKA and CREB1 in immature gilts but had the opposite effect in mature animals. In both groups, OT increased the content of IGF-I, IGFBP-3, IGFBP-4 and the expression of PCNA but decreased the expression of Bcl-2, PKA, PhT and ERK1,2. In immature gilts, OT increased the expression of CDC2/p34, Bax, CREB1, PKG and decreased P4 secretion. It had the opposite effect in mature animals. These data demonstrate that in pigs IGF-I, OT, cAMP, IGFBP-3 and IGFBP-4 control the proliferation and apoptosis of ovarian cell, the secretion of ovarian substances and sexual maturation. They also indicate differences in contents of P4, IGF-I, IGFBP-3 and in the expression of IGFBP-4, PCNA, CDC2/p34, cyclin B1, Bax, Bcl-2, PKA, CREB1, PKG, PhT and ERK1,2 produced by granulosa cells during sexual maturation in gilts. These findings suggest the potential application of OT, IGF-I and cAMP preparation for regulation of porcine gonadal functions. KVALITA KRAVSKÉHO MLIEKA A METABOLICKÉ PORUCHY DOJNÍC DAIRY COW MILK QUALITY AND METABOLIC DISORDERS Kováčik,J., Michalcová,A., Massányi,P., Kolesárová A. Slovenská poľnohospodárska univerzita, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra Abstract The aim of our experiments was to study technological quality of milk in relation to parameters of internal milieu in dairy cows. We discovered that in milk of dairy cows with metabolically malfunctions was detected higher level of urea, lower level of calcium and fall of titrate acidity. From all studied biochemical parameters (urea, total lipids, total protein,calcium, phosphor) the higst negative effect of blood urea on determined parameters of technological quality of milk is reported. Significant dependence between parameters of blood and milk were registered in the group with metabolically malfunctions of ketosis between blood urea and milk urea, urea calcium and milk calcium, calcium and glucose. In the group with metabolically malfunctions of asidosis were detected significant correlation between total lipids in blood and level of fat in milk. Key words: internal milieu, milk, blood, urea, total lipids, total protein,calcium, 130 Abstrakt V práci sa zisťovali vzájomné interakcie medzi vybranými ukazovateľmi krvného séra dojníc s metabolickými poruchami a kvalitatívnymi ukazovateľmi mlieka. V mlieku dojníc s metabolickými poruchami bol zistený vyšší obsah močoviny (najvyšší u dojníc s poruchami acidobázickej rovnováhy), nižší obsah vápnika a pokles titračnej kyslosti. Z hodnotených ukazovateľov bol v krvnom sére ketóznych dojníc zaznamenaný veľmi nízky obsah močoviny so všetkými negatívnymi prejavmi na metabolizmus dusíka v bachore a následne v mliečnej žľaze. Signifikantné závislosti medzi ukazovateľmi v krvi a v mlieku boli zistené v skupine ketóznych dojníc medzi močovinou v krvi a mlieku , vápnikom v krvi a v mlieku , vápnikom a glukózou. V skupine dojníc s acidobázickými poruchami bola zistená štatisticky preukazná korelácia medzi celkovými lipidami v krvi a obsahom tuku v mlieku. Kľúčové slová : metabolické poruchy, mlieko, acidobázické poruchy, ketózy, močovina Úvod Kvalita kravského mlieka a jeho zloženie je ovplyvňovaná viacerými činiteľmi. Jedným z rozhodujúcich exogénnych faktorov je výživa dojníc, ktorou možno podľa mnohých autorov, (Kirst, Jakobi, 2002; Kološta et al., 2002a; Kirchnerová et al., 2002; Kološta, 2001; Kováčik, 1999; a i.) ovplyvniť produkciu a kvalitu mlieka. Vysokoúžitkové dojnice, vyšľachtené na vysokú produkciu mlieka, sú náročné na výživu a prípadné nedostatky vo výžive sa u nich výrazne prejavujú v znížení produkcie mlieka, ale zároveň i v zhoršení jeho technologických vlastností (Kirchnerová et al., 2002; Kološta et al., 2002a; Hanuš et al., 2002; Kováčik, 1999; a i.). Nedostatky vo výžive dojníc sa odrážajú v mnohých biochemických a fyziologických procesoch a v dôsledku narušenia vzťahu medzi tzv. metabolickou kapacitou zvieraťa a požiadavkami na produkciu vznikajú metabolické poruchy (Kováčik, 1999). K ekonomicky najzávažnejším ochoreniam vysokoúžitkových dojníc patria ochorenia acidobázickej rovnováhy a poruchy energetického metabolizmu. Funkčná schopnosť mliečnej žľazy je v priamej korelácii s celkovým zdravotným stavom dojníc a v jednotlivých zložkách mlieka sa premieta úroveň celkového metabolizmu ( Kirst, Jakobi, 2002). Cieľom práce bolo sledovať vplyv metabolických porúch dojníc na zloženie a kvalitu kravského mlieka mlieka. 131 Materiál a metódy Na metabolický profilový test bolo vo vybranom poľnohospodárskom podniku vyšetrených 30 dojníc a na základe výsledkov boli dojnice rozdelené do 3 skupín: 1. skupina – ketózne dojnice; 2. skupina – dojnice s acidobázickými poruchami; 3. skupina – zdravé dojnice. Odber krvi pre biochemické analýzy sa robil vždy 2 hodiny po rannom kŕmení punkciou vena jugularis. V krvnom sére bola stanovená močovina, celkové lipidy, celkové bielkoviny, glukóza a vápnik. V analyzovaných vzorkách mlieka sa stanovovali : tuk, bielkoviny, laktóza, BTS – na prístroji MilkoScan podľa STN 57 0536; PSB – prístrojom Fossomatic podľa STN 57 0532; vápnik (Ca) – komplexometrickou titráciou podľa Cvaka, Peterkovej a Černej (1992); močovina – spektrofotometricky Bio – La – testom; titračná kyslosť – titračne podľa Soxhlet - Henkela podľa STN 57 0530; syriteľnosť – podľa Kažimíra a Gemeriho (1993); kysacia schopnosť – podľa STN 57 0534; termostabilita – podľa Gajdůška (1997). Získané výsledky sa vyhodnotili programom MS EXCEL a STATGRAPHIC Plus 5.1. Výsledky a diskusia Ukazovatele kvality mlieka V priemerných hodnotách základných ukazovateľov zloženia mlieka, neboli medzi jednotlivými skupinami dojníc zistené štatisticky preukazné rozdiely (tab. 1). V obidvoch skupinách dojníc s metabolickými poruchami (1. a 2. skupina) boli zistené zhoršené technologické vlastnosti mlieka poukazujúce až na nevhodnosť mlieka na jeho spracovanie. Priemerné hodnoty ukazovateľov zloženia a vlastností mlieka Tabuľka 1 Ukazovateľ Skupiny dojníc 1. 2. 3. -1 Tuk (g.100g ) 3,746 4,987 4,098 Bielkoviny (g.100g-1) 2,989 2,997 3,09 Laktóza (g.100g-1) 5,086 4,663 4,973 BTS (g.100g-1) 8,791 8,41 8,798 PSB (tis . ml-1) 128,2 158,86 444,33 Ca (mg . 100ml-1) 116,38 115,86 128,92 -1 Močovina (mmol.l ) 5,378 5,862 5,005 Titračná kyslosť (o SH) 6,34 6,37 6,667 Syriteľnosť (sek) 159,6 227,86 181,667 Kysacia schopnosť (o SH) 19,16c 22,83 25,183a Termostabilita (ml 95% liehu) 1,72 1,88 2,01 a, b, c Priemery označené rozličnými písmenami v tom istom riadku sú rozdielne pri P< 0,05 132 Deficit príjmu energie v kŕmnej dávke dojníc s vybranými metabolickými poruchami sa prejavil i v nepreukazne nižšom obsahu laktózy a BTS (tab.1). Súčasne bol v mlieku týchto dojníc zaznamenaný zvýšený obsah močoviny (u dojníc s poruchami acidobázickej rovnováhy o 1,862mmol.l-1 ) nad referenčnú hodnotu uvádzanú Slaninom (1992). V súlade s výsledkami Kološtu (2004) bol zistený najnižší priemerný obsah Ca a najvyšší obsah močoviny v mlieku v 2. skupine dojníc – s poruchami acidobázickej rovnováhy.. V dôsledku zvýšeného obsahu močoviny a zníženému obsahu bielkovín, ako aj predpokladaným zmenám v ich zložení, ako ich uvádza Kološta (2004), bol zaznamenaný i nepreukazný pokles titračnej kyslosti mlieka, pričom jej hodnota sa pohybovala na dolnej hranici rozpätia štandardných hodnôt. V obidvoch skupinách dojníc s metabolickými poruchami boli tiež zistené signifikantne zhoršené technologické vlastnosti mlieka a to: kysacia schopnosť u obidvoch skupín a syriteľnosť u 2. skupiny dojníc (tab. 1), čo zodpovedá poznatkom Kirchnerovej et al. (2002), Kološtu (2002a,b) a Hanuša et al. (2002). Analýzou komponentov sa zistilo, že až na 78,% boli hodnoty kysacej schopnosti ovplyvnené bielkovinami a na 21, % obsahom laktózy. Zmenené zloženie bielkovín u obidvoch skupín dojníc s metabolickými poruchami sa negatívne prejavilo na nízkej kysacej schopnosti mlieka u týchto skupín na čo poukazujú i Kološta, 2004; Kirchnerová et al., 2002; Hanuš et al., 2002, Pažmová, 1992 a i. Ukazovatele vnútorného prostredia dojníc Hodnoty ukazovateľov krvného profilu vnútorného prostredia sledovaných dojníc (tab.2) sa pohybovali v rozmedzí referenčného rozpätia uvádzaných Slaninom et al. (1992) okrem priemernej hodnoty močoviny u ketóznych dojníc. Až u 50% zo všetkých analyzovaných vzoriek krvi sledovaných dojníc bola zistená zvýšená hladina glukózy. Poruchy energetického metabolizmu ketóznych dojníc sa premietajú aj do úrovne hodnôt močoviny v krvi, ktoré ani v jednej z hodnotených vzoriek nedosiahli minimum referenčného rozpätia (3, 3 – 6,6 mmol.l-1) podľa Slaninu et al. (1992). Podľa Davidsona et al. (2003) a Reista et al. (2002) sa z hľadiska výživy znížené hodnoty močoviny v krvnom sére pozorujú pri nedostatku NL. Disproporcia, ktorá vznikla medzi metabolickou kapacitou dojníc a ich požiadavkami na produkciu mohla narušiť procesy bachorovej fermentácie ako na to poukazujú Willige (2002), Hanuš et al. (2002) a (Kováčik, 1999). Poruchy bachorovej fermentácie sa prejavujú zníženou tvorbou prekurzorov i pre produkciu bielkovín mlieka, čo sa prejavilo v najnižšom obsahu bielkovín mlieka (x =2,989 g.100g-1) u 1. skupiny dojníc. Tieto výsledky sú v súlade s tvrdeniami Vajdu et al. (2003) a Hofírka et al. (2002). 133 Priemerné hodnoty ukazovateľov krvného profilu Tabuľka 2: Skupiny dojníc 1. 2. 3. -1 ab močovina (mmol.l ) 3,007 4,58 4,72ac -1 celkové lipidy (g.l ) 4,448 4,771 4,332 -1 celkové bielkoviny (g.l ) 78,74 77,525 82,84ab -1 glukóza (mmol.l ) 3,366 3,397 3,728 -1 Ca (mmol.l ) 2,43 2,41 2,389 ab Priemery označené rozličnými písmenami v tom istom riadku sú rozdielne pri P< 0,05 ac Priemery označené rozličnými písmenami v tom istom riadku sú rozdielne pri P< 0,01 Ukazovateľ Signifikantné závislosti medzi ukazovateľmi v krvi a v mlieku boli zistené v skupine ketóznych dojníc medzi močovinou v krvi a mlieku (r = -0,694; P<0,05 ), vápnikom v krvi a mlieku (r = -0,653; P<0,05 ), vápnikom a glukózou (r = -0,648; P<0,05 ). V skupine dojníc s acidobázickými poruchami bola zistená štatisticky preukazná korelácia medzi celkovými lipidami v krvi a obsahom tuku v mlieku (r = -0,879; P<0,05 ). Medzi kysacou schopnosťou mlieka a močovinou v krvi bola na rozdiel od výsledkov Kološtu (2004) zistená negatívna nepreukazná závislosť (r = -0,318; P>0,05) u skupiny zdravých dojníc. U obidvoch skupín dojníc s metabolickými poruchami bola táto závislosť pozitívna a u dojníc s acidobázickými potruchami štatisticky preukazná (r = 0,747; P<0,05). Vysoká pozitívna korelácia bola zistená aj medzi kysacou schopnosťou a hodnotami glukózy krvi (r = 0,909; P<0,05) u skupiny zdravých dojníc . Záver V mlieku dojníc s metabolickými poruchami bol zistený vyšší obsah močoviny (najvyšší u dojníc s poruchami acidobázickej rovnováhy), nižší obsah vápnika a pokles titračnej kyslosti. Z hodnotených ukazovateľov v krvnom sére bol u všetkých ketóznych dojníc zaznamenaný veľmi nízky obsah močoviny so všetkými negatívnymi prejavmi na metabolizmus dusíka v bachore a následne v mliečnej žľaze. Signifikantné závislosti medzi ukazovateľmi v krvi a v mlieku boli zistené v skupine ketóznych dojníc medzi močovinou v krvi a mlieku , vápnikom v krvi a mlieku , vápnikom a glukózou. V skupine dojníc s acidobázickými poruchami bola zistená štatisticky preukazná korelácia medzi celkovými lipidami v krvi a obsahom tuku v mlieku . 134 Pretože poruchy energeticko-dusíkového metabolizmu patria medzi najčastejšie metabolické problémy dojníc ovplyvňujúce aj zloženie a technologickú kvalitu mlieka, je potrebné venovať výberu ukazovateľov a štúdiu ich vzájomných interakcií náležitú pozornosť Literatúra 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Davidsona et al. 2003. Effects of Amounts and Degradability of Dietary Protein on Lactation, Nitrogen Utilization and Excretion in Early Lactation Holstein Cos. In: J. of Dairy Sci., roč. 86, 2003, č. 5, s. 1681 - 1689. Hanuš, O. et al. 2002. Ketózy, vážný problém vysoce dojných stád. In: Náš chov, roč. 62, 2002, s. 27 – 29. Hofírek, B. - Pechová, A. - Pavlata, L. - Dvořák, R. 2002. Klinická kontrola výživy, bachorové fermentace a konverze živín v chovu dojníc. In: Veterinářství, roč. 52, 2002, č.10, s. 403 - 410. Kirchnerová, K. et al. 2002. Kvalitatívne a technologické vlastnosti mlieka v závislosti od intenzity výživy dojníc počas prípravy na laktáciu. In: Výživa a potraviny pre 3. tisícročie, 2002, s. 199 – 202. Kirst, E. - Jakobi, U. 2002. Harnstoff - und acetongehalt der milch - Indikatoren zur beurteilung der futterung laktierender rinder. In: Practische Tierarzt, roč. 83, 2002, č. 3, s. 362 - 372. Kološta, M. 2001. Technologická kvalita mlieka dojníc na pastve. In: Mliekárstvo, roč.32, 2001, č. 1, s. 4 – 8 príloha. Kološta, M. et al. 2002a. Dynamika močoviny v krvnom sére, moči a mlieku dojníc na pastve. In: Mliekárstvo, roč. 33, 2002a, č. 2, s. 39 – 42. Kološta, M. 2004. Vybrané ukazovatele kvality mlieka a vnútorného prostredia dojníc na pastve. Autoreferát dizertačnej práce. Nitra: SPU, 2004. 31 s. Kováčik, J. 1999. Fyziologické aspekty výživy dojníc vo vzťahu k produkcii a kvalite mlieka. In: Nové systémy hodnotenia kvality surového kravského mlieka.1999, s. 41 – 45. Pažmová, J. 1992. Vplyv výživy dojníc na zloženie a vlastnosti mlieka. Kandidátská dizertačná práca. Bratislava: VÚP, 1992. 178s. Reista et al. 2002. Estimation of Energy Balance at the Individual and Herd Level Using Blood and Milk Traits in High-Yielding Dairy Cows. In: J. of Dairy Sci., roč. 85, 2002, č. 12, s. 3314 - 3327. Slanina, L. et al. 1992. Metabolický profil hovädzieho dobytka vo vzťahu k zdraviu a produkcii. Bratislava: ŠVS SR, 1992, 115s. Vajda, V. - Mitrík, T. - Maskaľová, I. - Bachratý, M. 2003. Nutričná regulácia bachorových funkcií (II.časť). In: Slovenský chov, roč. 8, 2003, č. 4, s. 32 - 33. Willige, B. 2002. Tranzitná výživa. In: Slovenský chov, roč. 7, 2002, č. 2, s. 45 – 46. IN VITRO TOXICITA NIKLU NA GRANULÓZNE BUNKY OŠÍPANEJ IN VITRO NICKEL TOXICITY ON PORCINE GRANULOSA CELLS Kročková, J.1, Massányi, P.1, Sirotkin, A.2, Pivko, J.1,2, Benčo, A3 1Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, SPU, Nitra centrum poľnohospodárskeho výskumu, Nitra 3Katedra zoológie a antropológie, Fakulta prírodných vied, UKF, Nitra 2Slovenské Abstract Aim: To study effects of nickel (NiCl2) on production of sexual hormone (progesterone), ultrastructure and cell apoptosis. Methods: Granulosa cells were aspirated using a 2 ml syringe and separated from the follicular fluid by centrifugation. The medium was replaced with new medium of the same composition containing, in addition, NiCl2 (Sigma, St. Louis, MO) in required concentrations (62,5; 125; 250; 500 and 1000 µM.l-1). Control medium 135 contained no NiCl2. Quantification of progesterone was performed after 48 h of culture directly from aliquots of the media from control and treated porcine granulosa cells by RIA. Quantification of apoptosis cells was performed using Tunel assay. From each experiment 20 electron microscopy sections from three different replicates were examined. Results: The highest production of progesterone was found in control group without NiCl2. After NiCl2 administration, there was a decrease of progesterone production.The lowest progesterone production was after addition of 1000 µM NiCl2. Tunel assay detected higher occurrence of apoptosis after NiCl2 administration. An increased apoptosis in each of experimental groups apart from concentration of 250 µM NiCl2 with the lowest percentage of apoptosis cells (42%) was detected. The highest percentage of apoptotic cells was found after administration of 1000 µM NiCl2 (79 %). Also the ultrastructure of granulosa cells was altered after NiCl2 administration. We observed higher frequency of euchromatin in nuclei, lipid drops, microfilaments and vacuoles in cytoplasm after NiCl2 treatment. There was also relatively lower frequency of mitochondria and smooth endoplasmic reticulum. Conclusion: Our findings suggest a negative effect of NiCl2 on steroidogenesis as well as on the ultrastructure and death of granulosa cells. Úvod Dôležitým ekologickým fenoménom najmä dnešnej doby je skutočnosť, že človek musí koexistovať s nadmerným množstvom chemických látok od začiatku embryonálneho vývoja až po smrť. S rastúcim stupňom znečistenia životného prostredia sa záujem o dôsledky pôsobenia toxických látok na živé systémy zvyšuje. Medzi tieto látky, ktorých je veľké množstvo, patria aj ťažké kovy. Mnohé sú toxické pre človeka, zvieratá ale aj rastliny. Sú schopné sa v organizme ukladať a akumulovať, čo zvyšuje ich toxický účinok. Hlavným zdrojom znečistenia recipientov kovmi sú odpadové vody z ťažby a spracovania rúd, hutí, z povrchovej úpravy kovov, fotografického, textilného priemyslu a iných odvetví. Ďalším zdrojom môžu byť atmosferické zrážky znečistené exhaláciami vznikajúcimi pri spaľovaní fosílnych palív a vyfukovanými plynmi motorových vozidiel. Medzi ťažké kovy patrí aj nikel. V organizme sa podieľa na zabezpečení stability bunkových membrán a ovplyvňuje produkciu niektorých hormónov. Je tiež kofaktorom rôznych mikrobiálnych enzýmov. Pohlavné orgány slúžia ako veľmi citlivý barometer výskytu rizikových prvkov v životnom prostredí. U samíc sa účinky ťažkých kovov najčastejšie prejavujú vo zvýšenej atrézii folikulov vo vaječníkoch ako aj zmenami stavby endometria maternice. Mnohé ťažké kovy výrazne negatívne ovplyvňujú steroidogenézu. 136 Materiál a metodika Odber a príprava vzoriek: Vaječníky sme získali od pubertálnych samíc ošípanej plemena Slovenská biela ušľachtilá vo veku 7 mesiacov, tesne na začiatku estrálneho cyklu (vizuálne vyšetrenie stavu vaječníkov). Vaječníky sme uložili do sklenenej nádoby obsahujúcej studený fyziologický roztok, následne sme ich transportovali do laboratória v termotaške na ľadových vankúšikoch. Ihneď sme ich opláchli (1 min.) v 70% roztoku liehu a potom dva krát v sterilnom fyziologickom roztoku. Granulózne bunky sme izolovali z dobre prekrvených folikulov stredných rozmerov ( 3 – 5 mm v diametre) pomocou aspirácie folikulárnej tekutiny so striekačkou a tenkou ihlou pod laminárnym boxom. Zhromaždenú folikulárnu tekutinu v sterilnej skúmavke sme centrifugovali (500g 2000 rpm 10 min pri 4°C). Odstredené folikulárne bunky sme premyli v médiom Hepes–buffered DME/F12. Centrifugácia, obnovenie média a pipetovanie boli opakované trikrát. Počet buniek sme stanovili pomocou hemocytometra a koncentráciu buniek sme upravili na 106.l-1 ml kultivačného média TCM–199, ktoré bolo doplnené s 10% bovinného fetálneho séra a 50 mg antibiotika gentamicin na liter média. Takto upravenú bunkovú suspenziu sme rozpipetovali (2 ml) do kultivačných platničiek. Následne sme bunky kultivovali v CO2 inkubátore pri 37°C, v 5% CO2 vo zvlhčenom vzduchu počas 3 – 4 dní, kým sa nevytvorila súvislá monovrstva buniek. Životaschopnosť buniek (determinovaná farbením s Trypánovou modrou) bola 75 – 78%. Médium sme potom nahradili novým médiom s rovnakým zložením a s prídavkom NiCl2 (Sigma, St. Louis, MO) v požadovaných koncentráciách 62, 125, 250, 500 a 1000 µM. Kontrolné médium neobsahovalo NiCl2. NiCl2 (Sigma, St. Louis, MO) sme rozpustili v kultivačnom médiu bezprostredne pred jeho použitím. Pre hodnotenie ultraštruktúry buniek sme po 48-hodinovej kultivácii s niklom alebo bez neho separovali bunky, fixovali v 2% paraformaldehyde a 2,5% glutaraldehyde v 0,2 M fosfátovom bufri pri 4°C 2 hodiny, dehydrovali v zostupnom rade roztoku etanolu a zaliali do epoxydovej živice. Ultratenké rezy sme zafarbili s acetát uranylom a citrátom olovnatým a pozorovali použitím JEM – 100 CX-II (JOEL, Japan). Z každého pokusu sme pozorovali 20 elektrónových mikroskopických rezov z minimálne troch rozdielnych opakovaní. Hodnotenie steroidogenézy: Kvantifikáciu progesterónu a 17-ß-estradiolu sme prevádzali priamo z alikvotného množstva média z kontroly a ošetrovaných buniek pomocou rádioimunometódy (RIA). V pokuse sme urobili 10 opakovaných ošetrení. Steroidy sme merali v slepej kontrole (médium kultivované bez buniek), v kontrole (médium kultivované s bunkami bez NiCl2) a v experimentálnych skupinách (médium kultivované s bunkami a s NiCl2). Vypočítaním obsahov hormónov produkovaných bunkami obsahy endogénnych hormónov (slepá kontrola) 137 boli vždy odrátané z obsahov celkových steroidov meraných v médiu kultivovaných buniek k vylúčeniu vplyvu endogénnych steroidov na stanovenie sekrécie steroidov kultivovanými bunkami. Minimálne detekčné limity pre progesterón boli 0,5 ± 0,02 ng.ml-1 a variácie intra- a intermetód boli 5,6 % a 7,9 %. Bol použitý izotopový (1,2,6,7-3H)-progesterón so špecifickou aktivitou 3,26 TBq.mmol-1 a protilátky progesterónu. Intra- a inter- variácie 17-ß-estradiolu boli 6,3 % a 9,2 %. Hodnotenie ultraštruktúry vaječníkov: Z fotografií získaných podľa morfologických kritérií (WEIBEL et al., 1966; MASSÁNYI a UHRÍN, 1996; ŽITNÝ et al., 2004) sme v granulóznych bunkách hodnotili: zastúpenie jadier, mitochondrií, endoplazmatického retikula, tukov, vakuol a mikrofilamentov. Výsledky Po podaní jednotlivých koncentrácií NiCl2 granulóznym bunkám sme zistili pokles produkcie progesterónu u všetkých koncentrácií, pričom najnižšia produkcia tohto hormónu bola pri koncentrácii 1000 µM NiCl2 (3,60 ng.ml-1 média). Najvyššia produkcia progesterónu bola u kontroly (5,19 ng.ml-1 média) (tabuľka 1, graf 1). Vplyv NiCl2 na produkciu progesterónu. Tabuľka 1 Koncentrácie niklu (µM NiCl2) kontrola 62,5 125 250 500 1000 počet pozorovaní 4 4 4 4 4 4 priemer 5,19 4,27 4,37 4,37 4,62 3,60 minimum 3,40 3,63 3,56 4,18 3,71 3,09 maximum 6,50 5,28 4,87 4,65 5,85 4,22 median 5,44 4,09 4,63 4,29 4,47 3,55 smerodajná odchylka 1,39 0,72 0,61 0,25 0,91 0,47 variačný koeficient 26,78 16,86 13,96 5,72 19,70 13,06 138 Vplyv NiCl2 na produkciu progesterónu Graf 1. 6 5 4 3 2 1 0 kontrola 62,5 125 250 500 1000 Koncentrácie NiCl2 Apoptóza granulóznych buniek po podaní rôznych koncentrácií NiCl2 [%] Tabu1ka 2. Koncentrácie NiCl2 (µM NiCl2) kontrola 62,5 125 250 500 1000 44,86 62,21 49,90 41,80 51,40 79,17 minimum 11,22 40,58 21,43 8,70 37,50 maximum 90,16 95,24 100,00 82,25 100,00 100,00 priemer median 40,86 59,39 47,19 10,00 35,48 48,22 100,00 Vplyv NiCl2 na množstvo apoptických buniek [%] Graf 2. 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 kontrola 63 125 250 500 1000 Koncentrácie NiCl2 139 Vplyv NiCl2 na ultraštruktúru granulóznych buniek Tabulka 3. ER Mitochondrie Jadro Mikro- Skupiny Hladké Gran. Trubičky Prepážky Euchr. Heter. Tuky Vakuoly filamenty Kontrola +++ - +++ - ++ + + + + 250 µM/Ni +++ - +++ - +++ - + ++ ++ 500 µM/Ni +++ - +++ - +++ - ++ +++ +++ - ++ - +++ - +++ +++ +++ 1000 µM/Ni ++ Vysvetlivky: výskyt organel +++ intenzívny; ++ stredný; + nízky; - žiadny ER – endoplazmatické retikulum Najvyššie percento apoptických buniek (79%) sme pozorovali pri najvyššej koncentrácii NiCl2 (1000µM). So zvyšujúcou sa koncentráciou NiCl2 sa množstvo apoptických buniek zvyšovalo okrem koncentrácie 250 µM, kde bolo percento apoptózy najnižšie (42%). Pozorovaním ultraštruktúry granulóznych buniek sme zistili zvýšenie výskytu euchromatínu v jadrách, tukových kvapôčok, mikrofilamentov a vakuolizáciu buniek po kultivácii s NiCl2 v porovnaní s kontrolou čo naznačuje degeneratívne procesy v bunkách. Zároveň vo všetkých experimentálnych skupinách bol znížený výskyt mitochondrií a hladkého endoplazmatického retikula a úplné vymiznutie heterochromatínu v jadrách po porovnaní s kontrolnou skupinou buniek. Diskusia Po podaní jednotlivých koncentrácií NiCl2 granulóznym bunkám sme zistili pokles produkcie progesterónu u všetkých koncentrácií, pričom najnižšia produkcia tohto hormónu bola pri koncentrácii 1000 µM NiCl2 (3,60 ng.ml-1 média). Najvyššia produkcia progesterónu bola u kontroly (5,19 ng.ml-1 média). Tieto výsledky poukazujú na vplyv niklu na produkciu sexuálnych steroidov. Ďalej sme pozorovali ultraštrukturálne zmeny v bunkách v porovnaní s kontrolnou skupinou. Hodnotením apoptózy sa tiež potvrdil negatívny účinok NiCl2, ktorý sa prejavil zvýšením odumieraním buniek po pridaní jednotlivých dávok tohoto kovu. Forgacs et al. (1997) študovali účinok NiSO4 na funkciu vaječníkov potkanov. NiSO4 pri dávke 40 mg.kg-1 narušil ovariálny cyklus a zvýšenie sekrécie progesterónu po hCG stimulácii. Krvný tlak a prúdenie krvi v ovariálnych cievach zostal nezmenený. Revesz et al. (2004) sledovali 140 účinok niklu na ľudské ovariálne granulózne bunky in vitro. Od koncentrácie závislý pokles hCG a db-cAMP stimulovanej produkcie progesterónu bol pozorovaný pri dávke 15,625 µM alebo vyššej koncentrácii Ni2+, ktorá nie je cytotoxická pre ľudské ovariálne granulózne bunky. Životaschopnosť buniek bola nezmenená pri koncentrácii do 31,25 µM a signifikantne znížená pri 62,5 µM Ni2+. Výsledky štúdie preukázali od dávky závislý pokles stimulovanej produkcie progesterónu granulóznymi bunkami pri dávke, ktorá nespôsobovala signifikantné cytotoxické deje. Výsledky poukazujú na to, že účinok Ni2+ na produkciu progesteróu nieje spôsobený cytotoxicitou. Účinok Ni2+ môže byť spojený s jeho interakciami s ďaľšími divalentnými esenciálnymi kovmi, ktoré blokujú jeho esenciálne biologické funkcie, vytláčajú esenciálne kovy alebo modifikujú ich účinnú štruktúru biomolekúl (Coogan et al., 1989). Mattison et al. (1983) po pokuse s niklom pozorovali zmenené metabolické aktivity mikrozomálnych monoxygenáz, z ktorých niektoré sú esenciálne pre steroidný metabolizmus. Revesz et al. (2004) sledovali účinok Ni2+ na ľudské granulózne bunky in vitro. Výsledky poukazujú na to, že Ni2+ nepôsobí cytotoxicky na produkciu progesterónu, a inhibične vo vnútri buniek pôsobí v miestach receptorov na membránach a na produkciu cAMP. Záver Z prezentovaných výsledkov vyplýva, že vystavenie granulóznych buniek vyšším koncentráciám NiCl2 pôsobí deštrukčne na gonadálne funkcie samíc. Nikel v tejto forme spôsobuje zníženie produkcie samičieho pohlavného hormónu progesterónu granulóznymi bunkami. Ďalej spôsobuje zvýšenie množstva apoptických granulóznych buniek, a zmeny v ultraštruktúre týchto buniek. Práca bola podporená projektami APVV-0299-06 a VEGA 1/2417/05. Literatúra 1. COOGAN, T.P., LATTA, D. M., SNOW, E. T., COSTA, M. 1989. Toxicity and carcinogenicity of nickel compounds, In: Critical Reviews in Toxicology, Vol 19. McClellan, R. O., ed.., CRC Press, Boca Raton, FL., 1989, s. 341-384. 2. MASSÁNYI, P., UHRÍN, V. 1996. Histological changes in the ovaries of rabbits after an administration of cadmium. In: Reprod Dom Anim, 1996, s. 629-632. 3. MTTISON, D. R., GATES, A. H., LEONARD, A., WIDE, M., HEMMINKI, K., COPIUS PEEREBOOM-STEQUEMAN, J. H. J. (1983). Reproductive and Developmental Toxicity of Metals: Female reproductive system. In: Reproductive and Developmental Toxicity of Metals (T.W. Clarkson, G. F. Nordberg, and P. R. Sager, eds.) Plenum Press, New York and London, pp. 43-91. 4. FORGACS, Z., PAKSY, K., VARGA, B., LAZAR, P., TATRAI, E. 1997. Effects of NiSO4 on the ovarian function in rats. In: Central european journal of occupational and environmental medicine, 1997, s. 4857. 141 5. REVESZ, C., FORGACS, Z., LAZAR, P., MATYAS, S., RAJCZY, K., KRIZSA, F., BERNARD, A., GATI, I. 2004. Effect of nickel (Ni2+ ) on primary human ovarian granulosa cells in vitro. In: Toxicology mechanisms and methods 14 (5), 2004, s. 287-292. 6. WEIBEL, ER, KISTLER, GS, SCHERLE, WF. 1966. Practical stereological methods for morpohometric cytology. In: J Cell Biol, 1966, s. 23-28. 7. ŽITNÝ, J., MASSÁNYI, P., TRAKOVICKÁ, A., RAFAJ, J., TOMAN, R. 2004. Quantification of the ovarian follicular growth in rabbits. In: Bull Vet Instit Pulawy, 2004, s, 37-40. Kontaktná adresa:Ing. Jiřina Kročková, doc. MVDr. Peter Massányi, PhD., SPU v Nitre, FBP, KFŽ, Tr. A. Hlinku 2, 94901 Nitra, [email protected], [email protected]. VPLYV MELATONÍNU NA PREJAVY ANXIETY U HYPERTENZNÝCH POTKANOV SO ZVÝŠENOU AKTIVITOU RENÍN-ANGIOTENZÍNOVÉHO SYSTÉMU INFLUENCE OF MELATONIN ON ANXIETY IN HYPERTENSIVE RATS WITH UP REGULATED RENIN-ANGIOTENSINE SYSTEM Kršková, L., Vrabcová, M., Zeman, M. Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Mlynská dolina B-2, 842 15 Bratislava [email protected] Abstract The purpose of the study was to investigate effects of melatonin (MEL) on anxiety behaviour of hypertensive rats. Mature Sprague-Dawley control normotensive rats (N, n=20) and hypertensive rats with high activity of renin–angiotensin system (H, n=20) were used. Half of each group was treated with MEL in drinking water (40 µg/ml) for 3 weeks. The influence of MEL on anxiety was measured in the elevated plus-maze test (EPM). H rats spent more time in closed arms (P<0.05) and showed low frequency of total arm entries (P<0.005) than N rats in EPM. MEL treated N rats did not exhibit differences in behaviour observed in EPM. MEL treated H rats spent less time in closed arms (P<0.05) and increased frequency of total arm entries (P<0.05) in EPM than untreated H animals. Our results suggest that MEL decreased anxiety related behaviours in H rats that were induced by over-expressed renin-angiotensin-aldosteron system. Úvod V rozvoji hyperenzie hrá veľmi dôležitú úlohu renín-angiotenzínový systém (RAS). Ten sa podieľa nielen na regulácii krvného tlaku, ale zároveň ovplyvňuje a moduluje aj mnoho so správaním súvisiacich funkcii mozgu (Braszko a kol., 2003, von Bohlen a kol. 142 2006, Saavedra a kol, 2006) vrátane pocitov úzkosti a depresie, ktoré sú považované za sprievodné znaky hypertenzie (Gard, 2004). Hypertenzné zvieratá so zvýšenou aktivitou RAS (Bachmann, 1992) poskytujú jedinečnú príležitosť na štúdium behaviorálnych účinkov hypertenzie. Vykazujú vyššiu hladinu anxiety a behaviorálne zmeny podobne behaviorálnym zmenám, ktoré sa vyskytujú u hypertenzných pacientov (Wilson a kol., 1996; Voigt a kol., 2000). Zmeny správania u hypertenzných pacientov, ale aj hypertenzných zvierat, súvisia podľa viacerých autorov (Lemmer a kol., 2003; Zeman a kol., 2005) s porušením kontrolných mechanizmov biosyntézy melatonínu. Ten moduluje vybrané formy správania (Jean-Louis a kol., 1998) a môže sa použiť aj pri liečbe stavov úzkosti (Nava a Carta, 2001). Cieľom nami prezentovanej práce preto bolo zistiť účinok melatonínu na anxietu u hypertenzných zvierat so zvýšenou aktivitou RAS. Materiál a metódy V pokuse sme použili samce normotenzných (N, n=10) potkanov a hypertenzných (H, n=10) potkanov so zvýšenou aktivitou renín-angiotenzínového systému kmeňa Sprague Dawley (dodávateľ: SEMED - Služby experimentální medicíny, PRAHA, Česká republika) vo veku 12 týždňov (361 ± 9g). Zvieratá boli chované za štandardných podmienok (teplota 21±2 °C, vlhkosťou 50-55%, svetelný režim 12h:12h svetlo/tma) po štyri v plastových klietkach o rozmeroch 57×37×19cm s podstielkou z drevených hoblín, s neobmedzeným prístupom ku štandardnej granulovanej potrave a vode. N aj H zvieratá boli na začiatku testu rozdelené na dve skupiny – neliečené (N, n=10; H, n=10) a liečené melatonínom (N MEL, n=10; H MEL, n=10). Melatonín sme zvieratám podávali (počas 3 týždňov) vo večerných hodinách v pitnej vode (40 µg/ml). Na meranie anxiety sme použili eleveted plus-maze test (Gurtman a kol., 2002). Princíp testovania spočíval v tom, že sme každé zviera v čase medzi 13:00 hod. až 15:00 hod. umiestnili na 5 min. do neznámeho prostredia - vyvýšeného bludiska v tvare znamienka plus s dvoma otvorenými (50x10cm) a s dvoma uzavretými ramenami (50×10x40cm) v strede s centrálnou zónou (10x10cm). Počas testovania sme do vopred pripravených protokolov registrovali čas (sec.) strávený v otvorenom ramene, čas (sec.) strávený v uzavretom ramene, ako aj frekvenciu vstupov do jednotlivých ramien. Štatistika 143 Na overenie štatistickej preukaznosti rozdielov medzi kontrolnou skupinou a skupinou ovplyvnenou melatonínom sme použili neparametrický Mann –Whitneyho testu. Výsledky H potkany sa v porovnaní s N potkanmi javili v elevated plus-maze teste ako viac anxiózne. Trávili viac času v uzavretom ramene (P<0,05; obr. 1) a zaznamenali sme u nich v porovnaní s N zvieratami aj vyššiu frekvenciu celkových vstupov do ramien (P<0,005; obr. 1). Melatonín podaný N zvieratám neovplyvnil ich správanie v elevated plus-maze teste (obr. 2 - a, b). U H zvierat spôsobil melatonín v porovnaní s kontrolou pokles času stráveného v uzavretom ramene (P<0,05; obr. 2 - c) a nárast celkovej frekvencie vstupov do ramien (P<0,05; obr. 2 - d). Obr. 1 - a, b. Správanie N (n=10) a H (n=10) zvierat v elevated-plus maze teste. Hodnoty sú udávané ako priemer za 20 min. ± S.E.M. Hviezdička označuje signifikantnosť rozdielov medzi testovanými skupinami (* P<0,05). * 300 a) b) 16 14 12 200 frekv encia trv anie v s ec . 250 150 100 10 * 8 6 4 50 2 0 čas v otvorenom ramene čas v uzavretom ramene 0 N N vstupy do ramien H H Obr. 2 - a, b, c, d. Správanie normotenzných (N, n=10) a hypertenzných (H, n=10) zvierat pred a po liečbe melatonínom (N MEL, n=10; H MEL, n=10) v elevated-plus maze teste. Hodnoty sú udávané ako priemer za 20 min. ± S.E.M. Hviezdička označuje signifikantnosť rozdielov medzi testovanými skupinami (* P<0,05). a) 250 b) 16 14 12 frekvencia trvanie v sec. 200 150 100 10 8 6 4 50 2 N 0 0 čas v otvorenom ramene čas v uzavretom ramene N vstupy do ramien N MEL N MEL 144 c) 300 d) * 8 * 7 250 frek v enc ia trvanie v sec. 6 200 150 100 5 4 3 2 50 1 0 čas v otvorenom ramene čas v uzavretom ramene H 0 vstupy do ramien H MEL H H MEL Diskusia V súlade s výsledkami iných autorov (Voigt a kol., 1999, 2000; Wilson a kol., 1996) sa nami testované H potkany v porovnaní s N potkanmi javili v elevated plus-maze teste ako viac anxiózne čo môže odrážať modifikáciu mozgových neurotransmiterov zahrnutých do mechanizmu kontroly anxiety ako je GABA a serotonín. Potkany so zvýšenou aktivitou RAS majú totiž podľa Voigt a kol. (1999) serotonergický systém funkčne zmenený. Model akútnej anxiety je spojený s nárastom uvoľňovania 5-hydroxytryptamínu (5HT) v hipokampe (Voigt a kol., 1999; Rodgers, 1997). Po vložení H a N potkanov do elevated plus-maze testu vzrastá u oboch skupín uvoľňovanie intrahipokampálneho 5-HT. Po spätnom vložení do prostredia domácej klietky je však jeho spätný pokles rýchlejší u H zvierat so zvýšenou aktivitou RAS (Voigt a kol., 1999). Anxiogénny profil H potkanov je charakterizovaný nárastom hladiny mozgového ANG II (Wilson, 1996) ktorý vedie k nárastu emocionality. Neuroanatomickým miestom tohto anxiogéneho efektu ANG II môžu byť AT1 a AT2 receptory v amygdale (Tsutsumi a Saavedra, 1991) a tiež AT2 receptory v locus coeruleus (Okuyama, 1999). Obe štruktúry sú totiž zahrnuté do regulácie emocionálneho správania (Tsutsumi a Saavedra, 1991). Melatonín podaný N zvieratám neovplyvnil ich správanie vo vyvýšenom bludisku v tvare znamienka plus. U H potkanov melatonín znižoval vprejavy anxiety, interagoval s up regulovaným RAS systémom a normalizoval zmeny v mozgu indukované zvýšenou aktivitou RAS. RAS má stimulačný efekt na adrenergickú neurotransmisiu (Ferrario, 1972; KLaflamme a de Champlain, 1998; DiBona, 2004). Hypotenzívny účinok melatonínu je asociovaný s inhibíciou bazálneho sympatoadrenálneho tónusu a môže byť sprostredkovaný blokádou postsynaptických alpfa1-adrenergických receptorov (K-Laflamme a kol., 1998). U H zvierat je denzita alfa1-adrenoreceptorov v porovnaní s N signifikantne vyššia (Schnabel a kol., 1997). Preto môžu byť nami získané údaje o správaní H potkanov vysvetľované 145 špecifickým účinkom melatonínu na up reguláciu alfa1-adrenoreceptors, aj keď interakcia s mozgovým RAS je tiež dôležitá. Záver Odlišný účinok MEL na správanie N a H potkanov v elevated plus-maze teste demonštruje, že u H potkanov nejde len o dôsledok zvýšeného krvného tlaku, ale že kontrola správania je rozrušená na komplexnejšej úrovni. Poďakovanie Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu vedy a techniky na základe Zmluvy č. APVT-20-022704. Literatúra Bachmann S, Peters J, Engler E, Ganten D, Mullins J. Transgenic rats carrying the mouse renin gene-morphological characterization of a low-renin hypertension model. Kidney Int. 1992; 41:24-36. Braszko JJ, Kulakowska A, Winnicka MM. Effects of angiotensin II and its receptor antagonists on motor activity and anxiety in rats. J Physiol Pharmacol. 2003; 54:271-81. DiBona GF. The sympathetic nervous system and hypertension: recent developments. Hypertension. 2004; 43:147-50. Ferrario CM, Gildenberg PL, McCubbin JW. Cardiovascular effects of angiotensin mediated by the central nervous system. Circ Res. 1972; 30:257-262. Gard PR. Angiotensin as a target for the treatment of Alzheimer's disease, anxiety and depression. Expert Opin Ther Targets. 2004; 8:7-14. Gurtman CG, Morley KC, Li KM, Hunt GE, McGregor IS. Increased anxiety in rats after 3,4methylenedioxymethamphetamine: association with serotonin depletion. Eur J Pharmacol. 2002; 446:89-96. Jean-Louis G, von Gizycki H, Zizi F. Melatonin effects on sleep, mood, and cognition in elderly with mild cognitive impairment. J Pineal Res. 1998; 25:177-83. K-Laflamme A, de Champlain J. Interaction between the sympathetic and renin-angiotensin system. Therapie. 1998; 53:245-52. K-Laflamme A, Wu L, Foucart S, de Champlain, J. Impaired basal sympathetic tone and alpha1-adrenergic responsiveness in association with the hypotensive effect of melatonin in spontaneously hypertensive rats. Am J Hypertens. 1998; 11:219-229. Lemmer B, Witte K, Enzminger H, Schiffer S, Hauptfleisch S. Transgenic TGR(mREN2)27 rats as a model for disturbed circadian organization at the level of the brain, the heart, and the kidneys. Chronobiol Int. 2003; 20:711-38. Nava F, Carta G. Melatonin reduces anxiety induced by lipopolysaccharide in the rat. Neurosci Lett. 2001; 307:57-60. Okuyama S, Sakagawa T, Inagami T. Role of the angiotensin II type-2 receptor in the mouse central nervous system. Jpn J Pharmacol. 1999; 81: 259-63. Rodgers RJ, Cao BJ, Dalvi A, Holmes A. Animal models of anxiety: an ethological perspective. Braz J Med Biol Res. 1997; 30:289-304. Saavedra JM, Benicky J, Zhou J. Angiotensin II: multitasking in the brain. J Hypertens Suppl. 2006; 24:131-7. Schnabel P, Nohr T, Nickenig G, Paul M, Bohm M. Alpha-adrenergic signal transduction in renin transgenic rats. Hypertension. 1997; 30:1356-61. Tsutsumi K, Saavedra JM. Characterization of AT2 angiotensin II receptors in rat anterior cerebral arteries. Am J Physiol. 1991; 261:667-70. 146 Voigt JP, Rex A, Sohr R, Fink H. Hippocampal 5-HT and NE release in the transgenic rat TGR(mREN2)27 related to behavior on the elevated plus maze. Eur Neuropsychopharmacol. 1999; 9:279-85. Voigt JP, Rex A, Bader M, Fink H. From genotype to phenotype--behavior of the transgenic rat TGR(mRen2)27 as an example. Rev Neurosci. 2000; 11:37-45. von Bohlen O, Halbach O, Albrecht D. The CNS renin-angiotensin system. Cell Tissue Res. 2006; 326:599-616. Wilson W, Voigt P, Bader M, Marsden CA, Fink H. Behaviour of the transgenic TGR (mREN2)27 rat. Brain Res. 1996; 729:1-9. Zeman M, Dulková K, Bada V, Herichová I. Plasma melatonin concetrations in hypertensive patients with the dipping and non-dipping blood pressure profile. Life Sci. 2005; 76:1795-803. Kontaktná adresa: RNDr. Lucia Kršková, PhD., Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Mlynská dolina B-2, 842 15 Bratislava, [email protected] EXPRESE CD14 BĚHEM APOPTÓZY POLYMORFONUKLEÁRNÍCH LEUKOCYTŮ V REZOLUCI ZÁNĚTU EXPRESSION OF CD14 DURING APOPTOSIS OF POLYMORPHONUCLEAR LEUKOCYTES IN RESOLUTION OF INFLAMMATION Langrová, T.1,2, Sládek, Z.1,2, Ryšánek, D.2 1 2 Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat, Agronomická fakulta, MZLU v Brně Oddělení Imunologie,Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i., Brno Abstract The goal of the study was to prove the effect of bacterial components (toxins of Grampositive and Gram-negative bacteria) on the expression of CD14 during an induced inflammatory reaction of the heifers mammary gland. The experimental inflammatory reaction was induced by the toxins from Gram-positive and Gram-negative pathogens, muramyldipeptide (MDP) and lipopolysaccharide (LPS); phosphate buffered saline (PBS) was used as a control. The course of the inflammatory reaction was monitored in four time points – 24 hours and 48 hours (initiation of inflammatory reaction), 72 hours and 168 hours (resolution of inflammatory reaction). Flow cytometry was used to determine portion of apoptotic polymorphonuclear leukocytes (PMNs) and portion of CD14+ PMNs. Intramammary administration of used inductors (PBS, MDP, LPS) resulted in an inflammatory reaction. with different character in the initial phase and in resolution. The results of this study reveal that, during an initiation, apoptosis of PMNs occurs, which shows an increasing trend. On the other hand a decline in the portion of apoptosis of PMNs in resolution then indicates its termination. The difference in the portion of apoptotic PMNs was the greatest after PBS, whereas after MDP and LPS it was manifested with more gradual increase. The higher portion of CD14+ PMNs was observed 72 hours after induction with PBS. A statistically highly significantly lower portion was observed after induction with MDP 147 (P<0.01), and a statistically lower portion after induction with LPS (P<0.05). Decrease in the portion of CD14+ PMNs followed. The results of this study indicate that just the bacterial toxins prolong the duration of an acute inflammation and have shown that expression of CD14 is controlled by the factors inducing inflammatory response as well as by the mechanisms of resolution. Úvod Polymorfonukleární leukocyty (PMN) plní významnou úlohu v imunitě, jsou odpovědné především za nespecifickou obranu těla proti pronikajícím mikroorganismům, zejména bakteriím (Smith, 2000). Funkcí PMN je eliminace patogenních mikroorganismů během iniciální fáze akutního zánětu, kdy dochází k migraci těchto buněk z krve do postižené tkáně. Lipopolysacharid, složka buněčné stěny G- bakterií a muramyldipeptid, jako minimální strukturální jednotka peptidoglykanu G+ bakterií, mají schopnost vyvolat ve tkáni zánětlivou reakci. PMN disponují krátkou životností a neschopností reemigrovat zpět do krevního řečiště (Hughes et al., 1997). To vytváří potencionální nebezpečí pro okolní tkáň, protože při nekróze PMN je jejich histotoxický obsah uvolněn extracelulárně. Proto je pro zachování homeostázy orgánu nutná rezoluce, tedy ukončení zánětu. Rezoluce je realizována funkční a fyzickou eliminací PMN, proto podstupují PMN programovanou buněčnou smrt, apoptózu. Apoptóza představuje fyziologický způsob zániku buňky, který je geneticky řízen, omezuje poškození zanícené tkáně a podporuje rezoluci zánětu (Savill, 1997). Rezoluce se realizuje fagocytózou apoptotických buněk makrofágy, tím se zabrání uvolňování histotoxického obsahu granulí mimo buňky. Při fagocytóze apoptotických PMN neuvolňují makrofágy prozánětlivé mediátory do extracelulárního prostoru (Meagher et al., 1992). Je tedy zřejmé, že ovlivnění délky života PMN je důležité pro průběh infekční mastitidy a návrat postižené tkáně do původního stavu bez trvalého poškození (Capuco et al., 1986). Prvním krokem eliminace apoptotických PMN je jejich identifikace makrofágy. Pro rozpoznání apoptotických PMN makrofágy jsou důležité biochemické změny realizované na povrchu cytoplazmatické membrány buněk (Akgul et al., 2001; Savill et al., 2003). Makrofágy jsou pak vybaveny specifickými receptory, které mají schopnost apoptotické PMN rozpoznat (Savill et al., 1993). Při studiu role CD14 během zánětlivé reakce mléčné žlázy byl vysloven předpoklad o aktivní účasti CD14 během rezoluce. Úloha membránového receptoru CD14 mléčné žlázy skotu byla studována u mastitidy vyvolané LPS, S. aureus a S. uberis. Bylo zjištěno, že zánětlivá reakce mléčné žlázy na LPS byla spojena s expresí CD14 receptorů PMN a makrofágů (Paape et al., 1996; Sládek et al., 2002), přičemž exprese CD14 receptoru 148 výrazně závisí na stádiu zánětlivé odpovědi mléčné žlázy. Navíc bylo zjištěno, že exprese CD14 na PMN vysoce koreluje se zastoupením apoptotických PMN (Sládek a Ryšánek, 2006). Nabízí se otázka, zda toxin G+ bakterií (MDP) rovněž ovlivňuje expresi CD14 PMN a zda je exprese CD14 řízena mechanismy rezoluce. Cílem této studie bylo tedy potvrdit nebo vyvrátit uvedené hypotézy. K tomuto účelu byla použita experimentální zánětlivá reakce mléčné žlázy, která byla indukována MDP a LPS. Materiál a metodika Pokus byl realizován na osmi klinicky zdravých jalovicích, kříženkách holštýnského a českého strakatého plemene ve věku 15-18 měsíců, ustájených certifikované pokusné stáji a krmených standardní krmnou dávkou sena a krmných doplňků. Mléčné žlázy pokusných zvířat byly před každým experimentem bakteriologicky vyšetřeny. U zvířat byla indukována zánětlivá reakce mléčné žlázy inertním činitelem (PBS), který sloužil jako kontrola a komponenty buněčné stěny Gram pozitivních bakterií (MDP) a Gram negativních bakterií (LPS). Mléčné žlázy byly vypláchnuty v jednotlivých časových bodech a buněčné suspenze byly zpracovány pro stanovení celkového počtu leukocytů a analýzu životnosti PMN ve světelném mikroskopu. Průtokový cytometr byl použit pro analýzu exprese CD14 na povrchu PMN a detekci apoptózy PMN. K vyvolání zánětlivé reakce byl použit: a) PBS – phosphate buffered saline (Sigma, Saint Louis, Missouri, USA) 0,01 M, pH 7,4, o objemu 20 ml/mléčnou žlázu, b) MDP – syntetický derivát muramyldipeptidu (MurNAc-L-Abu-DIsoGln, Institut Organické chemie a biochemie České akademie věd, Praha, Česká republika) v koncentraci 500µg ve 20 ml PBS, c) LPS – lipopolysacharid Escherichia coli, serotyp 0128:B12 (Sigma, MO, USA) v koncentraci 5 µg ve 20 ml PBS. Mléčné žlázy byly dezinfikovány 70% ethanolem, zvláště v okolí zevního ústí strukového kanálku, a následně podrobeny laváži. Laváž byla provedena pomocí upravených ureterálních katetrů (AC5306CH06, Porges S. A., France). Po indukci zánětlivé reakce byly mléčné žlázy vyplachovány podle následujícího schématu: pravá přední - 24 hod, pravá zadní - 48 hod, levá přední - 72 hod, levá zadní - 168 hod po použití příslušného induktoru. Získané laváže byly ihned po odběru posouzeny aspekcí a byly z nich odebrány vzorky pro bakteriologické vyšetření, pro stanovení celkového počtu buněk a pro stanovení vitality buněk. Byly použity pouze laváže s negativním bakteriologickým nálezem. Apoptotické PMN byly analyzovány průtokovým cytometrem (FCM) s využitím barvení Annexinem V značeným FITC (fluorescin isothiocyanate) a PI (propidium jodide) (Vermes et al., 1995). Pro barvení byl použit Annexin-V-FLUOS Staining Kit (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) dle 149 instrukcí výrobce. Detekce povrchových receptorů: jako primární a sekundární protilátky byly použity CD14 VPM65 (mouse anti-ovine, Serotec, Oxford, UK) ředěný 1:20 a fluorescein isothiocyanate značený immunoglobulin (swine anti-mouse, SwM-FITC, Sevac, Prague, Czech Republic), ředěný 1:500. Kontrolní vzorky byly barveny pouze sekundárními protilátkami. K analýze byl použit FACS Calibur flow cytometer a CELLQuest™ software (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Pořízené dot ploty byly následně vyhodnoceny za použití softwaru WinMDI 2.8 (Trotter, 2000). Analyzováno bylo vždy 20 000 PMN/dot plot. Získaná data byla statisticky zpracována programem STAT Plus software (Matoušková et al., 1992). Rozdíly v procentuálním zastoupení apoptotických, CD14+ PMN po indukci PBS, MDP a LPS byly statisticky vyhodnoceny analýzou variance (ANOVA) a významnost rozdílů Sheffeho metodou vícenásobného srovnání. Výsledky Apoptóza PMN během zánětlivé reakce Apoptóza byla detekována v populaci PMN během zánětlivé reakce indukované všemi činiteli. Podíl apoptotických PMN (Annexin+/PI- PMN) dosáhl ve sledovaném období maxima 72 h po indukci zánětlivé reakce. V tomto časovém bodě byly barvením Annexinem V zaznamenány statisticky velmi významné (P<0,01) rozdíly mezi PBS a MDP, PBS a LPS. AnnexinV+/PI- PMN (%) 60 50 PBS MDP LPS ** ** 40 * 30 20 10 0 24h 48h 72h 168h Podíl CD14+ PMN během zánětlivé reakce Z grafu je patrné, že nejvyšší podíl CD14+ PMN byl zjištěn 72 hod po indukci PBS. Statisticky vysoce významně nižší podíl byl zaznamenán po indukci MDP (P<0,01), významně nižší podíl po indukci LPS (P<0,05). Následovalo snižování podílu CD14+ PMN. 150 100 PBS 90 MDP LPS * 80 ** CD14+ (%) 70 60 50 40 30 20 10 0 24h 48h 72h 168h Diskuze Cílem této studie bylo zjistit, zda je exprese CD14 PMN ovlivněna toxinem G+ bakterií (MDP), stejně jako je tomu u LPS a zda je exprese CD14 řízena mechanismy rezoluce zánětlivé odpovědi. Zánětlivá reakce byla indukována komponenty buněčné stěny G+ (muramyldipeptid) a G- (lipopolysacharid) bakterií. Intramammární aplikace použitých induktorů (PBS, MDP, LPS) vyvolala zánětlivou reakci. Apoptóza PMN a následná fagocytóza apoptotických PMN makrofágy jsou důležité pro úspěšné ukončení reakcí akutního zánětu mléčné žlázy (Sládek a Ryšánek 2001; Van Oostveldt et al., 2002). Výsledky této studie ukazují, že během iniciace dochází k apoptóze PMN, která vykazuje vzestupnou tendenci, to naznačuje spuštění mechanizmů rezoluce mléčné žlázy (Sládek a Ryšánek, 2000, 2001). Pokles podílu apoptózy PMN v rezoluci pak naznačuje její terminaci. Změna podílu apoptotických PMN byla nejvýraznější po PBS, zatímco po MDP a LPS se projevila pozvolnějším nárůstem. V předešlých studiích bylo prokázáno, že MDP a LPS oddalují apoptózu bovinních PMN in vitro (Ryšánek et al., 2005; Liu et al., 2005) a in vivo (Sládek a Ryšánek, 2000; 2001). Z výsledků této studie je tedy zřejmé, že právě bakteriální toxiny prodlužují dobu trvání akutního zánětu. Iniciální fáze akutního zánětu vyvolaná všemi induktory (PBS, MDP, LPS) byla charakteristická nízkými podíly CD14+ PMN. Nízký podíl CD14+ PMN může být způsoben uvolňováním CD14 molekul z povrchu buňky (Paape et al., 1996). Důvodem této regulace v iniciální fázi zánětlivé reakce po indukci LPS je zabránit produkci IL-1 a TNF-α tím, že dojde k vyblokování komplexu LPS-LBP (Maliszewski, 1991). Naopak, během rezoluce podíl CD14+ PMN stoupá, což potvrzuje roli CD14 jako tzv. eat me signálu pro makrofágy. Pro ukončení akutního zánětu a návratu postižené tkáně do původního stavu je nutné, aby PMN podstoupily apoptózu, a aby byly i odstraněny z tkáně. Tuto funkci zajišťují makrofágy, které 151 rozpoznávají apoptotické PMN mimo jiné receptorem CD14. Úloha receptoru CD14 pro rozpoznání apoptotických PMN byla popsána již dříve (Gregory a Devitt, 1999; Heidenreich, 1999; Schűtt, 1999). Na mléčné žláze skotu se CD14 jeví jako kandidátní receptor pro rozpoznání apoptotických PMN makrofágy (Sládek a Ryšánek, 2006). Závěr Výsledky této studie ukázaly, že mezi zastoupením CD14+ PMN po indukci MDP a LPS nebyly zaznamenány významné rozdíly. Exprese CD14 po PBS však byla statisticky významně odlišná. Toxin G+ bakterií tedy rovněž ovlivňuje expresi CD14. Dále, že průběh zánětlivé reakce je obdobný po indukci MDP a LPS oproti PBS. To ukazuje, že exprese CD14 je řízena jak činiteli vyvolávajícím zánětlivou reakci, tak mechanismy rezoluce. Tato práce vznikla za finanční podpory výzkumného záměru MZE 0002716201 a Grantové agentury České republiky (GAČR No. 524/03/1531). Literatura AKGUL C, MOULDING DA, EDWARDS SW. Molecular control of neutrophil apoptosis. FEBS Letters 487: 318-322, 2001. CAPUCO AV, PAAPE MJ, NICKERSON SC. In vitro study of polymorphonuclear leukocyte damage to mammary tissues of lactating cows. Am J Vet Res 47(3): 663-8, 1986. GREGORY CD, DEVITT A. CD14 and apoptosis. Apoptosis 4: 11-20, 1999. HEIDENREICH S: Monocyte CD14: a multifunctional receptor engaged in apoptosis from both sides. Journal of Leukocyte Biology 65: 737-743, 1999. HUGHES JR, JOHNSON A, MOONEY C, HUGO K, GORDON J, SAVILL J. Neutrophil fate in experimental glomerular capillary injury in the rat. Am J Pathol 150: 223-234, 1997. LIU JJ, SONG CW, YUE Y, DUAN CG, YANG J, HE T, HE YZ. Quercetin inhibits LPS-induced delay in spontaneous apoptosis and activation of neutrophils. IR 54: 500-507, 2005. MALISZEWSKI CR. CD14 and immune response to LPS. Science 252: 1321-2, 1991. MATOUŠKOVÁ O, CHALUPA J, CÍGLER M, HRUŠKA K. STAT Plus. VRI Brno, 1992. MEAGHER LC, SAVILL J, BAKER A, FULLER RW, HASLETT CH. Phagocytosis of apoptotic neutrophils does not induce macrophage release of thromboxan B2. JLB 52: 269-273, 1992. PAAPE MJ, LILIUS EM, WIITANEN PA, KONTIO MP, MILLER RH. Intramammary defense against infections induced by Escherichia coli in cows. Am J Vet Res 57: 477-82, 1996. RYŠÁNEK D, SLÁDEK Z, VAŠÍČKOVÁ D, FALDYNA M. Effects of Certain Inducers of Leukocytes Migration into the Bovine Mammary Gland on Neutrophil Apoptosis Manifestation in a Subsequent in Vitro Cultivation. Physiol Res 54: 305-312, 2005. SAVILL JS, FADOK V, HENSON P, HASLETT C. Phagocyte recognition of cells undergoing apoptosis. Imunology Today 14: 131-136, 1993. SAVILL JS. Recognition and phagocytosis of cell undergoing apoptosis. British Medical Bulletin 53: 491-508, 1997. SAVILL JS, GREGORY C, HASLETT C. Cell biology. Eat me or die. Science 302: 1516-7, 2003. SCHÜTT CH. Molecules in focus, CD14. IJBCB 31: 545-549, 1999. SLÁDEK Z, RYŠÁNEK D. Apoptosis of polymorphonuclear leukocytes of the juvenile bovine mammary gland during induced influx. Vet Res 31: 553-63, 2000. SLÁDEK Z, RYŠÁNEK D. Neutrophil apoptosis during the resolution of bovine mammary gland injury. Res Vet Sci 70: 41-46, 2001. SLÁDEK Z, RYŠÁNEK D, FALDYNA M. Activation of phagocytes during initiation and resolution of mammary gland injury induced by LPS in heifers. Vet Res 33: 191-204, 2002. 152 SLÁDEK Z, RYŠÁNEK D. The role of CD14 during resolution of experimentally induced S. aureus and S. uberis mastitis. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 29: 243-262, 2006. SMITH GS. Neutrophils. In: Schalm´s veterinary hematology. BF Feldman, JG Zinkl, NC Jain. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, 281-296, 2000. TROTTER J. WinMDI 2.8 software. 2000. VAN OOSTVELDT K, PAAPE MJ, DOSOGNE H, BURVENICH C. Effect of apoptosis on phagocytosis, respiratory burst and CD18 adhesion receptor expression of bovine neutrophils. Domest Anim Endocrinol 22: 3750, 2002. VERMES I, HAANEN C, STEFFENS-NAKKEN H, REUTELLINGSPERGER C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J Immunol Methods 184: 39-51, 1995. Kontaktní adresa: Ing. Tereza Langrová, MZLU v Brně, Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat, Zemědělská 1, 613 00 Brno, [email protected] VPLYV VYBRANÝCH MIRNA KONŠTRUKCIÍ NA FUNKCIE OVARIÁLNYCH GRANULÓZNYCH BUNIEK ČLOVEKA THE EFFECT OF SELECTED MIRNA CONSTRUCTS ON THE FUNCTIONS OF HUMAN OVARIAN GRANULOSA CELLS Lauková, M.1, Sirotkin, A.V2., Grossman, R.3, Ovcharenko D.4, Mlynček M.5 1 Fakulta biotechnológie a potravinárstva, SPU v Nitre, 2 Slovenské centrum poľnohospodárskeho výskumu, Nitra, 3 Inštitút živočíšnej výroby, Mariensee, Neustadt am Rübenberge, SRN, 4 Ambion-Asuragen, Inc., Austin, Texas, USA, 5 Fakultná nemocnica Nitra Abstract The aim of our experiment was to investigate the effects of several miRNA constructs, recently discovered regulators of gene functions via RNA interference, on ovarian cell functions. Human ovarian granulosa cells were isolated, transfected with 40 different miRNA constructs and cultured for 2 days. Release of hormones (estradiol, testosterone and progesterone) and apoptosis (expression of BAX) was analyzed using radioimmunoassay and immunocytochemistry. It was observed that the majority of miRNAs decreased estradiol (mir15a, mir-29a, mir-126) and testosterone (mir-25, mir-20, mir-26a) release. Some miRNAs were able either inhibit or stimulate progesterone release (inhibitors: mir-181a, mir-20, mir29, stimulators: mir-182, mir-122, mir-125). Several miRNAs appear to be inhibitors (mir-173p, mir-20, mir-135) or promoters (mir-136, mir-29a and mir-125a ) of ovarian cell apoptosis. The obtained results represent the first demonstration of involvement of miRNAs in control of ovarian cell functions. Key words: miRNA, reproduction, hormone secretion, apoptosis, ovarian granulosa cells 153 Úvod V súčasnosti sa hľadajú možnosti ako účinne ovplyvňovať reprodukčné procesy. Intracelulárne mechanizmy regulácie proliferácie, apoptózy a sekrécie ovariálnych buniek ako aj riadenie expresie génov zapojených do týchto procesov nie sú dostatočne preštudované. Poznatky o regulácii, expresii a úlohe týchto génov umožnia lepšie spoznať mechanizmus riadenia reprodukcie. Jedným z nástrojov ako skúmať funkciu génov a intracelulárne dráhy sú mikroRNA (miRNA). Ide o krátke, nedávno objavené RNA molekuly, ktoré regulujú expresiu mnohých génov na základe RNA interferencie väzbou na 3’neprekladanú oblasť mediátorovej RNA (mRNA) (Mello a Conte, 2004). Týmto spôsobom inhibujú syntézu určitých proteínov a tým pádom zasahujú do mnohých biologických procesov (Ambros, 2004). Existujú dôkazy o účasti miRNA napr. v metabolizme tukov (Xu 2003), ontogenéze (Leaman et al, 2005), diferenciácii (Dostie, 2003), v bunkovej proliferácii a apoptóze (Cimmino et al, 2005) neovariálnych buniek. Vplyv miRNA na sekrečnú aktivitu buniek a reprodukčné funkcie doposiaľ nebol preskúmaný. Cieľom nášho experimentu bolo preto preskúmať možnú účasť miRNA v kontrole ovariálnych funkcií ľudí, konkrétne apoptózy a sekrečnej aktivity granulóznych buniek. Materiál a metodika Ako materiál boli použité ovariálne granulózne bunky (GC) človeka získané aspiráciou tekutiny z folikulov vaječníkov pacientiek FN Nitra pomocou injekčnej striekačky. Následne sme bunky premyli prepipetovaním a centrifugáciou (10 min/1500 otáčok) v médiu DMEM/F12 (BioWhittaker, Verviers, Belgium). Bunky sme resuspendovali na magnetickom miešadle v médiu DMEM/F12 (BioWhittaker) a rozpipetovali do 96-komôrkových platničiek, tzv. pre-mir Library plate #1 (Ambion, Texas, USA). V každej komôrke bola umiestnená špecifická miRNA konštrukcia. Po pridaní transfekčného reagentu JetPEI (PolyPlustransfection, Illkirch, France) sme bunky transfekovali podľa návodu výrobcu transfekčného reagentu. Platničky sme umiestnili na rocker do CO2 inkubátora pri 38,50C na dobu 4 hodín. Z komôrok sme potom odstránili transfekčné médium a pridali čerstvé kultivačné médium DMEM/F12 (BioWhittaker) + 20% FCS (BioWhittaker) o množstve 200µl/ komôrku. Platničky sme opäť nechali kultivovať na dobu 2 dní. Z každej komôrky sme potom odobrali médium pre rádioimunoanalýzu (Münster, 1989) na stanovenie množstva secernovaného testosterónu, estradioulu a progesterónu. Bunky sme zafixovali 4% paraformaldehydom. Stanovenie percenta apoptotických buniek sme uskutočnili metódou imunocytochémie (Osborn a Isenberg, 1994) pomocou protilátky viažúcej sa na pro-apoptotický BAX proteín 154 (Santa Cruz Inc., Santa Cruz, USA). Celkovo sme testovali 40 konštrukcií. Úspešnosť transfekcie sme zistili pomocou analýzy expresie markerových proteínov CREB a GAPDH bez a po transfekcii buniek siRNA konštrukciami, ktoré by mali potláčať túto expresiu. Percento buniek obsahujúcich CREB a GAPDH sme stanovili pomocou imunocytochémie. Výsledky boli spracované a vyhodnotené bežnými štatistickými metódami pomocou programu Sigma Plot 9.0 (Systat Software, Inc., CA, USA). Výsledky Porovnaním s kontrolnou skupinou transfekcia siRNA pre markerové proteíny CREB a GAPDH preukazne znižovala percento buniek obsahujúcich CREB (z 43,7% ± 3,8% na 30% ± 3,3%) a GADPH (z 51,5% ± 2,8% na 37,1% ± 3,3%), čo svedčí o úspešnosti transfekcie. Zistili sme, že väčšina miRNA znižovala sekréciu testosterónu (najmä mir-25, mir-20, mir-26a) (Graf 1) a estradiolu (najmä mir-15a, mir-29a, mir-126) (Graf 2). Niektoré miRNA boli schopné výrazne inhibovať (mir-181a, mir-20, mir-29) alebo stimulovať (mir-182, mir122, mir-125) sekréciu progesterónu (Graf 3). Určitý počet miRNA prejavil schopnosť značne zvyšovať (mir-17-3p, mir-20, mir-135) alebo znižovať (mir-136, mir-29a, mir-125a) percento apoptotických buniek (Graf 4). 30 ............................................................................................. 6 Sekrécia testosterónu (pg/10 buniek/deň) Graf 1: Vplyv transfekcie miRNA konštrukciami na sekréciu testosterónu ľudskými granulóznymi bunkami in vitro * 25 *** * * 20 * * ** ** * * * * * ** * * * * * * * * * * *** Control Let-7a Let-7b Let-7c mir-15a mir-16 mir-17-3p mir-24 mir-25 mir-26a mir-95 mir-96 mir-92 mir-108 mir-122 mir-124 mir-133B mir-134 mir-135 mir-144 mir-145 mir-146 mir-155 mir-181a mir-182 Let-7d Let-7g mir-1 mir-18 mir-19a mir-20 mir-27a mir-28 mir-29a mir-98 mir-99a mir-100 mir-125a mir-125b mir-126 mir-136 15 155 6 30 Control Let-7a Let-7b Let-7c mir-15a mir-16 mir-17-3p mir-24 mir-25 mir-26a mir-95 mir-96 mir-92 mir-108 mir-122 mir-124 mir-133B mir-134 mir-135 mir-144 mir-145 mir-146 mir-155 mir-181a mir-182 Let-7d Let-7g mir-1 mir-18 mir-19a mir-20 mir-27a mir-28 mir-29a mir-98 mir-99a mir-100 mir-125a mir-125b mir-126 mir-136 6 Sekrécia estradiolu (pg/10 buniek/deň) 50 45 40 35 1400 1300 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 Control Let-7a Let-7b Let-7c mir-15a mir-16 mir-17-3p mir-24 mir-25 mir-26a mir-95 mir-96 mir-92 mir-108 mir-122 mir-124 mir-133B mir-134 mir-135 mir-144 mir-145 mir-146 mir-155 mir-181a mir-182 Let-7d Let-7g mir-1 mir-18 mir-19a mir-20 mir-27a mir-28 mir-29a mir-98 mir-99a mir-100 mir-125a mir-125b mir-126 mir-136 Sekrécia progesterónu (pg/10 buniek/deň) Graf 2: Vplyv transfekcie miRNA konštrukciami na sekréciu estradiolu ľudskými granulóznymi bunkami in vitro 60 55 ............................................................................................. * * * ** * * * * * * * * * * * * * * * * ** * * * Graf 3: Vplyv transfekcie miRNA konštrukciami na sekréciu progesterónu ľudskými granulóznymi bunkami in vitro 2000 1900 1800 * 1700 1600 1500 * 1200 * 1100 * * * * * ............................................................................................. * * ** *** * ** ** * * * ** * *** 0 156 Graf 4: Vplyv transfekcie miRNA konštrukciami na expresiu BAX ľudskými granulóznymi bunkami in vitro 80 * 75 % buniek obsahujúcich BAX 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 * * * * * * * ........................................................................................... * * * * * * * * * * * * ** * * * * * * 5 Control Let-7a Let-7b Let-7c mir-15a mir-16 mir-17-3p mir-24 mir-25 mir-26a mir-95 mir-96 mir-92 mir-108 mir-122 mir-124 mir-133B mir-134 mir-135 mir-144 mir-145 mir-146 mir-155 mir-181a mir-182 Let-7d Let-7g mir-1 mir-18 mir-19a mir-20 mir-27a mir-28 mir-29a mir-98 mir-99a mir-100 mir-125a mir-125b mir-126 mir-136 0 Diskusia Nami získané výsledky svedčia o tom, že niektoré miRNA majú účinok na sekrečnú aktivitu a apoptózu granulóznych buniek. Na základe toho môžme usúdiť, že niekoľko miRNA môže hrať úlohu v kontrole niektorých ovariálnych procesov. Konštrukcia mir-1 znižovala množstvo vylúčeného estradiolu, progesterónu a tiež expresiu pro-apoptotického BAX proteínu, ale neovplyvnila vylučovanie testosterónu. Je známe, že skoré štádiá folikulogenézy sú typické tvorbou testosterónu, ktorý indukuje rozvoj primordiálnych folikulov a slúži ako prekurzor pre tvorbu estrogénov v granulóznych bunkách (GC) (Steckler et al, 2005). To môže svedčiť o úlohe mir-1 v tomto procese. Let-7b, Let-7c, mir-133B a mir-134 naopak, znižovali vylučovanie testosterónu a progesterónu, neovplyvňovali vylučovanie estradiolu a znižovali, prípadne neovplyvňovali expresiu BAX proteínu. Je známe, že preovulačná fáza folikulogenézy je typická najmä produkciou estradiolu proliferujúcimi GC (McNatty, 1979), čo naznačuje účasť uvedených miRNA v raste a vývoji folikulov. Mir-16, mir-24, mir-122 a mir-182 výrazne zvyšovali vylučovanie progesterónu a znižovali, prípadne neovplyvňovali sekréciu estradiolu, testosterónu a expresiu BAX, čo môže byť nepriamym dôkazom o ich spolupôsobení v procesoch ovulácie, luteinizácie GC a tvorbe corpus luteum, ktoré charakterizuje zvýšená sekrécia progesterónu (Nussey a Whitehead, 2001). Mir-29a znižovala sekréciu všetkých stanovených hormónov, zvyšovala expresiu BAX a týmto účinkom by mohla pôsobiť vo fáze regresie corpus luteum ako aj v neskorom štádiu atrézie, ktoré sú typické zvýšenou apoptózou (Quirk et al, 2003). Skorá fáze atrézie folikulov je charakteristická zvýšenou hladinou testosterónu v GC, 157 blokovaniu jeho premeny na estradiol a zvýšenou expresiou BAX proteínu, následkom čoho všetky vyvíjajúce sa folikuly, okrem dominantného, podliehajú zániku (Billig et al,1993). Mir-96, mir-92 a mir-15a svojim účinkom zodpovedajú uvedeným procesom a môžu v nich zohrávať úlohu. Podľa našich meraní mir-15a zvyšovala percento buniek obsahujúcich proapoptotický BAX, čo je v súlade s údajmi Cimmino et al (2005), kedy mir-15a indukovala apoptózu blokáciou génov pre anti-apoptotický Bcl-2 proteín v neovariálnych bunkách. Nadobudnuté výsledky ako prvé svedčia o účasti miRNA v kontrole funkcií ovariálnych buniek a ich možnom účinku vo folikulárnom vývoji a apoptóze. Mir-1 môže svojím účinkom pôsobiť vo fáze rannej folikulogenézy a indukovať vývoj primordiálnych folikulov. Následne Let-7b, Let-7c, mir-133B a mir-134 môžu nadväzovať na predchádzajúcu fázu tým, že indukujú proliferáciu GC a tým aj rast a vývoj folikulov. Ovulácia, luteinizácia a tvorba žltého telieska môžu byť sprostredkované mir-16, mir-24, mir-122 a mir-182 a následná luteolýza pomocou mir-29a. Atrézia folikulov môže byť v začiatku ovplyvnená mir-96, mir-92 a mir-15a a v konečnej fáze, typickou rozsiahlou apoptózou, pomocou mir29a. miRNA možno pokladať za účinné regulátory reprodukčných procesov. Záver Zistili sme, že niektoré miRNA znižovali sekréciu testosterónu (najmä mir-25, mir-20, mir-26a) a estradiolu (najmä mir-15a, mir-29a, mir-126). Niektoré miRNA boli schopné výrazne inhibovať (mir-181a, mir-20, mir-29) alebo stimulovať (mir-182, mir-122, mir-125) sekréciu progesterónu. Niekoľko miRNA prejavili schopnosť značne znižovať (mir-17-3p, mir-20, mir-135) alebo zvyšovať (mir-136, mir-15a, mir-29a) apoptózu (expresiu BAX). Naše pozorovania sú prvou demonštráciou, že miRNA konštrukcie môžu vystupovať ako pozitívne alebo negatívne regulátory reprodukčných funkcií ľudí (ovariálnej steroidogenézy a apoptózy). Literatúra Ambros, V. 2004: The functions of animal microRNAs. Nature, vol 431, September 2004. Billig, H., Furata, I., Hsueh, A.J.W. 1993: Oestrogens inhibit and androgens enhance ovarian granulosa cell apoptosis. Endocrinology 1993, 133:2204-2212. Cimmino, A., Calin, G.A., Fabbri, M. et al 2005: miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2. Proceeding of the National Academy of Sciences of the USA 2005, 102(39):13944-13949. Dostie J, Mourelatos Z, Yang M, Sharma A, Dreyfuss G. 2003: Numerous microRNPs in neuronal cells containing novel microRNAs. RNA 9(2): 180-6. Erratum in: RNA 9(5): 631-2. Leaman, D., Chen, P.Y., Fak, J. et al. 2005: Antisense-mediated depletion reveals essential and specific functions of microRNAs in Drosophila development. Cell. 2005, 121(7):1097-1108. McNatty KP, Makris A, DeGrazia C, Osathanondh R, Ryan KJ. 1979: The production of progesterone, androgens, and estrogens by granulosa cells, thecal tissue, and stromal tissue from human ovaries in vitro. J Clin Endocrinol Metab. 1979 Nov;49(5):687-99. 158 Mello, CC., Conte, D Jr. 2004: Revealing the world of RNA interference. Nature 2004, Sep 16;431(7006):33842. Nussey, S., Whitehead, S. 2001: Endocrinology An Integrated Approach. BIOS Scientific Publishers Ltd, 2001. ISBN 1 85996 252 1. Quirk, S.M., Cowan, R.G., Harman, R.M., Hu, C.-L., Porter, D.A. 2004: Ovarian follicular growth and atresia: The relationship between cell proliferation and survival. J. Anim. Sci. 2004. 82(E.Suppl.): E40-E52. Steckler, T., Wang, J., Bartol F.F., Roy S.K., Padmanabhan V. 2005: Fetal programming: prenatal testosterone treatment causes intrauterine growth retardation, reduces ovarian reserve and increases ovarian follicular recruitment. Endocrinology 2005: 3185-3193. Xu P, Vernooy SY, Guo M, Hay BA. 2003: The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism. Curr Biol 13(9): 790-5. Kontaktná adresa: Ing. Marcela Lauková, Katedra fzyiológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, SPU v Nitre, email: [email protected] h.doc.RNDr. Alexander Sirotkin, DrSc., VÚŽV SCPV, Oddelenie genetiky a reprodukcie, Hlohovská 2, 949 92 Nitra, email: [email protected] METABOLICKÉ PARAMETRE A ZLOŽENIE MLIEKA PRASNÍC PO PODÁVANÍ PROBIOTÍK NA BÁZE BACILLUS METABOLIC PARAMETERS AND COMPOSITION OF SOW´S MILK AFTER ADMINISTRATION OF PROBIOTIC ON BASES OF GENUS BACILLUS Link, R., Kováč, G., Húska, M., Novotný, J., Hisira, V., Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice, Komenského 73, 041 81, SR Abstract There were 2 x 16 hybrid sows included into the trial. Control and BioPlus 2B groups were balanced according to the sow parity number. The trial lasted from 2 weeks before farrowing until weaning at 4 weeks after farrowing. Control group was fed with standard feed for lactating sows, experimental one was fed with control feed (same as that of the control group) with 400 g BioPlus 2B/t feed which equals 1.28x106 CFU/g feed. Probiotic preparation BioPlus 2B consisted of equal proportion probiotic bacteria Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis, i.e. 1.6 x 109/g of preparation. Milk-samples of all sows were collected on the 3rd and 14th day of lactation. Milksamples were analyzed for cholesterol, total lipids, protein, lactose and total solids. Blood samples for determination of parameters of protein and lipid profile was taken on day 1 and 15 after parturition. The experimental group had higher content of lipids and cholesterol in milk compared with control group on day 3 and also on day 14 of lactation. The concentration of cholesterol and total proteins had slightly decreasing tendency in both groups, e.g. cholesterol decreased from 1.54%, 1.42% respectively, to 1.2% or 0.91%. On the other hand, concentration of 159 lactose increased on day 14 of lactation in both groups. No significant differences between groups were observed in total solids and lactose concentration in sow’s milk. Level of cholesterol in blood of experimental group increased. As a result, significant higher cholesterol level was found in experimental group compared to control group on day 15 (P=0.038). Similar to cholesterol, total lipids in blood of experimental group was significantly higher in comparison to control group on day 15 (P=0.007). Results of our experiment indicate that the probiotics based on representatives of the genus Bacillus are able to affect the nutrient composition, e.g. total lipids and cholesterol, of sow´s milk and consequently improve performance and average daily gains of suckling piglets. Introduction Despite some advantages related to the use of antibiotics as stimulators of growth some adverse effects related to such practice have also been noted, particularly development of resistant bacterial strains and presence of antibiotic residua in the food chain of humans. The use of antibiotic growth stimulators had been banned in Sweden and Finland before admittance of these countries to EU and a little later Denmark also joined in this effort. The states mentioned initiated gradual elimination of antibiotic stimulators throughout EU. In relation to this it is clear that we should concentrate on finding other means of prevention of the diarrhoeic syndrome of young of the farm animals and subsequent improvement in animal growth. Great potential in this direction has been associated with probiotics. Probiotics were characterised as microbial cellular preparations or components of microbial cells which are beneficial to the health and well-being of the host (Salminen et al., 1999). Recently, in addition to conventional probiotics based on genera Lactobacillus and Bifidobacterium, preparations based on representatives of the genus Bacillus come into the foreground. At present, we recognise 77 species belonging to the genus Bacillus, of which the following are used most frequently: coagulans, subtilis, clausii, cereus, toyoi (Sanders et al., 2003). In the agricultural sector, Bacillus licheniformis has also been used to improve the health status of pigs and increase their weight gains. The advantage of spores as probiotics was proved recently by La Ragione et al. (2001) who, after oral administration of Bacillus subtilis to one-day-old chicks at a dose of 2.5 x 108, observed that all symptoms of infection induced by previous inoculation of E. coli 078:K80 were suppressed. Germination of spores of Bacillus cereus var. toyoi in the intestinal samples from broiler chicks was also confirmed 160 by other authors It seems that germination of spores in the digestive tract is a precondition of the potential probiotic effect resulting in improvement of health and increased weight gains in farm animals (Jadamus et al., 2001). Material and methods There were 2 x 16 hybrid sows - all with the same genetic background (Landrace, and cross-bred, Landrace x Slovak White) included into the trial. Control and BioPlus 2B groups was balanced according to the sows parity number. Both groups consisted of 8 uniparae and 8 multiparae. From about 14 days before the anticipated farrowing date the sows were housed in conventional farrowing crates. The trial lasted from 2 weeks before farrowing until weaning at 4 weeks after farrowing. The weaning will take place from about 28 days. Control group was fed with standard feed for lactating sows, experimental one was fed with the same type of feed with 400 g BioPlus 2B/t feed, which equals 1.28x106 CFU/g feed. In both groups the piglets received the same creep feed without additives until weaning. Milk-samples of all sows were collected on the 3rd and 14th day of lactation from teats two to six between 9.00 and 11.00 hrs. Milk-samples were analyzed for cholesterol, total lipids, protein, lactose and total solids. Blood samples for determination of selected parameters of protein and lipid profile was taken on day 1 and day 15 after parturition. The blood was sampled from the eye sinus. Results In spite of the fact that no significant differences were noticed in concentration of total lipids and cholesterol in milk, the experimental group had higher content of lipids and cholesterol compared with control group on day 3 and also on day 14 of lactation. The concentration of cholesterol and total proteins had slightly decreasing tendency in both groups, e.g. cholesterol decreased from 1.54%, 1.42% resp., to 1.2% or 0.91%. On the other hand, concentration of lactose increased on day 14 of lactation in both groups. No significant differences between group were observed in total solids and lactose concentration in sow´s milk (Table 1). 161 Table 1 Level of nutrients in sow´s milk 3rd day 14th day TL - exp. group, g/100g 10.41±3.64 10.9±4.2 TL - control group, g/100g 9.14±3.80 9.31±2.31 TCh - exp. group, mmol.l-1 1.54±1.48 1.2±0.6 TCh - control group, mmol.l-1 1.42±0.85 0.91±0.35 TP - exp. group, g/100g 6.01±1.02 4.9±0.62 TP - control group, g/100g 6.16±1.55 4.69±0.49 TS - exp. group, g/100g 22.29±3.84 22.3±3.97 TS - control group, g/100g 21.26±4.32 20.54±2.09 Lactose - exp. group, g/100g 4.95±0.99 5.64±0.53 Lactose - control group, g/100g 5.06±0.99 5.77±0.35 TL – total lipids, TCh – total cholesterol, TP – total proteins, TS – total solids Serum levels of total proteins were in physiological range and had increasing tendency in both groups. Though no significant differences were revealed between groups, the increase was higher in experimental group. The albumin level was relatively uniform during the experiment and did not deflect from the reference range, but on the contrary to experimental group there was slight decrease of albumin in control group on day 15. Serum urea level increased in experimental and also in control group on day 15 in comparison with day 1. Level of urea in blood ranged from 3.66 to 4.64 mmol.l-1. No significant differences were observed between groups in individual sampling. Level of cholesterol in blood of experimental group increased. On the contrast, cholesterol level in control group was constant in both sampling. As a result, significant higher cholesterol level was found in experimental group compared to control group on day 15 (P=0.038). Similar to cholesterol, total lipids in blood of experimental group was significantly higher in comparison to control group on day 15 (P=0.007). Total lipids in experimental group were steady in both samplings, but serum lipids in control group decreased in second sampling, that caused significant difference (Table 2). 162 Table 2 Level of total proteins, albumin, urea, total lipids and cholesterol in blood of swine 0th day TP – exp. group, g.l-1 TP – contr. group, g.l 15th day 70.01±5.64 75.18±5.73 -1 70.88±4.26 72.93±8.21 Alb – exp. group, g.l-1 37.69±4.38 36.34±2.93 Alb – contr.. group, g.l-1 38.71±2.30 35.01±2.38 Urea – exp. group, mmol.l-1 3.80±1.06 4.65±0.95 Urea – contr. group, mmol.l-1 3.66±0.94 4.09±0.60 TL – exp. group, g.l-1 2.03±0.50 2.01±0.60* TL – control group, g.l 2.30±0.50 1.47±0.43* TCh – exp. group, mmol.l-1 2.03±0.62 2.25±0.58* TCh – contr. group, mmol.l-1 1.84±0.36 1.83±0.47* -1 * P < 0.05, TP – total proteins, Alb – albumin, TL – total lipids, TCh – total cholesterol Discussion Ahrens et al. (1992) conducted an experiment on weanlings and observed that digestion of proteins in the small intestine of experimental pigs was significantly better (76%) in comparison with that in the control (68%). In another experiment Ahrens et al. (1992) recorded higher weight gains (by 13%) in the experimental group supplemented with BioPlus 2B in comparison with the control, however, the differences were insignificant. Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis produce proteases, amylase, and catalases, which may explain better weight gains in the experimental group. About half of all industrially produced proteases and amylases originate from bacteria of the genus Bacillus. These enzymes support digestion of feed which is particularly important for the young of farm animals. Our results are similar to Alexopoulos et al (2004), who also revealed higher serum cholesterol concentration and serum lipids in experimental group. The increase in the values normally occurring between the first and the 15th day postpartum was more pronounced in the BioPlus 2B group, for both serum parameters examined. Conclusion Results of our experiment indicate that the probiotics based on representatives of the genus Bacillus are able to affect the nutrient composition of sow´s milk and increase some metabolic indices in blood. 163 References 1. 2. 3. 4. 5. 6. Ahrens F., Schmitz M., Warlies B.: Mikrobieller Zusatzstoff in der Ferkelfűtterung. Kraftfutter, 1992, 75, 418 – 420. Alexopoulos, C., Georgoulakis, I.E., Tzivara, A., Kritas, S.K., Siochu, A., Kyriakis, S.C.: Field evaluation of the efficacy of a probiotic containing Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis spores, on health status and performance of sows and their litters. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr., 2004, 88, 381 – 392. Jadamus A., Vahjen W., Simon O.: Growth behaviour of a spore-forming probiotic in the gastrontestinal tract of broiler chicken and piglets. Arch. Tierernahr., 2001, 54, 1 – 17. La Ragione R.M., Casua G., Cutting S.M., Woodward M.J.: Bacillus subtilis spores competitively exclude E. coli 078:K80 in poultry. Veterinary Microbiology, 2001, 79, 133 – 142. Salminen S., Ouwehand A., Benno Y., Lee Y.: Probiotics: how should they be defined? Trends in Food Science and Technology, 1999, 10, 107 – 110. Sanders M.E., Morelli L., Tompkins T.A.: Sporeformers as human probitics: Bacillus, Sporolactobacillus, and Brevibacillus. Comprehensive reviews in food science and food safety, 2003, 2, 101 – 110. 7. Kontaktná adresa: MVDr. Robert Link, PhD., II. Interná klinika, UVL, Košice, 041 81 KONCENTRÁCIA STOPOVÝCH PRVKOV V INSEMINAČNÝCH DÁVKACH LIŠIAKOV A KVALITA SPERMIÍ. CONCENTRATION OF TRACE ELEMENTS IN INSEMINATION DOSES OF FOXES AND SPERMATOZOA QUALITY. Lukáč, N., Massányi, P., 1Trandžík, J., 2Slamečka, J., 2Jurčík, R. Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre 1Štátný plemenársky ústav, Nitra, 2 Výskumný ústav živočíšnej výroby SCPV Nitra Abstract Development in industry and agriculture produce an infiltration of elements in the food chain. This also promotes the distribution of essential elements in the animal body and changes their interactions. The purpose of this study was to determine cadmium, copper, lead, nickel, iron and zinc concentration in fox insemination dose and to find relation between these contaminants and the occurrence of pathological spermatozoa. The semen samples were analyzed by atomic absorption spectrophotometry (AAS). For analysis of pathological spermatozoa samples fixed with Hancock’s solution and stained with Giemsa were prepared. The concentrations of cooper, zinc and iron in insemination doses of foxes were found to be 2.16±0.53 mg.kg-1, 13.09±5.22 mg.kg-1, and 33.16±24.36 mg.kg-1, respectively, on wet weight basis. Concentration of cadmium was low (0.07±0.05 mg.kg-1). The levels of lead and nickel in the insemination doses of foxes were 0.08±0.06 mg.kg-1 and 0.35±0.24 mg.kg-1 respectively. The total percentage of pathological spermatozoa was 7.76±1.33% with 164 predominance of knob twisted flagellum. In relation to trace elements the analysis shoved significances (P<0,001) between iron level and total number of pathological spermatozoa. These result also indicate, that concentration of trace element in insemination dose of foxes they have direct effect to the sperm quality. Key words: spermatozoa, insemination dose, fox, trace ellements Úvod Reprodukčný proces samcov závisí na komplexnom rade biologických vzťahov zahrňujúcich mnoho orgánov, typov buniek, typov molekúl ako aj presnú časovú a priestorovú koordináciu procesov. Nie je preto prekvapujúce, že tento zložitý biologický systém je zraniteľný rozličnými environmentálnymi faktormi, fyzikálnymi ako aj chemickými. Škodlivé a deštruktívne účinky medi na gonády baranov po intoxikácii oxidom meďnatým opísali Vrzgulová et al. 1993; Vrzgulová et al., 1995.. Šimoník et al., (1990) zaznamenali zastavenie pohyblivosti spermií býka v koncentrácii 0,01 µg Cu po 270 - 300 minútach. Machal et al. (2002) zistili štatisticky preukaznú pozitívnu koreláciu medzi hladinou medi v krvnej plazme a celkovým množstvom spermií v ejakuláte. Deficit zinku u mladých samcov spôsobuje atrofiu semenotvorného epitelu, poškodzuje sa vývoj gonád, čo sa primárne prejaví hypogonadizmom. U pohlavne dospelých samcov deficit zinku spôsobuje poruchy v priebehu spermatogenézy. (Cigánková et al., 1994, 1997, 1998). Zinok sa nachádza aj v spermiách. Podľa Kvista et al. (1985, 1987) a Reyesa et al. (1993) sa najviac zinku nachádza v jadre spermií. V bičíku je viazaný na sulfhydrilové skupiny a disulfidické väzby (Hidiroglou a Knipfel, 1984). Neúmerné hladiny železa vplývajú toxicky na spermie a redukujú veľkosť semenníkov mužov a potkanov (Lucesoli et al., 1999). Neúmerné hladiny železa pôsobia deštruktívne na testikulárnu funkčnosť a spermatogenézu (Merker et al. 1996; Lucesoli et al., 1999). Je dokázané poškodenie niekoľkých orgánov ako obličky, pečeň, pľúca, kosti, semenníky, vaječníky vplyvom podania kadmia (Massányi a Uhrín, 1996; Gubrely et al., 2004). Už pri nízkych dávkach kadmia semenníky stmavnú, sčervenajú a semenotvorný epitel i intersticiálne väzivo podliehajú nekróze. Parenchým sa zmenšuje, hromadí sa v ňom eozinofilná masa a zbytky bazofiných jadier. (Toman a Massányi, 1997). Podanie kadmia má za následok poruchu spermiácie od štádia IX po neskoršie štádiá spermatogenézy v semenotvornom epiteli (Scialli a Zinaman, 1993). 165 Acharya a Mishra (1995) zistili toxický účinok olova a patologické zmeny semenníka vyvolávajúce atrofiu orgánu. Cytologickým rozborom ejakulátov intoxikovaných zvierat olovom sa zistila aspermia, hypospermia, teratospermia a výrazné rozdielnosti v počte spermií (Bell a Thomas, 1980). Kendall a Scanton (1981) zistili, že pridávanie olova hrdličkám do vody počas rozmnožovacieho cyklu spôsobilo zníženie počtu spermií v ich semenníkoch. Das a Dasgupta (2002) dokázali negatívny vplyv niklu na enzýmy steroidogenézy v semenníkoch čím dochádza k alteráciam formovania testosterónu. Vplyvom niklu dochádza k poklesu hladín cholesterolu, kyseliny askorbovej a zníženiu aktivity kľúčových enzýmov steroidogenézy. Pandey et al. (1999) zistili, že po dlhodobobom podávaní niklu myšiam sa výrazne vyskytli abnormality spermií, ktoré sa prejavili poklesom motility a koncentrácie spermií. ako aj alterácie testikulárnych enzýmov. Intraperitoneálna aplikácia chloridu nikelnatého (NiCl2) myšiam vyvoláva pokles množstva a motility spermií, dochádza k chromozomálnym aberáciam ako aj ultraštrukturálnemu poškodeniu semenníka (Li a Wang, 1989). Materiál a metódy Ako materiál boli vybraní siedmi lišiaci (farma Korytov, VÚŽV Nitra), ktorí boli pripravovaní na odber niekoľko týždňov vopred. Odber bol vykonaný dvakrát do týždňa elektroejakuláciou, v celkovej anestéze použitím zmesi kyslíka a 5% halotanu kedy boli samci fixovaní na špeciálnom stolíku. Po odbere celej ejekcie sa dodalo potrebné množstvo riedidla podľa získaných hodnôt. Aktivita pred zmrazením sa u všetkých lišiakov pohybovala od 50 do 70% a tepelné testy boli medzi 10 - 20 % u všetkých zvierat. Osmolarita používaných riedidiel bola od 650 do 850 mOsm. Pre stanovenie kovov v biologických materiáloch boli použité metódy atómovej absorpčnej spektrofotometrie s atomizáciou v plameni (FAAS) a elektrotermickou atomizáciou v grafitovej kyvete s pyrolytickou vrstvou (ETAAS) (Juarsovic a Telisman, 1993). Pri metóde ETAAS bol použitý atómový absorpčný spektrofotometer Varian SpectrAA 20 BQ s elektrotermickým atomizátorom GTA 96. Pri metóde FAAS bol použitý atómový absorpčný spektrofotometer Varian SpactrAA 300A. Pri analýze výskytu patologických spermií sme zhotovovali z inseminačných dávok nátery na podložné sklíčka (Gamčík et al., 1992). Mikroskopické preparáty náterov sme hodnotili pomocou optického mikroskopu Olympus BX 51 (Tokyo, Japan). Z každej 166 inseminačnej dávky sme zhotovili dva mikroskopické preparáty na, ktorých sme hodnotili v priemere 1000 spermií. (Gamčík et al., 1992; Massányi et al., 1996). Zo získaných výsledkov laboratórnych analýz sme pomocou štatistického programu GraphPad Prism 3.02 (GraphPad Software Incorporated, San Diego California USA) a MS Excel 2003 (Microsoft Corporation, USA, ID 73408-640-0789605-57229) vypočítali základné štatistické ukazovatele, jednofaktorovú analýzu variácií pomocou Dunettovho testu a vypočítali korelácie. Výsledky Na základe výsledkov stanovenia hladín sledovaných prvkov (meď, zinok, železo, kadmium, olovo a nikel) v inseminačných dávkach sme vyhodnotili základné štatistické ukazovatele, ktoré sú uvedené v tabuľke 1. Hladiny sledovaných prvkov mali veľké smerodajné odchýlky čiže samotná variabilita sledovaného ukazovateľa bola vysoká. Hladiny stanovovaných prvkov v inseminačných dávkach boli veľmi variabilné v závislosti od plemenníka. Koncentrácie sledovaných ťažkých kovov(x ± SD) v inseminačných dávkach zvierat Tabuľka 1 Prvok Líšiaci (7) Cu (mg.kg-1) 2,16 ± 0,53 Zn (mg.kg-1) 13,09 ± 5,22 Fe (mg.kg-1) 33,16 ± 24,36 Cd (mg.kg-1) 0,07± 0,05 Pb (mg.kg-1) 0,08 ± 0,06 Ni (mg.kg-1) 0,30 ± 0,24 Analýza sledovaných inseminačných dávok lišiakov preukázala, že obsah medi je 2,16 mg.kg-1, s minimálnou hodnotou 1,00 a maximálnou 2,50 mg.kg-1. Priemerný obsah železa je 33,16 mg.kg-1, maximálnou hodnotou 74,78 mg.kg-1 a minimálnou hodnotou 9,43 mg.kg-1. Koncentrácia zinku v inseminačných dávkach lišiakov sa pohybuje od 7,40 do 21,12 mg.kg-1, s priemernou koncentráciou 13,09 mg.kg-1. Pri sledovaní obsahu kadmia v inseminačných dávkach sme zistili, že priemerná koncentrácia kadmia je 0,07 mg.kg-1 s minimálnou zistenou hodnotou 0,03 a maximálnou 0,17 mg.kg-1. Priemerný obsah olova bol 0,08 mg.kg-1 s minimálnou hodnotou 0,03 a maximálnou 0,20 mg.kg-1. Pri sledovaní obsahu niklu bol 167 zistený obsah 0,3 mg.kg-1 v rozpätí od 0,05 do 0,83 mg.kg-1. Najviac vyrovnané hladiny prvkov v inseminačných dávkach lišiakov sa zistili v prípade medi a zinku (v % 24,29% a 39,91%). Zastúpenie patologicky malformovaných spermií v jednotlivých inseminačných dávkach plemenníkov prezentuje tabuľka 2. Z celkového počtu sledovaných spermií u lišiakov bolo patologických len 7,76%, pričom 3,22% boli kľučkovite stočené bičíky, 1,99% vo forme hlavičiek bez bičíkov, 0,33% malo zlomený bičík, 0,30% malo torzo bičíka, 0,30% zvinutie bičíka (klbko), 0,29% retenciu cytoplazmatickej kvapky, 0,21% malo akrozomálne zmeny, 0,09% veľkú hlavičku, 0,01% malú hlavičku a 1,02% tvorili iné patologické formy spermií. V inseminačných dávkach boli najviac zastúpené klučkovite stočené bičíky, ktoré tvorili až 41,96% s celkového počtu patologických spermií, 25,64% tvorili zmeny zatriedené ako hlavičky bez bičíka, 4,25% zlomené bičíky, 3,87% torzo bičíka, 3,87% zvinutie (klbko) bičíka, 3,74% retencie cytoplazmatickej kvapky, 2,71% akrozomálne zmeny, 1,16% veľké hlavičky, 0,13% malé hlavičky 13,14% tvoria iné formy patologických spermií. Výskyt jednotlivých foriem patologických spermií (%) v sledovaných inseminačných dávkach plemenníkov vo vzťahu k celkovému počtu sledovaných spermií Tabuľka 2 Patologická zmena (%) Lišiaci (7) Celkový počet patologických spermií 7,76±1,33 Kľučkovité stočenie bičíka 3,22±1,01 Hlavička bez bičíka 1,99±0,82 Torzo bičíka 0,33±0,18 Zlomený bičík 0,30±0,18 Retencia cytop. kvapky 0,30±0,22 Akrozomálne zmeny 0,29±0,17 Veľká hlavička 0,21±0,25 Malá hlavička 0,09±0,11 Zvinutie (klbko) bičíka 0,01±0,03 Iné patologické spermie 1,02±0,48 V inseminačnej dávke lišiakov sme zistili vysokú preukaznosť (P<0,001) medzi celkovým percentuálnym zastúpením patologických spermií a hladinou železa (Obr. 1) v sledovanej matrici. 168 Obrázok 1 Korelačná analýza preukázala silnú pozitívnu koreláciu v inseminačných dávkach lišiakov medzi: • hladinou medi a olovom (r=0,85); • prvkami a patologickými zmenami: o meďou a inými formami patologických spermií; zinkom a zlomeným bičíkom; železom a retenciou cytoplazmatickej kvapky; kadmiom a hlavičkou bez bičíka; kadmiom a retenciou cytoplazmatickej kvapky; • patologickými zmenami: o celkovým počtom zmenených spermií a hlavičkou bez bičíka; hlavičkou bez bičíka a veľkou hlavičkou; torzom bičíka a malou hlavičkou; torzom bičíka a zlomeným bičíkom; malou hlavičkou a veľkou hlavičkou; malou hlavičkou a akrozomálnymi zmenami; malou hlavičkou a zlomeným bičíkom; akrozomálnymi zmenami a inými formami patologických spermií. Diskusia Spermie v ejakuláte nie sú tak citlivé na meď i kadmium ako spermie bez semennej plazmy (Scialli a Zinaman, 1993). Z našej práce je zrejmé, že v inseminačných dávkach sú vysoké korelačné závislosti medzi kadmiom a meďou (r=0,74), kadmiom a olovom (r=0,77) a meďou a olovom (r=0,71). Cigánková et al., (1994) zistili, že zinok je nepostrádateľný pre normálny priebeh spermatogenézy. Neúmerné hladiny železa pôsobia deštruktívne na 169 testikulárnu funkčnosť a spermatogenézu (Merker et al., 1996; Lucesoli et al., 1999). Huang et al, (2001) zistili vplyv mangánu, železa a olova na motilitu spermií a peroxidáciu lipidov. Z našich výsledkov je zrejmé, že vysoká preukaznosť medzi hladinou železa v inseminačnej dávke a výskytom patologických spermií je zapríčinené výrazným vplyvom železa na peroxidáciu lipidov a tým deštrukčnosť jednotlivých komponentov spermií. Fiorini et al., (2004) a Liao et al., (2006) dokazujú vplyv kadmia na subcelularnu inkorporáciu albumínu a prípadnú dislokáciu v thin junction Sertoliho buniek a zonula occludens. V našom experimente sme v inseminačných dávkach lišiakov zistili nízku hladinu kadmia. Je pravdepodobné, že mäsožravce, potravou príjmajú nižšie koncentrácie rizikových stopových prvkov ako bylinožravce. Massányi et al. (2007) zistili výrazný vplyv olova na semenník potkanov. Popisujú pokles relatívneho objemu semenotvorného epitelu pri vysokej koncentrácii olova. Signifikantné zvýšenie počtu abnormálnych spermií zistil Acharya et al. (2003) po podaní olova pričom došlo aj k zvýšenej peroxidácii lipidov. Znížená pohyblivosť spermií môže byť spôsobená zvýšeným výskytom spermií s morfologickými abnormalitami (Kasker, 1994). Väčšina poznatkov sa zameriava na vplyv niklu na obličky (Gitliz et al. 1975), pečeň (Knight et al. 1991). Nikel je vysoko karcinogénny prvok (Costa et al., 2005). Naše výsledky poukazujú na fakt, že nikel priamo ovplyvňujú výskyt patologických spermií v inseminačných dávkach. Tieto poznatky je možné nepriamo porovnať s výsledkami prác Danadeviho et al., (2003), ktorí zistili pozitívnu koreláciu medzi percentuálnym výskytom defektov bičíka spermií a koncentráciou niklu v krvi zváračov. Predložená práca jednoznačne konštatuje vysoké vzájomné závislosti medzi sledovanými ťažkými kovmi v inseminačných dávkach ako aj závislosti s niektorými formami patologických spermií. Poďakovanie Výskum bol realizovaný za finančnej podpory projektov VEGA 1/2417/05 a 1/4347/07. Literatúra ACHARYA U. R. – MISHRA, P.: Lead induced histopatholological changes in the testes of Swiss mice. Adv. Biosci., 1995, 14, 37-44. ACHARYA, U. R. – ACHARYA, S. – MISHRA, M.: Lead Acetate Induced Cytotoxicity in Male germinal Cells of Swiss Mice. In: Industrial Health, 2003, 41, 291-294. BELL, J. U. – THOMAS, J. A.: Effects of lead on mammalian reproduction. In: Lead toxicity. eds. SINGHAL, R. L. – THOMAS, J. A.: Baltimore, 1980, 169-185. CIGÁNKOVÁ, V. - MESÁROŠ, P. - BÍREŠ, J. - LEDECKÝ, V. - CIGÁNEK, J. - TOMAJKOVÁ, E.: Morfologické zmeny semenníkov žrebcov pri deficite zinku. In: Slov. Vet. Čas., 1998, 23,. 97-100. 170 CIGÁNKOVÁ, V. - MESÁROŠ, P. - BÍREŠ, J. - RAVASOVÁ, O. - ČERNOTA, S. - TOMAJKOVÁ, E.: Vplyv zinku na morfológiu a prežívateľnosť spermií hlbokozmrazeného semena býkov. In: Slov. Vet. Čas., 1997, 22,. 266-269. CIGÁNKOVÁ, V. - MESÁROŠ, P. - BÍREŠ, J. - TOMAJKOVÁ, E. - ČERNOTA, S. Morfologická štruktúra semenníkov býkov pri deficiencii zinku a vplyv aplikácie prípravku Zindep inj. na obnovu spermatogenézy. In: Slov. Vet. Čas., 1994, 19, 134-138. COSTA, M. – DAVIDSON, T. L. – CHEN, H. – KE, Q. – ZHANG, P. – YAN, Y. – HUANG, CH. – KLUZ, T.: Nickel carcinogenesis: Epigenetics and hypoxia signaling. In: Mutat. Resch. 2005, 528, 345-355 DANADEVI, K. – ROZATI, R. – REDDY, P. P. – GROVER, P.: Semen quality of Indian welders occupationally exposed to nickel and chromium. In: Reprod Toxicol. 2003, 17, 451-456. DAS, K. K. – DASGUPTA, S.: Effect of Nickel Sulfate on Testicular Steroidogenesis in Rats during Protein Restriction. In: Environ. Health Perspectives, 2002, 110, 923-926. FIORINI, C. - TILLOY-ELLUL A. – CHEVALIER, S. – CHARUEL, C. – POINTS, G.: Sertoli cell junctional proteins as early targets for different classes of reproductive toxicants. In: Reprod. Toxicol., 2004, 18, 413421. GUBRELAY, U. – MEHTA, A. – SINGH, M. – FLORA, S. J.: Comparative hepatic and renal toxicity of cadmium in male and female rats. In: J. Environ. Biol. 2004, 25, 65-73 HIDIROGLOU, M. A. - KNIPFEL, J.E. Zinc in mammalian sperm. A review. In: J. Dairy Sci., 1984, 67, 11471156. HUANG, Y. L. – TSENG, W. C. – LIN, T. H. In vitro effects of metal ions (Fe2+, Mn2+, Pb2+) on sperm motility and lipid peroxidation in human semen. In: J. of Toxicol. Environm. Health-part A, 2001, 62, 259267. JURASOVIC, J. – TELIŠMAN, S. Determination of Lead and Cadmium in Human Seminal Fluid by Electrothermal Atomic Absorbtion Spectrometry. In: J. Analytic Atomic Spectrometry, 1993, 8, 419-425. KASKER, H. T.: The relationship between morphology, motility, and Zone pellucida binding potential of human spermatozoa. In: Andrologia, 1994, 26, 1-4. KENDALL, R.J. - SCANLON, P.F. Effects of chronic lead ingestion on reproductive characteristics of ringed turtle doves Streptopelia risoria and on tissue lead concentrations of adults and their protein. In: Environ. Poll., 1981, 26, 203-213. KNIGHT, J. A. – PLOWMAN, M. R. – HOPFER, S. M. – SUNDERMAN JR., F. W. 1991. Pathological reactions in Lung, Liver, Thymus, amd Spleen of Rats after Subacute Parenteral Administration of Nickel Sulfate. In: Ann.Clin. Lab. Sci., 1991, 21, 275-283. KVIST, U. - BJÖRNDAHL, L. - KJELLBERG, S. Sperm nuclear zinc. Chromatin stability and male fertility. In: Scanning Microscopy, 1987, 1, 1241–1247. KVIST, U. - BJÖRNDAHL, L. - ROOMANS, G.M. - LINDHOLMER, CH. Nuclear zinc in human epididymal and ejaculated spermatozoa. In: Acta Physiol. Scand., 1985, 125, 297-303. LI, J. – WANG, X.: Toxic effect of nickel chloride on testis of mice. In: Weisheng Dulixue Zazhi, 1989, 3, 222224. LIAO, X. – TERADA, N. – OHNO, N. – LI, Z. – FUJII, Y. – BABA, T. – OHNO, S.: Immunohistochemical study of serum albumin in normal and cadmium-treated mouse testis organs by “in vivo cryotechnique”. In: Histol. Histopathol, 2006, 21, 35-40. LUCESOLI, F. – CALIGIURI, M. – ROBERTI, M. F. – PERAZZO, J. C. – FRAGA, C. C.: Dose dependent increase of oxidative damage in the testes of rats subjected in acute iron overload. In: Arch. Biochem. Biophys., 1999, 372, 37-43. MÁCHAL, L. – CHÁLEK, G. – STRAKOVÁ, E.: Copper, phosphorus and calcium in bovine blood and seminal plasma in relation to semen quality. In: Journal of Animal and Feed Sciences, 2002, 11, 425-435 MASSANYI, P. – LUKAC, N. – ZEMANOVA, J. – MAKAREVICH, A. – CHRENEK, P. – FORGACS, ZS. – SOMOSY, Z. – CIGANKOVA, V. – TOMAN, R. – LAZOR, P.: Effect of nickel administration in vivo on the testicular structure in mice. In: Acta Veterinaria (Brno), 2007, accepted. MASSÁNYI, P. – UHRÍN, V.: Histological changes in the ovaries of rabbits after an administration of Cadmium. In: Reprod. Dom. Anim., 1996, 31, 629-632. MERKER, H. J. – VORMANN, J. – GUNTHER, T.: Iron-induced injury of rat testis. In: Andrologia, 1996, 28, 267-273. PANDEY, R. – KUMAR, R. – SINGH, S. P. – SAXENA, D. K. – SRIVASTAVA, S. P.: Male reproductive effect of nickel sulphate in mice. In: Biometals., 1999, 12, 339-346. REYES, J. G. - ARRATE, M. P. - SANTANDER, M. - GUZMAN, L. - BENOS, D J. Zn (II) transport and distribution in rat spermatids. In: Am. J. Physiol., 1993, 265 (Cell Physiol. 34), 893–900. SCIALLI, R.A. – ZINAMAN, J.M. Reproductive toxicology and infertility. In: McGraw-Hill Inc., New York, 1993, 338 s. 171 ŠIMONÍK, I. - PAVELKA, J. - KUDLÁČ, E. The spermiotoxicity of selected chemical elements (Cr, Cu, Zn) in vitro. In: Reprod. Dom. Anim., 25, 1990, 242-246. TOMAN, R. – MASSÁNYI, P.: Štrukturálne zmeny semenníka a prísemenníka králika po podaní kadmia. In: SPU, Nitra, 1997. 83 s. ISBN 80-7137-420-2. VRZGULOVÁ, M. – BÍREŠ, J. – VRZGULA, L.: The effects of copper from industrial emission on the somniferous epithelium in rams. In: Reprod. Dom. Anim., 1993, 28, 108–118. VRZGULOVÁ, M. – BÍREŠ, J. – VRZGULA, L.: The microscopic structure of the testes in breeding rams after experimental copper oxide intoxication form industrial emissions. In: Folia Veterinaria, 1995, 39, 101–106. Norbert Lukáč, Ph.D., Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, SPU v Nitre, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, [email protected] REPRODUKČNÉ PARAMETRE PRI CHRONICKEJ INTOXIKÁCII ŤAŽKÝMI KOVMI U POTKANOV REPRODUCTION PARAMETERS IN CHRONIC INTOXICATION WITH HEAVY METALS IN RATS Lukačínová, A1., Beňačka, R2., Lovásová, E2., Hijová, E3., Ništiar, F2., 1Ústav fyziológie, 2Ústav patologickej fyziológie, 3Ústav experimentálnej medicíny, Lekárska fakulta, UPJŠ Košice Abstract Summary: The aim of the present investigation was to evaluate the effects of chronic intoxication with low doses of lead, mercury and cadmium dissolved in drinking water (200times above maximal permissible dosage) on reproductive potency of 80 Wistar rats (40 males; 40 females) and the physical health of their progeny. The animals were divided into 4 groups - control (C) and 3 groups intoxicated by metals (Pb, 100 µmol/l; Hg, 1 µmol/l, Cd, 20 µmol/l, respectively). Females gave births from 13th to 78th week of experiment. Parameters of reprotoxicity such as number of litters, total number of newborns (assigned in the birth day), number of newborns per litter and number of weanlings (raised youngs that reached 28th day of life) were measured in 13-week intervals. The data revealed that the number of litters and number of newborns in rats exposed to either Pb and Hg were significantly higher compared either to C or Cd group (P<0.05) and increased in the following order: Hg>Pb>Cd. Thus, while the highest numbers of litters and total count of offsprings was observed in Hg group (P <0.05), in Cd group they barely differed from control. From 13th to 39th week of exposition the number of newborns per litter was higher in all intoxicated groups compared to control (P<0.05). The burst of fertility ceased on 52nd week and later the number of newborns per litter decreased in intoxicated animals dramatically. In contract to above, the numbers of weanlings in intoxicated groups evolved in entirely opposite way. The numbers obtained from intoxicated groups were always lower compared to control (p<0.05 – 0.001) and the survival rate decreased in the order: Cd>Pb>Hg (Cd vs. Pb p <0,05, Pb vs. Hg p <0.001). The 172 exposition to mercury, thus, induced the highest reproduction rate on account of lowest survival rate of off-springs. Similar co-relations applied to other metals, too. The results suggest, that increase in reproduction rate early after intoxication onset may disclose certain reactive adaptation mechanisms. Nevertheless, number of weanlings appears to be most practical marker as to the outcome of progeny in reprotoxicity tests. Úvod Kontaminácia životného prostredia, vrátane zdrojov pitnej vody je stále aktuálnejší problém. Napriek tomu ju nesmieme akceptovať ako zákonitú realitu rozvoja spoločenského bytia. Denno denne je potrebné zaoberať sa týmto problémom a poukazovať na skutočnosti, ktoré ju môžu doprevádzať. Rozvoj priemyslu bol nutne spojený s novým spôsobom znečistenia vodných zdrojov (Bencko a spol., 1995). Pokiaľ sú tieto zdroje kontaminované nadlimitnými koncentráciami sú prijímanie racionálne opatrenia na ich eliminiáciu. Vplyv ťažkých kovov na rôzne fyziologické a biochemické parametre bol v odbornej literatúre v celku podrobne analyzovaný pre akútne intoxikácie. Pomerne málo údajov je už k dispozícii pre chronické, najmä celoživotné podmienky. Čo sa týka chronickej expozície veľmi nízkymi dávkami ťažkých kovov a multigeneračných štúdií intoxikácie rôznymi kovmi sú v literatúre len ojedinelé zmienky (Sutou a spol., 1980; Paksy a spol., 1996). Problémom je kontaminácia nízkymi dávkami. Práve chronická expozícia takýmito nízkymi dávkami môže mať ťažko predvídateľné následky nielen pre tie generácie, ktoré sú priamo exponované, ale najmä pre budúce. To nás motivovalo k multigeneračnej štúdií chronickej intoxikácie subtoxickými dávkami ťažkých kovov. Hlavným cieľom štúdia bolo sledovanie vybraných fyziologických, reprodukčných a biochemických parametrov vo vzťahu ku chronickej (celoživotnej) expozícii potkanov kmeňa Wistar veľmi nízkymi dávkami vybraných ťažkých kovov (olovo, kadmium a ortuť), za účelom výberu vhodných indikátorov chronickej intoxikácie nízkymi dávkami ťažkých kovov. V tejto práci prezentujeme časť výsledkov z parentálnej generácie a vplyvu na reprodukčné parametre. Materiál a metodika Zvieratá: Do pokusu sme zaradili 80 potkanov kmeňa Wistar (40 samičiek a 40 samcov, vo veku 4 týždňov, priemernej hmotnosti 120±19 g) a narodené mláďatá do veku 28. dní (po 28. dni boli preradené do iného pokusu). Potkany boli držané v klietkach 1 samec a 1 samička s voľným prístupom k vode a potrave. Svetelný režim bol 12 hodín svetlo 12 hodín 173 tma. Pokus bol ukončený na 156. týždeň trvania. Experimenty boli vykonané na pracovisku Centrálny zvieratník LF UPJŠ, ktoré má akreditáciu na chov laboratórnych zvierat a na vykonávanie pokusov na zvieratách v súlade s príslušnými legislatívnymi ustanoveniami. Pokusy boli schválené Etickou komisiou LF UPJŠ ako aj ŠVPS SR Č.k. Ro-7879/04-220/3. Usporiadanie pokusu: Zvieratá boli náhodne zaradené do 4 skupín (10 samíc a 10 samcov, 1 párik v každej klietke). Prvá skupina (kontrola; n=10) prijímala čistú vodu. Druhá skupina (Pb; n=10) vodu s obsahom octanu olovnatého zásaditého v koncentrácii 100 µmol/l (t.j. 20,0 mg olova/l pitnej vody, čo zodpovedalo 200 násobku MPK (maximálne prípustnej koncentrácii) vo vode. Tretia skupina (Cd; n=10) vodu s obsahom chloridu kademnatého dvojvodého v koncentrácii 20 µmol/l (t.j. 2,0 mg kadmia/l pitnej vody, zodpovedajúcemu 200 násobku MPK vo vode. Štvrtá skupina (Hg; n=10) vodu s obsahom chloridu ortutnatého v koncentrácii 1 µmol/l (t.j. 0,2 mg ortuti/l pitnej vody, zodpovedajúcej 200 násobku MPK vo vode. U všetkých skupín sme sledovali a vyhodnocovali každý týždeň nasledovné reprodukčné parametre: počet vrhov, počet vrhnutých mláďat (stanovené v deň narodenia), počet odchovaných mláďat (počet mláďat 28. deň po narodení) a ich dynamiky. Štatistické metódy: Vyhodnotenie výsledkov, výpočty a štatistické spracovanie boli vykonané s použitím Microsoft Excel a štatistické výpočty (priemerné hodnoty, smerodajné odchýlky, párový a nepárový t-test doplnený U-testom Wilcox-Mann-Whitney) boli počítané v programe Statgraphic. Na vyhodnotenie štatistickej významnosti zistených hodnôt bola použitá jednocestná ANOVA s Newman-Keulsovým post-hoc testom. Výsledky a diskusia Obdobie vrhu mláďat trvalo od 13. do 78. týždňa pokusu. Na naše veľké prekvapenie v skupinách exponovaných olovom a ortuťou bol počet vrhov (pôrodov) podstatne vyšší, ako v kontrolnej skupine (Tab. 1). Mierne nižší počet vrhov bol zaznamenaný v skupine exponovanej kadmiom. Štatistická významnosť medzi skupinami bola nasledovná: C vs Pb (P = 0,0008); C vs Cd (P = 0,0878); C vs Pb (P = 0,0006); Pb vs Cd (P = 0,0008); Pb vs Hg (P = 0,0421) a Cd vs Hg (P = 0,0027). Pri porovnaní dynamiky vrhov sa počet vrhov v skupine so suplementáciou ortuti a olova stúpal do 26. týždňa a potom počet vrhov vykazoval klesajúci trend. V prípade kontrolnej skupiny stúpajúci trend pretrvával až do 39. týždňa a potom začal klesať. Zaujímavé bolo pri kadmiu, že v priebehu prvých 52. týždňoch bol počet vrhov vyrovnaný a potom začal klesať. Aj keď je tento ukazovateľ takto samo osebe málo 174 preukazný, v porovnaní s údajmi o počte narodených mláďat, počte novorodencov na vrh a najmä počtu odstavených mláďat (Tab. 1). Tieto štyri parametre poskytujú dobré východisko pre posúdenie reprotoxicity expozície ťažkými kovmi. Tab. 1 – Vybrané reprodukčné ukazovatele v 78. týždni pokusu Ukazovateľ C Pb Cd Hg Počet vrhov 98 106 90 128 Počet mláďat na vrh 7,69 8,05 7,84 7,93 Celkový počet mláďat 754 853 706 1015 Celkový počet odstavených mláďat 686 599 606 574 % odstavených mláďat 91 70,2 85,8 56,6 Gonády sú považované za dôležitý terč toxických látok z prostredia (Sokol, 1997). Kadmium pôsobí prednostne cez depriváciu vylučovania testosterónu, cez os hypotalamushypofýza-semenníky (Lafuente a spol., 2001). Aj keď väčšina prác prezentuje negatívny účinok je potrebné si uvedomiť, že intoxikácia bola s podstatne väčšími dávkami, ako v našich podmienkach. Predpokladáme, že nami použité nízke koncentrácie ťažkých kovov v prvej etape aktivujú biologické mechanizmy smerujúce k zachovaniu druhu (vrátane aktivácie reprodukčných funkcií), a negatívne pôsobenie nastupuje až po prekročení určitého príjmu toxickej noxy. Podobne ako počet vrhov, aj počet mláďat bol najvyšší v skupine exponovanej ortuťou, signifikatne vyšší bol aj v skupine exponovanej olovom. V skupine exponovanej kadmiom bol takmer zhodný s kontrolnou skupinou. V tomto ukazovateli boli medzi všetkými skupinami štatisticky významné rozdiely. C vs Pb (P = 0,0003); C vs Cd (P = 0,0366), C vs Hg (P = 0,0006); Pb vs Cd (P = 0,0004); Pb vs Hg (P = 0,0172) a Cd vs Hg (P = 0,0013). Pri vyjadrení v absolútnych počtoch v skupine kontrolnej sa narodilo za celé obdobie pokusu 754 mláďat, v skupine intoxikovanej kadmiom to bolo len 706, oproti tomu v skupine s olovom to bolo 853 a ortuťou až 1015 novorodencov. Aj to potvrdzuje nás predpoklad, že ide o adaptačnú odpoveď na prostredie so záťažovým faktorom (zvýšené pozadie toxického ťažkého kovu). Podobne zvýšený počet vrhnutých mláďat ale za vysokého úhynu počas prvých dvoch týždňov zistili aj iní autori pri štúdiu s chronickou expozíciou, ale pri podstatne vyšších dávkach ťažkého kovu (Sutou a spol., 1980; Paksy a spol., 1996). Pri hodnotení dynamiky počtu vrhnutých mláďat počas pokusu boli výsledky veľmi podobné počtu vrhov. V prípade ortuti a olova sa narodila väčšina mláďat do 26. týždňa 175 pokusu, oproti tomu v kontrole a pri kadmiu to bolo okolo 39. týždňa. Vo väčšine skupín bol počet novorodencov rovnaký okolo 52. týždňa a potom postupne klesal až do konca 78. týždňa. V tomto období bol významnejší pokles len v skupine intoxikovanej olovom. Počet novorodencov na vrh (obr. 1) je jedným z najdôležitejších ukazovateľov reprotoxicity vo všeobecnosti. Prekvapením bolo, že do 39. týždňa najnižší počet mláďat na vrh bol zaznamenaný v kontrolnej skupine, zatiaľ čo vo všetkých pokusných skupinách bol počet mláďat vyšší. Na 52. týždeň boli počty mláďat na vrh porovnateľné a potom významne začali klesať najmä v intoxikovaných skupinách. Snáď najdôležitejším ukazovateľom reprotoxicity je počet odstavených mláďat, t.j. jedincov, ktorí sa dožili 28. dňa svojho života (Tab. 1) a to najmä v percentuálnom vyjadrení z počtu narodených mláďat. Do konca pokusu bol najnižší počet odstavených mláďat v skupine intoxikovanej ortuťou (574 mláďat), v skupinách s olovom (599 mláďat) a kadmiom (606 mláďat) bol počet porovnateľný a najvyšší bol podľa očakávania v kontrolnej skupine (686 mláďat). Rozdiely za celé trvanie pokusu boli štatisticky významné pri porovnaní skupín C vs Cd (P = 0,0386); Pb vs Cd (P = 0,0444) a Pb vs Hg (P = 0,0003). Dynamika počtu odstavených mláďat (obr. 2) sa podobala počtu narodených mláďat. Obr. 1 - Počet mľáďat na vrh počet mľáďat na 1 vrh 10 9 8 C Pb Cd Hg 7 6 5 4 13 26 39 52 65 78 trvanie pokusu v týždňoch Pri porovnaní percenta prežívajúcich mláďat z počtu narodených (obr. 2) boli významné rozdiely medzi skupinami C vs Pb (P = 0,0217); C vs Hg (P = 0,0039); Pb vs Cd (P = 0,0022); Pb vs Hg (P = 0,0204) a Cd vs Hg (P = 0,0018). 176 Obr 2 - Percento odstavených mľáďat % odstavených mľáďat 100 90 80 70 C Pb Cd Hg 60 50 40 30 20 10 13 26 39 52 65 78 trvanie pokusu v týždňoch Záver Na základe získaných poznatkov tak fyziologických, ale najmä ukazovateľov reprotoxicity je možné konštatovať, že získané výsledky sú do určitej miery prekvapivé. Významne lepšie reprodukčné parametre zistené v skupinách exponovaných ťažkými kovmi sú v protiklade s morfologickými ukazovateľmi, ktoré v prípade skupín exponovaných ťažkými kovmi, či už ohľadom výskytu tumorov alebo morfologických zmien boli podstatne horšie a v kontrolnej skupine neboli zistené (zaostávanie v raste, bezchvostosť, kožné zmeny, najmä vypadávanie srsti až alopécia, krvácanie do telových dutín, hnačky a pod.). Zaujímavé výsledky bude možné na základe našich pokusov očakávať v ďalších filiálnych generáciách. Aby bolo možné nami získané výsledky ďalej kriticky prehodnotiť a interpretovať bude potrebné v ďalšom štúdiu pokračovať a doplniť sortiment sledovaných parametrov o biochemické, imunologické a genetické ukazovatele, najmä na potvrdenie a presného mechanizmu a úlohy reaktívnych foriem kyslíka a metalotioneínu pri chronickej intoxikácii ťažkými kovmi (Sato a Kondoh, 2002), vplyv na vrodenú ako aj adaptívnu zložku imunitných mechanizmov (imunokompetenciu), aké ochranné mechanizmy sú aktivované v záujme vysporiadania sa so zvýšeným pozadím subtoxických koncentrácii ťažkých kovov v prostredí (Singh a spol., 2003; Biser a spol., 2004). Mimoriadne zaujímavou otázkou s perspektívou je aj štúdium mechanizmov karcinogenézy pri dlhotrvajúcom príjme nízkych (netoxických) dávok ťažkých kovov (Waalkes, 2003; Waisberg a spol., 2003). 177 Literatúra: 1. Bencko, V. - Cikrt, M. - Lener, J.: Toxické kovy v životním a pracovním prostředí člověka. Grada Publ., Praha, 1995: 282 s. 2. Biser, J.A. – Vogel, L.A. – Berger, J. – Hjelle, B. – Loew, S.S.: Effects of heavy metals on immunocompetence of white-footed mice (Peromyscus leucopus). J. Wildlife Dis., 40, 2004: 173-184. 3. Lafuente, A. – Márquez, N. – Pérez-Lorenzo, M. – Pazo, D. – Esquifino, A.I.: Cadmium effects on hypothalamic-pituitary-testicular axis in male rats. Exp.Biol.Med., 226, 2001: 605-611. 4. Paksy, K. – Varga, B. – Lazar, P.: Effect of cadmium on female fertility, pregnancy and postnatal development in the rat. Acta Physiol.Hung., 84, 1996: 119-130. 5. Sato, M. – Kondoh, M.: Recent studies on metallothionein: protection against toxicity of heavy metals and oxygen free radicals. Tohoku J. Exp. Med., 196, 2002: 9-22. 6. Singh, V.K. – Mishra, K.P. – Rani, R. – Yadav, V.S. – Awasthi, S.K. – Garg, S.K.: Immunomodulation by lead. Immunol.Res., 28, 2003: 151-166. 7. Sokol, R.Z.: The hypothalamic-pituitary-gonadal axis as a target for toxicants. In: Sipes, I.C. – McQueen, C.A. – Gandolfi, A.J. (Eds.): Comprehensive Toxicology. Vol. 10. Elsevier Science, Oxford, 1997: 87-98. 8. Sotou, S. – Yamamoto, K. – Sendota, H. – Sugiyama, M.: Toxicity, fertility, teratogenicity, and dominant lethal tests in rats administered cadmium subchronically. II. Fertility, teratogenicity, and dominant lethal tests. Ecotoxicol.Environ.Saf., 4, 1980: 51-56. 9. Waalkes, M.P.: Cadmium carcinogenesis. Mutat.Res., 533, 2003: 107-120. 10. Waisberg, M. – Joseph, P. – Hale, B. – Beyersmann, D.: Molecular and cellular mechanisms of cadmium carcinogenesis. Toxicology, 192, 2003: 95-117. Kontaktná adresa: Prof. MVDr. František Ništiar, CSc., Department of Pathological Physiology Faculty of Medicine, Šafárik University Trieda SNP 1, 040 66 Košice, Slovak republic Phone: +421 55 640 22 79 Fax: +421 55 642 33 50 E-mail: [email protected] VPLYV BIOFLAVONOIDOV NA HLADINU GLYKÉMIE U ALOXÁNOVÉHO DIABETU U POTKANOV THE EFFECT OF BIOFLAVONOIDS ON GLYCAEMIA LEVELS IN ALLOXAN DIABETIC RATS 1 Lukačínová, A., 2Beňačka, R., 3Mojžiš, J., 2Ništiar, F. 1Ústav fyziológie, 2Ústav patologickej fyziológie a 3Ústav farmakológie, Lekárska fakulta UPJŠ Košice Abstract The aim of the present study was to evaluate the possible protective effects of quercetin and chrysin in experimental alloxan-induced diabetes in rats (n=60). Alloxan was injected at a single dose of 60 mg/kg (to the tail vein) for diabetes induction. Flavonoids quercetin (single dose 50 mg/kg; orally) and chrysin (single dose 50 mg/kg; orally) were administered daily for 3 days prior and 7 days after alloxan injection. Alloxan induced a significant increase of glycaemia (p<0.001) in comparison with control animals. Both quercetin and chrysin prevented serum glucose elevation, although, protective effect of chrysin was weaker (p<0,001 vs. p<0.05). On the other hand, glycosuria was increased in all groups of animals receiving alloxan. We suggest that protective effect of used flavonoids in experimental diabetes mellitus may be related to their antioxidative/chelatory properties. Increased 178 glycosuria indicated that inhibition of renal glucose reabsorption may also play role in hypoglycemic effect of both flavonoids. Úvod Za posledné roky sa zhromaždil celý rad údajov o úlohe oxidačného stresu v patogenéze diabetes mellitus. Počas diabetu sú voľné radikály tvorené pri oxidácii glukózy, neenzýmovej glykácii bielkovín a následnom katabolizme glykovaných proteínov (Mehta a spol., 2006). Vysoké hladiny voľných radikálov pri súčasnom poklese antioxidačných obranných mechanizmov môžu viesť ku poškodeniu bunkových organel a enzýmov (El Naggar a spol., 2005), zvýšenej proxidácii lipidov a rozvoju inzulínovej rezistencie. Tieto následky oxidačného stresu môžu spustiť rozvoj komplikácií diabetes mellitus. Na základe týchto nových poznatkov sa upriamila pozornosť aj na kauzálnu antioxidačnú terapiu, napr. na flavonoidy. Flavonoidy (viac ako 6000) predstavujú veľkú a veľmi významnú skupinu folyfenolov v rastlinách. Nachádzajú sa v mnohých bežne konzumovaných rastlinných požívatinách ako ovocie, zelenina, víno, čaj a kakao (Ross a Kasum, 2002). Je všeobecne akceptované, že dietetické polyfenoly môžu mať významnú úlohu v ochrane organizmu pred rôznymi chronickými ochoreniami, ako sú napr. nádory, kardiovaskulárne ochorenia (Mojžišová a spol., 1999; Karaca a spol., 2006), a diabetes mellitus (Knekt a spol., 2002). Flavonoidy môžu uplatňovať svoj antioxidačný účinok rôznymi mechanizmami, napr. zhášaním alebo lapaním voľných radikálov, chelatáciou kovových iónov alebo inhibíciou enzýmových systémov zapojených do tvorby voľných radikálov (Dias a spol., 2005). O aloxáne je známe, že vyvoláva nekrózu β-buniek pankreasu (Dunn a McIechie, 1943). Bolo tiež preukázané, že aloxán indukuje tvorbu H2O2 a niektorých voľných radikálov ako O2•− a OH−, ktoré po počiatočnom poškodení môžu viesť až ku smrti buniek (Soto a spol., 1994). Z uvedených dôvodov sme sa rozhodli pre vyššie uvedený model štúdia patogenézy diabetes mellitus. Cieľom nášho štúdia bolo overiť preventívny účinok flavonoidov kvercetínu a chryzínu na aloxánom indukovaný diabetes mellitus u potkanov. Materiál a metodika Chemické látky: Aloxán (A), kvercetín (Q) a chryzín (Ch) boli od firmy Sigma Chemical Company (St. Louise, MO). Zvieratá: Do pokusu sme zaradili 60 potkanov, samcov kmeňa Wistar (150-180 g, vo veku 8 týždňov) z vlastného chovu. Pokusy boli schválené Etickou komisiou LF UPJŚ 179 a SVPS SR. Zvieratá boli držané v celoskelených metabolických klietkach za kontrolovaných podmienok (22±1 °C, vlhkosť 60±5 %, 12 h svetlo:12 h tma) s voľným prístupom k štandardnej komerčnej diéte (LD) a vody ad libitum. Každé ráno boli stanovené: hmotnosť, spotreba krmiva a vody, výdaj moča. Indukcia a ošetrenie diabetes: Diabetes bol vyvolaný jednou i.v. injekciou aloxánu v dávke 60 mg/kg živej hmotnosti po 16 hod hladovaní. Glykémie boli stanovené denne 3 dni pred a 7 dní po podaní aloxánu. Za diabetické boli považované potkany u ktorých bola zistená glykémia nad 16 mmol/l a glykozúria.. Potkany boli ošetrené flavonoidmi (kvercetín a chryzín) desať dní po sebe (od 3. dňa pred aplikáciou po 7. deň po aplikácii aloxánu) per os žalúdkovou sondou. V deň podania aloxánu boli flavonoidy aplikované 1 hodinu pred aloxánom. Usporiadanie pokusu: Potkany boli náhodne rozdelené do 6 skupín (n = 10) nasledovne: Skupina I (C): kontrolné zvieratá, dostali vehikulum v ktorom boli flavonoidy rozpustené (karboxymetyl celulózu, 1 % sondou) a namiesto aloxánu fyziologický roztok (podobne aj v skupinách II-III). Skupina II (Q50): zvieratá boli ošetrené s Q v dávke 50 mg/kg ž.hm. Skupina III (Ch50): zvieratá boli ošetrené s Ch v dávke 50 mg/kg ž.hm. Skupina IV (DC): zvieratá ošetrené aloxánom (60 mg/kg ž.hm., i.v.). U potkanov prepukol diabetes po dvoch dňoch po aplikácii aloxánu reprezentovaný hyperglykémiou a glykozúriou. Flavonoidy aj aloxán boli aplikované v skupinách V (A+Q50) – VI (A+Ch50), kde flavonoidy boli aplikované ako v skupinách II-III. Biochemické vyšetrenia: Hladiny glukózy v krvi a moči boli zisťované vždy ráno komerčným enzýmovým spektrofotometrickým (BioLaTest, Lachema,ČR). Štatistická analýza: Údaje prezentované ako priemer±S.E.M. Štatistické porovnanie vykonané dvocestnou variačnou analýzou (ANOVA) a Student-Neuman-Keulsovým post hoc testom. Za signifikantnú bola považovaná hodnota p < 0,05. 180 Výsledky Účinok kvercetínu (Q) a chryzínu (Ch) na hladinu glykémie u potkanov sú zhrnuté v grafe 1. Údaje o prírastku hmotnosti, príjme potravy a vody, výdaja moča, glukózovom indexe a asimilačnom koeficiente sú uvedené v Tab. 1. 30 glykémia v mmol/l 25 C Q5O Ch50 DC A+Q50 A+Ch50 20 15 10 5 0 -3 -2 -1 2 3 4 5 6 7 dni pred a po aplikácii aloxánu Obr. 1. Účinok kvercetínu (Q) a chryzínu na glykémiu. C – nediabetická kontrola (n=10); Q50 – nediabetické ošetrené Q (n=10); Ch50 – nediabetické ošetrené Ch (n=10); DC – diabetické kontroly bez terapie (n´10); A-Q50 – diabetické ošetrené Q (n=10); A-Ch50 – diabetické ošetrené Ch. (n=10) Table 1. – Vybrané charakteristiky potkanov ošetrených Q a Ch Skupina Prírastok Príjem Príjem Výdaj GI AQ hmotnosti (g) potravy (g) vody (ml) moča (ml) C 32±3 19,6±4 26,8±6 14,8±2 1,61 0,99 Q50 29±4 21,3±4 27,7±5 16,1±2 1,69 0,99 Ch50 31±5 22,3±6 28,6±8 18,4±3 1,69 0,97 A -2±5 32,6±7 96,0±16 92,9±9 0,58 0,46 A+Q50 27±6 22,2±4 28,1±4 19,3±4 1,35 0,95 A+Ch50 18±7 26,8±6 52,2±7 38,1±5 1,15 0,78 GI = glukózový index (glukóza v potrave/glykémia); AQ = asimilačný koeficient (glukóza v potrave/výdaj glukózy močom). V prípade normoglykemických zvierat kvercetín oproti chryzínu mierne znížil glykémiu (p = 0,034). U diabetických zvierat mali oba bioflavonoidy signifikantný účinok na zníženie 181 glykémie, ktorý bol výraznejší pri kvercetíne (p<0,001). Podobne mal kvercetín významne lepší vplyv aj na ostatné sledované parametre (Tab. 1). Glykozúria bola u všetkých diabetických skupín signifikantne zvýčená oproti nediabetickým zvieratám (obr. 2). Ukázalo sa, že kvercetín aj u tohto ukazovateľa mal významný pozitívny účinok, zatiaľ čo u chryzínu tento efekt nebol výrazný, kvercetín výrazne obmedzil nárast glykozúrie oproti diabetickej kontrolnej skupine (p<0,001) ako aj proti skupine ošetrenej chryzínom (p<0,05). Chryzín preukazoval mierny účinok na zvýšenie vylučovania glukózy močom aj u nediabetických zvierat. Tento výsledok naznačuje, že v hypoglykemizujúcom efekte chryzínu môže zohrávať určitú úlohu vylučovanie glukózy obličkami. glukóza v moči mmol/l 600 500 400 A B 300 200 100 0 C Q50 Ch50 DC A+Q50 A+Ch50 skupina (A = na začiatku pokusu; B = na konci pokusu) Obr. 2. Primerné hodnoty glykozúrie u potkanov po podaní kvercetínu a chryzínu. Legenda ako pri obr. 1. Diskusia Oxidatívny stres ako významný činiteľ v patogenéze diabetes a diabetických komplikácií bol v posledných rokov intenzívne študovaný tak na animálnych modeloch, ako aj u pacientov v klinických štúdiách. Význam peroxidácie lipidov a oxidačného stresu v patogenéze diabetu bol potvrdený aj na animálnych modeloch (Anjaneyulu a Chopra, 2004). Účinok aloxánu pri selektívnej deštrukcii β-buniek pankreasu bol prvý krát popísaná v roku 1943 (Dunn a McIechie; 1943). Od tej doby viacerí autori potvrdili úlohu voľných 182 radikálov pri poškodzovaní buniek aloxánom. Aloxán, ako chemický diabetogén, je v prítomnosti glutatiónu redukovaný cez aloxánový hemiacetál na aloxantín. V priebehu tohto redukčného cyklu sa uvoľňujú reaktívne formy kyslíka, ktoré poškodzujú β-bunky pankreasu (Winterbourn a Munday, 1989). V toxicite aloxánu sa pripisuje významná úloha aj prechodným kovom ako je, železo, zinok a meď (Szkudelski, 2001). V predloženej štúdii sme potvrdili, že kvercetín, čiastočne aj chryzín, mali preventívny účinok na rozvoj glykémie a čiastočne aj glykozúrie u aloxánového diabetu u potkanov. Podobné výsledky boli popísané ohľadom normalizácie glykémie kvercetínom u potkanov so streptozotocínom indukovaným diabetes (Mahesh a Manon, 2004; Coskun a spol., 2005). O chryzíne sme literárne údaje v tomto ohľade nenašli. Ak predpokladáme antioxidačný mechanizmus tohto antidiabetogenného efektu vysvetlením rozličných účinkov u oboch flavonoidov v naších pokusoch môže byť ich odlišná štruktúra. Tá môže zohrávať významný vplyv na ich antioxidačné vlastnosti (Chen a spol., 2002), pretože pre účinné zhášanie voľných radikálov sa vyžadujú 3’,4’-dihydroxy skupiny (katecholová štruktúra) v beta kruhu, ktoré u chryzínu, na rozdiel od kvercetínu chýbajú (obr. 3, Tab. 2). Obr. 3. Základná štruktúra flavonoidu Tab.2. Chemická štruktúra kvercetínu a chryzínu Flavonoid Substituents 3 5 7 2´ 3´ 4´ 5´ Quercetin OH OH OH H OH OH H Chrysin H OH OH H H H H Uvedené štruktúrne rozdiely medzi oboma flavonoidmi môžu byť zodpovedné za ich odlišný mechanizmus a efektívnosť účinku. Kvercetín okrem výrazných antioxidačných účinkov (zhášanie voľných radikálov) disponuje aj výraznými chelatačnými účinkami (Okamoto, 2005). Oproti tomu má chryzín len mierne antioxidačné účinky a nemá chelatačné vlastnosti (Furusawa a spol., 2005). 183 Naše výsledky preukazujú, že denné ošetrenie 50 mg/kg ž.hm. kvercetínu per os má preventívny účinok na nový aloxánom indukovaného diabetes mellitus a obmedzí nárast glykémie zvierat v hornom rozsahu hodnôt euglykémie. Menej výrazný účinok chryzínu, ale najmä významný glykozurický efekt sú pravdepodobne výsledkom ich odlišného mechanizmu. Jedným z vysvetlení je, že mnohé flavonoidy môžu účinne inhibovať reabsorpciu glukózy v obličkových tubuloch inhibíciou sodík-glukózových symportérov (Hongu et al., 1998; Maghrani et al., 2005). To, že oba flavonoidy znižujú glykémiu môže priniesť viaceré klinické aplikácie pri prevencii komplikácií diabetes. Presné mechanizmy účinku bude potrebné ďalej študovať. Záver Naše výsledky naznačujú, že kvercetín a čiastočne aj chryzín vykazujú ochranný (preventívny) účinok na aloxánom indukovaný diabetes mellitus u potkanov. Predpokladáme, že to spočíva v ich antioxidačných, resp. chelatačných účinkoch. Navyše, na ich hypoglykemizujúcom účinku sa môže významne podielať aj inhibícia reabsorpcie glukózy v obličkových tubuloch. Táto práca bola podporovaná Grantovou agentúrou Ministerstva školstva SR (VEGA 1/3494/06). Literatúra 1. Anjaneyulu, M. – Chopra, K.: Quercetin, an anti-oxidant bioflavonoid, attenuates diabetic nephropathy in rats. Clin.Exp.Pharmacol.Physiol., 31, 2004: 244-248. 2. Chen, J.W. – Zhu, Z.Q. – Hu, T.X. – Zhu, D.Y.: Structure-activity relationship of natural flavonoids in hydroxyl radical-scavenging effects. Acta Pharmaco. Sin., 3, 2002: 667-672. 3. Coskun, O. – Kanter, M. – Korkmaz, A. – Oter, S.: Quercetin, a flavonoid antioxidant, prevents and protects streptozotocin-induced oxidative stress and β-cell damage in rat pancreas. Pharmacol.Res., 51, 2005: 117-123. 4. Dias, A.A. – Porawski, M. – Alonso, M. – Marroni, N. – Collado, P.S. – González-Gallego, J.: Quercetin decreases oxidative stress, NF-κB activation, and iNOS overexpression in liver of streptozotocininduced diabetic rats. J.Nutr., 135, 2005: 2299-2304. 5. Dunn, J.S. – McIechie, N.G.B.: Experimental alloxan diabetes in the rat. Lancet, 245, 1943: 484-487. 6. El Naggar, E.M.B. – Bartošíková, L. – Žemlička, M. – Švajdlenka, E. - Rabišková, M. – Strnadová, V. – Nečas, J.: Antidiabetic effect of Cleome droserifolia aerial parts: Lipid peroxidation-induced oxidative stress in diabetic rats. Acta Vet.Brno, 74, 2005: 347-352. 7. Karaca, T. – Cemek, M. – Kanter, M.: Lipid peroxidation and antioxidant levels, and alpha naphtyl acetate esterase activity of peripheral blood lymphocytes in mallard, muscovy and pekin ducks. Acta Vet.Brno, 75, 2006: 33-38. 8. Knekt, P. - Kumpulainen, J. - Järvinen, R. – Rissanen, H. – Heliövaara, A. – Hakulinen, T. – Aromaa, A.: Flavonoid intake and risk of chronic diseases. Am.J.Clin.Nutr., 76, 2002: 560-568. 9. Maghrani, M. – Michel, J.-B. – Eddouks, M.: Hypoglycaemic activity of Retama raetam in rats. Phytother.Res., 19, 2005: 125-128. 10. Mahesh, T. – Menon, V.P.: Quercetin allievates oxidative stress in streptozotocin-induced diabetic rats. Phytother. Res., 18, 2004: 123-127. 184 11. Mehta, J.L. – Rasouli, N. – Sinha, A.K. – Molavi, B.: Oxidative stress in diabetes: A mechanistic overview of its effects on atherogenesis and myocardial dysfunction. Int.J.Biochem.Cell.Biol., 38, 2006: 794-803. 12. Mojžišová, G. – Petrášová, D. – Koprovičová, J.: Flavonoids with antioxidant action and their effect on human health. Slovakofarma Rev., 9, 1999: 35-37. 13. Okamoto, T.: Safety of quercetin for clinical application (Review). Int.J.Mol.Med., 16, 2005: 275-278 14. Ross, J.A. – Kasum, C.M.: Dietary flavonoids: bioavailability, metabolic effects, and safety. Ann.Rev.Nutr., 21, 2002: 19-34. 15. Soto, C. – Muriel, P. – Reyes, J.L.: Pancreatic lipid peroxidation in alloxan-induced diabetes mellitus. Arch.Med. Res., 25, 1994: 377-380. 16. Szkudelski, T.: The mechanism of alloxan and streptozotocin action in B cells of the rat pancreas. Physiol.Res., 50, 2001: 536-546. 17. Winterbourn, C.C. – Munday, R.: Glutathione-mediated redox cycling of alloxan. Mechanisms of superoxide dismutase inhibition and of metal-catalyzed OH formation. Biochem.Pharmacol., 38, 1989: 271277. Kontaktná adresa: Prof. MVDr. František Ništiar, CSc., Department of Pathological Physiology Faculty of Medicine, Šafárik University Trieda SNP 1, 040 66 Košice, Slovak republic Phone: +421 55 640 22 79 Fax: +421 55 642 33 50 E-mail: [email protected] VPLYV POSTAVENIA CECKOV A TYPU TOKU MLIEKA NA JEDNOTLIVÉ PARAMETRE TOKU MLIEKA EFFECT OF TEAT PLACEMENT AND MILK FLOW PATTERN ON MILK FLOW PARAMETERS Mačuhová L., Uhrinčať M., Margetín M., Mačuhová J., Tančin V. Výskumný ústav živočíšnej výroby, SCPV, Hlohovská 2, Nitra, [email protected] Abstract Milk flow is influenced by anatomy of udder, teat (size, shape, placement teat) and neuro – humoral reaction ewes on milking. Mainly traits of teat and cistern are considered very good parameters of milkability ewes by machine milking. The trial was performed with 70 ewes. We evaluated milk flow, cisternal depth and teat placement. Cisternal depth and teat placement were evaluated by a linear evaluation system (cisternal depth /HC/: 1 point – shallow, 9 points – deep; teat placement /PC/: 1 point – vertical, 9 points - horizontal). From 165 measured milk flow were 27 % unimodal (1V), 48 % bimodal (2V), 22 % plateau I (PI ) and 3 % plateau II (PII). Ewes with more horizontally positioned teats had higher the volume of milk yield 0.233 ± 0.041 l /≤ 3 points/, 0.343 ± 0.031 l /4 points/, 0.394 ± 0.028 l /5 points/, 0.411 ± 0.023 l /≥6 points/; P < 0,0004) and machine milk yield (0.180 ± 0.038 l /≤3 points/, 0.279 ± 0.028 l /4 points/, 0.296 ± 0.026 l /5 points/, 0.303 ± 0.022 l /≥6 points/; P < 0,0183). The traits of milkability were 63 ± 2 s, 15 ± 1 s, 0.946 ± 0.046 l/min, 0.217 ± 0.012 l by the time of machine milking, latency, maximal milk flow and milk yield of the first emission at bimodality. There were observed positive and significant 185 correlations (P < 0,0001) between these traits (maximal flow, yield in 30s, yield in 60 s, yield after the first peak of milk flow from machine milking, except latency) and milk yield, machine milk yield. Positive and significant correlations were between yield (milk yield, machine milk yield) and PC, HC. Úvod Charakteristiky dojenia a morfológia vemena patria medzi faktory, ktoré ovplyvňujú dojiteľnosť oviec. Znalosti o úžitkovosti, čase dojenia a stavbe vemena sú nevyhnutné pre optimálne prispôsobenie prostredia dojenia pre potreby bahnice. Veľkosť, tvar a utváranie vemena sú dané geneticky (Fernández a kol., 1997) a hrajú dôležitú úlohu v uložený mlieka medzi dojeniami a uvoľňovaní mlieka v čase dojenia (Labussière, 1988). Preto sa v poslednej dobe kladie dôraz na lineárny systém hodnotenia vlastností vemena. Tieto údaje sa využívajú hlavne pre budúce genetické selekčné programy (de la Fuente a kol., 1996; Margetín a kol., 2005). Dojiteľnosť môže byť hodnotená pomocou analýz kriviek tokov mlieka, charakteristík dojenia a meraní, hodnotení morfologických vlastností vemena (Dzidic a kol., 2004). Vzťahy medzi morfologickými a produkčnými vlastnosťami u dojných oviec sú analyzované ako výsledok anatomických a fyziologických charakteristík (Caja a kol., 2000). Preto sme sa v tejto práci zamerali na vplyv typu toku mlieka a postavenia ceckov na jednotlivé parametre toku mlieka. Materiál a metóda Experiment sa uskutočnil v mesiaci máj na účelovom hospodárstve Slovenského centra poľnohospodárskeho výskumu Nitra v Trenčianskej Teplej. Do pokusu bolo zaradených 70 bahníc plemien cigája, zošľachtená valaška, lacaune. Ovce boli dojené dvakrát denne v dojárni 1 x 24. Parametre dojacieho zariadenia boli: frekvencia pulzácie 180 cyklov za minútu, pulzačný pomer 50:50 a podtlak 40 kPa. Merania sme uskutočnili počas troch po sebe nasledujúcich večerných a troch raňajších dojení. Z ukazovateľov lineárneho popisu vemena sa podľa metodiky Margetína (2002) hodnotila hĺbka cisterny a postavenie ceckov deň pred začatím pokusu. Meranie parametrov intenzity toku mlieka sme robili podľa metodiky Marneta a Negraoa (2000). Klasifikácia dynamiky toku mlieka sa hodnotila podľa metodiky Bruckmaiera a kol. (1997) a Rovai a kol. (2002). Celkovo sme hodnotili 165 priebehov toku mlieka. K štatistickému hodnoteniu sme použili Proc Mixed Model štatistického programu SAS/ 8.2 (2002). Sledovali sme vplyv typu toku mlieka (jednovrcholový – nebimodálny (1V), dvojvrcholový – bimodálny (2V), vyrovná fáza toku mlieka dlhšia ako 20 s a maximálnym tokom mlieka nad 0,4 l/min (PI) a pod 0,4 l/min (PII)) a postavenia 186 ceckov (1.skupina ≤ 3 body, 2. skupina = 4 body, 3. skupina = 5 bodov, 4. skupina > 6 bodov lineárnej škály). Štatistická významnosť vplyvu jednotlivých faktorov zahrnutých do modelu bola stanovená použitím Fisherovho F-testu. Pre pozorované vlastnosti sme k stanoveniu rozdielností v rámci jednotlivých efektov použili Scheffeho multiple range test. Výsledky Základné ukazovatele dojiteľnosti oviec zaradených do pokusu sú uvedené v tabuľke 1. Zistili sme pomerne veľkú variabilitu nameraných parametrov úžitkovosti a charakteristík toku mlieka. Celkový výdojok bol 0,400 ± 0,013 l, pričom množstvo mlieka získaného dodájaním tvorilo 24,30 ± 1,32 %. Čas dojenia sa pohyboval od 19 do 150 s. Bimodalita bola zaznamenaná pri 80 tich tokoch mlieka. Čas začiatku toku druhého vrcholu toku mlieka bol 42 ± 1 s. Z celkového počtu nameraných tokov mlieka bolo 44 tokov mlieka typu 1V (27 %), 80 tokov typu 2V (48 %), 36 tokov typu PI (22 %) a 5 tokov typu PII (3 %). Celkový výdojok sa pohyboval pri toku 1V 0,321 ± 0,023 l, 2V 0,380 ± 0,018 %, PI 0,450 ± 0,029 l a pri PII 0,229 ± 0,069 l (tabuľka 2). Najvyšší strojový dodojok bol nameraný pri 1V 40,27 ± 2,23 % a najnižší pri PI (17,07 ± 2,78 %). Vplyv postavenia ceckov na niektoré parametre dojiteľnosti sa nachádzajú v tabuľke 3. Skupina 1 mala celkový výdojok 0,233 ± 0,041 l a skupina 4 0,411 ± 0,023 l. Najvyšší dodojok bol zaznamenaní pri postavení ceckov v skupine 4. (0,108 ± 0,011 l) a najnižší v skupine 1 (0,053 ± 0,019 l). Preukazné a pozitívne korelácie boli pozorované medzi celkovým výdojkom a ostatnými sledovanými charakteristikami dojenia okrem množstva mlieka získaného dodájaním, latentnej doby a času dosiahnutia bimodality. Preukazné a pozitívne korelácie boli tiež zistené medzi celkovým výdojkom a postavením ceckov (r = 0,3445; P < 0,0035), hĺbkou cisterny (r = 0,4656; P < 0,0001) (tabuľka 4). Diskusia Tok mlieka 2V bol zaznamenaný v 48 % a PI v 22 %. Pri týchto typoch kriviek toku mlieka sa predpokladá, že došlo k ejekcii mlieka, a teda počas dojenia by sme mali získať mlieko cisternové aj alveolárne. Množstvo mlieka získané dodájaním by malo byť nižšie ako pri toku mlieka 1V, PII keďže v týchto prípadoch sa nepredpokladá vznik ejekcie mlieka (Marnet a kol., 1998). Čo nám potvrdili aj nami namerané hodnoty. Čas začiatku druhého vrcholu toku mlieka sa pohyboval okolo 42 s. Podobné výsledky zaznamenal aj Margetín a kol. (2005). Počas pokusu sme pozorovali, že čím sú horizontálnejšie postavené cecky tým viac mlieka sme získali prostredníctvom strojového dojenia. Negatívom je však zvyšovanie objemu mlieka získaného pomocou dodájania. Horizontálne postavené cecky môžu mať vplyv na znižovanie účinnosti dojenia a to hlavne kvôli predlžovaniu času dojenia, či už kvôli dodájaniu alebo padaniu 187 ceckových nástrčiek (Labussiere, 1988). V našom prípade preukazné výsledky sa prejavili iba medzi postavením ceckov 2 - 3 a 6 pri množstve mlieka získaného pomocou dodájania. Tento aspekt je často pozorovaný pri bahniciach, kde prebehla selekcia zameraná len na produkciu mlieka, čo viedlo k zhoršeniu morfológie vemena (Caja a kol., 2000). Vysoké dodojky sú spôsobené tým, že časť cisternového mlieka sa nachádza pod ústím ceckového kanálika (Bruckmaier a kol., 1997), čo sa ale v našom prípade nepotvrdilo, nakoľko iba málo bahníc prekročilo v lineárnej deväť bodovej škále 6 bodov. Ďalším aspektom je, že postavenie ceckov sa s poradím laktácie zhoršuje (Margetín, 2005). Preukazné a pozitívne výsledky sme zaznamenali medzi hĺbkou cisterny a množstvom mlieka získaného za 60 s dojenia. Z tohto nám teda vyplýva, že čím je cisterna hlbšia je väčší priestor nielen na uskladňovanie mlieka medzi dojeniami, ale aj možnosť kontinuálneho presunu mlieka z alveol do cisterny počas dojenia (Dzidic a kol., 2004). Príkladom toho je tok mlieka PI, kde počas dojenia je získané najprv cisternové a potom hneď kontinuálne alveolárne mlieko. Za 60 s pri tomto type toku mlieka sme získali najväčší objem mlieka počas strojového dojenia a najnižšie percentuálne množstvo mlieka získané pomocou dodájania v porovnaní s ostatnými tokmi mlieka. Postavenie ceckov a hĺbka cisterny preukazne ovplyvňovali celkový aj strojový výdojok. Za najvhodnejšie bahnice na strojové dojenia môžeme považovať bahnice s veľkou kapacitou cisterny a vertikálne postavenými ceckami. Veľký dôraz sa musí klásť hlavne na postavenie ceckov, pretože zvieratá s horizontálne postavenými ceckami dosahujú vyššiu produkciu, avšak majú vyššie dodojky ako zvieratá s vertikálne postavenými ceckami, čo je však z pohľadu účinnosti strojového dojenia nežiaduce. Literatúra Bruckmaier R.M, Paul G., Mayer H. and Schams D., 1997a. Machine milking of Ostfriesian and Lacaune dairy sheep: udder anatomy, milk ejection and milking characteristics. J. Dairy Res. 64:163-72. Caja G., Such X. and Rovai M., 2000. Udder morphology and machine milking ability in dairy sheep. In: Proceedings of the 6th Great Lakes Dairy Sheep Symposium November 2-4, 2000. Guelph, Ontario, Canada. str. 17-40. De la Fuente L. F., Fernández G. and San Primitivo F., 1996. A linear evaluation system for udder traits of dairy ewes. Livest. Prod. Sci. 45: 171-178. Dzidic A., Kaps M. and Bruckmaier R. M., 2004. Machine milking of Istrian dairy crossbreed ewes: udder morphology and milking characteristics. Small. Rum. Res. 55: 183-189. Fernández G., Baro J. A., de la Fuente L. F. and San Primitivo F., 1997. Genetic parameters for linear udder traits of dairy ewes. J. Dairy Sci. 80: 601-605. Labussière J., 1988. Review of physiological and anatomical factors influencing the milking ability of ewes and the organization of milking. Livest. Prod. Sci. 18: 253-274. 188 Margetín, M., Apolen, D., Čapistrák, A., Špánik, J. and Margetínová, J., 2002. Cielené vylepšovanie tvarových a funkčných vlastností vemena oviec plemena cigája a zošľachtená valaška pre strojové dojenie. Výskumná správa za účelovú činnosť, Trenčianská Teplá, str. 57 Margetín M., Milerski M., Apolen D., Čapistrák A. and Špánik J., 2005. Spúšťanie mlieka bahníc v prvých 60 sekundách strojového dojenia. J. Farm. Anim. Sci. 38: 201 – 210. Marnet P. G. and Negrao J.A., 2000. The effect of a mixed-management system on the release of oxytocin, prolactin, and cortisol in ewes during suckling and machine milking. Reprod. Nutr. Dev. 40: 271-281. Tabuľka 1: Základná charakteristika súboru. The basic characteristic of data. 1 Ukazovateľ 17 2 Celkový výdojok (CV), l 0,400 0,013 0,050 0,980 3 Strojový výdojok (SV), l 0,310 0,012 0,030 0,970 4 Strojový dodojok (SD), l 0,090 0,006 0 0,550 5 SD z CV, % 24,30 1,32 0 92,11 6 Čas dojenia, s 63 2 19 150 7 Latentná doba, s 15 1 6 82 8 Maximálny tok, l/min 0,946 0,046 0,180 3,230 9 Výdojok za 30 s, l 0,173 0,008 0 0,550 Priemer 18 Str.chyba Minimum Maximum 10 Výdojok za 60 s, l 0,279 0,011 0,010 0,960 11 Výdojok za 30 s zo SV, % 58,59 1,94 0 100 12 Výdojok za 60 s zo SV, % 87,50 1,42 0 100 13 Bimodalita bola pri 80 14 Čas dosiahnutia bimodality, s 42 1 22 80 15 Výdojok prvého toku, l Výdojok prvého toku k SV, % 0,217 65,74 0,012 2,24 0,030 7,69 0,560 94,12 16 1 Trait, 2Milk yield, 3Machine milk yield, 4Stripping, 5Stripping from milk yield, 6 Milking time, 7Latency, 8Maximal flow, 9Milk yield in 30 s, 10Milk yield in 60 s, 11 Milk yield in 30 s from machine yield, 12Milk yield in 60 s from machine yield, 13 Bimodality was by 90 milkings, 14Begining of bimodality, 15 Milk yield of the first emission at bimodality, 16 Milk yield of the first flow from machnine milking, 17Average, 18Median error, 189 Tabuľka 2 Vplyv doby dojenia a typu toku mlieka na sledované parametre dojiteľnosti. The effect of the evening and morning milking and the type of milk flow on milkability 1 14 Ukazovateľ 15 2 Celkový výdojok (CV), l 3 Strojový výdojok (SV), l 16 Bimodálny Nebimodálny 0,0001 5 20,94 ± 1,77a 40,27 ± 2,23b 6 66 ± 2 a 7 14 ± 1a a Latentná doba, s 1,033 ± 0,082 Výdojok za 60 s, l 11 Výdojok za 30 s zo SV, % 12 Výdojok za 60 s zo SV, % a,b,c a,b,c 1-12 ab 0,061 ± 0,032 0,0012 26,58 ± 6,64ab < 0,0001 a 85 ± 8 < 0,0001 a 71 ± 3 18 ± 2a a 0,983 ± 0,098 a 0,172 ± 0,016 ab 0,169 ± 0,064c a 17,07 ± 2,78a 17 ± 1a 0,177 ± 0,014 10 0,069 ± 0,013 b 9 Výdojok za 30 s, l b 44 ± 3 8 Maximálny tok, l/min P 0,310 ± 0,017ac 0,198 ± 0,021bc 0,381 ± 0,027a 0,123 ± 0,011 Čas dojenia, s Plateau II F-test 0,0009 0,070 ± 0,008 SD z CV, % 17 0,380 ± 0,018abc 0,321 ± 0,023ac 0,450 ± 0,029b 0,229 ± 0,069ac 4 Strojový dodojok (SD), l 13 Tok mlieka 17 Plateau I 31 ± 4b ab 0,754 ± 0,120 a 0,133 ± 0,019 ab < 0,0001 ab 0,220 ± 0,269 ab 0,050 ± 0,041 a 0,140 ±0,058 b 0,0109 b 0,0066 b 0,277 ± 0,020 0,225 ± 0,023 0,309 ± 0,027 61,34 ± 2,53a 77,98 ± 3,05b 42,27 ± 3,71c 28, 08 ± 8,33d < 0,0001 88,57 ± 2,37 87, 36 ± 2,96 83,97 ± 3,67 66,35 ± 8,49 0,0737 0,0027 Priemery v tom istom riadku a pri rovnakom faktore s nerovnakými písmenami sa od seba odlišujú na úrovni P< 0.05. Averages in the same line and by the identical factor with different letter are different 13 14 15 16 17 18 See tab.1, F- test, Milk flow, Bimidality, Unbimodality, Plateau I, Plateau II Tabuľka 3: Vplyv postavenia ceckov na sledované parametre dojiteľnosti The effect of the teat placement on milkability 1 Postavenie ceckov 4 ≤3 2 Celkový výdojok 18 17 Ukazovateľ 5 ≥6 F-test P 0,233 ± 0,041a 0,343 ± 0,031ab 0,394 ± 0,028b 0,411 ± 0,023b 0,0004 a ab ab b 0,0183 3 Strojový výdojok (SV), l 0,180 ± 0,038 4 Strojový dodojok (SD), l 0,053 ± 0,019ab 0,064 ± 0,014a 0,097 ± 0,013ab 0,108 ± 0,011b 0,0064 5 SD k CV 29,90 ± 3,98 21,08 ± 2,96 27,03 ± 2,70 26,85 ± 2,25 0,1213 6 Čas dojenia, s 62 ± 5 67 ± 4 66 ± 4 71 ± 3 0,369 7 Latentná doba, s 25 ± 2a 18 ± 2ab 19 ± 2ab 18 ± 1b 0,0246 8 Maximálny tok, l/min 0,850 ± 0,192 0,548 ± 0,147 0,777 ± 0,130 0,816 ± 0,106 0,3517 9 Výdojok za 30 s, l 0,110 ± 0,034 0,124 ± 0,026 0,135 ± 0,023 0,163 ± 0,019 0,3801 0,279 ± 0,028 0,296 ± 0,026 0,303 ± 0,022 10 0,185 ± 0,048 0,233 ± 0,037 0,263 ± 0,033 0,270 ± 0,026 0,3905 11 59,015 ± 5,924 47,574 ± 4,579 50,259 ± 4,029 52,817 ± 3,287 0,3686 12 73,126 ± 5,408 86,343 ± 4,090 84,700 ± 3,660 82,081 ± 3,030 0,1452 35 ± 4 40 ± 3 43 ± 3 45 ± 2 0,1293 0,182 ± 0,043 0,196 ± 0,037 0,189 ± 0,034 0,237 ± 0,023 0,5501 Výdojok za 60 s, l Výdojok za 30 s zo SV, % Výdojok za 60 s zo SV, % 13 Bimodalita 14 Čas dosiahnutia bimodality, s Výdojok prvého toku, l 15 1-16 See tab.1, 17 teat placement, 18 F - test a,b,c Priemery v tom istom riadku a pri rovnakom faktore s nerovnakými písmenami sa od seba odlišujú na úrovni P< 0.05. a,b,c Averages in the same line and by the identical factor with different letter are different 190 Tabuľka 4: Vplyv postavenia ceckov na sledované parametre dojiteľnosti The effect of the teat placement on milkability Ukazovateľ 2 CV 3 4 DO 6 9 14 15 0,1851 0,3681** -0,1059 0,5159*** 0,6222*** 0,8824*** -0,2310 0,3958** -0,1782 0,5453*** 0,6416*** 0,9791*** -0,0309 0,7457*** 0,2631* 0,3517** -0,0745 0,1799 -0,0849 -0,0641 -0,2708* 0,4503 -0,0741 0,1887 0,2653* 0,4149** -0,1233 -0,1079 0,2254 0,0175 -0,0025 0,2861* 0,1838 -0,3939 -0,5784 -0,2810 0,3691 -0,4524 0,0784 0,0169 0,7846*** 0,5856*** -0,1396 0,5624** -0,0767 0,0459 0,6962*** -0,1285 0,8407*** 0,0458 0,1924 -0,0775 0,7443*** 0,2349 0,3012* 0,2763 0,3534* 0,0007 0,1367 V30 10 V60 CDBI V60 CDBI 0,1278 VPRT HC 0,9134*** MT V30 17 CD LD MT PC DO CD 7 8 SV LD 16 SV 0,6779*** 0,3445** 0,4656*** 0,1449 VPRT 1-15 See tab.1, 16 teat placement, 17cisternal depth * P< 0,05 **P<0,01 ***P<0,001 DVOJETAPOVÁ INDUKCIA A SYNCHRONIZÁCIA ESTRU V STÁDE OVIEC DETERMINOVANÁ POČTOM A ZDRAVOTNÝM STAVOM PLEMENNÝCH BARANOV TWO STAGE INDUCTION AND SYNCHRONISATION OF OESTRUS IN FLOCK OF SHEEP DETERMINATE BY NUMBER AND HEALTH CONDITION OF RAMS. Maraček, I., Vlčková, R., Jankurová, J., Klapáčová, K., *Horňáková, Ľ., *Pošivák.J. Ústav fyziológie, Katedra normálnej anatómie, histológie a fyziológie, *Klinika pôrodníctva, gynekológie a andrológie UVL Košice Abstract This work was focused on oestrus induction and synchronisation of Tsigai sheep that occurred from physiology anoestrus period in spring. Implementation of rational biotechnical reproduction control program to be properly „tailored“ for the individual flock of ewes proves to be an assumption how to obtain high fertility, higher yields of slaughter milk lambs production for Christmas markets. Oestrus induction and synchronisation by means of the combination of gestagen- and eCG-based preparation consisted in (1) application of vaginal sponge impregnated with gestagen, (2) i.m. injection of eCG based preparation at the time of gestagen discontinuing, and (3) observation and making records on fertilization. This biotechnical control of oestrus was carried out during two stages in the experimental flock sheep which was determinate by limited number rams in the breeding period. 191 Úvod Indukcia a synchronizácia ruje oviec v mimosezónnom období je významnou biotechnickou metódou riadenej reprodukcie v stádach s produkčným zameraním na jatočné jahňatá na vianočný trh. Racionálne uplatnenie týchto biotechnických metód intenzifikácie reprodukcie nie je možné bez využitia a zohľadnenia poznatkov o biologických zákonitostiach dejov reprodukčného cyklu a fyziologického priebehu jeho jednotlivých fáz a štádií regulovaných neurohumorálne (Goodman, 1994; Goodman a i, 2002; Maraček, 1993, 1995, 1997; Maraček a i. 1993, 2002; 2004 Vlčková a i., 2006). Výsledky plodnosti oviec limitujú zvyšovanie stavov, determinujú produkciu jatočných jahniat a zároveň sú významným ukazovateľom nielen chovateľskej úrovne, zdravotného stavu bahníc v príslušnom chove, ale aj vzdelanostnej, odbornej a kultúrnej úrovne manažmentu i personálu chovateľa (Maraček, 2002). V súčasnom období nezriedka je limitujúcim činiteľom dosahovanej úrovne reprodukcie stáda nedostatočný počet plemenných baranov na pripúšťanie a málo využívaná inseminácia oviec. V práci sme sa zamerali na riešenie problému menšieho počtu držaných plemenných baranov než ako by bolo potrebné pre jarnú mimosezónnu indukciu a synchronizáciu estru a overili sme postup dvojetapovej metódy rozvrhnutej podľa dostupného počtu baranov a tak sme zabezpečili plánovanú produkciu jatočných mliečnych jahniat na vianočný trh. Materiál a metódy Pokusné stádo. Overovací pokus sme vykonali v jednom chove zvolenského typu cigáje. Stádo bolo držané v podmienkach bežného úžitkového chovu. Stádo oviec sa v období sledovania chovalo tradičným pastevným spôsobom, salašnícky, s extenzívnou a polointenzívnou pastvou. Indukciu a synchronizáciu ruje i prípravy baranov na pripúšťanie sme začali v poslednej dekáde apríla a trvali do konca druhej dekády mája s ukončením pripúšťania 20. – 25. mája v roku sledovania. V rámci prípravy experimentálnych sledovaní bolo celé stádo vrátane baranov odčervené a upravili sa im paznechty. Ovce a barany zaradené na ošetrenie pre mimosezónne pripúšťanie dostali kŕmny prídavok (flushing) jadrového krmiva (0,40 – 0,50 kg na zviera a deň) od 15. apríla do ukončenia pripúšťania. Indukcia a synchronizácia estru. Na indukciu a synchronizáciu ruje boli ovce ošetrené s fluorogestónacetátom (FGA) v dávke 40 mg v pošvovom polyuretánovom tampóne prípravku Chrono-gest (Intervet), ktorý bol podávačom inštalovaný do pošvy na dobu 12 dní. V čase vysadenia tampónu sme i.m. injikovali 500 I.U. eCG (sérový ekvinný choriový 192 gonadotropín) v prípravku Sergon inj. a. u. v. (Bioveta a.s.). Na druhý deň po vybratí tampónov a podaní eCG sa začalo pripúšťanie. V prvej etape bolo ošetrených na indukciu estru (27. 04. 2006) 197 klinicky zdravých oviec v druhej etape (09. 05. 2006) sa ošetrilo 207 klinicky zdravých zvierat spolu celkom 404 oviec stáda. Dve etapy boli zvolené limitovaným počtom 30 baranov, ktorí boli k dispozícii na pripúšťanie v aktuálnom mimosezónnom období. Týmto postupom sa zabezpečilo, že na jedného plemenného barana pripadlo 6,6 – 6, 9 oviec s indukovaným estrom na pripustenie. Štatistická analýza dosiahnutých výsledkov. Rozdiely vo výsledkoch medzi dvoma etapami sme štatisticky hodnotili χ2 – testom (chí-kvadrátový test). Výsledky a diskusia Z ošetrených 404 oviec sa obahnilo 330 bahníc a to predstavuje 81,7 % a z nich porodilo dvojičky 82 bahníc t.j. 24,8% a jedna bahnica porodila štyri jahňatá. Neobahnilo sa 74 ošetrených oviec a to predstavuje 18,3 %-nú jalovosť. Spolu sa narodilo 418 jahniat a odchovalo sa 411 jahniat pripravených ako mliečne jatočné jahňatá na vianočný trh.. Zistili sme pritom, že v období od 2. do 15. októbra sa obahnilo 125 bahníc a narodilo sa 189 jahniat a to znamená, že 64 (51.2%) obahnených oviec porodilo dvojičky, čo predstavuje v reprodukčných parametroch natalitu 151,2 jahniat na 100 obahnených bahníc. Kým v období od 18. októbra do 12. novembra sa obahnilo 205 bahníc a narodilo sa 229 jahniat, pričom 24 (11,7%) porodilo dvojičky a to v reprodukčných ukazovateľoch predstavuje natalitu 111,7 narodených jahniat na 100 obahnených zvierat. Celkom z dvoch etáp spolu vychádza natalita v hodnote 126,7 jahniat na 100 obahnených bahníc v rámci celého stáda zaradeného na mimosezónne pripúšťanie. Pri štatistickom hodnotení týchto výsledkov sme zistili signifikantne vyšší ovulačný pomer (OR) a následne viac pôrodov dvojičiek rezultujúci vo vyššej natalite po prvej etape ošetrenia P<0.001. Výsledky štatistickej analýzy poukazujú aj nato, že prvá etapa ošetrenia sa vyššou mierov podieľa na celkovom dosiahnutom výsledku. Z porovnania dosiahnutých výsledkov po uplatnení biotechniky riadenej reprodukcie s údajmi o plemennom štandarde a chovnom cieli oviec plemena slovenské merino (SM), slovenská cigája (SC) a zošľachtená valaška (ZV) s úžitkovým typom zameraným na mäso a mlieko (Margetín, 1996; Margetín a i., 1996) vyplýva možnosť dosiahnutia plodnosti na obahnenú ovcu (natalita) podľa plemien SM 120 až 127 %, SC 117 až 123 % a ZV 113 až 118 % v úžitkových chovoch, ktorú sme dosiahli v sledovaných chovoch v rámci kontroly úžitkovosti v rokoch 2000 až 2001 (Žatkovič, 2001) a podľa kontroly úžitkovosti 193 v šľachtiteľských a rozmnožovacích chovoch v kontrolnom roku 2001/2002 bol dosiahnutý v SR priemerný výsledok podľa plemien: SM-šľach.-131,6 %, SM-rozm.-128,1 %; SC-šľach.129,6 %, SC-rozm.-115,4 %; ZV-šľach.-122,3 %, ZV-rozm.-119,1 % (Štefanková, Machynová, Matta, 2003), prirodzene bez biotechnických postupov. Podľa novších literárnych údajov treba pri rozhodovaní o počte bahníc pripadajúcich na jedného plemenného barana vychádzať z veku barana, jeho vyvinutosti, kondície a sexuálneho libida, dĺžky trvania obdobia a spôsobu pripúšťania (Vahid, Kóbori, 2002). Pri voľnom pripúšťaní (zaradením baranov do stáda na 4 – 5 týždňov) treba na jedného barana v strednom veku počítať s 40 – 50, na starého barana 30 – 40 a na mladého barana 15 – 20 bahnicami. Pri synchronizácii ruje je treba počítať s trikrát väčším počtom baranov. Na jedného barana by nemalo pripadať viac ako desať bahníc. Výsledky sledovania vplyvu synchronizácie ruje na výskyt počtu bahníc s pôrodom dvojičiek z overovacieho experimentu dokladajú priebežné výsledky analýzy plodnosti úžitkového stáda oviec plemena cigája u realizátora, ktoré boli realizované v programe prípravy mliečnych jatočných jahniat na vianočný trh s indukciou estru v dvoch etapách v poslednom týždni apríla 2006 a v prvej dekáde mája 2006 s cieľom bahnenia v októbri a v prípade prebiehaviek až v prvej dekáde novembra. Pri prirodzenom pripúšťaní po synchronizácii ruje oviec prípravkami na báze gestagénov a sérového ekvinného chóriového gonadotropného hormónu (eCG) je potrebný taký počet plemenných baranov, aby na jedného pripadlo menej ako 19 ošetrených oviec. V prípade indukcie a synchronizovaní estru len časti oviec v stáde treba zabezpečiť barany v takom počte, aby na jedného pripadlo do desať ošetrených oviec. Záver V overovacom experimente priamo v úžitkovom stáde na farme oviec úžitkového chovu sa získali cenné poznatky o význame chovateľských manažmentských opatrení pri zabezpečení využívania biotechnických metód riadenej reprodukcie v systéme mimosezónnej reprodukcie v stáde chovu oviec. Bola overená metóda etapového postupu uplatnenia indukcie fertilnej ruje v anestrickom jarnom období v príprave stáda na produkciu jatočných mliečnych jahniat na vianočný trh. Limitujúcim faktorom pre dvojetapový postup bol počet baranov ako aj príprava jatočného produktu vo vyššej aj nižšej hmotnostnej kategórii. Zaujímavé je pritom zistenie, že po prvej etape bol vyšší výskyt pôrodov dvojičiek. Z tohto úspešne overeného výsledku bol vypracovaný návrh priebežného realizačného výstupu z riešenia projektu. 194 Literatúra 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. GOODMAN, R. L.: Neuroendocrine control of the ovine estrous cycle. In: The physiology of reproduction. Ed.: E. Knobil and J. Neil et al., Raven Press. New York, 1994, 659 – 709. KOSTECKÝ, M., KRAJNIČÁKOVÁ, M., VALOCKÝ, I., POŠIVÁK, J., ŠUTIAKOVÁ, I., MARAČEK, I.: Selekcia negravidných oviec pomocou ultrasonografie. Agriculture (Poľnohospodárstvo), 49, 2003, 69 – 74. MARAČEK, I.: Využiteľnosť biotechnických metód v riadení reprodukcie oviec v súčasných podmienkach hospodárskej transformácie. Veterinářství, 43, 1993, 62 – 65. MARAČEK, I.: Riadená reprodukcia v chove oviec. In: Využitie vedeckých poznatkov pre efektívny chov oviec v trhových podmienkach. Ed.: D. Ochodnický. VÚŽV – Stanica chovu a šľachtenia oviec a kôz, Trenčín, 1995, 85 – 89. MARAČEK, I.: In: Moderný chov oviec a kôz. Ed.: D. Ochodnický. VÚŽV – Stanica chovu a šľachtenia oviec a kôz, Trenčín, 1997, 67 – 77. MARAČEK, I.: Prevention and treatment of reproductive diseases in sheep. In: Proceedings from 13th Congress of Hungarian Association for Buiatrics „The effect of herd health of cattle, sheep and goat on the profitable production“. Ed.: Szenci, O. and Brydl, E., Hajdúszoboszló, 10 – 12 October 2002, 147 – 154. MARAČEK, I., HENDRICHOVSKÝ, V., MALECKÝ, E., LABAJ, J.: Hodnotenie plodnosti a objektivizácia intenzity reprodukcie v chove oviec. Veterinářství, 35, 1985, 461 – 464. MARAČEK, I., HENDRICHOVSKÝ, V., KRAJNIČÁKOVÁ, M., LAZÁR, L.: Dominant follicle selection in sheep after cloprostenol administration. Slov. vet. čas., 18, 1993, 9 – 14. MARAČEK,I., HENDRICHOVSKÝ, V., KRAJNIČÁKOVÁ, M.: Súčasné problémy reprodukcie oviec v podmienkach Slovenska. Slov. vet. čas., 20, 1995, 60 – 66. MARAČEK, I., KRAJNIČÁKOVÁ, M., KOSTECKÝ, M., GRÉSEROVÁ, G., VALOCKÝ, I.: Tertiary follicular growth wave dynamics after oestrus synchronization and superovulation in ewes and goats. Acta vet. Brno, 71, 2002, 481 – 486. MARAČEK, I., KRAJNIČÁKOVÁ, M., KOSTECKÝ, M.: Aktuálnosť monitoringu plodnosti a kvality ejakulátu baranov. Chov oviec a kôz, 23, 2003, (2), 20 – 22. MARGETÍN, M.: Plemenný štandard a chovný cieľ merinských oviec. Chov oviec a kôz, 17, 1996, (4), 11 – 12. MARGETÍN, M., ČAPISTRÁK, A., KALIŠ, M.: Plemenný štandard a chovný cieľ oviec plemena cigája a zošľachtená valaška. Chov oviec a kôz, 17, 1996, (2 – 3), 4 – 7. ŠTEFANKOVÁ, M., MACHYNOVÁ, A., MATTA, M.: Kontrola úžitkovosti oviec a kôz 2001/2002. Štátny plemenársky ústav SR, Vydavateľstvo Slovenský Chov, 2003. VAHID, Y., KÓBORI, J.: Juhtenyésztők kézikönyve. Szaktudás Kiadó Ház, Budapest, 2002. VLČKOVÁ, R., KOSTECKÁ, Z., FAIGL, V., MARTON, A., KERESZTES, M., ÁRNYASI, M., KULCSÁR, M., DANKÓ, G., ŠVANTNER, R., NAGY, S., CSATÁRI, G., CSEH, S., SOLTI, L., HUSZENICZA, G., MARAČEK, I.: Recent progress in endocrine, nutritional and genetic aspects of the ovine reproduction (A Review), Folia veterinaria, 50, 2006, (3), 157–166. ŽADKOVIČ, J.: Vybrané ukazovatele úžitkovosti a reprodukčných vlastností. In: Správa o poľnohospodárstve a potravinárstve v Slovenskej republike 2001 (ZELENÁ SPRÁVA). Vydalo Ministerstvo pôdohospodárstva Slovenskej republiky, Bratislava, november 2001. Práca bola vytvorená pri riešení projektu AV 4/1113/06 Kontaktná adresa Prof. MVDr. Imrich Maraček, DrSc., Ústav fyziológie KNAHF, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, 041 81 Košice 195 FYZIOLOGICKÉ MONITOROVANIE PROCESOV NÁBORU, VÝBERU A DOMINANCIE TERCIÁRNYCH FOLIKULOV VAJEČNÍKOV OVIEC PHYSIOLOGICAL MONITORING OF PROCESSES RECRUITMENT, SELECTION AND DOMINANCE OF TERTIARY FOLLICLES IN OVARIES OF SHEEP Maraček, I., Vlčková, R., Halagan, J. Ústav fyziológie, Katedra normálnej anatómie, histológie a fyziológie, UVL Košice Abstract Presented paper is focused on physiological monitoring of the tertiary antral follicles during growth and development in processes: (1) recruitment, (2) selection, (3) dominance, (4) ovulation and luteinisation (corpus luteum – developing and growing) based on simultaneous use of laparothomy with digital photo documentary evidence, ultrasound investigation, histological evaluation and determination of the oestradiol-17β and progesterone in the blood serum and the follicular fluid of the largest follicles from the ovaries of the Improved Wallachian ewes. It can be concluded from performed observations that the results suggest on possibility of monitoring of ewes ovarian folliculogenesis and its phases in vivo conditions during experiments and investigations. Úvod V súčasnosti je všeobecne známe, že rast a vývoj terciárnych, dutinku (antrum) obsahujúcich, folikulov vaječníka prežúvavcov prebieha v rastových vlnách po prekonaní puberty, adolescencie a dosiahnutí dospelosti (adultus). Proces rastu a vývoja dutinkových folikulov vaječníkov oviec prebieha v štádiách: (1) nábor (recruitment), (2) výber (selection), (3) vláda (dominatio), či dominancia a (4) ovulácia (ovulatio) s nadväznou tvorbou žltého telieska (corpus luteum). Tieto štádiá je možné monitorovať v určitej kohorte (cohohors), či družine dutinkových folikulov na trajektórii rastových vĺn týchto folikulov vo vaječníkoch (Driancourt et al., 1985, 1985a; Murdoch, 1985,1988; Dickie et al., 1999;Bartlewski et al., 1999; Gither et al., 2001). Význam a potreba zdokonaľovania a sústavného systematického monitorovania procesov rastu a vývoja dutinkových folikulov spočíva po prvé v prehlbovaní a rozširovaní poznatkov o regulácii a modulovaní týchto dejov uvedených štádiách intra vitam tak, aby po druhé tieto poznatky boli racionálne aplikovateľné v chovateľskej a veterinársko-lekárskej praxi pri profitujúcej produkcii s trvalo udržateľným zdravím stáda, kvality produktu ako aj produkčného environmentu a ekológie (Faigl et al., 2005; Maraček et al., 2005; Vlčková et al., 2006). 196 V práci sme sa sústredili na súčasné možnosti monitorovania rastu a vývoja dutinkových folikulov vaječníkov so zameraním na jednotlivé štádiá tohto funkčného procesu zabezpečujúceho ovuláciu a ovulačný pomer (ovulation rate) determinujúci reprodukčnú i produkčnú úroveň. Materiál a metódy Získanie ultrasonogramov. Ultrasonografické (USG) vyšetrenie vaječníkov sme uskutočnili počas laparotómie prístrojom Sono ACE – 600V (Medison Co., Korea) s 5 MHz lineárnou sondou PB – 06LV50/65AD (Medison Co., Kórea) so získaním USG snímok pomocou tlačiarne (Video Graphic Printer) SONY UP – 880/890 CE/ 890 MD (Sony Co., Japonsko). Niektoré snímky boli zaznamenané na disketu použitím 7,5 MHz sondy, napojenej na USG prístroj ESAOTE Falco (ESAOTE S.p.A, Taliansko). Vaječníky sme ultrasonograficky vyšetrovali priamo na ich povrchu. Fotografie vaječníkov sme získali počas laparotómie digitálnym fotoaparátom Pentax Optio S 30 (Pentax Co., Japonsko) a upravovali sme ich v programe pre úpravu fotografií Adobe Photoshop 7.0. Získané fotografie a ultrasonogramy sme vyhodnotili kvalitatívne a kvantitatívne podľa metód uvádzaných v literatúre (Dickie et al., 1999; Bartlewski et al., 2000). Pri vyhodnocovaní ultrasonogramov sme sledovali echogenické a anechogenické štruktúry vo vaječníku podľa literatúry (Grygar, Kudláč 1997; Battocchio et al., 1999). Odber krvi. Od sledovaných experimentálnych oviec sme odobrali krv z vena jugularis klasickým spôsobom. Získané séra sme uskladnili v mrazničke pri teplote –18 až –20 ºC do stanovenia koncentrácií hormónov – 17β-estradiolu (E2), progesterónu (P4) a inzulínu podobného rastového faktora I (IGF-I). Odber tekutiny folikulu sme vykonali z dutinkových folikulov > 5 mm punkciou pritom sme získaný objem riedili a spracovali pre stanovenie koncentrácie E2 i P4 tak ako sme to opísali prv (Maraček et al., 2002). Ovariektómiu sme uskutočnili v terénnych podmienkach laparotomicky. Zvieratá sme podrobili celkovej anestézii pentobarbitalom sodným (Lazar et al., 2005). Ovce sme položili a fixovali na špeciálne upravené nosidlá. Po príprave operačného poľa vrátane zarúškovania sme brušnú dutinu otvorili rezom v linea alba, 5 cm kraniálne od mliečnej žľazy. Vaječníky sme opatrne vtiahli do operačnej rany a ultrasonograficky vyšetrili. Zároveň sme získali fotografické snímky a následne sme vaječníky odobrali pre histologické spracovanie. Histologické spracovanie. Vaječníky sme fixovali v 10 % formole. Tento sme neutralizovali práškovým uhličitanom vápenatým. Ďalšie spracovanie bločkov tkanív s cieľom zhotoviť 197 histologické preparáty sme vykonali štandardným spôsobom, ako uvádzajú príručky histologickej techniky (Vacek, 1990). Mikroskopické hodnotenie. Hotové preparáty sme prezerali a vyhodnocovali mikroskopom ZEISS Axiolab (Nemecko). Mikrofotografie sme získali prostredníctvom programu pre analýzu obrazu LUCIA G Verzia 4,60 – System for Image Processing, prepojením svetelného mikroskopu s PC pomocou kamery PAL GKB CCD camera CC-8603. Histologické preparáty boli aj skenované pomocou Scanner hp scanjet 5550c metódou modifikovanou podľa Halagana a Maračeka (nepublikované dáta). Vyhodnocovali sme každý dvadsiaty rez. Jednotlivé rezy vaječníkov sme vyhodnocovali kvantitatívne (počet povrchových terciárnych folikulov) a kvalitatívne (typ folikulu). Všímali sme si kategórie neatretických a atretických dutinkových folikulov na povrchu vaječníka. Ich atréziu sme posudzovali podľa kritérií opísaných inde (Maraček et al., 1977, 1983). Stanovenie progesterónu, 17β-estradiolu a IGF-I. Koncentrácia progesterónu v krvnom sére bola stanovená RIA metódou súpravou RIA PROGESTERON REF IM1188 (IMMUNOTECH, A Beckman Coulter Co. ISO 9001, U.S.A.). Analytická citlivosť 0,03 ng.ml-1. Presnosť intra-assay bola ≤ 5,4 % pre vzorky séra a inter-assay ≤ 9,1 %. Výsledky sú vyjadrené v ng.ml-1. Koncentrácia 17β-estradiolu v krvnom sére bola stanovená súpravou RIA ESTRADIOL REF IM1663 (IMMUNOTECH, A Beckman Coulter Co. ISO 9001, U.S.A.). Analytická citlivosť 4 pg.ml-1 pri presnosti intra-assay ≤15,1 % a inter-assay ≤14,4 %. Výsledky sú uvedené v pg.ml-1. Koncentrácia IGF-I sa stanovila IGF-I 600 ELISA súpravou (DRG Instruments GmbH, Germany). Absorbancia sa zmerala ELISA readerom pri vlnovej dĺžke 450 nm. Výsledky sú vyjadrené v ng.ml-1. Štatistické spracovanie výsledkov. Zistené hodnoty biometrického, ultrasonografického a fotografického merania vaječníkov a histologických preparátov vaječníkov sme vyhodnotili štatisticky udaním priemernej hodnoty a jej smerodajnej odchýlky. Na štatistické zhodnotenie rozdielov medzi dvomi aritmetickými priemermi sme použili Studentov t-test. Výsledky a diskusia Na prezentovaných obrázkoch v prednáške dokumentujeme ultrasonogramy (a) a digitálne fotografie (b) tých istých vaječníkov bahnice v období laktácie tri dni po odstavení jahniat. Z obrázkov je jasne vidieť nami sledované povrchové terciárne folikuly. Prítomnosť folikulov je jednoznačným potvrdením toho, že folikulogenéza prebieha aj po pôrode, počas dojčenia 198 jahniat a pokračuje aj v priebehu galaktopoézy po odstavení jahniat. K ovulácii nedochádza z dôvodu popôrodného laktačného a sezónneho fotoperiodického bloku, ktorý zabraňuje cyklickému uvoľňovaniu GnRH z hypotalamu, a preto chýba preovulačné vrcholné uvoľnenie lutropínu (LH) z adenohypofýzy (Goodman, 1994). Pozoruhodný je nález žltého telieska na ľavom vaječníku v období 3 dni po odstavení jahniat. Pravdepodobnou príčinou bola blízka prítomnosť baranov v jednej ovčiarni s bahnicami, ktorí boli oddelení len drevenými lesovými zábranami, ktoré nezabránili účinku feromónov. Hodnoty získané pri zhodnotení USG záznamov sú oproti hodnotám získaných zhodnotením digitálnych fotografií s menšími rozdielmi v rámci jednotlivých skupín a taktiež s nižšími smerodajnými odchýlkami. Signifikantné rozdiely sa získali pri porovnaní skupiny zvierat po ošetrení prípravkom Chrono-gest so skupinami zvierat 17, 25 a 35 dní po pôrode, a to na rôznych hladinách významnosti. Týka sa to rozdielu veľkosti folikulov menších ako 3 mm, pri porovnaní so 17. (P<0,01) a s 35. dňom p.p. (P<0,001), ako aj pri priemernej veľkosti folikulov väčších ako 3 mm v porovnaní s 25. (P<0,01) a 35. dňom p.p (P<0,01). Významné sú rozdiely medzi skupinou zvierat po ošetrení prípravkom Chrono-gest a skupinou zvierat po odstavení jahniat. Ide o celkový počet folikulov, ako aj počet folikulov menších ako 3 mm. Pri analýze folikulov pri skupine gravidných oviec sme získali signifikantné rozdiely v celkovom počte folikulov (P<0,05) a v počte folikulov väčších ako 3 mm (P<0,05). Rozdiely v jednotlivých skupinách folikulov pri ovciach v jednotlivých dňoch po pôrode sú málo významné, až na rozdiel v počte folikulov menších ako 3 mm pri skupinách zvierat 17 a 35 dní p.p. (P<0,01). V porovnaní so skupinou po odstavení sú zreteľné signifikantné rozdiely v porovnaní so 17. dňom p.p. pri celkovom počte folikulov (P<0,001), ako aj pri počte folikulov menších ako 3 mm (P<0,05). Pri ovciach po odstavení je signifikantne väčší priemer maximálneho folikulu v porovnaní s 25. (P<0,05) aj 35. dňom p.p. (P<0,05). Z USG záznamov sme získali rozmery najväčších folikulov u jednotlivých pokusných skupín zvierat. Zistili sme výrazné rozdiely medzi jednotlivými skupinami zvierat ošetrených na indukciu ruje a stimuláciu OR, ako aj medzi skupinami gravidných zvierat. Pri skupinách zvierat po pôrode sú rozdiely medzi veľkosťami minimálne. U oviec po odstavení je veľkosť najväčšieho folikulu dvojnásobná oproti ovciam po pôrode. Pri gravidných ovciach sú málo významné rozdiely v celkovom počte folikulov, v počte folikulov menších ako 3 mm a priemere maximálneho folikulu. Významný rozdiel je len v počte folikulov väčších ako 3 mm (P<0,01). 199 Naša identifikácia jednotlivých veľkostných a funkčných kategórií sledovaných terciárnych folikulov a výsledok ich kvantitatívneho hodnotenia s prítomnosťou folikulovej tekutiny ako anechogénneho útvaru resp. útvarov je porovnateľný s údajmi Dickieho et al. (1999) a Bartlewskiho et al. (2000). Rôzni autori opisujú folikuly väčšie ako 5 mm ako preovulačné pri ovciach s monoovuláciami (Bartlewski et al., 1999; Evans et al., 2000). Po ošetrení gravidných bahníc nižšou dávkou eCG sme na 50. deň gravidity zaznamenali vysoký počet folikulov s veľkým diametrom. Zaznamenali sme podobné výsledky v počte a veľkosti veľkých dutinových folikulov ako Driancourt et ali. (2001), ktorí opisujú postupný pokles počtu týchto folikulov s postupujúcou graviditou. Z našich výsledkov v tomto smere pre budúcnosť vyplýva možnosť podsledovania a otestovania aj u gravidných bahníc odber kumulo-oocytárnych komplexov transvaginálnou aspiráciou OPU (ovum pick-up) technikou po príprave s ošetrením vyššími dávkami eCG pre in vitro produkciu raných embryí a pre asistovanú reprodukciu s uplatnením moderných biotechnologických metód na základe molekulovo-genetických postupov. Záver Z výsledkov vyplýva možnosť využitia overovaných metód pri hodnotení povrchových terciárnych folikulov na vaječníkoch oviec. Poukazuje sa na možnosť monitoringu folikulogenézy po pôrode v období dojčenia jahniat, po odstavení jahniat a počas galaktopoézy v období dojenia bahníc, ako i v experimentálnych podmienkach aj u kôz. Po použití dvojfrekvenčnej USG sondy s možnosťou prepnutia na 7,5 – 8 MHz a viac bude možné v budúcnosti uplatniť hodnotenie terciárnych folikulov v štádiu výberu aj klinicky pri vyšetrovaní zvierat ultrasonografom. Literatúra 1. Bartlewski, P.M., Beard, A.P., Rawlings, N.C, 2000.: An ultrasoun-aided study of temporal relationships between the patterns of LH/FSH secretion, development of ovulatory sized antral follicles and formation of corpora lutea in ewes. Theriogenology, 54, 229-245. 2. Cahill, L.P., Mariana, J.C., Mauléon, F. 1979: Total follicular populations in ewes of high and low ovulation rates. J. Reprod. Fert., 55, 27-36. 3. Dickie, A.M., Paterson, C., Anderson, J.L.M., Boyd,J.S. 1999: Determination of corpora lutea numbers in booroola – texel ewes using transrectal ultrasound, Theriogenology, 51, 1209-1224. 4. Driancourt, M.A., Gibson, W.R., Cahill, L.P. 1985: Follicular dynamics throughout the oestrus cycle in sheep. Reprod. Nutr. Dev., 25, 1-15. 5. Driancourt, M.A. 1994,: Lack of between-follicle interactions in the sheep ovary Reprod. Nutr. Dev., 34, 249260. 6. Lazar, G.,Pošivák, J., Kačmárik,.J., Valocký, I., Karahutová, Ľ., Čurlík, J., 2005: Laparoskopické monitorovanie ovariálnej aktivity oviec. In: Zborník z vedeckej konferencie s medzinárodnou účasťou „Reprodukčná medicína“ Ed.: Hredzák, R. Ostró, A., Kačmátrik, J, organizovaná pri príležitosti 10. vbýročia založenia Centra asistovanej reprodukcie pri II. gynekologicko-pôrodníckej klinike. LF UPJŠ a FN L. Pasteura, Košice, Dom techniky ZSVTS Košice 25. február 2005, 85-86. 200 7.Maraček, I., Tokoš, M., Halagan, J., 1977: Tertiary follicles in heifers treated with melengestrol acetate. Endocrinologia Experimentalis. 11. 249-262. 8. Maraček, I., Elečko, J., Choma, J., Bekeová, E., 1983: Filikulárny systém vaječníkov kráv po synchronizácii ruje luteolytickým pôsobením cloprostenolu. Veter. Med. (Praha), 28: 705-716. 9. Maraček, I., Krajničáková, M., Kostecký, M., Gréserová, G., Valocký, I. 2002: Tertiary follicular growth wave dynamics after oestrus synchronization and superovulation. Acta Vet. Brno, 71, 481-486. 10. Mc Natty, K.P., Gibb, M., Dobson, C., Ball, K., Coster, J.,Heath, D., Thurley, D.C. 1982: Preovulatory follicular development in sheep treated with PMSG and/or prostaglandin. J. Reprod. Fert., 65, 111-123. 11. Vacek, Z., 1990: Histológia a histologická technika. Vydavateľstvo Osveta, Martin, 1990, 503 s., ISBN 80217-0084-X 12. Vlčková, R., Lacková, Z., Antal, J., Maraček, I. 2005: Povrchové terciárne folikuly ovárií bahníc po odstave jahniat a ich zmeny počas indukovaného estru v riadenej reprodukcii. In: Zborník prác a abstraktov prezentovaných na 81. Fyziologických dňoch konaných 2.– 4. februára 2005 v Košiciach, Ed,. P Švorc, Vydal: ZZ design studio – Ing, Zvonimír Záviš, 221 – 223. 13. Vlčková, R., Kostecká, Z., Faigl, V., Marton, A., Keresztes, M., Árnyasi, M., Kulcsár, M., Dankó, G., Švantner, R., Nagy, S., Csatári, G., Cseh, S., Solti, L., Huszenicza, G., Maraček, I., 2006: Recent progress in endocrine, nutritional and genetic aspects of the ovine reproduction (A Review), Folia veterinaria, 50, 3: 157– 166. Práca bola vytvorená pri riešení grantu VEGA 1/0612/03 a projektu AV 4/1113/06 Kontaktná adresa Prof. MVDr. Imrich Maraček, DrSc., Ústav fyziológie KNAHF, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, 041 81 Košice VPLYV HYPERTERMIE NA BIOCHEMICKÉ PARAMETRE KRVI KRÁLIKOV A VYBRANÉ VÝKRMOVÉ UKAZOVATELE INFLUENCE OF HYPERTHERMIA TO THE BIOCHEMICAL PARAMETERS OF BLOOD IN RABBIT AND SELECTED FEEDER INDICES Marcinková, M.,1 Pivko, J.,1,2 Lukáč, N.,1 Parkányi, V.,2 Rafay, J.,2 Massányi, P.,1 Capcarová, M.,1 1 2 Slovenská poľnohospodárska univerzita Nitra, Slovenské centrum poľnohospodárskeho výskumu Nitra Abstrakt Thermal stress is the main constraint in farm animal production in warm season. It starts to manifest by enviromental temperature above 32 °C. As a result the parameters of growth and reproduction utility decrease due to alterations of biological functions. The biochemical parameters of blood and feeding parameters were monitored. In our study, we used flesch- lines of rabitts. The blood of rabitts was taken from auricular marginal vein every morning. Physiological parameters from blood serum were defined by automatical biochemical analyser Microlab 300. We anaysed the following parameters: glucose (energy profile), level of total protein, cholesterol (lipid profile) and calcium (mineral profile). All of 201 these observed parameters of experimental young rabbits were lower as compared to the control group (from – 10.04%). Total growth of live weight (g/ks) of experimental young rabbits was found to decrease by about 235.2 g as compared with control group. Quantity of total protein in experimental group was from 50,60,04±3,78 to 60.93±4.39 g.l-1. It decreased as compared with control group (49,02±4,62–60,13,63±3,51 g.l-1). Quantity of glucose was found to be increase almost in all experimental groups (5.15±0.50 – 6.24±0.67 mmol.l-1) as compared with control group (5.05±0.52 – 5.56±1.14 mmol.l-1). Level of protein profile and level of calcium profile also decreased. Level of cholesterol was increased (expect for the first intake) in experimental group (3.02±0.1.02-3.34±1.17 mmol.l-1) as compared with control group (1.74±0.272.25±3.34 mmol.l-1). In our study we found that biochemical parameters of blood were affected by higher temperature of feeding environment. Úvod Biologický princíp vzťahu organizmu a prostredia je významným fenoménom, ktorý určuje využitie produkčných a reprodukčných schopností zvierat. Optimalizácia mikroklímy v modernom chove hospodárskych zvierat má viacero aspektov. Významnými faktormi, ktoré nie sú vždy docenené sú mikroklimatické podmienky chovu zvierat. Vo výrazne diferencovanom vonkajšom prostredí je celý rad vplyvov, ktoré menia svoje funkčné závislosti odvodené od priebehu klimatickej a sezónnej periodicity. V súvislosti s meniacimi klimatickými podmienkami sa sústreďuje pozornosť na definovanie vzťahov medzi vyššou teplotou chovného prostredia a úžitkovosťou, reprodukciou ako aj zdravotným stavom. Z mnohých klimatických faktorov má na zvierací organizmus najväčší vplyv teplota vzduchu, v našom prípade teplota nad horným okrajom termicky neutrálnej zóny. Teplotný stres je hlavným obmedzením produkcie z chovu hospodárskych zvierat v horúcich obdobiach roka. Začína sa prejavovať pri teplote prostredia nad 32 °C. V dôsledku drastických zmien v biologických funkciách sa znižujú ukazovatele rastovej a reprodukčnej úžitkovosti. Práca je zameraná na prehodnotenie zdravotného stavu zvierat s negatívnymi dôsledkami na jednotlivé parametre vnútorného stavu prostredia vo vzťahu ku klimatickým zmenám chovného prostredia. 202 Cieľ práce • vyhodnotiť stav medzi definovaným hypertermickým stresom a vybranými výkrmovými ukazovateľmi • hodnotenie vplyvu vysokej teploty chovného prostredia (36 °C) na biochemické parametre a celkovú homeostázu organizmu • vytvorenie vedeckých základov pre adekvátne hodnotenia a pochopenie mechanizmov vplyvu teplotných zmien na fyziologické procesy a úžitkovosť hospodárskych zvierat Materiál a metodika Do experimentu boli zaradené mäsové línie králikov M91 a P91. Počty zvierat zaradených do experimentu: (p- pokus, k- kontrola) 20 samíc (k) 20 (p), 4 samce (k) a 4 (p), 32 mláďat (16 P + 16 k) vo veku od 35 dní (odstav) do 75 dní (porážková hmotnosť). V uzavretom chovnom priestore, s nainštalovaným termoagregátorom a senzorom boli simulované experimentálne podmienky s definovanou vyššou teplotou (36 ± 3 °C). Zvieratá boli vystavené hypertermickej záťaži od 6.00 hod. do 18.00 hodiny, od 18.00 do 6.00 hod. neboli zvieratá vystavované pôsobeniu hypertermickej záťaže. Simulované podmienky boli kontinuálne monitorované. Experimentálne zvieratá boli ustajnené v štyroch samostatných sektoroch chovných klietok so systémom kŕmenia a napájania ad libitum. Kontrolné zvieratá boli chované v čiastočne klimatizovanej hale pre produkciu brojlerových králikov v priestoroch SCPV Nitra. Na preskúmanie úlohy vplyvu teplotného faktora bolo potrebné vytvoriť dve základné skupiny zvierat (k) kontrolná (fyziologicky optimálna teplota, cca. 18-22 °C v priebehu 20-30 dní) a (p) pokusná (teplota nad fyziologické optimum, cca. 34-40 °C). Zvieratám sa odobrala krv z ušnej marginálnej žily makrometódou, odbery sa realizovali v ranných hodinách ( medzi 8 a 10 hodinou) 4x počas celého obdobia. Po odobratí sa separovalo krvné sérum centrifugáciou pri otáčkach 3000 min-1po dobu 30 minút. V krvnom sére boli stanovené jednotlivé fyziologické ukazovatele použitím automatického analyzátora Microlab 300 (Merck®, Germany). Pre analýzu parametrov boli použité sety radu Ecoline, určené pre uvedené zariadenie. Stanovoval sa dusíkový, energetický, lipidický a minerálny profil. 203 Všetky experimenty boli schválené Štátnou veterinárnou a potravinovou správou Č.k. RO ŠVPS 2058/06-221/3a pokusné zariadenia, farma králikov OMHZ SKP 28 004 v Bratislave 31. júla 2006. Výsledky a diskusia Z analýzy celosvetových literárnych prameňov v tejto oblasti vyplýva, že krátkodobý mierny teplotný šok ( 39-40 °C) môže naštartovať adaptačný mechanizmus organizmu voči stresu. Avšak nie sú údaje o vplyve teplotného stresu v podmienkach dlhodobého vystavovania (jeden až niekoľko týždňov) vysokým teplotám. Nie je jasné, za akých okolností môže byť naštartovaný adaptačný mechanizmus pri dlhodobejšom strese. Poznatky získané s nasledujúcich zámerov môžu dať odpoveď na tieto otázky a môžu byť využité pri znižovaní mortality resp. morbidity hospodárskych zvierat vyvolanej hypertermickým šokom. Z výsledkov vyplýva, že hypertermický stres ovplyvnil sledované biochemické parametre. V skupine dospelých jedincov bol zistený pokles hodnôt vápnika v pokusných skupinách zvierat (3,43±0,31 – 3,53±0,23 mmol.l-1) vo všetkých sledovaných obdobiach v porovnaní s kontrolnou skupinou (3,62±0,32 – 3,87±0,29 mmol.l-1). Množstvo glukózy bolo vyššie v pokusnej skupine (5,15±0,50 - 6,24±0,67 mmol.l-1) vo väčšine odberov v porovnaní s kontrolnou skupinou (5,05±0,52 - 5,56±1,14 mmol.l-1). Podobne ako pri vápniku, aj hladina celkových bielkovín mala tendenciu znižovať sa.. Pri porovnaní kontrolnej a pokusnej skupiny, boli hodnoty tohto ukazovateľa v pokusnej skupine vždy nižšie a pohybovali sa v rozmedzí od 56,57±4,86 do 63,88±3,93 mmol.l-1. Hodnoty v kontrolnej skupine jedincov boli v intervale 63,48±6,39 – 68,12±4,41 mmol.l-1. Hodnoty hladiny cholesterolu sa pohybovali v kontrolnej skupine od 1,88±0,62 do 2,10±0,49 mmol.l-1. V pokusnej skupine boli jeho hodnoty vyššie a kolísali v rozpätí od 2,41±0,73 do 3,37±0,72 mmol.l-1. Tab. 1 Zmeny biochemických parametrov dospelých jedincov králika pri 36 °C 1. odber 2. odber Kontrola Pokus X Sd X Ca 3,62 0,32 CB 63,76 Glu Chol 3.odber Kontrola Pokus Kontrola Pokus Sd X Sd X Sd X Sd X Sd 3,43 0,31 3,68 0,30 3,53 0,47 3,87 0,29 3,50 0,23 4,88 60,99 4,13 67,58 4,09 63,88 3,93 68,12 4,41 62,5 4,54 6,80 0,64 6,77 0,48 5,31 0,49 6,24 0,67 5,05 0,52 5,15 0,50 2,10 0,5 3,37 0,73 1,94 0,60 3,27 0,91 1,93 0,53 3,28 1,40 204 4. odber Kontrola Pokus X Sd X Sd Ca 3,55 0,29 3,63 0,51 CB 57,50 3,16 56,73 2,80 Glu 7,46 0,82 5,81 0,89 Chol 1,74 0,27 3,02 1,02 Tab. 2 Zmeny biochemických parametrov mláďat králika pri 36 °C 1. odber 2. odber Kontrola Pokus X Sd X Ca 3,54 0,21 CB 57,97 Glu Chol 3.odber Kontrola Pokus Kontrola Pokus Sd X Sd X Sd X Sd X Sd 3,02 0,44 3,38 0,28 3,41 0,29 3,76 0,42 3,64 0,34 4,12 60,93 4,39 49,02 4,62 50,6 3,77 60,13 3,58 58,37 4,08 8,58 0,83 10,07 0,94 6,25 0,70 6,66 0,72 5,14 0,49 6,18 0,52 2,55 0,73 4,82 1,26 2,25 0,93 3,34 1,17 1,96 0,95 3,27 1,40 4. odber Kontrola Pokus X Sd X Sd Ca 3,82 0,23 3,53 0,23 CB 63,48 6,39 56,57 4,86 Glu 5,56 1,14 5,69 0,92 Chol 1,88 0,62 2,41 0,73 V skupine mláďat sa obsah vápnika v kontrolnej skupine pohyboval od 3,38±0,28 do 3,76±0,42 mmol.l-1. V pokusnej skupine boli zistené hodnoty daného ukazovateľa (3,02±0,44 – 3,64±0,34 mmol.l-1). Zaznamenali sme striedavé kolísanie hodnôt, v dvoch odberoch bol obsah vápnika vyšší v pokusnej skupine a v dvoch v kontrolnej skupine. Hodnoty koncentrácie glukózy boli vo väčšine prípadov vyššie v pokusnej skupine na rozdiel od kontrolnej skupiny. Najnižšia zistená hodnota v kontrolnej skupine bola 5,14±0,49 mmol.-1 a najvyššia 8,58±0,83 mmol.l-1. V pokusnej skupine sa hodnoty pohybovali v rozmedzí 5,81±0,89 – 10,07±0,94 mmol.l-1. V poslednom odbere koncentrácia glukózy kontrolnej skupiny prevýšila jej množstvo v pokusnej skupine. Množstvo celkových bielkovín bolo pri porovnaní pokusnej skupiny (50,60,04±3,78 – 60,93±4,39 g.l-1) s kontrolnou (49,02±4,62–60,13,63±3,51 g.l-1) bolo na začiatku sledovaného obdobia v prvých dvoch odberoch nižšie v kontrolnej skupine. V posledných dvoch odberoch sme zaznamenali opačný jav. 205 Hodnoty cholesterolu boli vyššie (okrem prvého odberu) v pokusnej skupine (3,02±0,1,023,34±1,17 mmol.l-1) v porovnaní s kontrolnou skupinou (1,74±0,27-2,25±3,34 mmol.l-1). Z výsledkov vyplýva, že biochemické parametre krvi sú ovplyvnené zvýšenou teplotou chovného prostredia. Signifikantnejšie rozdiely sledovaných parametrov boli zistené u vekovo mladších skupín jedincov, čo naznačuje nestabilitu regulačných mechanizmov intermediárneho metabolizmu (viď. Graf 1 a 2). Graf 1 Graf 2 Tab. 3 Výsledky výkrmových pokusov počas hypertermickej záťaže králikov Pokusná skupina Ukazovateľ Spotreba krmiva na 1 kg prírastku medzi 56. až 77. dňom veku v kg Priemerný prírastok živej hmotnosti medzi 56. až 77. dňom veku v g/deň/ks Celková spotreba krmiva v g/ks Celkový prírastok živej hmotnosti v g/ks x ± S.D. Kontrolná skupina Rozdiel ku kontrole x ± S.D. 4,093 4,55 -10,04% 23,62 34,82 -32,16% 1412,88 3337,32 -1924,44 g 496,02 731,22 -235,2 g Všetky sledované parametre u experimentálnych mláďat králikov počas výkrmového pokusu boli výrazne nižšie v porovnaní s kontrolnou skupinou mláďat (od -10,04% pri spotrebe krmiva na 1 kg prírastku až po -57,66% pri spotreba krmiva do 77. dňa veku v g / deň). Celkový prírastok živej hmotnosti v g/ks bol u mláďat vystavených hypertermii o 235,2 206 g nižší voči kontrolnej skupine. To svedčí o negatívnom vplyve vysokej teploty chovného prostredia na živú hmotnosť a tým aj na celkový zdravotný stav sledovaných zvierat. Záver Počas stresovej záťaže v organizme dochádza k narušeniu homeostázy. Aktivujú sa mechanizmy, ktoré zabezpečujú energiu pre zdolanie záťaže a následne mechanizmy, ktoré zabezpečia obnovu vlastných energetických zdrojov organizmu. V literatúre nie sú doteraz jednotné názory na jednoduché hodnotenie a interpretáciu stresových reakcií podľa eventuálnych ukazovateľov v krvi a tkanivách. Literatúra zaoberajúca sa tematikou stresu sa zhoduje v tom, že od vnútorného prostredia významne závisia adaptačné schopnosti zvieraťa a jeho stresové reakcie. Expozícia mláďat a dospelých samcov a samíc hypertermickému prostrediu (36 ± 3° C) pôsobí negatívne na ich fyziologické procesy a narúša ich vnútornú homeostázu. Prejavuje sa to negatívne v narušení metabolizmu bielkovín, glukózy, cholesterolu, vápnika a na príjme a konverzii krmiva, na intenzite rastu, na prírastkoch živej hmotnosti, ovplyvňuje zdravotný stav a vitalitu experimentálnych zvierat. POĎAKOVANIE: Touto cestou by som chcela poďakovať Ing. M. Schneidgenovej a Ing. P. Čupkovi za vykonanie biochemických analýz. ZMENY V ŠTRUKTÚRE STEHNOVEJ KOSTI RYŠAVKY ŽLTOHRDLEJ (APODEMUS FLAVICOLLIS) A RYŠAVKY KROVINNEJ (APODEMUS SYLVATICUS) DIFFERENCES IN FEMORAL BONE STRUCTURE OF YELLOW-NECKED MOUSE (APODEMUS FLAVICOLLIS) AND WOOD MOUSE (APODEMUS SYLVATICUS) Martiniaková, M.1, Omelka, R.2, Grosskopf, B.3, Jančová, A.1 1Department of Zoology and Anthropology, of Botany and Genetics, Constantine the Philosopher University, Nitra, Slovak Republic 3Institute of Zoology and Anthropology, Georg – August University, Göttingen, Germany 2Department Abstract Femoral bone structure of yellow-necked mouse (Apodemus flavicollis) and wood mouse (Apodemus sylvaticus) was investigated in this study. Altogether 40 bones were analysed. We compared bone length, bone weight and histological structure of the femora between examined animals. Our results indicate the measured values for bone length were higher in yellow-necked mouse (P<0.01). On the other hand, wood mouse disposed higher values of 207 bone weight (P<0.01). Statistically significant differences for bone length and bone weight between females and males of both species were identified. Histological observation of thin sections through a shaft of femora of both species revealed an outer and inner essentially nonvascular lamellar layer around a poorly developed reticular layer, containing unorganized vascular canals. We did not identify differences in qualitative histological characteristics of examined bones between Apodemus flavicollis and Apodemus sylvaticus. Introduction Although generally larger in size, the yellow-necked mouse (Apodemus flavicollis) is very similar in appearance to the wood mouse (Apodmeus sylvaticus) and the two are often difficult to distinguish. Both species have brown fur with paler, white bellies, although the yellow-necked mouse may often be somewhat lighter in colour. The main difference between these mice is that, as the name suggests, the yellow-necked mouse has a collar of yellowish fur, which forms a bib on the chest. This collar is often fairly difficult to see, however (Leach, 1990). In general, compact bone tissue forms the shafts of long bones, the surfaces of their extremities, short bones, and the outer and inner layer (lamina externa et interna) of the skull vault in rodents. Basic constituents of its structural organization are primary osteons and secondary osteons. While primary osteons are not surrounded by a reversal (cement) line and lamellae round them merge smoothly with the surrounding bone, the secondary osteons consist of a central (Haversian) channel, which is surrounded by concentric rings (lamellae) of matrix (Currey, 2002; Martiniaková et al., 2007). According to Enlow and Brown (1958) the outer compacta of rodents is made of circumferencial lamellae containing a few vessels, but it is essentially non-vascular in structure. In the middle of reticular compacta, secondary activity is evident, but Haversian bone tissue is not always formed. An absence of Haversian bone tissue was also identified in the study by Martiniaková et al. (2005) for adult rats. On the other hand, Rajtová and Globočník (1978) mention an occurrence of secondary osteons in compact bone tissue of adult mice. In the present study a femoral bone structure of yellow-necked mouse (Apodemus flavicollis) and wood mouse (Apodemus sylvaticus) was investigated. Material and Methods 208 Our research focused on 40 femora (20 from females and 20 from males) from adult animals of the species Apodemus flavicollis and Apodemus sylvaticus living in the area of Nitra region. We compared bone length, bone weight and histological structure of the femora between investigated animals. Values for macroscopic analysis were expressed as mean ± standard deviation. The T-test was used to distinguish possible changes in bone length and bone weight between examined species and also between females and males of the same species. For histological analysis, each of the bones was sectioned at the mid-shaft of its diaphysis. In total, 40 transversal sections of the femur diaphysis were cut. The obtained segments were macerated and degreased (Martiniaková et al., 2005). Later the samples were embedded in epoxy resin Biodur (Herrmann et al., 1990). Transverse thin sections (70-100 µm) were prepared with a sawing microtome (Leitz 1600) and mounted on glass slides with Eukitt (Merck). The qualitative characteristics of analysed microstructure were determined according to Enlow and Brown's (1956) classification systems in anterior, posterior, medial, and lateral views of thin sections. Results and Discussion According to our results the measured values for bone length were higher in yellownecked mouse (P<0.01). On the other hand, wood mouse disposed higher values of bone weight. This difference was also significant (Table 1). Our findings related to bone length of both species are in complete agreement with those published by Leach (1990). However, a higher value of bone weight identified in wood mouse was observed only in our study. In addition, statistically significant differences for bone length and bone weight between females and males of both species were found (Table 2). We identified higher values of bone weight in females of Apodemus sylvaticus (P<0.05), whereas males disposed higher values of bone length (P<0.01). Opposite results in macroscopic analysis of examined bones were observed between females and males of wood mouse. Table 1 Results of macroscopic analysis of investigated femora in Apodemus flavicollis and Apodemus sylvaticus. species n bone weight (g) bone length (cm) Apodemus flavicollis 20 0.078±0.019 1.881±0.106++ Apodemus sylvaticus 20 0.086±0.020++ 1.767±0.079 P<0.01 (++) 209 Table 2 Sex-related differences in macroscopic analysis of examined bones in yellow-necked mouse and wood mouse. species sex n bone weight (g) bone length (cm) yellow-necked mouse females 10 0.081±0.025+ 1.841±0.095 yellow-necked mouse males 1.920±0,106++ 10 0.075±0.012 wood mouse females 10 0.078±0.024 wood mouse males 10 0.094±0.011++ 1.786±0.099+ 1.747±0.051 P<0.05 (+), P<0.01 (++) Histological observation of thin sections through a shaft of femora from the investigated rodents revealed an outer and inner essentially non-vascular lamellar layer around a poorly developed reticular layer, containing unorganized vascular channels (Figures 1 and 2, magnification x 200). No secondary osteons were found in the microstructure, showing that the remodeling process is absent in the investigated bones. Similar results were also found in the studies by Enlow and Brown (1958) and Martiniaková et al. (2005) for long bones of rodents. Figure 1 Bone microstructure of Apodemus sylvaticus. Figure 2 Bone microstructure of Apodemus flavicollis. In conclusion, differences in macroscopic analysis of femora from yellow-necked mouse (Apodemus flavicollis) and wood mouse (Apodemus sylvaticus) were identified in our study. On the contrary, no changes in qualitative histological characteristics of the femur were observed between both species. In order to obtain more reliable results in this direction, quantitative histological analysis should also be assessed. It is a subject of current research. 210 Moreover, further research in this area will need to extend the number of analysed skeletal elements and to verify the results that were obtained from our skeletal samples. Acknowledgment This study was supported by the grants VEGA 1/2364/05 (Ministry of Education, Slovak Republic) and CGA: Study of morphologic changes in skeleton microstructure of various mammalian species. References Currey J.D.: Bones: Structure and mechanics. Princeton University Press: New Jersey, 2002, 14-21. Enlow D.H. and Brown S.O.: The Texas Journal of Science, 1956, 8, 405-412. Enlow D.H. and Brown S.O.: The Texas Journal of Science, 1958, 10, 187-230. Herrmann B., Grupe G., Hummel S., Piepenbrink H. and Schutkowski H.: Prähistorische Anthropologie. Leitfaden der Feld- und Labormethoden. Springer Verlag: Heidelberg, 1990. Leach, M.: Mice of the British Isles. Shire Publications Ltd: Shire Natural History, Aylesbury, 1990. Martiniaková M., Grosskopf B., Vondráková M., Omelka R. and Fabiš M.: Scripta Medica (Brno), 2005, 78, 4550. Martiniaková M., Grosskopf B., Omelka R., Dammers K., Vondráková M. and Bauerová M.: Int. J. Osteoarchaeol, 2007, 82-90. Rajtová V. and Globočník E.: Gegenbaurs. Morphol. Jahb. 1978, 124, 649-662. Contact address: RNDr. Monika Martiniaková, PhD., Katedra zoológie a antropológie, Nábrežie mládeže 91, 949 74 Nitra, e-mail: [email protected] HEPATODYSTROFIE - STEATÓZA HEPATODYSTROFIA – STEATOSIS Massányi P., Kováčik, J. Žoldoš, E.,Fabiš, M., Lukáč, N., Kolesárová, A. Slovenská poľnohospodárska univerzita, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Katedra fyziológie živočíchov, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra Abstact In this study occurence of hepatal steatosis is described, where optical empty vaccuoles in hepatocytes were observed. In developing steatosis in the biggining small adipose droplets in hepatocytes cytoplasm later bleding to big droplets with increasing size were found. Finally a large adipose droplet fill the cell and replace cytoplasm to the marginal zone. Steatosis affected at central, intermedium and peripheral zone of lobe, perspectively all lobe. The finding of pathological changes of liver is also supported by metabolic profile where alteration in energy and hepatal profile were detected. Results of metabolic profile correlate with pathohistological finding and represent the disease development. Úvod 211 Pečeň je najväčšou žľazou v organizme a jedným z najdôležitejších orgánov vôbec. Patogeneticky sa na vzniku steatózy pečene uplatňujú kvantitatívne a kvalitatívne odchýlky v prísune tukov, v ich syntéze, odbúravaní a odsune. Ide o poruchu vzájomnej rovnováhy uvedených pochodov. Zjavné patologické hromadenie tuku v pečeňovom tkanive po určitú dobu organizmus znáša (Cihelek et al., 2006; Lubojacka et al., 2005; Schouvert, 2000). Za normálnych okolností pečeň obsahuje menej ako päť percent tuku. Pri ťažkej steatóze stúpa obsah tuku na 50% i viac (Cuvelier et al., 2005; Varga et al., 2005; Chavatte-Palmer et al., 2004) Na vzniku sa môže spolupodieľať aj nedostatok tzv. lipotropných látok, ako sú cholín a metionín, poprípade vitamíny a iné nutritívne faktory. Ak sa odstráni včas vyvolávajúca príčina, tukové zmeny pečene v pomerne krátkej dobe a bez následkov vymiznú. V predloženej práci popisujeme štrukturálne zmeny pečene v súvislosti s problémami v chove, ktoré si vyžiadali analýzu tohto orgánu a dôkaz predpokladaných zmien. Cieľom práce bola aj analýza vybraných parametrov metabolického profilu zvierat v sledovanom chove, ktoré indukovali zistené patologické zmeny pečene. Materiál a metodika Vzorky pečene sme získali od vysokoteľných jalovíc a dojníc s predpokladom metabolických porúch z poľnohospodárskeho družstva v okrese Nitra. Vzorky sa fixovali v 10% formalíne, odvodnili vo vzostupnom rade alkoholu a zaliali do parafínu. Sériové rezy o hrúbke približne 10 µm sme ukladali na odmastené a označené podložné sklíčka. Po narezaní sa rezy farbili prehľadným farbením hematoxylín – eozínom podľa platných metodík. Po zafarbení sa vzorky zamontovali do solakrylu a výsledkom sú trvalé histologické preparáty vhodné na hodnotenie svetelným mikroskopom. V danom chove sme sledovali aj parametre klinickej biochémie krvi. Zvieratá (n=5) boli rozdelené do troch skupín – zasušené, 4 týždne post partum a 4 mesiace post partum. Krv sa získavala z hrdelnicovej žily (vena jugularis) do pripravených skúmaviek. Následne sa krv centrifugovala 15 minút pri 3000 otáčkach, aby sme získali krvné sérum. Z krvého séra sa spektrofotometricky stanovili parametre metabolického profilu – minerálny (Ca, P, Ca:P, Mg, Na, K), energetický (glukóza, cholesterol, triglyceridy, celkové lipidy), enzymatický (ALT, AST) a dusíkový (močovina, celkové bielkoviny) profil. Od sledovaných zvierat sa v rovnakých intervaloch odoberal aj moč s sledovali sa nasledovné parametre – Ca, P, Mg, Na, K, močovina, pH, merná hmotnosť (Mh) a čistý acidobázický výťažok (ČABV). 212 Jednotlivé získané hodnoty sme porovnávali s normami, ktoré sú využívané v poľnohospodárskej a veterinárnej praxi. Výsledky a diskusia Základnou stavebnou jednotkou pečene sú pečeňové lalôčiky, tvorené pečeňovými bunkami (hepatocyty) a krvnými sinusoidami, medzi ktorými sa nachádza väzivo (Obrázok 1, 3, 5). Pri steatóze pečene (n=12) sa zistili v parenchýmových bunkách pečene väčšie alebo menšie opticky prázdne vakuoly. Pri rozvíjajúcej sa steatóze sa najprv v cytoplazme parenchýmových buniek objaví množstvo drobných tukových kvapôčok (drobnokvapkové stukovatenie), ktoré neskôr splynú vo veľké kvapky, alebo sa zjaví jedna kvapka, ktorá sa zväčšuje. Nakoniec veľká tuková kvapka vypĺňa celú bunku a zatláča cytoplazmu a jadro na okraj (veľkokvapkové stukovatenie). Stukovatenie môže postihnúť ojedinelé bunky, alebo skupiny pečeňových buniek v ktorejkoľvek časti lalôčikov. Stukovatenie postihlo selektívne centrálnu (Obrázok 2), intermediárnu, alebo len periférnu zónu lalôčikov, prípadne vzniklo stukovatenie celého lalôčika (Obrázok 4). Veľmi často sa ukladá tuk v pečeňových bunkách centrálnej zóny lalôčika, stukovatenie periférnej zóny lalôčikov je pomerne zriedkavé a nachádza sa hlavne pri toxémiách a pri niektorých poruchách výživy. Dokiaľ stukovatenie pečene postihuje menšiu časť pečeňových buniek, zostáva štruktúra pečene dobre zreteľná. Ak stukovatenie pokročí tak, že všetky bunky celého lalôčika sa vyplnia tukom, tkanivo prestáva mať podobu pečene, ale podobá sa skôr tukovému tkanivu (Obrázok 6). Len podľa portobiliárnych priestorov a podľa centrálnych vén poznať, že ide o pečeň. Tuková degenerácia je tiež príčinou poklesu leukocytov (hlavne eozinofilov a neutrofilov) a lymfocytov. Tým sa znižuje imunitná aktivita dojníc. Kravy sú náchylnejšie na rôzne bakteriálne a polyfaktoriálne ochorenia (mastitídy, metritídy, puerperálne atónie, peritonitídy, ochorenia končatín, laminitídy atď.), kde základnou príčinou ich vzniku sú hepatodystrofie (Griffin et al., 2007; Brouwers et al., 2007). Biochemický nález v krvom sére bol nasledovaný: hyperfosfatémia, hypermagneziémia, hypomagneziémia, hyperprotinémia, hypoproteinémia, zvýšené hodnoty AST, zvýšené hodnoty ALT, zvýšené hodnoty GGT, zvýšené hodnoty ALP, hyperlipidémia, hypercholesterolémia, hyperbilirubinémia a hypertriglyceridémia. V moči (Tabuľka 15) sa zistila hypokalciúria, hypomagneziúria, hyponatriúria, zvýšená hladina močoviny v moči, znížená hladina močoviny v moči, znížené pH a znížený ČABV. Problémy v minerálnom profile, hoci na prvý pohľad v sére veľmi mierne a nepatrné plne odhaľujú a dokumentujú hladiny minerálií v moči. Zatiaľ čo priemerná hladina Ca v moči 213 zasušených zvierat je v referenčnom rozpätí, u zvierat post partum a najmä v strede laktácie jeho dolnú hranicu nedosahuje (1,158 resp. 0,597). Hladiny fosforu sú v moči v rozpätí, ale tiež majú svoju tendenciu (najnižšia u zasušených a najvyššia u dojníc v strede laktácie). Sodík je výrazne znížený u zasušených a ešte viac u zvierat v strede laktácie. Draslík je v moči v referenčnom rozpätí u všetkých skupín zvierat. Minerálny profil Ca P Ca:P Mg Na K -1 Jednotka mmol.l zasušené 2,48 1,86 1,30 0,71 147 4,68 4 TPP 2,44 2,00 1,20 0,94 147 4,56 4 MPP 2,42 2,36 1,00 1,12 146 4,40 priemer 2,44 2,07 1,20 0,92 146,9 4,55 norma* 2,25 – 3,00 1,60 – 2,26 1,2 – 1,6 0,80 – 1,07 136 – 150 4,0 – 5,8 214 1 2 3 4 5 6 Steatóza pečene – normálna stavba pečene (1 – zväčšenie 4x, 3 – 10x, 5 – 20x) [dojnica, vek 64 mes., úžitkovosť – 1. laktácia 8008 l/446 dní. lakt. – 8637 l/297 dní, 3. lakt. – 10057 l/291 dní]; abnormálna stavba (2 – zv. 4x) [vysokoteľná jalovica, prvoteľka, vek 26 mes.] abnormálna stavba (4 – zv. 10x) [dojnica, vek 63 mes., úžitkovosť – 1. lakt. 7544 l/399 dní, 2. lakt. – 8212/314 dní l,3. lakt. – 10384 l/293 dní] abnormálna stavba (6 – zv. 20x [vysokoteľná jalovica, prvoteľka, vek 26 mes.] 215 Hodnoty ukazovateľov bielkovinového profilu v sére (močovina) naznačujú vzostupnú dotáciu bielkovín v KD smerom od zvierat zasušených, cez skupinu otelených až po zvieratá v strede laktácie. O nedostatku ľahko dostupnej (glycidovej) energie u zvierat v strede laktácie svedčí aj stúpajúca hladina celkových lipidov (hoci stále v referenčnom rozpätí) sprevádzaná tiež zvýšením hladiny celkového cholesterolu a triglyceridov ako dôsledku zintenzívňujúcej sa lipomobilizácie v snahe vykryť nedostatok ľahko dostupnej energie chýbajúcej v KD. Tento stav (značne vysoký príjem bielkovín a tomu neprimerane nízky príjem energie krmivom sprevádzaný lipomobilizáciou) zaťažuje pečeňové bunky, o čom svedčia aj zvýšené hodnoty AST a ALT v skupine 4 mesiace v laktácii, resp. AST post partum. ALP je zvýšený u všetkých jedincov. Môže to byť reakcia na prebiehajúce hepatopatie, ale aj cholestázu (ktorej výskyt by mohla naznačovať zvýšená hladina bilirubínu v sére). Hodnoty ALP ale súvisia aj s vekom jedinca (u mladších sú hodnoty vyššie než u starších). Zvýšená hladina celkového bilirubínu môže mať pôvod prehepatálny (hemolýza), hepatálny (hepatopatie) alebo posthepatálny (cholestáza). Hyperbilirubinémia však môže vzniknúť aj ako dôsledok nedostatočného príjmu energie krmivom. Po zvýšenej lipomobilizácii stúpajúce množstvo VMK súperí v hepatocytoch s bilirubínom o rovnaké transportné proteíny, v dôsledku čoho sa hladiny bilirubínu v plazme zvyšujú a prekračujú horné hranice referenčného rozpätia (Deckers-Kocken et al., 2006; Mourot et al., 2006). Zvýšenie hladín celkového cholesterolu a triglyceridu spôsobí poškodenie pečeňového parenchýmu, následne nastupuje ťažká steatóza pečene (syndróm stučnenia kráv), cirhóza pečene. Zvýšenie hladín celkových lipidov a voľných mastných kyselín je spôsobené prekrmovaním ľahko stráviteľných sacharidov (najmä pri dojniciach v období státia nasucho), zvýšeným ukladaním tukov v depotných tkanivách a následná zvýšená lipomobilizácia (po pôrode), steatóza pečene, ketóza, zmeny v enzymatickom, dusíkovom, bachorovom profile. Hyperglykémia sa prejaví pri prekŕmení ľahko stráviteľných sacharidov, pri stresových stavoch – pôrod, transport, cukrovka (Degrace et al., 2006; Negro, 2006). Energetický profil GL CH TG CL Jednotka mmol.l-1 mmol.l-1 mmol.l-1 g.l-1 Zasušené 4,63 2,83 0,54 2,75 4 TPP 3,85 3,46 0,60 3,54 4 MPP 4,11 6,49 0,70 4,98 Priemer 4,20 4,26 0,61 3,76 norma* 2,20 – 3,90 2,60 – 5,20 0,20 – 0,80 2,00 – 5,20 GL – glukóza; CH – cholesterol; TG – triglyceridy; CL – celkové lipidy 216 Enzymatický profil AST ALT GMT ALP BI µkat.l-1 Jednotka Zasušené 0,53 0,25 0,39 2,21 10,16 4 TPP 0,73 0,29 0,50 3,18 12,50 4 MPP 0,73 0,39 0,49 1,63 9,32 Priemer 0,66 0,28 0,46 2,34 10,66 norma* 0,22 – 0,50 0,16 – 0,38 0,20 – 0,50 0,28 – 0,84 0,17 – 5,13 CK – celkový keratín; BI – bilirubín Dusíkový profil močovina celkové bielkoviny Jednotka mmol.l-1 g.l-1 Zasušené 3,87 73,84 4 TPP 4,42 72,81 4 MPP 5,72 84,89 priemer 4,67 77,18 norma* 3,0 – 5,0 68 – 84 Tabuľka 15 – Močový profil – odber III. Ca P Mg Na K MO pH Mh logmolc g.ml-1 jednotka mmol.l-1 zasušené 0,60 2,90 7,9 9,5 217,4 408,0 8,1 1,036 4 TPP 1,16 3,03 6,8 37,5 222,3 280,8 7,7 1,033 4 MPP 1,24 1,42 7,3 14,0 213,7 183,8 8,1 1,024 priemer 1,00 2,45 7,3 20,3 217,8 290,9 8,0 1,031 norma* 0,12 – 0,32 – 6,17 – 20 1,50 5,17 16,46 80 – 140 – 130 – 7,8 – 8,4 320 300 1,030 – 1,045 Zvýšenie enzýmu AST sa prejaví vo vzniku akútnej hepatitídy, dystrofie, steatózy pečene, myokarditídy, nutričnej svalovej dystrofii, nefróze. Zvýšenie enzýmu ALP naznačuje intrahepatálnu a extrahepatálnu obštrukciu. Zvýšenie bilirubínu sa prejaví pri puerperálnej pečeňovej kóme, puerperálnej hemoglobinúrii, akútnej hepatopatii, intrahepatálnom 217 a posthepatálnom iktere. Nadbytok ALT sa prejaví v akútnej hepatocelulárnej nekróze, hepatitíde, cirhóze (Ota et al., 2007). Hypoproteinémia – nedostatok SNL v kŕmnej dávke, dlhodobá negatívna dusíková bilancia, dysfunkcie bachorového trávenia (nedostatočná tvorba bielkovín v predžalúdku), hepatopatie, nekrotický syndróm (degeneratívne a zápalové ochorenie obličiek), endoparazitózy. Hyperproteinémia sa prejaví u starších zvierat ako dehydratácia (zvýšená hemokoncentrácia), infekčné ochorenia (zvýšenie najmä globulínovej frakcie), ako aj chronické zápalové procesy. Nadmerný prívod tukov sa uskutočňuje lipémiou, alebo zvýšenou koncentráciou lipidov v bezprostrednom okolí postihnutej bunky. Takto je to u steatózy saginatívnej, transportatívnej, dyskratickej a resorptivnej (Hussein et al., 2007; Wisniewska-Ligier et al., 2006). Literatúra BROUWERS, M.C.G.J., BILDERBEEK-BECKERS, M.A.L., GEORGIEVA, A.M., et al.: Fatty liver is an integral feature of familial combined hyperlipidaemia: relationship with fat distribution and plasma lipids. Clin. Sci., 112, 2007, 123-130. CIHELEK, T., SEVINC, M., BOYDAK, M., et al.: Serum apolipoprotein B100 concentrations in dairy cows with left sided displaced abomasum. Rev. Med. Vet., 157, 2006, 361-365. CUVELIER, C., CABARAUX, J.F., DUFRASNE, I., et al.: Blood transport and hepatic metabolism of fatty acids in ruminants. Ann. Med. Vet., 149, 2005, 117-131. DECKERS-KOCKEN, J.M., NIKKELS, P.G.J., VERHEEM, A., et al.:Atypical findings in a rat model for parenteral nutrition-induced cholestasis. Nutr. Res., 26, 2006, 664-669. DEGRACE, P., MOINDROT, B., MOHAMED, I., et al.: Upregulation of liver VLDL receptor and FAT/CD36 expression in LDLR-/- apoB(100/100) mice fed trans-10,cis-12 conjugated linoleic acid. J. Lipid Res., 47, 2006, 2647-2655. GRIFFIN, J.L., SCOTT, J., NICHOLSON, J.K.: The influence of pharmacogenetics on fatty liver disease in the Wistar and Kyoto rats: A combined transcriptomic and metabonomic study. J. Proteome Res., 6, 2007, 54-61. HUSSAIN, G., NAKAGAWA, T., GOTO, H., et al.: Astaxanthin ameliorates features of metabolic syndrome in SHR/NDmcr-cp. Life Sci., 80, 2007, 522-529. CHAVATTE-PALMER, P., REMY, D., CORDONNIER, N., et al.: Health status of cloned cattle at different agens. Cloning Stem Cells, 6, 2004, 94-100. LUBOJACKA, V., PECHOVA, A., DVORAK, R., et al.: Liver steatosis following supplementation with fat in dairy cow diets. Acta Vet. Brno, 74, 2005, 217-222. MOUROT, J., GUY, G., PEINIAU, P., et al.: Effects of overfeeding on lipid synthesis, transport and storage in two breeds of geese differing in their capacity for fatty liver production. Anim. Res., 55, 2006, 427-442. NEGRO, F.: Mechanisms and significance of liver steatosis in hepatitis C virus infection. World J. Gastroenterol., 12, 2006, 6756-6765. OTA, T., TAKAMURA, T., KURITA, S., et al.: Insulin resistance accelerates a dietary rat model of nonalcoholic steatohepatitis. Gastroenterol., 132, 2007, 282-293. SCHOUVERT, F.: Fatty liver disease in the dairy cow. Point Vet., 31, 2000, 7-13. VARGA, I., SZEBENI, A., SZOBOSZLAI, N., et al.: Determination of trace elements in human liver biopsy samples by ICP-MS and TXRF: hepatic steatosis and nickel accumulation. Anal. Bioanal. Chem., 383, 2005, 476-482. WISNIEWSKA-LIGIER, M., WOZNIAKOWSKA-GESICKA, T., KUPS, J., et al.: Lipid metabolism in children with chronic hepatitis C, a preliminary report. Hepato-Gastroenterol., 53, 2006, 887-891. 218 PROTEKTÍVNY ÚČINOK ZINKU VOČI PÔSOBENIU KADMIA U HYDINY PROTECTIVE EFFECT OF ZINC AGAIN CADMIUM ACTIVITY IN POULTRY Naď, P., Skalická, M., Koréneková, B., Pistl, J., Massanyi, P.*, Cigánková, V. Univerzita veterinárskeho lekárstva Košice, SR *Slovenská poľnohospodárska univerzita Nitra, SR Abstract In the 2 experiments on Japanese quails and turkeys was investigate markedly important depressive effect of cadmium on the level of cellular immunity after long-term exposition, however after short-time exposition, it was not manifested. Feeding of higher Zn amounts together with Cd assigned protective effect. Statistically important (p<0.05) protected effect of Zn against immunodepresive effects of Cd was found at cellular immunity. Accumulation of Cd was 36 multiple lower in muscle in comparison to kidney and 26 multiple lower in comparison to liver. Per os zinc application statistically important (p<0.05) decreased Cd accumulation in kidneys and livers of birds. Key words: cadmium, zinc, immunity, health, food quality, poultry Úvod V životnom prostredí migrujú polutanty vstupujúce do potravového reťazca a následne negatívne pôsobiace na rôznych úrovniach organizmu a jeho jednotlivé systémy (Toman a kol., 2002, Uyanik a kol., 2001). Medzi najdôležitejšie toxické prvky patria olovo, kadmium, ortuť a arzén. Pravidelný, aj keď nie vysoký, príjem kadmia potravou môžeme považovať za rizikový, pre jeho kumulačnú vlastnosť v cieľových orgánoch a tkanivách. Z tohto pohľadu je nevyhnutné hľadať spôsoby a postupy pre spomaľovanie migrácie kadmia v prostredí a metódy ovplyvňovania neho negatívneho účinku na živý organizmus. Ľahko sa vstrebáva a koncentruje v črevnej stene, najmä v duodene, menej v jejune a ileu. Podľa Duizera (1999) kadmium narúša spojenie buniek sliznice čreva a tým sa prestup kadmia cez stenu tráviaceho aparátu zvyšuje. Primárnym miestom pôsobenia kadmia sú biologické membrány, pretože katión kadmia ľahko reaguje s membránovými fosfolipidmi (Sokol a kol.,1998). Je schopné preniknúť do vnútra bunky a narušiť syntézu nukleových kyselín, čo je podstatou jeho mutagénneho účinku, chromozomálnych aberácií, karcinogénnych a teratogénnych účinkov a nekróz. Jedným z významných antagonistov kadmia je zinok. Je súčasťou mnohých metaloenzýmov a ovplyvňuje viaceré systémy organizmu, predovšetkým reprodukčný aparát a imunitný obranný systém (Bíreš, 1985). 219 Materiál a metodika V dvoch experimentoch boli použité japonské prepelice (vo veku 3 týždňov) a morky plemena BIG-6 (vo veku 5 týždňov). Po aklimatizácií v experimentálnych priestoroch boli zvieratá rozdelené do skupín. Kontrolná skupina (K), kŕmená klasickou kŕmnou zmesou (KZ) bez prídavkov; skupina s prídavkom kadmia v dávke predstavujúcej 6 násobok prípustného limitu v kŕmnej zmesi (Cd1); skupina s prídavkom kadmia v dávke predstavujúcej 12 násobok prípustného limitu v KZ (Cd2); skupina s prídavkom zinku v dávke rovnajúcej sa 2 násobku doporučeného obsahu v KZ (Zn) a skupina s prídavkom kadmium v kombinácií so zinkom (CdZn). Odber vzoriek krvi, tkanív a orgánov u prepelíc bol vykonaný na 37., 58. a 118. deň od začiatku podávania prípravkov. V experimente na morkách boli vzorky tkanív odoberané po 71 dňovej expozícií. Kadmium ako chlorid kademnatý (CdCl2) a zinok ako síran zinočnatý (ZnSO4) boli prepeliciam podávané v malom objeme pitnej vody pri rannom napájaní a morkám vo vodnom roztoku individuálne aplikáciou do zobáka. Vzorky tkanív a orgánov boli spracované mikrovlnným rozkladom na zariadení MILESTONE 1 200 MEGA. Zmineralizované vzorky boli analyzované na atómovom absorpčnom spektrometri SOLAR 939 UNICAM podľa metodiky, ktorú uvádza Kocourek, (1992). Boli sledované obsahy kadmia (Cd), zinku (Zn), železa (Fe) a medi (Cu). Pre analýzu imunologických parametrov boli zvolené testy hodnotiace funkčnú aktivitu fagocytárnych buniek (metabolická aktivita fagocytov) a lymfocytov (polyklónová aktivácia lymfocytov). Metabolická aktivita fagocytov bola hodnotená na základe tetrazolium– reduktázovej aktivity buniek počas fagocytózy (Goldová a kol., 2001). Agarózový MIT bol vykonaný podľa Bendixena a kol. (1976) a bol použitý na hodnotenie polyklónovej aktivácie lymfocytov. Celkové imunoglobulíny boli stanovované Zinksulfátovým testom, založeným na princípe zrážania globulínov v sére síranom zinočnatým za vzniku zákalovej reakcie. Intenzita zákalu je meraná spektrofotometricky pri 623nm. Výsledky a diskusia V krvi prepelíc na konci experimentu (po 118 dňoch) boli najvyššie priemerné hodnoty metabolickej aktivity fagocytov (IMAF) zistené v skupine prijímajúcej zinok (3,02) a v kontrolnej skupine (2,99). Najnižšia hodnota (2,23) bola v skupine s prídavkom kadmia vo vyššej koncentrácií (tab. 1.). Štatisticky významne rozdiely na hladine významnosti P>0,001 boli medzi kontrolnou skupinou a skupinami Cd1, Cd2, medzi skupinou Cd1 a skupinami Zn a CdZn, medzi Cd2 a Zn. Z týchto zistení je výrazne preukázaný negatívny účinok kadmia na 220 aktivitu leukocytov. Štatistický významne rozdiely, ale rádovo na nižšej hladine, boli medzi uvedenými skupinami zaregistrované aj pri vzorkách krvi odobratých po 58 dňoch od začiatku aplikácie prípravkov a na hladine významnosti P>0,05 sme zistili rozdiel medzi skupinou kontrolnou (K) a skupinou s vyšším prídavkom kadmia (Cd2) už po 37. dni od začiatku experimentu. Tabuľka č. 1 Metabolická aktivita fagocytov a mobilita leukocytov v krvi prepelíc IMAF IML K Cd1 Cd2 Zn Cd+Zn Min. 2,56 2,08 2,05 2,57 2,67 max. 3,36 2,63 2,55 3,33 3,13 X 2,99 2,32 2,23 3,02 2,79 SD 0,239 0,127 0,135 0,246 0,178 Min. 0,39 0,63 0,55 0,42 0,61 max. 0,84 0,88 0,85 0,75 0,75 X 0,62 0,76 0,71 0,58 0,69 SD 0,122 0,068 0,085 0,075 0,066 IMAF – index metabolickej aktivity fagocytov, IML – index migrácie leukocytov Index migrácie leukocytov, na konci experimentu, bol štatistický významne nižší (P>0,01) medzi skupinami Zn:Cd1 a na hladine významnosti P>0,05 medzi skupinami K:Cd1 a Zn:Cd2. Medzi ostatnými skupinami neboli zistené štatisticky významné rozdiely. Pri odbere krvi na 58. deň experimentu boli zistené významne rozdiely (P>0,01) iba medzi skupinami Zn:Cd1 a na hladine významnosti P>0,05 medzi K:Cd1. Vo vzorkách séra z odberu na 37. deň od začiatku experimentu nebol zistený žiadny významný rozdiel medzi skupinami. Obsah imunoglobulínov bol najvyšší v kontrolnej skupine (3,13 uZST). Najnižšie hodnoty sme namerali v skupine CdZn (1,87 uZST). V ostatných skupinách sa hodnoty pohybovali v rozpätí 1,97 – 2,56 uZST. Medzi jednotlivými skupinami nebol zistený štatisticky významný rozdiel. Sledovaním vplyvu kadmia na imunitný systém a ovplyvňovanie jeho účinku zinkom, sa zaoberali Vasilyeva a kol.(2001). Zistili, že v nízkych dávkach Cd stimuluje imunitný systém, vyššie koncentrácie pôsobia imunodepresívne. Ujamik a kol. (2001) sledovali vplyv rôznych dávok kadmia na vybrané biochemické 221 parametre, hmotnosť a kumuláciu v orgánoch, pričom negatívny účinok zisťovali pri dávkach 50, 75 a 100mg Cd/kg krmiva. V experimente na morkách bol sledovaný obsah jednotlivých prvkov v tkanivách (tab. 2.). Obsah kadmia v stehnovom svale bol významne vyšší (P>0,001) v skupinách s prídavkom kadmia a kadmia+zinok (0,029 mg/kg, resp. 0,028 mg/kg) oproti kontrolnej skupine a skupine s prídavkom zinku ( 0,014 mg/kg, resp. 0,015 mg/kg). Medzi skupinou s prídavkom kadmia a skupinou prijímajúcou kadmium a zinok neboli zistené rozdiely v obsahu kadmia. Antagonistický účinok zinku oproti kadmiu sa v tomto prípade neprejavil. Vo vzorkách pečene a obličiek sa zinok prejavil ako významný faktor blokovania transportu a ukladania kadmia v týchto orgánoch. Priemerný obsah kadmia v pečeni moriek prijímajúcich kadmium bol 0,78 mg/kg, naproti tomu skupina s príjmom kadmia a zinku mala priemerný obsah iba 0,41 mg/kg, štatisticky významný rozdiel na hladine P>0,001. Významný rozdiel obsahu kadmia na tej istej hladine sme zistili aj v obličkách. Skupina s prídavkom samotného kadmia mala priemerný obsah 1,09 mg/kg, pričom v skupine s kombinovaným podávaním kadmia a zinku iba 0,63 mg/kg. V týchto dvoch orgánoch sa ochranný účinok zinku oproti kadmiu prejavil významne v znížení hladín kadmia takmer o polovicu. Tabuľka č.2: Obsah kadmia a zinku v svalovine a orgánoch moriek Vzorka prvok sval Cd pečeň skup. K skup. Cd skup. Zn skup. Cd+Zn x 0,0295 0,0155 0,0283 SD 0,001 0,001 0,004 0,007 x 0,070 0,780 0,072 0,409 SD 0,026 0,062 0,018 0,031 0,072 1,091 0,094 0,627 SD 0,018 0,057 0,016 0,044 x 15,93 31,55 19,04 SD 2,09 3,05 5,60 1,56 x 20,81 29,22 19,92 0,99 2,96 2,34 19,44 25,08 20,41 1,99 2,85 1,12 obličky x sval Zn pečeň 0,0143 19,46 25,66 SD 6,29 obličky x 23,02 SD 5,98 Záver V experimentoch na japonských prepeliciach a morkách bol zistený preukazne významný depresívny účinok kadmia na úrovni bunkovej imunity pri dlhodobejšej expozícií, ktorý sa pri 222 krátkodobom pôsobení (do 50 dní) neprejavil. Podanie vyšších dávok zinku s kadmiom preukazuje protektívny účinok. Významný ochranný efekt zinku voči imunodepresívnym účinkom kadmia bol zistený pri bunkovej imunite. Podávanie zinku v skupine exponovanej kadmiom významne eliminovalo nepriaznivé účinky kadmia. Ukladanie kadmia v svalovine bolo 36 násobne nižšie oproti obličkám a 26 násobne nižšie oproti pečení. Per orálna aplikácia zinku významne znižovala kumulovanie kadmia v obličkách i pečení. Literatúra Bíreš J., Vrzgula L.: Veterinářství, 35, 1985:62-64Golian, J., Sokol, J., Bohunická, T.“ Risk factor of the food change, Proceeding book, Nitra, 2002. Bendixen, G., Bentzen, K., Clausen, J. E., et al. (1976): Inhibition of human leucocyte migration. In Natvig, J. B., Permann, P., Wigzel, H.: Lymphocytes. Isolation, Fractionation and Characterization. Scand. I. Immunol., Suppl. 5, Universitetsforlaget, Nyegaard, Oslo, pp. 244 – 267. Duizer, E., Gilde, A. J., Versantvoort, Ch.: Toxicol. Appl. Pharmacol., 155, 2, 1999, 117-126. Goldová M., Revajová V., Pistl J., Letková V., Levkut M., Wagshal G., Csizsmárová G., Loószová A.: Eimeria colchici and immunocompetent cells in specific and nonspecific hosts. Acta Parasitologica 46, 2001, 39-44 Sokol, J., Uhrín, V., Massányi, P.:Kadmium a jeho výskyt v organizmoch živočíchov. Bratislava, ŠVS SR, ISBN 80-7148-022-3, 1998, s.116. Toman, R., Massanyi, P., Uhrín, V.: Trace elements and electrolytes, 19,3,2002: 114-117 Uyanik, F., Eren, M., Atasever, A., Tunsoku, G., Kolsuz, A.H.: J. of Israel Veterinary Medical Association, 2001 Vasilyeva, C. – Berzina, H. – Remez, I.: Complex of methods for the estimation of cadmium and zinc action on chicken immunity methods of estimation of chicken immunity. Baltic J. Lab. Anim. Sci., 11, 2001: 149-159 Kontaktná adresa: MVDr. Naď Pavel, PhD., Univerzita veterinárskeho lekárstva, Katedra výživy, dietetiky a chovu zvierat, Komenského 73, 041 81 Košice, e-mail: [email protected], mobil: 0907 923235 QUO VADIS POKUSY NA ZVIERATÁCH VO VYSOKOŠKOLSKEJ EDUKÁCII A VÝSKUME? QUO VADIS OF ANIMAL EXPERIMENTS IN UNIVERSITY TEACHING AND RESEARCH? 1 Ništiar, F., 1Beňačka, R., 2Lukačínová, A., 1Lovásová, E., 3Ništiarová, A., 1Ústav patologickej fyziológie, 2Ústav fyziológie a 3Centrálny zvieratník, Lekárska fakulta, Univerzita P.J. Šafárika, Trieda SNP 1, 040 66 Košice Summary: There are few areas of animal use that arise so many emotions and questions as that of their use in education. The physical presence of an animal (whether alive or dead) is a dramatic event experience for most students, and their effects it has will depend heavily on their previous experience with that species, their moral values and the perceived necessity of the practical. Most of the current literature on this subject is highly emotive, based on relative little data and provide few conclusions. This paper attempts to clarify the issues raised and present an overview of the alternatives available with their strengths and weakness. Finally, it 223 offers guidelines for humane education that take into consideration both the practical issues and the feelings of all those involved. 1. Pokusy na zvieratách ako súčasť didaktickej a vedeckej reality a hľadanie alternatív Uplynulo už viac ako 40 rokov odkedy Russell a Burch (1959) publikovali svoje pohľady na pokusy na zvieratách a predložili návrhy pre humánnejšie využívanie zvierat pre účely vedecké, testovacie i edukačné. Legislatívne opatrenia, najmä Nariadenie 86/609/EEC (Directive for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes), zamerané na ochranu a reguláciu použitia laboratórnych zvierat pre vedecké ako aj edukačné účely (Louhimies, 2002) upriamili pozornosť na využívanie alternatívnych metód (Worth a Balls, 2002). Otáznym zostáva čo je možné účelne nahradiť, do akej miery treba nahradiť a v akej forme je možné nahradiť. Pokiaľ v pedagogickom procese sa rysujú vcelku využiteľné alternatívne postupy (Smith a Smith, 2004), podstatne zložitejším sa to javí v testovaní liekov, resp. toxických látok v životnom prostredí, ale najmä v oblasti vedeckého výskumu. Výučba a jej metodológia v biomedicínskych oblastiach je realizovaná okrem prednášok, seminárov, praktických cvičení, konzultácií aj, ale nie v poslednom rade formou študentskej vedeckej odbornej činnosti. V rámci mnohých predmetov, ako sú patologická fyziológia a fyziológia, anatómia, farmakológia je ťažké, a často nie je ani z etických aspektov účelné vylúčiť praktické zamestnania za využitia laboratórnych zvierat alebo zvieracích orgánov a tkanív. Problém je v správnej voľbe zámeru takéhoto zamestnania a v zdôvodnení, že okrem získania poznatkov a zručnosti majú aj etický rozmer. Práve tento etický rozmer môže byť v budúcnosti osožný pri ochrane experimentálnych zvierat, z hľadiska správnej manipulácie efektívnemu použitia, resp. zváženia použitia alternatívnych metód. Pre praktické cvičenia často neobstojí len samotné zdôvodnenie získania zručnosti pre manipuláciu so zvieratami. Iný rozmer však môže takéto zamestnanie dostať ak je do popredia postavený etický rozmer správnej manipulácie so živým materiálom (teraz zviera, neskôr pacient – človek). Tento rozmer si musí uvedomiť aj pedagóg pri zaradení praktického zamestnania za využitia živých zvierat. Počet zvierat používaných pri praktických zamestnaniach v pedagogickom procese na univerzítách predstavuje len zanedbateľný zlomok z počtu zvierat používaných na výskum alebo testovanie chemických látok. Podobne, tento počet, napr. hlodavcov, je absolútne neporovnateľný s počtami, ktoré sú vyhubené napr. pri deratizácii. Ďalšia otázka, ktorá vyvoláva určitý problém v tejto oblasti je nejednotná interpretácia platnej legislatívy týkajúcej sa tejto oblasti (Zákon NR SR č. 488/2002 Z.z. o 224 veterinárnej starostlivosti a o zmene niektorých zákonov, a Nariadenie vlády SR č. 289/2003 Z.z. ktorým sa ustanovujú požiadavky na ochranu zvierat používaných na pokusné účely alebo iné vedecké účely). Uvedená legislatíva je reštriktívna, ale v žiadnom prípade nemá za cieľ „zakázať“ alebo „znemožniť“ využitie zvierat pre vedecké alebo pedagogické účely. Nebola tvorená so zámerom likvidovať pokusy na zvieratách, ale na to, aby tieto boli riešené v určitom definovanom a kontrolovateľnom rámci a zodpovedali aj etickému duchu zákona a čo najviac sa približovali Európskym legislatívnym normám. Preto by pokusy alebo praktické zamestnania mali byť profesionálne zdôvodnené (potreba demonštrácie javu na zvierati, počty použitých zvierat, experimentálne algoritmy a etický rozmer) a schválené. Profesionálny a etický rozmer by mali posúdiť a schváliť príslušné etické komisie ustanovené v intenciách uvedených legislatívnych noriem, a schvaľujúci orgán (t.j. ŠVPS; Štátna veterinárna a potravinová správa) by mal v konečnom dôsledku preveriť splnenie zákonných podmienok pre žiadaný pokus na zvierati, a po splnení zákonných požiadaviek vydať povolenie. Kontrolu nad dodržaním pokusných podmienok vykonávajú tak príslušné etické komisie ako aj schvaľujúci orgán v rámci svojich pôsobností. V prípade, že by táto legislatívna úprava bola nesprávne interpretovaná, v zmysle neopodstatnených obštrukcií pokusoch na zvieratách, mohlo by to mať, tak pre edukačný proces, ako aj pre vedecký výskum negatívne dopady. Ako ukázali skúsenosti z iných krajín správna pedagogická prax (s použitím zvierat tam kde to je nenahraditeľné a zdôvodnené) znížilo v rozumnej miere aj využívanie zvierat v profesionálnej vedeckej práci (van der Valk a spol., 1999). Za výučbu a demonštráciu sa považuje odovzdávanie poznatkov a techník (technických úkonov, napr. operačné, manipulačné a pod.) potrebných pre pochopenie fyziológie, patologickej fyziológie alebo farmakológie živých systémov. Oproti tomu za cvičenie sa považuje získanie zručnosti. Je potrebné jednoznačne už tu podotknúť, že pri výučbe a demonštrácii je použitie zvierat pre určité prípady jednoznačne zdôvodnené. Diskutabilné zostávajú cvičenia, t.j. získanie zručnosti. V oboch prípadoch je ale potrebné zvážiť možnosť využitia alternatívnych postupov, ktoré je možné zaradiť do nasledovných skupín (Zinko a spol., 1997): modely, fantómy a mechanické simulátory, filmy a interaktívne video, počítačová simulácia a virtuálne systémy, pokus na sebe a na ľuďoch, pokusy na rastlinách, pozorovanie a štúdiá v prírodných podmienkach, odpadové materiály z bitúnkov a ryby spracujúceho priemyslu, in vitro štúdiá na bunkových kultúrach (na jednobunkovcoch, červoch a nestavovcoch), mŕtve zvieratá (prirodzený úhyn, humánne utratené) a klinická prax (veterinárne fakulty). Samozrejme pre pedagogické účely je možné vyvíjať rôzne modely a modelové systémy. 225 2. Súčasný stav používania zvierat problémy v edukácii a výskume, možné alternatívy Udáva sa, že na výučbu sa používa asi 1 % zvierat využívaných pre vedecké účely. U nás je to rádovo nižšie číslo, aj keď zďaleka nie pre etické uváženie, ale z prozaického dôvodu nedostatku finančných prostriedkov. Pokiaľ sme na začiatku 90-tých rokov minulého storočia v rámci praktických cvičení (28 cvičení po 2 hodín z predmetu patologická fyziológia) mali 18 na zvieratách (potkany, myši, morčatá a králiky), po prvej legislatívnej úprave po roku 1998 (na základe Zákona č. 115/1995 Z.z. a Vyhlášky 231/1998 Z.z.) nám už vtedajšia Štátna veterinárna správa povolila jedno 2 hodinové cvičenie (demonštrácia základných manipulačných úkonov, fixácia, handling, rôzne spôsoby aplikácie liekov a pod.) po 1 potkanovi pre 1 krúžok (cca. 16 študentov všeobecného lekárstva) a to isté cvičenie už nepovolila pre zubné lekárstvo. Podobný pokles animálnych pokusov je zaznamenaný aj vo výskume, kde v súčasnosti poklesol počet zvierat za poslednú dekádu až na tretinu. Opakovane musím použiť paralelu deratizácie a etických úvah ochrany laboratórnych zvierat a nájdenie racionálneho kompromisu a uvedomenia, že duch zákona „nie je proti“ pokusom na zvieratách, nemá za účel obštrukciu animálnych experimentov, ale ich racionalizáciu, účelnosť, evidenciu a ich kontrolu. Práve preto zopakujeme, že sa žiada jednoznačne vymedzenie právomoci pri ich posudzovaní, a to, čo je kompetenciou vedeckých agentúr (vedecká oponentúra), etických komisií (etické posúdenie a kontrola) a ŠVPS (administratívna centralizácia evidencie pokusov na zvieratách, po preverení dodržania zákonom stanovených podmienok, predloženie žiadosti v intenciách legislatívy s vyjadrením príslušnej etickej komisie, kontrola ich dodržania, zamedzenie duplicitných štúdií, zabezpečenie prístupu k databázam resp. ich propagácia, spracovanie a vydávanie rukovätí pre správne zaobchádzanie s laboratórnymi zvieratami, popr. o možných alternatívach). Hlavné možnosti racionálneho zníženia počtu zvierat pre pokusné účely spočívajú práve v dobrých vedomostiach o možných alternatívnych postupoch, o existencii databáz (zabránenie duplicitným pokusom). Momentálne o týchto možnostiach je možné seriózne informácie získať na mnohých dostupných databázach. V prípade že ani po racionálnom zvážení riešeného projektu nie je možné použiť alternatívne metódy je potrebné veľmi jednoznačne zhodnotiť potrebu zvierat pre pokus (za maximálnej možnej redukcie počtov, bez toho aby to znížilo validitu výsledkov), zabezpečiť minimalizáciu distresu zvierat (použitie šetrných postupov, bolestivé úkony robiť za znecitlivenia zvierat a profesionálna manipulácia počas celého experimentu za dodržania maximálneho komfortu pokusných zvierat). 226 3. Použitie alternatívnych postupov vo výučbe Pri použití zvierat vo výučbe je rozhodujúce zadefinovať do akej miery sú pre splnenie cieľov výučby potrebné zamestnania za využitia zvierat ako aj to, koľko študentov bude potrebovať zručnosť získanú pri týchto cvičeniach pre výkon svojho povolania. Tu existuje zjavná paralela, či je potrebné aby študenti medicíny mali praktické cvičenia na zvieratách intervenčného typu (aplikácia liekov, operačné výkony a pod.) alebo ich stačí len ukázať na videu. Odpoveď sa núka sama od seba. Dali by ste si operovať slepé črevo chirurgovi, ktorý ešte v živote neoperoval, ale videl stovky videozáznamov takýchto operácií? Prirodzene na druhej strane takéto cvičenia by mali byť výberové, to znamená to, že by sa na ne mohli prihlásiť študenti, ktorí sa chcú orientovať takým smerom, že tieto cvičenia pre nich môžu znamenať z hľadiska budúcej profesie veľký prínos. V prípade študentov veterinárnej medicíny to je výučba na pacientovi. U študentov medicíny je to vzťah k živej bytosti, uvedomenie si bolestivosti, resp. dopadov chybných úkonov (napr. operačné cvičenia). Pri selektívnom prístupe je možné do značnej miery redukovať potrebu živých zvierat, nakoľko to nebudú vykonávať študenti, ktorí sa takýmto smerom neorientujú a nemajú k tomu náležitý vzťah a cit. Inými slovami dostať výučbu na zvieratách do oblasti vypísaných výberových zamestnaní, popr. do oblasti študentskej vedeckej odbornej činnosti, pri dôslednom dodržaní zásad 3 R (reduction, refinement, replacement). Posúdenie potrebnosti a schválenia týchto zamestnaní by mala byť jednoznačne v pôsobnosti príslušných etických komisií, za dodržania legislatívneho rámca v zmysle NV SR č. 289/2003 Z.z. Akémukoľvek využitiu živých zvierat pre výučbu, má predchádzať podrobné poučenie a inštruktáž študentov o manipulácii, welfare a etike práce so zvieratami. Napriek tomu vo výučbe nie sú veľké problémy s využitím alternatív, najmä videa alebo počítačovej simulácie. Na lekárskych fakultách je možnosť najmä vo výučbe fyziológie demonštrovať niektoré problémy za využitia dobrovoľníkov z radov samotných študentov. Ďalšie možnosti sú trojdimenzionálne modely potkana alebo králika, s ktorými sú dobre skúsenosti na veterinárnych univerzitách vo svete (Martinsen a Jukes, 2005). Problémy pri zavádzaní alternatív do výučby spočívajú najmä v ich finančnej náročnosti, čo pri súčasnom financovaní vysokých škôl je takmer nerealizovateľné. Práve pre tieto, hlavne finančné bariéry, zostáva často jedinou alternatívou výučba klasickým spôsobom na (laboratórnych) zvieratách, ale s maximálnou snahou o humanizáciu tohoto spôsobu výučby (zníženie počtu zvierat a zabezpečenie maximálneho možného komfortu). 227 4. Alternatívy vo vedecko-výskumnej činnosti V oblasti vedecko-výskumnej činnosti je situácia s využitím alternatívnych postupov ešte zložitejšia, ako v pedagogickej praxi. Tu nahradenie pokusu na zvieratách musí predchádzať rozsiahla vedecko-výskumná činnosť a majú sa hľadať, validifikovať a štandardizovať alternatívne postupy. V tejto oblasti má významné postavenie ECVAM (European Centre for the Validation of Alternative Methods), v ktorom Slovenskú republiku zastupuje Prof. Ing. Ján Šajbidor, DrSc., z Fakulty chemickej a potravinárskej technológie Slovenskej TTU v Bratislave. Základom pre úspešnosť alternatívnych postupov je najmä porovnateľnosť výsledkov a možnosť ich extrapolácie pre modelované objekty in vivo (Höfer a spol., 2004). V súčasnosti je k dispozícii veľké množstvo alternatívnych modelov od in vitro techník (tkanivové a bunkové kultúry) cez jednobunkové organizmy (baktérie, kvasinky, prvoky), bezstavovce (červy, hmyz), alebo nové šetrnejšie prístupy in vivo (počty, manipulácia, welfare; Ništiar a spol., 2003). 5. Závery a východiská Je možné záverom povedať, že čo sa týka využívania zvierat na výučbu, predstavuje to asi 1% zo všetkých zvierat využívaných na vedecké účely (Smith a Smith, 2004). Pre Slovensko je tento údaj rádovo nižší. Zavedenie alternatívnych postupov do výučby na vysokých školách je finančne náročné. Preto nie je možné v tejto oblasti v dohľadnej dobe očakávať výrazné zmeny. Jedinou zchodnou cestou zostáva posunúť edukáciu za využitia zvierat (pokiaľ sa dá) do oblasti špecializovanej (výberovej) výučby, popr. do oblasti študentskej vedeckej činnosti. Ďalšou možnosťou pre zaradenie alternatívnych metód do výučby je možnosť získania prostriedkov pre tento proces z Eurofondov, resp. prostredníctvom Európskych alebo aj domácich grantov (KEGA). Zásadne iná je situácia v oblasti vedeckého výskumu, kde zatiaľ využívanie alternatív je len zbožným želaním, napriek tomu, že celý rad alternatívnych postupov sa vcelku úspešne ujal v bežnej praxi. Ide najmä o monitorovanie znečistenia prostredia (testy na jednobunkovcoch, prokaryotoch), pri skúšaní toxicity látok a liečiv. V tejto oblasti máme ešte veľa rezerv, ktoré je možné a bude potrebné prednostne riešiť v rámci vedecko-výskumnej činnosti najmä na báze grantových úloh VEGA a APVV. Osobitnú úlohu pri riešení tejto problematiky môže zohrať aj Slovenská spoločnosť pre vedu o laboratórnych zvieratách, ktorá by mala podchytiť čo najširšiu bázu odborníkov, zaoberajúcich sa problematikou edukácie na zvieratách, resp. aj zaujímajúcich sa 228 o alternatívne metódy pre vedecký výskum alebo rutinnú expertízu (toxicitné testy a ich validácia). Záverom je možné povedať, že najlepšou ochranou zvierat zďaleka nie sú legislatívne opatrenia, ale dobré vedomosti o nich, o zaobchádzaní s nimi a starostlivosti o ne. A to je možné získať a vypestovať len v kontakte s nimi, v úzkej väzbe profesionálnych, etických, morálnych aj náboženských prístupov (Capaldo, 2004). Táto práca vznikla v rámci riešenia vedeckého projektu podporovaného Vedeckou grantovou agentúrou MŠ SR VEGA číslo 1/3494/06. Literatúra: 1. Capaldo, T.: The psychological effects on students of using animals in ways that they see as ethically, morally or religiously wrong. Altern. Lab. Anim., 32, 2004: 525-531. 2. Höfer, T. – Gerner, I. – Gundert-Remy, U. – Liebsch, M. – Schulte, A. – Spielmann, H. – Vogel, R. – Wettig, K.: Animal testing and alternative approaches for the human health risk assessment under the proposed new European chemicals regulation. Arch. Toxicol., 78, 2004: 549-564. 3. Louhimies, S.: Directive 86/609/EEC on the protection of animals used for experimental and other sientific purposes. Altern. Lab. Anim., 30, 2002: 217-219. 4. Martinsen, S. – Jukes, N.: Towards a humane veterinary education. J. Vet. Med. Educ., 32, 2005: 454-460. 5. Ništiar, F. – Lukačínová, A. – Ništiarová, A.: Rapid bioassay that uses protozoan Tetrahymena pyriformis to asses the toxicity of various xenobiotics. Labor. Diagnostika. 8, 2003: 85-86. 6. Russell, W.M.S. – Burch, R.L.: (1959). The Principles of Humane Experimental Technique, 238 pp. London, UK: Methuen. 1959. 7. Smith, A.J. – Smith, K.: Guidelines for humane education: alternatives to the use of animals in teaching and training. Altern. Lab. Anim., 32, 2004: 29-39. 8. van der Valk, J. – Dewhurst, D. – Hughes, I. – Atkinson, J. – Balcombe, J. – Braun, H. – Gabrielson, K. – Gruber, F. – Miles, J. – Nab, J. – Nardi, J. – van Wilgenburg, H. – Zinko, U. – Zurlo, J.: Alternatives to the use of animals in higher education. Altern. Lab. Anim., 27, 1999: 39-52. 9. Worth, A.P. – Balls, M.: Alternative (non-animal) methods for chemicals testing: current status and future prospects. Alter. Lab. Anim., 30, 2002: 1-125. 10. Zinko, U. – Jukes, N. – Gericke, C.: From Guinea-pig to Computer Mouse: Alternative Methods for a Humane Education. 229 pp., Leicester, UK: EuroNICHE, 1997. Kontaktná adresa: Prof. MVDr. František Ništiar, CSc., Department of Pathological Physiology Faculty of Medicine, Šafárik University Trieda SNP 1, 040 66 Košice, Slovak republic Phone: +421 55 640 22 79 Fax: +421 55 642 33 50 E-mail: [email protected] 229 POUŽITIE PARACETAMOLU V TERAPII RESPIRAČNÝCH OCHORENÍ OŠÍPANÝCH USING OF PARACETAMOL IN THERAPY OF RESPIRATORY DISEASES OF PIGS Novotný, J., Kováč, G., Link, R., Hisira, V. II. interná klinika, UVL Košice Abstract The work presented was aimed at evaluation of therapeutic using of paracetamol and its effects on haematological profile, as well as body weight and concentration of total immunoglobulins in blood serum of pigs with respiratory diseases symptoms. Fifteen piglets were divided to 3 groups (1st experimental group – treatment with paracetamol; 2nd experimental group – paracetamol + inj. marbofloxacin; and control group). A four days supplementation of paracetamol resulted in a positive effect on concentration of leukocytes and body weight of pigs (in the 1st and the 2nd experimental group). Úvod Intenzívny spôsob chovu ošípaných v podmienkach veľkokochovov so sebou prináša aj mnohé negatíva, ku ktorým patrí extrémne vysoká koncentrácia zvierat. Vysoká hustota ustajnenia v uzavretom prostredí a priame zavlečenie infekčných zárodkov (nákup nových zvierat, prichádzajúce a odchádzajúce vozidlá, vtáky, osoby) uľahčuje prenos aerogénnych patogénov v rámci chovu a tiež medzi jednotlivými farmami. V súvislosti s tým sú v súčasnosti respiračné ochorenia a systémové aerogénne infekcie považované za najzávažnejšie ochorenia v modernej produkcii ošípaných (Christensen a kol., 2003). Paracetamol, alebo acetaminophen je para amino-fenolový derivát s analgetickými a antipyretickými vlastnosťami. Vo veterinárnej medicíne sa môže využiť predovšetkým pri symptomatickej liečbe – na redukciu horúčky v priebehu akútnych respiračných ochorení ošípaných v kombinácii s vhodnou anti-infekčnou terapiou. Cieľom predloženej práce bolo posúdenie vplyvu podávania paracetamolu na hematologické parametre, koncentrácie celkových imunoglobulínov a hmotnosť odstavčiat s postihom respiračného aparátu. Materiál a metodika Použité zvieratá: Zo skupiny 240 kusov odstavčiat sme vyselektovali 15 kusov zvierat s postihom respiračného aparátu a klinicky zjavnými respiračnými problémami (s postihom 230 horných dýchacích ciest – rinitída, výtok z nosa, s postihom dolných dýchacích ciest – kýchanie, kašeľ, výskyt respiračných šelestov; dyspnoe). Experiment sa zrealizoval v praktických podmienkach na farme ošípaných PDP – Seleška. Ošípané boli ustajnené v sekcii pre kategóriu ošípaných do 15 kg v kotercoch s identickými štandardnými podmienkami. Zvieratá boli kŕmené adlibitným typom kŕmenia suchou kŕmnou zmesou, prislúchajúcej tejto kategórii zvierat OŠ-02 Experimentálny dizajn: 1. skupina: 5 odstavčiat liečba len paracetamol 2. skupina: 5 odstavčiat liečba paracetamol + injekčné ATB ( marbofloxacin) 3. skupina: 5 odstavčiat neliečené Paracetamol (Pracetam 10% premix, Vétoquinol) bol primiešaný do KZ v koncentrácii 5 g Pracetamu / kilogram krmiva. Injekčné antibiotikum – marbofloxacín (Marbocyl 10% inj. a.u.v., Vétoquinol) bolo aplikované v dávke 0,25 ml/ 12,5 kg živej hmotnosti raz denne – počas 4 dní. Odber krvi z očného splavu ošípaných (Kováč a kol., 1990) sa zrealizoval na začiatku experimentu 0. odber, a na konci experimentu 4. deň. Na začiatku a na konci experimentu sa zisťovala aj hmotnosť ošípaných. Stanovenie hematologického profilu: koncentrácie Er, Le, Hb, Htk, MCV sa zisťovali na prístroji animal blood counter (abc TM Vet.). Diferenciálny krvný obraz: mikroskopicky v laboratóriu II. internej kliniky. Stanovenie celkových imunoglobulínov: spektrofotometricky na prístroji SPEKOL 211. Kultivácia mikroorganizmov: z dýchacích ciest postihnutých zvierat boli urobené výtery – zaslané do mikrobiologických laboratórií UVL a ŠVU v Košiciach. Serologické vyšetrenie krvi: za účelom detekcie vírusov – ŠVU Košice. Analýza plynov maštale: koncentrácia CO2 v ovzduší – prístroj ANAGAS CD 98, koncentrácia NH3, H2S, O2, a CO – TETRAGAS detektor Koprologická analýza: ovoskopické vyšetrenie – flotačná a sedimentačná metóda Štastistické zhodnotenie experimentu: namerané parametre boli zhodnotené 1 cestnou A novou. Výsledky Vo všetkých sledovaných skupinách sa koncentrácia Le pohybovala nad referenčnou normou (tabuľka 1). Na 4. deň po začatí terapie sa v 1. a 2. skupine zaznamenalo nesignifikantné 231 zníženie koncentrácie Le. Koncentrácia Le v krvnom sére 3. skupiny sa nesignifikantne zvýšila. Tabuľka 1. Koncentrácia leukocytov v krvi ošípaných (x ± sd; fyziologická norma 11 – 18 G/l) 0. deň 4. deň 1. skupina – paracetamol 23,16 ± 6,77 20,96 ± 6,85 2. skupina – paracetamol + marbocyl inj. 23,46 ± 6,07 20,98 ± 9,51 3. skupina – kontrola 22,40 ± 7,66 24,46 ± 4,93 Koncentrácia Er sa vo všetkých odberoch a vo všetkých 3 skupinách pohybovala v medziach fyziologického rozpätia (tabuľka 2). Medzi skupinami sa nezaznamenali signifikantné rozdiely. Tabuľka 2. Koncentrácia erytrocytov v krvi ošípaných (x ± sd; fyziologická norma 5 – 8 T/l) 0. deň 4. deň 1. skupina – paracetamol 6,52 ± 0,63 5,79 ± 0,63 2. skupina – paracetamol + marbocyl inj. 6,54 ± 0,49 5,66 ± 0,18 3. skupina – kontrola 6,07 ± 0,59 5,93 ± 0,62 Koncentrácia Hb sa pohybovala v medziach fyziologickej normy, nedošlo tu k štatisticky významným rozdielom (tabuľka 3). Tabuľka 3. Koncentrácia hemoglobínu v krvi ošípaných (x ± sd; fyziologická norma 10 – 14 g/dl) 0. deň 4. deň 1. skupina – paracetamol 10,80 ± 0,95 10,14 ± 0,61 2. skupina – paracetamol + marbocyl inj. 11,54 ± 1,06 10,38 ± 0,47 3. skupina – kontrola 10,12 ± 0,94 10,12 ± 1,13 Hematokrit sledovaných skupín ošípaných sa okrem 2. skupiny (0. deň) pohyboval pod fyziologickou normou. Medzi skupinami sa nezaznamenali signifikantné rozdiely (tabuľka 4.). 232 Tabuľka 4. Hematokritová hodnota krvi ošípaných (x ± sd; fyziologická norma 0,32 – 0,42 l/l) 0. deň 4. deň 1. skupina – paracetamol 0,31 ± 0,03 0,28 ± 0,02 2. skupina – paracetamol + marbocyl inj. 0,32 ± 0,04 0,28 ± 0,01 3. skupina – kontrola 0,28 ± 0,03 0,28 ± 0,03 Stredný objem erytrocytov sa vo všetkých odberoch nachádzal pod referenčným rozpätím (tabuľka 5.). Štatistickou analýzou sa nezistili žiadne signifikantné rozdiely. Tabuľka 5. MCV krvi ošípaných (x ± sd; fyziologická norma 50 – 68 f/l) 0. deň 4. deň 1. skupina – paracetamol 47,2 ± 2,17 48 ± 1,73 2. skupina – paracetamol + marbocyl inj. 49,20 ± 1,79 49,8 ± 1,79 3. skupina – kontrola 46,80 ± 3,27 47,6 ± 3,13 Pri stanovení percentuálneho zastúpenia jednotlivých druhov bielych krviniek (tabuľka 6.) sa v 0. dni nezistili žiadne patologické odchýlky. Naopak v 4. dni experimentu sme zachytili zvýšenú úroveň neutrofilov a zníženú úroveň lymfocytov. Tabuľka 6. Diferenciálny krvný obraz ošípaných – priemerné hodnoty Deň Ly Mo Ba Ty Se Eo pokusu 40 – 55 2–8 1–3 2–5 30 – 50 1–3 1. 0. deň 44 4 48,67 3 skupina 4. deň 39,33 2,67 56 3 2. 0. deň 50,8 2 46,4 3 skupina 4. deň 39 2 59 2 3. 0. deň 48,67 4 45,33 3 skupina 4. deň 39,20 4 56,60 2,60 Koncentrácia celkových imunoglobulínov sa pohybovala v medziach fyziologického rozpätia (tabuľka 7.). Rovnako sa tu nezistili žiadne štatisticky preukázateľné rozdiely. 233 Tabuľka 7. Koncentrácia C Ig v krvnom sére ošípaných (x ± sd; fyziol. norma 20 – 35 UZST) 0. deň 4. deň 1. skupina – paracetamol 25,78 ± 2,38 24,88 ± 2,72 2. skupina – paracetamol + marbocyl inj. 24,99 ± 2,76 25,18 ± 3,16 3. skupina – kontrola 25,58 ± 4,28 27,24 ± 5,39 V 1. skupine odstavčiat sme za sledované obdobie zaznamenali nárast priemernej hmotnosti o 1, 06 kg, v 2. skupine o 1,00 kg a v 3. skupine o 0,90 kg (tabuľka 8). Medzi sledovanými skupinami sa nezaznamenali signifikantné rozdiely. Tabuľka 8. Telesná hmotnosť ošípaných (x ± sd; kg) 0. deň 4.deň 1. skupina – paracetamol 13,60 ± 3,07 14,66 ± 3,12 2. skupina – paracetamol + marbocyl inj. 11,70 ± 1,68 12,70 ± 2,22 3. skupina – kontrola 11,50 ± 3,00 12,40 ± 3,31 Kultiváciou výterov z rypákov postihnutých ošípaných sme zistili prítomnosť: Proteus mirabilis, virid. Streptokoky, Enterobacter agglomerans, E. coli. Sérologicke vyšetrenie na prítomnosť respiračných vírusov bolo negatívne. Koprologické vyšetrenie zamerané na detekciu a identifikáciu vajíčok endoparazitov (gastrointestinálnych oblých červov, pečeňových červov a pásomníc) bolo negatívne. Analýzou plynov maštale sa zistila chyba v cirkulácii vzduchu (neprítomnosť ventilačného systému) a s tým spojené relatívne vyššie koncentrácie NH3 (0,0015 %) a CO2 (0,25 %). Diskusia Analýzou hematologického profilu krvi ošípaných sa zistili odchýlky od fyziologickej normy (Vrzgula a Sokol 1990). Vyplýva to však z toho, že do experimentu sme zámerne vyselektovali choré zvieratá – s postihom respiračného aparátu. Zvýšené hodnoty boli zistené pri koncentrácii leukocytov (leukocytóza; tabuľka 1.) – čo poukazuje na to, že v organizme zvierat prebiehali infekčné, alebo zápalové ochorenia pri ktorých sa stupňovala tvorba bielych krviniek a zvyšoval sa ich počet. Do úvahy by mohli prichádzať aj parazitárne ochorenia – tie sme však vylúčili koprologickým vyšetrením a leukogramom. V skupinách ošípaných pri ktorých sa zrealizovala terapia (1. a 2. skupina) došlo k nesignifikantnému zníženiu 234 koncentrácie Le – čo poukazuje na efektivitu terapie. Naopak u neliečených zvierat (3. skupina) došlo k zvýšeniu koncentrácie Le – čo zrejme vyplýva z rozvoja patologického procesu na dýchacích cestách. Znížená hodnota hematokritu (vyšetrenie krvi pri ktorom sa určuje pomer medzi objemom krviniek a krvnej plazmy; tabuľka 4.) u všetkých skupín zvierat sa môže spájať so zníženou hodnotou stredného objemu erytrocytov – MCV (mikrocytóza = malé formy erytrocytov; tabuľka 5.), pretože hodnota hematokritu predovšetkým závisí od množstva a veľkosti erytrocytov (Bartko a Hofírek., 1993). Koncentrácie erytrocytov a hemoglobínu (tabuľky 2., 3.) sa u všetkých 3 skupín pohybovali vo fyziologickom rozpätí – nebola tam anémia (súvis s parenterálnou aplikáciou Fe v perinatálnom období života prasiatok). Z pohľadu diferenciálneho krvného obrazu (leukogramu) sa zistili patologické odchýlky len v 4. dni experimentu (tabuľka 6.) a to u všetkých 3 skupín: • neutrofília s posunom jadra doprava – indikuje bakteriálnu infekciu (akútne zápalové procesy, akútne infekcie; Vrzgula a Sokol 1990), pretože neutrofily sú obyčajne prvou odozvou k výskytu bakteriálnych patogénov (neutrofily – pohlcujú baktérie a tvoria chemické látky, ktoré ich ničia). • mierna lymfopénia – u všetkých 3. skupín na obdobnej úrovni – čo vylučuje nejaký imunosupresívny účinok liekov (ako majú napr. kortikoidy, steroidy) Z hľadiska detekcie infekčných zárodkov, neboli zachytené žiadne primárne respiračné patogénny (ako sú napr. vírusy – PRRS, Aujeskyho choroby, influenzy ošípaných; baktérií – ako napr. Actinobacillus pleuropneumonie, A. suis, Haemophilus parasuis atď.). Vzhľadom na nedostatočné vetranie maštalí (prirodzené vetranie oknami – nestačilo zabezpečiť dostatočnú cirkuláciu vzduchu) a prašnosť spojenú so suchým typom kŕmenia predpokladáme – že u odstavčiat dochádzalo k dráždeniu slizníc respiračného traktu, k poklesu lokálnej slizničnej imunity a tým aj k patogénnemu vplyvu nami zachytených baktérií (Proteus mirabilis, virid. Streptokoky, Enterobacter agglomerans, E. coli). Záver Podávanie paracetamolu priaznivo ovplyvnilo koncentrácie Le v krvnom sére postihnutých odstavčiat. Priemerný denný prírastok liečených ošípaných dosahoval vyššiu úroveň ako u kontrolnej skupiny. Použitie paracetamolu môže byť vhodným doplnkom pri terapii respiračných ochorení ošípaných. 235 Literatúra 1. 2. 3. 4. Bartko P., Hofírek B. 1993. Krv a krvotvorné orgány. In: Veterinárna klinická diagnostika vnútorných chorôb (Slanina Ľ, Dvořák R. a kol.). 300. Christensen G, Sorensen V., Mousing J. 2003. Choroby dýchacieho systému. In: Choroby ošípaných (Straw E. B., D´Allaire, Mengeling W. L., Taylor D. J.), 659. Kováč G, Martinček M, Mudroň P, Cilk D, Demonovič T, Paštek J, Stanislavský V, Ružička S, 1990. Odber krvi u ošípaných – Porovnanie doteraz zaužívaných metód a popis novšej metódy.., Veterinářství, 40. Vrzgula L., Sokol J. 1990. Interpretácia hematologického profilu. In: Poruchy látkového metabolizmu hospodárskych zvierat a ich prevencia (Vrzgula a kol.), II., prepracované vydanie, 472. Kontaktná adresa: MVDr. Jaroslav Novotný, PhD., II. Interná klinika, UVL Košice, Komenského 73 PÔSOBENIE HYPERTERMIE NA PREIMPLANTAČNÉ EMBRYÁ KRÁLIKOV IN VITRO A ÚLOHA PROTEÍNOV HSP70 HYPERTHERMIA EFFECTS OM PREIMPLANTATION RABBIT EMBRYOS IN VITRO AND THE ROLE OF PROTEINS HSP70 Olexikova L. 1, Makarevič A.V.2, Chrenek P.2, Kubovičova E.2, Pivko J.1,2 1 Slovenská poľnohospodárska univerzita, Nitra, Slovensko; 2Slovenské centrum poľnohospodárskeho výskumu, Nitra Abstract The aim of our study was to test the influence of short exposure (6 h) of preimplantation rabbit embryos to elevated temperatures (41.5 ºC and 42.5 ºC) in vitro on their developmental capacity and evaluate a role of Hsp70 in response of rabbit preimplantation embryos to hyperthermia. Fertilized rabbit eggs isolated from oviducts of slaughtered females 19 hpc were cultured in k-DMEM medium + 10% FCS at standard temperature (37.5 ºC) until 72 hpc. Afterwards, the embryos which reached morula stage were divided into two groups hyperthermic (HT, 41.5 ºC or 42.5 ºC) and control (C, 37.5 ºC). In a half of embryos from both groups an Hsp70 was blocked by the adding anti-Hsp70 to the medium. The embryos were cultured during 6 h. Then the embryos from HT group were transferred to 37.5 ºC and post-incubated overnight (16-20h) along with control group. Following incubation the embryos were evaluated for developmental stages and processed for apoptosis (TUNEL), actin cytoskeleton and presence of heat-shock-specific proteins Hsp70. Embryo samples were analyzed using Leica fluorescent microscope. It was observed that hyperethermic conditions at 41.5 ºC did not alter advancement of embryos to higher preimplantation stages (expanded and hatching/hatched blastocysts. There were no damages in actin filament structure compared to control embryos. Western-blotting revealed the presence of heat-stress-induced 72 kDa fraction of Hsp70 proteins in lyzates of embryos exposed to 41.5 ºC. Following elevation of temperature to 42.5 ºC the embryo development was dramatically compromised. The embryos were arrested at early blastocyst stage and did not advance in development. The 236 structure of actin filaments in blastomeres was damaged and such blastomeres often contained apoptotic nuclei. In this group Western-blotting did not reveal a presence of heat-stressinduced fraction of Hsp70. Blocking of Hsp70 before developmental block resulted in no embryos (0%) at blastocyst stage. From Hsp70-blocked embryos after developmental block, 27.6% (C+anti-Hsp) and 22.6% (HT+anti-Hsp) of blastocyst were formed, versus 71.4% (C) and 69.7% (HT) in non-Hsp70-blocked embryos. These results demonstrate a threshold of thermotolerance of preimplantation rabbit embryos to short hyperthermic exposure in vitro. The embryos before genome activation (GA) are more sensitive to HT. The resistance of embryos before GA to HT is related to Hsp70, whilst after GA, Hsp70 is not probably a major factor of thermotolerance and the existence of additional protective mechanism is hypothesized. Úvod Poškodenia vznikajúce vystavovaním teplotnému stresu počas preimplantačného vývoja môžu negatívne ovplyvňovať vývojový program znížením proteosyntézy a prežívateľnosti embryí (Putney a kol., 1988, Ealy a kol., 1993). K takým poškodeniam môžu patriť aj poruchy cytoskeletu buniek. Následky teplotného stresu závisia od teploty, dĺžky expozície a vývojového štádia embrya. Napríklad, poruchy vývoja embryí ošípaných nastali po krátkodobej (10-60 min) inkubácii pri 43 až 45,5 ºC, zatiaľ čo pri 42 ºC mali embryá dokonca väčší počet buniek a priemer, než pri kontrolnej teplote (Kojima a kol., 1996). U hovädzieho dobytka bola vývojová kapacita embryí znížená až pri 43 ºC (Ju a kol., 1999). U viacerých druhov sa škodlivé vplyvy teplotného šoku znižujú v procese vývoja embryí. Sakatani a kol. (2004) uvádzajú, že vývoj do štádia blastocysty a proliferácia sa znižovali, ak boli teplotnému stresu vystavené embryá v raných štádiách. Podľa Ju a kol. (1999) zvyšovanie termotolerancie je spojené s prechodom z materskej na vlastnú genomovú expresiu génov. To znamená, že embryo počas vývoja nadobúda jednu, alebo viac obranných (termoprotekčných) reakcií adaptácie. Tento adaptačný jav bol pozorovaný in vivo u oviec (Dutt, 1963), ošípaných (Tompkins a kol., 1967), hovädzieho dobytka (Putney a kol., 1988) a králikov (Wolfenson a Blum, 1988), a in vitro u hovädzieho dobytka (Edwards a Hansen, 1997, Ealy a kol., 1995). Na ovciach a hovädzom dobytku bolo dokázané, že teplota vyššia ako 37 °C spôsobuje produkciu bielkoviny známej ako heat-shock proteín 70 (Hsp70) bunkami embrya. Mirkes a kol. (1999) popísal, že Hsp70 indukuje termotoleranciu u post-implantačných embryí myší a jej úroveň závisí od úrovne expresie samotnej Hsp70. Hsp sú produkované medzi prvými proteínmi počas embryonálneho vývoja. Konštitutívne produkované Hsp bielkoviny pritom 237 zohrávajú dôležité úlohy v tvorbe a transporte proteínov aj za nestresových podmienok (Hendrick a Hartl,1995). Pri strese umožňujú tieto proteíny bunkám prežívať a eliminovať škodlivé vonkajšie vplyvy tým, že zabraňujú denaturácii bunkových proteínov. Hsp proteíny sú pravdepodobne jedným z faktorov rezistencie voči teplotnému, ako aj iným formám stresu. Blokovanie tvorby Hsp 70 proteínov pridaním protilátky do kultivačného média na 3. až 9. deň kultivácie zvyšovalo výskyt apoptóz a preukazne redukovalo percento blastocyst (Matwee a kol., 2001). Napriek stále pribúdajúcim údajom o vplyve teplotného stresu na embryá je mechanizmus vzniku termotolerancie u embryí stále nejasný. Rovnako odpoveď embryí na zvýšené teploty je druhovo špecifická a kritická teplota pre každý druh embryí je odlišná. Cieľom tejto práce bolo otestovať vplyv krátkej dĺžky expozície (6 h) pri zvýšených teplotách (41,5 ºC a 42,5 ºC) v podmienkach in vitro na vývojovú kapacitu embryí králikov a skúmať úlohu Hsp 70 vo vzniku adaptačnej reakcie na hypertermiu. Materiál a metódy Tri dni pred párením, samice králikov plemena Novozélandské biele boli superovulované i.m. injekciou PMSG (Werfaser, 80 IU). Následne po 72 h od PMSG, im bol aplikovaný HCG (Werfachor, 150 IU) a boli pripustené samcom. Zygoty v štádiu 2 prvojadier boli vyplavené z vajcovodov samíc 19 hodín post-coitum (hpc) a boli kultivované pri štandardnej teplote 37.5 ºC po dobu 72 hpc. Po tejto dobe embryá, ktoré dosiahli štádium moruly boli prenesením do čerstvého média rozdelené do dvoch skupín: 1. štandardné prostredie (37,5 ºC) – kontrola (K) a 2. hypertermické prostredie (41,5 ºC resp. 42,5 °C , HT). V niekoľkých pokusoch sme u polovice embryí z obidvoch skupín zablokovali tvorbu Hsp70 bielkoviny pridaním protilátky anti-Hsp70 (4µg/ml) do kultivačného média a to buď pred alebo po aktivácii embryonálneho genómu. Embryá boli inkubované v hypertermických podmienkach po dobu 6 hodín. Potom boli embryá prenesené do normálnej teploty a inkubované cez noc (16-20h). Po inkubácii bolo u embryí analyzované: vývojové štádium (percento blastocýst), apoptóza (TUNEL-metóda) a proliferácia (celkový počet jadier), štruktúra cytoskeletových filamentov aktínu (Phalloidin-TRITC), prítomnosť Hsp70 proteínov (imunocytochémia, Western-blotting). Analýzu prítomnosti apoptotických buniek sme robili metódou TUNEL použitím Mebstain Apoptosis Direct kit od firmy Coulter-Immunotech (Marseille, Francúzsko). Detekcia heat-shock proteínov (Hsp70) bola vykonaná buď imunocytochemicky na 238 intaktných embryách, alebo pomocou Western-blottingu embryonálnych lyzátov použitím protilátky MAB 3516 (Chemicon) reagujúcej ako na konštitučnú (72 kDa) tak aj na indukovanú (73 kDa) frakciu Hsp70. Pre analýzu celkového počtu buniek sme použili jadrový fluorochrom DAPI (Vector Laboratories). Stav cytoskeletu sme analyzovali na základe prítomnosti a štruktúry filamentov aktínu farbením Phalloidinom-TRITC (Chemicon). Embryá boli súčasne spracované pre TUNEL, celkový počet buniek a aktínový cytoskelet. Detekcia heat-shock proteínov (Hsp70) bola uskutočnená v rozdielnych pokusoch. Preparáty embryí sme analyzovali pomocou fluorescenčného mikroskopu LEICA použitím špecifických filtrov pre zelenú (TUNEL, Hsp70), červenú (aktín) a modrú (DAPI) fluorescenciu. Výsledky Hypertermické podmienky pri teplote 41,5 ºC neovplyvnili vývoj embryí do vyšších štádií (expandovaná blastocysta a blastocysta uvolňujúca sa zo zona pelucida). Percento embryí dosahujúcich vyšších štádií (57,7 %) v hypertermickej skupine sa preukazne neodlišovalo od kontrolnej skupiny (53,3 %). Naopak pri zvýšení teploty na 42,5 ºC sme zaznamenali úplné zastavenie vývoja na nižších vývojových štádiách. Ani jedno embryo sa nevyvýjalo do štádií expandovanej blastocysty a blastocysty uvolňujúcej sa zo zona pelucida. Vývoj embryí po vystavení teplote 42,5 ºC bol prevažne zastavený v štádiu včasnej blastocysty. Tab. 1. Vplyv hypertermie in vitro na vývoj preimplantačných embryí králika –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Skupina Počet embryí Vývojové štádiá, n (%) Pozastavené Moruly Bl XBl HBl XBl+HBl –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Control (37,5 ºC) 221 15 (6,8) 26 (11,8) 62 (28,1) 51 (23,1) 67 (30,2) 118 (53,3) HT (41,5 ºC) 196 14 (7,1) 27 (13,8) 42 (21,4) 42 (21,4) 71 (36,3) 113 (57,7) –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– HT (42,5 ºC) 52 0 (0) 4 (7,7) 48 (92,3) 0 (0) 0 (0) 0 (0) –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bl - blastocysta, XBl – expandovaná blastocysta, HBl – hatching, blastocysta uvolňujúca sa zo zona pelucida. Analýzou embryonálnych lyzátov metódou Western-blottingu sme potvrdili prítomnosť inducibilnej frakcie proteínov HSP 70 v preimplantačných embryách vystavených 239 teplote 41,5 ºC ako aj konštitutívnej frakcie HSP 70 v embryách kultivovaných za normálnych podmienok (kontrola). Nepodarilo sa dokázať prítomnosť inducibilnej frakcie HSP 70 u embryí vystavených teplotnému stresu pri 42,5 ºC. V štruktúre aktinových filamentov pri 41,5 ºC neboli pozorované rozsiahle poruchy. Ireverzibilné zmeny vývoja boli v skupine vystavenej teplote 42,5 ºC sprevádzané poruchami štruktúry cytoskeletu (rozpad aktínu, porušenie normálnej štruktúry, tvorba zhlukov) buniek. Blastoméry s poruchami aktínových filamentov obsahovali apoptotické jadrá. Za prítomnosti protilátky anti-Hsp70 počas kultivácie embryí v štádiu pred aktiváciou genómu neboli dosiahnuté vyššie vývojové štádiá, väčšina embryí bola pozastavená vo vývoji v štádiu moruly (Tab.2.). Pri blokovaní Hsp70 u embryí po aktivácii genómu, sa z nich vyvinulo 27,6% (K+anti-Hsp) a 22,6% (HT+anti-Hsp) expandovaných a uvolňujúcich sa blastocýst, oproti 71,4% (K) a 69,7% (HT) u neblokovaných embryí (Tab.3.). Tab.2. Preimplantačný vývoj embryí s blokovaním proteínu Hsp70 pred aktiváciou embryonálneho genómu, n (%) _____________________________________________________________________________ Skupiny Počet embryí Pozastavené Mo Bl XBl HBl -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------K 23 0 K+anti-Hsp 25 7 (28) HT 22 0 HT+anti-Hsp 26 15 (57,7) 2 (8,7) 17 (68) 3 (13,6) 11 (42,3) 3 (13) 4 (17,4) 1 (4) 0 (0) 2 (9,1) 2 (9,1) 0 (0) 0 (0) 14 (60,9) 0 (0) 15 (68,2) 0 (0) _______________________________________________________________________________ Tab. 3. Preimplantačný vývoj embryí s blokovaním proteínu Hsp70 po aktivácii embryonálneho genómu, n (%) ______________________________________________________________________________ Skupiny Počet embryí Pozastavené Mo Bl XBl HBl -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------K 28 0 (0) 4 (14,3) 4 (14,3) 2 (7,1) 18 (64,3) K+anti-Hsp 29 0 (0) 12 (41,4) 9 (31,0) 2 (6,9) 6 (20,7) HT 33 0 (0) 5 (15,2) 5 (15,2) 6 (18,2) 17 (51,5) HT+anti-Hsp 31 0 (0) 18 (58,1) 6 (19,4) 5 (16,1) 2 (6,5) _______________________________________________________________________________ 240 Diskusia V našich experimentoch sme testovali vplyv dvoch zvýšených teplôt v priebehu 6 h inkubácie na vývojové charakteristiky králičích embryí. Z výsledkov pokusov vyplýva, že embryá vystavené hypertermickým podmienkam v štádiu moruly až včasnej blastocysty sú odolné voči teplote 41.5ºC, ale pri 42,5 ºC nastali značné zmeny v životaschopnosti embryí. Termotolerancia embryí je všeobecne ovplyvnená niekoľkými faktormi, ako sú dĺžka trvania teplotného šoku, intenzita teploty, vývojové štádium embrya a jeho živočíšny druh. U hovädzieho dobytka bolo zistené (Ryan a kol. 1992), že krátke impulzy vyššej teploty (43 ºC) dokonca stimulovali vývoj embryí do „hatchingu“ v porovnaní so skupinou bez teplotného šoku (38 ºC). Pravdepodobne krátkodobé expozície (10 – 30 min) teplu nad 40 ºC sú menej škodlivé, ako chronický šok pri nižších teplotách. V našich kultivačných podmienkach teplota 41,5 ºC neovplyvňovala kvalitu embryí, zatiaľ čo u bovinných embryí v štádiu ≤ 16 blastomér Jousan a Hansen (2004) pozorovali rast počtu apoptotických buniek a redukciu počtu buniek už pri 41 ºC. Je známe, že včasné preimplantačné embryá sú veľmi citlivé na následky teplotného šoku (Sakatani a kol., 2004), a rezistenciu voči nemu nadobúdajú v procese vývoja. Napríklad hypertermia pri 41 ºC počas 12 h expozície 2bunkových a 4-8-bunkových embryí znižovala počet následných blastocýst, zatiaľ čo teplotný šok v štádiu morula sa nepotvrdil (Edwards a Hansen, 1997). K podobným záverom prišli aj Ealy a kol. (1995) na embryách hovädzieho dobytka. Tieto fakty vysvetľujú termotoleranciu embryí v našich podmienkach voči hypertermii pri 41,5 ºC. Predpokladá sa že odolnosť embryí voči teplotnému šoku vzniká v dôsledku de novo produkcie proteínu Hsp70, avšak mechanizmus termotolerancie je stále nejasný. V súlade s Matwee a kol. (2001) nastali pri kultivácii s blokovaním proteínov Hsp70 výrazné zmeny. Vývoj bol narušený, avšak preukazne výraznejšie bolo blokovanie vývoja u embryí pred aktiváciou embryonálneho genómu, oproti rovnakému pôsobeniu až po jeho aktivácii. Toto zistenie podporuje teóriu postupného zvyšovania termorezistencie embryí a existenciu súvislosti medzi aktiváciou embryonálneho genómu a zlepšením schopnosti reagovať na stresový podnet. Záver Expozícia embryí (6h) pri teplote 41,5 ºC neovplyvňovala embryonálny vývoj a bola spojená s tvorbou Hsp-proteínov. Pri teplote 42,5 ºC dochádzalo k ireverzibilným poškodeniam embryí, čo malo za následok pozastavenie preimplantačného vývoja embryí ako aj poruchy v štruktúre aktínového cytoskeletu. Tieto výsledky demonštrujú prah 241 termotolerancie preimplantačných embryí králikov k hypertermickým podmienkam in vitro. Negatívny efekt hypertermie pri 42,5 ºC môže súvisieť s narušením proteosyntézy. Embryá králikov pred aktiváciou embryonálneho genomu (GA) sú citlivejšie na zvýšené teploty, a blokovanie tvorby Hsp70 vyvoláva u nich poruchy vo vývoji. Termorezistencia embryí u ktorých došlo k aktivácii embryonálneho genómu nebola úplne narušená blokovaním Hsp70. Tieto výsledky naznačujú že odolnosť embryí pred aktiváciou genómu voči hypertermii je úzko spojená s proteínom Hsp70, zatiaľ čo po aktivácii genómu táto bielkovina pravdepodobne už nie je jediným faktorom termotolerancie a predpokladá sa aj existencia iného (alebo iných) protekčných mechanizmov. Literatúra Dutt R. H., 1963. J Anim Sci 1963; 22: 713 -719. Ealy A. D. a kol., 1993. J Dairy Sci 1993; 76: 2899 – 2905. Ealy A. D. a kol., 1995. J Anim Sci 1995; 73: 1401 -1407. Edwards J. L. - Hansen P.J. 1997. Mol Reprod Dev 1997; 46: 138 -145. Hendrick J.P. – Hartl F.U. 1995. FASEB J 1995; 9: 1559- 1569 Jousan F. D. - Hansen P.J. 2004. Biol Reprod 2004; 71: 1665 – 1670. Ju J-C. a kol., 1999. Mol Reprod Dev 1999; 53: 336 – 340. Kojima T. a kol., 1996. Mol Reprod Dev 1996; 43: 452 – 457. Matwee C. a kol., 2001. Mol Hum Reprod. 2001; 9: 829-837. McMillan D. R. a kol., 1998. J Biol Chem 1998; 273: 7523 – 7528. Mirkes P. E. a kol., 1999. Dev Dyn 1999; 214: 159 – 170. Mosser D. D. a kol., 1997. Mol Cell Biol 1997; 17: 5317 – 5327. Paula-Lopes F. F. - Hansen P. J., 2002. Biol Reprod 2002; 66: 1169 – 1177. Putney D. J. a kol., 1988. J Reprod Biol 1988; 39: 717 – 728. Ryan D. P. a kol., 1992. J Anim Sci 1992; 70: 3490 – 3497. Sakatani M. a kol., 2004. Mol Reprod Dev 2004; 67: 77 – 82. Tompkins E. C. a kol., 1967. J Anim Sci 1967; 26: 377 – 380. Wolfenson D. - Blum O., 1988. Anim Reprod Sci 1988; 17: 259 – 270. Táto práca bola financovaná z projektu Ministerstva pôdohospodárstva SR RÚVV 06:“Ochrana zdravotného stavu zvierat v jednotlivých fázach reprodukčného cyklu pri narušení stability prírodných systémov“. 242 CHEMOPREVENTÍVNY ÚČINOK DIKLOFENAKU U MAMÁRNEJ KARCINOGENÉZY SAMÍC POTKANOV KMEŇA SPRAGUE-DAWLEY. CHEMOPROTECTIVE EFFECT OF DICLEFENAC IN MAMMARY CARCINOGENESIS IN FEMALE SPRAGUE-DAWLEY RATS Orendáš, P., Kassayová, M., Ahlers, I., Ahlersová, E., Friedmanová, L., Starostová, M., Bojková, B. Katedra fyziológie živočíchov, Ústav biologických a ekologických vied, Prírodovedecká fakulta, Univerzita P. J. Šafárika, Košice, Abstrakt The chemopreventive effect of non-steroidal anti-inflammatory drugs in mammary carcinogenesis was frequently reported. In this work we evaluated the tumosupressive effect of non-selective cyclooxygenase (COX) inhibitor diclofenac in N-methyl-N-nitrosoureainduced (NMU) mammary carcinogenesis in female Sprague-Dawley rats. Diclofenac was administered in drinking water in the concentration of 0,01 mg/ml (0,001%). In the last (22nd) week of experiment we recordet incidence decrease by 11,54%. Tumor frequency per group decreased by 39,45% a tumor frequency per animal decreased by 31,58% when compared to control group. Latency period (time span from first carcinogen administration till the first palpable tumor development) was lengthened by 16%. Diclofenac as a preventive substabstance (non-selective COX inhibitor with predominantly COX-1 inhibition) altered basic NMU-induced mammary carcinogenesis parameters in female rats. Keywords: Mammary carcinogenesis; Rat; Chemoprevention; Diclofenac; Cyclooxygenase Úvod Rakovina mliečnej žľazy u žien predstavuje závažný celosvetový problém. Chemoprevencia je prísľubom úspešného boja proti rakovinotvornému procesu. Nesteroidné antiflogistiká (NSAIDS) sú dôležité farmaká potláčajúce zápal. Sú často aplikované pri reumatických ochoreniach, pri zmierňovaní bolesti a funkčných obtiaží. V nedávnej dobe boli zaznamenané ich preventívne účinky pri karcinogenéze. Klinické štúdie zistili pri dlhodobom podávaní rôznych NSAIDs výrazný pokles rizika rakoviny hrubého čreva (Thun, 1991), mliečnej žľazy (Harris, 1999), prostaty (Nelson, 2000) a pľúc (Harris, 2002). Experimentálne štúdie na laboratórnych zvieratách dokázali chemopreventívny efekt NSAIDs u rôznych typov neoplázií, vrátane rakoviny mliečnej žľazy. Naša skupina preukázala chemopreventívny efekt indometacínu podávanáho v pitnej vode (Môciková-Kalická, 2001), nimesulidu podávaného subkutánne (Kubatka, 2002) a rofekoxibu 243 aplikovaného v laboratórnej potrave (Kubatka, 2003) pri mamárnej karcinogenéze u samíc potkana kmeňa Sprague-Dawley. Hlavný účinok NSAIDs spočíva v potláčaní syntézy prostanoidov inhibíciou aktivity kľúčového enzýmu ich syntézy, cyklooxygenázy (COX). Sú známe dve izoformy COX: konštitutívna COX-1 a inducibilná COX-2 izoforma nachádzajúca sa viac pri chorobných stavoch. COX-2 môže ovplyvňovať proces karcinogenézy prostredníctvom viacerých mechanizmov: peroxidázová aktivita COX-2 podporuje transformáciu prokarcinogénov na karcinogény (Fosslien, 2000), bol zistený inhibičný efekt formovaných prostaglandínov v imunitných reakciách (Rita, 1994), tiež angiogénny (Tsujii, 1998), a antiapoptotický účinok (Fosslien, 2000). Na druhej strane bol pozorovaný súvis zvýšenej invázie nádorových buniek so zvýšenou expresiou COX-2. Brueggemeier at.al (1999) poukazuje na lineárnu závislosť medzi expresiou génu aromatázy (CYP 19) a expresiou COX-2. Predchádzajúce fakty predpokladajú využitie NSAIDs v prevencii mamárnej karcinogenézy. Z farmakodynamického hľadiska majú inhibítory COX-1 (kys. acetylsalicylová, indometacin, ibuprofen) pri dlhodobom užívaní vedľajšie účinky na tráviaci systém. Riziko týchto nepriaznivých účinkov je nižšie pri užívaní inhibítorov COX-2, čo umožňuje ich dlhodobejšiu aplikáciu. Diklofenak patrí do skupiny NSAIDs, ktorá neselektívne inhibuje aktivitu COX (prevažná inhibícia COX-1, čiastočná inhibícia COX-2). Cieľom tejto práce bolo skúmať chemopreventívny účinok diklofenaku u mamárnej karcinogenézy samíc potkana Sprague-Dawley. Materiál a metódy V experimente boli použité samice potkana kmeňa Sprague-Dawley, získané z chovnej stanice Charles River Laboratories (Sulzfeld, Nemecko) vo veku 30-35 dní, s hmotnosťou 101-125g. Zvieratá boli adaptované na štandardné podmienky zverinca s teplotou 23±2 °C, relativnou vlhkosťou 60-70%, držané pri umelom svetelnom režime svetlo : tma = 12:12 h so začiatkom svetla od 7.00 hod. (intenzita svetla 150 luxov/klietku, zdroj svetla: fluorescenčné lampy Tesla - 40W). Počas experimentu boli zvieratá krmené peletovanou diétou (Top Dovo, Dobrá Voda) a napájané pitnou vodou ad libitum. Diklofenak /Diclofenac sodium/, (výrobca: Ningbo Smart Chemical & Pharmaceutical Co., LTD, Ningbo, Zhejiang, China, poskytol: Zentiva a.s., Hlohovec, Slovensko) bol aplikovaný v pitnej vode v koncentrácii 0,01mg/1ml pitnej vody po dobu trvania celého experimentu. Mamárna karcinogenéza bola indukovaná pomocou N-metyl-N-nitrózourey (NMU) (Sigma, Deisenhofen, Germany), ktorá bola podaná 244 vo forme dvoch intraperitoneálnych dávok (50 mg/kg) v 6 dňovom intervale medzi 42.-48. postnatálnym dňom všetkým zvieratám. NMU bola pripravená tesne pred použitím, rozpustená vo fyziologickom roztoku (objem roztoku 0,5 ml/zviera). Chemoprevencia diklofenakom začala 7 dní pred podaním karcinogénu a trvala až do konca experimentu (20 týždňov po podaní NMU). Zvieratá boli rozdelené do 2 experimentálnych skupín : 1. kontrolná skupina bez chemoprevencie (20 zvierat); 2. chemoprevencia s diklofenakom o koncentrácii 0,01mg/1ml pitnej vody (24 zvierat). Zvieratá boli každý týždeň vážené a palpované. Palpáciou sme zistili a zaznamenali výskyt, počet, lokalizáciu a veľkosť tumorov. V 22. týždni experimentu (počítané od podania 1. dávky NMU) boli zvieratá usmrtené rýchlou dekapitáciou. Mamárne nádory boli vypitvané, zvážené a ich rozmery zaznamenané. V jednotlivých experimentálnych skupinách boli hodnotené základné parametre mamárnej karcinogenézy: 1. incidencia nádorov ako percentuálne zastúpenie zvierat s nádorom, 2. frekvencia nádorov na skupinu vyjadrená ako priemerný počet nádorov na všetky zvieratá v skupine, 3. frekvencia nádorov na zviera vyjadrená ako priemerný počet nádorov na nádorové zvieratá, 4. priemerný objem nádorov, 5. latenčná perióda určená obdobím od podania karcinogénu až do objavenia sa prvého nádoru u zvieraťa. Bol sledovaný vplyv chemopreventíva na prírastok telesnej hmotnosti (hodnotený od začiatku až do konca experimentu), na príjem potravy a vody. Spotrebu potravy a vody za 24 hodín sme zisťovali v 6., 11. a 20. týždni po podaní karcinogénu v 6 meraniach (2x v danom týždni). Incidencia nádorov bola vyhodnotená Mann-Whitney U–testom, ďalšie parametre pomocou jednocestnej analýzy variancie alebo Kruskal-Wallis–ovým testom na hladine významnosti P<0.05. Objemy nádorov boli vypočítané podľa vzorca: V (mm3) = π x S12 x S2 / 12, pričom (S1<S2), S1 je šírka a S2 dĺžka nádoru v mm, S1 a S2 boli merané kolmo na seba. Experiment prebiehal od augusta 2006 do januára 2007. Výsledky Preventívny účinok diklofenaku u mamárnej karcinogenézy samíc potkanov kmeňa Sprague-Dawley je znázornený v Tab.1. Diklofenak v experimentálnej skupine DIKLO 10 zmenil sledované hodnoty základných parametrov mamárnej karcinogenézy (incidencia, frekvencia, objem nádorov, latencia), ale zaznamenali sme pokles frekvencie nádorov na skupinu o 39,45%, frekvencie nádorov na zviera o 31,58%. Latencia vzrástla o 14 dní (16%). Bol zistený signifikantý pokles hmotnosti potkanov s DIKLO 10 oproti KONT o 5.58% čo 245 môže súvisieť s vedľajšími účinkami diklofenaku na gastrointestinálny trakt. Bol signifikantne nižší príjem vody v 6. týždni pokusu v skupine príjímajúcej diklofenak. Experimentálne skupiny • KONT – kontrolná skupina zvierat s podaným karcinogénom bez chemoprevencie • DIKLO 10 (0,001%) - skupina zvierat s podaným karcinogénom + chemoprevencia diklofenakom obsiahnutom v pitnej vode s koncentráciou 0.01mg/1ml (0.001%) Tabuľka č. 1: Chemopreventívne účinky diklofenaku u NMU-indukovanej mamárnej karcinogenézy u samíc potkanov kmeňa Sprague-Dawley v záverečnom 22. týždni experimentu. Skupina KONT n=20 DIKLO 10 (0,001%), n=24 Počet nádorových zvierat 16 17 Incidencia nádorov (%) 80,00±0,09 70,83 ±0,09 (-11,54%) Frekvencia nádorov na skupinu 3,65±0,67 2,21±0,41(-39,45%) Frekvencia nádorov na zviera 4,56±0,66 3,12±0,40 (-31,58%) Prírastok objemu nádorov (mm3) 1649,53±215,57 2614,54±992,09 (+58.5%) Latencia nádorov (dni) 90,60±4,80 105,06±7,37 (+14,46%) Prírastky telesnej hmotnosti (g) 265,00±5,94 * 250,21±4,08 Hodnoty sú uvedené ako aritmetické priemery±SEM. Hodnoty v zátvorkách vyjadrujú %-uálnu odchýlku voči KONT (predstavuje 100%). Štatistická signifikancia rozdielov medzi kontrolnou skupinou a skupinou s chemoprevenciou je vyjadrená ako * pre P<0,05. Tabuľka č. 2: Účinky diklofenaku na príjem potravy Týždne po podaní NMU KONT DIKLO 10 (0,001%) 6 20,00±0,45 24,13±1,37 11 18,05±0,59 18,39±0,30 16 19,08±0,49 20,72±1,11 21 18,28±1,90 21,83±2,11 Hodnoty príjmu potravy (g) sú uvedené ako priemery ±SEM. 246 Tabuľka č. 3: Účinky diklofenaku na príjem vody KONT DIKLO 10 (0,001%) 6 34,58±0,45 a 11 27,50±1,05 25,56±0,47 16 26,50±1,45 25,26±1,13 21 26,25±3,33 21,81±1,80 Týždne po podaní NMU 25,62±2,18 *(25,91%) Hodnoty príjmu vody (ml) sú uvedené ako priemery ±SEM. * Hodnota v zátvorke predstavuje %-álnu odchýlku DIKLO10 vs KONT (predstavuje 100%). Signifikantný rozdiel, a P<0.05 vs KONT Celkový prehľad parametrov mamárnej karcinogenézy počas pokusu. LATENCIA INCIDENCIA 90% 130 80% 70% NMU 120 DIKLO 110 60% NMU DIKLO 100 Deň 50% 40% 90 80 30% 70 20% 60 10% 50 0% 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 9. 22. 10. 11. 12. 13. 4 NMU DIKLO 3 cm 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. OBJEM NÁDOROV FREKVENCIA NA SKUPINU 4,5 3,5 14. Týždeň po 1. podaní NMU Týždeň po 1. podaní NMU 18. Týždeň po 1. podaní NMU 19. 20. 21. 22. 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 NMU DIKLO 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. Týždeň po 1. podaní NMU 247 Diskusia V tejto práci sú prvý krát prezentované údaje o účinkoch nesteroidného antiflogistika diklofenaku v chemoprevencii experimentálnej mamárnej karcinogenéze. Ako nesteroidné antiflogistiká (NSAIDs) sa označuje veľká skupina chemicky odlišných látok blokujúcich kaskádu kyseliny arachidonovej. Sú vo veľkej miere používané pri zmierňovaní chronickej bolesti u reumatických ochorení (reumatoidná artritída, spondylartritídy), osteoartrózy. Hlavná podstata ich účinku spočíva v inhibícii aktivity cyklooxygenázy (COX) vedúcej k poklesu produkcie prostaglandínov (PG), ktorých zvýšená tvorba a hladiny najmä prostaglandínu E2 (PGE2), bola zistená u rôznych druhov tumorov. Biosyntéza prostaglandínov hrá zásadnú úlohu v karcinogenéze u viacerých typov neoplázií vrátane karcinómu mliečnej žľazy a blokáda tohto procesu prostredníctvom NSAIDs má výrazný chemopreventívny efekt. Mechanizmus protinádorového účinku NSAIDs je založený na antiproliferačných a antioxidačných vlastnostiach látok. Dôležitá je inhibícia formovania a aktivácie karcinogénu (Kelloff et al., 1999), vlastnosti antiangiogénne, proapoptotické a antimetastatické (Anderson, 2002; Moore, 2000). Bežné alebo neselektívne NSAIDs sú inhibítory oboch izoforiem cyklooxygenázy v rôznom pomere. Do tejto skupiny patrí aj ibuprofen . Robertson et al. (1998) pozorovali zníženie objemu DMBA- indukovaných mamárnych karcinómov u samíc potkanov kmeňa SD podávaním ibuprofenu v diéte počas obdobia 35 dní, pričom ibuprofen sa začal podávať až od 100 dňa po aplikácii karcinogénu. Regresia vzniknutých tumorov bola spojená s inhibíciou expresie oboch izoforiem COX enzýmu. Pokusy vykonané našou skupinou u DMBA- indukovanej mamárnej karcinogenézy u samíc potkanov kmeňa SD, ukázali pri aplikácii indometacínu v pitnej vode zníženie incidencie mamárnych nádorov o 63%, zníženie frekvencie nádorov na skupinu o 88% a predĺženie latencie o 59 dní oproti kontrole (Môciková-Kalická et. al., 2001). V tejto prezentovanej práci nami sledovaný chemopreventívny efekt diklofenaku (neselektívny inhibítor COX s prevažnou inhbíciou COX-1) u NMU-indukovanej mamárnej karcinogenézy samíc potkanov kmeňa SD podávaný v pitnej vode sa prejavil v poslednom 22. týždni experimentu miernym poklesom frekvencie nádorov na skupinu o 39,45%, frekvencia nádorov na zviera klesla o 31,58%. Latenčná doba sa predĺžila o 14 dní (16%). V priebehu experimentu sme zaznamenali signifikantný pokles incidencie nádorov v 17., 18., 19. a 20. týždni pokusu. Signifikantný pokles frekvencie na skupinu sme zistili iba v 21. týždni experimetu. V 19., 20. a 21. týždni sme pozorovali aj signifikantné zníženie objemu nádorov. 248 V pilotnom experimente s diklofenakom trvajúcom 19 týždňov, v ktorom naša skupina analyzovala chemopreventívny účinok tejto látky aplikovanej po dobu 2 týždňov intramuskulárne (dávka 0,005 mg/1 g b.w.) u NMU-indukovanej mamárnej karcinogenézy samíc potkanov SD, sme zaznamenali zníženie frekvencie nádorov na skupinu i na zviera, ostatné parametre mamárnej karcinogenézy neboli výrazne ovplyvnené (Orendáš et al., nepublikované údaje). Možným vysvetlením nižšieho chemopreventívneho účinku diklofenaku môže byť zistenie Hamida et. al. (1999), že u NMU-indukovaných mamárnych tumorov sú hladiny COX-2 proteínov v bunkách tumoru asi 3-násobne vyššie ako hladiny COX-1, čo mohlo mať vplyv na účinnosť diklofenaku ako preventíva s prevažnou inhibíciou COX-1. Ďalším faktorom majúcim vplyv na preventívny účinok diklofenaku je pravdepodobne aj zvolená dávka tejto látky. Naša skupina tiež zaznamenala tumor supresívny efekt nimesulidu (prevažný inhibítor COX-2) u NMU-indukovanej mamárnej karcinogenézy samíc potkanov kmeňa SD aplikovaného subkutánne 2x týždenne. U DMBA-indukovanej mamárnej karcinogenézy v tom istom experimente nebol zistený onkostatický efekt nimesulidu (Kubatka et al., 2002). Dokázali sme preventívny efekt rofekoxibu (selektívneho inhibítora COX-2) u NMUindukovanej mamárnej karcinogenézy samíc potkanov kmeňa SD aplikovanom v potrave bol potvrdený zreteľným znížením incidencie nádorov, frekvencie u oboch podávaných dávok ( 0,01 mg/1 g potravy, 0,05 mg/1 g potravy). Latenčná doba bola predĺžená o 8 dní (Kubatka et. al., 2003). V štúdii, v ktorej sa naša skupina zamerala na prevenciu NMU-indukovanej mamárnej karcinogenézy etorikoxibom (selektívny inhibítor COX-2) podávaným v potrave samiciam potkana kmeňa SD, bol zistený nesignifikantný tumorsupresívny účinok u vyššej dávky (0,025 mg/1 g potravy), ktorý sa prejavil miernym poklesom incidencie nádorov, poklesom frekvencie nádorov na skupinu a bolo zaznamenané predĺženie latencie o 7 dní (Orendáš et al., nepublikované údaje). Z našich výsledkov vyplýva, že chemopreventívny účinok diklofenaku výrazne znížil incidenciu nádorov medzi 15. a 20. týždňom, ich frekvenciu na skupinu v 16. až 22. týždni a objem nádorov v 19. až 21. týždni pokusu. Táto štúdia prináša prvú zmienku o prevencii mamárnej karcinogenézy u samíc potkanov diklofenakom. V ďalšom výskume bude potrebné analyzovať možný efekt ďalších druhov NSAIDs, hlavne so zreteľom na ich terapeutické využitie u človeka. 249 Litratúra Anderson, W.A., Umar, A., Viner, J.L., Hawk, E.T.: The role of cyclooxygenase inhibitors in cancer prevention, Curr. Pharm. Des. 8: 1035– 062, 2002 Brueggemeier, R.W., Quinn, A.L., Parrett, M.L., Joarder, F.S., Harris, R.E., Robertson, F.M.: Correlation of aromatase and cyclooxygenase gene expression in human breast cancor specimens, Cancer Lett. 140: 27–35, 1999 Fosslien, E.: Molecular pathology of cyclooxygenase-2 in neoplasia, Ann. Clin. Lab. Sci. 30: 3 21,2000 Hamid R., Singh J., Reddy B.S., Cohen L.A.: Inhibition by dietary menhaden oil of cyclooxygenase-1 and 2 in N- nitrosomethylurea – induced rat mammary tumors. Int. J. Oncol. 14, 523-528, 1999 Harris R.E., Kasbari S., Farrar W.B. : Prospective study of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and breast cancer. Oncol. Rep. 6, 71-73, 1999 Harris R.E., Beebe_Donk J.,. Schuller H.M: Chemoprevention of lung cancer by non-steroidal anti-inflammatory druha among cigarette smokers, Oncol. Rep. 9 693–695, 2002 Kelloff GJ., Sigman CC., Greenwald P.: Cancer chemoprevention: Progress and promise. Eur. J.Cancer 35:17551762, 1999 Kubatka, P., Kalická, K., Chamilová, M., Ahlersová, E., Ahlers, I., Bojková, B.,. Adámeková, E.: Nimesulide and melatonin in mammary carcinogenesis prevention in female Sprague–Dawley rats, Neoplasma 49: 255– 259, 2002 Kubatka, P., Ahlers, I., Ahlersová, E., Adámeková, E., Luk, P., Bojková, B., Marková, M.: Chemoprevention of mammary carcinogenesis in female rats by rofecoxib, Cancer Lett. 202: 131-136, 2003 B.C. Moore, D.L. Simmons, COX-2 inhibition, apoptosis, and chemoprevention by non-steroidal antiinflammatory drugs, Curr. Med. Chem. 7, 1131–1134, 2000. Môciková-Kalická, K., Bojková, B., Adámeková, E., Mníchová-Chamilová, M., Kubatka, P., Ahlersová, E., Ahlers, I.: Preventive effect of indomethacin and melatonin on 7,12- dimethylbenz(a)anthracene-induced mammary carcinogenesis in female Sprague–Dawley rats. A preliminary report, Folia Biol. (Praha) 47: 75–79, 2001 Nelson J.E., Harris R.E.: Inverse association of prostate cancor and non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs): results of a case-control study, Oncol. Rep. 7 169–170, 2000 Rita, M., Young, I.: Eicosanoids and the immunology of cancer, Cancer Met. Rev. 13: 337–348, 1994 Robertson F.M., Parrett M.L., Joarder F.S., Ross M., Abou-Issa H.M, Alshafie G., Harris R.E. : Ibuprofeninduced inhibition of cyclooxygenase isoform gene expression and regression of rat mammary carcinomas. Cancer Lett. 122, 165-175, 1998 Thun M.J., Namboodiri M.M., Heath C.W.J.: Aspirin use and reduced risk of fatal colon cancer. N. Engl. J. Med. 325, 1593-1596, 1991 Tsujii, M., Kawano, S., Tsuji, S., Sawaoka, H., Hori, M., DuBois, R.N.: Cyclooxygenase regulates angiogenesis induced by colon cancer cells, Cell 93: 705–716, 1998 Táto práca vznikla v súlade s plnením úloh VEGA 1/2355/05 Ďakujeme reprezentantom Zentiva a.s. (Hlohovec, SR) za poskytnutie substancie. LEUKOPÉNIA BROJLEROVÝCH KRÁLIKOV VPLYVOM HYPERTERMIE LEUCOPENIA OF THE BROILER RABBITS UNDER THE INFLUENCE HYPERTHERMY Parkányi, V.1, Ondruška, Ľ.1, Rafay, J.1, Chrastinová, Ľ.1, Pivko, J.1, Massányi, P.2, Lukáč, N.2, Capcarová, M.2 1 2 Slovenské centrum poľnohospodárskeho výskumu Nitra Slovenská poľnohospodárska univerzita Nitra Abstract Exposure of the young and adult rabbit´s males and females to hyperthermic conditions (36 ± 3° C) negatively affects on their physiological processes and interferes with them internal homeostasis. The changes are demonstrated on all observed biological levels : fodder intake 250 and conversion, growth intensity, haematological characteristics and viability. There is a significant leucopenia (7.380 x 109/ L) , together with a significant lymphopenia (3.700x 109/L) of young rabbits (p<0,05*), typical accompanying effect of the stress reaction to hyperthermy. The hyperthermic collapse is attended by increased of mortality (young rabbits: 25 – 44%, adult rabbits: 20 – 50%). Úvod Špecializované populácie hospodárskych zvierat šľachtené na komplex ukazovateľov mäsovej úžitkovosti majú malú mieru tolerancie voči výkyvom podmienok chovateľského prostredia, vrátane mikroklimatických faktorov. Králiky sú veľmi citlivé na tepelný stres, pretože majú minimálne množstvo potných žliaz a ťažko eliminujú extrémnu telesnú teplotu, ako dôsledok vysokej teploty prostredia, tzv. hypertermie. Tepelný stres je definovaný ako stav fyziologickej záťaže, v ktorej už zvieratá nie sú dlhšie schopné pasívne regulovať ich teplotnú homeostázu organizmu. Z tohto hľadiska sa králik javí ako vhodné experimentálne zviera pri sledovaní vplyvu klimatickej zmeny na komplex biologických ukazovateľov. Vhodné biokinetické rozpätie teplôt pre králika je 15 - 20° C, pričom termoneutrálna zóna sa uvádza 5 - 30° C (Harris, 1994 . Marai a kol. (2002) uskutočnili experimenty na dospelých králikoch a na mláďatách oboch pohlaví pri vysokých teplotách počas leta v Egypte. Zistili nepriaznivé účinky hypertermie na rast mláďat, reprodukciu dospelých zvierat a zníženie rezistencie voči chorobám. Burnett a kol. (2006) uvádzajú komplexné údaje o štandardizácii biochemických a hematologických ukazovateľov u králikov. Králik je z pohľadu testovania vysokých teplôt na organizmus vhodným modelovým a zároveň produkčným hospodárskym zvieraťom. Materiál a metodika Cieľom predloženej práce bolo hodnotenie vzťahu medzi definovaným hypertermickým stresom a fyziologickou reakciou králikov línií M91 a P91. Sledovali sme vplyv hypertermického stresu na: 1. vybrané zverozdravotné a produkčné ukazovatele ( mortalita dospelých samíc, mortalita dospelých samcov a mortalita králikov od odstavu (35 dní veku) do veku 77 dní (dosiahnutie porážkovej hmotnosti králikov) 2. prírastky živej hmotnosti odstavených králikov 3. hematologické ukazovatele (leukocyty, lymfocyty, neutrofily, eozinofily a bazofily) 251 Experimentálne podmienky s definovanou vysokou teplotou (36 ± 3°C) boli simulované v uzavretom chovnom priestore, s nainštalovaným termoagregátom a tepelným senzorom. Experimentálne zvieratá (20 dospelých ♀♀, 4 dospelí ♂♂, 16 mláďat ♀♀, 16 mláďat ♂♂) boli ustajnené v samostatných sektoroch chovných klietok s ad libitným systémom kŕmenia a napájania. Kontrolná skupina zvierat (20 dospelých ♀♀, 4 dospelí ♂♂, 16 mláďat ♀♀, 16 mláďat ♂♂) bola ustajnená v čiastočne klimatizovanej hale pre produkciu brojlerových králikov v priestoroch VÚŽV-SCPV Nitra. Graf 1 Teplotný profil v experimentálnych priestoroch ( hypertermická záťaž králikov) 6,00-18,00 hod.=hypertermická záťaž: 36° C ± 3° C. 18,00 -6,00 hod.=bez hypertermickej záťaže. Ventilátor bol nastavený na 2 hodinový interval po 15 minút činnosti. Výsledky boli spracované štatistickými metódami v programe MS Excel 2000 s použitím programového systému SAS. Signifikantnosť rozdielov medzi jednotlivými skupinami bola hodnotená Duncanovým testom viacnásobného rozsahu a Scheffesovým testom. Výsledky a diskusia I. Vplyv hypertermického stresu na prírastky živej hmotnosti, mortalitu odstavených a dospelých králikov: Všetky sledované parametre u experimentálnych mláďat králikov počas výkrmového pokusu boli výrazne nižšie v porovnaní s kontrolnou skupinou mláďat (od -10,04% pri spotrebe krmiva na 1 kg prírastku až po -57,66% pri spotreba krmiva do 77. dňa veku v g / deň). Celkový prírastok živej hmotnosti v g/ks bol u mláďat vystavených hypertermii o 235,2 g nižší voči kontrolnej skupine. To svedčí o negatívnom vplyve vysokej teploty chovného prostredia na živú hmotnosť a tým aj na celkový zdravotný stav sledovaných zvierat. 252 Tabuľka 1 Výsledky výkrmových pokusov počas hypertermickej záťaže králikov Pokusná Kontrolná skupina skupina x ± S.D. x ± S.D. Počet zvierat pri zahájení pokusu 32 32 Živá hmotnosť na 56.deň veku v g 1645,91±151,30 1888,13±234,155 -12,82% Živá hmotnosť na 77.deň veku v g 2173,81±158,91 2 637,33±244,35 -17,57% 4,093 4,55 -10,04% 23,62 34,82 -32,16% Spotreba krmiva do 77. dňa veku v g / deň 67,28 158,92 -57,66% Celková spotreba krmiva v g/ks 1412,88 3337,32 -1924,44 g Celkový prírastok živej hmotnosti v g/ks 496,02 731,22 -235,2 g Ukazovateľ Spotreba krmiva na 1 kg prírastku medzi 56. až 77. dňom veku v kg Priemerný prírastok živej hmotnosti medzi 56. až 77. dňom veku v g/deň/ks Rozdiel ku kontrole Graf 2 Priemerné denné prírastky rastúcich králikov v (g) 45 40 35 30 25 p.d.p. (g) 20 15 10 5 0 kontrola pokus 56.-63. 63.-70 70.-77. vek (v dňoch) Tabuľka 2 Mortalita zvierat ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– KRÁLIKY HYPERTERMIA KONTROLA –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– ♀♀ DOSPELÉ MORTALITA 20 ks 20 ks 20% (4/20) 10% (2/20) ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––♂♂ DOSPELÉ MORTALITA ♀♀ MLÁĎATÁ MORTALITA 4 ks 4 ks 50% (2/4) - 16 ks 16 ks 25% (4/16) 12,5% (2/16) –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– ♂♂ MLÁĎATÁ MORTALITA 16 ks 16 ks 44% (7/16) - 253 Tabuľka 3 Mortalita dospelých králikov počas hypertermického pokusu Skupina/dátum 6.6.-13.6. 13.6.-20.6. 20.6.-27.6. kontrola - - 2 pokus 6 - - Tabuľka 4 Mortalita mladých - rastúcich králikov počas hypertermického pokusu Skupina/dátum 6.6.-13.6. 13.6.-20.6. 20.6.-27.6. kontrola 1 1 - pokus 11 - - Hypertermické chovné prostredie malo nepriaznivý dopad na zníženie vitality experimentálnych zvierat, čoho dôkazom je ich výrazne zvýšená mortalita. U pokusnej skupiny dospelých samíc bola 20%, u pokusnej skupiny dospelých samcov bola 50%. Mortalita mláďat dosahovala hodnoty u pokusných samičiek 25% a u pokusných samčekov 44%. V kontrolnej skupine uhynuli len samice (dospelé 10 % a mláďatá 12,5%). Prevažná väčšina zvierat uhynula v prvom týždni hypertermického experimentu, kedy bola zaznamenaná najvyššia stresová záťaž na organizmus rastúcich mláďat, ale aj dospelých králikov. II. Vplyv hypertermického stresu na hematologické ukazovatele krvi králikov: Graf 3 Graf 4 LEUKOCYTY *) *88 14 12 10 8 LEUKOCYTY 15 SAMCI -K-MLAĎATÁ SAMCI -K-DOSPEL 10 SAMCI-P-MLÁĎATÁ SAMICE-K-MLÁĎATÁ 6 4 SAMICE-P-MLÁĎATÁ 2 SAMCI-P-DOSPEL SAMICE-K-DOSPEL 5 SAMICE-P-DOSPEL 0 0 1 1 Tabuľka 5 LEUKOCYTY SAMCI-KONTROLA-MLÁĎATÁ 11.620 x 109/L SAMCI-KONTROLA-DOSPELÍ 14.500 x 109/ L SAMCI-POKUS-MLÁĎATÁ 9.700 x 109/ L SAMCI-POKUS- DOSPELÍ 12.150 x 109/ L SAMICE-KONTROLA-MLÁĎATÁ 12.420 x 109/L SAMICE-POKUS-MLÁĎATÁ p<0,05 * 7.380 x 109/ L SAMICE-KONTROLA-DOSPELÉ 14.780 x 109/ L * SAMICE-POKUS-DOSPELÉ 12.720 x 109/ L Scheffesov test 254 U oboch vekových kategórií, tak u samíc ako aj u samcov, sme zaznamenali leukopéniu (Tabuľka 5, Grafy 3–4). Leukopénia-pokles leukocytov – je charakteristická reakcia na stresové podmienky hypertermického prostredia (36° C ± 3° C). Mláďatá králikov reagovali na vysokú teplotu prostredia senzitívnejšie. V periférnej krvi mláďat bol pokles leukocytov výraznejší (signifikantná leukopénia u mladých samíc), v porovnaní s dospelými králikmi. Graf 5 Graf 6 LYMFOCYTY LYMFOCYTY 7 10 6 8 5 SAMCI -K-MLAĎATÁ 4 SAMCI-P-MLÁĎATÁ 6 3 SAMICE-K-MLÁĎATÁ 4 2 SAMCI -K-DOSPEL SAMICE-P-MLÁĎATÁ 1 SAMCI-P-DOSPEL SAMICE-K-DOSPEL SAMICE-P-DOSPEL 2 0 0 1 1 Tabuľka 6 LYMFOCYTY SAMCI-KONTROLA-MLÁĎATÁ 6.360x 109/L SAMCI-KONTROLA- DOSPELÍ SAMCI-POKUS-MLÁĎATÁ 3.700x 109/L * SAMICE-KONTROLA-MLÁĎATÁ 6.140x 109/L p<0,05 * 8.100x 109/L SAMCI-POKUS- DOSPELÍ SAMICE-KONTROLA-DOSPELÉ 7.780x 109/L 4.060x 109/L SAMICE-POKUS-DOSPELÉ SAMICE-POKUS-MLÁĎATÁ 8.625x 109/L 6.980x 109/L Scheffesov test Pokles bielych krviniek-leukocytov je zapríčinený hlavne poklesom lymfocytov – lymfopénia (Tabuľka 6, Grafy 5, 6). Týmto je vysvetlená zvýšená senzitivita mláďat na hypertermické chovné prostredie, v porovnaní s dospelými zvieratami. Signifikantne znížená koncentrácia lymfocytov u mláďat (samcov) je predispozíciou aj k narušeniu obranných reakcií ich organizmu. Graf 7 Graf 8 MONOCYTY MONOCYTY 8*) 1,2 0,8 1 SAMCI -K-MLAĎATÁ 0,8 SAMCI-P-MLÁĎATÁ 0,6 0,6 SAMCI -K-DOSPEL SAMCI-P-DOSPEL 0,4 SAMICE-K-DOSPEL SAMICE-K-MLÁĎATÁ 0,4 SAMICE-P-MLÁĎATÁ 0,2 0,2 SAMICE-P-DOSPEL 0 0 1 1 255 Tabuľka 7 MONOCYTY SAMCI-KONTROLA-MLÁĎATÁ 0.762x 109/L SAMCI-KONTROLA- DOSPELÍ 0.553x 109/L SAMCI-POKUS-MLÁĎATÁ 0.576x 109/L SAMCI-POKUS- DOSPELÍ 0.400x 109/L SAMICE-KONTROLA-MLÁĎATÁ 1.002x 109/L * 0.426x 109/L SAMICE-POKUS-MLÁĎATÁ p<0,05 * SAMICE-KONTROLA-DOSPELÉ 0.720x 109/L 0.628x 109/L SAMICE-POKUS-DOSPELÉ Scheffesov test Graf 9 Graf 10 NEUTROFILY NEUTROFILY 5 6 5 4 3 SAMCI -K-MLAĎATÁ 4 SAMCI -K-DOSPEL SAMCI-P-MLÁĎATÁ 3 SAMCI-P-DOSPEL 2 SAMICE-K-MLÁĎATÁ 1 SAMICE-P-MLÁĎATÁ 0 SAMICE-K-DOSPEL 2 SAMICE-P-DOSPEL 1 0 1 1 Tabuľka 8 NEUTROFILY SAMCI-KONTROLA-MLÁĎATÁ 2.760x 109/L SAMCI-KONTROLA- DOSPELÍ 4.425x 109/L SAMCI-POKUS-MLÁĎATÁ 4.580x 109/L SAMCI-POKUS- DOSPELÍ 3.200x 109/L SAMICE-KONTROLA-MLÁĎATÁ 4.740x 109/L SAMICE-KONTROLA-DOSPELÉ 5.360x 109/L 2.600x 109/L SAMICE-POKUS-DOSPELÉ SAMICE-POKUS-MLÁĎATÁ Graf 11 Graf 12 EOZINOFILY EOZINOFILY 0,2 0,2 0,15 0,15 SAMCI -K-MLAĎATÁ SAMCI-P-MLÁĎATÁ SAMICE-K-MLÁĎATÁ SAMICE-P-MLÁĎATÁ 0,1 0,05 0 4.420x 109/L SAMCI -K-DOSPEL SAMCI-P-DOSPEL 0,1 SAMICE-K-DOSPEL 0,05 SAMICE-P-DOSPEL 0 1 1 Tabuľka 9 EOZINOFILY SAMCI-KONTROLA-MLÁĎATÁ 0.116x 109/L SAMCI-KONTROLA- DOSPELÍ 0.06x 109/L SAMCI-POKUS-MLÁĎATÁ 0.180x 109/L SAMCI-POKUS- DOSPELÍ 0.085x 109/L SAMICE-KONTROLA-MLÁĎATÁ 0.037x 109/L SAMICE-KONTROLA-DOSPELÉ 0.160x 109/L SAMICE-POKUS-MLÁĎATÁ 0.052x 109/L SAMICE-POKUS-DOSPELÉ 0.050x 109/L 256 Graf 13 Graf 14 BAZOFILY BAZOFILY 0,8 0,8 0,6 SAMCI -K-MLAĎATÁ SAMCI-P-MLÁĎATÁ SAMICE-K-MLÁĎATÁ SAMICE-P-MLÁĎATÁ 0,4 0,2 0 0,6 SAMCI -K-DOSPEL SAMCI-P-DOSPEL 0,4 SAMICE-K-DOSPEL 0,2 SAMICE-P-DOSPEL 0 1 1 Tabuľka 10 BAZOFILY SAMCI-KONTROLA-MLÁĎATÁ 0.618x 109/L SAMCI-KONTROLA- DOSPELÍ 0.538x 109/L SAMCI-POKUS-MLÁĎATÁ 0.368x 109/L SAMCI-POKUS- DOSPELÍ 0.420x 109/L SAMICE-KONTROLA-MLÁĎATÁ 0.506x 109/L SAMICE-KONTROLA-DOSPELÉ 0.762x 109/L SAMICE-POKUS-MLÁĎATÁ 0.216x 109/L SAMICE-POKUS- DOSPELÉ 0.658x 109/L Vzhľadom ku zisteným koncentráciám ostatných typov bielych krviniek môžeme konštatovať, že iba u neutrofilov v kategórii dospelých zvierat a u monocytov a tiež bazofilov pre obe kategórie zvierat sme zaznamenali pokles týchto typov bielych krviniek u pokusných králikov vystavených hypertermickému chovnému prostrediu. Signifikantné zníženie sme zaznamenali len u monocytov mladých samíc. Záver Expozícia králikov (mláďat a dospelých samcov a samíc) hypertermickému prostrediu (36 ± 3° C) pôsobí negatívne na ich fyziologické procesy a narúša ich vnútornú homeostázu. Zmeny sa manifestujú na všetkých biologických úrovniach. Prejavuje sa to negatívne na príjme a konverzii krmiva, intenzite rastu, ale aj v narušení hematologických ukazovateľov. Zaznamenaná signifikantná leukopénia (7.380 x 109/ L), so sprievodnou signifikantnou lymfopéniou (3.700x 109/L) u mladých experimentálnych zvierat (p<0,05*), je charakteristickým sprievodným javom stresovej reakcie na hypertermické chovné prostredie. Keď sú králiky vystavené dlhšie trvajúcemu tepelnému stresu, senzitívnejšie zvieratá nedokážu regulovať svoje vnútorné prostredie a dostavuje sa hypertermický kolaps, sprevádzaný zvýšenou mortalitou (u mláďat:25–44 %, u dospelých zvierat:20–50 %). Literatúra Burnett N., Mathura K., Metivier K. S., Holder R. B., Brown G. and Campbell M. (2006) An investigation into haematological and serum chemistry parameters of rabbits in Trinidad. World Rabbit Science 14, s. 175 – 187. Harris I. (1994) The laboratory rabbit. ANZCCART Facts Sheet, News, vol.7, No. 4, s. 1 – 8. Marai I. F. M., Habeeb A. A. M. and Gad A. E. (2002) Rabbit´s productive, reproductive and physiological performance traits as affected by heat stress: a review. Livestock Production Science 78, s. 71 – 90. 257 Kontaktná adresa: RNDr. Vladimír Parkányi, CSc., Slovenské centrum poľnohospodárskeho výskumu, Hlohovská 2, 949 92 Nitra, e-mail: [email protected] ANALÝZA VNITŘNÍHO PROSTŘEDÍ MASNÉHO SKOTU THE ANALYSIS OF BEEF CATTLE INTERNAL ENVIRONMENT Pavlík, A. 1, Bartuňková, H. 1, Bjelka, M. 2, 1Jelínek P. 1 1Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat, Agronomická fakulta, MZLU v Brně ústav pro chov skotu, Rapotín 2Výzkumný Abstract The aim of the study was to compare some biochemical parameters of blood plasma of different beef cattle category (bulls, heifers and steers) during the fattening. In each group, there have been 11 beef cattle crossbreeds observed during the period from day 26 to 618 of age. Animals live weight measurement and blood samples collecting were provided during this period in day 26, 310, 403, 448, 479, 512, 554 and 618. Blood plasma samples were analyzed for total protein, glucose, urea, calcium and phosphorus concentration. The values of blood plasma metabolic and mineral profile parameters in all monitored groups during experimental period ranged in intervals stated for healthy animals. Significantly highest body weight gain during experimental period was found in the group of bulls. There were found significant differences in blood plasma total protein concentration between the groups. Sporadic differences in other objected internal environment parameters between the groups were noted. Úvod S postupným nárůstem užitkovosti dojnic a omezením produkce mléka kvótami se neustále snižuje počet skotu dojených plemen. Otevírá se tak prostor pro chov masného skotu, především v systému chovu krav bez tržní produkce mléka, který není určen pro zpeněžení mléka, ale k výživě telat a v konečném důsledku pro výrobu kvalitního hovězího masa. Důležitým aspektem je zde využití masných plemen skotu v podmínkách podhorských a horských oblastí, kde zemědělská produkce dosahuje nižších výnosů, čímž klesá i ekonomická efektivita zdejší výroby. Chov masného skotu v systému bez tržní produkce mléka tak podporuje zemědělské hospodaření na venkově, především využitím trvalých travních porostů, podílí se na ochraně životního prostředí, tvorbě krajiny a přispívá k řešení zaměstnanosti. 258 Při rozšiřování tohoto způsobu chovu skotu je potřeba nezanedbat vliv působení chovatelských podmínek na organismus zvířat, tak aby byl zabezpečen především dobrý zdravotní stav, optimální užitkovost vyjádřená růstovou schopností zvířat a tím i výroba kvalitních živočišných produktů. Pro vytvoření optimálních podmínek, které by odpovídaly aktuálním potřebám jednotlivých zvířat je však nutné znát co nejvíce ukazatelů vnitřního prostředí, které tyto vlivy odrážejí a zejména signalizují stupeň dotace organismu živinami, minerálními látkami, vitaminy a současně jsou projevem určitého funkčního stavu jedince. Mnoho vědeckých publikací popisuje změny hematologických a biochemických parametrů krve u různých kategorií skotu (Dubreuil a Lapierre, 1997; PARRA et al., 1999; Whitaker et al., 1999; Knowles et al., 2000; Jorritsma et al., 2003; Kumar a Pachauri, 2003; Accorsi et al., 2005; Cavestany et al., 2005; Fontaneli et al., 2005). Většina z nich se však zaměřuje pouze na mléčný skot, případně na některé kategorie skotu zastaveného ve výkrmu. Navíc většina těchto sledování je ve vztahu k aplikací různých léčiv nebo suplementací krmné dávky minerálními a vitaminovými doplňky. Komplexním studie, zabývající se sledováním parametrů vnitřního prostředí jednotlivých kategorií masného skotu chovaného v systému bez tržní produkce mléka, tedy extenzivně, nebyla do dnešní doby na národní úrovní vypracována. Existují ojedinělé práce zahraničních autorů, kteří popisují biochemické a hematologické parametry masného skotu (Grunwaldt et al., 2005). Je však nutné brát v potaz skutečnost, že klimatické podmínky v těchto studiích jsou odlišné od klimatických podmínek ČR a tím těžko srovnatelné. Cílem této práce bylo stanovit vybrané ukazatele vnitřního prostředí v průběhu výkrmu u kategorií býků, jalovic a volů chovaných v podhorské oblasti Jeseníků. Materiál a metodika Řešený projekt byl realizován v provozní stáji Výzkumného ústavu pro chov skotu v Rapotíně. Do pokusu bylo zařazeno 22 ks telat býků a 11 telat jalovic kříženců masných plemen. Telata byla vybírána do sledování na základě data narození, tak aby rozdíl mezi jednotlivými zvířaty byl co nejmenší. První odběr krve byl proveden v průměrném věku telat 26 ± 10 dní z vena jugularis, v době, kdy byla telata s matkou na pastvě. Zde také probíhal odchov telat systémem bez tržní produkce mléka. Ve věku 290 dnů bylo 11 býků vykastrováno a všechna sledovaná zvířata byla zařazena do výkrmu. V odchovně mladého dobytka byla rozdělena do kotců dle pohlaví. V průběhu sledování byla tato zvířata krmena směsnou krmnou dávkou na bázi kukuřičné 259 siláže, jetelotravní senáže, sena a jadrné směsi (NL -170,28g; Suš.- 86,88%; vlák. – 71,02g; PDIN – 109,74g; PDIE – 92,69g; NEV - 6,84 MJ,ME - 12,03MJ) TMR – sušina 391,4 g; NL – 106,6g; vláknina – 223,3g, NEV - 6,18 MJ. Ve věku 26, 310, 403, 448, 479, 512, 554 a 618 dnů byla u zvířat zjišťována živá hmotnost a současně byla z podocasní žíly odebrána pomocí odběrového systému Hemos krev. Krev byla stabilizována heparinem a bezprostředně po odběru všech zvířat zařazených do sledování odstředěna při 2 500 ot/min-1 po dobu 15 minut. Krevní plazma byla uchována při teplotě -20oC až do analýzy. Z krevní plazmy byly stanoveny hladiny následujících parametrů vnitřního prostředí: celkové bílkoviny, glukóza, močovina, vápník, fosfor. Z rozdílu hmotností při prvním odběru a hmotností zvířat po zařazení do výkrmu byl stanoven průměrný přírůstek za období odchovu. Růstová intenzita v průběhu výkrmu byla hodnocena výpočtem průměrných přírůstků v časových intervalech mezi jednotlivými odběry. Statistické vyhodnocení získaných dat bylo provedeno dvoufaktorovou analýzou variance při opakovaných měřeních a rozdíly mezi jednotlivými skupinami následným testováním pomocí Fisherova LSD testu. Výsledky Nejvyšší hmotnostní přírůstek za období odchovu byl zjištěn u býků a volů (Tab 1). Tyto hodnoty byly statisticky průkazně vyšší (p < 0.05) oproti průměrnému přírůstku zjištěnému u jalovic ve stejném období. V období výkrmu od 310 do 618 dnů věku dosahovali nejvyšších přírůstku býci. V průběhu výkrmu byly rozdíly mezi skupinami stanoveny ve většině případů jako statisticky průkazné (p < 0.05). Nejnižší hodnoty hmotnostních přírůstku v průběhu výkrmu byly zjištěny většinou u skupiny jalovic. Hodnoty hladiny celkových bílkovin v krevní plazmě se v průběhu odchovu a výkrmu výrazně neměnily (Tab 2). Nárůst koncentrace byl zaznamenán na počátku výkrmu ve 310. dni a na konci ve 618. dni. Statisticky průkazně vyšší (p < 0.05) byly stanoveny průměrné hodnoty u skupiny jalovic v 310., 479. a 554. dni věku. 260 Tab 1: Přírůstek živé hmotnosti (kg.den-1) Přírůstek Odběr období 1. 26-310 3102. 403 4033. 448 4484. 479 4795. 512 5126. 554 5547. 618 Tab 2: Obsah celkových bílkovin (g.l-1) býci jalovice p p x x 1,063 a 0,887 b a b 1,466 1,066 a b 1,149 0,846 a b 1,460 1,016 voli p x 1,043 a b 1,244 b 0,733 b 1,082 0,912 0,909 0,810 a 1,281 ab 1,079 a 0,759 CB Odběr 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. věk 26 310 403 448 479 512 554 618 býci x 64,5 74,0 70,7 70,6 69,1 68,7 64,2 73,6 jalovice x p 66,9 ab 72,0 b 70,9 72,9 a 72,3 b 70,3 a 68,0 b 71,7 p voli x 67,3 75,8 70,8 70,1 69,8 68,7 66,3 72,1 p a ab ab b 0,991 b 0,413 a 0,629 Koncentrace plazmatické glukózy se ve všech skupinách s mírným kolísáním v průběhu sledování snižovala do 512. dne (Tab 3). Nejvyšší hodnoty byly stanoveny ve věku 26 dnů. Nižší koncentrace, především v druhé polovině sledování byly zjištěny u skupiny býků. Tyto rozdíly mezi skupinami v průběhu sledovaného období nebyly statisticky průkazné. Zvýšení koncentrace glukózy bylo zaznamenáno na konci výkrmu u jalovic a volů. Nebyl zaznamenán jednoznačný trend vyšších nebo nižších hodnot hladiny močoviny v krevní plazmě u některé ze sledovaných skupin. Hladina močoviny vykazovala ve všech skupinách v průběhu sledovaného období kolísavou tendenci (Tab 4). Statisticky průkazně nižší (p < 0.05) byla hodnota zjištěná u skupiny býků oproti skupině volů v 403. dnu věku. Tab 3: Koncentrace glukózy (mmol.l-1) Glukóza Odběr věk 1. 26 2. 310 3. 403 4. 448 5. 479 6. 512 7. 554 8. 618 býci jalovice x p x p 5,70 6,37 5,15 5,28 5,19 4,81 4,79 4,73 4,60 4,59 4,70 4,93 4,70 4,78 4,81 a 5,20 b voli x p 6,37 5,15 4,75 4,77 4,60 5,05 4,53 5,11 ab Tab 4: Koncentrace močoviny (mmol.l-1) Urea Odběr 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. věk 26 310 403 448 479 512 554 618 býci jalovice voli x p x p x p 1,81 2,57 2,35 2,42 2,54 2,65 2,98 a 3,24 ab 3,46 b 1,79 2,29 1,77 3,23 3,66 2,72 3,06 3,01 2,94 3,65 4,25 3,69 2,31 1,97 1,93 Po mírném kolísání koncentrace plazmatického vápníku na počátku sledovaného období došlo k postupnému snižování hodnot do 479. dne (Tab 5). Do konce experimentu se hladina 261 vápníku ve všech skupinách výrazně neměnila. Statisticky průkazně vyšší byla průměrná hodnota ve skupině jalovic ve 310. dnu věku oproti ostatním kategoriím. Nejvyšší průměrné hodnoty fosforu v krevní plazmě byly zjištěny ve věku 26 dnů (Tab 6). V ojedinělých případech byl zaznamenán statisticky průkazný rozdíl mezi jednotlivými kategoriemi, avšak nebyl patrný trvalý trend vyšší nebo nižší koncentrace u některé z kategorií. Tab 5: Obsah vápníku (mmol.l-1) Ca býci jalovice Odběr věk x p x p 1. 26 2,61 2,64 2. 310 2,34 a 2,61 b 3. 403 2,63 2,81 4. 448 2,46 2,52 5. 479 2,25 2,31 6. 512 2,42 2,44 7. 554 2,33 2,36 8. 618 2,44 2,48 voli x p 2,72 2,44 a 2,65 2,56 2,33 2,43 2,34 2,49 Tab 6: Obsah fosforu (mmol.l-1) P býci jalovice Odběr věk x p x p 1. 26 2,85 a 3,16 b 2. 310 2,53 ab 2,44 b 3. 403 2,44 2,32 4. 448 2,75 2,57 5. 479 2,44 ab 2,38 b 6. 512 2,49 2,47 7. 554 2,49 2,34 8. 618 2,40 2,38 voli x 2,99 2,60 2,45 2,64 2,57 2,51 2,43 2,39 p ab a a Diskuse Hodnoty sledovaných parametrů vnitřního prostředí stanovené u jednotlivých kategorií se v průběhu sledovaného období pohybovaly ve fyziologickém rozmezí. Vzhledem k nevelkému počtu studií zabývající se touto problematikou, není možné dostatečně diskutovat dosažené výsledky. Grunwaldt et al. (2005) sledovali změny metabolického profilu jalovic plemene Aberdeen Angus a uvádějí oproti našim výsledků nižší hodnoty plazmatické glukózy, vápníku a fosforu. Nižší hodnoty koncentrace plazmatické glukózy, oproti našim zjištěním, u extenzivně chovaného skotu stanovili i Otto et al. (2000). Také Whitaker et al. (1999) zaznamenali nižší koncentraci fosforu v krevní plazmě ve srovnání s výsledky našeho pokusu. Underwood (1969) uvádí, že kritická hranice koncentrace plazmatického vápníku pro skot je 2 mmol.l-1. V našem experimentu se hodnoty u všech kategorií pohybovaly nad touto mezní hodnotou. Grunwaldt et al. (2005) stanovili podstatně vyšší koncentraci močoviny v krevní plazmě jalovic. Průměrná koncentrace močoviny stanovená v našem experimentu se nachází v rozmezí hodnot, které uvádějí Whitaker et al. (1999). Závěr Problematika řešené práce se v širším pojetí zabývá chovem masných plemen skotu a jejich kříženců systémem bez tržní produkce mléka s cílem dosažení maximálního využití pastvy v podhorských podmínkách a ekonomicky výhodné produkce kvalitního hovězího masa. V České Republice jde dosud o rozšiřování tohoto systému chovu a plemen skotu, a proto informace o parametrech vnitřního prostředí, jež byly v rámci řešení získány u různých 262 kategorií skotu v průběhu výkrmu jsou určitým přínosem pro hodnocení jejich funkčního a zdravotního stavu a jejich produkční kapacity. Perspektivou řešené problematiky je rozšíření a doplnění stávajících poznatků pořízených jednak v jiných oblastech a u jiných plemen skotu. Rovněž mohou tyto poznatky přispět na základě sledované intenzity růstu, spotřeby krmiva a výsledků zpeněžování k orientaci chovatele na zaměření výkrmu z hlediska výživy, věku a příslušné kategorie skotu (jalovice, býci, voli). Tato studie byla vypracována za podpory grantového projektu IGA MZLU 25/2006 a NAZV QF3020. Literatura 1. ACCORSI PA, GOVONI N, GAIANI R, PEZZI C, SEREN E, TAMANINI C. Leptin, GH, PRL, insulin and metabolic parameters throughout the dry period and lactation in dairy cows. Reprod Domest Anim. 40:217-23, 2005 2. CAVESTANY D, BLANC JE, KULCSAR M, URIARTE G, CHILIBROSTE P, MEIKLE A, FEBEL H, FERRARIS A, KRALL E. Studies of the transition cow under a pasture-based milk production system: metabolic profiles. J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med. 52:1-7, 2005 3. DUBREUIL P, LAPIERRE H. Biochemistry reference values for Quebec lactating dairy cows, nursing sows, growing pigs and calves. Can J Vet Res. 61:235-9, 1997 4. FONTANELI RS, SOLLENBERGER LE, LITTELL RC, STAPLES CR. Performance of lactating dairy cows managed on pasture-based or in freestall barn-feeding systems. J Dairy Sci. 88:1264-76, 2005 5. GRUNWALDT EG, GUEVARA JC, ESTEVEZ OR, VICENTE A, ROUSSELLE H, ALCUTEN N, AGUERREGARAY D, STASI CR. Biochemical and haematological measurements in beef cattle in Mendoza plain rangelands (Argentina). Trop Anim Health Prod. 37:527-40, 2005 6. JORRITSMA R, WENSING T, KRUIP TA, VOS PL, NOORDHUIZEN JP. Metabolic changes in early lactation and impaired reproductive performance in dairy cows. Vet Res. 34:11-26, 2003 Review. 7. KNOWLES TG, EDWARDS JE, BAZELEY KJ, BROWN SN, BUTTERWORTH A, WARRISS PD. Changes in the blood biochemical and haematological profile of neonatal calves with age. Vet Rec. 147:593-8, 2000 8. KUMAR B, PACHAURI SP. Haematological profile of crossbred dairy cattle to monitor herd health status at medium elevation in Central Himalayas. Res Vet Sci. 2000 69:141-5. 9. OTTO F, VILELA F, HARUN M, TAYLOR G, BAGGASSE P, BOGIN E. Biochemical blood profile of angoni cattle in Mozambique. Israel J Vet Med. 55, 2000 dostupné na: http://www.isrvma.org/article/55_3_4.htm 10. PARRA O, OJEDA A, COMBELLAS J, GABALDON L, ESCOBAR A, MARTINEZ N, BENEZRA M. Blood metabolites and their relationship with production variables in dual-purpose cows in Venezuela. Prev Vet Med. 38:133-45, 1999 11. UNDERWOOD EJ. Mineral metabolism. Annu Rev Biochem. 1969 28: 499-526. 12. WHITAKER DA, GOODGER WJ, GARCIA M, PERERA BM, WITTWER F. Use of metabolic profiles in dairy cattle in tropical and subtropical countries on smallholder dairy farms. Prev Vet Med. 38:119-31, 1999 Kontaktní adresa: Ing. Aleš Pavlík, Ph.D., Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat, Agronomická fakulta, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, e-mail: [email protected] 263 ZMENY NEUROMEDIÁTOROV V HYPOTALAMO – HYPOFYZÁRNYCH OBLASTIACH PO HORMONÁLNOM OVPLYVNENÍ CATECHOLAMINE LEVELS IN THE HYPOTHALAMO – PITUITARY STRUCTURES AFTER HORMONAL STIMULATION Pástorová,B., Staníková, A., Halagan, J. Ústav fyziológie Katedry normálnej anatómie, histológie a fyziológie, UVL, Košice Abstract The effect of hormonal stimulation on catecholamine levels in the eminentia mediana, area preoptica, corpus mamillare and pituitary gland of ewes in the estric period by the radioenzymatic method. The estrus of ewes was synchronized with Agelin sponges (Agelin, Spofa) containing 20 mg chlorsuperlutine. After complete synchronization we induced superovulation in the experimental groups by means of 2000 IU serum gonadotropin (PMSG). Catecholamine were determined radioenzymatically using the Catechola test. The results indicate that hormonal serum gonadotropin stimulation decreases significantly (p< 0.05) the levels of dopamine, norepinephrine and epinephrine in the eminentia mediana of sheeps hypothalamus. An increase of norepinephrine levels (p< 0.001) following 2000 IU PMSG in the corpus mamillare was pronouced. Its administration is associated with increase dopamine and epinephrine levels in the pituitary gland. We suspect that given changes in catecholamine levels can be associated in relationship to steroid alteration after administration of gonadotropic hormone PMSG. Úvod Napriek veľkému množstvu vedeckých poznatkov (2, 3) vzťah jednotlivých neuromediátorov k produkcii gonadotropných hormónov nie je dostatočne objasnený. Katecholamíny (CA) hypotalamu zasahujú do sekrécie gonadotropných hormónov hypofýzy tak, že sa podieľajú na regulácii sekrécie hypotalamických releasing hormónov do hypofyzárneho portálneho krvného obehu (4). Norepinefrín (NE) je mediátor na nervových zakončeniach ventrálnej časti hypotalamu a stimuluje sekréciu FSH, LH z hypofýzy. Dopamín (DA) je považovaný za prolaktostatín a do hypofýzy sa dostáva portálnym systémom, kde priamo inhibuje hypofyzárne bunky sekretujúce prolaktín. Súčasne dopamín stimuluje alebo inhibuje sekréciu LH v závislosti od koncentrácie ovariálnych steroidov, ktoré senzibilizujú receptory neurotransmiterov, čím ovplyvňujú syntézu regulačných hormónov (1). Sekrécia LH a FSH je pod kontrolou α-adrenergných receptorov hypotalamu, pričom koncentrácia 17β-estradiolu 264 v krvi moduluje α-adrenergický účinok na sekréciu gonadotropných hormónov. Naopak zmeny v hladinách gonadotropných hormónov v krvnej plazme spätne pôsobia na hladiny a funkciu katecholamínov v hypotalame (8). Katecholamíny hypotalamu sa podieľajú aj na regulácii sekrécie hormónov neurohypofýzy – oxytocínu a vazopresínu. V súčasnosti sa predpokladá, že norepinefrín pôsobí ako inhibítor neurosekrécie. Materiál a metodika Pozorovania sme vykonali na 30 ovciach plemena valaška, vo veku 3-4 roky, s priemernou ž. h. 40 kg v estrickom období. Všetky ovce, aj kontrolné, boli synchronizované 20 mg chlorsuperlutínu v pošvových tampónoch Agelín Spofa. Ovce boli po vybratí agelínových tampónov ihneď stimulované 2000 IU Serového gonadotropínu - PMSG (Bioveta, Ivanovice na Hané). Zvieratá sme zabíjali 99-149 hodín po vybratí hubiek. Bezprostredne po vykrvení a vybratí z lebečnej dutiny sme mozgy rozdelili segmentovou analýzou a podľa stereotaxickej konfigurácie hypotalamu oviec (15) odobrali vzorky z oblasti eminentia mediana, area preoptica a corpus mamillare. Tkanivo sme po odobraní ihneď ponorili do kvapalného dusíka, v ktorom sme ho udržiavali v zmrazenom stave až do ďalšieho spracovania. Koncentrácia katecholamínov bola stanovená u 12 oviec plemena valaška, (6 oviec kontrolných a 6 pokusných). Vzorky sme homogenizovali vo vychladenej HClO4 (c=0,4 mol.l-1), s pridaním redukovaného glutatiónu (c=0,05 mol.l-1) a centrifugovali po dobu 15 minút pri g 10000 / min. Katecholamíny v tkanivových supernatantoch sme stanovili radioenzymatickou metódou za pomoci testu Catechola (Adico, Praha). Aktivitu derivátov katecholamínov sme stanovili 3H značeným donorom metylových skupín (S-adenosyl–l–metyl) – 3H metionín. Produkty reakcie o-metylderiváty katecholamínov sme rozdelili tenkovrstvovou chromatografiou na chromatografických doskách SILUFOL UV 254. Aktivitu vzoriek sme zmerali na scintilačnom spektrometri PACKARD TRI CARB v 3H kanáli. Výsledky uvádzame v ng katecholamínov/1 mg bielkovín tkanivových homogenátov. Bielkoviny sme stanovili metódou podľa LOWRYHO a i. (11). 265 Výsledky Koncentrácia katecholamínov je u kontrolnej intaktnej skupiny oviec v analyzovaných oblastiach hypotalamu oviec rozdielna. Najvyššie zastúpenie norepinefrínu sme stanovili v preoptickej oblasti hypotalamu (4,2±0,350 ng/mg). V oblasti corpus mamillare a v eminentia mediana (obr.2,3) sú hladiny norepenifrínu vyrovnané. Dopamín sa nachádza v hypotalame kontrolnej skupiny oviec v nižších koncentráciách než norepinefrín ( 0,4900,900 ng/mg). Hladiny hypotalamického epinefrínu sú veľmi nízke (0,051-0,270 ng/mg). Po podaní 2000 IU PMSG v porovnaní s kontrolnou intaktnou skupinou sme zaznamenali zmeny koncentrácie katecholamínov študovaných oblastiach CNS podieľajúcich sa na regulácii reprodukčných funkcií oviec. V preoptickej oblasti (obr.4) hypotalamu oviec sme pozorovali signifikantné zníženie (p<0,05) hladín epinefrínu (o 36,4 %). Dopamín a norepinefrín nevykazujú v preoptickej oblasti hypotalamu v porovnaní s kontrolnou skupinou štatisticky významné zmeny. Signifikantné zníženie hladín norepinefrínu (p<0.001) sme pozorovali po podaní serového gonadotropínu (o 52,8 %) v oblasti corpus mamillare (obr.3). Koncentrácie dopamínu a epinefrínu sa v corpus mamillare v porovnaní s kontrolnou skupinou signifikantne nemenili. Podanie 2000 IU SG najvýraznejšie mení hladiny katecholamínov v oblasti eminentia mediana (obr.2), kde sme zaznamenali štatistický významný pokles koncentrácii norepinefrínu (p<0.001). Hladiny dopamínu sa znížili v eminentia mediana o 40,9 % v porovnaní s kontrolnou skupinou oviec a tento pokles je štatisticky významný (p<0.05). V hypofýze sme zaznamenali (obr.1) signifikantné zmeny. P IT U IT A R Y G L A N D D O P A M IN E N O R E P IN E P H R IN E n g /m g p r o t n g /m g p ro t 2 ,5 * 2 E P IN E P H R IN E n g /m g p ro t 8 10 7 9 * 8 6 7 5 1 ,5 1 6 4 5 3 4 3 2 0 ,5 2 1 0 1 0 C o n tr o l, A g e lin A g e lin ,2 0 0 0 IU P M S G C o n tr o l, A g e lin A g e lin ,2 0 0 0 IU P M S G 0 C o n t r o l, A g e lin A g e lin ,2 0 0 0 IU P M S G * -p < 0 ,0 5 Obr. 1 266 E M IN E N T IA M E D IA N A N O R E P IN E P H R IN E D O P A M IN E n g /m g p r o t 0 ,5 1 ,6 0 ,1 4 1 ,4 0 ,1 2 1 ,2 0 ,4 0 ,1 1 ** 0 ,3 0 ,0 8 0 ,8 * 0 ,6 0 ,2 E P IN E P H R IN E n g /m g p r o t n g /m g p rp t 0 ,6 ** 0 ,0 6 0 ,0 4 0 ,4 0 ,0 2 0 ,1 0 ,2 0 0 0 C o n t r o l, A g e lin C o n t r o l , A g e l in A g e lin ,2 0 0 0 IU PM SG C o n t r o l, A g e li n A g e l in , 2 0 0 0 I U P M S G * - p < 0 ,0 5 A g e li n ,2 0 0 0 IU PMSG * * p < 0 ,0 1 Obr. 2 C O R P U S M A M IL L A R E n g /m g p ro t N O R E P IN E P H R IN E D O P A M IN E n g /m g p ro t 1 0 ,9 1 ,6 0 ,8 1 ,4 0 ,7 1 ,2 0 ,6 ** 1 0 ,5 0 ,4 0 ,8 0 ,3 0 ,6 0 ,2 0 ,4 0 ,1 0 ,2 0 C o n tro l, A g e lin A g e lin ,2 0 0 0 IU PM SG E P IN E P H R IN E n g /m g p ro t 1 ,8 0 ,5 0 ,4 5 0 ,4 0 ,3 5 0 ,3 0 ,2 5 0 ,2 0 ,1 5 0 ,1 0 ,0 5 0 * C o n tro l, A g e lin 0 C o n tro l, A g e lin A g e lin ,2 0 0 0 IU P M S G A g e lin ,2 0 0 0 IU PM SG * p < 0 ,0 5 ; ** p < 0 ,0 1 Obr. 3 267 A R E A P R E O P T IC A D O P A M IN E n g /m g p r o t 1 ,4 n g /m g p r o t 6 0 ,0 7 5 0 ,0 6 1 ,2 0 ,0 5 4 1 0 ,8 3 0 ,6 2 0 ,4 1 0 ,2 0 ,0 4 0 ,0 3 0 ,0 2 0 ,0 1 0 0 0 C o n tr o l, A g e lin C o n tr o l, A g e lin A g e lin ,2 0 0 0 IU PMSG E P IN E P H R IN E N O R E P IN E P H R IN E n g /m g p r o t 1 ,6 A g e lin ,2 0 0 0 IU PM SG C o n tr o l, A g e lin A g e lin ,2 0 0 0 IU PMSG Obr. 4 Diskusia Pomer a zastúpenie katecholamínov v nami skúmaných oblastiach mozgu kontrolnej intaktnej skupiny oviec študovaných rádioenzymatickou metódou zodpovedá údajom iných autorov získaných na laboratórnych zvieratách (5. Extrahypofyzárny hormón sérový gonadotropín, ktorý vykazuje FSH a LH aktivitu, má dlhý polčas biologického rozpadu v organizme a jeho podanie je spojené s výrazným dlhodobým zvýšením estrogénov v krvnej plazme. Vysoké koncentrácie estrogénov pôsobia na adrenergické receptory hypotalamu a ako uvádzajú DAVIES a i. (6), dochádza pri týchto stavoch k poklesu zastúpenia hypotalamického norepinefrínu. V súlade s uvedenými údajmi sme v našom pokuse pozorovali štatisticky významný pokles (p<0.001) koncentrácie norepinefrínu v oblasti eminentia mediana a corpus mamillare po aplikácii hormonálneho preparátu serového gonadotropínu. Do rostrálneho hypotalamu patrí preoptická oblasť, ktorá je súčasťou vyššieho regulačného mechanizmu riadenia gonadotropných funkcií adenohypofýzy (9). V tejto oblasti sa nachádzajú adrenergické nervové terminály podieľajúce sa na sekrécii gonadotropínov. Podľa súčsných vedeckých poznatkov sa predpokladá, že zvýšenie turnoveru norepinefrínu v mediálnej preoptickej oblasti počas proestru spôsobuje adrenergnú blokádu, ktorá predchádza výraznému vrcholu LH. Katecholamíny v preoptickej oblasti pôsobia na uvoľňovanie LH-RH tónickou inhibíciou cez GABA – ergické interneurózy, ktoré potencujú uvoľňovanie LH-RH. LOFSTROM a i. (10) zistili, že exogénne hormóny PMSG a HCG pôsobia na adrenergné receptory hypotalamu potkanov, najvýraznejšie na neuróny 268 v rostrálnej oblasti hypotalamu. V našom pokuse sme pozorovali signifikantné zníženie koncentrácie epinefrínu (p<0,05) v preoptickej oblsati hypotalamu oviec. SAAVEDRA (14) uvádza, že neuróny obsahujúce epinefrín v preoptickej oblasti hypotalamu sa podieľajú i na regulácii integrácie periférnej adrenergickej odozvy. Výraznú funkciu v hypotalame má dopamín, nachádzajúci sa v tuberoinfundibulárnych dopaminergických neurónoch hypotalamu, ktoré vykazujú cyklické zmeny aktivity v priebehu estrálnych cyklov. Tieto neuróny sa podieľajú na koordinácii hypotalamickej kontroly sekrécie 3 gonadotropných hormónov: prolaktínu, FSH a LH. Dopamín je uvoľňovaný z neurónov eminentia mediana do portálnych ciev a je dôležitým faktorom v regulácii sekrécie prolaktínu v hypofýze (17). Z našich výsledkov vyplýva, že najvýraznejšie zmeny dopamínu sme pozorovali po podaní 2000 IU SG najmä v oblasti eminentia mediana, kde sme zaznamenali signifikantné zníženie hladín dopamínu (o 46,94 %). Pri porovnaní výsledkov z tohoto pokusu s našimi predchádzajúcimi (12, 13) je možné konštatovať, že i napriek tomu, že exogénny hormón serový gonadotropín spôsobuje štatisticky významné zníženie hypotalamických katecholamínov u oviec plemena valaška, ešte výraznejší vplyv má na zmeny katecholamínov oviec plemena slovenské merino. V hypofýze dochádza po hormonálnom ovplyvnení k signifikantnému vzostupu dopamínu a epinefrínu (p<0,05). O funkcii hypofyzárnych katecholamínov sú známe vedecké poznatky iba niekoľko rokov (7). Významnú úlohu v hypofýze má najmä dopamín prítomný v neurálnej a intermediálnej časti hypofýzy, ktorý má význam najmä v priebehu laktácie a pri sekrécii oxytocínu a vazopresínu. Mechanizmus účinku vplyvu exogénnych hormonálnych prípravkov (15, 16) na koncentrácie katecholamínov v hypotalame a hypofýze je bez štúdia ich obratu ťažko definovať. Je pravdepodobné, že dochádza k spätnoväzobnému pôsobeniu estrogénov na adrenergické receptory hypotalamu a tým k zmenenému uvoľňovaniu katecholamínov v adrenergických neurónoch. Obrat a aktuálne hladiny katecholamínov závisia od mnohých faktorov, akými sú syntéza a degradácia, uskladnenie a extracelulárne vychytávanie, od transneurálneho toku a interakcie s aitoreceptormi. Porušenie niektorého z uvedených faktorov vedie k zmene koncentrácií a funkcie katecholamínov v nervovom tkanive. Literatúra 1. 2. 3. 4. AKEMA,T., KIMURA,F.: Neuroendocrinology, 50, 1989, 688-692. BAHR,J.M., BEN JONATHAN,N.N.: Endocrinology, 108,1981,1818-1819. BEKEOVÁ,E, HENDRICHOVSKÝ,V., KRAJNIČÁKOVÁ,M.: Slov.vet.čas., 23, 1998, 5:264-268. CROWLEY,W.R., DOHUL,T.L., JACOBOWITZ,D.A.: Brain. Res., 147, 1978, 315-326. 269 5. ČULMAN,J., KVETŇANSKÝ,R., KISS,A., MEZEY,E., MURGAŠ,K.: In: USDIN,E.KVETŇANSKÝ,R.-KOPIN,J. (eds): Catecholamine and stress. Elsevier North Holland, 1981, 31-32. 6. DAVIES,J.J., NAFTOLINI,F.K.,RYAN,J., FISCHMANN,A., SINN,J.: Endocrinilogy, 997,1975,554558. 7. HOLZBAUER,M., SHARMAN,D.F., STEPHENS,D.B.: In: USDIN,E., KVETŇANSKÝ,R.-KOPIN,J. (eds.): Catecholamine and stress. Recent Advances. Elsevier North Holland, New York, Amsterdam, Oxford, 1981, 137-143. 8. KULJIS,R.O., ADVIS,J.P.: Endocrinology, 124, 1989, 1579-1581. 9. LERANTH,C., MacLUSKY,N.J., SHANABROUGH,M., NAFTOLINI,F.K.: Neuroendocrinology, 48, 1988, 591-602. 10. LOFSTROM,J.E.R., ENEROTH,J., GUSTAFSON,J.A., SKETT,P.: Endocrinology, 101,1977,15591567. 11. LOWRY,O.,ROSENBROUGH,N., FARR,A., RANDALL,R.: J. biol. Chem., 194,1951,265-275. 12. PÁSTOROVÁ,B., ARENDARČIK,J., MOLNÁROVÁ,M.: Vet.Med., 33,1988,281-292. 13. PÁSTOROVÁ,B., ARENDARČIK,J.: Vet.Med., 33,1989,171-180. 14. SAAVEDRA,J.M.: Cell. Mol. Neurobiol., 4,1984,397-402. 15. SOPKOVÁ, D.: In: Proceedings of lecture and posters, September 2004, 310 – 313. 16. SOPKOVÁ, D., VÁRADY, J., ELIÁŠ, V., MAKOVÁ, Z.: Phys. Res., 3, 48, 1999, 21. 17. WELENTO,J., SZTEYN,S., MILART,Z.: Antropool. Anz., 124,1968,1-27. Kontaktná adresa: doc. RNDr. Bernadetta Pástorová, PhD., Ústav fyziológie KNAHF, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, 041 81 Košice Práca bola podporená grantom VEGA 1/2446/05 . VPLYV DIÉTY OBOHATENEJ SELENIČITANOM SODNÝM NA ANTIOXIDAČNÝ A SELÉNOVÝ STATUS OVIEC. EFFECT OF SODIUM SELENITE SUPPELMENTATION INTO THE DIET FOR SHEEP ON SELENIUM AND ANTIOXIDANT STATUS. Petrovič, V., Leng, L.1, Pisarčíková, J., Farkašová, Z., Tóthová, Cs., Kováč, G. Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, Košice 1Ústav fyziológie hospodárskych zvierat, Slovenská Akadémia Vied, Košice Abstract In experiment on sheep, the effect of supplementation of sodium selenite on superoxide dismutase (SOD) in erytrocytes, glutathione peroxidaze (GPx) in blood, tissues and fractions of rumen fluid, malondialdehyde (MDA) and Se concentration in plasma, blood and tissues was investigated. Ten animals were randomly divided into two groups and were fed experimental diets for 2 months. Control group of sheep received BD providing a daily intake of Se 42.35 µg only. The diet for second group consisted of BD enriched with Se 0.3 mg.kg-1 in the form of Na2SeO3 and provided total daily intake 270.4 µg of Se per head. Increases in Se concentrations in whole blood and tissues as well as increases in the activities of blood and tissues GPx were highly significant in group of sheep fed diet supplemented with selenite. Interestingly, the concentration of Se in muscle was significantly increased in this 270 group of animals too. Activity of SOD in erythrocytes as well as the contents of MDA in tissues were significantly reduced in animals fed diet supplemented with Se. The cumulation of Se in rumen microflora resulted in its significant increased in the bacterial and protozoal fractions of rumen fluid. The results suggest on the important role of rumen microflora in the creation of selenomethionine from selenite which is the only form of selenium able to build significant body deposits. The benefit of Se supplementation on the maintainance of antioxidant and selenium status of sheep was demonstrated. Key words: sheep, selen, GPx, SOD, MAD Úvod Antioxidačná ochrana je aktívne odstraňovanie kyslíkových voľných radikálov pomocou antioxidantov „vitamínov, kys. močovej, superoxid dismutázy (SOD), zložiek zahrnutých do glutatiónového a tioredoxínového systému a iných“. Antioxidanty zabezpečujú ochranu biologicky dôležitých molekúl pred oxidačným poškodením vyvolaným pôsobením voľných radikálov. Sú lokalizované v organelách, subcelulárnych kompartmentoch a extracelulárnom priestore (Surai a kol., 1999). Enzýmy ako superoxid dismutáza a selénoenzýmy „glutatión peroxidáza (GPx), tioredoxín reduktáza“ sú považované za hlavné zložky antioxidačnej ochrany organizmu. Selén vo forme selénocysteínu zabudovaný do aktívneho centra selénoenzýmov zodpovedá za ich enzymatickú aktivitu (Behne a Kyriakopoulos, 2001), i preto je sledovanie selénového a antioxidačného statusu zvierat a ľudí stredobodom záujmu. Našu prácu sme preto zamerali na hodnotenie antioxidačného a selénového statusu vnútorného prostredia oviec, pomocou merania vybraných antioxidačných parametrov, pri skrmovaní bazálnej diéty a diéty obohatenej o seleničitan sodný. Materiál a metodiky Ovce s priemernou ž. hmotnosťou 36 kg boli náhodne rozdelené do dvoch skupín po päť zvierat. Boli ustajnené v individuálnych boxoch s volným prístupom k vode. Počas dvoch mesiacov boli ovce kontrolnej skupiny kŕmené bazálnou diétou (BD) zabezpečujúcou denný príjem Se 42,35 µg na zviera, kým ovce seleničitanovej skupiny dostávali rovnakú BD obohatenú o 228 µg Se vo forme seleničitanu sodného. Ovciam boli po eutanázii odobraté vzoriek orgánov na analýzy, ktoré sme uložili pod –60 ˚C do ich analyzovania. Aktivita SOD bola meraná hneď po odbere krvi kitom RANSOD od firmy Randox, UK. Aktivita GPx v krvi bola meraná kitom RANSEL od firmy Randox, UK. Aktivitu GPx v tkanive pečene, obličky a 271 duodéna sme merali ako zmenu absorbancie vzorky spôsobenú vznikajúcim oxidovaným NADP+ pri 340 nm metódou (Paglia and Valentine, 1967) modifikovanou podľa Zagrodzkého a kol. (1998). Hemoglobín bol analyzovaný kitom od firmy Randox, UK. Koncentrácia selénu v krmive, krvi a orgánoch bola hodnotená v duplikátoch použitím fluorometrickej metódy (Rodriguez a kol., 1994). Koncentrácie MDA v plazme, tkanive pečene, obličky a duodéna boli merané modifikovanou fluorimetrickou metódou (Jo a Ahn, 1997). Bielkoviny sme stanovili metódou podľa Bradforda (1976). Bakteriálnu a protozoálnu frakciu sme z bachorového obsahu oviec získali metódou podľa Czerkawského (1976). Na štatistické vyhodnotenie významností výsledkov sme použili Studentov t-test nepárový. Výsledky sú uvedené ako priemerné hodnoty ± SEM. Výsledky a diskusia Koncentrácie Se v krvi, tkanive pečene, kôry obličky, drene obličky, duodéna, chrbtovej svaloviny a srdca oviec sú prezentovaná v Tabuľke 1. Skrmovanie diéty obohatenej o seleničitan sodný ovciam viedlo k významnému zvýšeniu koncentrácie Se v krvi, ako i všetkých sledovaných tkanivách v porovnaní s koncentráciami selénu stanovenými v krvi a orgánoch oviec s bazálnym príjmom Se. Je známe, že koncentrácia Se v telových tekutinách a tkanivách je v úzkej lineárnej korelácii s aktivitou GPx v krvi (Pavlata a kol., 2001). Rovnako ako koncentrácia Se i aktivita GPx v krvi a všetkých sledovaných orgánoch bola významne zvýšená v seleničitanovej skupine v našich oviec. Tieto výsledky sú v zhode s pozorovaniami uvedenými v mnohých prácach, v ktorých sledovali vplyv skrmovania diét doplnených o Na2SeO3 u rôznych druhov zvierat (Kuricová a kol., 2003; Zuberbuehler a kol., 2006). Tabuľka 1. Koncentrácie Se v krvi, tkanive pečene, kôry obličky, drene obličky, slezine, epiteli, chrbtovej svalovine a srdci oviec kŕmených bazálnou diétou a diétou obohatenou Na2SeO3. parameter krv µmol.l-1 -1 pečeň µmol.kg sušiny -1 kôra obličky µmol.kg sušiny kontrolná skupina Na2SeO3 skupina 0,43 ± 0,03 3,62 ± 0,26 p < 0,001 4,06 ± 0,11 23,04± 2,58 p < 0,001 45,85 ± 3,03 66,86 ± 2,37 p < 0,001 -1 dreň obličky µmol.kg sušiny 8,77 ± 1,13 14,61 ± 1,15 p < 0,01 -1 epitel µmol.kg sušiny 5,86 ± 0,67 14,07 ± 0,59 p < 0,001 chrbtový sval µmol.kg sušiny 0,89 ± 0,08 3,43 ± 0,14 p < 0,001 -1 3,88 ± 0,23 14,88 ± 0,49 p < 0,001 -1 srdce µmol.kg sušiny Hodnoty sú priemery ± SEM, n=5 v každej skupine. 272 Tabuľka 2. Aktivity GPx v krvi, tkanive pečene, kôry obličky, drene obličky, duodéna, koncentrácie MDA v plazme, tkanive pečene, obličky, duodéna a koncentrácia –SH skupín v plazme oviec kŕmených bazálnou diétou a BD obohatenou Na2SeO3. parameter kontrolná skupina Na2SeO3 skupina -1 GPx v krvi U.g Hb 265,9 ± 53,2 993 ± 66,04 p < 0,001 -1 18,06 ± 2,36 88,25 ± 4,77 p < 0,001 -1 47,19 ± 8,21 88,52 ± 15,39 p < 0,01 -1 GPx v dreni obličky U.g bielkovín 26,95 ± 4,53 44,43 ± 3,34 p < 0,05 GPx v duodéne U.g-1 bielkovín 36,17 ± 4,66 114,8 ± 17,38 p < 0,01 -1 0,28 ± 0,04 0,29 ± 0,02 NS MDA v pečeni nmol.g-1 bielkovín GPx v pečeni U.g bielkovín GPx v kôre obličky U.g bielkovín MDA v plazme µmol.l 22,53 ± 1,15 16,76 ± 0,87 p < 0,01 -1 31,9 ± 3,53 19,51 ± 3,42 p < 0,05 -1 26,09 ± 1,84 20,04 ± 1,52 p < 0,05 MDA v duodéne nmol.g bielkovín 47,59 ± 2,80 38,42 ± 1,17 p < 0,05 -1 0,54 ± 0,01 0,46 ± 0,02 p < 0,01 MDA v kôre obličky nmol.g bielkovín MDA v dreni obličky nmol.g bielkovín -1 –SH skupín v plazme mmol.l Hodnoty sú priemery ± SEM, n=5 v každej skupine. Koncentrácia MDA v tkanive pečene, kôry obličky, drene obličky a duodéna bola významne znížená v seleničitanovej skupine v porovnaní s kontrolnou skupinou oviec. Balogh a kol., (2004) zistili, že pokles hladín GPx v tkanivách je sprevádzaný vzostupom koncentrácie MDA v sledovaných tkanivách. Koncentrácia –SH skupín v plazme oviec bola významne znížená v seleničitanovej skupine oproti kontrolnej skupine. Tiolové skupiny sú významnou ochrannou bariérou plazmy pred oxidačným pôsobením voľných radikálov. Ich pokles poukazuje na zníženie tvorby alkoxylového a hydroxylového radikálu v organizme. Aktivita krvnej SOD bola v seleničitanovej skupine významne znížená v porovnaní s kontrolnou skupinou oviec (Graf 1). K rovnakému záveru sme dospeli i v našom predošlom experimente na sliepkach, v ktorom skrmovanie diéty obohatenej o Na2SeO3 resp. selenizované kvasnice, spôsobilo významný pokles aktivity SOD v porovnaní s hydinou kŕmenou iba BD (Petrovič a kol., 2006). Predpokladáme, že zvýšenou aktivitou selénoenzýmov (GPx, TRxR a iných) v seleničitanovej skupine oviec sa zabezpečilo zlepšenie recyklácie vitamínu C a vitamínu E, ktoré slúžia ako scavenger superoxidového radikálu (Surai, 2002), ktorý je špecifickým substrátom pre superoxid dismutázu. 273 7000 6000 U.g-1 Hb 5000 ** 4000 3000 2000 1000 0 Kontrola Na2SeO3 Graf 1. Efekt obohatenia bazálnej diéty pre ovce seleničitanom sodným na aktivitu krvnej superoxid dizmutázy. Hodnoty sú priemery ± SEM, n=5 v každej skupine. Porovnanie koncentrácie Se prijímaného diétou s koncentráciou selénu v bakteriálnej a protozoálnej frakcii bachorovej tekutiny potvrdzuje schopnosť bachorovej mikroflóry kumulovať Se do mikrobiálnych proteínov (tabuľka 3). V telách bachorových mikroorganizmov sa selén nachádza hlavne vo forme selénoaminokyselín. Van Ryssen a kol., (1989) zistili, že selénocysteín bol predominantnou selénoaminokyselinou prítomnou v bachorových mikroorganizmoch kultivovaných v médiu obsahujúcom Na2SeO3. Preto môžeme predpokladať, že nami zaznamenané zvýšenie v koncentrácii Se v oboch frakciách bachorového obsahu oviec seleničitanovej skupiny v porovnaní s kontrolou je zapríčinené hlavne prítomnosťou selénoaminokyselín zabudovaných do mikrobiálnych proteínoch. Tabuľka 3. Koncentrácie Se v bakteriálnej a protozoálnej frakcii bachorového obsahu oviec kŕmených bazálnou diétou a BD obohatenou Na2SeO3. parameter kontrolná skupina Na2SeO3 skupina 3,08 ± 0,28 9,72 ± 1,73 p < 0,01 5,06 ± 0,54 12,21± 0,1 p < 0,001 Se v bakteriálnej frakcii µmol.kg-1 sušiny Se v protozoálnej frakcii µmol.kg-1 sušiny Hodnoty sú priemery ± SEM, n=5 v každej skupine. Záver Obohatenie diéty oviec seleničitanom sodným spôsobilo zlepšenie sledovaných parametrov antioxidačného i selénového statusu vnútorného prostredia oviec. 274 POĎAKOVANIE: Táto práca bola podporovaná agentúrou na podporu vedy a techniky na základe zmluvy č. APVT-51-004804. Literatúra ARTHUR J.R., BOYNE R., 1985. Superoxide-dismutase and glutathione-peroxidase activities in neutrophils from selenium deficient and copper deficient cattle. Life Sci. 36, 1569-1575 BALOGH K., WEBER M., ERDÉLYI M., MÉZES M., 2004. Effect of excess selenium supplementation on the glutathione redox system in broiler chicken. Acta Vet. Hung. 52, 403-411 BEHNE D., KYRIAKOPOULOS A., 2001. Selenium-containing proteins in mammals and other forms of life. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 145, 1-46 BRADFORD M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 CZERKAWSKI J.W., 1976. Chemical composition of microbial matter in the rumen. J. Sci. Food Agric. 27, 621-632 ELLMAN G.L., 1958. Tissue sulfhydryl groups. Arch. Biochem. Biophys. 82, 70-77 Jo C., Ahn D.U., 1998. Fluorometric analysis of 2-thiobarbituric acid reactive substances in turkey. Poultry Sci. 77, 475-480 HOLOVSKÁ K., LENÁRTOVÁ V.,HOLOVSKÁ K., PRISTAŠ P., JAVORSKÝ P. 2002. Are ruminal bacteria protected against environmental stress by plant antioxidants ? Lett. App. Microbiol. 35, 303-304 KIM H.S., CHAE H.S., JEONG S.C., HAM J.S., IM S.K., AHN C.N., LEE J.M. 2006. In vitro antioxidative properties of lactobacilli, J Anim. Sci. 19 (2): 262-265 KURICOVÁ S., BOLDIŽÁROVÁ K., GREŠÁKOVÁ Ľ., LEVKUT M., LENG Ľ., 2003. Chicken selenium status when fed a diet supplemented with Se-yeast. Acta Vet. Brno 72, 339-346 PAGLIA D.E., VALENTINE W.N., 1967. Studies on quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J. Lab. Med. 70, 158-169 PAVLATA L., ILLEK J., PECHOVÁ A., 2001. Blood and tissue selenium concentration in calves treated with inorganic or organic selenium compounds - A comparison. Acta Vet. Brno 70, 19-26 PETROVIČ V., BOLDIŽÁROVÁ K., FAIX Š., MELLEN M., ARPAŠOVÁ H., LENG Ľ., 2006. Antioxidant and selenium status of laying hens fed with diets supplemented with selenita or Se-yeast. Anim. Feed Sci. 15, 435-445 RODRIGUEZ E.M., SANZ M.T., ROMERO C.D., 1994. Critical study of fluorometric determination of selenium in urine. Talanta 12, 2025-2031 Kontaktná adresa: Petrovic Vladimir, MVDr., University of Veterinary Medicine, II. Internal Clinic, Komenskeho 73, Kosice 041 81, Slovakia, [email protected] VLIV GRAVIDITY NA POČET LEUKOCYTŮ A T - LYMFOCYTŮ U OVCÍ SUPLEMENTOVANÝCH SELENEM. EFFECTS OF GRAVIDITY ON NUMBER OF LEUKOCYTES AND T CELLS SUBSETS IN SELENIUM SUPPLEMENTED EWES. *Písek, L., Trávníček, J., Kroupová, V., Rodinová, H. Katedra anatomie a fyziologie hospodářských zvířat, Zemědělská fakulta, Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích Department of Anatomy and Physiology of Farm Animals, Faculty of Agriculture, University of South Bohemia in Ceske Budejovice Abstrakt: Cílem práce bylo posoudit vliv reprodukčního cyklu na dynamiku počtu leukocytů a na zastoupení subpopulací T – lymfocytů u ovcí suplementovaných selenem. Do pokusu bylo zařazeno 15 jedinců plemene ovce Šumavská ve věku 18 měsíců. V průběhu pokusu byla krev 275 odebírána jalovým, gravidním (0-50; 51-100 a 101-150 dnů) a obahněným (0-30 a 31-60 dnů) ovcím. Počty leukocytů a lymfocytů byly stanovovány mikroskopicky z krevních nátěrů dle platných norem (č. 84 3206 a 84 3209). Pro stanovení zastoupení subpopulací T-lymfocytů byla použita průtoková cytometrie. Počty leukocytů i relativní zastoupení lymfocytů nevykazovaly statisticky významné rozdíly a pohybovaly se v rozmezí fyziologické normy. V dynamice CD4+ a CD8+ T-lymfocytů byl zjištěn statisticky významný rozdíl (P < 0,001) mezi obdobím gravidity a obdobím po porodu, kdy byl zaznamenán strmý nárůst v zastoupení obou subpopulací až na dvojnásobek. Klíčová slova: ovce; krev; FACS; subpopulace Abstract: The aim of the work was assessed influence of reproduction cycle at the dynamics of leukocytes and T cells subsets in selenium supplemented ewes. The experiment was conducted on fifteen ewes of the Sumava sheep breed at 18 months of age. The ewes were in the stage of non-pregnancy, pregnancy and lactation during the experiment. Blood for analysis were collected in monthly intervals. After parturition blood samples were taken from lambing ewes on day 30 and 60. Number of leukocytes in blood smear was detected by microscopically analysis by the norm no. 84 3206, and the CD4+ and CD8+ T cells subsets in blood were detected by flow cytometery. The number of leukocytes was in physiological norm without statistically significant differences during the experiment. In the dynamics of the T cells subsets was founded statistically significant difference between stadium of gravidity and stadium after lambing (P < 0,001). Key words: sheep; blood; FACS; subsets Poděkování Tento projekt byl podporován MSM 6007665806 a GAČR 523/03/H076. *Kontaktní osoba: Lukáš Písek, ZF JU v Č. Budějovicích, Studentská 13., 370 05 České Budějovice, e-mail: [email protected], tel.: +420387772620 276 VPLYV PRÍDAVKU TREHALÓZY NA FERTILIZAČNÚ KAPACITU ZMRAZENÉHO SEMENA BARANOV. THE EFFECT OF TREHALOSIS ADDITION ON FERTILIZATION CAPACITY OF FROZEN RAM SEMEN Riha, Ľ., Apolen, D., Pivko, J., Kubovičová, E., Grafenau, P., *Lukáč, N. Research Institute Of Animal Produktion Nitra *Slovak Agricultural University, Nitra, Slovak Republic Abstrakt V našich experimentoch sme sa zamerali na otestovanie vplyvu prídavku rôznych koncentrácií trehalózy ( 0, 25, 50, 75 a 100 % ) na úkor glukózy, do žĺtkovo – citrátového riedidla na fertilizačnú kapacitu zmrazeného – rozmrazeného semena baranov. Rozmrazené inseminačné dávky sme analyzovali pomocou CASA metódy, kde sme hodnotili spermie rýchle s lineárnym progresívnym pohybom, spermie pomalé s nelineárnym progresívnym pohybom, spermie neprogresívne s lokálnou pohyblivosťou a nepohyblivé spermie. Výsledky našich experimentov ukázali, že pre zmrazovanie semena baranov sa javí ako optimálna kombinácia 50 % glukózy a 50 % trehalózy, kedy sme zaznamenali vysoko preukazný ( P < 0,001 ) rozdiel ako v celkovej motilite, tak aj v progresívnej motilite (64,67 % resp. 45,01 %). Výsledky našich experimentov poukázali tiež na to, že úspešnosť zmrazovania je závislá tiež na prídavku 4 % - glycerolu do riedidla po uplynutí ekvilibračnej doby tesne pred mrazením. Kľúčové slová: fertilizačná kapacita semena, ekvilibračná doba, motilita spermií, trehalóza Úvod Inseminácia oviec sa nezaobíde bez konzervácie baranieho semena. Jednou z konzervačných metód je zmrazovanie za účelom dlhodobého uchovávania. V súčasnej dobe zmrazovanie baranieho semena spôsobuje závažné poškodenie spermií, čo zhoršuje jeho fertilizačnú schopnosť. Viacerí autori popísali poškodenia spermií barana po zmrazenírozmrazení, ktoré znižujú motilitu a fertilizačnú schopnosť semena po umelej inseminácii (AI). U oviec je vo všeobecnosti úspešnosť gravidity po cervikálnej inseminácii zmrazenýmrozmrazeným semenom nízka (20-40%). Je to spôsobené zložitou anatomickou stavbou cervixu oviec. Pre úspešný transport spermií na miesto oplodnenia je potrebná dobrá počiatočná motilita spermií po rozmrazení. Z tohto dôvodu, za účelom ovplyvnenia fertility po cervikálnej inseminácii, je potrebné redukovať poškodenia spôsobené zmrazovaním. Riedidlá semena pre rôzne živočíšne druhy, vrátane morských cicavcov, obsahujú zvyčajne glukózu alebo fruktózu, vajcový žĺtok a glycerol. Trehalóza je disacharid glukózy, ktorý sa 277 pridáva do riedidiel semena a bolo zistené, že chráni spermie rôznych druhov počas procesu zmrazovania a ovplyvňuje motilitu spermií po rozmrazení u capov, baranov a býkov. Cieľom našej práce bolo laboratórnymi testami overiť vplyv prídavku rôznych koncentráciií trehalózy na fertilizačnú kapacitu zmrazeného semena baranov. Materiál a metodika Semeno sme odoberali od plemenných baranov na Ústave chovu oviec v Trenčianskej Teplej. Odobraté semeno sme posúdili dodržiavajúc zásady STN 466219 a vytvorili sme heterospermiu, aby sme vylúčili (minimalizovali) vplyv barana. Riedenie odobratého semena sme vykonávali žĺtkovo – citrátovým riedidlom v pomere 1 : 4, kde sme vytvorili kontrolnú skupinu bez prídavku trehalózy ( 0 % ) a pokusné skupiny s prídavkom trehalózy (25, 50, 75 a 100%) na úkor glukózy obsiahnutej v žĺtkocitrátovom riedidle. Odobraté semeno sme posúdili zmyslovo (farba, pach, atď.) a mikroskopicky v zmysle ON 466219. Posúdené semeno sme riedili žĺtkovo-citrátovým riedidlom tak, aby sme dosiali 100 miliónov aktívnych spermií v inseminačnej dávke. Nariedené semeno sme následne ekvilibrovali pri teplote 5 0C po dobu 90 minút. Po uplynutí ekvilibračnej doby sme doplnili do nariedeného semena 4% glycerolu a magnetickou miešačkou premiešali. Inseminečné dávky sme pripravili z nariedeného a ekvilibrovaného semena do 0,25 ml pejetiek pomocou automatickej pipety. Semeno sme zmrazovali v parách tekutého dusíka v zariadení „Plávajúci závesný zmrazovač „ (f. Minitüb, SRN) po dobu 20 minút a následne uskladnili v tekutom dusíku. Laboratórne analýzy zmrazených inseminačných dávok sme robili metódou CASA v „Laboratóriu kvantifikácie motility a charakteristiky celulárnych a subcelulárnych štruktúr“ na SPU v Nitre. Z rozmrazenej inseminačnej dávky sme pripravili preparát a na mikroskope Olympus prepojenom s počítačom sme pomocou počítačového softwéru sme vyhodnotili nasledovné parametre: spermie rýchle s lineárnym progresívnym pohybom, spermie pomalé s nelineárnym progresívnym pohybom, spermie neprogresívne s lokálnou pohyblivosťou a nepohyblivé spermie (Obrázok 1). 278 Obr. 1 Schématické znázornenie pohybu spermií hodnotené CASA metódou VCL (curvilinear velocity, µm/s) – krivočiarová rýchlosť; VSL (straight line velocity, µm/s) – priama rýchlosť, VAP (average path velocity, µm/s) – priemerná dráhová rýchlosť; ALH (amplitude of lateral head displacement, µm/s) – aplitúda latarálneho prenesenia hlavičky spermie okolo priemernej dráhy; LIN (linearity) – priamočiarosť krivočiarovej dráhy, vyjadená jako VSL:VCL; WOB (wobble) - miera pre kmitanie (osciláciu) aktuálnej dráhy okolo priemernej dáhy vyjadrená ako VAP:VCL. Výsledky Testovanie vplyvu prídavku rôznych koncentrácií trehalózy (25, 50, 75 a 100%) pri zmrazovaní semena baranov prinieslo zaujímavé výsledky. Výsledky naších experimentov poukázali na skutočnosť, že motilita, ako aj progresívna motilita spermií baranov po zmrazení - rozmrazení bola ovplyvnená prídavkom trehalózy. Aplikácia žĺtkovo-citrátového riedidla s rôznymi koncentráciami trehalózy (25, 50, 75 a 100% pridaná na úkor glukózy) a pridávanie 4% glycerolu po ekvilibrácii semena tesne pred zmrazovaním (Tab. 1) ukázala, že ako najoptimálnejšia sa javí kombinácia 50% trehalózy + 50% glukózy, kedy sme zaznamenali vysoko preukazný (P<0,001) rozdiel ako v celkovej motilite, tak aj v progresívnej motilite. Pri testovaní prídavku 4% glycerolu pred ekvilibráciou semena (Tab. 2) vo všetkých skupinách bola v porovnaní s kontrolou, ako celková, tak aj progresívna motilita v skupinách s prídavkom trehalózy preukazne nižšia (P<0,05 - 0,0001). 279 Tab. 1 Výsledky CASA laboratórnej analýzy zmrazeného – rozmrazeného semena baranov po pridaní 4% glycerulu po ekvilibrácii semena Konc. Motilita Progresívna VAP trehalózy % Motilita % VCL VSL LIN WOB ALH Kontrola x 36,95 13,34 30,10 55,62 22,63 0,40 0,54 3,16 (0 %) sd 5,63 2,83 5,16 9,81 4,59 0,06 0,05 0,44 25 % x 32,92 14,38 42,75 69,88 35,59 0,51 0,61 3,69 sd 5,09 3,57 4,09 7,75 4,02 0,05 0,04 0,39 x 64,67 45,01 53,22 83,83 43,95 0,52 0,63 3,71 sd 3,76 4,46 3,03 4,19 3,73 0,03 0,02 0,33 x 42,69 19,39 58,93 89,10 52,65 0,59 0,66 3,35 sd 5,35 3,42 5,10 9,11 4,79 0,04 0,04 0,33 x 26,24 9,36 51,0 76,75 45,45 0,59 0,66 3,09 sd 5,34 3,27 5,71 6,59 6,01 0,05 0,04 0,64 50 % 75 % 100% Tab. 2 Výsledky CASA laboratórnej analýzy zmrazeného – rozmrazeného semena baranov po pridaní 4% glycerulu pred ekvilibráciou semena Konc. Motilita Progresívna VAP trehalózy % motilita % VCL VSL LIN WOB ALH Kontrola x 35,66 20,00 55,08 74,33 45,82 0,61 0,74 7,68 (0 %) sd 10,73 8,35 5,16 8,52 3,88 0,02 0,03 0,38 25 % x 27,62 12,39 54,34 69,13 45,36 0,67 0,80 7,34 sd 6,51 4,57 6,50 16,67 4,41 0,13 0,10 0,89 x 20,60 11,92 55,22 77,90 46,44 0,62 0,73 7,63 sd 3,19 3,49 3,08 21,56 3,35 0,14 0,14 1,36 x 18,15 10,92 55,32 68,99 46,26 0,66 0,79 7,29 sd 2,07 1,02 4,27 6,09 5,66 0,03 0,02 0,28 X 25,57 11,54 50,37 65,21 43,81 0,67 0,77 7,02 sd 3,46 2,72 3,13 8,05 2,15 0,09 0,08 0,49 50 % 75 % 100% Diskusia Prospešný efekt vplyvu pridania trehalózy do riedidla na životaschopnosť cicavčích spermií po rozmrazení bola popísaná v mnohých štúdiách (Aisen a kol., 2000; Foote a kol., 280 1993; Molinia a kol., 1994; Yildiz a kol., 2000; An a kol., 2000; Sztein a kol., 2001) a štúdie Israeli a kol. (1993) a Conrad a kol. (2000) ukázali, že trehalóza je efektívna aj pri ochrane vysušených buniek a lipozómov. Ako sa ukazuje, mechanizmy, ktorými trehalóza chráni bunky pri dehydratácii alebo zmrazení, zahŕňajú jej stabilizujúci účinok na bunkové proteíny aj tiež na membrány. Podstata mechanizmov však zostáva neznáma a tiež je popisované aj kolísanie účinkov trehalózy v jednotlivých prácach (Molinia a kol., 1994; Yildiz a kol., 2000). Storey a kol..(1998) zistili, že trehalóza preukazne ovplyvňujer spermie myší. Aisen a kol. (2000) popisujú preukazne pozitívny efekt vplyvu trehalózy na životaschopnosť spermií barana a zmrazených-rozmrazených Molinia a kol. (1994) prišli k záveru, že motilita spermií barana je vyššia v prítomnosti sacharózy alebo trehalózy, v porovnaní s glukózou ak nie je súčasťou riedidla glycerol; zatiaľ čo v prípade, ak bol glycerol súčasťou riedidla, nepozorovali rozdiely medzi rôznymi typmi cukrov. K podobnému záveru prišli aj Meszároš a kol. (1992), ktorí zistili, že semeno baranov možno zmraziť aj bez glycerolu v riedidle s obsahom hlavných komponentov vajcového žĺtka. Prežívateľnosť a aktivita spermií sa síce znížila, avšak preukazne sa znížil aj výskyt morfologických zmien Prospešný ochranný efekt prídavku trehalózy do riedidla bol popísaný tiež pri zmrazených-rozmrazených spermiách psov.(An a kol., 2000).Aj napriek dôkazom o prospešnom efekte trehalózy, nie všetky štúdie sú vo svojich záveroch zhodné. Chen a kol..(1993) nezistili preukazný efekt vplyvu trehalózy na prežívanie býčich spermií a Liu a kol. (1998) zistili, že náhrada časti TCG zmrazovacieho média obsahujúceho vajcový žĺtok trehalózou alebo sacharózou až do 25% (v:v), nemalo pozitívny efekt v procese zmrazovania býčich spermií. Uvedená skutočnosť môže byť však spôsobená aj tým, že v týchto prácach boli použité nízke koncentrácie trehalózy (0,05 a 0,1 M), pretože ako popísali niektorí vyššie uvedení autori, vysoké koncentrácie trehalózy mali preukazne ochranný efekt proti poškodeniam chladom (An a kol., 2000). Aj napriek kontroverzným názorom viacerých autorov môžeme záverom, vychádzajúc z našich dosiahnutých výsledkov konštatovať, že trehalóza má pozitívny a prospešný efet pri zmrazovaní semena baranov, v prípade ak je pridávaná na úkor glukózy, ktorá je bežne používaná pri príprave riedidiel. Na základe dosiahnutých výsledkov môžeme tiež konštatovať, že dôležitú úlohu zohráva pridanie kryoprotektíva (glycerolu) po ekvilibrácii semena, tesne pred samotným zmrazovaním. Treba však povedať, že nielen prídavok aditíva, ale tiež teplota pri rozmrazovaní zohrávajú veľmi dôležitú úlohu pri zachovaní životaschopnosti baraních spermií. Ako uvádzajú Nur a kol. (2003) percento defektov akrozómov a iných morfologických defektov sa 281 preukazne znížilo, ak boli pejetky rozmrazované pri 70 0C 5 sekúnd v porovnaní s 37 0C 30 sekúnd. Záver Záverom, na základe výsledkov našich experimentov môžeme konštatovať, že celková motilita, ako aj progresívna motilita spermií baranov po zmrazení-rozmrazení bola ovplyvnená prídavkom trehalózy. Pri aplikácii žĺtkovo-citrátového riedidla sme najlepšie výsledky zaznamenali pri kombinácii 50% trehalózy + 50% glukózy a pridávaní 4% glycerolu po ekvilibrácii semena tesne pred zmrazovaním. Literatúra 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Aisen EG, Alvarez HL, Venturino A, Garde JJ. Effect of trehalose and EDTA on cryoprotective action of ram semen diluents. Theriogenology 2000 53:1053-1061. An TZ, Iwakiri M, Edashige K, Sakurai T, Kasai M. Factors affecting the survival of frozen-thawed mouse spermatozoa. Cryobiology 2000 40:237-249. Conrad PB, Miller DP, Cielenski PR, de Pablo JJ. Stabilization and preservation of Lactobacillus acidophilus in saccharide matrices. Cryobiology 2000 41:17-24. . Foote RH, Chen Y, Brockett CC, Kaproth MT. Fertility of bull spermatozoa frozen in whole milk extender with trehalose, taurine, or blood serum. DJ Dairy Sci 1993 76:1908-1913. Chen Y, Foote RH, Brockett CC. Effect of sucrose, trehalose, hypotaurine, taurine, and blood serum on survival of frozen bull sperm. Cryobiology 1993 30:23-31 Israeli E, Shaffer BT, Lighthart B. Protection of freeze-dried Escherichia coli by trehalose upon exposure to environmental conditions. Cryobiology 1993 30:519-523. Liu Z, Foote RH, Brockett CC. Survival of bull sperm frozen at different rates in media varying in osmolarity. Cryobiology 1998 37:219-230. Meszároš, P., Gamčík, P.: Štúdium možnosti zmrazovania semena baranov v riedidle bez glycerínu. Veterinářství, 1992, 62 (10), s. 377-378. Molinia FC, Evans G, Maxwell WMC. Effects of monosaccharides and disaccharides in Tris-based diluents on motility, acrosome integrity and fertility of pellet frozen ram spermatozoa. Anim Rep Sci 1994 36:113-122. Nur, Z., Dogan, I., Squilu, M.K., Ak, K.: Effect of different thawing procedures on the quality of bull semen. Rev. Méd. Vet., 2003, 154, 7, s. 487-490. Storey BT, Noiles EE, Thompson KA. Comparison of glycerol, other polyols, trehalose, and raffinose to provide a defined cryoprotectant medium for mouse sperm cryopreservation. Cryobiology 1998 37:46-58. Sztein JM, Noble K, Farley JS, Mobraaten LE. Comparison of permeating and nonpermeating cryoprotectants for mouse sperm cryopreservation. Cryobiology 2001 42:28-39. Yildiz C, Kaya A, Aksoy M, Tekeli T. Influence of sugar supplementation of the extender on motility, viability and acrosomal integrity of dog spermatozoa during freezing. Theriogenology 2000 54:579585. 282 VÝZNAM METABOLICKÉHO PROFILOVÉHO TESTU VO VZŤAHU K ZDRAVIU A PRODUKCII THE ROLE OF METABOLIC PROFILE TEST IN RELATION TO HEALTH AND PRODUCTION Schneidgenová, M., Kováčik, J. Katedra fyziológie živočíchov, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre Abstract Good health status of animal is important condition for achievement and keeping of high utility. The aim of our experiments was to analyze some metabolic parameters dairy cattle´s blood in agricultural enterprises Žiar, Mariková a Naháč. It was observed that metabolic parameters of mineral profile (Na, K) which we analyzed respond to physiological interval in all farms. At the some time we determined that concentration of glukose in blood serum was in the physiological interval, too. The higher concentration of cholesterol in dairy cattle´s blood was observed in agricultural enterprises Mariková a Naháč but in the middle lactation. Úvod Premena látok (metabolizmus) je základným prejavom života vôbec. Prijaté látky organizmus využíva na výstavbu svojho tela, na zabezpečenie vnútorného prostredia, energetické deje, rozmnožovanie, výmenu informácií s vonkajším prostredím. Aby mohli v živých organizmoch prebiehať metabolické deje, musia sa prijaté látky neprestajne premieňať- tvoriť a odbúravať. Premena látok sú zložité chemické deje, ktoré sú časovo i priestorovo zosúladené zložitými enzýmovými procesmi (Paulov, 1980). V praxi sa dosť často stretávame s metabolickými poruchami, hlavne pri vysokoúžitkových dojniciach (Novák, 2003). Tieto poruchy sú zapríčinené viacerými faktormi, ako napr. skrmovaním závadných (plesnivých, kyslých) objemových krmív, nesprávnym zložením kŕmnej dávky, vysokým podielom jadrových krmív, čo má za následok vytvorenie nestability bachorového prostredia. Tým dochádza k zníženému rozmnožovaniu mikroorganizmov, ktoré v bachore produkujú mikrobiálnu bielkovinu, sacharidy premieňajú na kyselinu octovú, propiónovú, maslovú, enzýmy a vitamíny. Zavádzaním industrializačných prvkov do technológie chovu hovädzieho dobytka, najmä dojníc, sa zvyšuje efektívnosť živočíšnej výroby (Beseda, 1990). V tomto procese však vzniká nekompromisná požiadavka dôsledne rešpektovať biologické potreby organizmu 283 v záujme udržania jeho vysokej produkcie. V opačnom prípade dochádza k metabolickým poruchám alebo k tzv. produkčným chorobám. Metabolické poruchy môžu prebiehať skryte (latentne) najmä v začiatočnom období píše Fečková (2001), spôsobujú však vážne ekonomické straty na úžitkovosti, zhoršujú využiteľnosť krmiva, negatívne ovplyvňujú reprodukčný proces, životaschopnosť mláďat, neskoršie klinické štádium má už zreteľné prejavy a sprevádza ho aj hynutie, prípadne núdzové zabitie. Metabolický profilový test (MPT) je významná diagnostická metóda na odhaľovanie predklinických štádií metabolických porúch, a to najmä v chovoch dojníc (Kantíková a Balážik, 2003). Umožňuje kontrolu zdravia a včasné odhalenie porúch metabolizmu (Slanina a Beseda 1992), odhalenie rôznych endogénnych záťaží organizmu ešte pred klinickým prejavom ochorenia (Novanská, 1990), odhalenie príčin neadekvátnej úžitkovosti, poruchy vo výžive a utilizácii živín ako aj niektoré toxické vplyvy, najmä na parenchymatózne orgány (Slanina et al., 1985). Materiál a metodika Dojnice sme sledovali v troch poľnohospodárskych podnikoch a to: PD Žiar, PD Mariková a PD Naháč. Vybrané dojnice boli klinicky zdravé, na 3- 4 laktácii a rozdelené do troch skupín podľa fyziologického stavu. V každej skupine bolo po päť kusov dojníc. • I. skupina- zasušené (4 týždne pred otelením) • II. skupina- postpartálne obdobie (4 týždne po pôrode) • III. skupina- v strede laktácie (4 mesiace po pôrode) Krv pre laboratórne spracovanie krvného séra sme získali punkciou vena jugularis do troch hodín po rannom kŕmení. Zachytávala sa priamo do označených centrifugačných skúmaviek. Centrifugáciou zrazenej krvi pri 3000 ot.min-1 po dvoch hodinách po odbere sme získali krvné sérum, v ktorom sme stanovili jednotlivé biochemické ukazovatele: sodík, draslík, glukóza a cholesterol využitím biochemického analyzéra Microlab 300. Výsledky a diskusia Výsledky biochemických parametrov sú spracované v tabuľkách 1, 2 a 3. V prvom PD Žiar (tabuľka 1) sa hodnoty všetkých sledovaných ukazovateľov (sodík, draslík, glukóza a cholesterol) v krvnom sére vo všetkých skupinách pohybovali v referenčnom rozmedzí, ako uvádzajú Slanina et al. (1992). Referenčné rozpätie u sodíka v krvnom sére je 135- 150 mmol.l-1, u draslíka je 4,0- 5,8 mmol.l-1, u glukózy je 2,2- 4,1 mmol.l-1 a referenčné rozmedzie u cholesterolu je 1,5- 5,2 mmol.l-1 284 Tab. 1 Biochemické parametre Tab. 2 Biochemické parametre podniku PD Žiar II III podniku PD Mariková podniku PD Naháč 147 4,75 2,90 1,38 Gluk. Chol. skupina Na K Glu Chol 145 4,55 4,00 2,78 146 4,95 3,00 2,64 149 4,45 3,30 1,68 148 4,85 3,10 3,68 146 4,95 2,90 0,95 148 4,75 3,30 2,24 147 4,45 3,10 3,04 147 4,70 3,80 2,94 149 4,55 3,10 1,42 144 4,95 3,10 2,96 148 4,75 3,70 2,61 147 4,70 3,90 2,76 147 4,40 3,00 3,50 148 4,80 4,00 4,30 145 4,60 3,60 2,15 149 4,20 2,90 3,73 149 4,65 3,90 4,63 147 4,80 3,70 2,50 150 4,50 3,70 0,99 145 4,55 3,40 4,68 147 4,60 3,90 3,54 148 4,50 3,70 0,52 145 4,80 3,10 3,91 147 4,70 4,00 4,22 147 4,80 3,50 6,33 147 4,85 3,20 4,51 150 4,65 3,50 5,33 147 4,70 4,00 7,15 148 4,75 3,10 4,31 149 4,70 4,10 6,34 149 4,85 3,50 7,67 147 4,60 3,40 5,39 147 4,85 3,20 4,60 149 4,70 3,30 4,30 146 4,90 3,90 4,05 146 4,85 3,10 4,51 146 4,60 4,20 2,94 skupina Na K I Tab. 3 Biochemické parametre Gluk. Chol. skupina Na K I II III 148 4,75 2,90 2,76 143 4,35 2,90 4,83 144 4,60 3,20 4,37 148 4,70 3,80 2,88 I II III 146 4,60 4,30 3,13 146 4,70 3,60 7,02 146 4,60 3,90 6,58 V PD Mariková (tabuľka 2) boli sledované hodnoty sodíka, draslíka aj glukózy vo všetkých troch skupinách v referenčných rozmedziach, v súlade s tým, ako udávajú Slanina et al.(1992). V prvej a druhej skupine bola zistená mierne znížená hladina cholesterolu u niekoľkých dojníc a v tretej skupine bola zaznamenaná mierne zvýšená hladina cholesterolu u všetkých dojníc. V treťom sledovanom podniku v PD Naháč (tabuľka 3) bola zistená zvýšená hladina cholesterolu u jednej dojnice v druhej skupine a u troch dojniciach v tretej skupine. Ostatné sledované parametre, teda parametre sodíka, draslíka glukózy v krvnom sére sa pohybovali v referenčných rozmedziach podľa Slaninu et al. (1992). Záver Poruchy metabolizmu, najmä vysoko produktívnych zvierat, sa výrazne zúčastňujú na celkových stratách v živočíšnej výrobe. Ich výskyt s rozvinutými klinickými príznakmi je menší, väčšinou prebiehajú v latentných formách, ktoré sú z ekonomického hľadiska 285 mimoriadne závažné. Metabolický profilový test umožňuje zisťovať zmeny metabolických procesov a zabrániť tým vzniku klinických foriem ochorení. Vo všetkých sledovaných podnikoch sa parametre minerálneho profilu, konkrétne hodnoty sodíka a draslíka, pohybovali v rámci referenčných noriem. Zároveň sa v referenčných normách pohybovali aj stanovené hodnoty glukózy vo všetkých troch sledovaných družstvách. V PD Mariková a PD Naháč bola zistená zvýšená koncentrácia cholesterolu u dojníc v strede laktácie. Literatúra 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. BESEDA, I. 1990. Nové aspekty štúdia metabolických porúch hovädzieho dobytka profilovými testami. Bratislava : SAV, 1990. s. 13. ISBN 80-224-0146-3. FEČKOVÁ, M. 2001.Hodnotenie vybraných ukazovateľov metabolického profilu djníc v podmienkach PD Močenok. Diplomová práca. 2001, s. 7. KANTÍKOVÁ, M. – BALÁŽIK, T. 2003. Diagnostika metabolických porúch alebo prevencia je vždy lacnejšia. In Slovenský chov, roč. 8, 2003, č. 7, s. 39-40. NOVANSKÁ, M. 1990. Dynamika zmien ukazovateľov metabolických testov dojníc a ich príčiny. Dizertačná práca. Nitra : VŠP. 1990. 115 s. NOVÁK, M. 2003. Aplikácia nových prípravkov firmy Medipharm Slovakia pri metabolických poruchách dojníc v praxi. In Slovenský chov, roč. 8, 2003, č. 5, s. 20. PAULOV, Š. 1980.Fyziológia živočíchov a človeka. Bratislava: SPN. 1980, 648 s. SLANINA, Ľ. et al. 1985. Klinická diagnostika vnútorných chorôb hospodárskych zvierat. 3. vyd. Bratislava : Príroda. 1985. 493 s. SLANINA, Ľ. – BESEDA, I. 1992. Metabolický profil hovädzieho dobytka vo vzťahu k zdraviu a produkcii. 2 vyd. Bratislava : ŠVS SR. 1992, ISBN 80-71-48-001-0. ORTUŤOU VYVOLANÉ ZMENY V SEMENNÍKOCH POTKANOV IN VIVO MERCURY INDUCED ALTERATIONS IN RAT TESTES IN VIVO Slivková J., Massányi P., Lukáč N., Kováčik J., Toman R.1 Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva SPU v Nitre,SR 1)Katedra veterinárnych disciplín, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov SPU v Nitre,SR Abstract In this study effects of mercury administration on the testicular structure of adult rats were evaluated. Wistar rats received mercury (as HgCl2) in single intraperitoneal dose 20 mg HgCl2 (group A), 10 mg HgCl2 (group B) and 5 mg HgCl2 (group C) per kilogram of body weight and were killed after 48 hours following mercury administration. After the preparation of histological samples the results were compared with control group (K). Qualitative analysis showed that the shape of seminiferous tubules was typically oval, without degenerative alterations. On the other hand, these observations revealed dilatation of blood vessels in interstitium, undulation of basal membrane and occurrence of empty spaces in 286 germinal epithelium. Decreased relative volume of germinal epithelium, increased relative volume of interstitium and increased occurrence of apoptosis suggests damaged interstitium and revealed occurrence of edemas. The relative volume of seminiferous tubules showed higher luminization. Also other evaluated criteria demonstrated significant differences between control group and experimental groups. This study reports a negative effect of mercury on the structure and function of testis. Úvod Ortuť patrí spolu s kadmiom a olovom k tým ťažkým kovom, ktorým sa vo svete venuje zvýšená pozornosť kvôli ich karcinogénnym, mutagénnym a teratogénnym účinkom. Živé organizmy nedisponujú homeostatickým mechanizmom, ktorý by reguloval koncentráciu ortuti v tkanivách. Z tohto dôvodu sa ortuť zaraďuje medzi tzv. abiogénne prvky. Zároveň je to nešpecifický jed , ktorý poškodzuje rôzne enzýmové systémy a tkanivá (Melicherčík a Melicherčíková, 1997). Medzi orgány, ktorých základom sú tkanivá zložené z viacerých typov buniek, patria samčie pohlavné orgány. Práve vzhľadom na rozmanitosť buniek tkanív samčích pohlavných orgánov, nám môžu reprodukčné orgány slúžiť ako citlivé indikátory negatívnych vplyvov exogénneho alebo endogénneho prostredia. Materiál a metodika V pokusoch sme použili pohlavne dospelých samcov (n=15) potkana laboratórneho Wistar, vo veku minimálne 6 mesiacov. Zvieratá boli rozdelené do štyroch skupín. Skupine A (n=4) sme aplikovali intraperitoneálne (i.p.) ortuť (20 mg.kg-1 živej hmotnosti) vo forme chloridu ortuťnatého (HgCl2), skupine B (n=3) v koncentrácii 10 mg HgCl2 .kg-1 živej hmotnosti, a v skupine C sme 3 potkanom aplikovali i.p. ortuť v koncentrácii 5 mg HgCl2.kg-1 živej hmotnosti. Posledná skupina – K (n=5) nám slúžila ako kontrola bez podania ortuti. Ortuť sme riedili do požadovanej koncentrácie fyziologickým roztokom. Po 48 hodinách sme potkanov usmrtili a odobrali sme vzorky obličiek na histologické a morfometrické analýzy. Vzorky sa fixovali v 10% formalíne, odvodnili vo vzostupnom rade alkoholu a zaliali do parafínu. Sériové rezy o hrúbke približne 10µm sme ukladali na odmastené a označené podložné sklíčka. Po narezaní sa rezy farbili prehľadným farbením hematoxylín – eozínom podľa platných metodík. Po zafarbení sa vzorky zamontovali do solakrylu a výsledkom sú trvalé histologické preparáty vhodné na hodnotenie svetelným mikroskopom. Na histologických preparátoch semenníkov sme subjektívne zhodnotili ich mikroskopickú stavbu rovnako ako aj stavbu semenotvorných kanálikov, intersticiálneho 287 tkaniva, Leydigových buniek, výskyt krvných kapilár v interstíciu, množstvo epitelu kanálikov a priebeh spermatogenézy. Na základe morfometrických kritérií sme v semenníku sledovali a kvantifikovali nasledujúce parametre: 1. relatívny objem (%) semenotvorného epitelu, interstícia a lúmenu 2. priemer (µm) semenotvorného kanáliku a lúmenu semenotvorného kanáliku 3. počet jadier na konštantnú plochu 4. výšku (µm) semenotvorného epitelu Dosiahnuté výsledky sme štatisticky zhodnotili použitím PC programu Excel. Ďalej sme vypočítali rozdiely medzi skupinami F –testom. Preukaznosť sme hodnotili na hladine P < 0,05. Výsledky Po intraperitoneálnej aplikácii troch rôznych koncentrácií ortuti vo forme HgCl2 sme u potkanov zistili hodnoty sledovaných parametrov. Výsledky získané zo všetkých štyroch skupín (K, A, B, C) sú uvedené a štatisticky vyhodnotené v tabuľke č.1 a v tabuľke č.2. Tabuľka 1 – Relatívny objem (%) semenotvorného epitelu, interstícia a lúmenu epitelu a počtu jadier plochu * P < 0,05 Tabuľka 2 – Hodnotenie priemeru semenotvorného kanálika, priemeru lúmenu kanálika, výšky semenotvorného na K A B C Priemer semenotvorného kanálika (µm) x 271,60 251,65 245,00* 218,67 SD 44,54 42,95 28,18 31,94 Semenotvorný epitel CV 16,40 17,07 11,50 14,61 x 77, 49 65, 11 71, 08 71, 24 Median 266 238 238 210 SD 5, 00 4, 56 3, 06 2, 68 Priemer lúmenu semenotvorného kanálika(µm) CV 6, 45 7, 00 4, 31 3, 76 x 135,36 122,15 133,93* 117,13 71, 32 SD 32,55 27,45 22,57 23,39 CV 24,05 22,47 16,85 19,97 Median 136 119 140 112 K Median 79, 09 A 66, 18 B 71, 69 C Interstícium x 5, 84 9, 68 9, 64 10, 25 SD 1, 26 2, 07 2,11 1, 74 x 68,32 69,83 61,00 54,13* CV 21, 58 21, 38 21,89 16, 98 SD 20,03 16,89 16,34 13,26 Median 5, 56 9, 56 9,93 9, 93 CV 29,32 24,19 26,79 24,50 Median 70 70 56 56 Lúmen Výška semenotvorného epitelu (µm) 2 x 16,67 25,21 19,28 18,51 Počet jadier na plochu µm SD 3,90 3,50 2,82 3,15 x 111,60 103,00 100,67 98,33 CV 23,40 13,88 14,63 17,02 SD 6,42 7,53 4,48 8,14 CV 5,75 7,31 4,45 8,28 Median 111 102 101 96 Median 15,69 24,82 19,12 17,65 288 Diskusia V experimentálnych skupinách sme sledovaním nami hodnotených parametrov zistili pokles relatívneho objemu semenotvorného epitelu a nárast relatívneho objemu interstícia, čo naznačuje edematizáciu semenníka. Aj napriek tomu, že je údajov o reprodukčnej toxicite ortute pomerne málo, vieme, že krvno – semenníková bariéra je pre ortuť priepustná (Lee, 1975). Chowdhury (1982) zistil, že HgCl2 zapríčiňuje degeneráciu semenníkov, bunkovú deformáciu tak v semenotvorných kanálikoch ako aj v Leydigových bunkách a preukázateľne aj zníženie hmotnosti semenníkov, a to u viacerých živočíšnych druhov. O pár rokov neskôr dospel k podobným výsledkom aj Sharma et al. (1996) ktorý tvrdí, že podanie HgCl2 spôsobuje redukciu plodnosti ako aj parametrov ejakulátu u myší. V prípade najtoxickejšej organickej formy ortuti - metylortuti sa predpokladá, že poškodzuje spermatogenézu deléciou zárodočných buniek a tak vyvolá závislú apoptózu (Homna – Takeda et al.,2001). Výsledky viacerých štúdií potvrdzujú cytotoxický účinok ortute na Sertoliho bunky a zároveň aj jej schopnosť akumulovať sa v intersticiálnych Leydigových bunkách ako aj v už spomenutých Sertoliho bunkách (Monsees et al., 2000; Ernst et al., 1991). V súlade s našimi výsledkami sú aj zistenia Marettu et al. (1995), ktorí zistili, že ortuť už v nízkych dávkach (5 ppm fenylortuti) zapríčiňuje zníženú pohyblivosť spermií a výskyt abnormálne sa vyvíjajúcich buniek. V prípade vyšších dávok (30 ppm fenylortuti) zistili výskyt abnormálneho zrenia spermií, zníženie objemu semena a zníženie množstva spermií. Všetky zistené hodnoty nami meraných parametrov naznačujú, že ortuť má v uvedených koncentráciách toxický účinok na celkovú štruktúru semenníkov a tým aj na priebeh spermatogenézy. Záver Z dosiahnutých výsledkov v tejto práci môžeme vyvodiť nasledovné závery: 1. Kvalitatívne pozorovania zaznamenali dilatáciu krvných ciev v interstíciu, unduláciu bazálnej membrány a objavenie sa prázdnych miest v niektorých oblastiach semenotvorného epitelu. 2. Najvyšší objem semenotvorného epitelu sme pozorovali v kontrolnej skupine. Vo všetkých pokusných skupinách bol zreteľný pokles relatívneho objem semenotvorného epitelu, ale v žiadnej skupine nebol preukázaný. Relatívny objem interstícia rovnako ako aj relatívny objem lúmenu bol nepreukázane vyšší vo všetkých pokusných skupinách. Tieto výsledky poukazujú na poškodenie a edematizáciu interstícia ako aj na zvýšenú luminizáciu kanálika. 289 3. Pri hodnotení priemeru semenotvorného kanálika sme zistili znižujúcu sa tendenciu, ktorá bola preukazná v skupine B. Po podaní ortuti dochádza k preukaznému zvýšeniu priemeru semenotvorného kanálika v skupine B, ale v skupine A a C sme sledovali tendenciu zníženej luminizácie kanálika. Výška semenotvorného epitelu vykazovala výrazný pokles po podaní ortuti a vo všetkých pokusných skupinách sa pohybovala od 68,32 do 54,13 µm. Preukaznosť bola dokázaná v skupine C. Pri hodnotení počtu viditeľných jadier na sledovanú konštantnú plochu sme zistili, že v kontrolnej skupine je ich 111,60 ale vo všetkých pokusných skupinách je počet jadier nižší. Z dosiahnutých výsledkov možno konštatovať, že aplikované koncentrácie ortuti vo forme HgCl2 majú negatívny efekt na štruktúru a následne aj na funkciu semenníkov. Práca bola riešená s podporou projektu APVV – 0299-06 a projektu VEGA 1/2417/05. Literatúra Ernst, E., Moller-Madsen, B., Danscher, G.: Ultrastructural demonstration of mercury in Sertoli and Leydig cells of the rat following methyl mercuric chloride or mercuric chloride treatment. Reprod. Toxicol., 5, 1991, 205209. Chowdhury A.R., Arora, U.: Toxic effect of mercury on testes in different animal species. Indian J. Physiol. Pharmacol., 26, 1982, 246-249. Lee, I.P., Dixon, R.L.: Effects of mercury on spermatogenesis studies by velocity sedimentation and serial mating. J. Pharmacol. Exp. Therap., 193, 1975, 171-181. Maretta, M., Marettova, E., Skrobanek, P., Ledec, M.: Effect of mercury on the seminiferous epithelium of the fowl testis. Acta. Vet. Hung., 43, 1995, 153-161. Melicherčík, M., Melicherčíková, D.: Bioanorganická chémia.: Chemické prvky a ľudská organizmus. Bratislava: Príroda, 1997. 188 s. ISBN 80-07-01028-9 Monsees, T.K., Franz, M., Gephardt, S., Winterstein, U., Schill, W.B., Hayatpour, J.: Sertoli cells as a target for reproductive hazards. Andrologia, 32, 2000, 239-246. Homma-Takeda, S., Kugenuma, Y., Iwamuro, T., Kumagai, Y., Shimojo, N.: Impairment of spermatogenesis in rats by methylmercury: involvement of stage- and cell- specific germ cell apoptosis. Toxicology. 169, 2001, 2535. Sharma, A.K., Kapadia, A.G., Fransis, P., Rao, M.V.: Reversible effects of mercuric chloride on reproductive organs of the male mouse. Reprod. Toxicol., 10, 1996, 153-159. KUMULÁCIA ZINKU V TKANIVÁCH A VAJCIACH JAPONSKÝCH PREPELÍC ZINC KUMULATION IN TISSUE AND JAPANESE QUAIL EGGS Skalická, M., Naď, P, Koréneková, B., Katedra výživy,dietetiky a chovu zvierat, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice, SR Abstract The effect long – term addition of zinc on quality of Japanese quail eggs and tissues was investigated. Japanese quails (n=48) were divided into 2 groups. Each group consisted of 24 birds. Group 1 was the control group. In the experimental group G3, Zn was administered 290 daily in form of water solution in dose 12 mg of Zn for one quail. The levels of Zn in tissues and eggs were evaulate vith method AAS. Key words: zinc, Japanse quail , egg, tissue Úvod V súčasnej dobe sa do popredia záujmu výskumu zaradili esenciálne prvky ako Cr, Cu, Mo, Se a Zn, ktoré majú mimoriadny význam pre organizmus v rade katalytických, enzymatických, aktivačných a regulačných procesoch. Zinok je esenciálny prvok pre zvieratá. Je súčasťou viacerých biochemických reakcií. Úloha zinku pre metabolizmus organizmu vyplýva z jeho účasti v štruktúre rozličných enzýmov, dehydrogenázy, aldolázy, fosfatázy, peptidázy a i. Viac než 70 enzýmov obsahuje zinok. Pri ďalších enzýmoch pôsobí ako ko-faktor (Zowczak-Drabarczyk et al., 2004). Jeho resorpcia je závislá od viacerých faktorov napr. vek, vzájomný pomer s inými elementami. Dokázalo sa to pri ošípaných, hydine a psoch. Deficit zinku sa pozoroval aj u hydiny. Nedostatok zinku narušuje aj reprodukciu. Narušená osteogenéza ako dôsledok karencie zinku sa zistila pri hydine (Kottferová, 1996). Cieľom experimentu bolo sledovanie hladín zinku v tkanivách, v bielku, žltku a škrupine vajec Japonských prepelíc. Materiály a metódy V experimente boli použité Japonské prepelice v počte 48ks, rozdelené do 2 skupín po 24ks. Skupina K bola kontrolná. V skupine 2 bol zinok denne podávaný vo forme vodného roztoku (ZnSO4.6H2O) v dávke 12 mg na jednu prepelicu. Prepelice boli kŕmené kompletnou kŕmnou zmesou HYD –10. Kŕmna zmes a voda boli podávané ad libitum. Podmienky experimentu boli v súlade s etickými požiadavkami. Biologický pokus trval 58 dní. Vzorky boli spracované mikrovlnným rozkladom a analyzované na prítomnosť Zn na AAS podľa metodiky, ktorú uvádza Kocourek, (1992). Štatistické analyzované Studentovým vyhodnotenie výsledkov bolo t - testom v programe Microsoft Excel 7,0 na hladine významnosti P ≤ 0,05; P ≤ 0,01 a P ≤ 0,001 medzi skupinami. Výsledky a diskusia V kontrolnej skupine na 50.deň sme zistili množstvo zinku v sledovaných tkanivách a vo vajciach Japonských prepelíc. V prsnej svalovine 29,506 mg.kg-1, v stehennej svalovine 291 51,076 mg.kg-1 , v pečeni 50,607 mg.kg-1 , vo vaječnom bielku 26,118 mg.kg-1 , vo vaječnom žĺtku 69,388 mg.kg-1 a v škrupine 76,505 mg.kg-1 zinku. Zn je nevyhnutný pre rast, operenie, rast dlhých kostí. Jeho množstvo v kŕmnej diéte nemalo by byť menej ako 25 mg.kg-1. Sahin and Kucuk (2003) navrhli, že suplementácia 60 mg Zn/kg KZ chráni prepelice pred negatívnymi účinkami tepelného stresu. Na druhej strane pri podaní vysokej dávky Zn sa organizmus homeostatickým mechanizmom vyrovnáva so zvýšeným príjmom Zn. V experimentálne skupine s dlhodobou aplikáciou zinku sme na 50. deň pozorovali, že množstvo Zn štatisticky významne sa zvýšil v bielku, žĺtku, v škrupine vajec a v prsnej svalovine Japonských prepelíc v porovnaní s kontrolnou skupinou. Štatisticky významne sa znížili hladiny Zn v pečeni a v stehennej svalovine (tab.1) Nami zistené množstvo Zn v žĺtku vajec (69,388 mg) z kontrolnej skupine bol vyšší ako uvádza Baumgartner a kol. (1999), ktorí zistili priemerný obsah zinku v žĺtku vajec Japonských prepelíc 46,02 mg. Prepeličie vajcia sú bohaté na minerálne látky a vitamíny. Obsahujú 1,1 % popolovín, z minerálnych látok na 100 g vaječnej hmoty 59 mg vápnika, 220 mg fosforu, 3,8 mg železa, 11,6 mg horčíka, 0,11 mg medi a 1,46 mg zinku. Z vitamínov obsahujú prepeličie vajcia v 100 gramoch vaječnej hmoty 300 m.j. vitamínu A, 0,10 mg vitamínu PP, 0,12 mg vitamínu B1, 0,85 mg vitamínu B2, 0,086 mg voľnej a 0,14 mg viazanej kyseliny listovej a 0,13 mg vitamínu B6. Z amínokyselín si zasluhuje pozornosť vysoký obsah metionínu, cysteínu, asparagínu, treonínu, serínu, glutamínu, izoleucínu a leucínu. Mbe a kol, (2003) uvádzajú, že vysoké hladiny Ca redukujú Zn absorpciu u dospelých prepelíc, ktorý sa prejavuje u vajec. Zistili, že dlhotrvajúci prídavok Zn spôsobil zníženie hladín Ca v škrupine. Množstvo zinku (mg.kg –1 ) v tkanivách a vajciach japonských prepelíc Hladiny zinku kontrola Zn n x sd xmax n x sd xmax 50.deň prsná stehenná svalovina svalovina 12 12 29,506 51,076 5,575 4,212 37,360 58,440 12 12 57,971** 30,584* 17,065 15,454 90,458 59,970 pečeň bielok žĺtok škrupina 12 50,607 11,087 61,200 12 44,497 10,970 50,887 12 26,118 1,707 28,420 12 71,089*** 4,965 77,930 12 69,388 20,356 98,050 12 53,840** 6,867 61,750 12 76,505 8,976 89,590 12 50,820** 3,369 55,654 * štatistická významnosť na hladine P ≤ 0,05; ** štatistická významnosť na hladine P ≤ 0,01; *** štatistická významnosť na hladine P ≤ 0,001. 292 Vysoký obsah Zn spôsobuje rozličné anémie organizmu. Nízke hladiny Fe dôsledku pridania vysokej dávky Zn sú redukované nízkou dávkou Ca alebo vysokou dávkou vitamínu D. Hmotnosť vajec je veľmi variabilná a pri nosivých plemenách Japonských prepelíc je v priemere 10,16g Hmotnosť vajec je na začiatku znášky nižšia a je silne závislá od výživy. V pomere k hmotnosti tela znáša prepelica veľké, približne 10 gramové vajcia, čo predstavuje 7,8 % zo živej hmotnosti. Nami aplikovaný prídavok zinku neovplyvnil priemernú hmotnosť vajec Japonských prepelíc, nakoľko v kontrolnej skupine bola na 50. deň 10,00 g a v experimentálnej skupine s prídavkom zinku bola priemerná hmotnosť vajec 10,11 g. Záver Z pokusu vyplýva, že prídavok Zn nebol pravdepodobne dostatočne využitý organizmom Japonských prepelíc a došlo ku nestabilite zinkovej väzby v tráviacom trakte. Preto je vhodné v praktickej výžive zvierat použiť zinok v organickej väzbe, ktorá zinok v nezmenenej forme dopraví do cieľového orgánu. Pomerne veľká časť mikroprvkov, ktoré zvieratá prijímajú krmivami, nie je využitá a neplní svoju biologickú funkciu. Literatúra 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. BAUMGARTNER, J. KONČEKOVÁ, Z., CSUKA, J., BENKOVA,J., ŠÁRNIKOVÁ K.B., SIMEONOVOVÁ,J.: Šľachtenie prepelice japonskej na obsah žĺtkového cholesterolu. In: Zborník referátov z vedeckej konferencie s medzinárodnou účasťou „Genetika a morfogenetika v chove HZ“ . Nitra : VÚŽV, 1999: 158 . MASSANYI, P., UHRIN, V., TOMAN, R., KOVACIK, J., BIRO, D.: Histological changes in the oviduct of rabbits after administration of cadmium, J. Animal Feed Sci., 8, 1999, 255-261. MBE,I.,RAPP, C., BAIN, MM., NYS, Y.: Supplementation of a corn – soybean meal diet with manganese, copper, and zinc from organic or inorganic sources improves eggshell quality in aged laying hens. Poult. Sci., 2003, 82, 1903-1913. KOCOUREK, 1999, Method's of analysis residues substance in food. (1992) Praha, Czech republic KOTTFEROVÁ J.: Residual contaminants of cadmium in relation to environmental protection, health and quality of food products, Dissertation work, Košice, 1996. SAHIN, K., KUCUK., O.: Zinc supplementation alleviates heat stress in Japanese quail, J. Nutrition., 133, 2003, 2808 –2811. STOEPPLER, M. 1991 In: Merian E.: Metals and their compounds in the environment. VCH Weinhem- NY - Basel - Cambridge, 803-852 ZOWCZAK-DRABARCZYK, M., TORLINSKA, T., ISKRA, M., MIELCARZ, G., MATYLLA, G., TORLINSKI, L.: Serum zinc concentration in patients colorectal cancer, Trace Elelements and Electrolytes 21, 2004, 236-239. Práca vznikla za podpory projektu VEGA 1/2410/05 293 ZMENY KVALITATÍVNYCH UKAZOVATEĽOV BRAVČOVÉHO MÄSA POČAS DLHODOBÉHO MRAZIARENSKÉHO USKLADNENIA THE CHANGES OF NUTRITIONAL CHARACTERISTICS OF PORK MEAT DURING THE LONG PERIOD OF FREEZING STORAGE Sopková, D. Ústav fyziológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, 041 81 Košice, SR Abstract Freezing is one of the most cautious ways of meat preservation. It enables long-term storage without application of chemical additives and significant side-effect. However, criteria of rozen meat have not been unambigously determined. The changes in the nutritional characteristics of pork meat (m. longissimus dorsi) of normal quality, and that of altered quality (PSE: pale, soft, exudative) were observed in dependence on the length of freezing storage. The aim was to deepen and to make objective the knowledge on the effect of freezing process on the parameters of quality of pork meat. During freezing storage, the differences in the contents of total proteins and aminoacids between the PSE and control meat were eliminated, the values of valine, lysine, leucine, custine, histidine and arginine significantly decreased, probably in the form of free aminoacids due to the elevated losses of meat juice after defreezing. Úvod Pre zabezpečenie plynulého zásobovania trhu mäsom a mäsovými výrobkami je nevyhnutná konzervácia a úschova potravín, ktorá v plnom rozsahu zachováva alebo len minimálne mení vlastnosti potravín. Z tohoto dôvodu je v popredí využívanie mraziarenskej techniky. Zmrazovanie potravín a ich uchovávanie v pásme teplôt pod -18 oC je veľmi výhodný spôsob konzervovania potravín, pretože nie je nutné aplikovať chemické prísady a potraviny si po rozmrazení uchovávajú svoje vlastnosti, ale kritériá kvality zmrazeného mäsa nie sú jednoznačne stanovené. Hodnotenie kvality zmrazeného mäsa sa vykonáva organolepticky a fyzikálno-chemickými metódami. Počas skladovania mäsa alebo roztokov izolovaných proteínových preparátov v zmrazenom stave dochádza k bočnej (side-to side) agregácii molekúl v prípade myozínu a aktomyozínu a agregácii alebo intramolekulárnej transformácii v prípade globulárnych proteínov (Matsumoto, 1990; Iguchi a kol.1991; Pástorová a kol. 1999, 2000). Toto vedie k zmenám v extrahovateľnosti, enzymatickej aktivity, viskozity a funkčných vlastností týchto 294 proteínov. Zníženie extrahovateľnosti v soliach rozpustných frakcií (v podstate myofibrilárne proteíny) a ATP-ázovej aktivity sú vo všeobecnosti považované za primárne indikátory zmien v dôsledku zmrazenia (denaturácia), pričom prvá z nich je považovaná za relatívnu mieru zmien vyskytujúcich sa v mäse počas skladovania pri negatívnych teplotách (Matsumoto, 1990; Partman, 1997). V práci sledujeme vplyv mraziarenských teplôt a dlhodobého mraziarenského skladovania na hodnoty aminokyselín s cieľom prehĺbiť poznatky o nutričných parametroch mrazeného bravčového mäsa. Materiál a metódy Materiál bol odoberaný na bitúnku, kde sa vyselektovalo dvanásť ošípaných s atypickým priebehom zrenia a následnými kvalitatívnymi zmenami mäsa PSE (pokusná skupina), a dvanásť ošípaných s normálnym priebehom zrenia mäsa (kontrolná skupina). Po porážke zvieraťa a 24 hodinovom chladení v chladiarni pri 4 oC, sme odoberali materiál na rozrábkovej linke vykostením karé priamo z bravčových polovičiek. Bravčové karé sa rozdelilo na dvanásť častí, jedenásť z nich bolo hlboko zmrazených prúdom chladeného vzduchu v zmrazovacích tuneloch pri -40oC, prúdení vzduchu 4-6 m.s-1 a uložených do mraziarenského skladu na dlhodobé uskladnenie pri teplote -18 oC, relatívnej vlhkosti 90-95%. Jedna vzorka bola určená na laboratórne vyšetrenia hneď po odobratí materiálu ako čerstvá surovina. Vzorky bravčového karé, skladované v mraziarni boli pravidelne v mesačných intervaloch z mraziarne vyberané a spracovávané. Vzorky pre stanovenie aminokyselín boli spracované kyslou hydrolýzou. Mäsový homogenát, prenesený do infúznych fliaš bol zaliaty 6N HCl. Hydrolýza prebiehala v sušičke pri 1100C ± 30C po dobu 24 hodín (Dičáková, 2005). Aminokyseliny boli analyzované klasickou metódou stĺpcovej chromatografie na ionexoch automatickým analyzátorom aminokyselín AAA T 339. Zastúpenie jednotlivých aminokyselín bolo vyjadrené v g.kg-1 a v mol.kg-1 celkového množstva aminokyselín. Matematicko–štatistické porovnanie jednotlivých parametrov medzi pokusnou a kontrolnou skupinou bolo robené Studentovým T-testom. Na vyhodnotenie dynamiky zmien jednotlivých testovaných parametrov v priebehu 12 mesačného mraziarenského skladovania sme použili test ANOVA a na porovnávanie kontrastov v rámci mesiacov TUKEY´S test. 295 Výsledky V mrazenom mäse medzi porovnávanými skupinami sme zistili: • porovnaním strát mäsovej šťavy - vysoko signifikantne (P<0,001) väčšie straty mäsovej šťavy v PSE mäse po prvom mesiaci mraziarenského skladovania a (P<0,01) po druhom mesiaci skladovania, v priebehu ďalších mesiacov sa rozdiely v množstve uvolnenej mäsovej šťavy medzi PSE a kontrolným mäsom zmenšujú a sú nesignifikantné • rozdiely v obsahu vody - medzi mrazeným PSE a kontrolným mäsom, na hladine významnosti (P<0,01) konštatujeme po 1., 2. a 3. mesiaci skladovania. Po 4., 5. a 6. mesiaci je už nižší obsah vody v PSE mäse menej signifikantný (P<0,05) a od siedmeho mesiaca sa obsah vody v sledovanom mäse takmer vyrovnáva a rozdiely napriek neustálemu poklesu sú štatisticky nevýznamné • pomerne vyrovnané hodnoty celkových bielkovín v PSE a kontrolnom mäse prezentujú len malé rozdiely medzi porovnávanými skupinami, signifikantne vyššie (P<0,05) hodnoty celkových bielkovín boli v čerstvom PSE mäse v porovnaní s kontrolnou skupinou a tiež v PSE mäse po prvom mesiaci skladovania. V ďalších mesiacoch sú rozdiely medzi porovnávanými skupinami štatisticky nevýznamné. Počas skladovania sledovaním dynamiky zmien v rámci skupín sme zaznamenali: Zvyšujúce sa percento strát mäsovej šťavy u obidvoch sledovaných skupín v závislosti od dĺžky mraziarenského skladovania: • v PSE mäse signifikantné zvýšenie (P<0,01) sme zistili po 7., 8., 9. mesiaci a vysoko signifikantné zvýšenie (P<0,001) po 10. a 11. mesiaci mraziarenského skladovania • v kontrolnom mäse vysoko signifikantne (P<0,001) stúplo množstvo uvolnenej mäsovej šťavy už po piatom mesiaci mraziarenského skladovania a stúpajúcu tendenciu si udržalo až do konca mraziarenského skladovania. Obsah vody v PSE a kontrolnom mäse v závislosti od dĺžky mraziarenského skladovania priamo súvisel a odzrkadľoval zvyšujúce sa straty mäsovej šťavy v priebehu skladovania: • v PSE mäse sme zaznamenali signifikantný pokles (P<0,01) obsahu vody v porovnaní s čerstvou surovinou po štyroch mesiacoch a vysoko signifikantný pokles (P<0,001) od piatich mesiacov skladovania • v kontrolnom mäse intenzívnejší pokles obsahu vody, signifikantné zníženie (P<0,05) už po treťom mesiaci, od štvrtého mesiaca mraziarenského skladovania vysoko signifikantné (P<0,001) zníženie obsahu vody 296 Hodnoty celkových bielkovín v priebehu mraziarenského skladovania mierne klesali, predovšetkým v PSE mäse, tento pokles bol však štatisticky nevýznamný. HODNOTY AMINOKYSELÍN V TESTOVANOM MÄSE V priebehu 12 mesačného mraziarenského skladovania zaznamenávame: • signifikantný pokles u esenciálnych aminokyselín: valínu od 7. mesiaca (P<0,001), lyzínu od 8. mesiaca (P<0,01) a leucínu od 10. mesiaca (P<0,01), • signifikantný pokles neesenciálnych aminokyselín konštatujeme u cystínu od 6. mesiaca (P<0,001), histidínu od 9. mesiaca (P<0,01) a arginínu od 10. mesiaca (P<0,01) • signifikantné zvýšenie sme zaznamenali u esenciálneho izoleucínu od 6. mesiaca a fenylalanínu od 7. mesiaca skladovania na hladine významnosti (P<0,05) a u neesenciálnej kyseliny glutámovej od 3. mesiaca (P<0,001) v kontrolnej skupine • štatisticky nevýznamné kolísanie hodnôt aminokyselín konštatujeme u esenciálneho treonínu, metionínu a neesenciálneho alanínu, tyrozínu, kyseliny asparágovej, glycínu, prolínu a serínu Záver V priebehu mraziarenského skladovania sa rozdiely v obsahu celkových bielkovín a aminokyselín medzi PSE a kontrolným mäsom eliminujú, pravdepodobne vplyvom zvýšených strát mäsovej šťavy v kontrolnom mäse po rozmrazení a následným znížením obsahu vody, takmer na hodnoty PSE mäsa. Na základe týchto výsledkov predpokladáme, že hodnoty valínu, lyzínu, leucínu, cystínu, histidínu a arginínu sa znižujú vplyvom zvýšených strát mäsovej šťavy v podobe voľných aminokyselín. V priebehu mraziarenského skladovania sa signifikantne zvýšili hodnoty izoleucínu, fenylalanínu a kyseliny glutámovej, kde pravdepodobne nedochádza k stratám v podobe voľných aminokyselín stratou mäsovej šťavy a zvýšenie hodnôt môže byť čiastočne zapríčinené zvyšujúcimi sa stratami vody v priebehu mraziarenského skladovania a tým vyššou koncentráciou svalových proteínov. Literatúra Dičáková, Z.: Mliekarstvo, 36, 2: 28-31, 2005. Iguchi, S.M.M., Tsuchiya, T., Matsumoto, J.J.: Bull. Japa. Soc. Sci. Fish., 47, 11, 1991, 1499. Matsumoto, J.J.: Chemical Deterioration of Proteins. Eds. Whitaker J.R., Fujimaki, M., ACS Symposium Series 123, American Chem. Soc., Washington D.C., 1990, 95. Partman, W.: Z. Ernährungswiss, 16, 1997, 167. 297 Pástorová,B., Molnárová,M., Staníková,A: Phys. Res., 48, 3: 17, 1999. Pástorová,B., Staníková,A., Molnárová,M., Halagan,J., Buleca,J.: Acta Vet. Hungar, 48(1), 107-111, 2000. ANALÝZA PRODUKTOV DEGRADÁCIE LIPIDOV V TUKOVOM TKANIVE OŠÍPANÝCH THE ANALYSIS OF PRODUCTS OF HYDROLYTIC AND OXIDATIVE DEGRADATION OF ADIPOSE TISSUE Sopková D., Staníková A., Pástorová B. Ústav fyziológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, 041 81 Košice, SR Abstract The changes in the basic lipid constants (peroxidation number, number of fat acidity and thiobarbituric acid) of pork meat (m. longissimus dorsi) of normal quality, and that of altered quality (PSE: pale, soft, exudative) were observed in dependence on the length of freezing storage. The aim was to deepen and to make objective the knowledge on the effect of freezing process on the parameters of quality of pork fat. Statistically significant changes in the basic lipid constants in thermally untreated frozen pork fat occur in general after month 6 of freezing storage in both groups. Úvod Tuk ošípaných a hydiny má pomerne vysoký obsah nenasýtených mastných kyselín, čo ovplyvňuje jeho konzistenciu a náchylnosť na oxidáciu (Pipová a kol. 1995; Byrne a kol. 2002).Na výslednú kvalitu tuku získaného z jatočných zvierat majú vplyv intravitálne faktory, ako je druh zvieraťa, jeho pohlavie, vek, zloženie kŕmnej dávky, a lokalizácia v tele živočícha (Enser a kol. 2000), ale tiež fyzické zaťaženie, zlé zaobchádzanie so zvieratami a iné stresové faktory pôsobiace tesne pred odporazením zvyšujú spotrebu energie, čo spôsobuje zvýšenie počtu voľných radikálov v bunkách, ktoré značne urýchľujú oxidatívnu degradáciu tuku post mortem (Bystrický a kol. 1999; Máté a kol. 1999). Pretože produkty oxidatívnej degradácie veľmi výrazne negatívne ovplyvňujú organoleptické vlastnosti potravín, ich analýze sa venuje veľká pozornosť. Existuje celý rad metód, od tých najjednoduchších kvalitatívnych až po veľmi presné analytické metódy (Bakalová a kol. 2000; Fenaille a kol. 2001). Finálnym produktom, ktorý vzniká v najväčšom množstve je malonyldialdehyd (Marcinčák a kol. 2002; Faix a kol. 2005). Pri hlbokej oxidácii tukov vznikajú cyklické peroxidy a z nich hydroxykyseliny, tzv. lojovatenie tukov. 298 Počas získavania, spracovávania a skladovania tukov dochádza k chemickým zmenám, ktoré senzoricky a dieteticky znehodnocujú tuky a sú zdrojom zdraviu škodlivých zlúčenín. Stres a zlé zaobchádzanie so zvieratami tesne pred porážkou zvyšuje počet voľných radikálov a hladinu adrenalínu v organizme, čo značne urýchľuje degradáciu tuku post mortem. Zamerali sme sa preto na analýzu produktov hydrolytickej a oxidatívnej degradácie lipidov normálneho a PSE mäsa v priebehu 12-mesačného mraziarenského uskladnenia. Materiál a metódy Dvanásť ošípaných s atypickým priebehom zrenia mäsa a následnými kvalitatívnymi zmenami mäsa PSE tvorilo pokusnú skupinu, a dvanásť ošípaných s normálnym priebehom zrenia mäsa kontrolnú skupinu. Po porážke zvieraťa a 24 hodinovom chladení v chladiarni pri 4 oC, sme odoberali materiál na rozrábkovej linke vykostením karé priamo z bravčových polovičiek, na ktorých bola ponechaná minimálne 2 cm vrstva chrbtovej slaniny, potrebná na stanovenie kvality tukovej zložky mäsa. Bravčové karé sa rozdelilo na dvanásť približne rovnakých častí, jedenásť z nich bolo hlboko zmrazených prúdom chladeného vzduchu v zmrazovacích tuneloch pri -40oC, prúdení vzduchu 4-6 m.s-1 a uložených do mraziarenského skladu na dlhodobé uskladnenie pri teplote -18 oC, relatívnej vlhkosti 90-95%. Jedna časť bola určená na laboratórne vyšetrenia hneď po odobratí materiálu ako čerstvá surovina. Materiál na stanovenie kvality tukovej zložky mäsa: ¾ peroxidové číslo (PČ) metódou podľa Helclová a kol. (1991) ¾ číslo kyslosti tukov (ČKT) metódou Helclová a kol. (1991) ¾ tiobarbiturové číslo (TBA) metódou podľa Bulla a Marnetta (1985) bol skladovaný v mraziarni a pravidelne v mesačných intervaloch z mraziarne vyberaný a spracovávaný. Matematicko–štatistické porovnanie jednotlivých parametrov medzi pokusnou a kontrolnou skupinou bolo robené Studentovým T-testom. Na vyhodnotenie dynamiky zmien jednotlivých testovaných parametrov v priebehu 12 mesačného mraziarenského skladovania sme použili test ANOVA a na porovnávanie kontrastov v rámci mesiacov TUKEY´S test. 299 Výsledky V tukovom tkanive medzi porovnávanými skupinami konštatujeme, že: • hydrolytické zmeny tukovej zložky sú prezentované vo všeobecnosti vyššími hodnotami ČKT v PSE skupine ako v skupine kontrolnej • signifikantne vyššie (P<0,05) sú hodnoty ČKT v prvom, druhom a ôsmom mesiaci mraziarenského skladovania • oxidačné zmeny zaznamenané PČ sme zistili v kontrolnej skupine, signifikantne vyššie (P<0,001) hodnoty PČ v šiestom mesiaci a (P<0,05) vo štvrtom, piatom a siedmom mesiaci skladovania • maximálnu prípustnú hodnotu PČ 6 mmol.kg-1 tuku sme u obidvoch sledovaných skupín namerali v jedenástom mesiaci skladovania • rozdiely v TBA čísle medzi pokusnou a kontrolnou skupinou sú štatisticky nevýznamné V priebehu mraziarenského skladovania. Porovnaním hodnôt základných tukových konštánt počas 12-tich mesiacov mraziarenského skladovania s čerstvou surovinou a zhrnutím dosiahnutých výsledkov medzi skupinami sme zistili, že k štatisticky významným zmenám v tepelne neošetrenom mrazenom bravčovom tuku dochádza: • ČKT po šiestom mesiaci uskladnenia v obidvoch sledovaných skupinách (hodnoty nad 1 mg KOH.g-1) • PČ po šiestom mesiaci uskladnenia v PSE skupine, v kontrolnej skupine po štvrtom mesiaci uskladnenia (hodnoty 3,5 až 4,2 mmol.kg-1) • TBA po šiestom mesiaci uskladnenia v kontrolnej skupine, po siedmom mesiaci uskladnenia v PSE skupine (hodnoty 0,9 až 1 mmol.kg-1) Záver Analýzou výsledkov získaných pri sledovaní kvality čerstvého tukového tkaniva jatočne opracovaných tiel ošípaných sme zistili, že hydrolytické poškodenie tukového tkaniva je ovplyvnené stresovými faktormi pôsobiacimi pred porážkou. Zaznamenali sme signifikantne vyššie hodnoty čísla kyslosti tukov u ošípaných s kvalitatívne zmeneným PSE mäsom. Nezistili sme však štatisticky významne vyššie hodnoty produktov oxidatívnej degradácie tukov v čerstvej surovine medzi pokusnou a kontrolnou skupinou, čo je v súlade 300 s výsledkami BYSTRICKÝ a DIČÁKOVÁ (1998); BYSTRICKÝ a kol. (1999). Hodnoty primárnej oxidatívnej degradácie lipidov už v čerstvom tukovom tkanive obidvoch skupín ošípaných sú však všeobecne vyššie (PČ PSE skupina 2,35; kontrolná skupina 2,31mmol.kg-1) a naznačujú, že toto poškodenie je podmienené aj inými faktormi ako stresovým zaťažením. Skladovanie takejto suroviny vedie k urýchleniu oxidatívnych zmien v tukovej zložke aj pri mraziarenských teplotách. Deštruované bunky tkanív sú bohatým zdrojom nenasýtených mastných kyselín, tvoriacich vnútrobunkové štruktúry. Tieto sú v priebehu propagačnej fázy autooxidácie zdrojom voľných radikálov a urýchľujú produkciu hydroperoxidov a peroxidov mastných kyselín aj v ostatných tukoch. Po zvýšení teploty dochádza k rýchlemu priebehu terminálnej fázy autooxidácie, produkcii terminálnych produktov oxidatívnej degradácie lipidov – tuchnutie tukov. Danému problému je možné predísť predovšetkým: • maximálnou možnou elimináciou stresu zvierat in vivo a predovšetkým ante mortem • suplementáciou krmiva antioxidantmi, hlavne v tuku rozpustným vitamínom E • dodržiavaním teplôt v mraziarenských skladoch s maximálnym zvýšením teploty na -15 oC, tak ako to stanovuje POTRAVINOVÝ KÓDEX SR Súčasná legislatíva nestanovuje požiadavky pre sledovanie základných tukových konštánt (ČKT, PČ, TBA) v čerstvej a mrazenej surovine. Tretia časť POTRAVINOVÉHO KÓDEXU SR ustanovujúca konkrétne požiadavky pre všetky komodity v piatej hlave konkretizuje len osobitné požiadavky pre škvarené živočíšne tuky vrátane bravčovej masti. V zmysle NARIADENIA VLÁDY SR č. 286/2003 z.z, Prílohy č.4 v časti B, ustanovujúcej osobitné hygienické požiadavky pre živočíšne tuky a mäsové výrobky tiež absentuje čerstvá a mrazená surovina. Na základe našich zistení navrhujeme legislatívne stanoviť požiadavky na čerstvé a mraziarensky ošetrené tukové tkanivo. Literatúra BAKALOVA, R., MILEVA, M., KOTSEV, CH., BARDAROV, V., RIBAROV, St.: Determination of malondialdehyde in biological samples by solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography. Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 22,2000, 267-269. BYRNE, D.V., BREDIE, W.L.P., BAK, L.S., BERTELSEN, G., MARTENS, H., MARTENS, M.: Sensory and chemical analysis of cooked porcine meat patties in relation to warmed-over flavour and pre-slaughter stress. Meat Science, 59, 3, 2002, 229-249. BYSTRICKÝ, P., DIČÁKOVÁ, Z.: Živočíšne tuky v potravinách. Slov. vet. čas., Supl. 1, 1998, 3–42. BYSTRICKÝ, P., DIČÁKOVÁ, Z., PAULSEN, P.: Oxidačné zmeny v tukovom tkanive ošípaných. Hygiena Alimentorum XX, 1999, 48-50. ENSER, M., RICHARDSON, R.I., WOOD, J.D., GILL, B.P., SHEARD, P.R.: Feeding linseed to increase the n3 PUFA of pork: fatty acid composition of muscle, adipose tissue, liver and sausages, Meat-Science, 55, 2000, 201-212. 301 FAIX, S., FAIXOVÁ, Z., BOLDIZAROVÁ, K., JAVORSKÝ, P.: The effect of long-term high heavy metal intake on lipid peroxidation of gastrointestinal tissue in sheep,Vet. Med.- Czech, 50, 2005 (9):401-405. FENAILLE, F., MOTTIER, P., TURESKY, R.J., ALI, S., GUY, P.A.: Comparison of analytical techniques to quantify malondialdehyde in milk powders. J. Chromatogr. A, 921, 2001, 237-245. MARCINĆÁK, S., TUREK, P., SOKOL, J., POPELKA, P., BYSTRICKÝ, P.: Determination of malondialdehyde in pork by HPLC as the 2,4-dinitrophenylhydrazine derivate. Folia Veterinaria, 46, 3, 2002, 135-138. MÁTÉ, D., TUREK, P., KORIMOVÁ, Ľ.: Využitie prírodných antioxidantov v mäsovej výrobe. Hygiena Alimentorum XX, 1999, 148-149. PIPOVÁ, M., CABADAJ, R., NAGY J.: Hygiene of Poultry ,Eggs, Fish, and Game. Datahelp Košice, 1995, 110 s. MORFOLOGICKÉ ZMENY V MATERNICI OVIEC PO APLIKÁCII CLOPROSTENOLU A EKVÍNNEHO CHORION-GONADOTROPÍNU MORPHOLOGICAL CHANGES IN THE UTERUS OF SHEEP AFTER APPLICATION OF CLOPROSTENOL AND EQUIN CHORION GONADOTROPINE Staníková, A., Pástorová, B., Halagan, J., Sopková, D., Maraček, I. Ústav fyziológie, Katedra normálnej anatómie, histológie a fyziológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice Abstract Qualitative and quantitative histological changes in the uterus Slovak merino sheep were investigated following the synchronization and hormonal treatment. The investigations were carried out on 40 sheep in the period of physiological anoestrus. Oestrus induction in anoestrus sheep was achieved by intravaginal instillation of fluorogestonacetate (40mg/sponge) oestrus was detected 2 – 5 days after removal of sponges. During inducted oestrous cycle in sheep on 7 day were administered of Cloprostenol (synthetic PGF2α) 250 ng/head, as first injection on day 1 and as second injection on 11 days was used in sheep that did not responded on first treatment. Next day after first application of Cloprostenol was administrated of the equine chorione gonadotropine (eCG) hormone in dose of 750, 1000 and 1500 IU. The animals were killed on average 72 h following the Cloprostenol injection. The uterus samples were processed by common histological methods for examination under a light microscope and under an electron microscope. A scanning electron microscope Stereoscan Cambridge 2A and Joel were used to examine the samples. Our investigations showed that the administration of PGF2α resulted in a less significant decrease in the mass of uterus (p<0.05) than that observed after the application of eCG (p<0.001). An increase in the uterus cervix mass, observed following the administration of PGF2α was of low significance (p<0.1) however that recorded after the administration of eCG (750 and 1500 IU) was more significant (p<0.01) and the most significant increase was elicited by administration of 100 IU eCG (p<0.001). 302 The number of glands in the uterus cervices increased significantly (p<0.05) only after the highest administered dose of eCG (1500 IU), however the epithelium height increased significantly (p<0.001) after all doses of the hormones administered (i.e. also after PGF2α). The height of the surface epithelium of cervix increased on the level of significance p<0.001 following the administration of all hormonal preparations tested. Higher statistical significance was recorded for changes in the cervical epithelium. Cervical epithelial cilia of experimental sheep were many times elongated in comparison with those in the control animals. Secondary and tertiary projections were also observed. SEM examinations showed that the cervical epithelial surface was covered with dense microvillus and cilia and secretion blebs cud be observed in many places. The administration of oestrus inducing preparations elicits responses in the uterus of anoestrus sheep similar to those observed during the natural oestrus. Key words: anoestrus, induction of oestrus cycle, sheep, uterus, histology, light and electron microscope, observations. Úvod Pre úspešné zvládnutie riadenej reprodukcie je dôležité poznať funkcie regulačných mechanizmov, ale aj úlohu gonadotropných, steroidných a tkanivových hormónov [1,9,10], podieľajúcich sa na riadení a udržiavaní fyziologických estrálnych cyklov a funkcií orgánov, počnúc hypotalamom, hypofýzou, vaječníkmi až maternicou [6,7,17]. Aktivita endokrinných štruktúr regulujúcich pohlavné funkcie je ovplyvňovaná optimálnou látkovou výmenou a krvením [12] v neuroendokrinných štruktúrach. V dostupnej literatúre sú známe práce, ktoré sa zaoberajú štúdiom zmien pohlavného aparátu u rôznych druhov zvierat počas estrálneho cyklu a za rôznych experimentálnych podmienok [2,3,8]. Tieto morfologické zmeny sa navonok prejavujú predovšetkým zmenou koncentrácií gonadotropíny uvoľňujúcich hypofyzárnych a ovariálnych hormónov, ako aj histologickými zmenami cieľových orgánov, ktoré tieto hormóny produkujú. Na ovariálnej činnosti závisí stav vajcovodu a maternice [11,15]. Cieľom našej práce bolo získanie objektívnych funkčne – morfologických údajov o charakteristike zmien maternice oviec po hormonálnom ovplyvnení. Materiál a metodika Do pokusu sme zaradili 40 oviec plemena slovenské merino, 2 – 4 ročných v období fyziologického anestru. Zvieratá boli chované za štandardných podmienok a boli rozdelené do 303 piatich skupín. Estrálny cyklus oviec v anestrickom období sme indukovali fluórogestonacetátom (40 mg/ intravaginálnu špongiu) v trvaní 12 dní. Ruja bola detegovaná 2 – 5 dní po vybratí špongií. V prebiehajúcom estrálnom cykle na 7. deň od zaznamenanej ruje sa i. m. injikovala prvá dávka cloprostenolu (PGF2α) 250 ng/kus ako 1. deň ošetrenia a oviec, ktoré na prvé podanie PGF2α neodpovedali na 11. deň cyklu boli ošetrené druhou dávkou cloprostenolu. Nasledujúci deň po prvej dávke cloprostenolu boli ovce ošetrené ekvínnym choriovým gonadotropným (eCG) hormónom v dávkach 750, 1000 a 1500 IU. Zvieratá boli vykrvené v priemere 72 hodín od aplikácie eCG. Maternice pre štúdium v svetelnom mikroskope sa fixovali v médiu formalín – sublimát – kyselina octová ( v objemových dieloch 4 : 1 : 2). 6 nm hrubé parafínové rezy sme farbili hematoxylín – eozínom. Vzorky maternice pre štúdium v rastrovacom elektrónovom mikroskope sa premývali fosfátovým pufrom, potom Karnovského roztokom a dofixovali 3% roztokom glutaraldehydu v kakodylátovom pufri (pH všetkých roztokov bolo 7,4 a teplota 4 ºC). Potom nasledovalo spracovanie vzoriek podľa M u r a k a m i h o a kol. [13] dehydratácia etylalkoholom, sušenie metódou kritického bodu, pozlátenie vo vákuu a prehliadanie v rastrovacom elektrónovom mikroskope Stereoscan Cambridge 2A a Jeol. Výsledky Zistili sme, že hmotnosti materníc sa po podaní PGF2α zvyšovali na nižšej hladine významnosti (p<0.05) ako po stimulácii PMSG (p<0.001). Hmotnosť maternicových krčkov sa po aplikácii PGF2α zvyšovali len na nízkej hladine významnosti (p<0.1) ale po podaní PMSG (750 a 1500 IU) sa hladina významnosti zvyšovala (p<0.01) a najvyššia bola po podaní 1000 IU PMSG (p<0.001). Odpoveď krčku maternice na superovulačné stimulácie sa prejavila aj zmenami v počte žliaz, zmenami výšky epitelu žliaz ako aj zmenami výšky povrchového epitelu krčku maternice u synchronizovaných a hormonálne stimulovaných oviec, ktorých štatistická významnosť sa zvyšovala so zvyšujúcou sa dávkou podaných hormónov. Počty žliaz krčku maternice sa signifikantne zvyšovali (p<0.05) až po najvyššej podanej dávke PMSG (1500 IU) ale výška ich epitelu sa signifikantne zvyšovala (p<0.001) po všetkých dávkach podaných hormónov (teda aj PGF2α). Výška povrchového epitelu krčku maternice sa zvyšovala po podaní všetkých dávok hormonálnych preparátov na úrovni p<0.001. Tieto zmeny sú štatisticky významnejšie u epitelu krčka maternice. Sliznica cervixu u kontrolných zvierat tvorí nižšie riasy, z ktorých vystupujú len ojedinelé sekundárne výbežky. Slizničné riasy v cervixe sa po hormonálnom ovplyvnení na rozdiel od kontrol mnohonásobne predĺžili a sú tu prítomné sekundárne alebo aj terciárne 304 výbežky. Aj tu je zreteľné bohatšie zastúpenie žliaz. Z pozorovaní pomocou rastrovacieho elektrónového mikroskopu sme zistili, že povrch sliznice cervixu u hormonálne stimulovaných oviec pokrývajú husté mikroklky a cílie, ktoré na určitých miestach tvoria buď súvislú vrstvu alebo tvoria ojedinelé trsy. Na mnohých miestach sme pozorovali väčšie sekrečné granuly (blebs). Diskusia a záver Synchronizácia cyklu u oviec s cyklickým žltým telieskom je najúspešnejšia v období včasnej luteálnej fázy, pretože aktivite cyklického žltého telieska počas exogénnej progesterónovej dominancie sa nezamedzí. K luteolýze dochádza stimuláciou uvoľnenia uterinného prostaglandínu. Samotný prostaglandín sa indukuje odňatím, alebo doznením exogénneho zdroja gestagénu [14], čím narastá koncentrácia estradiolu po odznení dominancie progesterónu s priamym pôsobením na maternicu. Ako vhodný hormón pre superovuláciu sa používa eCG, pre svoj skorý účinok a jednoduchý spôsob podávania [9]. Prostaglandín F2α patrí medzi vazokonstriktory maternicových ciev a stimuluje kontrakcie maternice [3] a je dôležitý pre luteolýzu a následne ovplyvňuje folikulogenézu v štádiu výberu v procese dominancie a nadväzne i ovuláciu resp. ovulačný pomer (ovulation rate OR). Výskyt cílií v maternici študovali viacerí autori [4,16], ktorí sa domnievajú, že bunky s vysokou mitotickou aktivitou nemajú cílie a že cílie sa vytvárajú iba pred delením buniek, ktoré sú stimulované estradiolom. Počas pohlavného cyklu prechádza sliznica maternice radom zmien, ktoré sa sústreďujú do dvoch základných procesov – proliferácie a sekrécie. D a v i e s a H o f f m a n [5] tvrdia, že nástup mitotickej aktivity epitelu maternice v procese proliferácie nie je závislý od progesterónovej aktivity, ale je stimulovaný a udržiavaný estrogénovou aktivitou a na základe pozitívnej spätnej väzby produkciou LH z hypofýzy. Z uvedeného vyplýva, že po hormonálnom ovplyvnení oviec 1500 IU PMSG sme na sliznici krčku maternice pozorovali zvýšený výskyt cílií usporiadaných v trsoch, alebo na iných miestach tvoria súvislú vrstvu. Aj proces sekrécie je riadený hormonálne, to znamená, že existuje priamy vzťah steroidných hormónov k sekrečnej činnosti. Je známa skutočnosť, že progesterón má za následok zníženie množstva sekrétu . Dosiahnuté výsledky prinášajú návody na zistenie optimálnych dávok a kombinácií hormonálnych preparátov používaných na superovuláciu s priaznivým biologickým účinkom na reprodukčnú schopnosť oviec s minimálnymi vedľajšími účinkami na reprodukčné orgány. 305 Literatúra 1. ARENDARČIK, J., - MAROSSY, A., - ITZE, L. (1974): Účinok syntetického LH- RH a L –Dopa na hladinu LH v sére oviec určovaný rádioimunotestom (RIA). In : Čsl. Fyziol., vol. 23, 1974, pp. 250 – 251. 2. BEŇOVÁ, K., - TOROPILA, M., - FALIS, M., - PALUCHOVÁ, K., - NOVÁKOVÁ, J.(2001): The effect of ionising radiation on an organism in dependence on the dose, type, age and sex (In Slovak ). Proc: Topical problems of bioclimatology of animals., VFÚ Brno, 2001, pp. 10 – 11. 3. CLARK, K. E., - AUSTIN, J. E., - STYS, S. J. (1981): Prostaglandins. vol. 22, 1981, pp. 333 – 348. 4. CLARK, M. V. – BRIENSFIELD, T. H. (1973) : Ciliated stromal cells in the hamster uterus. In : Biol. Reprod., vol. 8, 1973. 5. DAVIES, J. – HOFFMAN, L. H. (1973) : Studies on the progestational endometrium of the rabbit. In : Amer. J. Anat., vol. 137, 1973, pp. 423 – 446. 6. HRIŇÁKOVÁ, G. (2005) : Funkčná histológia povrchového epitelu a žliaz endometria bahníc po ukončenom puerpériu. 48. kolo ŠVOČ, 2005. 7. KRAJNIČÁKOVÁ, M., - CIGÁNKOVÁ, V., - LENHARDT, Ľ., - KOSTECKÝ, M., - MARAČEK, I. (2002) : Functional and Morphological Evaluation of the Mucosa of Endometrium and Oviduct in Postpartum Goats. In : Acta Vet. Brno, vol. 71, 2002, pp. 517 – 522. 8. KRAJNIČÁKOVÁ, M., - KOSTECKÝ, M., - DANKO, J., - LENHARDT, Ľ., - CIGÁNKOVÁ, V., MARAČEK, I. (2002) : Biometric. Idices of the uterus and oviducts in post – parturient goats. In : V. košický morfologický deň s medzinárodnou účasťou, Zborník referátov, Košice, 31. máj 2002, pp. 143 – 144. 9. MARAČEK, I. (1991) : Niektoré aspekty regulácie a riadenia reprodukčného cyklu a sexuálnych funkcií plemeníc prežúvavcov. Doktorská dizertačná práca, Košice, 1991. 10. MAROSSY, A., - ARENDARČIK, J. (1974): Vplyv LH – RH , L – Dopa a hypofyzárneho extraktu ošípaných deleného na Sephadexe G – 25 na hladinu FSH a LH v krvnom sére anestrálnych oviec. In : Čsl. Fyziol., vol. 23, 1974, pp. 266 – 267. 11. Mc DONALD, L. E. (1975) : Veterinary endocrinology and reproduction. Lea and Febiger, Philadelphia, 1975. 12. MITRO, A., - JALČ, P., - MAROSSY, A., - DAXNEROVÁ, Z., - POMFY, M., MARŠALA, J. (1983): Model of irreversible complete cerebral ischemia. In : Biologia., vol. 38, 1983, pp. 679 – 682. 13. MURAKAMI, I., - YAMAMOTO, K., - ITHOSIMA, T. (1977): Modified tanninosmium conductive staining method for noncoated SEM specimens and aplication to icrodissection SEM of spleen. In : Arch. Histo. JAP., vol. 40, 1977, pp. 35 – 40. 14. SMITH, J. F. – FAIRCLOUGH, R. J. – PETERSON, A. J. (1979) : Plasma levels of progesterone, Provera, oestradiol – 17 beta and 13, 14 – dihydro- 15- Keto prostaglandin F in cows treated with Provera impregnated sponges. In : J. Reprod. Fert., vol. 55, 1979, pp. 359 – 364. 15. STANÍKOVÁ, A., - RAJTOVÁ, V., - MOLNÁROVÁ, M., - PÁSTOROVÁ, B., - HALAGAN, J. (2000) : Qualitative and quantitative changes in the oviducts of ewess after hormonal stimulation. In : Czech J. Anim. Sci., vol. 45, 2000, pp. 11 – 15. 16. TACHI, S. (1974) : Influence of ovarian hormones on formation of solitary cilia and behaviour of the centrioles in uterine epithelial cells of the rat. In : Biol. Reprod., vol. 10, 1974. 17. UHRÍN, V. (1992 ) : Funkčná morfológia epitelov vajcovodu a maternice kravy. VÚŽV Nitra, Vydavateľstvo SAP – Slovak Academic Press, s.r.o. Bratislava, 1992, pp. 80 – 140. 306 KONZUMÁCIA MLIEKA A MLIEČNYCH VÝROBKOV U SLOVENSKEJ POPULÁCIE MILK AND DAIRY PRODUCTS CONSUMPTION IN SLOVAK POPULATION Šramková, K., Chlebo, P. , Kopčeková, J. , Dudriková, E. *, Mrázová, J. Katedra výživy ľudí FAPZ SPU Nitra, * Ústav hygieny a technológie mlieka UVL Košice Abstract The aim of the study was to evaluate milk and dairy products consumption in adult population in Slovak Republic – in the case of 483 random selected adults at the age from 25 to 95 years (52,80 % females and 47,20 % men), with average age 47,60 ± 15,01 years. Used research method was nutritional questionnaire. Body mass index was assessed according to criteria of WHO (2004). In the sample occured overweight in 56,31 % of respondents (45,88 % females and 67,98 % men) and obesity in 16,98 % of adults (13,73 % females and 20,61 % men). Android risk of metabolic complications of obesity was determined according to waist-to-hip ratio values in 28,63 % of females and 89,47 % of men. The most prefered consumed milk was semi-bold milk (56,71 %) and low-fat milk (26,29 %). Milk consumption refused 9,03 % of females and 8,77 % of men, low-fat milk did not consume more men than females (20,30 % versus 30,77 %), acidified milk refused 28,14 % of females a 25,00 % of men, yoghurts with higher fat content refused 52,69 % of females and 53,66 % of men. Úvod Mlieko a mliečne výrobky sú jednou zo základných zložiek racionálnej výživy moderného človeka. Mlieko má vo výžive ľudí výsostné postavenie. Konzumuje sa už viac ako 10 000 rokov. Okrem základných živín a príslušnej energie poskytuje ľudskému organizmu mnoho látok, ktoré sa vyznačujú nielen významnými výživovými, funkčnými, ale aj zdravotnými účinkami. Mlieko má nezastupiteľnú úlohu vo výžive pre obsah plnohodnotných proteínov, vrátane cenných srvátkových bielkovín, vápnika, draslíka a fosforu, ľahko stráviteľného mliečneho tuku s vysokým obsahom konjugovanej kyseliny linolovej (často a pozitívne sa dáva do súvisu s prevenciou voči vzniku chronických civilizačných ochorení), vitamínov (A, D, skupiny B ) a mliečneho cukru – laktózy (Valík, 2006, Babinská, 2005). Cieľom práce bolo sledovať a zhodnotiť konzumáciu mlieka a mliečnych výrobkov i životný štýl a antropometrické parametre u vybranej časti dospelej populácie SR. Zámerom tiež bolo 307 zistiť pokrytie odporúčaných výživových dávok konzumom mlieka a vybraných mliečnych výrobkov. Materiál a metodika Sledovali a hodnotili sme konzumáciu mlieka a mliečnych výrobkov u dospelej populácie v Žilinskom, Trenčianskom, Banskobystrickom, Bratislavskom a Prešovskom kraji. Výskum sme uskutočnili dotazníkovou metódou. Zúčastnilo sa ho 483 náhodne vybratých osôb vo veku 25-95 rokov (52,80 % žien a 47,20 % mužov). V skupine žien bol priemerný vek 47,60 ± 15,01 rokov, v skupine mužov 47,90 ± 15,00 rokov. Takmer 75 % osôb (cca 2/3) bolo vo veku najviac 50 rokov a približne 30 % (cca 1/3) vo veku viac ako 50 rokov (tab. 1). Tabuľka 1 Rozdelenie súboru podľa veku a pohlavia Vek ženy muži spolu n % n % n % ≤ 50 rokov 174 68,24 153 67,11 327 67,70 > 50 rokov 81 31,76 75 32,89 156 32,30 Z antropometrických parametrov sme použitím kalibrovaných váh merali a hodnotili telesnú hmotnosť, použitím pásového meradla telesnú výšku, obvod pásu, obvod bokov. Hodnotili sme index telesnej hmotnosti – BMI (na základe kritérií podľa WHO, 1995, WHO, 2000, WHO, 2004), ktorý sme vypočítali z antropometrických parametrov (z telesnej hmotnosti a telesnej výšky) nasledovne: body mass index = hmotnosť v kg / (výška v m)2. Z obvodu pása a bokov sme vypočítali index centrality, tzn. pomer pás-boky (WHR; waist to hip ratio) ako podiel obvodu pása a bokov v centimetroch. WHR sme hodnotili podľa Kleinwächterovej, Brázdovej (2001). Väčšinu súboru tvorili vydaté ženy, resp. ženatí muži (tab. 2). Pri hodnotení zdravotného stavu prevažoval zdravotný stav priemerný/dobrý, z hľadiska fyzickej aktivity pri zamestnaní práca fyzicky ľahká alebo stredná, zo vzdelania stredoškolské vzdelanie a z pohľadu pracovného pomeru zamestnané osoby (tab. 3). Tabuľka 2 Zaradenie osôb v súbore ženy muži spolu n % n % n % Slobodný/á 41 16,08 37 16,23 78 16,15 Ženatý/vydatá 175 68,63 167 73,25 342 70,81 Rozvedený/á 17 6,67 12 5,26 29 6,00 Vdovec/a 22 8,62 12 5,26 34 7,04 308 Tabuľka 3 Charakteristika súboru Sledované ukazovatele Hodnotenie podpriemerný ženy muži spolu n % n % n % 31 12,16 35 15,35 66 13,66 64,31 121 53,07 285 59,01 Zdravotný stav priemerný/dobrý 164 veľmi dobrý 60 23,53 72 31,58 132 27,33 fyzicky ľahká 138 54,12 108 47,37 246 50,93 stredná 105 41,18 95 41,67 200 41,41 ťažká 12 4,71 25 10,96 37 7,66 základné 34 13,33 13 5,70 47 9,73 stredoškolské 172 67,45 151 66,23 323 66,87 vysokoškolské 49 19,22 64 28,07 113 23,40 študent 9 3,53 6 2,63 15 3,11 Pracovný zamestnaný 164 64,31 159 69,74 323 66,87 pomer dôchodca 72 28,24 57 25,00 129 26,71 nezamestnaný 10 3,92 6 2,63 16 3,31 Práca Vzdelanie Vzhľadom na to, že sme v dospelej populácii zisťovali konzum potravín z mliečnej skupiny, zaujímalo nás aj pokrytie odporúčaných výživových dávok konzumom jednotkovej porcie mlieka a vybraných mliečnych výrobkov: mlieka v množstve 250 g; z mliečnych výrobkov jogurtu v množstve 150 g a tvrdého syra v množstve 30 g. Na modelový výpočet nutričného a energetického príjmu z konzumu vybraných potravín a nápojov (mlieka, mliečnych výrobkov) sme použili nutričný software Alimenta 4.3e a príjem sme porovnali s odporúčanými výživovými dávkami pre Slovenskú republiku (OVD SR) z roku 1997 (Vestník, 1997) a vyjadrili ich vo forme percentuálnej úhrady OVD pre jednotlivé kategórie dospelých osôb (žien a mužov). Výsledky a diskusia Na základe klasifikácie hmotnosti podľa BMI sme zistili podhmotnosť u 7 osôb, t.j. 1,45 %, nadhmotnosť u 272 opýtaných, t.j. 56,31 % (45,88 % žien a 67,98 % mužov) a obezitu u 82 osôb, t.j. 16,98 % (13,73 % žien a 20,61 % mužov) (tab. 4). Priemerná hodnota BMI bola v súbore 25,82 ± 4,24 kg.m-2 a WHR 0,86 ± 0,11. Index centrality, poukazujúci na androidné riziko, sa týkal menej ako tretiny žien (28,63 %) a takmer 90 % mužov (89,47 %) (tab. 5). 309 Z hodnotenia konzumu mlieka a mliečnych výrobkov sme zistili, že najviac uprednostňovaným mliekom bolo polotučné mlieko u viac ako polovice osôb (tab. 6). Respondenti najčastejšie uprednostňovali polotučné mlieko (56,71 %), menej nízkotučné (26,29 %) a najmenej plnotučné mlieko (17,00 %). Plnotučné mlieko preferovali najmä muži (21,12 % versus 13,03 %) a nízko-/polotučné mlieko naopak o 8,09 % viac žien (86,97 % versus 78,18 %). Tabuľka 4 Podhmotnosť, nadhmotnosť a obezita u dospelých osôb podľa medzinárodnej klasifikácie BMI (podľa WHO, 1995, WHO, 2000, WHO, 2004) BMI klasifikácia ženy muži n % n % Podhmotnosť < 18,50 7 2,75 0 0 vážna < 16,00 1 0,39 0 0 stredná 16,00-16,99 0 0 0 0 mierna 17,00-18,49 6 2,35 0 0 Normálny rozsah 18,50-24,99 18,50-22,99 86 33,72 31 13,60 23,00-24,99 42 16,47 42 18,42 117 45,88 155 67,98 25,00-27,49 58 22,75 61 26,75 27,50-29,99 24 9,41 47 20,61 35 13,73 47 20,61 30,00-32,49 20 7,84 33 14,47 32,50-34,99 11 4,31 8 3,51 35,00-37,49 4 1,57 6 2,63 37,50-39,99 0 0 0 0 0 0 0 0 Nadhmotnosť ≥ 25,00 Pre-obezita 25,00-29,99 Obezita ≥ 30,00 I. stupňa 30,00-34,99 II. stupňa 35,00-39,99 III.stupňa ≥ 40,00 Tabuľka 5 Index centrality - WHR ženy muži spolu Riziko norma n % n % n % gynoidné < 0,85 182 71,37 24 10,53 206 42,65 androidné ≥ 0,85 73 28,63 204 89,47 277 57,35 Tabuľka 6 Preferencia mlieka Mlieko ženy muži spolu n % n % n % nízkotučné 76 29,83 51 22,54 127 26,29 polotučné 146 57,14 128 56,34 274 56,71 plnotučné 33 13,03 48 21,12 81 17,00 310 Tabuľka 7 Odmietanie mlieka a mliečnych výrobkov ženy muži spolu n % n % n % mlieko 23 9,03 20 8,77 43 8,90 zakysané mlieko 72 28,14 57 25,00 129 26,71 nízkotučné 52 20,30 70 30,77 122 25,26 134 52,69 122 53,66 256 53,00 33,75 97 42,75 183 37,89 131 51,27 125 54,90 256 53,21 nízkotučný tvaroh 71 27,81 77 33,77 148 30,24 vysokotučný 107 41,76 95 41,67 202 41,72 jogurty vysokotučné jogurty mäkké nízkotučné 86 syry mäkké vysokotučné syry tvrdé syry tvaroh Pri sledovaní konzumácie mlieka a mliečnych výrobkov sme sa zamerali najmä na odmietanie jednotlivých druhov potravín z mliečnej skupiny, čo poukazuje na pestrosť alebo naopak jednostrannosť stravy (tab. 7). Mlieko vôbec nekonzumovalo 9,03 % žien a 8,77 % mužov. Ženy nekonzumovali z mliečnych výrobkov najmä jogurty s vysokým obsahom tuku (52,69 %), na druhom mieste mäkké vysokotučné syry (51,27 %) a vysokotučný tvaroh (41,76 %). Muži najviac odmietali konzum mäkkých vysokotučných syrov (54,90 %), vysokotučných jogurtov (53,66 %) a na treťom mieste mäkkých nízkotučných syrov (42,75 %). Jurkovičová (2005) uvádza, že plnotučné mlieko preferujú najmä mladšie osoby, a že trend spotreby mlieka u mužov i u žien v priebehu posledných šiestich rokov prudko klesá. Prepočtom krytia odporúčaných výživových dávok konzumom mlieka a mliečnych výrobkov sme zistili, že konzum jednej jednotkovej porcie polotučného mlieka 1,5 % t.v.s. (250 g) predstavuje príjem vápnika 302 mg a energetický príjem 484,96 kJ (115,81 kcal), čo znamená krytie OVD jednotlivých kategórií dospelých žien a mužov podľa veku a fyzickej záťaže pre vápnik (tzn. 800–1000 mg/deň) na 24,75–37,75 % (priemerne 33,77 ± 3,40 %) a pre energiu na 3,13 až 6,38 % (v priemere na 4,62 ± 0,92 %). Konzumácia bieleho jogurtu (min. 1,5 %, 311 max. 1,8 % t.v.s.) v množstve 150 g poskytuje 171 mg vápnika a 319,65 kJ (76,33 kcal). Jogurt pokryje pre jednotlivé kategórie žien OVD vápnika na 15,55–21,38 % (v priemere na 18,45 ± 2,13 %) a OVD energie na 2,06 až 3,76 % (priemerne na 2,74 ± 0,59 %). Tvrdý syr (eidam, 45 % t.v.s.) v množstve 30 g poskytuje 286,8 mg vápnika a energiu 430,69 kJ (102,85 kcal) a zabezpečí úhradu OVD pre vápnik u dospelých žien na 26,07–35,85 % (v priemere na 30,94 ± 3,70 %) a energiu 2,78 až 5,07 % (priemerne na 3,69 ± 0,84 %). Z celkového zhodnotenia vyplýva, že jedna porcia potravín pokryje OVD pre vápnik na 27,72 ± 0,84 % (15,55 až 37,75 %) a OVD pre energetický príjem len na 3,68 ± 0,17 % (2,06 až 6,38 %). Záver Nadhmotnosť alebo obezitu sme v súbore zistili až u takmer troch štvrtín súboru (73,29 % osôb), a to u viac mužov až (o 28,98 %) ako žien (59,61 % žien, ale až 88,59 % mužov). Plnotučné mlieko preferujú najmä muži. Z mliečnych výrobkov respondenti uprednostňovali vo všeobecnosti výrobky so zníženým obsahom tuku. Jednotková porcia polotučného mlieka a vybraných mliečnych výrobkov pokryje odporúčaný príjem pre vápnik u dospelých osôb z jednej štvrtiny (na 27,72 %), zatiaľ čo má nízky obsah energie - len 4 % odporúčaného energetického príjmu. Na základe toho možno plne odporúčať konzum mlieka a mliečnych výrobkov u dospelých osôb, a to rôznych výrobkov v závislosti od ich zdravotného stavu, resp. telesnej hmotnosti. Literatúra 1. 2. BABINSKÁ, K. 2005. Výživa bez mlieka. In: Výživa a zdravie, roč. 49, 2005, č.2, s.21. JURKOVIČOVÁ, J. 2005. Vieme zdravo žiť? Bratislava : Univerzita Komenského v Bratislave, 2005, 166 s. ISBN 80-223-2132-X. 3. VALÍK, Ľ. 2006. Prospešnosť konzumácie mlieka. In: Výživa a zdravie, roč. 50, 2006, č. 3-4, s. 15. 4. Vestník MZ SR, roč. 45, čiastka 7-8, zo dňa 28. apríla 1997. 5. WHO. Physical status: the use and interpretation of anthropometry. Report of a WHO Expert Committee. WHO Technical Report Series 854. Geneva : World Health Organization, 1995. 6. WHO. Obesity: preventing and managing the global epidemic. Report of a WHO Consultation. WHO Technical Report Series 894. Geneva : World Health Organization, 2000. 7. WHO expert consultation. Appropriate body-mass index for Asian populations and its implications for policy and intervention strategies. In The Lancet, 2004; 157-163. Práca bola podporená z projektu VEGA 1/2321/05 a KEGA 3/5082/07. Kontaktná adresa: Ing. Katarína Šramková, PhD., Katedra výživy ľudí, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov SPU Nitra, Tr. A. Hlinku 2, 949 01 Nitra 312 INDEX ZDRAVÉHO STRAVOVANIA U DOSPELÝCH ŽIEN HEALTHY EATING INDEX IN ADULT WOMEN Šramková, K. 1, Kolesárová, A. 1, Brányik, K. 2, Mišiaková, M. 3 1 Katedra výživy ľudí FAPZ SPU Nitra, 2 NsP Dunajská Streda, 3ADOS Nitra Abstract The aim of the study was to evaluate the nutrition in Slovak adult women and to analyse the actual nutrition according to Healthy Eating Index. 24-hours dietary records (n = 161) were evaluated by using software Alimenta version 4.3e. 41,61 % of protocols contained five food groups (cereals, vegetables, fruit, milk, meat). The ground of the nutrition was cereals and/or their products in the case of 98,89 % protocols, 89,44 % of anamnesis contained vegetables and/or its products, 88,82 % of protocols contained milk and/or dairy products, and 82,23 % of records contained meat, poultry and/or fish. Fruit or fruit products represented the component part of 68,32 % of retrospective protocols. Receipt of cholesterol (maximal 300 mg a day) exceeded 30,43 % of nutritional records, daily fat receipt (maximal 30 % from daily energy receipt) was higher in the case of 67,08 % protocols, receipt of saturated fat was in 70,37 % of dietary records (was is too much) higher as is recommended (10 % of total energy content). Úvod Faktory životného štýlu, vrátane nutričných faktorov, sa významne uplatňujú v prevencii neinfekčných chorôb. Štúdia bola zameraná na zhodnotenie výživy vybranej skupiny slovenských žien a na analýzu aktuálneho spôsobu výživy prostredníctvom indexu zdravého stravovania. Materiál a metodika V skupine náhodne vybraných žien dospelého veku (25-58 rokov) sme hodnotili stravovanie použitím 24-hodinových retrospektívnych stravovacích anamnéz (161 ks). Veková charakteristika súboru žien je v tab. 2. Celodenný záznam stravy sme počítačovo spracovali v nutričnom programe Alimenta verzia 4.3e (vypracovaný vo Výskumnom ústave potravinárskom v Bratislave), ktorý používa Potravinovú banku dát zloženia potravín. Celodenný príjem potravy sme na základe výsledkov zo spracovania v nutričnom software zhodnotili podľa tzv. HEI (Healthy Eating Index) - Indexu zdravého stravovania (tab. 1). 313 Hodnotili sme všetky potravinové skupiny - obilniny, zelenina, ovocie, mlieko, mäso (ich prítomnosť/neprítomnosť v celodennej strave) a štyri výživové odporúčania: celkový tuk (položka 61374 vo výstupe z nutričného software Alimenta 4.3e), nasýtený tuk (položka 61375 vo výstupe z nutričného software Alimenta 4.3e), cholesterol (položka 52610 vo výstupe z nutričného software Alimenta 4.3e), sodík (položka 54111 vo výstupe z nutričného software Alimenta 4.3e). Tabuľka 1 Index zdravého stravovania - HEI (Healthy Eating Index) Zložka Interval Kritériá pre max. Kritériá pre min. hodnotenia hodnotenie 10 b hodnotenie 10 b 1. obilniny 0 – 10 6 – 11 porcií 0 porcií 2. zelenina 0 – 10 3 – 5 porcie 0 porcií 3. ovocie 0 – 10 2 – 4 porcie 0 porcií 4. mlieko 0 – 10 2 – 3 porcie 0 porcií 5. mäso 0 – 10 2 – 3 porcie 0 porcií 6. celkový tuk 0 – 10 30 % a menej energie 45 % a viac energie 7. nasýtený tuk 0 – 10 < 10 % energie 15 % a viac energie 8. cholesterol 0 – 10 300 mg a menej 450 mg a viac 9. sodík 0 – 10 2400 mg a menej 4800 mg a menej 10. pestrosť 0 – 10 8 a viac rôznych 3 a menej rôznych položiek za deň položiek za deň Skupina potravín Výživové odporúčania Výsledky a diskusia Priemerný počet zaradených potravinových skupín do stravovacích anamnéz bol 4,27 ± 0,27 (tab. 2). Poukazuje to na celkom dostatočnú pestrosť stravy. Z celkového počtu 161 nutričných protokolov (24-hod. retrospektívnych záznamov) obsahovala potraviny zo všetkých piatich sledovaných potravinových skupín menej ako polovica (41,61 %) z hodnotených nutričných protokolov (tab. 3). Štyri až päť potravinových skupín obsahovala podstatná časť nutričných protokolov (86,33 %), čo poukazuje na pestrosť stravy. Pozitívne je, že len malá časť stravovacích záznamov bola zložená len z dvoch potravinových skupín (1,24 %), zatiaľ čo potraviny len z troch skupín potravinovej pyramídy (tzv. pyramídy 314 zdravia) boli súčasťou 12,42 % retrospektívnych nutričných anamnéz. Jednoznačne možno tvrdiť, že stravovanie obsahujúce zložky len z dvoch, prípadne z troch potravinových skupín nespĺňajú požiadavku dostatočnej pestrosti stravy. Tabuľka 2 Veková charakteristika súboru žien a počet potravinových skupín zaradených do stravovania (ukazovatele deskriptívnej štatistiky) Vek (roky) Počet potravinových skupín priemer ± SD 44,42 ± 9,84 4,27 ± 0,72 minimum 25,00 2,00 maximum 58,00 5,00 medián 46,00 4,00 modus 51,00 4,00 Tabuľka 3 Počet potravinových skupín zaradených do stravovania Počet potravinových skupín Stravovanie obsahujúce potraviny z príslušného počtu potravinových skupín n % 0 0 0,00 1 0 0,00 2 2 1,24 3 20 12,42 4 72 44,72 5 67 41,61 U najväčšieho počtu stravovacích záznamov sme zistili zaraďovanie potravín z „cereálnej skupiny“ potravinovej pyramídy, a to u 143 (98,89 %) protokolov (tab. 4). Na druhom mieste bola „zeleninová skupina“, ktorej potraviny boli zahrnuté do stravy v prípade 144 (89,44 %) nutričných protokolov. Za zeleninovou skupinou nasledovala „mliečna skupina“, pričom mlieko a mliečne výrobky obsahovalo 143 (88,82 %) stravovacích anamnéz, ďalej „mäsová skupina“ so 134 (83,23 %) protokolmi, obsahujúcimi mäso, hydinu, ryby, prípadne výrobky z nich. Najmenej zaraďované boli potraviny z „ovocnej skupiny“, nakoľko ovocie, príp. ovocné výrobky sa nachádzali v 110 (68,32 %) restrospektívnych anamnézach. Americký inštitút pre výskum rakoviny iniciovl v roku 1991 nutričný program „Denne päťkrát pre lepšie 315 zdravie” (Five a day for best Health). Pravidlo stravovania „Päťkrát dene ovocie a zeleninu” úspešne bojuje proti chronickým neinfekčným chorobám (najmä nádorovým a kardiovaskulárnym) (ŠRAMKOVÁ, 2004, ŠRAMKOVÁ, 2005). Podľa USDA (US Department of Agriculture) potravinovej pyramídy sa odporúča konzum z potravinovej skupiny obilniny 6-11 jednotkových porcií (JP) denne, zelenina 3-5 JP, ovocie 2-4 JP, zo skupiny mlieko a mliečne výrobky a rovnako aj zo skupiny mäso, ryby, hydina a strukoviny 2–3 JP denne (US Department of Agriculture, 1997). Tabuľka 4 Zaradenie potravín do denného stravovania Potraviny /potravinové Stravovanie obsahujúce príslušné potraviny skupiny n % 1. obilniny 156 98,89 2. zelenina 144 89,44 3. ovocie 110 68,32 4. mlieko 143 88,82 5. mäso 134 83,23 Hodnotením výživových odporúčaní sme zistili dodržiavanie najmä odporúčania pre príjem cholesterolu – maximálne 300 mg cholesterolu spĺňala strava v prípade viac ako dvoch tretín (69,57 %) 24-hod. nutričných protokolov. Na druhom mieste bolo odporúčanie pre príjem celkového tuku, keďže jeho príjem predstavoval najviac 30 % z celkového denného energetického príjmu v prípade tretiny (32,92 %) nutričných anamnéz. Tretie miesto obsadil príjem saturovaného (nasýteného) tuku, ktorý spĺňala len menej ako tretina stravovacích záznamov (29,63 %) (tab. 5). Ukazovatele opisnej štatistiky sú pre vybrané výživové odporúčania uvedené v tab. 6. Priemerné hodnoty pre príjem nasýteného tuku a cholesterolu zodpovedá výživovým odporúčaniam. V prípade príjmu celkového tuku a sodíka sú priemerné hodnoty vyššie ako odporúčané. Odporúčané výživové dávky SR určujú vo všeobecných odporúčaniach podiel tukov na celkovom objeme energie na maximálne 30 % s nasledujúcou štruktúrou mastných kyselín: saturované mastné kyseliny 10 %, monoénové mastné kyseliny 10-12 %, polyénové mastné kyseliny 8-10 % (Vestník MZ SR, 1997). Hlavnými zdrojmi cholesterolu sú vaječný žĺtok, produkty s obsahom mliečneho tuku, živočíšne tuky a mäso. Každých 200 mg cholesterolu prijatého stravou denne zvýši koncentráciu sérového LDL-cholesterolu (LDL, low density lipoproteins, lipoproteíny s nízku hustotou) priemerne asi o 6 mg/dl (0,155 mmol/l). Nasýtené 316 mastné kyseliny sa vyskytujú v živočíšnych tukoch aj v rastlinných olejoch. K bohatým zdrojom saturovaných mastných kyselín patrí maslo, živočíšny tuk a tropické oleje (palmový, kokosový olej a olej z palmových jadier). V USA a v Európe tvoria nasýtené mastné kyseliny 12-15 % z celkového energetického príjmu. V priemere na každé 1 % energie prijatej vo forme nasýtených mastných kyselín, ktoré zvyšujú cholesterol, sa v porovnaní s kyselinou olejovou hladina LDL-cholesterolu zvýši asi o 2 mg/dl (0,025 mmol/l). Jedna nasýtená mastná kyselina - kyselina stearová (C18:0) nezvyšuje koncentráciu LDL-cholesterolu. Hlavným zdrojom tejto kyseliny je hovädzí loj a kakaové maslo (Grundy, 2003). Tabuľka 5 Výživové odporúčania Výživové odporúčania Stravovanie zodpovedajúce príslušnému výživovému odporúčaniu n % 53 32,92 7. nasýtený tuk (max. 10 % 96 29,63 6. celkový tuk (max. 30 % energie) energie) 8. cholesterol (max. 300 mg) 112 69,57 9. sodík (max. 2400 mg) 40 24,84 Tabuľka 6 Výživové odporúčania (ukazovatele deskriptívnej štatistiky) Parameter Výživové odporúčanie Parameter 6. celkový tuk * Výživové odporúčanie 8. cholesterol (mg) priemer ± SD 32,13 ± 9,00 priemer ± SD 233,80 ± 180,33 minimum 2,17 minimum 1,03 maximum 54,67 maximum 1041,58 medián 32,45 medián 188,09 modus 35,56 modus 145,58 7. nasýtený tuk 9. sodík (mg) priemer ± SD 8,87 ± 4,21 priemer ± SD 3733,16 ± 2049,72 minimum 0,39 minimum 336,50 maximum 24,78 maximum 13116,06 medián 8,65 medián 3490,79 modus 11,44 modus 3009,15 * percentuálny podiel z energie (z energetického príjmu) 317 Záver Hodnotením stravovania dospelých žien sme zistili, že zo 161 nutričných protokolov (24-hod. retrospektívnych záznamov) malo 41,61 % obsiahnutých všetky základné potravinové skupiny, čo poukazuje na dostatočnú pestrosť stravy u menej ako polovice anamnéz. Základom väčšiny protokolov (98,89 %) boli cereálie a výrobky z nich, zelenina a zeleninové výrobky boli súčasťou 89,44 % záznamov, mlieko a mliečne výrobky obsahovalo 88,82 % stravovacích anamnéz, mäso, prípadne výrobky z neho 83,23 % protokolov. Najmenej boli zaraďované potraviny z ovocnej skupiny potravinovej pyramídy - v 68,32 % retrospektívnych anamnézach. Odporúčaný denný príjem cholesterolu 300 mg prekračovalo 30,43 % nutričných protokolov, príjem celkového tuku v množstve maximálne 30 % z denného energetického príjmu bol vyšší v prípade 67,08 % nutričných anamnéz, príjem saturovaného (nasýteného) tuku bol až u 70,37 % vyšší ako odporúčaných 10 % celkového príjmu energie. V strave dospelých žien je potrebné zredukovať najmä príjem nasýtených tukov, a teda najmä tukov živočíšneho pôvodu a dbať na zastúpenie rôznych potravinových skupín v dennej strave. Literatúra 1. 2. 3. 4. 5. GRUNDY, S.M. 2003. Factors Determining Blood Cholesterol Levels. In: Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. Volume 2. Second Edition. Oxford : Elsevier Science, 2003. p. 1237-1243. ISBN 0-12227055-X ŠRAMKOVÁ, K. 2004. 5-krát denne ovocie a zeleninu. In: Gastro : Gastro informuje, roč. 15, 2004, č. 3/4, s. 7-8. ŠRAMKOVÁ, K. 2005. Ovocie a zeleninu päťkrát denne pre zdravie. In: Výživa a zdravie, roč. 49, 2005, č.54, s. 26-38. US Department of Agriculture, 1997. Pyramid Servings Data. Results from USDAs 1994-1996 Continuing Survey of Food Intakes by Individuals.1997. US Department of Agriculture, Agriculture Research Service, Food Survey Research Group, Bethesda, MD. Vestník MZ SR, roč. 45, čiastka 7-8, zo dňa 28. apríla 1997. Práca bola podporená z projektu VEGA 1/2321/05 a KEGA 3/5082/07. Kontaktná adresa: Ing. Katarína Šramková, PhD., Katedra výživy ľudí, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov SPU Nitra, Tr. A. Hlinku 2, 949 01 Nitra 318 VLIV VYBRANÝCH MIKROKLIMATICKÝCH PODMÍNEK PROSTŘEDÍ NA JAKOSTNÍ PARAMETRY MLÉKA NA VOLNÉM USTÁJENÍ THE INFLUENCE OF MICROCLIMATIC PARAMETERS OF STABLING ENVIRONMENT ON MILK QUALITY OF COWS IN FREE STABLING SYSTEM Šťastná, J., Šoch, M., Katedra anatomie a fyziologie hospodářských zvířat, Zemědělská fakulta, Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích Department of Anatomy and Physiology of Farm Animals, Faculty of Agriculture, University of South Bohemia in Ceske Budejovice Abstract: The experiment was realized in a brick stable with stocker floor and boxes with plastic litter made from separated slurry. The average number of the animals was 509 Holstein cows with average production 7741.65 liters of milk per year, during the experiment. The ventilation was provided by an overhead inlet shaft and by lateral windows. Temperature and relative humidity of the stabling environment were measured in hour intervals. Through the experiment were founded MSCC and microorganisms tendencies to grow up, and milk protein (casein) and fat to decline in DM after growing temperature. Key words: cows, milk, quality, temperature, humidity Acknowledgement: This project was supported by NAZV 1G58053 a GAČR 523/03/H076. *Corresponding author: Jana Šťastná, ZF JU v Č. Budějovicích, Studentská 13., 370 05 České Budějovice, e-mail: [email protected], tel.: +420387772618 HODNOTENIE FREKVENCIE MIKROJADIER V KOSTNEJ DRENI MYŠI PO PODANÍ MORFÍNU A PROTEÁZY ASPERGILLUS ORYZAE THE EVALUATION OF MICRONUCLEUS FREQUENCY IN THE BONE MARROW OF MICE TREATED WITH MORPHINE AND PROTEASE OF ASPERGILLUS ORYZAE Šutiaková, I., Šutiak, V., Kovalkovičová, N., 1Poračová J., Váczi, P., Sabová, L. Department of Pharmacy and Pharmacology, University of Veterinary Medicine, 73, Komenského, 041 81 Košice, Slovak Republic, 1Department of Biology, Faculty of Humanities and Natural Sciences, PU, 1, 17th November, Prešov, Slovak Republic Abstract In this study we have used 4 groups of mice with 4 animals in each, using 1 negative control K- (obtained 1ml of 0.9% NaCl sol. (PS) i.p. and 20 µl of the PS s.c. into tail), 1 positive control - KA+ (obtained 30mg of morphini HCl (M) .kg in 0.1% sol. i.p. and 20 µl of PS s.c. 319 into tail) and 2 experimental groups of mice. The first of them - B-group (obtained except of M as in group KA+ also A. oryzae protease (PAO) diluted in relation 1:20 in 20 µl of PS s.c. into tail & also C-group of mice which obtained except of M as in group KA+ also PAO diluted in relatio1:10 in 20 µl of PS s.c. into tail). The effects of both agents in mice were observed via following the dynamics of the body temperature, genotoxicity & cytotoxicity criteria of studies. The experiments demonstrated that used M induced already alone significant decrease of body temperature (P<0.05) as well as in groups with the PAO, however body temperature decrease in KA+ was not significant (P> 0.05) when we compare the data in relation with values before administration of agent. However in cases when were taken the comparisons in relation with the K- data the P<0.05 decreases of body temperature were observed not only in B- and C-groups but also in KA+group of mice. Significant differences in micronucleated polychromatic and normochromatic erythrocytes was observed (P<0.001); resp. (P< 0.001) in experimental group of mice which obtained 30 mg/kg b. w. of morphine and PAO (1:10) into tail against negative control. The ratio of polychromatic to normochromatic erythrocytes of female mice of both exposed groups was not significantly changed in comparison to negative control. Supported by Vega grant No. 1-2408-05. Introduction Analgesic morphine & endogenous opioid ligands are implicated in diverse function in the central & peripheral nervous system, especially in acute & chronic pain management. In experimental & clinical studies, peripheral analgesic effects of opioids have been observed mainly during the inflammatory-induced pain (Welte et al., 1992, Antonijevic et al., 1995., Walter and Stella, 2004, Costa et al., 2004, 2007). The capacity of morphine in attenuation of inflammation & pain has been demonstrated within a few hours after the induction of inflammation. This could be due to an enhancement of the permeability of the perineurium & to activation of opioid receptors in the terminal nerve endings, which may undergo structural changes in the acidic environment of the inflammation (Stein, 1993). A recently observed phenomen, the development of "dark neurons" is associated with both chronic constriction injury & morphine tolerance. This observation of interrelationships between neural mechanisms underlying hyperalgesia & morphine tolerance may lead to a better understanding of the pain (Mayer et al., 1999). On the other hand, according to the Physicians Desk Reference (PDR) (Anonymous 2005), no formal studies to assess the mutagenic potential of morphine have been conducted for the FDA. In vivo genotoxicity tests play an important role in genotoxicity studies. Increases in micronucleated bone marrow cells are 320 given great regulatory weight indicating that the test compound is likely to be a genotoxic agent. An alternative explanation for the in vivo micronucleus effect is that it is a consequence of body temperature which is caused in rodents by morphine (Tweats et al, 2007 a, b). Our previous experiments with mice demonstrated that Aspergillus oryzae protease induced a pronounced inflammation reaction (Šutiak and Šutiaková, 1991, Šutiak et al., 2002) and this experience we have utilized in the following our experiments. The main aim of this work was to evaluate the efficacy of morphine treatment in model of acute inflammation with Aspergillus oryzae protease in mice and we examined the interaction effect of mutual administration of both agents on the induction of micronuclei in bone marrow and cytotoxicity in mice. Materials and methods Animals Female laboratory mice (Mus musculus var. alba) of the strain ICR (age of 5 months) obtained from the officially approved supplier (by SVaFA Bratislava - SK-CH-40 004 on 5.5.2004 - the Animal breeding facility) of the laboratory animals (Division of toxicology and breeding of laboratory animals of the Institute of Experimental Pharmacology at the SAS, 91954 Dobra Voda). Mice were adapted to the experimental conditions for the period of 7 days before its starting. They were fed on the commercially available and standard diet (Kŕmna zmes pre myši a potkany MP of the firm Top Dovo, 919 54 Dobrá Voda, producer PD Horné Dubové - Naháč, SR. Together with food they obtained also water both administered ad libitum and kept in plastic boxes, containing the metallic cowering at the temperature 20 ± 2.0 ˚C and 50-54 % humidity on the natural light/ dark cycle. Chemicals and reagents Morphini HCl purchased from Hoechst-Biotika, Martin, producer a.s. Slovenská Ľupča, SR. 0.9% NaCl solution (Infusio natrii chlorati isotonica) obtained from Infusia a.s. Hořatev, CR and Thiopental ICN inj. (thiopentalum natricum) was of the firm ICN a.s. Roztoky, CR. The enzyme protease of Aspergillus oryzae (CAS No. 9014-01-1, EC 232-752-2) was purchased from Sigma Aldrich St. Louis-Steinheim, Germany. We used also methanol p.a. (No. 305 34 0503), Lachema Lach, Ner, s.r.o. Neratovice, CR, Giemsa-Romanowski, Diagnostica, Merck, Darmstadt, May-Grünwald, R6 020305, Vakos, XT a.s., Praha, CR & Foetal bovine serum (No. A-15-043-PAA), Laboratories GmbH Germany. Doses and exposure 321 The animals were divided into 4 groups with 4 animals in each using 1 negative control - K(obtained 1ml of 0.9% NaCl sol. - Infusio natrii chlorati isotonica (PS) i.p. & 20 µl of the PS s.c. into tail), 1 positive control - KA+ (obtained 30mg of morphini HCl (M).kg in 0.1% sol. i.p. & 20 µl of PS s.c. into tail) & 2 experimental groups of mice. The first of them - B-group (obtained except of M as in group KA+ also A. oryzae protease (PAO) diluted in relatio1:20 in 20 µl of PS s.c. into tail & also C- group of mice which obtained except of M as in group KA+ also PAO diluted in relatio1:10 in 20 µl of PS s.c. into tail). 4 days after administration of drugs the mice were anesthetised with 75 mg of thiopentalum natricum (Thiopental ICN 1 g inj. plv. sol.).kg b.w. i.p. after solubilisation with the 0.9 % PS & carefully decapitated (Šutiak et al.1981). Blood samples were obtained & used for analyses. Temperature test method The body (rectal) temperature of mice were monitored by the Geratherm GmbH Digital thermometer, model 8022, Germany at: -0.5 h before starting of experiment and 0.5; 1; 2; 3; 4; 6 & 24 h after administration of agents. Body weight of animals Body weights of animals were measured by the Metler Toledo AG type BDI 201 scales Greifen-See, Switzerland & U.S.A. Micronucleus (MN) test At appropriate time points, the experimental animals were killed, a 10 ml centrifuge tube was filled with 5.0 ml of foetal calf serum for each individual. All mice were carefully decapitated 96 h after the end of exposure (Šutiak et al.1980) & both femora were removed. The preparations were then air dried & fixed in absolute methanol for 5 min. Smears were stained with May Grünwald-Giemsa & analyzed for the presence of MN in both polychromatic erythrocytes (PCEs) and normochromatic erythrocytes (NCEs). 1000 PCEs & the corresponding number of NCEs per animal were analysed for the presence of MN. The ratio of PCEs to NCEs (P/N) was calculated for all treated & control groups. Criteria for scoring follow those data of Mac Gregor et al. (1987) and OECD Guideline 474 (1997). Statistical treatment of data The results were compared by Student´s test using the Sigma Stat program (Statistical software, Jandel Scientific) was employed for statistical evaluation of the results. P1 is relation to values at –0.5h & P2 is relation to K-group. 322 Results Body weight measurement of animals demonstrated no significant differences between the individual animal groups (K-group = 33.55 ± 2.105 g, B-group = 33.71±1.317 g, C-group = 33.50 ± 0.696 g & KA+group = 33.98 ± 0.676 g with the values of P2 = 0.753; 0.762 and 0.422 respectively related to values of K-group). Studies of the body temperature dynamics in individual groups of mice demonstrated that the rectal temperature did not changed significantly its values only in K-group of mice (P1 < 0.184) during the experiment, in relation to the values before administration. In other groups the rectal temperature decreased more to maximal lowest levels also at the time interval 0.5 h after administration (B-group = P1 < 0.008; C-group = P1 < 0.0002 & KA+group = P1 < 0.089). The comparisons of the body temperature dynamics of individual animal groups in relation to the K-group pointed to the fact of significant decrease of rectal body temperature with the following values (B-group = P2 < 0.009; C-group = P2 < 0.01 & KA+group = P2 <0.038. The results of mice bone marrow micronucleus tests studies after exposure to the morphine and PAO administration of 30 mg/kg b. w. morphine and 1:20 PAO into tail did not increase the frequency of the MN PCE s (P ≥ 0.286) and MNCEs (P ≥ 0.086) in the bone marrow of mice against negative control. Significant differences in micronucleated polychromatic and normochromatic erythrocytes was observed (P< 0.001); resp. (P< 0.001) in experimental group of mice which obtained 30 mg/kg b. w. of morphine and PAO (1:10) into tail. The ratio of polychromatic to normochromatic erythrocytes of female mice of both exposed groups was not significantly changed in comparison to negative control (Table 1). Table 1 Micronucleus frequencies and distributions in bone marrow cells of female mice after exposure morphine and protease Aspergillus oryzae Group Control Animal MNPCEs MN distribu – NNCEs Mn distribu- Ratio tion in PCEs tion in NCEs PCEs/ 1 2 3 1 2 3 NCEs K1/1 1000 18 18 0 0 9 5 4 0 1,31 K1/2 1000 14 11 2 0 15 11 2 0 1,20 K1/3 1000 9 9 0 0 14 12 1 0 1,26 K1/4 1000 15 15 0 0 12 8 2 0 1,46 Mean ± SD Experim. 1:20 PCEs 14.0 ± 3.742 12.5 0 ± 2.646 E2/1 1000 11 11 0 0 10 8 1 0 1,25 E2/2 1000 22 22 0 0 21 4 4 3 1,09 E2/3 1000 19 17 1 0 25 10 6 1 0,97 323 E2/4 Mean ± SD P= Experim. 1:10 Pos. control 1000 18 16 1 17.50 ± 4.655 0 25 21 1 1 0,839 20.25 ±7.089 0.286 0.086 E3/1 1000 28 26 1 0 40 36 2 0 1,29 E3/2 1000 29 27 1 0 35 31 2 0 0,77 E3/3 1000 32 30 1 0 27 23 2 0 1,12 E3/4 1000 24 24 0 0 33 33 0 0 0,52 Mean ± SD 28.25±3.304 P = = <0.001 33.75±5.377 =<0.001 C4/1 1000 21 21 0 0 32 30 1 0 0,84 C4/2 1000 25 23 1 0 32 24 4 0 1,03 C4/3 1000 28 16 6 0 25 17 4 0 0,60 C4/4 1000 24 24 0 0 28 24 2 0 0,79 Mean ± SD 24.50 ± 2.887 29.25 ± 3.403 P= < 0.004 = < 0.001 Discussion Opioids are considered to exert their analgesic effects within CNS mainly & the evidence has begun to accumulate knowledge that potent analgesia can be elicited also by activation of opioid receptors in peripheral inflammed tissues. In peripheral tissues such as in joints opioids act to reduce inflammation & morphine has been administered locally for a relieving painful inflammatory disorders (Kosta et. al. 2007). We have studied the effect of morphine interaction at the local inflammatory process induced by PAO. We have registered also a positive effect of morphine at the lower dose of PAO. Our results demonstrated that morphine may have good interaction effect also at the induction of inflammation peripherally not only via CNS action, especially at the lover concentration of enzyme results in contrast to Kcontrol. In vivo genotoxicity tests in particular bone marrow cytogenetic tests play an important role in the risk and hazard assessments. Increases in the micronucleated bone marrow cells are given great regulatory weight indicating that the test compound is likely to be a genotoxic agent. However non physiological temperatures have been known for some time to induce also cytogenetic damage. An alternative explanation for the in vivo micronucleus effects is that it is consequence of hypothermia which is caused in rodents by morphine (Twents et. al. 2007a, b; Asanami and Shimono, 1997). These were the arguments why we have also measured the body temperatures in mice. The highest statistically significant changes were observed most frequently in time scale between 0.5 to 1.0 h after administration of morphine1 h after application of morphine. From our results can be seen 324 that administration of morphine alone to mice significantly increase the frequency micronuclei at the PCE and NCE erythrocytes and we registered also the cytotoxic effects. In addition to the central nervous system opioid receptors can be found also in peripheral organs and work is in progress to determine morphine’s mechanism of action in greater detail including the site of receptors important to the genotoxic response (Sawant and Couch, 1995). Supported by Vega grant No. 1-2408-05. References Asanami, S. and Shimono, K.: Mutat. Res., 390, 79-83, 1997. Costa, B. et al.: NaunynSchmiedeberg's Arch Pharmacol.369, 294-299, 2004. Costa, B. et al.: Eur. J. Pharmacol., 556, 75-83, 2007. Mayer, D.J. et al.: Proc. Natl.Acad.Sci., USA, 96, 7731-7736, 1999. Welte, M. et al.: Br. J. Anestesth., 69, 637-639, 1992. Antonijevic, I. et al.: J. Neuroscienci., 15, 165-172, 1995. Sawant, S.G. and Couch, D.B.: Environ. Mol. Mutagen., 25, 279-283, 1995. Walter, L. et al.: Br. J.Pharmacol., 141, 775-778, 2004. Stein, C.: Anesth. Analg., 76, 182-191, 1993. Šutiak, V. et al.: Služba zdrav., Health Service, 4, 245-248, 1981. Šutiak, V. et al.: Folia Veter., 35, 1-2, 1991. Šutiak, V.: Bangladesh Vet. J., 36, 1-2, 51-55, 2002. OECD Guideline for testing of chemicals 474, 1997. Mammalian erythrocyte micronucleus test. 21st July 1997. MacGregor, J.T. et al.: Mutat. Res., 189, 103-112, 1987. Anonymous 2005. PDR 2005 Physicians Desk Reference, Medical Economics Montvale, NJ, 2005. Tweats, D.J. et al.: Mutat. Res., 627, 78-91, 2007a. Tweats, D.J. et al.: Mutat. Res., 627, 92-105, 2007b. Kontaktná adresa: Prof. MVDr. Václav Šutiak, PhD., Ústav farmácie a farmakológie, UVL, Komenského 73, 041 81 Košice. MÁ ZVÝŠENÁ HLADINA MATERNÁLNEHO TESTOSTERÓNU VPLYV NA POMER DRUHÉHO A ŠTVRTÉHO PRSTA (2D:4D) U LABORATÓRNEHO POTKANA? DOES INCREASED MATERNAL TESTOSTERONE LEVEL HAVE AN EFFECT ON THE SECOND-TO-FOURTH-DIGIT RATIO (2D:4D) IN RATS? Talarovičová A., Kršková, L., Blažeková, J. Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Mlynská dolina B-2, 842 15 Bratislava [email protected] Abstract 325 The purpose of the study was to investigate effects of increased maternal testosterone level on the second-to-fourth-digit ratio (2D:4D) in rats. Digit length of the 2nd and 4th of both forepaws in control (C) and testosterone treated (T) groups of male and female rats (C: 8 males, 8 females; T: 8 males, 8 females) was measured at 90 days of age. Animals of the T group were prenatally exposed to testosterone (a single intramuscular injection of 2.5 mg testosteroni isobutyras) on gestation day 14. Our results showed that males and females of groups prenatally treated with testosterone had the 2D:4D ratio lower than C (P<0.001) on both left and right forepaw. The 4th digit was longer in T group than in C group in both genders (P<0.001). Our results suggest that higher level of maternal testosterone during intrauterine development influence digit ratio in laboratory rats. Since a similar relationship is known also in humans, this observation may be useful for noninvasive evaluation of androgen status in rats under experimental conditions. Úvod Testosterón, klasicky ponímaný ako mužský pohlavný hormón neobmedzuje svoje účinky len na maskulinizáciu pohlavných orgánov ale významnou mierou zasahuje aj do procesu sexuálnej diferenciácie centrálnej nervovej sústavy (CNS) (Baron-Cohen a kol., 2004; Morris a kol., 2004). Zvýšenie jeho hladiny počas senzitívnych období vývinu vedie k maskulinizácií CNS (Garcia-Falgueras a kol., 2005), kým jeho nedostatok naopak CNS feminizuje (Hotchkiss a kol., 2002; Casto a kol., 2003). Je zodpovedný za adekvátne formovanie sexuálne dimorfických jadier v area preoptica (POA) (Gorski a kol., 1980; Hsu a kol., 2001) čím zároveň zasahuje do procesu formovania sexuálnej, rodovej a druhovej sebaidentifikácie daného pohlavia (Dörner a kol., 2001). Jeho nedostatok v prenatálnom období sa spája s rozvojom homosexuality u mužov a naopak s jeho zvýšenou hladinou sa spája preferencia rovnakého pohlavia u lesbických žien (Miller, 1994). So zvýšenou hladinou testosterónu sa tiež spája vznik pervazívnych vývinových porúch, ako je napríklad autizmus (Baron-Cohen, 2002), alebo poruchy pozornosti (ADHD) (Jesmin a kol., 2004). Literatúra tiež uvádza existenciu spojitosti medzi zvýšenou hladinou prenatálneho testosterónu a niektorými morfologickými znakmi napr. rozdielmi v pomere ukazováka a prstenníka (2D:4D) (Manning a kol., 1998). Podľa Peichel a kol. (1997) modulujú androgény vývin pohlavných orgánov vplyvom na Hox gény, ktoré veľmi úzko súvisia aj s vývinom prstov u myší aj u ľudí. 326 Ženy majú 2D:4D pomer v priemere väčší než muži (Manning a kol., 1998). Podobné výsledky zistili aj Brown a kol. (2002a) na pravej zadnej končatine u myší. U homosexuálnych žien prichádza pravdepodobne účinkom prenatálneho testosterónu k maskulinizácii (zmenšovaniu) tohto pomeru (Williams a kol., 2000). Podobne je tomu aj u pacientov s kongenitálnou adrenálnou hyperpláziou (CAH), kde v dôsledku intrauterinného vystavenia zvýšenej hladine androgénov (Kreze a kol., 2004) dochádza u oboch pohlaví k znižovaniu pomeru 2D:4D (Brown a kol., 2002b). Podľa Manning a kol. (2001) prichádza k maskulinizácii pomeru 2D:4D aj u autistov. Rovnako je tomu aj u jedincov s ADHD (deBruin a kol., 2006). Cieľom našej práce je zistiť existenciu vzťahu medzi prenatálne zvýšenou hladinou testosterónu a pomerom prstov 2D:4D u laboratórneho potkana. Materiál a metodika V experimente sme použili potomstvo 6 samíc laboratórneho potkana kmeňa Wistar z chovnej stanice Dobrá Voda. Zvieratá boli chované pri svetelných podmienkach 12D:12L s prístupom k vode a potrave ad libitum. Samice sme pripustili vo veku 10 týždňov a rozdelili na skupinu s podaným testosterónom (T; na 14. deň gravidity intramuskulárne aplikovaný 0,1 ml prípravku Agovirin Depot, Biotika, Slovenská Ľupča = 2,5mg Testosteroni isobutyras) a kontrolnú skupinu (K; na 14. deň gravidity aplikovaný olivový olej). Merania 2. a 4. prstu na predných labkách sme uskutočnili na 32 živých zvieratách (8 K samcov, 8 T samcov, 8 K samíc, 8 T samíc) prostredníctvom posuvného meradla s presnosťou na desatiny milimetra vo veku približne 80 dní. Údaje sme vyhodnotili t-testom. Výsledky Porovnaním druhého a štvrtého prsta a 2D:4D pomeru ľavej a pravej prednej labky samčieho a samičieho potomstva sme zistili nasledovné skutočnosti: Samce prenatálne ovplyvnené testosterónom majú oproti kontrole pomer 2D:4D signifikantne nižší (P<0,001) na ľavej aj pravej labke (Obr. 1). Rovnako u samíc prenatálne vystavenie zvýšenej hladine testosterónu spôsobilo pokles v pomere 2D:4D (P<0,001) na ľavej aj pravej labke (Obr. 2). Takisto veľkosť štvrtého prsta na ľavej aj pravej labke samcov bola signifikantne väčšia u testosterónovej skupiny (P<0,001). Vo veľkosti druhého prsta na oboch labkách sme u samcov nezistili signifikantný rozdiel (Obr. 3). U samíc sa nám podobne ako u samcov potvrdili rozdiely iba v dĺžke štvrtých prstov na oboch labkách (P<0,001), pričom tak ako u samcov, mali testosterónom ovplyvnené samice štvrtý prst dlhší (Obr. 3). 327 1,4 1,2 ** ** ľavá pravá 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Kontrola Testosterón Obr. 1. Pomer druhého a štvrtého prsta ľavej a pravej prednej labky samcov potkana. Hodnoty sú udávané ako priemer ± SEM, **P<0,001. 1,2 ** ** ľavá pravá 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Kontrola Testosterón Obr. 2. Pomer druhého a štvrtého prsta ľavej a pravej prednej labky samíc potkana. Hodnoty sú udávané ako priemer ± SEM, **P<0,001. Tab.3: Dĺžka druhého a štvrtého prsta predných labiek potkana. samce samice labka prst kontrola testosterón kontrola testosterón ľavá 2. 0,76 ± 0,02 0,7 ± 0,02 0,68 ± 0,03 0,64 ± 0,02 4. 0,67 ± 0,02 0,8 ± 0,01** 0,63 ± 0,03 0,75 ± 0,01** 2. 0,71 ± 0,01 0,67 ± 0,01 0,67 ± 0,02 0,64 ± 0,02 4. 0,65 ± 0,01 0,79 ± 0,02** 0,64 ± 0,02 0,78 ± 0,01** pravá Hodnoty sú udávané ako priemer ± SEM, **P<0,001. Diskusia Z našich výsledkov vyplýva, že zvýšená hladina maternálneho testosterónu počas prenatálneho vývinu mláďat signifikantne znižuje pomer 2D:4D u samcov aj u samíc na oboch predných labkách. Ak vychádzame z predpokladu, že je tento pomer dôležitým 328 ukazovateľom prenatálneho vplyvu androgénov (Manning a kol., 1998) ide podobne ako v prípade homosexuálnych žien (Williams a kol., 2000) ale aj žien s CAH (Brown a kol., 2002b) o účinok prenatálne zvýšenej hladiny testosterónu. V dôsledku zvýšenia hladiny testosterónu počas gravidity prichádza k tzv. maskulinizácii plodu, ktorá sa prejaví nielen na poklese hodnoty pomeru 2D:4D (Rizwan a kol. 2007), ale aj na vzniku extrémne mužského mozgu (Baron-Cohen, 2002). U oboch pohlaví nami testovaných potkanov prenatálne ovplyvnených zvýšenou hladinou testosterónu sme zistili, že prišlo k štatisticky preukaznému predĺženiu štvrtého prsta na pravej aj ľavej končatine u oboch pohlaví. Aj tu ide pravdepodobne o maskulinizačný účinok testosterónu ktorý vedie u mužov k zvýšeniu veľkosti štvrtého prsta (Peters a kol., 2002). Vplyv zvýšenej hladiny prenatálneho testosterónu na pomer 2D:4D ako aj na samotnú dĺžku štvrtého prsta u oboch pohlaví nami testovaných potkanov poukazuje na fakt, že spojitosť medzi prenatálnym testosterónom a dĺžkou prstov existuje aj u iných živočíšnych druhov ako je človek. Potkany sa preto v budúcnosti (podobne ako myši) môžu využívať ako animálny model na štúdium korelácie medzi prenatálnou hladinou testosterónu, dĺžkou prstov a niektorými špecifickými prejavmi resp. poruchami správania súvisiacimi práve s prenatálnymi účinkami testosterónu. Záver Prenatálne zvýšená hladina testosterónu maskulinizuje 2D:4D pomer u potomstva laboratórneho potkana samčieho aj samičieho pohlavia. Poďakovanie Tento projekt bol zrealizovaný vďaka finančnej podpore grantu VEGA 43434/07 Literatúra Baron-Cohen S, Lutchmaya S, Knickmeyer R. (eds.) Prenatal Testosterone in Mind. A Bradford Book, London, pp. 131, 2004. Baron-Cohen S. The extreme male brain theory of autism. Trends Cogn. Sci., 6:248-254, 2002. Brown WM, Finn, CJ, Breedlove SM. Sexual Dimorphism in Digit-length Ratios of Laboratory Mice. The anatomical Record 267:231-234, 2002a. Brown WM, Hines M, Fane BA, Breedlove SM. Masculinized Finger Length Patterns in Human Males and Females with Congenital Adrenal Hyperplasia. Horm. Behav. 42:380-386, 2002b. Casto JM, Ward OB, Bartke A. Play, copulation, anatomy, and testosterone in gonadally intact male rats prenatally exposed to flutamide. Phys.Behav. 79:633-641, 2003. de Bruin EI, Verheij F, Wiegman T, Ferdinand RF. Differences in finger length ratio between males with autism, pervasive developmental disorder-not otherwise specified, ADHD, and anxiety disorders. Developmental Medicine &Child Neurology 48:962-965, 2006. Dörner G, Götz F, Rohde W, Plagemann A, Lindner R, Peters H, Ghanaati Z. Genetic and Epigenetic Effects on Sexual Brain Organization Mediated by Sex Hormones. Neuroendocrinol. Lett., 22:403-409, 2001. 329 Garcia-Falgueras A, Pinos H, Collado P, Pasaro E, Fernandez R, Jordan CL, Segovia S, Guillamon A. The role of the androgen receptor in CNS masculinization. Brain Res., 1035:13-23, 2005. Gorski RA, Harlan RE, Jacobson CD, Shryne JE, Southam AM. Evidence for the existence of a sexually dimorphic nucleus in the preoptic area of the rat. J. Comp. Neurol., 193:529-39, 1980. Hotchkiss AK, Ostby JS, Vandenbergh JG, Gray LE. Androgens and Environmental Antiandrogens Affect Reproductive Development and Play Behavior in the Sprague-Dawley Rat. Environ Health Perspect 110:435439, 2002. Hsu HK, Yang RC, Shih HC, Hsieh YL, Chen UY, Hsu C. Prenatal exposure of testosterone prevents SDN-POA neurons of postnatal male rats from apoptosis through NMDA receptor. J. Neurophysiol., 86:2374–2380, 2001. Jesmin S, Togashi H, Sakuma I, Mowa CN, Ueno K, Yamaguchi T, Yoshioka M, Kitabatake A. Gonadal Hormones and Frontocortical Expression of Vascular Endothelial Growth Factor in Male Stroke-Prone, Spontaneously Hypertensive Rats, a Model for Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder. Endocrinology 145:4330-4343, 2004. Kreze A, Langer P, Klimeš I, Stárka L, Payer J, Michálek J. (eds.) Všeobecná a klinická endokrinológia. Academic electronic press, Bratislava pp. 912, 2004. Manning JT, Baron-Cohen S, Wheelwright S, Sanders G. The 2nd to 4th digit ratio and autism. Developmental Medicine &Child Neurology 43:160-164, 2001. Manning JT, Scott D, Wilson J, Lewis-Jones DI. (). The ratio of 2nd to 4th digit length: A predictor of sperm numbers and concentrations of testosterone, luteinizing hormone and oestrogen. Hum. Reprod. 13:3000–3004, 1998. Miller EM. Prenatal sex hormone transfer: A reason to study opposite-sex twins. Person. Individ. Diff. 17:511529, 1994. Morris JA, Jordan CL, Breedlove SM. Sexual differentiation of the vertebrate nervous system. Nat. Neurosci., 7:1034-1039, 2004. Peichel CL, Prabhakaran B, Voght TF: The mouse Ulnaless mutation deregulates posterior HoxD gene expression and alters appendicular patterning. Development. 124:3481-3492, 1997. Peters M, Mackenzie K, Bryden P. Finger length and distal finger extent patterns in humans. Am J Phys Anthropol, 117: 209-17, 2002. Rizwan S, Manning JT, Brabin BJ. Maternal smoking during pregnancy and possible effects of in utero testosterone: evidence from the 2D:4D finger length ratio. Early Hum Dev. 83:87-90, 2007. Williams TJ, Pepitone ME, Christensen SE, Cooke BM, Huberman AD, Breedlove NJ, Breedlove TJ, Jordan CL, Breedlove SM: Finger-length ratios and sexual orientation. Nature 404:455-456, 2000. Kontaktná adresa: Mgr. Alžbeta Talarovičová, Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Mlynská dolina B-2, 842 15 Bratislava, [email protected] POSSIBLE INTERACTION OF SOMATIC CELL COUNT AND QUARTER MILK FLOW PATTERNS Tančin,V1 Ipema,2 A. H., Mačuhová,1 L., Uhrinčať,1 M., Hogewerf2 P. 1Slovak Centre of Agricultural Research, Hlohovská 2, SK-949 92 Nitra, Slovakia, [email protected] Sciences Group Wageningen UR, P.O. Box 65, NL-8200 AB Lelystad, The Netherlands 2Animal Abstract Milk flow parameters at udder and quarter levels were studied in relation to somatic cell count (SCC) and other risk factors for mastitis (duration of decline and overmilking phase). Thirty-eight Holstein cows in their first to sixth lactations were investigated during 10 mo of lactation. Monthly milk samples were collected for SCC during morning milking. The SCC differentially affected whole udder milk flow and quarter level milk flow. At both the udder 330 and quarter levels milk yield was reduced in groups with high SCC. Quarters with high SCC (over 500 x 103 cells/mL) had lower peak flow rate and longer overmilking phases when compared with quarters with low SCC (less than 200 x 103 cells/mL). The quarters with a longer duration of the decline phase (over 80 s) had greater SCC and peak flow rate but had lower milk yield compared with quarters with a shorter duration of the decline phase (less than 27 s). Duration of the overmilking phase influenced all measured parameters except SCC. We conclude that for good udder health the duration of the decline phase at the quarter level should be considered for milking parameters and udder preparation before milking. Introduction Somatic cell count (SCC) is an indicator of mastitis and its relationship to the parameters of milk flow pattern could be important for improving of milking conditions. The duration of the decline phase for udder milk flow was positively correlated with SCC perhaps implying a negative effect of overmilking individual quarters within the udder (Naumann et al., 1998). Overmilking the udder creates a high risk for poor udder health (Natzke et al., 1978) although no correlation between the duration of overmilking of earlier milked out quarter and SCC was found (Wellnitz et al., 1999). It is also known that cows with a high peak flow rate are more sensitive to mastitis (Grindal and Hillerton, 1991). Few studies have addressed the quarter milk flow pattern or milkability and SCC (Naumann and Fahr, 2000; Kohler and Kaufmann, 2003). We have found that quarters with longer decline phases had greater SCC (Tančin et al., 2002) and quarters with a high peak flow had a longer decline phase (Tančin et al., 2003, 2006). It is important to know if there are quarter milk flow characteristics that can be used for earlier identification of health problems or if specific milk flow characteristics are risk factors for mastitis. An experiment was conducted to study the milk flow characteristics at the udder and quarter levels in relation to SCC and other mastitis risk factors (duration of decline and overmilking phase). Materials and methods The study was conducted at the experimental farm “De Vijf Roeden” in the Netherlands in 1999 and 2000. Thirty-eight Holstein cows (first to sixth lactation) were investigated during 10 mo of lactation. Cows were free of clinical symptoms of mastitis. Cows were milked twice a day at 0530 and 1530 h in a 2 x 3 open auto tandem milking parlor. Premilking udder preparation lasted 8 to 10 s per udder and consisted of forestripping, cleaning and drying with 331 a dry paper towel. A cluster was attached immediately after preparation. Quarter milk was collected in receiver jars that were mounted in a basement below the milking stalls (Tančin et al., 2006a). The milk samples for SCC were collected monthly at the end of a milking from the quarter milk receiver jars. The cow was included in the statistical analysis if one quarter was found to have SCC higher than 200 x 103 cells/mL. There were 3,262 quarter milk flow curves and 804 udder milk curves flow from 22 cows (6 primiparous and 16 multiparous). The milk yield and the milk flow measures at quarter and udder levels were analyzed by the mixed model procedure (SAS, version 8.2, 2001). The results of SCC were log transformed. Results The SCC differentially affected whole udder milk flow and quarter level milk flow (Table 1). At both the udder and quarter levels milk yield was reduced in groups with high SCC. Quarters with high SCC (over 500 x 103 cells/mL) had lower PFR and longer overmilking phases when compared with quarters with low SCC (less than 200 x 103 cells/mL). There was a tendency for longer duration of the decline phase in quarters with high SCC but this effect was not seen at the udder level. The duration of decline phase at the quarter level influenced all measured end points except the duration of the increase phase (Table 2). Quarters with long duration of the decline phase (over 80 s) had higher SCC and higher PFR but had lower milk yield compared with quarters with lower duration of the decline phase (less than 27 s). Quarters with longer duration of decline phase had longer duration of overmilking. Duration of the overmilking phase affected all measured parameters except SCC (Table 2). Discussion The duration of the decline phase and the PFR could be important factors related to SCC. We found higher SCC in quarters with duration of decline phase over 80 s. The data agree with our published results (Tančin et al., 2002). The quarters with a longer decline phase had less milk yield and higher PFR than quarters with a shorter decline phase. Quarters with a longer overmilking phase had lower milk yield and higher PFR but there was no effect on SCC. On the basis of these findings we suggest that quarters with a long overmilking phase are quarters that are milked out faster because of a higher PFR and a lower milk yield. Quarters with a long decline phase could be more sensitive to health problems because they are comprised mostly of quarters with high PFR (Grindal and Hillerton, 1991). 332 When SCC was evaluated, no difference in PFR at the udder level was detected but a reduction of PFR in quarters with high SCC was observed. These quarters had the longest duration of the decline phase in spite of the lowest PFR. We believe that one or more quarters with high SCC within such udders reduce milk yield and consequently PFR. Additionally, we can speculate that reduced PFR in such quarters could be related to high SCC by influencing the free flow of milk through milk ducts from alveoli to cistern. Other unknown peripheral mechanisms may limit milk flow as well (Bruckmaier et al., 1993). The relationship between SCC and the decline phase is more difficult to explain because we do not know if a high SCC is a consequence of or the reason for the longer duration of the decline phase. The majority of machine-induced infections occur near the end of milking and a possible explanation could be adapted from Philpot and Nickerson (1991). They discussed the possible importance of reduced milk flow near the end of milking. Reduced milk flow near the end of milking decreases the chance of microorganisms being flushed out of the teat and increases the likelihood of infection in the quarter. The duration of decline phase at the quarter level, therefore, should be minimized because of the possible negative relationship to udder health. Present machine milking systems, however, are not able to reduce the duration of the decline phase. The duration of decline phase at the udder level indicates the overmilking of one or more quarters. No effect of SCC score on the decline phase at the udder level was observed although quarters with high SCC had the longest overmilking. A negative effect of the duration of overmilking phase on udder health at the udder level has been described (Natzke et al., 1978; Naumann et al., 1998) but this relationship seems to have less importance at the quarter level (Wellnitz et al., 1999). Our data also showed that quarters with long duration of overmilking did not differ in SCC from quarters with short overmilking. Osteras and Lund (1988) reported that overmilking for > 1 min predisposes cows to subclinical mastitis under field conditions. References Bruckmaier, R. M., M. Schallibaum, and J. W. Blum. 1993. Escherichia coli endotoxin-induced mastitis in dairy cows: changes and importance of insulin-like growth factor I and oxytocin. Milchwissenschaft 48:374-378 Grindal, R. J., and J. E. Hillerton. 1991. Influence of milk flow rate on new intramammary infection in dairy cows. J. Dairy Res. 58:263-268. Kohler, S. D., and O. Kaufmann. 2003. Quarter-related measurements of milkings and milk parameters in an AMS herd. Milchwissenschaft 58:3-6. Natzke, R. P., P. A. Oltenacu, and G. H. Schmidt. 1978. Change in udder health with overmilking. J. Dairy Sci. 61:233-238 Naumann, I., and R. D. Fahr. 2000. Investigation of milk flow from udder quarters. Arch. Tierz., Dummerstorf 43:431-440 333 Naumann, I., R. D. Fahr, and G. Lengerken. 1998. Relationship between somatic cell count of milk and special parameters of milk flow curves of cows. Arch. Tierz., Dummerstorf 41:237-250. Osteras, O., and A. Lund. 1988. Epidemiological analyses of the associations between bovine udder health and milking machine and milking management. Prev. Vet. Med. 6:91-108. Philpot W. N., and S. C. Nickerson. 1991. Mastitis: counter attack. A strategy to combat mastitis. Published by Babson Bros. Co., Naperville, IL SAS 8,2 Institute Inc., Cary, NC, USA, 2001. Tančin, V., B. Ipema, D. Peškovičová, P. Hogewerf, and J. Mačuhová. 2003. Quarter milk flow patterns in dairy cows: factors involved and repeatability. Vet. Med. – Czech 48:275-282. Tančin, V., B. Ipema, P. Hogewerf, P. Groot Koerkamp, S. Mihina, and R. M. Bruckmaier. 2002. Milk flow patterns at the end of milking at the whole udder or quarter levels: relationship to somatic cell counts. Milchwissenschaft 57:306-309. Tančin, V., B. Ipema, P. Hogewerf, P., and J. Mačuhová. 2006. Sources of Variation in milk flow characteristics at udder and quarter levels. J. Dairy Sci. 89:978-988 Wellnitz, O., R. M. Bruckmaier, and J. W. Blum. 1999. Milk ejection and milk removal of single quarters in high yielding dairy cows. Milchwissenschaft. 54:303-306. Kontaktná adresa: doc. Ing. Vladimír Tančin, DrSc.Slovak Centre of Agricultural Research, Hlohovská 2, SK-949 92 Nitra, Slovakia, [email protected] Table 1. Least squares means and SEM of measured variables at udder and quarter level in relation to the level of somatic cell count (SCC). Udder level SCC, cells/mL Quarter level SCC, cells/mL 2x105- < 2x105 Number 353 a Milk yield, kg 18.61±0.47 a Milking time, s 463± 5 Peak flow, kg/min 3.79±0.21a 2x105-5x105 > 5x105 210 241 b 17.61±0.45 b P< 5x105 < 2x105 2669 b 17.30±0.47 b > 5x105 291 a 0.0001 4.29±0.14 a P< 302 b 4.01±0.14 b 3.61±0.14c b 0.0001 429±14 434±15 0.0001 372±13 362±12 367±13 0.0001 3.94±0.21b 3.79±0.21a 0.0009 0.95±0.05a 0.91±0.04a 0.83±0.05b 0.0001 Milk yield in 1st min, g 1661±104 1732±105 1582±105 0.1114 422±21a 398±23b 320±23c 0.0001 Phase increase, s 83±4 81±4 83±4 0.8106 75±4 75±4 75±4 0.9159 a b b 212±10 172±10 178±10 0.0001 231±16 221±16 228±16 0.0875 Phase of decline, s 169±10 171±10 168±10 0.8996 63±6 67±6 70±6 0.0578 66±6a 62±7a 79±7b 0.0042 Phase plateau, s Phase of overmilking, s abc Least squares means within 1 line of evaluated level without a common superscript letter were significantly different at P < 0.05 334 Table 2. Least squares means and SEM of measured variables in relation to the duration of decline and overmilking phases Category of decline, s <27 Number Category of overmilking, s 27-79 >80 P< 789 1695 a Milk yield, kg 4.04±0.15 a Milking time, s Peak flow, kg/min 0.79±0.05 min, g Phase increase, s 346±22a 75±4 286±16 985 b 3.75±0.15 b >100 0.99±0.05 392±23b 400±23c P< 0.0001 0.83±0.05 161±15 of overmilking, s log cells/mL x, 63±7a 74±7b 71±7b 4.68±0.08a 4.87±0.07b 4.91±0.08b 309±13 b 0.96±0.04 380±21b 426±23c b 72±4 b 0.0001 0.0001 c 0.90±0.04 75±4 0.0001 278±15 3.65±0.15c c b a Phase of decline, s Phase 334±23a 0.7471 80±5 c 3.98±0.14 366±12 a 0.0001 1019 b b a 76±4 232±15 0.0001 4.27±0.15 0.0001 427±12 c 0.89±0.05 b 1258 a a 358± 13 b 75±4 a Phase plateau, s 4.11±0.14 359±13 385±13 Milk yield in 1st 778 a b a abc 15-99 of quarters SCC <15 0.0001 0.0001 0.0002 c 227±14 173±15 0.0001 75±4a 68±4b 65±5b 0.0001 4.80±0.08 4.77±0.08 4.85±0.08 0.0025 0.0003 Least squares means within 1 line of evaluated level without a common superscript letter were significantly different at P < 0.05. PROTEÍNY AKÚTNEJ FÁZY VO VZŤAHU K VYBRANÝM UKAZOVATEĽOM VNÚTORNÉHO PROSTREDIA U DOJNÍC ACUTE PHACE PROTEINS IN RELATION TO SELECTED PARAMETERS OF INTERNAL STATUS IN DAIRY COWS Tóthová, Cs., Nagy, O., Konvičná, J., Petrovič, V., Pisarčíková, J., Kováč, G. University of Veterinary Medicine, Košice, Slovak Republic Abstrakt Zámerom práce bolo sledovanie koncentrácie vybraných proteínov akútnej fázy – haptoglobínu (Hp) a sérového amyloidu A (SAA) – v krvnom sére dojníc vo vzťahu k rôznym fázam reprodukčného cyklu, ako aj vo vzťahu k niektorým ukazovateľom bielkovinového metabolizmu (celkové bielkoviny, albumín, urea, kreatinín, celkové imunoglobulíny). Analýzy boli vykonané celkovo u 64 dojníc plemena slovenský strakatý dobytok, ktoré boli rozdelené do 9 skupín podľa reprodukčného obdobia – od 4 týždňov pred pôrodom do 10 týždňov po pôrode. V prípade Hp a SAA sme zaznamenali významné rozdiely priemerných hodnôt ich koncentrácií v jednotlivých skupinách počas sledovaného obdobia (P<0,05 resp. 335 0.1526 P<0,001). Koncentrácie Hp a SAA u dojníc v ranom popôrodnom období boli signifikantne vyššie v porovnaní s neskorším popôrodným obdobím. Významné rozdiely priemerných hodnôt počas sledovaného obdobia sme zistili aj u celkových bielkovín (P<0,001), urey (P<0,001) a celkových imunoglobulínov (P<0,05). Koncentrácia albumínu, ako jedného z predstaviteľov negatívnych proteínov akútnej fázy, sa postupne znižovala v popôrodnom období až po obdobie 4 týždne po pôrode. Pri hodnotení korelačných vzťahov bola zistená významná korelácia dynamiky medzi Hp a SAA (P<0,001), celkovými bielkovinami a ureou (P<0,05), resp. celkovými imunoglobulínmi (P<0,01), a medzi celkovými imunoglobulínmi a ureou (P<0,001). Naše výsledky poukazujú na to, že v období okolo pôrodu dochádza k významným zmenám v koncentrácii proteínov akútnej fázy, ako aj v celom bielkovinovom metabolizme dojníc. Abstract The aim of this study was to evaluate the concentrations of selected acute phase proteins – haptoglobin (Hp) and serum amyloid A (SAA) – in blood serum of dairy cows in relation to different phases of reproduction cycle, as well as to some variables of protein metabolism (total proteins, albumin, urea, creatinin, total immunoglobulins). The analysis were performed in dairy cows of a low-land black spotted breed divided into 9 groups according to the reproduction period – from 4 weeks before parturition to 10 weeks after parturition. In case of Hp and SAA we found significant differences in average values of their cocentrations in several groups during the monitored period. The Hp and SAA concentrations in cows during early postparturient period were significantly higher compared with later postparturient period. We found significant differences of average values throughout the monitored time in total proteins (P<0,001), urea (P<0,001), and total immunoglobulins (P<0,05). The concentration of albumin, like one of representant of negative acute phase proteins, decreased progressively in postparturient period until 4 weeks after parturition. In assessment of correlation relations we found significant correlations of dynamics between Hp and SAA (r=0,916; P<0,001), total proteins and urea (r=0,668; P<0,05), total proteins and total immunoglobulins (r=0,826; P<0,01), and between total imunoglobulins and urea (r=0,899; P<0,001). Our results suggests, that in time around parturition there are significant changes in concentrations of acute phase proteins, as well as in complete protein metabolism of dairy cows. 336 Úvod Prechodné, alebo peripartálne obdobie je najkritickejším obdobím u dojníc z pohľadu zdravia, produkcie a úžitkovosti. Predstavuje konečnú fázu gravidity a začiatok laktácie, spravidla 3 týždne pred a 3 týždne po pôrode (Grummer a kol., 1995). Väčšina infekčných ochorení a metabolických porúch, ako pôrodná paréza, ketóza, syndróm stučnenia kráv, dislokácie slezu, zadržanie lôžka, metritída, sa vyskytuje u kráv v tomto období (Stabel a kol., 2003). Imunosupresia v uvedenom období vedie k zvýšenej náchylnosti k mastitídam (Mallard a kol., 1998). V dôsledku oslabenia imunitného systému kravy sa stanú menej rezistentnými voči infekčným ochoreniam, nastávajú veľké zmeny v celom metabolizme a naruší sa homeostáza. Na tieto zmeny zvieratá reagujú sledom fyziologických reakcií. Jedným z nich je aj odpoveď akútnej fázy zápalu ako súčasť všeobecného nešpecifického imunitného systému. Základná odpoveď na vniknutie patogénov alebo poškodenie sa začína aktiváciou makrofágov. Aktivované makrofágy uvoľňujú celý rad produktov známych ako cytokíny, z ktorých najvýznamnejšie sú TNF-α, interleukín-1 a interleukín-6. Uvedené mediátory medzi inými funkciami podporujú produkciu rôznych proteínov v pečeni, ako sú sérový amyloid A (SAA) a haptoglobín (Hp) (Kováč a kol., 2005). Zámerom práce bolo sledovanie koncentrácie vybraných proteínov akútnej fázy – haptoglobínu a sérového amyloidu A – v krvnom sére dojníc vo vzťahu k rôznym fázam peripartálneho obdobia, ako aj vo vzťahu k niektorým ukazovateľom bielkovinového metabolizmu. Materiál a metodika Vybrané proteíny akútnej fázy – haptoglobín (Hp) a sérový amyloid A (SAA) - a vybrané parametre bielkovinového profilu - celkové bielkoviny (CB), albumín (Alb), urea (U), kreatinín (Kreat) a celkové imunoglobulíny (CIg) - boli sledované celkovo u 64 dojníc plemena slovenský strakatý dobytok a jeho krížencov v poľnohospodárskom podniku s modernizovanou technológiou chovu. Zvieratá boli kŕmené 2 krát denne osobitnou kŕmnou dávkou podľa fázy laktácie a produkcie mlieka. Základ ich krmiva tvorili objemové krmivá, a to siláž a senáž. Dojnice mali voľný prístup k pitnej vode z vlastnej studne. Zvieratá boli rozdelené do 9 skupín podľa určitých štádií predpôrodného a popôrodného obdobia: 1. - 4 týždne pred pôrodom (n=6), 2. – 1 týždeň pred pôrodom (n=8), 3. – 1 týždeň po pôrode (n=6), 4. – 2 týždne po pôrode (n=11), 5. – 3 týždne po pôrode (n=7), 6. – 4 týždne po pôrode (n=6), 7. – 5 týždňov po pôrode (n=6), 8. – 8 týždňov po pôrode (n=7), 9. – 10 týždňov po pôrode (n=7). 337 Všetky parametre sa hodnotili v krvnom sére. Krv sa odoberala priamou punkciou v. jugularis. Pred každým odberom boli zvieratá klinicky vyšetrené bežnými klinickými vyšetrovacími metódami. Hodnoty CB, Alb, U a Kreat sa stanovovali automatickým biochemickým analyzátorom Alizé firmy Lisabio. CIg sa analyzovali spektrofotometricky turbidimetrickou metódou zink-sulfátovým testom. Stanovenie Hp a SAA bolo vykonávané metódou enzýmovej imunoanalýzy (ELISA) použitím komerčných ELISA testov firmy Tridelta Development, Ltd. , Wicklow, Írsko. Vyhodnotenie dosiahnutých výsledkov bolo vykonané stanovením priemerných hodnôt (x) a smerodajných odchýlok (sd). Významnosť rozdielov priemerných hodnôt vo vzťahu k jednotlivým sledovaným obdobiam bola hodnotená 1 faktorovou analýzou rozptylov (ANOVA). Významnosť rozdielov priemerných hodnôt medzi jednotlivými skupinami bola vyhodnotená nepárovým t-testom. Zároveň boli vyhodnotené korelačné vzťahy medzi sledovanými ukazovateľmi. Výsledky Výsledky stanovenia koncentrácie Hp, SAA a parametrov bielkovinového profilu sú zhrnuté v tabuľke 1. Blížiacim sa pôrodom sme u dojníc zaznamenali postupné zvyšovanie koncentrácií Hp a SAA, pričom ich najvyššiu priemernú hodnotu (346,64 resp. 127,83 µg/ml) sme zistili u dojníc 1 týždeň po pôrode. V skupine 2 týždne po pôrode sme pozorovali významný pokles koncentrácie SAA (P<0,05). K signifikantnému zníženiu priemernej hodnoty Hp došlo až u dojníc 3 týždne po pôrode. Rozdiely priemerných hodnôt koncentrácie Hp a SAA počas celého sledovaného obdobia v jednotlivých skupinách dojníc boli významné (ANOVA, P<0,05 resp. P<0,001). Štatisticky významné rozdiely sme zistili aj u CB (P<0,001), U (P<0,001) a CIg (P<0,05). Po signifikantnom poklese koncentrácie CB u dojníc 1 týždeň pred pôrodom došlo k následnému vzostupu ich hodnoty, s ďalším významným zvýšením priemernej hodnoty 2 týždne po pôrode (P<0,05). V koncentráciách CIg sme pozorovali počas sledovania trend postupného zvyšovania hodnôt. Najvyššiu priemernú koncentráciu 31,82 UZST sme zaznamenali u dojníc 10 týždňov po pôrode. V prípade albumínu sme zistili opačný trend, a to postupné znižovanie jeho koncentrácie v krvnom sére dojníc počas peripartálneho obdobia. Pri hodnotení korelačných vzťahov medzi Hp a SAA bola významná korelácia (P<0,001). Hodnotením korelačných vzťahov medzi sledovanými ukazovateľmi bielkovinového profilu sme zistili významnú koreláciu dynamiky medzi CB a U (P<0,05), resp. CIg (P<0,01), a medzi CIg a U (P<0,001). 338 Diskusia Úlohou proteínov akútnej fázy je izolovať a neutralizovať patogény, zamedziť ich ďalšiemu šíreniu, minimalizovať poškodenie tkaniva, podporovať opravné procesy a obnoviť normálne fyziologické funkcie (Kushner, 1982). Koncentrácia sérového amyloidu A sa zvyšuje v krvnom sére dojníc bezprostredne po pôrode (Alsemgeest a kol., 1993). Ametaj (2005) tiež uvádza, že k zvýšeniu dvoch hlavných proteínov akútnej fázy, Hp a SAA, dochádza hneď po pôrode. My sme pozorovali nesignifikantné zvýšenie ich koncentrácií už 1 týždeň pred pôrodom. Koncentrácie Hp a SAA sú zvýšené úmerne k počtu somatických buniek a zápalovým procesom mliečnej žľazy (Kováč a kol., 2007). Pechová a kol. (2002) sledovali dojnice v období od 2 týždňov pred pôrodom do 5 týždňov po pôrode, počas ktorého koncentrácia albumínu bola rovnaká a neprekročila fyziologické rozpätie. My sme zaznamenali postupné klesanie jeho koncentrácie v peripartálnom období, najnižšiu hodnotu 35,03 g/l sme zistili u dojníc 4 týždne po pôrode. Albumín, ako jeden z predstaviteľov negatívnych proteínov akútnej fázy, je vhodnejším ukazovateľom pri rozlišovaní chronických procesov od akútnych stavov, k výraznému znižovaniu jeho koncentrácie v plazme totiž dochádza najmä pri chronických ochoreniach. Pri chronických infekciách odpoveď pozitívnych proteínov akútnej fázy je menej evidentná (Stephensen, 1999). Rôzne typy imunoglobulínov, sú vylučované bovinnými plazmatickými bunkami. Van Kampen a Mallard (1997) uvádzajú, že pred pôrodom a pri pôrode sa nachádza v krvi menšie množstvo B-buniek, než po pôrode. Vzhľadom na ich funkčnú aktivitu sa v období okolo pôrodu pozoruje znížená produkcia protilátok. Aj naše výsledky poukazujú na to, že v peripartálnom období je nižšia koncentrácia celkových imunoglobulínov v krvi, k ich zvyšovaniu dochádza až v neskoršom popôrodnom období. Mordak a Nicpoń (2006) zaznamenali v postpartálnom období nižšiu koncentráciu celkových proteínov. Spomínané znižovanie môže byť zapríčinené transferom γ-globulínov z krvi do mliečnej žľazy (Kupczyński a kol., 2002). Naše výsledky sú v rozpore s týmito tvrdeniami, my sme totiž zaznamenali v popôrodnom období signifikantné zvýšenie ich koncentrácií. Záver Naše výsledky poukazujú na to, že v období okolo pôrodu dochádza k významným zmenám v koncentrácii proteínov akútnej fázy, ako aj v celom bielkovinovom metabolizme dojníc. Zaznamenali sme v sledovanom období signifikantné zmeny v dynamike ich hodnôt ako aj niektoré korelačné súvislosti. 339 Literatúra 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Ametaj, B.N.: A new understanding of the causes of fatty liver in dairy cows. Advances in Dairy Technology, 17, 2005: 97-112. Alsemgeest, S.P., Taverne, M.A., Boosman, R., van der Weyden, B.C., Gruys, E.: Peripartum acutephase protein serum amyloid-A concentration in plasma of cows and fetuses. Am. J. Vet. Res., 54 (1), 1993: 164-167. Grummer, R.R.: Impact of changes in organic nutrient metabolism on feeding the transition dairy cow. J. Anim. Sci., 73, 1995: 2820-2833. Kováč, G., Popelková, M., Tkáčiková, Ľ., Burdová, O., Ihnát, O.: Interrelationship between somatic cell count and acute phase proteins in serum and milk of dairy cows. Acta Vet. Brno, 76, 2007. Kováč, G., Vargová, M., Popelková, M.: Proteíny akútnej fázy u zvierat. VI. Celoslovenský seminár z fyziológie živočíchov. 8 – 9. júna 2005. SPU Nitra. Zborník z vedeckých seminárov s medzinárodnou účasťou. 113-116. ISBN 80-8069-526-1. Kupczyński, R., Chudoba-Drozdowska, B.: Values of selected biochemical parameters of cows blood during their Drying-off and the beginning of lactation. Electronic Journal of Polish Agricultural Universities, Veterinary Medicine, 5(1), 2002. Kushner, I.: The phenomenon of the acute phase response. Ann. N. Y. Acad. Sci., 389, 1982: 39-48. Mallard, B.A., Dekkers, J.C., Ireland, M.J., Leslie, K.E., Sharif, S., Van Kampen, C.L., Wagter, L., Wilkie, B.N.: Alteration in immune responsiveness during the peripartum period and its ramification on dairy cow and calf health. J. Dairy. Sci., 81, 1998: 585-595. Mordak, R., Nicpoń, J.: Values of some blood parameters in dairy cows before and after delivery as a diagnostic monitoring of health in herd. Electronic Journal of Polish Agricultural Universities, Veterinary Medicine, 9(2), 2006. Pechová, A., Podhorský, A., Lokajová, E., Pavlata, L., Illek, J.: Metabolic effects of chromium supplementation in dairy cows in the peripartal period. Acta Vet. Brno, 71, 2002: 9-18. Stabel, J.R., Goff, J.P., Kimura, K.: Effects of supplemental energy on metabolic and immune measurements in periparturient dairy cows with Johnes disease. J. Dairy Sci., 86, 2003: 3527-3535. Stephensen, C.B.: Burden of infection on growth failure. J. Nutr., 129, 1999: 5348-5388. Van Kampen, C., Mallard, B.A.: Effects of peripartum stress and health on circulating bovine lymphocyte subsets. Veterinary Immunology and Immunopathology, 59, 1997: 79-91. Tabuľka 1. Koncentrácia Hp, SAA a vybraných ukazovateľov bielkovinového profilu v krvnom sére dojníc v sledovaných obdobiach reprodukčného cyklu (x ± sd). Parametre Hp Anova Skupiny dojníc x 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 60,49 83,04 346,64a, 106,69 26,5a 172,6 32,48 32,25 31,99 9 b c d 285,4 79,13 78,87 48,36 70,67 38,88 40,91 24,59i c g d,h b,c,d (µg/ml) sd 37,82 189,30 283,83 163,17 25,61 P < 0,05 0 SAA x 34,81b,e,j 9,16f,j e,f,g,h,i 4,78 57,35 74,71 33,21 12,08 59,81 33,25 34,67 31,64 x 75,15a 67,88a,A, 70,13e,f,g 76,55A,e 74,81 84,27 79,38 81,19 83,50 ,b c,d,B,C,D ,h,E c,i d,f B,g C,h b,D,E,i 5,47 5,07 5,32 4,51 11,76 5,23 7,82 8,29 36,52 37,36 35,64 35,03 40,25 38,54 40,00 a,b,c,d c sd (g/l) 127,83a, sd (g/l) Alb 51,35 ,c,d (µg/ml) CB 6,31a,b x 4,83 a 40,12 b 38,54 < 0,001 < 0,001 n. s. d 340 sd x U a, 3,81 1,74 4,81 b,C,D 3,77 c,E,F 3,88 A,B (mmol/l) sd x Kreat 4,07 0,57 133,9 3,66 4,69 0,49 0,45 b x CIg (UZST) sd 17,28 4,39 2,56 d 4,09 130,40 122,25 31,20 C,b, 23,88 23,44 A,a,B D 2,57 3,87 3,79 A, 5,13 3,87 4,26 4,90 5,47B, C.E,G 0,90 c 118,12 0 sd d d,G A,a (µmol/l) 4,49 a,b,c, 0,87 0,49 0,77 1,25 0,87 98,83 106,2 111,7 122,8 118,9 a A,b,c,d,e d 7 8 1 3 21,84 14,52 14,62 18,38 23,32 17,79 25,41 26,85 27,31 28,28 30,26 31,61 31,82 A,C a,b B,D 3,47 5,82 5,01 4,59 3,22 8,02 n. s. e 24,48 8,01 < 0,001 D,F < 0,05 Rovnaké indexy v riadkoch znamenajú štatistickú významnosť rozdielov priemerných hodnôt medzi jednotlivými skupinami: a, b, c, d, e, f, g, h, i, j - P<0,05 A, B, C, D, E, F, G - P<0,01 VIABILITY OF PREIMPLANTATION RABBIT TRANSGENIC EMBRYOS Turanova Z.,1,2 Makarevich A.V1., Bauer M1., Chrenek P.1,2 1Slovak 2Faculty Agricultural Research Centre in Nitra, Slovak Republic of Biotechnology and Food Sciences, Slovak University of Agriculture in Nitra, Slovak Republic Abstract The objective of this study was to compare quality of transgenic (TR) and nontransgenic rabbit embryos in relation to preimplantation developmental rate, a number of blastomers in ICM and percentage of apoptotic index. The TR embryos were produced by microinjection of the EGFP and hFVIII genes into both pronuclei of fertilized rabbit eggs. The developmental rate and allocation of EGFP positive cells was examined at blastocyst (96h PC) by fluorescent microscope or by PCR as in case of hFVIII gene using. The transgenic rabbit embryos with hFVIII gene were also produced by mating of transgenic rabbits and flushing at 1-cell stage. Percentage of transgenic embryos reached blastocyst stage (90 and 88%) did not differ significantly from those in non-transgenic embryos (98% resp.). Based on fluorescence analysis the integration rate of EGFP gene in blastocyst stage embryos was 20%. The efficiency of hFVIII transgene integration as determined by PCR was 17%. No differences were observed in the total cell number, ICM area cell number and apoptotic nuclei between the groups. The higher number of total cell (142) and ICM area cells (36) were found in no- 341 transgenic rabbit embryos. The index of apoptotic nuclei (2.8%) was detected in nontransgenic rabbit embryos. Our preliminary results indicate that transgenic rabbit embryos (with EGFP or hFVIII gene construct) are of comparable quality with non-transgenic ones in concern of blastocyst rate, total and ICM area cell number and apoptotic index. Introduction In vitro manipulations on embryos have been widely used to produce genetically modified (transgenic or cloned) animals. The main obstacle at this technologies is lower survival and developmental abnormality of embryos. It could be caused by instability of integrated transgene or by other factors. Biological material in in vitro conditions is different in quality and vitality compared to in vivo conditions. Although efficiency of non-transgenic embryos production in in vitro conditions increased in the last decade, the quality of these embryos is still different compared to in vivo-derived embryos, particularly in morphology and metabolism, chromosomal abnormalities (Shi et al., 2004) and ultrastructural changes (Popelková et al., 2005). Cleavage-stage arrest of embryos was also documented in different species, including human, bovine, mice and rabbit and their relation to apoptosis. Production of transgenic embryos by microinjection of foreign gene into pronucleus of fertilized eggs resulted in decrease of survival of microinjected embryos (Makarevich et al., 2005). This may be caused by several factors including microinjection technique (single or double) (Chrenek et al., 2005), culture conditions (Chrenek et al., 1998), transgene localization, number of copies in the genome of embryo, total and ICM area cell number. The aim of this study was to compare quality of transgene and non-transgene rabbit embryos in relation to blastocyst rate, total cell number and ICM cell number in embryos and apoptotic index. Material and Methods Biological material Three days before mating, New Zealand White rabbit donors (SARC Nitra) were treated with PMSG (Werfaser, 20 IU/kg of body weight, Austria) followed by hCG (Werfachor, 40 IU/kg of body weight, Austria) 72h later (Chrenek et al., 2002). At 19 to 20h after mating, the pronuclear stage eggs were flushed from the oviducts of the animals with PBS. The selection of flushed eggs were done in CIM medium+10%FCS (Gibco BRL). The embryos were cultured in in vitro conditions (5%CO2, 39°C, k-DMEM + 10% FCS. Gibco BRL) as was early reported (Chrenek et al., 2005). 342 Gene constructs The EGFP reporter gene were used for microinjection into fertilized rabbit eggs after linearization of the plasmid (Clontech, USA) with Cla I. The second gene construct consists of a 2.5 kb murine whey acidic protein promoter (mWAP), 7.2 kb cDNA of the human clotting factor VIII (hFVIII), and 4.6 kb of 3’ flanking sequences of the mWAP gene. This gene had been provided by Dr. H. Lubon, American Red Cross, MD, USA. The plasmid was digested with Not I to release the 14.3 kb insert and purified in a Qiaex II gel extraction kit (Qiagen, USA). Production of rabbit transgenic embryos in vitro (EGFP gene) After the evaluation of the flushed ova, the eggs with both pronuclei were subjected to microinjection in CIM medium +10% fetal bovine serum (FBS, both from Gibco BRL, USA) using Olympus microscope equipped with micromanipulation units (Alcatel, France) and microinjector (Eppendorf, Femto Jet, Germany). The eggs were fixed by suction with a holding pipette, and 4µg/ml of the DNA (EGFP or hFVIII) in 1-2 pl were microinjected using air pressure into one pronucleus (single microinjection, SM). Swelling of pronuclei by 10% indicated successful microinjection. The eggs were cultured in k-DMEM medium supplemented with 10% FBS (Gibco BRL, USA) at 5% CO2 and 39°C up to the blastocyst stage (96hpc) for the analysis of transgene integration using fluorescent microscope (Chrenek et al., 2005). Production of rabbit transgenic embryos in vivo (hFVIII gene) Transgenic rabbits (F4 generation) carrying human factor VIII (gene construct mWAP-hFVIII, Chrenek et al., 2005) were mated to produce rabbit transgenic embryos, which were then flushed out from oviducts at 1-cell (20hpc). Differential staining Embryos were incubated in freshly prepared 0.2% Triton X-100 in PBS containing 2mg/ml BSA for 20s, and immediately washed twice in PBS-BSA medium. Embryos were transferred into PBS-BSA containing 30µg/ml propidium iodid (PI) and incubated in the dark for 5min in a 37°C warm chamber, and washed twice in PBS-BSA medium. Next, embryos were incubated in 4% paraformaldehyd (PFA) containg 10µg/ml bisbenzimide (Hoechst) for 30min at RT, followed by twice washing in PBS-BSA medium. Embryos were incubated in a freshly prepared ice-cold solution of 0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate (v/v) for 5 min and then washed twice in PBS-BSA medium. Washed embryos were mounted on glass slides and examined under a Leica fluorescence microscope. Analysis of apoptosis (TUNEL) 343 Transgenic embryos were removed from culture medium, washed 3x5min in PBS supplemented with PVP (PBS-PVP, 4mg/ml) and then fixed for 5min in 3.7% formaline and for 10min in 70% ethanol. For membrane permeabilization, embryos were incubated for 15min in 0.5% Triton X-100 in PBS. The embryos were processed for TUNEL using a MEBSTAIN Direct Apoptosis Detection Kit (Immunotech, Marseilles, France) according to the kit instructions. Afterwards, the embryos were counterstained with propidium iodid (PI, 1 µg/ml v PBS). After the washing, embryos were placed on a coverslip and covered with 5µl of Vectashield mounting medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA). For ICM (embryoblast) determination, the method of differential staining including incubation of embryos in PI and Hoechst 33342 (Chrenek et al., 2005) was used. PCR Total DNA was isolated from microinjected embryos, reached the blastocyst stage (Chrenek et al., 2005). As negative controls, DNA isolated from non-microinjected rabbit embryos. DNA was subjected to 30 cycles of amplification (30s at 94 °C, 30s at 64 °C, and 30s at 72 °C) using two sets of primers for the hFVIII gene: 5'-GTA GAC AGC TGT CCA GAG GAA-3' and 5'-CAT GCT GAA TAG CTT CAC GAG TCT T-3' giving a PCR product of 357 bp, or 5'-GTA GAC AGC TGT CCA GAG GAA-3' and 5'-GAT CTG ATT TAG TTG GCC CAT C-3' with a PCR product of 578 bp (Paleyanda et al., 1997). Statistic analysis Total number of blastomere, ICM cells, number of apoptotic nuclei were analysed by SAS software (SAS Institute, 2002). Results and discussion: The rate of development of rabbit embryos microinjected with either the EGFP or hFVIII gene constructs into the male pronucleus (SM) is presented in Table 1. No significant difference in development rate up to blastocyt stage of microinjected rabbit embryos (90 vs 88%) between EGFP and hFVIII gene construct was found. Based on fluorescence analysis the integration rate of EGFP gene in blastocyst stage embryos was 20%. The efficiency of hFVIII transgene integration as determined by PCR was 17%. The total cell number, number of cells in ICM area and percento of apoptotic cells apoptotic index of transgenic rabbit embryos at blastocyst stage are shown in Table 2. No differences were observed in the total cell number, ICM area cell number and apoptotic nuclei between the groups. The higher number of total cell (142) and ICM area cells (36) were found 344 in no-transgenic rabbit embryos. The lower number of apoptotic nuclei (2.8%) we detected in non-transgenic rabbit embryos. Table 1. In vitro development of microinjected rabbit embryos and transgene integration rate ____________________________________________________________________________________________________________ Treatment group Number Morula Blastocyt Transgene of stage stage integration embryos n/N n/N n/N N (%) (%) (%) ________________________________________________________________________ EGFP 100 90/100(90) 90/100(90) 18/90 (20) hFVIII 100 89/100(89) 88/100(88) 15/88 (17) ________________________________________________________________________ Non-injected 100 98/100 (98) 98/100 (98) ________________________________________________________________________ Table 2. Influence of gene integration on the quality of preimplantation rabbit transgenic embryos ____________________________________________________________________ Gene no. of Total cell No. Apoptotic Apoptotic construct embryos number ICM cells index N of Blastocyst cells embryo n (%) n (%) (%) ____________________________________________________________________ EGFP 50 133 ± 2.1 35 ± 0.5(26) 6 ±0.1 (4.5) ± 0.2 hFVIII 50 126 ± 1.8 31 ± 0.3(25) 4 ± 0.1 (3.2) ±0.1 Non-TR 25 142 ± 2.2 36 ± 0.6(25) 4 ± 0.1 (2.8) ±0.1 ____________________________________________________________________ Microinjection of foreign gene into the pronucleus of eggs can result in DNA rearrangement during integration and can cause decreased yield of blastocyst stage embryos (Voss et al. 1996). It is possible that other factors, associated with the microinjection itself, for example, mechanical damage by microinjection pipette, exposure of the zygote to a microscope light of a higher intensity, or their combination may result in decreased quality of Mi-derived embryos. In our experiments lower developmental rate of microinjected/transgenic rabbit embryos was observed, it was not different from nontransgenic control. Present results, obtained on the embryos microinjected/transgenic with two different gene constructs demonstrated that embryo cell number and ICM area cell number were comparable to those in the non-microinjected/non-transgenic embryos. The microinjection 345 procedure in our study tended to decrease blastocyst rate and cell number, but embryo quality was not significantly affected compared to non-transgenic one. Acknowledgment: This work was supported by the Slovak Research and Development Agency under the contract No. LPP-0126-06. References: Chrenek P. et al.: Theriogenology 50, 1998, 659-666. Chrenek P. et al.: Czech J. Anim Sci., 47(2), 2002, 45-49. Chrenek P. et al.: Transgenic Res, 14, 417- 428, 2005. Chrenek P. et al.: Zygote 13, 39-44, 2005. Makarevich A.V. et al.: Zygote 13, 125-137, 2005. Popelkova M. et al.: Zygote 13 (4), 2005, 283-293. Voss, A.K. et al.: Theriogenology 34, 1996, 813-824. ULTRASONOGRAFICKÉ A HISTOLOGICKÉ SLEDOVANIE ÚČINKU HORMONÁLNEJ INDUKCIE ESTRU BAHNÍC MIMO CHOVATEĽSKEJ SEZÓNY ULTRASONOGRAPHIC AND HISTOLOGICAL STUDY OF HORMONAL OESTRUS INDUCTION EFFECT IN ANESTROUS EWES Vlčková, R., Valocký, I., Lazar, G., Maraček, I. Katedra normálnej anatómie, histológie a fyziológie, Ústav fyziológie, UVL Košice Abstract Ultrasonic imaging of ovarian structures is rapid and highly accurate method for veterinary applications in sheep reproduction. In the present study, ovaries were USG analysed with 5.0 MHz linear and 7.5 MHz convex transducer. Follicular data were analysed quantitatively and qualitatively. The ovaries were picked up at the end of laparotomy and fixed in 10 % formalin. Sections of ovarian tissue were stained with haematoxylin and eosin and Azan staining. Ovarian slides were microscopically studied and quantitatively and qualitatively analysed by LUCIA-G ver. 4.6. Number of follicles < 3 mm monitored by USG was significant lower (P<0.01) after CIDR-G treatment. Image analysis of ovary sections determined not significant increase in total number of follicles and follicles < 3 mm opposite to that monitored by USG. Half of total number of antral follicles visible on the ovary surface is prepared for recruitment. The rate of atresia is not significantly higher after CIDR-G treatment and follicles in selection undergone atresia in 100 %. Increase in the number of follicles < 3 mm monitored by USG is due to impossibility of USG to notice image of follicles beginning to create the cavity and with very small cavities. We observed better effect on the follicle surviving after used FGA with 1000 IU eCG treatment. 346 Úvod Ultrasonografické zobrazovanie je veľmi presnou a rýchlou metódou pre hodnotenie štruktúry ovárií. Ultrasonografické snímače s lineárnym prevodníkom sú najvhodnejšie pre veterinárne aplikácie vyžadované u mliečneho dobytka a v reprodukcii oviec (6). Ultrasonograf vybavený 7.5 MHz prevodníkom má lepšie využitie v štúdiu malých ovariálnych štruktúr (vyvíjajúce sa folikuly), pretože má detailnejší obraz. V tejto práci sme analyzovali stav folikulov oviec v anestrickom období, ošetrených progesterónom/syntetickým gestagénom (Fluorogestón acetát, FGA) a 1000 m.j. eCG použitím USG a histologických metód analýzou obrazu (LUCIA-G ver. 4.6). Materiál a metódy Experimenty sme vykonali v poľnohospodárskom družstve podhorskej oblasti Nízkych Tatier na vaječníkoch 8 bahníc mimo estrickej sezóny. Bahnice vyčlenené na pokus boli na vyradenie, 4 – 10 ročné, plemena zošľachtená valaška, vážili 45 – 50 kg a boli v strednej telesnej kondícii (BCS 2,5 – 3,5). Bahnice boli chované tradičným salašníckym spôsobom s extenzívnou až polo intenzívnou pastvou a boli dokrmované kukuričným šrotom (750 g šrotu na kus a deň) – flushing. Bahnice sa dojili klasicky ručne, ráno a večer. Medzi dojeniami sa pásli. Štyri bahnice sme indukovali k estru v jarnom období (koncom apríla; anestrus) aplikáciou pošvových polyuretánových tampónov prípravku Chrono-gest (Intervet, Holandsko) s účinnou látkou fluorogestón acetát (FGA – 40 mg v tampóne) a 4 bahnice prípravkom Eazy-breed CIDR-G (9 % progesterón; Nový Zéland). Pre zvýšenie ovulačného pomeru (OR) bola bahniciam bezprostredne po vysadení tampónov a CIDR-G aplikovaná i.m. injekcia v dávke 1000 m.j. eCG (Sergon a.u.v., Bioveta a.s., ČR). Ultrasonografické (USG) vyšetrenie vaječníkov sme uskutočnili priamo na ich povrchu počas laparotómie (48 – 62 hodín po podaní eCG) prístrojom Sono ACE – 600V (Medison Co., Kórea) s 5 MHz lineárnou sondou PB – 06LV50/65AD (Medison Co., Kórea) a 7,5 MHz konvexnou sondou so získaním USG snímok. Získané ultrasonogramy sme vyhodnotili kvalitatívne a kvantitatívne podľa metód uvádzaných v literatúre (3, 4). Vaječníky pre histologické spracovanie sme fixovali v 10 % formole. Fixované a vypraté vaječníkové vzorky sme po odvodnení v stúpajúcom rade etanolov, presýtení metylsalicylátom a benzén-parafínom zalievali priamo do parafínu. Parafínové rezy o hrúbke 5 – 7 µm sme získali rezaním na sánkovom mikrotóme firmy Reichert (Nemecko). Po odparafínovaní rezov v xyléne, ich zavodnení v zostupnom etanolovom rade a vypratí vo vode sme na farbenie parafínových rezov použili prehľadné farbenie hematoxylín-eozínom a Azanom. Postup spracovania a 347 farbenia vzoriek sme dodržali podľa popisu Vaceka (14). Ofarbené preparáty sme po odvodnení vzostupným etanolovým radom a presýtení xylénom montovali do kanadského balzamu. Hotové preparáty sme prezerali a vyhodnocovali mikroskopom ZEISS Axiolab (Nemecko). Mikrofotografie sme získali prostredníctvom programu pre analýzu obrazu LUCIA G Verzia 4,60 – System for Image Processing, prepojením svetelného mikroskopu s PC pomocou kamery PAL GKB CCD camera CC-8603. Vyhodnocovali sme každý dvadsiaty rez. Všímali sme si počty a veľkosti neatretických a atretických Graafových folikulov na povrchu vaječníka. Ich atréziu sme posudzovali podľa kritérií opísaných autormi Marion, Gier a Choudary (10). Pri jednotlivých metódach vyhodnocovania počtu a veľkostí povrchových terciárnych folikulov sme štatisticky udali ich aritmetický priemer a smerodajnú odchýlku. Štatistické rozdiely sme hodnotili Studentovým t-testom. Výsledky Pri vyhodnocovaní ultrasonogramov (tab. 1) sme zaznamenali celkový počet folikulov takmer rovnaký po ošetrení FGA aj progesterónom. Počet folikulov v štádiu náboru bol pomerne nízky, ale signifikantne vyšší po ošetrení tampónmi impregnovanými FGA. Ostatné údaje neboli štatisticky významné. Pri vyhodnocovaní histologických preparátov (tab. 1) bol zaznamenaný približne dvojnásobný počet všetkých povrchových folikulov a vyšší počet folikulov náborových a v štádiu výberu po ošetrení FGA tampónmi. Rozdiely týchto údajov nevykazovali štatistickú významnosť. Tabuľka 1. Počty terciárnych folikulov po ošetrení FGA, progesterónom a eCG Skupina oviec Metóda Suma folikulov F < 3 mm F > 3 mm CH 1000 USG 10,87 ± 1,94 2,83 ± 0,98 ** 8,00 ± 2,45 (nv = 7) Histológia 26,50 ± 15,60 12,00 ± 8,69 14,50 ± 7,32 C 1000 USG 10,40 ± 2,30 1,80 ± 0,84** 8,60 ±2,41 (nv = 4) Histológia 18,00 ± 8,89 9,50 ± 5,00 8,50 ± 4,83 CH – Chrono-gest (FGA), C – CIDR-G (progesterón), ** P < 0,01 Priemerné veľkosti najväčších folikulov viditeľných na povrchu vaječníkov oviec ošetrených FGA tampónmi aj CIDR sú uvedené v tab. 2. Nezaznamenali sme tu signifikantné rozdiely pri jednotlivých metódach vyhodnocovania pri rôznom hormonálnom ošetrení. 348 Tabuľka 2. Veľkosti najväčších folikulov po ošetrení FGA, progesterónom a eCG Skupina oviec Metóda Priemer najväčších Veľkosť max. F F (mm) (mm) CH 1000 USG 6,95 ± 2,63 12,1 (nv = 7) Histológia 6,53 ± 0,96 7,5 C 1000 USG 6,36 ± 0,71 6,9 (nv = 4) Histológia 5,50 ± 1,73 7,5 CH – Chrono-gest (FGA), C – CIDR-G (progesterón) Graf 1. Výskyt atrézie po ošetrení oviec FGA tampónmi, progesterónom a eCG 105 CH1000 100 C1000 % 95 90 85 80 75 ∑F F < 3 mm F > 3 mm CH – Chrono-gest (FGA), C – CIDR-G (progesterón) Pri analyzovaní histologických preparátov sme určili percentuálne zastúpenie atretických folikulov v štádiu náboru, výberu a celkovú atréziu po ošetrení bahníc progesterónom a FGA tampónmi (graf 1). Zaznamenali sme všeobecne vyššie percento výskytu atrézie po ošetrení prípravkom CIDR-G, pričom všetky folikuly v štádiu výberu podľahli atretickým zmenám. Tieto rozdiely neboli signifikantné. Diskusia U anestrických oviec musí byť progestagén nahradený folikuly stimulujúcimi prípravkami (napr. PMSG/eCG) na indukovanie rastu folikulov, estru a ovulácie. Na zvýšenie počtu ovulácií sme použili metódu stimulácie, kde sme podali eCG v čase vybratia tampónov/CIDR a vo vyšších dávkach, ako uvádzajú rôzni autori (2, 9). Použitie prirodzeného progesterónu a syntetických gestagénov je všeobecne uplatnené (9, 11). Počet povrchových terciárnych folikulov po FGA ošetrení tvoriacich zásobu, z ktorej sa vyvinú ovulačné folikuly, súhlasí 349 s popisom Scaramuzziho a i. (12). Syntetické gestagény a vyššie dávky eCG podporujú selekciu v kohorte náborových folikulov rezultujúcich v zmnoženom výskyte dominantných ovulácie schopných folikulov, ktoré sú pripravené vo väčšom počte ovulovať a zvýšiť tak ovulačný pomer (8). Atrézia folikulov je u väčšiny cicavcov primárne indukovaná apoptózou buniek granulózy a téky. Vysoká dávka eCG (1000 m.j.) zvyšuje vplyv na atréziu vyselektovaných folikulov. Istú úlohu tu môže zohrávať koncentrácia IGF-I vo folikulovej tekutine, ktorá je rozhodujúcim faktorom, či folikul dozrie alebo podľahne atrézii (1). USG vyšetrením vaječníkov použitím 5,0 MHz sondy získame lepšiu penetráciu tkanivom, ale menej detailný obraz. Pri použití 7,5 MHz sondy je prípad opačný (7). Asi štvrtina všetkých folikulov vykazuje tvorbu malých dutín, ktoré sú citlivé na gonadotropín a vo folikulovej tekutine obsahuje androgén. Viac vyvinuté folikuly vykazujú aktivitu aromatázy v dôsledku obsahu estrogénu vo folikulovej tekutine (13). Pozorovať v nich jasnú líniu vo veľkosti, kedy sa folikuly stanú závislými na gonadotropíne a vo veľkosti, kedy sú folikuly vyselektované pre ovuláciu (5). Väčšina folikulov > 4 mm v proestre a estre sa stane preovulačnými. Záver Zvýšený počet folikulov < 3 mm zaznamenaný ultrasonograficky je výsledkom dostupného zariadenia USG na zobrazovanie folikulov, začínajúcich tvoriť dutinu, ktorá je veľmi malá. Lepší výber a proces dominancie folikulov sa zaznamenal po ošetrení FGA a 1000 m.j. eCG. Literatúra 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Armstrong, D.G., McEvoy, T.G., Baxter, G., 2001. Effect of dietary energy and protein on bovine follicular dynamics and embryo production in vitro: associations with the ovarian insulin-like growth factor system. Biol. Reprod., 64:1624-32. Bari, F., Khalid, M., Olf, B., Haresign, W., Murray, A., Merrel, B., 2001. The repeatability of superovulatory response and embryo recovery in sheep. Theriogenology, 56(1):147-155. Bartlewski, P.M., Beard, A.P., Rawlings, N.C., 2000. An ultrasound-aided study of temporal relationships between the patterns of LH/FSH secretion, development of ovulatory.sized antral follicles and formation of corpora lutea in ewes. Theriogenology, 54:229-245. Dickie, A.M., Paterson, C., Anderson, J.L.M., Boyd, J.S., 1999. Determination of corpora lutea numbers in Booroola – Texel ewes using transrectal ultrasound. Theriogenology, 51:1209-1224. Driancourt, M.A., 2001. Regulation of ovarian follicular dynamics in farm animals. Implications for manipulation of reproduction. Theriogenology, 55:1211-39. Fricke, P.M., 2002. Scanning the future – ultrasonography as a reproductive management tool for dairy cattle. J. Dairy Sci., 85:1918-1926. Grygar, I., Kudláč, E., 1997. Sonografie u krávy. Sonografie u malých přežvýkavcú. In: Ultrasonografie ve veterinárním porodnictví a gynekologii, Hlučín, 1997,135-196. Maraček, I., Hendrichovský, V., Kucharský, P., 1991. Analýza plodnosti ako východisko pre intenzifikáciu reprodukcie oviec. Veterinářství, 41:107-110. Maraček, I., Krajničáková, M., Kostecký, M., Danko, J., Švantner, R., 2004. Indukcia a synchronizácia ruje dojných bahníc zošľachtenej valašky počas laktácie: 85 %-ná úspešnosť, 167 %-ná natalita. Slovenský chov, 1:29-30. 350 10. Marion, G.B., Gier, H.T., Choudary, J.B., 1968. Micromorphology of the bovine ovarian follicular system. J. Reprod. Fertil., 27(2):451-465. 11. Notter, D.R., Cocket, N.E., Hadfield, N.E., 2003. Evaluation of melatonin receptor 1a as a candidate gene influencing reproduction in a fall-lambing sheep flock. J. Anim. Sci., 81:912-917. 12. Scaramuzzi, R.J., Adams, N.R., Baird, DT., Campbell, B.K., Dawning, J.A., Findlay, J.K., Henderson, K.M., Martin, G.B., McNatty, K.P., McNeilly, A.S., TsonisS, C.G., 1993. A model for follicle selection and the determination of ovulation rate in the ewe. Reprod. Fertil. Dev., 5:459-478. 13. Strmšnik, L., Pogačnik, M., Čebulj Kadunc, N., Kosec, M., 2002. Examination of oestrus cycle and early pregnancy in sheep using transrectal ultrasonography. Slov. Vet. Res., 39(1):47-58. 14. Vacek, Z., 1990. Histologická technika. In: Histológia a histologická technika, Vydavateľstvo Osveta, 1990, 267-488, ISBN 80-217-0084-X. Kontaktná adresa MVDr. Radoslava Vlčková, Ústav fyziológie KNAHF, Komenského 73, 041 81 Košice Práca bola podporená grantom VEGA 1/0612/03 a projektom aplikovaného výskumu AV 4/0113/06 THE EFFECT OF WATER SALINITY ON THE EMBRYONIC AND LARVALDEVELOPMENT IN THE COMMON FROG RANA TEMPORARIA L. Zamachowski W., R. Stawarz, nad G. Formicki Institute of Biology, Pedagogical University, ul. Podbrzezie 3, 31–054 Kraków Abstract Research was carried out on the embryos and larvae of the common frog Rana temporaria L. The effect of different concentrations of NaCl on the development of approx. 2,200 embryos and approx. 2,000 larvae was studied. It was found that the 5‰ solution of NaCl was a lethal concentration for both the embryos and larvae. In the 1‰ solution of NaCl the development of eggs was similar to that in pure water; the same concerned the mortality of embryos. It was found that the vulnerability of larvae to salinity depended on their developmental stage. Young larvae with external gills were most vulnerable to salinity, whereas older larvae were less vulnerable. The mortality of embryos and larvae increased in line with the growth of NaCl concentration in the solution. The duration of metamorphosis became prolonged as well. The present studies have shown that the common frog Rana temporaria is a typical freshwater amphibian with a very small tolerance for salinity. Key words: salinity, embryonic development, larval development, common frog, Rana temporaria. Introduction The reproduction and development of amphibians is usually connected with water environments. However, the occurrence, breeding and larval development of about 70 amphibian species were reported also from saline waters. Well-known is a strong resistance of Asiatic Rana cancrivora to salinity. Adult individuals of this species were found to tolerate 351 salinity of even 28‰, and its larvae of even 35‰ [1]. In the neighbourhood of Bangkok, Uchiyama et al. [2] observed the occurrence of Rana cancrivora in water with salinity of 33‰. Gordon and Tucker [3] reported the breeding of Rana cancrivora from waters with salinity from 6‰ to 24‰. They described the mechanism of great adaptation abilities of this frog, which can live and breed in both freshwater and marine water of salinity reaching 32‰. Most of the European amphibian species avoid saline waters. There are, however, a few species that are able to survive in waters with small salinity. The studies on the occurrence and reproduction in anurans have shown that some species lay eggs in slightly saline waters. Frogs Rana esculenta and Rana ridibunda and toads Bufo viridis and Bufo calamita were observed to lay eggs in coastal waters of the Baltic Sea [4,5,6,7]. A great tolerance for salinity was observed in Bufo viridis. Gordon [8] reported that it tolerated salinity to 19‰, and exceptionally to 23‰. The other toads, inhabiting the Danube delta, were resistant to salinity reaching 29‰ [9]. Viertel studied the places of courtship and egg-laying of Rana temporaria and the tolerance of its embryos for salinity. Viertel found that this frog chose for breeding waters of the smallest salinity but used also water bodies of salinity approximating the maximal tolerable salinity by its embryos. Adult Rana temporaria kept for 240 hours in water of salinity ranging from 3‰ to 6‰ showed the loss of body mass, the increased haematocrite index of peripheral blood and changes in the water content of the skin, muscles, heart and kidneys [10]. Rana temporaria is generally considered a little tolerant amphibian for salinity but in the literature there are no detailed data on its development in the saline environment and tolerance for salinity. The aim of this study was to determine the lethal and tolerable concentrations of NaCl for developing eggs, embryos and larvae of Rana temporaria and to describe their development in waters of different salinity. Material and methods The experiments were performed from 20–31 March to 1–10 July 2004. The development of eggs, embryos and larvae of Rana temporaria was observed in solutions with different concentrations of NaCl. Eggs were taken from the pseudo-uterus of sexually mature females and placed in 250 ml glass dishes, 10 cm in diameter. Next, they were submerged in water with sperms taken from seminal vesicles and testes of sexually mature males. After a lapse of approx. 15 min. the eggs were rinsed with water and submerged with solution containing different concentrations of NaCl. The dishes with fertilized eggs were divided into 7 groups: a control group with eggs developing in pure water and 6 experimental groups where eggs were 352 subject to action of 1‰, 2‰, 3‰, 4‰, 5‰ and 6‰ NaCl solutions. To maintain the constant concentration of NaCl the solutions were changed in the dishes every 24 hours. Each dish contained 50–60 eggs. Altogether, approx. 2,200 eggs were investigated. The temperature of water and solutions were maintained in the dishes at 19–21oC and pH at 7.2–7.6. The remaining fertilized eggs were placed in a large aquarium with pure water and the hatched tadpoles were used for experiments on the effect of NaCl on their development. The lethal concentrations of NaCl were established for three developmental groups of the larvae, i.e. for stage 23, stage 25 and stage 26–30, following the classification by Gosner [11]. It has been found that for these stages the lethal concentration (LC 50) of NaCl solution was 5‰. The experiments were conducted in 6 groups: a control group with larvae developing in pure water and 5 experimental groups with larvae subject to action of 1‰, 1.5‰, 2‰, 3‰ and 4‰ NaCl solutions. Each experimental group comprised 100 larvae. They were kept in groups of 25 in aquariums approx. 1000 ml in volume. Altogether approx. 2000 larvae were investigated. In the aquariums the temperature of water ranged from 19°C to 21°C and pH from 7.2 to 7.6. Water and solutions were changed every 48 hours. The larvae were fed every 2 days on dried nettle and boiled yolk of hen’s eggs. The larvae were controlled 2–3 times a day; dead larvae were removed from the aquariums. Experiments were carried out in three series beginning from the larvae in developmental stage 23 (opercular fold covers base of gills), next in stage 25 (spiracle forms) and in stages 26–30 (hindlimb bud). They were conducted until the metamorphosis of the larvae. The rate of development of the larvae and their survival were determined. In this way it was possible to find out the response of larvae in different developmental stages to salinity. To establish differences between the control group and the experimental groups with embryos and larvae subject to action of different concentrations of NaCl, the test of two structural indices was used [12]. A difference was considered statistically significant at P<0.01. A statistical U Mann-Whitney analysis (for mortality difference between control and investigated groups) was made using the STATISTICA programme. The study was approved by the ethical committee at the Pedagogical University of Krakow. Results Embryonic development The 5‰ NaCl solution is lethal (LC50) for the fertilized eggs of Rana temporaria. In this solution, just as in 6‰ solution, most of the cleavaging eggs die in the stage of a few blastomers. The remaining eggs die in the stage of blastula. The concentrations of 1‰-4‰ were tolerated by embryos and their mortality varied depending on the concentration. In the 353 1‰ NaCl solution and in pure water the mortality of embryos was similar. The higher mortality was found in the 2‰ and 3‰ solutions (as compared with the control, a difference was statistically significant already in the stage of cleavaging, while in the 4‰ solution only few embryos (2.7%) left egg capsules. A large number of developing eggs die during the cleavaging and in the stages of blastula and gastrula. Particularly high mortality was observed during the entire embryonic development in the 4‰ solution. The mortality of embryos markedly increased with the growth of NaCl concentrations (Table. 1). In addition, in the 3‰ and 4‰ solutions the embryos developed more slowly as compared to the embryos developing in pure water. The larvae leaving egg capsules had a less developed tail and buds of external gills. They were also smaller. Most of the dead embryos were deformed. Table 1. Development of Rana temporaria embryos in NaCl solutions of different concentrations. N – number of eggs. Numbers of embryos in particular stages were given in per cent (%). Developmental stages Gosner (1960) CONCENTRATION OF NACL IN PERCENTAGE (‰) 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 N =396 N =358 N=360 N=295 N=370 N=280 N=152 100 % 100 % 100 % 100% 100 % 100 % 100 % 99.5 98.6 97.2 93.2 67.6 25.0 9.2 CONTROL Fertilization (1) First divisions (3–7) P=0.100 P=0.006* P=0.000* P=0.000* P=0.000* P=0.000* Blastula (8–9) 99.5 98.3 96.1 91.2 * Gastrula (10–12) 97.5 97.0 * P=0.056 P=0.001 P=0.000 P=0.000 96.1 82.7 28.1 91.9 * Neural plate (13) 0.0 53.8 * P=0.140 P=0.000 P=0.000 P=0.000* 96.1 82.0 20.0 91.9 * 0.0 * P=0.000 P=0.000* P=0.252 P=0.001* P=0.000* P=0.000* Development of neural tube (14– 97.0 96.1 91.9 81.0 * 16) Tail bud (17) 96.8 P=0.252 P=0.001 P=0.000 P=0.000* 95.8 78.3 6.7 91.9 * Muscular response (18–19) 96.5 P=0.237 P=0.002 P=0.000 P=0.000* 95.8 76.6 2.7 91.3 * Leaving of egg capsules (21–22) 96.5 * P=0.312 P=0.002 P=0.000 P=0.000* 95.8 76.6 2.7 91.3 * P=0.312 P=0.002 * 14.3 * * * P=0.000 P=0.000* – statistically significant difference at P<0.01 Larval development 354 The lethal concentration (LC50) of NaCl solution for larvae in stages 23, 25, and 26–30 of the larval development was 5‰. In this solution the majority of the larvae died in a few hours, and only the most resistant individuals survived as long as 48 hours. In tolerable solutions the greatest resistance to salinity was shown by the larvae in stage 26–30 (Table. 4), and the least from stage 23 of the larval development (Table. 2). The larvae which since their leaving the egg capsules (stage 23) were kept in the 1‰, 1.5‰ and 2‰ NaCl solutions reached the metamorphosis. In the 3‰ and 4‰ solutions they only reached the stage of formation development of hind limbs (stage 31–36). Many of them died after reaching stage 26–30. Beginning from this developmental stage, in all concentrations of NaCl statistically significant differences were found between all the experimental groups and the control group. The larvae were clearly smaller than the larvae in the same developmental stages but kept in pure water. Most of the larvae kept in the 2‰ NaCl solution reached the maximum developmental stage (stage 37–41). The initial stage of metamorphosis (stage 42–43) was reached by a mere 20% of the larvae, and only 18% of the tadpoles passed through the full metamorphosis. Also the 1.5‰ solution had a toxic effect. In this solution only 35% of the larvae passed the metamorphosis. In the 1‰ solution the mortality was lower, and all the larvae which reached the initial stage of metamorphosis (stage 42–43) passed through it. Nevertheless the mortality was high, and a comparison to the control group showed a statistically significant difference (Table. 2). Table 2. Development of Rana temporaria larvae from stage 23 (opercular fold covers base of gills), according to Gosner 1960, in NaCl solutions of different concentrations. In each solution 100 larvae were used in the experiment. Developmental stages Gosner (1960) CONCENTRATION OF NACL IN PERCENTAGE (‰) Control 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0 Opercular fold covers base of gills (23) 100 100 100 100 100 100 Spiracle forms (25) 98 97 100 96 98 100 P=0.3276 P=0.0784 P=0.2072 P=0.5000 P=0.0784 Hindlimb bud (26–30) 98 P=0.0036 Toe differentiation 98 (31–36) Rapid hindlimb growth (37–41) * 88 P=0.0036 98 80 88 80 * 80 P=0.0001 P=0.0001 P=0.0001 P=0.0000 P=0.0002 * P=0.0000 P=0.0000 25 * 50 65 * 55 * 79 82 * * P=0.0000 P=0.0000* 1 * P=0.0000* 58 * P=0.0000* 355 Forelimbs protrude, tail begins to regress 95 75 (42–43) 38 P=0.0001 Tail greatly reduced (44) 95 75 95 * 75 P=0.0000 * P=0.0000* 18 P=0.0000 * 35 P=0.0001 * 20 * 35 P=0.0001 Tail reduced to stub (45) * P=0.0000* 18 P=0.0000 * P=0.0000* – statistically significant difference at P<0.01 Resistant to salinity was higher in the larvae which beginning from stages 25 and 26–30 of the larval development were placed in NaCl solutions. In particular concentrations more of them reached the metamorphosis. The larvae placed in stage 25 in the 1‰, 1.5‰ and 2‰ solutions developed in a similar way. A difference between the control group and experimental groups was statistically significant only in terminal stages of the larval development. Also their behaviour was similar to the behaviour of the larvae developing in pure water. Only a slight decrease in foraging activity was noted. The proportion of the transformed larvae reached 88% (1‰ solution) and 80% (1.5‰ and 2‰ solution), whereas in pure water as much as 98% of the larvae passed through the metamorphosis. In the 3‰ solution, 50% of the larvae reached the metamorphosis. In this solution higher mortality was observed during the particular phases of metamorphosis and a comparison with the control group showed a statistically significant difference (Table. 3). Table 3. Development of Rana temporaria larvae from stage 25 (spiracle forms), according to Gosner 1960, in NaCl solutions of different concentrations. In each solution 100 larvae were used in the experiment. Developmental stages Concentration of NaCl in percentage (‰) Gosner (1960) Control 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0 Spiracle forms (25) 100 100 100 100 100 100 Hindlimb bud (26 – 30) 99 100P=0.1587 100P=0.1587 98P=0.2820 100P=0.1587 88P=0.0011* Toe differentiation 99 100 100 98 100 55 (31 – 36) P=0.1587 P=0.1587 P=0.2820 P=0.1587 P=0.0000* Rapid hindlimb growth 99 98 100 98 93 (37 – 41) P=0.2820 P=0.1587 P=0.2820 P=0.0166 Forelimbs protrude, tail 98 90 88 begins to regress (42–43) Tail greatly reduced (44) 98 P=0.0102 P=0.0036 90 85 P=0.0102 Tail reduced to stub (45) 98 88 P=0.0036 * P=0.0007 85 * 80 * 80 * P=0.0001 P=0.0007 80 * P=0.0001 61 * 80 * P=0.0001 P=0.0001* P=0.0000* 50 * P=0.0000* – statistically significant difference at P<0.01 356 In the 4‰ solution the larvae did not pass the metamorphosis. Their development stopped at stage 31–36 (i.e. development of hind limbs). The larvae died one by one, whereas in other concentrations larvae reached the stage of metamorphosis. Larvae which in stage 26–30 were placed in the 1‰ and 1.5‰ NaCl solutions developed just as those in pure water. More than 90% of the larvae reached the metamorphosis. Those kept in the 2‰ and 3‰ solutions developed more slowly but considerable part of them reached the metamorphosis. In the 2‰ solution, 82% of the tadpoles passed the metamorphosis, whereas in the 3‰ solution – 73%; a comparison with the control group showed a statistically significant difference only in the terminal phase of the metamorphosis (Table. 4). In the 4‰ solution the larvae reached stage 37–41 of the larval development and died. Table 4. Development of Rana temporaria larvae from stage 26–30 (hindlimb bud), according to Gosner 1960, in NaCl solutions of different concentrations. In each solution 100 larvae were used in the experiment. Developmental stages Concentration of NaCl in percentage (‰) Gosner (1960) Control 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0 Hindlimb bud (26–30) 100 100 100 100 100 100 Toe differentiation 99 100 99 98 100 82 P=0.1587 P=0.5000 P=0.2807 P=0.1587 P=0.0000* 99 95 69 P=0.5000 P=0.2807 P=0.2807 P=0.0509 P=0.0000* Forelimbs protrude, tail begins to regress 98 99 94 (42–43) P=0.2820 P=0.5000 P=0.5000 P=0.0785 99 80 (31 – 36) Rapid hindlimb growth (37 – 41) Tail greatly reduced (44) 99 98 98 98 95 98 98 88 P=0.0001* P=0.2820 P=0.1284 P=0.0360 Tail reduced to stub (45) 98 99 95 82 P=0.2820 P=0.1284 P=0.0002 * 73 * P=0.0000* – statistically significant difference at P<0.01 Discussion The present studies have shown that both the embryonic and larval development of Rana temporaria is possible only in water of a slight salinity. In the 1‰ NaCl solution the fertilised eggs develop just as in pure water. No marked and statistically significant differences in the course of embryonic development and in a number of larvae leaving egg capsules have been found. The mortality of embryos is 4.2% in the 1‰ solution, whereas in pure water – 3.5%. The mortality is small and may be considered natural. It is within the range given by Viertel, 357 following Mittmann, who stated that the natural mortality might reach 10% at the end of the metamorphosis. An increase in the mortality of embryos was found in the 2‰ NaCl solution, while in the 4‰ solution only a very small number of larvae (2.7%) left egg capsules and as many as 97.3% of the embryos died. The results of these observations confirm the data obtained by Viertel. He observed an increased mortality of Rana temporaria embryos in solutions of 2.3‰ and higher. In the 5.2‰ solution a hundred per cent mortality appeared. The 5‰ and 6‰ solutions were lethal for embryos; most of them died in the stages of striation and blastula. In developing eggs the stage of gastrula was critical. In this stage a large number of embryos died in all solutions. The larvae of Rana temporaria are characterised by different vulnerability to salinity, depending on the stage of their development. The larvae in stage 23 are most vulnerable. In this group a small number of larvae (18%) pass through the metamorphosis still in the 2‰ solution (Figure. 1). The development of the larvae is uneven; it stops at different stages and the mortality is high. The metamorphosis is prolonged to 12 (1‰ solution) and 18 days (2‰ solution), whereas in pure water it takes only 6 days (Figure. 2). A higher resistance to salinity is shown by young larvae (stage 25). When placed in NaCl solutions, they reach the metamorphosis also in the 3‰ solution. Their development and the process of metamorphosis are irregular, too. In the 2‰ and 3‰ solutions it continues for 20 days. The fully formed larvae with hind limb buds (stage 26–30) develop in the 1‰ and 1.5‰ in a similar way as in pure water and do not show greater alterations of the development and behaviour. More than 95% of the larvae reach the metamorphosis. Also in the 2‰ and 3‰ solutions more than 70% of the larvae reach the metamorphosis (82% and 73%, respectively). At the 4‰ salinity the larvae reach the number of larvae maximum development (stage 37–41) and stop then. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 C 1,00 ‰ stage 23 1,5 ‰ 2,00 ‰ stage 25 stages 26-30 3,00 ‰ 358 Figure 1. Number of transformed Rana temporaria larvae, depending on the developmental stage in which they were placed in NaCl solutions of different concentrations. In each solution 100 larvae were used in the experiment. Developmental stages followed Gosner (1960). Changes in the vulnerability to salinity in Bufo melanostictus were described by Strahan [13]. He also found the growth of tolerance for salinity in line with the development of the larvae. He noticed that external gills and a tail were particularly vulnerable to saline water. Salinity affected also the circulation of blood and water content in the larvae. If tadpoles are placed in NaCl dilution their ability to uptake Na+ in exchange for NH4+ across the gills decreases [14, 15]. Accumulation of NH4+ in the body fluids enables tadpoles to tolerate high ambient salinities [16]. Changes observed in the larvae of Rana temporaria under the influence of salinity were similar to those described by Strahan in Bufo melanostictus. In summing up, one should stress that Rana temporaria is an anuran with a very small tolerance for salinity. Field studies conducted by Viertel and the author’s own observations showed that the growth of salinity probably caused a decrease in amphibian populations strictly connected with fresh water. In the small ponds where sewage and water from coal mines are released the growth of salinity is especially high. Another factors, just as the contamination by nitrogen compounds [17,18,19] and UV-B radiation [20,21,22], causes mortality. These factors acting together with the growth of salinity may cause a decrease in the number of habitats for amphibians’ development. 25 days 20 15 10 5 0 C 1,00 ‰ stage 23 1,5 ‰ stage 25 2,00 ‰ 3,00 ‰ stages 26-30 Figure 2. Duration of the process of metamorphosis (in days; from the first transformed larvae to the last one) in individual groups of Rana temporaria larvae subject to action of different NaCl concentrations beginning from a determined developmental stage. Developmental stages followed Gosner (1960). 359 References 1. Gordon M.S. K. Schmidt–Nielsen, and H.M. Kelly. 1961. Osmotic regulation in the crab–eating frog (Rana cancrivora). Journal of Experimental Biology. 38, 659–678. 2. Uchiyama M., T. Murakami, and H. Yoshizawa. 1990. Notes on the development of the crab–eating frog Rana cancrivora. Zool. Sci. 7, 73–78. 3. Gordon M.S., and V.A. Tucker. 1968. Further observations on the physiology of salinity adaptation in the crab–eating frog (Rana cancrivora). Journal of Experimental Biology 49, 185–193. 4. Kauri H. 1948. Über die Ausbreitung und die Ausbreitungsumstände der Wechselkröte (Bufo viridis) im Ostseegebiet. Lunds Universitets Årsskrift N. F. 44, 1–30. 5. Gislen T., and H. Kauri. 1959. Zoogeography of the Swedish amphibians and reptiles. Acta Vertebratica 1, 197–97. 6. Viertel B. 1999. Salt tolerance of Rana temporaria: spawning site selection and survival during embryonic development (Amphibia, Anura). Amphibia–Reptilia. 20, 161–171. 7. Andrén C., and G. Nilson. 1985. Habitat and other environmental characteristics of the natterjack toad (Bufo calamita Laur.) in Sweden. British Journal of Herpetology 6, 419–424. 8. Gordon M.S. 1962. Osmotic regulation in the green toad (Bufo viridis). Journal of Experimental Biology 39, 261–270. 9. Stoitovici F., and E.A. Pora. 1951. Comportared la variatuini de salinitate, Nota XXX. Influenta variatiunilor de salinite si a factorulai ecologie aspura supravieturii si mediului interior la Bufo viridis in diferitele periode, a le anului. Stud.Stüntif. Acad. Rep. Pop. Române Fil. Cluj. 2, 159–219. 10. Zamachowski W. 1999. Reactions of frog Rana temporaria on different salt contents. Biologické Dni. Proceedings from International Scientific Conference. Banská Bystrica. 1999. 170–171. 11. Gosner K.L. 1960. A simplified table for staging anuran embryos and larvae with notes on identification. Herpetologica 16, 183–190. 12. Stanisz A. 1998. Przystępny kurs statystyki. StatSoft Polska. pp. 1–362. 13. Strahan R. 1957. The effect of salinity on the survival of larvae of Bufo melanostictus Schneider. Copeia. 2, 146–147. 14. Dietz T.H., and R.H. Alvarado. 1974. Na+ ands Cl- transport across gill chamber epithelium of Rana catesbeiana tadpoles. American Journal of Physiology. 226, 764–770. 15. Boonkoom V., and R.H. Alvarado. 1971. Adenosinetriphosphate activity in gills and larval Rana catesbeiana. American Journal of Physiology. 220, 1820–1824. 16. Jørgensen. C.B. 1997. Urea and amphibian water economy. Comparative Biochemistry and Physiology – Part A. 117, 161–170. 17. Berger L. 1989. Dissapearance of amphibian larvae in the agricultural landscape. Ecol. Int. Bull. 17, 65–73. 18. Oldham R.S., D.M. Latham, D. Hilton-Brown, M. Towns, A.S. Cooke, and A. Burn. 1997. The effect of ammonium nitrate fertiliser on frog (Rana temporaria) survival. Agriculture, Ecosystems and Environment 61, 69–74. 19. Rouse J.D., C.A. Bishop, and J. Struger. 1999. Nitrogen pollution: An assessment of its threat to amphibian survival. Environ. Health Perspect 107, 799–803. 20. Blaustein A.R., P.D., Hoffman D. Grant Hokit J.M. Kiesecker S.C. Walls and J.B. Hays. 1994. UV repair and resistance to solar UV–B in amphibian eggs: A link to population declines? Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 91, 1791–1795. 21. Hatch A.C., and A.R. Blaustein. 2000. Combined effects of UV–B, nitrate, and low pH reduce the survival and activity level of larval cascades frogs (Rana cascadae). Archives of Environmental Contamination and Toxicology 39, 494–499. 22. Lizana M., and E.M. Pedraza. 1998. The effects of UV–B radiation on toad mortality in mountainous areas of Central Spain. Conserv. Biol. 12, 703–707. 360 CIRKADIÁNNA ORGANIZÁCIA A PORUCHY BIORYTMOV V KARDIOVASKULÁRNOM SYSTÉME THE CIRCADIAN ORGANISATION AND DISTURBANCES OF CIRCADIAN RHYTHMS IN THE CARDIOVASCULAR SYSTEM Zeman, M.1, Bada, V.2, Dulková, K.2, Liška, D. 2, Kováčiková, Z. 1, Košťál, L.1,3, Herichová, I.1, 1Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Prírodovedecká fakulta UK v Bratislave, interná klinika FNsP, Kramáre, Bratislave, 3Ústav biochémie a genetiky živočíchov, SAV Ivanka pri Dunaji 2Tretia Abstract The paper deals with disturbances of circadian rhythms in blood pressure and heart rate in hypertensive patients. Increased frequency of circadian rhythms disturbances in cardiovascular system in developed countries is well known but their ethiology is not understood. We hypothesize that a changed life style with shift of activity to late nights, light contamination of environment and shift work may represent risk factors that can contribute to higher incidence of cardiovascular diseases in developed countries. According to our present results conditions of continuous ambulatory blood pressure monitoring substantially influence the final share of different rhythm abnormalities, e.g non-dippers, reversed dippers or extreme dippers. Frequency of all three rhythms disturbances is increased when measurement is performed in hospital in comparison with home conditions. The findings underlay a role of stress and activated sympathetic system in development of rhythm abnormalities in cardiovascular system. Úvod Medzi najčastejšie civilizačné choroby patria poruchy kardiovaskulárneho systému a nádorové ochorenia. Aj keď sú to muktifaktoriálne podmienené poruchy, ktorých etiológia nie je kompletne známa, všeobecne sa akceptuje, že jednou z príčin ich stúpajúcej incidencie je zmena životného štýlu obyvateľov vyspelých štátov sveta. Zmenený životný štýl zahŕňa viacero prominentných aspektov, akými sú napríklad neprimeraná výživa s nadbytkom energetických zdrojov, obmedzený pohyb, zvýšené stresové zaťaženie a pod. Dôležitosť týchto faktorov je všeobecne akceptovaná vo vedeckej sfére a relatívne dobre prezentovaná aj verejnosti. Jedným z faktorov moderného životného štýlu, ktorý je veľmi málo akcentovaný vo vedeckej sfére a prakticky neznámy pre verejnosť, je narušovanie rytmického spôsobu života, determinovaného pravidelným striedaním fáz svetla a tmy počas 24 h cyklu. 361 K tomuto narušeniu dochádza prakticky iba od druhej polovice 20. storočia a tento trend je podmienený objavením svetelných zdrojov s vysokou intenzitou, obrazoviek televízorov a počítačov a letov cez časové pásmo (najmä transatlantické). Je alarmujúce, že dlhodobé dôsledky takýchto narušení sú zatiaľ prakticky neznáme. Ich kvantifikáciu sťažuje skutočnosť, že ich nie je ľahko identifikovať, pretože sú neoddeliteľnou súčasťou životného štýlu a pôsobia na ľudskú populáciu relatívne krátko. Je potrebné zdôrazniť, že život sa vyvinul v podmienkach striedania svetla a tmy v 24-hod. rytme a tomuto vplyvu je živá hmota permanentne vystavená miliardy rokov od jej vzniku a človek od začiatku procesu hominizácie. Dlhodobý vplyv rytmicky sa meniacich faktorov prostredia viedol k vývinu cirkadiánnych (približne 24–hodinových) oscilácií prakticky na všetkých úrovniach existencie živej hmoty (od prokaryontov po človeka). Tieto rytmy sú endogénne determinované, generované endogénnymi oscilátormi na úrovni buniek a pretrvávajú s geneticky determinovanou periódou v konštantných podmienkach prostredia. Za normálnych podmienok sú tisícky biochemických a fyziologických rytmov v jednotlivých funkčných systémoch navzájom koordinované, veľmi jemne vyladené a vykazujú navzájom determinované fázové vzťahy. Ich narušenie vedie k desynchronizácii, ktorá sa odrazí v znížení pohody a výkonnosti organizmu a môže skončiť funkčnými poruchami nervového, kardiovaskulárneho, gastrointestinálneho a ďalších systémov. Špecifický význam majú narušenia predovšetkým pri kardiovaskulárnom systéme, ktoré vykazujú najvýznamnejšiu cirkadiánnu variabilitu. Cirkadiánny systém Dominantný oscilátor, ktorý generuje cirkadiánne oscilácie u cicavcov je lokalizovaný v mozgu – konkrétne v suprachiazmatických jadrách hypotalamu. Rytmické vplyvy prostredia (predovšetkým striedanie svetla a tmy v 24 hod. rytme) synchronizujú rytmickú aktivitu neurónov suprachiazmatického jadra s aktuálnymi podmienkami prostredia a nastavujú ich na presných 24 hodín. Takto zosynchronizované rytmy sú neurálnymi a neuroendokrinnými mechanizmami prenášané na periférne orgány a žľazy a umožňujú ich rytmickú funkciu zosynchronizovanú s podmienkami prostredia. Neuróny suprachiazmatických jadier prenášajú svoj cirkadiánny signál (Boijs et al., 2003) na: • neuróny paraventrikulárnych jadier zodpovedných za sekréciu hypofyzárnych hormónov (najmä kortikoliberín a gonadoliberín;) • dopamínenergické neuróny regulujúce sekréciu prolaktínu; 362 • predovšetkým neuróny autonómneho nervového systému zabezpečujúce priamu cirkadiánnu kontrolu endokrinných žliaz (epifýza, nadobličky, gonády) a kľúčových periférnych orgánov (srdce, pankreas, pečeň, črevo). Regulácia funkcie týchto periférnych štruktúr nie je priama, ale zabezpečovaná synchronizáciou aktivity periférnych oscilátorov, ktoré sú v nich lokalizované (Pando et al., 2002). Objav periférnych oscilátorov, ktoré sú schopné nasynchronizovať sa nielen signálmi centrálnych hodín, ale aj priamo signálmi prostredia, akými sú príjem potravy (Damiola et al., 2000) predstavuje jeden z najpodstatnejších objavov v chronobiológii v posledných rokoch. Potvrdzuje pôvodnú predstavu multioscilačnej hierarchickej organizácie cirkadiánneho systému, ako bola navrhnutá zakladateľom modernej chronológie (Aschoff, 1989). Kardiovaskulárny systém Je všeobecne známe a akceptované, že viaceré parametre kardiovaskulárneho systému (tlak krvi, pulzová frekvencia, periférna rezistencia ciev) vykazujú výraznú cirkadiánnu variabilitu (White, 2000) a odrážajú schopnosť organizmov anticipovať zvýšenú záťaž vyplývajúcu z cyklicky sa meniacich podmienok prostredia počas 24 h. cyklu. Dôležitosť cirkadiánnej organizácie pre kardiovaskulárny systém zdôrazňuje aj viackrát potvrdený cirkadiánny profil vo výskyte akútnych kardiovaskulárnych ochorení, akými sú napríklad ischémia, infarkt myokardu a mozgové príhody (Manfrendini et al., 1996). Najfrekventovanejšou abnormalitou cirkadiánneho profilu u pacientov je tzv. neklesajúci (non-dipping) tlak krvi u niektorých hypertenzných pacientov. U týchto pacientov tlak krvi v noci neklesá pod určitú hranicu (arbitrárne zvyčajne 2-10 %) ako je zvyčajné u väčšiny ľudí. Štúdie na početných súboroch takýchto pacientov demonštrovali výraznejšie poškodenie cieľových koncových orgánov (srdce, obličky), ako tomu bolo u hypertenzných pacientov s normálnym cirkadiánnym profilom tlaku krvi (vysoký cez deň a nízky v noci) (White, 2000). Fyziologická podstata vzniku neklesajúceho tlaku krvi nie je zatiaľ známa, ale ukazuje sa, že môže byť čiastočne geneticky determinovaná (Singh et al., 1999). Pre hypertenzných pacientov je rizikový nielen neklesajúci tlak krvi, ale aj profil s maximálne zvýšenou amplitúdou počas dňa (Halberg et. al., 2006). V súčasnosti je kompletne neznáme, či je táto abnormalita spojená s anomáliami v cirkadiánnej organizácii jedinca a či niektoré genotypy môžu byť citlivejšie na vznik obrateného profilu TK. 363 Jedným z faktorov, ktorý môže ovplyvňovať zmeny cirkadiánneho profilu tlaku krvi môže byť hormón melatonín, ktorý je syntetizovaný dominantne v endokrinnej žľaze epifýze. U pacientov s neklesajúcim tlakom krvi bola zaznamenaná absencia nočného vzostupu metabolitu melatonínu v moči ( Jonas et al., 2003). V našej štúdii, ktorá zatiaľ ako jediná analyzovala plazmatické koncentrácie melatonínu u hypertenzných pacientov s neklesajúcim i klesajúcim TK sa ukázalo, že rytmus melatonínu bol zachovaný, ale pomer nočných a denných hodnôt diastolického tlaku bol signifikantne znížený u non-dipperov (Zeman et al., 2005). V našej súčasnej práci sledujeme cirkadiánne rytmy tlaku krvi (TK) a pulzovej frekvencie (PF) u pacientov s liečenou hypertenziou. Merania sa uskutočňujú v dvoch prostrediach, buď počas krátkodobej hospitalizácie (3. Interná klinika FNsP, Kramáre) alebo v domácich podmienkach. Na meranie v oboch prípadoch používame rovnaké zariadenie (monitor TM 2430, AND, Japonsko). Merania sa uskutočňujú automaticky v intervale každých 15 alebo 30 min cez deň (6.00-22.00) a 60 min v noci. Celkovo monitorovanie trvá 24-48 h a následne sú údaje prenesené do počítača, kde sú vyhodnocované. Rytmický priebeh zmien TK a PF sú vyhodnocované v spolupráci s Halbergovým Chronobiologickým centrom, Minneapolis, USA v rámci programu BIOCOS. Keďže zmena TK a PF po zobudení a vzpriamení sa je náhla, kosínorová analýza nie je optimálnym štatistickým riešením a musí byť adjustovaná vzhľadom na vek, pohlavie a očakávaný priebeh rytmických zmien (Cornelissen et al., 2007). V deskriptívnej rytmometrii najdôležitejšia metóda periodickej regresie s fixnou periódou je nazývaná kosínorová analýza. Keďže kosínusová funkcia nepopisuje ideálne variácie krvného tlaku počas dňa, v literatúre bolo popísaných množstvo iných modelov jeho priebehu počas dňa. Idema et al. (1992) napríklad ukázali, že obdĺžniková vlna (square wave) popisuje periodické zmeny krvného tlaku s väčšou presnosťou ako štandardná kosínusová funkcia. Marler et al. (2006) navrhli sigmoidálne transformovanú kosínusovú funkciu ako matematický model cirkadiánnych rytmov so symetrickými nesínusoidnými tvarmi a demnoštrovali jeho použiteľnosť na príklade dát merajúcihc aktivitu pacientov v domove dôchodcov. Adaptovali sme tento model na popis cirkadiánneho tlaku krvi (Košťál et al., v príprave). Model umožňuje výpočet viacerých parametrov rytmických zmien TK a PF, čo poskytuje možnosť individuálneho hodnotenia jednotlivých pacientov a koreláciu výsledkov opakovaného merania TK a PF s údajmi z echokardiologických vyšetrení, ako aj s parametrami funkčného poškodenia obličiek. Doterajšie výsledky demonštrujú zvýšenú 364 frekvenciu abnormalít rytmického priebehu tlaku krvi aj pulzovej frekvencie u pacientov, ktorí boli počas merania v nemocničnom ošetrení. Toto zistenie poukazuje na dôležitosť zohľadnenia podmienok merania a možného stresu a aktivovaného sympatikového systému pri hodnotení výsledkov. Práca bola podporená grantom APVV 20/022704. Literatúra Aschoff J: Circadian rhythms: influences of internal and external factors on the period measured in constant conditions. Z Tierpsychol., 1979, 49:225-49. Buijs RM, la Fleur SE, Wortel J, Van Heyningen C, Zuiddam L, Mettenleiter TC, Kalsbeek A, Nagai K, Niijima A: The suprachiasmatic nucleus balances sympathetic and parasympathetic output to peripheral organs through separate preautonomic neurons. J Comp Neurol., 2003, 464:36-48. Cornelissen, G., Halberg F., Singh R.B., Chen C.H. Chronobiology predcts actual and proxy outcomes when dipping fails. Hypertension, 2007, 49:237-239,. Damiola F, Le Minh N, Preitner N, Kornmann B, Fleury-Olela F, Schibler U.: Restricted feeding uncouples circadian oscillators in peripheral tissues from the central pacemaker in the suprachiasmatic nucleus. Genes Dev., 2000, 14:2950-61. Halberg, Halberg, F., Otsuka, K., Katinas, G., Sonkowsky, R., Regal, P., Schwartzkopff, O., Jozsa, R., Olah, A., Zeman, M.: A chronomic tree of life: ontogenetic and phylogenetic "memories" of primordial cycles - keys to ethics. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2004, 58:S1-S11. Idema RN, Gelsema ES, Wenting GJ, Grashuis JL, van den Meiracker AH, Brouwer RM, Man in 't Veld AJ. A new model for diurnal blood pressure profiling. Square wave fit compared with conventional methods. Hypertension, 1992, 19:595-605,. Jonas M, Garfinkel D, Zisapel N, Laudon M, Grossman E: Impaired nocturnal melatonin secretion in non-dipper hypertensive patients. Blood Press., 2003, 12:19-24. Manfredini R, Gallerani M, Portaluppi F, Salmi R, Chierici F, Tassi A, Rizzioli E, Notarstefano P, Risichella IS, Mirizio AM, Fersini C: Chronobiologic aspects of ischemic coronary artery disease. Jpn Heart J., 1996, 37:829-36. Marler MR, Gehrman P, Marti JL, Ancoli-Israel S: Sigmoidally transformed cosine curve: A mathematical model for circadian rhythms with symetric non-sinusoidal shapes. Stat Med., 2006, 25:3893-904. Pando MP, Morse D, Cermakian N, Sassone-Corsi P: Phenotypic rescue of a peripheral clock genetic defect via SCN hierarchical dominance. Cell, 2002, 110:107-17. Singh RB, Bajaj S, Niaz MA, Rastogi SS, Moshiri M: Prevalence of type 2 diabetes mellitus and risk of hypertension and coronary artery disease in rural and urban population with low rates of obesity. Int J Cardiol., 1998, 66:65-72. White WB: Ambulatory blood pressure monitoring: dippers compared with non-dippers. Blood Press Monit., 2000, Suppl 1:S17-23. Zeman, M., Dulková, K., Bada, V., Herichová, I.: Plasma melatonin concentrations in hypertensive patients with the dipping and non-dipping blood pressure profile. Life Sciences, 2005, 76:1795 – 1803 Kontaktná adresa: Prof. RNDr. Michal Zeman, DrSc.,Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Mlynská dolina B2, 842 15 Bratislava 365 OBSAH VPLYV HYPODYNAMIE NA OBLIČKY JAPONSKÝCH PREPELÍC (COTURNIX COTURNIX JAPONICA) 5 TU UT ALMÁŠIOVÁ, V., CIGÁNKOVÁ, V., HOLOVSKÁ, K., ZIBRÍN, M. TU UT THE EFFECT OF INCLUDING FABA BEAN IN THE DIET AND HEN’S AGE ON EGGS ALBUMIN QUALITY 11 TU UT AL-SARDARY SARDAR Y. T. - ABAS. KAMARAN ABDULJALIL TU UT VPLYV EXPERIMENTÁLNEHO PODANIA NIKLU NA KVALITU BIELKA A HMOTNOSŤ KONZUMNÝCH VAJEC TU 16 UT ARPÁŠOVÁ, H., MASSÁNYI, P., CAPCAROVÁ, M., KOLESÁROVÁ, A., KALAFOVÁ, A. TU UT DISTRIBÚCIA NIKLU V ORGANIZME POTKANA PO EXPERIMENTÁLNOM PODÁVANÍ TU 23 UT BÁBIKOVÁ, L., TOMAN, R., GOLIAN, J., MASSÁNYI, P., HLUCHÝ, S., LUKÁČ, N., ŠIŠKA, B. TU UT ÚLOHA TRANSKRIPČNÉHO FAKTORA P53 A HORMÓNU GHRELÍN V KONTROLE FUNKCIÍ OVARIÁLNYCH BUNIEK OŠÍPANÝCH TU 29 UT BENČO, A., SIROTKIN, A. V. TU UT VPLYV PROBIOTIKA BONVITAL NA ÚŽITKOVÉ PARAMETRE VÝKRMOVÝCH OŠÍPANÝCH 36 TU UT BINDAS, Ľ., VAJDA, V., MASKAĽOVÁ, I. TU UT VYUŽITIE GENOMIKY VO VÝSKUME FYZIOLOGICKÉHO POZADIA EKONOMICKY VÝZNAMNÝCH VLASTNOSTÍ HOSPODÁRSKYCH ZVIERAT 43 TU UT BULLA, J. TU UT VPLYV HYPODYNAMIE NA ŠTRUKTÚRU A FUNKCIU ENTEROCYTOV DUODENA JAPONSKÝCH PREPELÍC TU 48 UT CIGÁNKOVÁ, V., ALMÁŠIOVÁ, V., HOLOVSKÁ, K., LENHARDT Ľ., ŠKROBÁNEK P., ZIBRÍN, M. TU UT KVANTITATÍVNE HODNOTENIE OBLIČIEK APODEMUS FLAVICOLIS Z EKOSYSTÉMOV V NOVÁKOCH TU 53 UT DRÁBEKOVÁ, J., JANČOVÁ, A., MASSÁNYI, P., LUKÁČ, N. TU UT EFFECT OF GRADED LEVELS OF MYCOTOXIN ON CLINICAL PLASMA CHARACTERISTICS IN CHICKS TU 58 UT FAIXOVÁ , Z., FAIX, Š. TU UT CAROTENOID ABSORPTION IN LAYING HENS TU 68 UT GREGOSITS, B., KERTI, A., SZABÓ, CS., BÁRDOS, L. TU UT HODNOTENIE SÉROVÝCH KONCENTRÁCIÍ VYBRANÝCH BIOCHEMICKÝCH UKAZOVATEĽOV NUTRIČNÉHO A ZDRAVOTNÉHO STAVU K ÚROVNI ŽIVOTNÉHO ŠTÝLU SLOVENSKEJ POPULÁCIE 72 TU UT HARASNÍK V., SLIVKOVÁ J, MARCINKOVÁ M, ČIŽMÁROVÁ M¹ TU UT SLEDOVANIE STAVU VÝŽIVY A VYBRANÝCH BIOMARKEROV ZDRAVIA VO VZŤAHU KU KARDIOVASKULÁRNEMU RIZIKU MEDZI VYBRANÝMI SKUPINAMI OBYVATEĽSTVA SR 78 TU UT HARASNÍK V., MARCINKOVÁ M., SLIVKOVÁ J., ČIŽMÁROVÁ M. TU UT VPLYV PROBIOTICKÉHO PREPARÁTU NA TVORBU TUKU V TELE KURČIAT 85 TU UT HAŠČÍK, P., BOBKO, M., KAČÁNIOVÁ, M., ČUBOŇ, J., KULÍŠEK, V., PAVLIČOVÁ, S. TU UT FOTOINDUKOVATEĽNÁ EXPRESIA KURACIEHO PERIOD GÉNU V EPIFÝZE.91 TU UT HERICHOVÁ I., MONOŠÍKOVÁ J., ZEMAN M. TU UT ODCHÝLKY HEMATOLOGICKÝCH A BIOCHEMICKÝCH PARAMETROV PRI SÉROLOGICKY POZITÍVNYCH PRASNICIACH NA E. INTESTINALIS 96 TU UT HISIRA, V., KOVÁČ, G., LEŠNÍK, F., NOVOTNÝ, J., PETROVOVÁ, E., FARKAŠOVÁ, Z., LINK, R. TU UT ULTRAŠTRUKTÚRA M. GASTROCNEMIUS U JAPONSKÝCH PREPELÍC POČAS HYPODYNAMIE SIMULUJÚCEJ MIKROGRAVITÁCIU V KOZME 100 TU UT HOLOVSKÁ, K.,KOČIŠOVÁ, J., CIGÁNKOVÁ, V., ALMÁŠIOVÁ, V.,TOMAJKOVÁ, E.,ŠKROBÁNEK,P., ZIBRÍN, M. TU UT 366 OVERENIE ÚČINKU HOMEOPATÍK NA NIEKTORÉ FYZIOLOGICKÉ UKAZOVATELE U ODSTAVČIAT TU 104 UT HÚSKA M., LINK R., BULECA J., DUDRÍKOVÁ E. TU UT DIAGNOSTIKA DEDIČNÉHO OCHORENIA POLYCYSTICKÉHO OCHORENIA OBLIČIEK /PKD/ U MAČIEK DNA TESTOM NA SLOVENSKU. 109 TU UT JAKABOVÁ D., ŽIDEK R., TRANDŽÍK J., RAJTAROVÁ K., MASSÁNYI P., HAŠKO M., KOZLÍK P.1, BULECA J. JR., RYBA Š. TU UT ŤAŽKÉ KOVY A ŠTRUKTÚRA SEMENNÍKOV A MATERNICE APODEMUS FLAVICOLLIS Z OBLASTI JADROVEJ ELEKTRÁRNE TU 112 UT JANČOVÁ, A., MASSÁNYI, P., DRÁBEKOVÁ, J. TU UT INDUKCIA ESTRU OVIEC KOMBINÁCIOU FLUOROGESTÓN ACETÁTU A EKVINNÉHO CHORIOVÉHO GONADOTROPÍNU V ANESTRICKEJ SEZÓNE 118 TU UT JANKUROVÁ, J., VLČKOVÁ, R., MARAČEK, I., HALAGAN, J. TU UT HISTOLOGICAL FINDINGS IN THE ADRENAL GLANDS FROM SLAUGHTERED CATTLE 123 TU UT JELINEK, F., KONECNY, R. TU UT MINERÁLNY PROFIL KRÁLIKOV PO EXPERIMENTÁLNEM PODANÍ NIKLU A ZINKU 124 TU UT T KALAFOVÁ, A., KOVÁČIK, J., JURČÍK, R., LUKÁČ, N., MASSÁNYI, P., CAPCAROVÁ, M.,SCHNEIDGENOVÁ, M., ČUPKA, P. ÚLOHA VYBRANÝCH BIOLOGICKY AKTÍVNYCH LÁTOK V POHLAVNOM 129 DOSPIEVANÍ PRASNIČIEK U U KOLESÁROVÁ A., SIROTKIN A., CAPCAROVÁ M., MASSÁNYI, P., LUKÁČ N., KOVÁČIK J. U U KVALITA KRAVSKÉHO MLIEKA A METABOLICKÉ PORUCHY DOJNÍC U KOVÁČIK,J., MICHALCOVÁ,A., MASSÁNYI,P., KOLESÁROVÁ A. U U 130 U IN VITRO TOXICITA NIKLU NA GRANULÓZNE BUNKY OŠÍPANEJ U 135 U KROČKOVÁ, J., MASSÁNYI, P., SIROTKIN, A., PIVKO, J., BENČO, A U U VPLYV MELATONÍNU NA PREJAVY ANXIETY U HYPERTENZNÝCH POTKANOV SO ZVÝŠENOU AKTIVITOU RENÍN-ANGIOTENZÍNOVÉHO SYSTÉMU U U 142 KRŠKOVÁ, L., VRABCOVÁ, M., ZEMAN, M. U U EXPRESE CD14 BĚHEM APOPTÓZY POLYMORFONUKLEÁRNÍCH LEUKOCYTŮ V REZOLUCI ZÁNĚTU U 147 U LANGROVÁ, T., SLÁDEK, Z., RYŠÁNEK, D. U U VPLYV VYBRANÝCH MIRNA KONŠTRUKCIÍ NA FUNKCIE OVARIÁLNYCH GRANULÓZNYCH BUNIEK ČLOVEKA 153 U U LAUKOVÁ, M., SIROTKIN, A.V., GROSSMAN, R., OVCHARENKO D., MLYNČEK M. U U METABOLICKÉ PARAMETRE A ZLOŽENIE MLIEKA PRASNÍC PO PODÁVANÍ 159 PROBIOTÍK NA BÁZE BACILLUS U U LINK, R., KOVÁČ, G., HÚSKA, M., NOVOTNÝ, J., HISIRA, V., U U KONCENTRÁCIA STOPOVÝCH PRVKOV V INSEMINAČNÝCH DÁVKACH LIŠIAKOV A KVALITA SPERMIÍ. U U 164 LUKÁČ, N., MASSÁNYI, P., TRANDŽÍK, J., SLAMEČKA, J., JURČÍK, R. U U REPRODUKČNÉ PARAMETRE PRI CHRONICKEJ INTOXIKÁCII ŤAŽKÝMI KOVMI U POTKANOV 172 U U LUKAČÍNOVÁ, A., BEŇAČKA, R., LOVÁSOVÁ, E., HIJOVÁ, E., NIŠTIAR, F., U U VPLYV BIOFLAVONOIDOV NA HLADINU GLYKÉMIE U ALOXÁNOVÉHO DIABETU U POTKANOV U U 178 LUKAČÍNOVÁ, A., BEŇAČKA, R., MOJŽIŠ, J., NIŠTIAR, F. U U VPLYV POSTAVENIA CECKOV A TYPU TOKU MLIEKA NA JEDNOTLIVÉ PARAMETRE TOKU MLIEKA U U 185 MAČUHOVÁ L., UHRINČAŤ M., MARGETÍN M., MAČUHOVÁ J., TANČIN V. U U 367 DVOJETAPOVÁ INDUKCIA A SYNCHRONIZÁCIA ESTRU V STÁDE OVIEC DETERMINOVANÁ POČTOM A ZDRAVOTNÝM STAVOM PLEMENNÝCH BARANOV U U 191 MARAČEK, I., VLČKOVÁ, R., JANKUROVÁ, J., KLAPÁČOVÁ, K., HORŇÁKOVÁ, Ľ., POŠIVÁK.J. U U FYZIOLOGICKÉ MONITOROVANIE PROCESOV NÁBORU, VÝBERU A DOMINANCIE TERCIÁRNYCH FOLIKULOV VAJEČNÍKOV OVIEC U 196 U MARAČEK, I., VLČKOVÁ, R., HALAGAN, J. U U VPLYV HYPERTERMIE NA BIOCHEMICKÉ PARAMETRE KRVI KRÁLIKOV A VYBRANÉ VÝKRMOVÉ UKAZOVATELE 201 U U MARCINKOVÁ, M., PIVKO, J., LUKÁČ, N., PARKÁNYI, V., RAFAY, J., MASSÁNYI, P., CAPCAROVÁ, M., U U ZMENY V ŠTRUKTÚRE STEHNOVEJ KOSTI RYŠAVKY ŽLTOHRDLEJ (APODEMUS FLAVICOLLIS) A RYŠAVKY KROVINNEJ (APODEMUS SYLVATICUS) U 207 U MARTINIAKOVÁ, M., OMELKA, R., GROSSKOPF, B., JANČOVÁ, A. U HEPATODYSTROFIE - STEATÓZA U U 211 U MASSÁNYI P., KOVÁČIK, J. ŽOLDOŠ, E.,FABIŠ, M., LUKÁČ, N., KOLESÁROVÁ, A. U U PROTEKTÍVNY ÚČINOK ZINKU VOČI PÔSOBENIU KADMIA U HYDINY U NAĎ, P., SKALICKÁ, M., KORÉNEKOVÁ, B., PISTL, J., MASSANYI, P., CIGÁNKOVÁ, V. U 219 U U QUO VADIS POKUSY NA ZVIERATÁCH VO VYSOKOŠKOLSKEJ EDUKÁCII A VÝSKUME? 223 U U NIŠTIAR, F., BEŇAČKA, R., LUKAČÍNOVÁ, A., LOVÁSOVÁ, E., NIŠTIAROVÁ, A., U U POUŽITIE PARACETAMOLU V TERAPII RESPIRAČNÝCH OCHORENÍ OŠÍPANÝCH U 230 U NOVOTNÝ, J., KOVÁČ, G., LINK, R., HISIRA, V. U U PÔSOBENIE HYPERTERMIE NA PREIMPLANTAČNÉ EMBRYÁ KRÁLIKOV IN VITRO A ÚLOHA PROTEÍNOV HSP70 236 U U OLEXIKOVA L., MAKAREVIČ A.V., CHRENEK P., KUBOVIČOVA E., PIVKO J. U U CHEMOPREVENTÍVNY ÚČINOK DIKLOFENAKU U MAMÁRNEJ KARCINOGENÉZY SAMÍC POTKANOV KMEŇA SPRAGUE-DAWLEY. U 243 U ORENDÁŠ, P., KASSAYOVÁ, M., AHLERS, I., AHLERSOVÁ, E., FRIEDMANOVÁ, L., STAROSTOVÁ, M., BOJKOVÁ, B. U U LEUKOPÉNIA BROJLEROVÝCH KRÁLIKOV VPLYVOM HYPERTERMIE U 250 U PARKÁNYI, V., ONDRUŠKA, Ľ., RAFAY, J., CHRASTINOVÁ, Ľ., PIVKO, J., MASSÁNYI, P., LUKÁČ, N., CAPCAROVÁ, M. U U ANALÝZA VNITŘNÍHO PROSTŘEDÍ MASNÉHO SKOTU U 258 U PAVLÍK, A. , BARTUŇKOVÁ, H., BJELKA, M., JELÍNEK P. U U ZMENY NEUROMEDIÁTOROV V HYPOTALAMO – HYPOFYZÁRNYCH OBLASTIACH PO HORMONÁLNOM OVPLYVNENÍ U 264 U PÁSTOROVÁ,B., STANÍKOVÁ, A., HALAGAN, J. U U VPLYV DIÉTY OBOHATENEJ SELENIČITANOM SODNÝM NA ANTIOXIDAČNÝ A SELÉNOVÝ STATUS OVIEC. U 270 U PETROVIČ, V., LENG, L., PISARČÍKOVÁ, J., FARKAŠOVÁ, Z., TÓTHOVÁ, CS., KOVÁČ, G. U U VLIV GRAVIDITY NA POČET LEUKOCYTŮ A T - LYMFOCYTŮ U OVCÍ SUPLEMENTOVANÝCH SELENEM. U 275 U *PÍSEK, L., TRÁVNÍČEK, J., KROUPOVÁ, V., RODINOVÁ, H. U U VPLYV PRÍDAVKU TREHALÓZY NA FERTILIZAČNÚ KAPACITU ZMRAZENÉHO SEMENA BARANOV. U 277 U RIHA, Ľ., APOLEN, D., PIVKO, J., KUBOVIČOVÁ, E., GRAFENAU, P., LUKÁČ, N. U U VÝZNAM METABOLICKÉHO PROFILOVÉHO TESTU VO VZŤAHU K ZDRAVIU A PRODUKCII 283 U U SCHNEIDGENOVÁ, M., KOVÁČIK, J. U U ORTUŤOU VYVOLANÉ ZMENY V SEMENNÍKOCH POTKANOV IN VIVO U U 286 SLIVKOVÁ J., MASSÁNYI P., LUKÁČ N., KOVÁČIK J., TOMAN R. U U 368 KUMULÁCIA ZINKU V TKANIVÁCH A VAJCIACH JAPONSKÝCH PREPELÍC 290 U U SKALICKÁ, M., NAĎ, P, KORÉNEKOVÁ, B., U U ZMENY KVALITATÍVNYCH UKAZOVATEĽOV BRAVČOVÉHO MÄSA POČAS DLHODOBÉHO MRAZIARENSKÉHO USKLADNENIA U 294 U SOPKOVÁ, D. U U ANALÝZA PRODUKTOV DEGRADÁCIE LIPIDOV V TUKOVOM TKANIVE OŠÍPANÝCH U 298 U SOPKOVÁ D., STANÍKOVÁ A., PÁSTOROVÁ B. U U MORFOLOGICKÉ ZMENY V MATERNICI OVIEC PO APLIKÁCII CLOPROSTENOLU A EKVÍNNEHO CHORION-GONADOTROPÍNU U 302 U STANÍKOVÁ, A., PÁSTOROVÁ, B., HALAGAN, J., SOPKOVÁ, D., MARAČEK, I. U U KONZUMÁCIA MLIEKA A MLIEČNYCH VÝROBKOV U SLOVENSKEJ POPULÁCIE U 307 U ŠRAMKOVÁ, K., CHLEBO, P. , KOPČEKOVÁ, J. , DUDRIKOVÁ, E. *, MRÁZOVÁ, J. U U INDEX ZDRAVÉHO STRAVOVANIA U DOSPELÝCH ŽIEN U ŠRAMKOVÁ, K., KOLESÁROVÁ, A. , BRÁNYIK, K , MIŠIAKOVÁ, M. U 313 U U VLIV VYBRANÝCH MIKROKLIMATICKÝCH PODMÍNEK PROSTŘEDÍ NA JAKOSTNÍ PARAMETRY MLÉKA NA VOLNÉM USTÁJENÍ U 319 U ŠŤASTNÁ, J., ŠOCH, M., U U HODNOTENIE FREKVENCIE MIKROJADIER V KOSTNEJ DRENI MYŠI PO PODANÍ MORFÍNU A PROTEÁZY ASPERGILLUS ORYZAE U 319 U ŠUTIAKOVÁ, I., ŠUTIAK, V., KOVALKOVIČOVÁ, N., 1PORAČOVÁ J., VÁCZI, P., SABOVÁ, L. U U MÁ ZVÝŠENÁ HLADINA MATERNÁLNEHO TESTOSTERÓNU VPLYV NA POMER DRUHÉHO A ŠTVRTÉHO PRSTA (2D:4D) U LABORATÓRNEHO POTKANA? U 325 U TALAROVIČOVÁ A., KRŠKOVÁ, L., BLAŽEKOVÁ, J. U U POSSIBLE INTERACTION OF SOMATIC CELL COUNT AND QUARTER MILK FLOW PATTERNS 330 U U TANČIN,V IPEMA, A. H., MAČUHOVÁ, L., UHRINČAŤ, M., HOGEWERF P. U U PROTEÍNY AKÚTNEJ FÁZY VO VZŤAHU K VYBRANÝM UKAZOVATEĽOM VNÚTORNÉHO PROSTREDIA U DOJNÍC 335 U U TÓTHOVÁ, CS., NAGY, O., KONVIČNÁ, J., PETROVIČ, V., PISARČÍKOVÁ, J., KOVÁČ, G. U U VIABILITY OF PREIMPLANTATION RABBIT TRANSGENIC EMBRYOS U 341 U TURANOVA Z., MAKAREVICH A.V., BAUER M., CHRENEK P. U U ULTRASONOGRAFICKÉ A HISTOLOGICKÉ SLEDOVANIE ÚČINKU HORMONÁLNEJ INDUKCIE ESTRU BAHNÍC MIMO CHOVATEĽSKEJ SEZÓNY 346 U U VLČKOVÁ, R., VALOCKÝ, I., LAZAR, G., MARAČEK, I. U U THE EFFECT OF WATER SALINITY ON THE EMBRYONIC AND LARVALDEVELOPMENT IN THE COMMON FROG RANA TEMPORARIA L. 351 U U ZAMACHOWSKI W., R. STAWARZ, NAD G. FORMICKI U U CIRKADIÁNNA ORGANIZÁCIA A PORUCHY BIORYTMOV V KARDIOVASKULÁRNOM SYSTÉME U U 361 ZEMAN, M., BADA, V., DULKOVÁ, K., LIŠKA, D., KOVÁČIKOVÁ, Z., KOŠŤÁL, L., HERICHOVÁ, I., U U 369 Názov publikácie: VII. Celoslovenský seminár z fyziológie živočíchov Druh publikácie: Zborník vedeckých prác Autori publikácie: Kolektív autorov Zborník zostavili: Ing. Adriana Kolesárová, PhD. doc. MVDr. Peter Massányi, PhD. doc. Ing. Norbert Lukáč, PhD. Vydavateľ: Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre Náklad: 100 ks Rok vydania: 2007 Počet strán: 369 Konferencia bola podporená prostredníctvom projektov: APVV – 0299-06 VEGA 1/2417/05; 1/4347/ KEGA 3/4280/06 MVTS Maď/SR/SPU07 ISBN 978-80-8069-886-7
Podobne dokumenty
Vol. 3 - Potravinárstvo
ANDREJI, J., STRÁŇAI, I., KAČÁNIOVÁ, M. 2007. Koncentrácia niektorých ťažkých kovov a mikrobiologická kvalita mäsa pstruha dúhového (Oncorhynchus mykiss) z farmového chovu – predbežná štúdia. In Bu...
Bardziej szczegółowoZborník - Katedra fyziologie zivocichov
László Bárdos, prof., DVM, PhD. Szent István University, Budapest, GATE, Hungary Jozef Bíreš, prof. MVDr. DrSc. State Veterinary and Food Service of Slovak Republic, Bratislava, Slovak Republic Zso...
Bardziej szczegółowo