Biologia molekularna
Transkrypt
Biologia molekularna
transkrypcja chromatyny problem: kompleks pol II RNA nukleosom: dysocjacja histonów? Jak to może działać: >500 kD 145 bp DNA = 100 kD rdzeń histonowy = 100 kD skip: - split: - strip: + Skip czy Split czy Strip ? Thoma 1991 Trends Genet 7: 175 skip? Jak by to się mogło dziać? przesuwanie się wzdłuż pętli DNA Studitsky, Clark, Felsenfeld 1974 Cell 76, 371 tak działa pol III RNA i fagowe pol RNA (także zależne od ATP kompleksy remodelujące) Studitsky i in. 2004 Trends Bioch Sci 29: 127-135 split ? Jak by to się mogło dziać? w ME transkrybowana chromatyna wydaje się być „gładka” (o jednakowej grubości), nić jest grubsza niż gołe DNA, przeciwciała wykrywają obecność histonów czy to są artefakty? Transcription kb 3.53 -+ +3.5kb CIN2 +3.0kb 2.03 1.58 a +2.5kb 0.98 transkrypcja eksponuje dwie, normalnie ukryte, reszty cysteinowe H3 na działanie czynników modyfikujących i chromatografię powinowactwa Hg mononukleosomy wydają się być niesfałdowane w postaci dwu tetramerów histonów + nieduże białka niehistonowe Prior & Allfrey 1983 Cell 34, 1a0a33a HSP82 1.33 +2.0kb 0.82 w transkrybowanej chromatynie po trawieniu DNazą I pojawiają się powtórzenia połówek nukleosomów Lee & Garrard 1991 EMBO J. 10, 607 powolna transkrypcja przez pol II RNA powoduje wyparcie z nukleosomu jednego dimeru H2A-H2B Studitsky i in. 2004 Trends Bioch Sci 29: 127-135 strip ? synteza histonów obrót histonów problem: które histony są dostępne do tworzenia nukleosomów ? mitoza faza G2 zależne od replikacji faza G konstytutywne faza S M faza G1 zastępcze histony faza S faza G2 M u wszystkich eukariota H3.3, u roślin wysoce zacetylowany H3.2 aktywna transkrypcja przez pol II RNA powoduje rozpad nukleosomów Kulaeva i in. 2007 Mutat Res 618: 116-129 dynamiczna struktura chromatyny • w obrębie wysp CpG struktura chromatyny jest zależna od stanu metylacji DNA • modyfikacje histonów tworzą „kod histonowy” • remodelowanie chromatyny * z udziałem dużych kompleksów remodelujących zależnych od ATP * niekiedy za pośrednictwem interferencji RNA (RNAi) NOBEL 2006 przykłady zależnej od RNA heterochromatynizacji: - inaktywacja chromosomu X (Xi), - wyciszenie centromerów i loci typu koniugacyjnego u drożdży rozszczepkowych Schizosaccharomyces pombe modyfikacje histonów acetylacja lizyn metylacja lizyn (mono, di, tri) oraz arginin (mono, di) fosforylacja seryn i treonin ubikwitynacja C-końcowych lizyn ADP-rybozylacja Allfrey i in. PNAS 51, 786-794 koniugacja SUMO do lizyn Bradbury, BioEssays 14, 9-16 K – lizyna S - seryna acetylacja konserwowanych lizyn (N końce H3 i H4 oraz wzorce ich acetylacji są konserwowane) 5 Ac H4 N-terminus 12 Ac Ac 16 20 Ac Ac or Me Ac-S-G-R-G-K-G-G-K-G-L-G-K-G-G-A-K-R-H-R-K-V-L-R-D+ + + + + + + + + + 4 Me H3 N-terminus 8 9 Ac 18 Ac 14 Ac 23 Ac 27 Ac or Me A-R-T-K-Q-T-A-R-K-S-T-G-G-K-A-P-R-K-Q-L-A-T-K-A-A-R-K-S-A-P+ + + + + + + + + N lizyna Acetyl-CoA C C g C e N+ O C a b C d C HAT (Histone Acetyl-Transferase) O P P wiązanie DNA - O HDAC (Histone Deacetylase) - - - C C O C C e C C C - O - P - - C N - - - N e-N-acetylo-lizyna brak wiązania DNA - odwracalne reakcje CoA O O - -- - - - - - rozmaitość kompleksów HAT modyfikacje lizyny LSD1 demetyluje histony Klose & Zhang 2007 Nature Revi Mol Cell Biol 8, 307-318 a Mechanizm reakcji usuwania grup mon-metylowych przez LSD1. Uważa się, że LSD1 katalizuje demetylację mono- i dimetylowanych reszt lizynowych w reakcji oksydacji amin z FAD jako kemofactor. Loss of the methyl group from mono-methyl lysine occurs through an imine intermediate, which is hydrolysed to form formaldehyde by a non-enzymatic process. b A polypeptide backbone cartoon structure of LSD1 bound to Co-REST and the cofactor FAD. The twolobed amine oxidase (AO) domain is shown in orange and yellow. The Tower domain is in green and the SWIRM domain in blue. The Co-REST linker region (pink) associates with the LSD1 Tower domain and the SANT domain (red) situated at the top of the Tower domain. c Depiction of the potential association of LSD1–Co-REST with nucleosomal DNA. The bottom half shows a nucleo-some with the core histone octamer in the centre and the associated DNA double helix in blue. The LSD1–Co-REST complex modelled onto a nucleosome indi-cates that the SANT domain of Co-REST (red) could interact with nucleosomal DNA, whereas LSD1 tar-gets the histone H3 tail where it protrudes from the DNA gyres (shown by the arrow). d LSD1 w kompleksie Co-REST bierze udział w represji genów neuronalnych w komórkach nieneuronalnych. LSD1 uczestniczy w represji poprzez usuwanie metylacji H3K4. e LSD1 w kompleksie receptora adrogenu (AR) staje się aktywatorem poprzez zmianę specyficzności do substratu, tak żę katalizuje usuwanie metylacji H3K9. Peterson, Laniel 2004 Curr. Biol. 14:R546-51 kod histonowy daje możliwość acetylacji H4 - w 4 pozycjach, fosforylacji H3 – w 2 pozycjach… >4 000 kombinacji modyfikacji pojedynczego nukleosomu kod histonowy H4AcK8 H3AcK14 H3PhS10 = transkrypcja H3MeK9 (trimetylacja) brak acetylacji H3 lub H4 = represja transkrypcji H4AcK4 H4AcK12 = tworzenie nowych nukleosomów w fazie S H2APhS1 H2APhT119 H3PhT3 H3PhS10 H3PhS28 = skondensowana mitotyczna chromatyna Peterson, Laniel 2004 Curr Biol 14, R546 ogólne cechy chromatyny nieaktywnej aktywnej * * * * deacetylacja histonów H4MeK12 5mCpG obecność HP1 (izoformy α,β,γ) * * * * H4AcK5, H3AcK9/14 H3MeK9 brak metylacji DNA m-sca nadwrażliwe na DNazę I acetylacja histonów na promotorach TH receptor hormonu tarczycy przykład czynnika transkrypcyjnego TH ACGGTC ADA2 ADA3 GCN5 HAT p300 CPB HAT HAT P/CAF TACCCG koaktywator korepresor HDAC HAT N-CoR Sin3 RPD3 HAT TA TA TAFII 250 P pol.II TB TA TA P TB brak hormonu TACCCG HAT TAFII 250 represja transkrypcji TR/RXR hormon aktywacja transkrypcji + Wolffe 1997 Nature 387: 16 zmienione aktywacja genów fazy S korepresor Rb HAT CPB TAF 250 II P TB HAT niska aktywność HAT mitoza G2 G1 S Rb TA TA koaktywator HDAC1 (ang. Histone Deacetylase) geny fazy S WYŁĄCZONE E/ + R cyklina /kinaza cdk2 P CPB słaba aktywność Ait-Si-Ali et al. Nature 396, 184 (1998) zmienione TA TA P Rb P aktywny HAT (ang. Histone Acetyl Transferase) pol.II P korepresor TAF 250 II TB kontrola przejścia G1-S punkt R (ang. Restriction) HAT T HA geny fazy S WŁĄCZONE deacetylacja chromatyny wyciszenie transkrypcyjne np. inaktywacja chromosomu X 5 me º º 3’..pGpCp..5’ 5 me 5’..pCpGp..3’ MeCP2 represor transkrypcji korepresor Sin3 HDAC RPD3 + metylacja C w CpG występuje w wyciszonych genach i inaktywowanych chromosomach X metylacja CpG jest utrzymywana po replikacji dzięki metylazie DNA specyficznej dla hemimetylowanego DNA 5mC wiąże represor transkrypcyjny MeCP2 (MethylC-binding Protein-2) MeCP2 wiąże korepresor Sin3 z deacetylazą histonów RPD3 + hypoacetylowane wyciszone włókno chromatyny Nan et al. Mol.Cell.Biol. 16, 414 (1996); Cell 88, 1 (1997); Jones et al. Nat.Genet. 19, 187 (1998) acetylacja domen chromatynowych przykład: domena kurzych genów b-globinowych kompleksy nukleosomów z antyAcK 0 DNA remaining domain boundary 10 30 kb 20 br bH bA be DNA loop domain domain boundary kontrola: nieaktywny gen geny b-globiny kurzej m-sce nadwraż- owalbuminy liwe na DNazę I ogólna wrażliwość na DNazę I DNase I 0 1 2 DNase I (u/ml) l wysoki poziom acetylacji chromatyny w całych domenach (pętlach DNA) indukuje ogólną wrażliwość chromatyny na DNazę I l wewnątrz tych domen w obrębie funkcjonalnych genów lub miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych w strukturze chromatyny występują małe miejsca nadwrażliwe na DNazę I Hebbes, Clayton, Thorne, Crane-Robinson 1994 EMBO J. 13, 1823 owady – Dnmt2 nie ma N-końcowej domeny odpowiedzialnej za interakcje z in. białkami - metylacja DNA i histonów nie są ze sobą powiązane HMT – metylotransferaza histonów MBP - białka wiążące zmetylowane DNA Neurospora, Arabidopsis, człowiek – metylacja DNA i histonów współdziałają w wyciszaniu genów różnice gatunkowe interakcji metylacji DNA i histonów kooperatywna i samowzmacniająca się organizacja maszynerii modyfikujących chromatynę i DNA odpowiedzialnych za wyciszanie genów w komórkach normalnych i nowotworowych DNMT oddziałują z: deacetylazami histonów (HDACs) metylazami histonów (HMTases) zależnymi od ATP kompleksami remodelujacymi chromatynę białkami strukturalnymi chromatyny (z rodziny HP1) pośrednio z MBD (białkami wiążącymi zmetylowane DNA) www.med.ufl.edu/biochem/keithr/fig4pt1.html kolejność deacetylacji histonów, metylacji histonów, metylacji DNA jest różna komórki normalne – metylacja DNA dotyczy regionów repetytywnych, a większość wysp CpG w promotorach jest niezmetylowana komórki nowotworowe – powtarzalne DNA traci metylację, a wyspy CpG promotorów zyskują metylację, co powoduje wyciszenie bliskiego genu wiązanie DNMT do odpowiednich regionów prawdopodobnie zachodzi dzięki interakcjom białko–białko http://www.med.ufl.edu/biochem/keithr/fig3.html nukleosom metylowane CpG DNA modyfikacje histonów i metylacja DNA integrują funkcje jądrowe istnieje zależność struktury nukleosomowej, lokalizacji chromosomowej i aktywności transkrypcyjnej Esteller, Almouzni 2005 EMBO Rep 6: 624-8 ATP- zależne kompleksy remodelujące chromatynę 3 klasy kompleksów konserwowane pomiędzy S.c., D.m., H.s. Peterson 2002 EMBO Rep 3: 319–322 ATP- zależne kompleksy remodelujące chromatynę 3 klasy kompleksów konserwowane pomiędzy S.c., D.m., H.s. Peterson 2002 EMBO Rep 3: 319–322 biochemiczna aktywność ATP-zależnych kompleksów remodelujących chromatynę etapy działania kompleksów prowadzące do przesunięcia, transferu, rozpadu nukleosomu Vignali i in. 2000 Mol Cell Biol 20: 1899-1910 interakcje z czynnikami transkrypcyjnymi decydują o kierowaniu kompleksów do miejsc docelowych regulacja cyklu komórkowego przez kompleks SWI/SNF oddziaływania między: kompleksami HAT, kompleksami remodelującymi i czynnikami transkrypcyjnymi umożliwiają utworzenie PIC (ang. preinitiating complex) enzymy remodelujące chromatynę ułatwiają różne etapy aktywacji genów A.promotor drożdżowego genu HO - przed powstaniem PIC aktywator Swi5p rekrutuje SWI/SNF i HAT (Gcn5p), co zwabia aktywator SBF http://highered.mcgrawhill.com/sites/dl/free/0072835125/126997/animation30.html B. promotor ludzkiego IFN-β – związane wyżej aktywatory rekrutują HATy podczas tworzenia PIC, acetylacja histonów ułatwia przyłączenie SWI/SNF, który niszczy strukturę nukleosomu związanego z promotorem C. promotor ludzkiego α1-ATkompleksy HAT (CBP, P/CAF) i SWI/SNF przyłączają się do promotora po utworzeniu PIC stymulując ekspresję zmiany struktury chromatyny, rekrutacji czynników transkrypcyjnych i kofaktorów w rejonie regulatorowym locus lizozymu w linii erytroblastów HD37 (Lys¯ ¯), multipotencjalnych komórkach prekursorowych HD50 MEP (Lys¯), niestymulowanych (Lys+) i stymulowanych LPS komórkach prekursorowych makrofagów HD11 (Lys++) białe owale – czynniki transkrypcyjne związane z rdzeniami enhancerów, promotorem i -2.4-kb silencerem; TR- receptor hormonu tarczycy, związany do -2.4-kb silencera obok m-sca CTCF CH3 i Ac - m-sca metylacji DNA i acetylacji histonów szare kółka – nukleosomy owale z linia kreskowaną – kompleksy czynników transkrypcyjnych obecne w niektórych komórkach lub stabilizowane po stymulacji LPS strzałki czarne i szare – odpowiednio silne i słabe m-sca nadwrażliwe na DNazę I Lefevre i in. 2003 Mol. Cell. Biol. 23: 4386-4400 Lys¯ ¯ Lys¯ Lys+ Lys++ inne procesy zachodzące przy udziale enzymów modyfikacji histonów i/lub remodelujących chromatynę kompleks remodelujący NoRC wycisza geny rRNA Mayer i in. 2006 Intergenic transcripts regulate the epigenetic state of rRNA genes Mol Cell 22: 351-361 Wood i in. 2006 Combinatorial chromatin modifications and memory storage: A code for memory? Learn Mem 13: 241-244 naprawa DNA – NER, NHEJ, rekombinacja homologiczna, naprawa genów transkrypcyjnie aktywnych Shim i in. 2005 Mol Cell Biol 25: 3934-44 Kruhlak i in. 2006 Cell Biol 172: 823-834 Chai i in. 2005 Genes Dev 19: 1656-1661 acetylacji podlegają nie tylko białka histonowe http://www.cellsignal.com/reference/pathway/Protein_Acetylation.html