docNormy morfologii krwi u dzieci,Dlaczego testy serologiczne na
download 
Reklamacja Transkrypt
Normy morfologii krwi u dzieci,Dlaczego testy serologiczne na
Normy morfologii krwi u dzieci Interpretacja morfologii powinna uwzględniać wiele aspektów. Jednym z najważniejszych jest wiek pacjenta. Inaczej bowiem podchodzimy do wyników noworodka urodzonego w terminie, wcześniaka, kilkulatka czy dorosłego. W związku z powyższym odmienne zakresy referencyjne dotyczą różnych grup wiekowych. W obecnej rzeczywistości, kiedy nauka w szerokim zakresie wkracza w wirtualny świat, trudno znaleźć osobę, która nie posiadałaby podstawowej wiedzy o działaniu swojego organizmu. Nierzadko jeszcze przed wizytą u lekarza szukamy pomocy w Internecie. Nic nie zastąpi fachowej wiedzy specjalisty, ale wyszukanie najistotniejszych informacji (z wiarygodnych źródeł, nie forów) na nurtujący nas temat może ułatwić zrozumienie problemu. Morfologia krwi obwodowej to badanie kluczowe w podstawowej opiece zdrowotnej. Traktuje się je jako profilaktykę, zleca przy podejrzeniu anemii, infekcji, w bilansie dwulatka i w wielu innych sytuacjach. W związku z tym pozostaje ona w centrum zainteresowania pacjentów. Obecnie laboratoria komercyjnie proponują wykonanie morfologii podstawowej (3 diff, obejmuje analizę 3 frakcji krwinek białych) oraz morfologię pełnej (5 diff, dotyczy analizy 5 frakcji krwinek białych). Opis podstawowych parametrów poszczególnych układów opisywanich przez morfologię można znaleźć w artykule Morfologia krwi obwodowej. Tabela 1. Wybrane różnice pomiędzy morfologią 3-diff i 5-diff [5]. Morfologia jest badaniem wykonywanym z krwi żylnej, ale u niemowląt i noworodków pobranie krwi kapilarnej to zwykle metoda z wyboru (zwłaszcza w warunkach ambulatoryjnych). Także w niektórych szczególnych sytuacjach dopuszcza się pobieranie krwi włośniczkowej (zły stan naczyń żylnych pacjenta, pacjenci otyli, z planowanym leczeniem dożylnym lub chemioterapią, badania przyłóżkowe) [1]. Należy jednak pamiętać o ograniczeniach wyników morfologii pobranych na mikrometodę. Największym ograniczeniem pobierania krwi włośniczkowej jest system otwarty pobierania. Powoduje to często pozyskiwanie nieprawidłowego stosunku krwi do antykoagulanta w probówce, a tym doprowadza do odstępstw od rzeczywistego wyniku. Badania przeprowadzone przez Collegium Medicum UJ dostarczają informacji, że nawet 75% próbek może zawierać nieprawidłową objętość krwi, w większości przypadków większą niż zalecana przez producenta. Objętość krwi powyżej określonego poziomu powoduje obniżenie stężenia hemoglobiny, hematokrytu, liczby czerwonych krwinek, średniej objętości erytrocytów oraz wzrost liczby płytek krwi w porównaniu do wartości mierzonych w prawidłowo pobranej mikroprobówce [2]. Ponadto, sam proces pobierania może wpłynąć na wynik badania. Zbyt wolny wypływ krwi włośniczkowej z palca spowodowany zmniejszonym przepływem krwi (oziębienie, zaburzenie krążenia) oraz „wyciskanie” krwi może doprowadzić do powstania skrzepów, mikroskrzepów lub hemolizy w mikroprobówce. Badania przeprowadzone w CSK w Warszawie na prawie 7,5 tys. próbek morfologii wykazały odrzucenie 1,08% probówek z powodu skrzepów. Wśród powodów odrzucenia próbek to właśnie skrzep w probówce jest najczęstszy (49%). Tuż za nim lokuje się hemoliza (44%) [3]. Zakresy referencyjne u dzieci różnią się od wartości prawidłowych ustalonych dla osób dorosłych. Co więcej, mogą one być różne w poszczególnych laboratoriach w zależności od stosowanej metody. Tabela 2. Przykładowe normy różnych parametrów morfologii krwi obwodowej w podziale na poszczególne układy oraz wiek [4]. Prawidłowe rozmazy krwi u dzieci różnią się od rozmazów ocenianych u osób dorosłych. Oprócz wyżej wymienionych podstawowych parametrów, morfologia krwi opisuje zmiany w układzie białokrwinkowym w podziale na poszczególne komórki: limfocyty, neutrofile, monocyty, eozynofile i bazofile. Analiza automatyczna przekazuje wiedzę odnośnie ilości poszczególnych komponentów leukocytów. Pomimo dużej dokładności tej metody (głównie ze względu na liczbę zliczanych komórek), mikroskopowanie pozostaje nadal sposobem potwierdzenia obecności populacji komórek nieprawidłowych, które przez analizator zostały zidentyfikowane jako podejrzane. Ręczne wykonanie analizy mikroskopowej rozmazu krwi nie ma jednak na celu sprawdzenia liczebności poszczególnych populacji krwinek białych, ale potwierdzenie obecności komórek nieprawidłowych oraz sprecyzowanie wszelkich istotnych zmian morfologicznych [5]. Tabela 3. Przykładowe zakresy referencyjne automatycznego rozmazu krwi [4]. Źródło zdjęć: własne® W rozmazie krwi można obserwować także układ czerwonokrwinkowy. U noworodków normą jest pojawienie się echinocytów, kodocytów, schistocytów sferocytyów, makrocytów (związane z wysokim MCV), niewielka ilość erytroblastów (poniżej 7% do kilku dni po narodzinach) czy polichromazja (polichromatofilia, wielobarwliwość), które zaobserwowane u osoby dorosłej budziłyby niepokój. Wykonanie i ocena rozmazu krwi noworodka wymaga wprawy, ponieważ duża zawartość hemoglobiny w krwinkach powoduje zniekształcenie krwinek. Niejednokrotnie zniekształcenie obserwuje się także w obrębie leukocytów. U niemowląt i dzieci do 3 r.ż. popularne jest występowanie pobudzonych limfocytów (ang. reactive lymphocytes). U dzieci zwykle odsetek limfocytów jest wyższy niż neutrofili [6]. Nieprawidłowości w układzie czerwonokrwinkowym zostały omówione w artykule Różnorodność morfologiczna erytrocytów — struktury wewnątrzerytrocytowe oraz Różnorodność morfologiczna erytrocytów — anizo- i poikilocytoza. Opis przyczyn zmian parametrów w obrębie układu czerwonokrwinkowego, białokrwinkowego oraz płytek krwi można znaleźć w tabeli 2 artykułu Morfologia krwi obwodowej. Zmiany ilościowe płytek krwi i wskaźników płytkowych zostały przedstawione w artykule Zaburzenia ilościowe płytek krwi oraz Przydatność wskaźników płytkowych w diagnostyce. Morfologia krwi powinna być oceniana z uwzględnieniem wieku pacjenta Źródło Flickr, autor Crystal, licencja CC BY 2.0 W przypadku uzyskania wyniku morfologii krwi wykraczającego poza wartości referencyjne nie należy od razu wpadać w panikę. Należy pamiętać, że to niekoniecznie patologia, ponieważ na uzyskany rezultat ma wpływ wiele czynników takich jak wiek, płeć, rasa, stres, pora dnia, miejsce pobrania, przebywanie na dużych wysokościach czy zażywane leki. Niemniej jednak, w przypadku jakichkolwiek wątpliwości związanych ze stanem zdrowia należy niezwłocznie zasięgnąć rady lekarza. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: 1. Sysmex. Faza przedanalityczna w hematologii (cz.1). rev.1 2015-07-22 2. Kościelniak B. i wsp. Wpływ czynników przedanalitycznych na wynik badania morfologii krwi. Diagn Lab, 2015; 51,4: 271-276. 3. Bobilewicz D. i wsp. Ocena jakości próbek krwi przesyłanych do laboratorium w aspekcie błędów przedanalitycznych – doświadczenia własne. Diagn Lab, 2007; 43: 669-677. 4. Trusler J. Paed’s haematology reference range. Johannesburg/Pretoria, 2009. 5. Sysmex. Przegląd korzyści płynących ze zmiany analizatora hematologicznego 3-Diff na analizator hematologiczny 5-Diff. Sysmex Polska, rev. 1 2013-08-19 6. Hays T., Jamieson B. Atlas o paediatric peripheral blood smears. Abbott Laboratories, 2008. *** Portal dolinabiotechnologiczna.pl ma z założenia charakter wyłącznie informacyjno-edukacyjny dla branży biotechnologii, diagnostyki i biologii medycznej. Użytkownicy portalu powinni mieć pełną świadomość, że treści Portalu nie mają charakteru porad medycznych. Treści te mają na celu działania edukacyjne, a nie zastąpienie kontaktu pomiędzy Użytkownikiem Portalu a lekarzem. W przypadku jakichkolwiek wątpliwości natury klinicznej, pacjenci powinni skonsultować się natychmiast z lekarzem. Administrator nie ponosi żadnych konsekwencji wynikających z wykorzystania informacji zawartych w serwisie portalu. Dlaczego testy serologiczne na obecność bakterii Helicobacter pylori są znacznie mniej wiarygodne niż testy oddechowe? Metoda testu oddechowego na obecność bakterii Helicobacter pylori uznawana jest za tzw. „złoty standard” diagnostyczny. Mimo że testy oddechowe zyskują na znaczeniu w Polsce, wciąż zdecydowana liczba pacjentów jest kierowana do ośrodków wykonujących badanie przy użyciu – często dających nieprawidłowe wyniki – metod serologicznych. Skąd więc biorą się nieprawidłowe wyniki testów serologicznych dostępnych w aptece, czy badania kału na obecność H. pylori i jakie są ograniczenia tych testów? Bakterie należące do gatunku Helicobacter pylori to Gram ujemne, krótkie pałeczki o lekko heliakalnym kształcie, zaopatrzone w wici na biegunach komórki. Uważa się, że bakterie te odpowiadają za ok. 80% przypadków choroby wrzodowej żołądka i dwunastnicy, z zakażeniem wiąże się też występowanie zmian skórnych, w tym trądziku u osób dorosłych. Zakażenie tą bakterią szerzy się głównie drogą pokarmową, zwłaszcza wśród osób utrzymujących bliskie kontakty (np. członkowie rodziny), przy czym sam fakt kolonizacji bez występowania objawów nieżytu żołądka czy choroby wrzodowej nie stanowi wskazania do leczenia farmakologicznego (tzw. eradykacji bakterii). Nie zmienia to jednak tego, że każdy pacjent zgłaszający lekarzowi dolegliwości ze strony przewodu pokarmowego powinien bezwzględnie zostać zdiagnozowany w kierunku obecności H. pylori w żołądku, co pozwoli na postawienie szybkiej i prawidłowej diagnozy i wdrożenie skutecznego leczenia. Morfologia krwi powinna być oceniana z uwzględnieniem wieku pacjenta Źródło Flickr, autor Crystal, licencja CC BY 2.0 Diagnostyka zakażenia czy tylko kolonizacji (obecność bakterii, bez występowania objawów choroby) oferuje obecnie kilka możliwości. Wykonuje się badanie histopatologiczne wycinka błony śluzowej żołądka lub (i) hodowle z takiej próbki, ale te metody są najmniej czułe oraz wymagają inwazyjnego badania gastroskopowego. Możliwe jest także przeprowadzenie testów molekularnych przy użyciu metody PCR i choć ten sposób jest zarówno bardzo czuły i specyficzny, to jednak konieczne jest pobranie wycinka z błony śluzowej żołądka aby przeprowadzić analizy laboratoryjne. Na uwagę zasługują jednak kolejne dwie grupy metod, a mianowicie testy oddechowe (UBT) oraz testy serologiczne. Są to obecnie najbardziej popularne sposoby wykrywania zakażenia przez H. pylori. Test oddechowy polega na podaniu pacjentowi tabletki zawierającej mocznik znakowany izotopem węgla (najczęściej nieradioaktywnym, w pełni bezpiecznym 13C). Bakteria H. pylori posiada enzym ureazę, która rozkłada znakowany mocznik m.in. do dwutlenku węgla (CO 2 ) zbudowanego z izotopu węgla pochodzącego z podanego pacjentowi mocznika. Ten CO2 trafia do płuc i jest wydychany z powietrzem, a specjalne urządzenie analizuje czy jest w nim wspominany izotop węgla. Jeśli tak – to wiadomo że w żołądku znajduje się poszukiwana bakteria. Testy serologiczne polegają na tym, że stosuje się specjalne techniki diagnostyczne opierające się na reakcjach immunologicznych, gdzie wykorzystuje się przeciwciała skierowane przeciwko antygenom bakteryjnym lub przeciwciałom produkowanym przez organizm w odpowiedzi na zakażenie. Jeśli w badanych próbkach są antygeny lub przeciwciała anty H. pylori, to wskutek odpowiedniej reakcji enzymatycznej zmienia się zabarwienie próbki, bądź jest emitowana fluorescencja, której intensywność jest mierzona i w ten sposób oznacza się zawartość w próbce przeciwciał lub antygenów. W przypadku badania próbek kału, oznacza się obecność w próbkach antygenów H. pylori, czyli tak naprawdę fragmentów komórek bakterii, które przedostają się do jelit z żołądka. Test pozwala stwierdzić czy w danym momencie w przewodzie pokarmowym znajdują się bakterie H. pylori. Badanie serologiczne krwi działa na nieco innej zasadzie. Tutaj poszukiwane są przeciwciała anty H. pylori produkowane przez organizm człowieka w skutek kontaktu systemu odpornościowego z bakterią. Potwierdzenie pewnej minimalnej ilości tych przeciwciał w surowicy krwi jest dowodem na to, że w przewodzie pokarmowym występuje bakteria lub, że była tam obecna w przeszłości. Specjaliści spierają się o to, który test jest bardziej skuteczny i użyteczny w diagnostyce. Niewątpliwą zaletą obydwu jest to, że są nieinwazyjne (tzn. nie ingeruje się w organizm w celu wykonania badania), jednakże na tym podobieństwa się kończą. Testy oddechowe nie wymagają angażowania wyspecjalizowanego laboratorium mikrobiologicznego. Pacjent otrzymuje znakowany izotopem węgla mocznik i po ok. pół godzinie wykonuje się za pomocą dedykowanej aparatury analizę wydychanego powietrza – wynik jest otrzymywany natychmiast. Test oddechowy jest wysoce specyficzny, ponieważ poza H. pylori w przewodzie pokarmowym niewiele bakterii potrafi rozkładać mocznik. Pozytywny rezultat testu jest dowodem obecności bakterii, natomiast wynik negatywny świadczy o jej braku. Nie ma możliwości uzyskania wyniku dodatniego po skutecznej eradykacji, jak to ma miejsce w przypadku testów serologicznych, co pozwala na monitorowanie skuteczności terapii. Testy serologiczne opierają się na zasadzie reakcji immunologicznej pomiędzy przeciwciałami a antygenami. Wykorzystuje się tutaj najczęściej technikę ELISA lub proste testy paskowe, które pacjent może wykonać samodzielnie w domu.Niestety, metody te obarczone są ryzykiem błędu. Do przeprowadzenia analizy serologicznej metodą ELISA wymagane jest laboratorium diagnostyczne oraz wykwalifikowani diagności laboratoryjni potrafiący przeprowadzić badania, a na wyniki badania zwykle trzeba czekać co najmniej kilkanaście godzin. Bardzo ważna jest także wiedza na temat ograniczeń metod serologicznych. Badanie kału pozwalające wykryć aktywne zakażenie bądź kolonizację bakterią H. pylori, jest wiarygodne tylko wtedy, jeśli zastosujemy pewne zasady. Komórki bakterii muszą namnażać się w błonie śluzowej żołądka, zatem stosowanie leków z grupy inhibitorów pompy protonowej (IPP), zmniejszających wydzielanie kwasu solnego w żołądku wpływa niekorzystnie na rozwój bakterii, bo te wymagają kwaśnego środowiska. IPP są obecnie bardzo powszechnie stosowane, także bez recepty, dlatego należy uświadomić pacjenta jak mogą one wpłynąć na wyniki badania serologicznego. Podobnie jest z lekami przeciwdrobnoustrojowymi, takimi jak antybiotyki, które mogą zmniejszać liczbę komórek bakterii H. pylori w żołądku. Jeśli pacjent zostaje skierowany na serologiczne badanie kału w kierunku H. pylori, to musi wiedzieć, że trzeba odstawić wymienione leki na co najmniej dwa tygodnie, aby wynik badania był wiarygodny. Nie zawsze jest możliwe przerwanie leczenia i oczekiwanie na odpowiedni moment pobrania próbki. Nawet jeśli nie ma przeciwwskazań do badania kału, to i tak uzyskanie wyniku ujemnego nie jest gwarancją braku bakterii w przewodzie pokarmowym. Liczba bakterii może być bowiem zbyt niska, aby ujawnić się w wyniku przeprowadzonego testu, ale wystarczająca do tego, aby dawać objawy kliniczne. Badanie serologiczne krwi pozwala wykryć przeciwciała przeciwko H. pylori w surowicy. Otrzymanie wyniku pozytywnego może świadczyć zarówno o aktywnym zakażeniu lub kolonizacji, ale równie dobrze może wskazywać na to, że w przeszłości organizm miał kontakt z bakterią i pozostał „ślad immunologiczny” tego zdarzenia, a komórek bakterii już nie ma. Przeciwciała mogą utrzymywać się w krwi od kilku miesięcy do nawet kilku lat po skutecznej eradykacji bakterii, z tego powodu testy serologiczne krwi nie dają pewności co do tego, czy konieczne jest leczenie zakażenia. Z tego samego powodu nie ma też możliwości monitorowania skuteczności leczenia. Odmianą testów serologicznych są szybkie testy paskowe, które można kupić w aptekach. Działają one na takiej samej zasadzie jak testy ciążowe. Pasek zawiera przeciwciała przeciwko antygenom H. pylori lub przeciwciałom anty H. pylori i jeśli w badanej próbce takie występują, to w polu testowym powinno się pojawić barwne oznaczenie wskazujące na wynik pozytywny. Testy paskowe pozwalają badać próbki kału lub krwi. Niestety, ich ogromną wadą jest to, że pacjent wykonuje oznaczenie samodzielnie, co związane jest z dużym ryzykiem błędu. Istnieją tutaj także wszystkie ograniczenia dotyczące skuteczności testów serologicznych opisywane powyżej. W przypadku badania krwi, test nie pozwala na uzyskanie surowicy, zatem analizie poddawana jest pełna krew (w dodatku z opuszki palca, a nie żylna), co dodatkowo zmniejsza skuteczność badania. Ponad to, testy paskowe pozwalają jedynie na jakościowe oznaczenie, natomiast nie ma możliwości ilościowego określenia zawartości antygenów czy przeciwciał, co jest ważne dla prawidłowej interpretacji wyniku. Bardzo ważną sprawą jest odpowiednie przechowywanie testu w domu – nieodpowiednia temperatura czy czas przechowywania prowadzą do degradacji odczynników i zafałszowania wyniku badania. Pacjent który samodzielnie wykonuje badanie, nie ma kontaktu z lekarzem lub z diagnostą laboratoryjnym, a zatem jest pozbawiony fachowej informacji na temat wyniku badania. Metody serologiczne oznaczania zakażenia lub kolonizacji przez bakterię H. pylori są najczęściej stosowanymi sposobami diagnozowania pacjentów. Wydaje się jednak że ograniczenia jakie są z nimi związane powinny skłaniać lekarzy oraz pacjentów do zwrócenia uwagi na testy oddechowe. Metoda testu oddechowego powoli uznawana jest za tzw. „złoty standard” diagnostyczny, czyli za metodę referencyjną stanowiącą punkt odniesienia dla innych sposobów diagnostyki. Mimo że testy oddechowe zyskują na znaczeniu w Polsce wciąż zdecydowana liczba pacjentów jest kierowana do ośrodków wykonujących badanie przy użyciu – często dających nieprawidłowe wyniki – metod serologicznych. dr n med. Tomasz Gosiewski Błędy analizatorów hematologicznych Istnieją pewne utrudnienia związane z oceną morfologii krwi obwodowej przez analizatory hematologiczne. Część z nich wiąże się z ograniczeniami stosowanej metody, niektóre ze zróżnicowaniem morfologicznym populacji leukocytów, inne z nieprawidłowym przygotowaniem badanej próbki lub ze zmianami w obrębie innych układów krwinkowych. Błędy w automatycznym oznaczaniu komórek krwi mogą dotyczyć wszystkich układów krwinkowych: leukocytów, erytrocytów oraz płytek krwi. Automatyczna ocena składników krwi może wskazywać na wyniki fałszywie zawyżone lub fałszywie zaniżone, które nie zawsze zależą od metody zastosowanej w danym analizatorze, ale często są związane także z czynnikami przedlaboratoryjnymi. Pomimo zastosowania w analizatorach coraz nowszych technik oznaczania poszczególnych składników krwi, pewne nieprawidłowości nie są wykrywane przez aparaty i wyniki powinny być każdorazowo oceniane i weryfikowane przez diagnostę laboratoryjnego. Błędy oznaczania krwinek białych Prawdopodobieństwo fałszywie zawyżonych wartości leukocytów pojawia się w przypadku następujących sytuacji: – Niezhemolizowane erytrocyty – Agregaty płytkowe – Płytki olbrzymie – Erytroblasty – Krioglobuliny – Białka monoklonalne – Heparyna – Zanieczyszczenia odczynników – Zanieczyszczenia antykoagulantu Prawdopodobieństwo fałszywie zaniżonych wartości leukocytów pojawia się w przypadku następujących sytuacji: – Skrzep lub mikroskrzepy w badanej próbce – Rozcieńczenie krwi w wyniku stosowania kroplówki – Nadmierny rozpad komórek – Zbyt długo przetrzymywany materiał do badań – Źle wymieszana krew (1). Błędy oznaczania parametrów układu czerwonokrwinkowego Odnotowano przypadki fałszywie zawyżonej liczby erytrocytów i leukocytów u pacjenta z nadpłytkowością samoistną z syndromem 5q- (3) oraz fałszywie zaniżone stężenie hemoglobiny w próbkach z bardzo wysoką leukocytozą (4). Błędy w określeniu rzeczywistego poziomu hemoglobiny metodą spektrofotometryczną wynikają głównie ze zmętnienia w hemolizacie jak dzieje się w przypadku ciężkiej leukocytozy lub wynikają z obecności lipidów w osoczu. Celem uniknięcia powyższej interferencji można użyć metod stosujących filtrację krwi, aby otrzymać krew ubogoleukocytarną, ocenę stężenia hemoglobiny w supernatancie po wirowaniu hemolizatu lub metodę oceny wyniku MCHC, MCV oraz różnicy liczby leukocytów i erytrocytów (4). Błędy oznaczania płytek krwi Duża anizocytoza płytek sprzyja uzyskiwaniu zafałszowanych wyników liczby płytek krwi. Przyczyną fałszywie zaniżonej liczby płytek krwi może być: – Obecność skrzepu w badanej próbce – Długotrwałe pobieranie krwi – Złe wymieszanie krwi z antykoagulantem – Pobranie zbyt dużej objętości krwi w stosunku do ilości antykoagulantu – Agregacja płytek pod wpływem antykoagulantu (małopłytkowość rzekoma, EDTA-zależna) – Satelityzm płytkowy (spłaszczanie płytek krwi na powierzchni leukocytów) – Wzrost ilości płytek olbrzymich (analizator może je zliczać jako leukocyty lub erytrocyty) W przypadku zaniżania liczby płytek krwi, czasami można dostrzec makroskopowo skrzepy. Zaleca się wtedy ponowne pobranie materiału. Przy podejrzeniu małopłytkowości rzekomej, stosuje się mikroskopową ocenę rozmazu oraz powtórne wykonanie badania z krwi pobranej równocześnie na EDTA oraz na cytrynian. Uzyskane wyniki porównuje się ze sobą. Przyczyną fałszywie zawyżonej liczby płytek krwi może być: – Obecność schistocytów (czyli zniekształconych erytrocytów o małej objętości, które mogą być zliczane przez analizatory impedancyjne jako płytki krwi) – Obecność fragmentów leukocytów (fragmentów cytoplazmy komórek białaczkowych, które są podobne do atypowych płytek krwi) – Obecność drobnoustrojów – Obecność lipidów (analizatory wykorzystujące optyczną metodę pomiaru mogą je zliczać jako płytki) – Obecność krioglobulin (wytrącają się czasami podczas rozcieńczania próbki, tworząc strąty) – Obecność zanieczyszczeń w płynach stosowanych do analizatorów. Podejrzenie pojawienia się schistocytów może sugerować podwyższona wartość RDW, MPV oraz nieprawidłowy kształt histogramu wielkości płytek. Skłania to do wykonania rozmazu i oceny mikroskopowej. Wzrost liczby płytek spowodowany obecnością lipidów (po posiłku, wlewie dojelitowym) nie ma znaczenia u pacjenta z prawidłową ilością płytek, ponieważ 9 zazwyczaj nie przekracza 50 x 10 /l, natomiast u pacjentów z głęboką małopłytkowością może prowadzić do błędnych decyzji terapeutycznych (2). Morfologia krwi powinna być oceniana z uwzględnieniem wieku pacjenta Źródło Flickr, autor Crystal, licencja CC BY 2.0 Nawet najlepsze analizatory hematologiczne nie zawsze są w stanie wyeliminować różne czynniki fałszujące wyniki badania morfologii krwi obwodowej. Należy korzystać z ostrzeżeń (oflagowań) jakie sygnalizują coraz nowocześniejsze analizatory oraz interpretować histogramy i/lub skategramy. Warto jednak znać i pamiętać o ograniczeniach zastosowanej metody oraz, kiedy to niezbędne, uzupełniać oznaczenia automatyczne o manualną ocenę rozmazu. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: 1. Mazur B. Rola analizatorów hematologicznych w różnicowaniu krwinek białych. Hematology Line 2012, 1(13): 3-7. 2. Lewandowski K. Płytki krwi w rutynowej diagnostyce hematologicznej. Hematology Line 2012, 1(13): 20-25. 3. Ciaudo M. et al. Falsely high erythrocyte and leucocyte counts related to extreme thrombocytosis in a patient with a 5 q-syndrome. Clin Lab Haematol 1994;16(1):91-3. 4. Fohlen-Walter A. et al. Underestimation of haemoglobin concentration in blood samples with high hyperleukocytosis: case report and alternative method for determination on blood cells automated analyzers. Haematologica. 2002; 87(10):ELT40. Pseudotrombocytopenia zależna EDTA- Gdy analizatory hematologiczne zaczęły wypierać manualne metody oznaczenia płytek krwi pojawił się nowy problem w postaci odchylenia od rzeczywistych wartości: wyniki zaczęły być fałszywie zaniżone lub zawyżone. Spowodowało to powstanie kłopotów z wiarygodnym oznaczaniem liczby płytek. Na uzyskane rezultaty wpływają zarówno czynniki przedanalityczne jak i analityczne. Spośród pierwszej grupy najistotniejsze są trudności z wkłuciem do żyły (inicjacja procesu krzepnięcia), pobranie wraz z płynem z kroplówki, zbyt późne wymieszanie krwi z antykoagulantem (powstawanie mikroskrzepów), niewłaściwa proporcja między objętością krwi i antykoagulantu, zbyt późne wykonanie oznaczenia. Czynniki analityczne to przede wszystkim jakość sprzętu, którą utrzymujemy i sprawdzamy podczas cyklicznych konserwacji oraz regularne wykonywanie badań kontrolnych. Antykoagulantem, na który pobieramy krew żylną w celu wykonania morfologii krwi obwodowej, jest standardowo wersenian (K2EDTA lub K3EDTA). Mechanizm jego działania opiera się na hamowaniu krzepnięcia poprzez tworzenie kompleksów z wolnymi jonami wapniowymi. Może on znacząco zaniżać liczbę płytek i prowadzić do małopłytkowości rzekomej zwanej także pseudotrombocytopenią EDTA-zależną. Zjawisko to występuje u około 0,2–2% populacji. Obserwuje się charakterystyczny dla pseudotrombocytopenii spadek liczby płytek w kolejnych badaniach morfologii krwi obwodowej wykonanej z tej samej próbki, pozostawionej w temperaturze pokojowej. Około czwartej godziny od pobrania wartość ta jest najniższa. Powyższym zmianom towarzyszy pseudoleukocytoza – agregaty płytkowe tworzą kompleksy oceniane przez analizatory jako małe limfocyty. Jednym z mechanizmów prowadzących do pseudotrombocytopenii jest tworzenie konglomeratów płytkowych w obecności EDTA. W środowisku in vitro, EDTA chelatuje jony wapnia, odsłaniając epitopy kompleksu GP IIb/IIIa płytek, do którego wiążą się zimne przeciwciała, najczęściej klasy IgG (maksimum działania w zakresie temperatur od 22ºC do 4ºC). Skupiska płytek są odczytywane przez analizator jako pojedyncze płytki, co znacznie zaniża odczyt liczby płytek. W przypadku dużych skupisk konglomeraty mogą być traktowane przez analizator jako leukocyty lub komórki niezidentyfikowane. Nie jest znana przyczyna powstawania przeciwciał EDTA zależnych. Prawdopodobnie u osób zdrowych ich rola polega na w niszczeniu fragmentów uszkodzonych, jednak w dużej ilości przypadków zjawisko pseudotrombocytopenii obserwowane jest u pacjentów ze współistniejącymi innymi chorobami. Niektóre czynniki związane z występowaniem pseudotrombocytopenii [1] Nowotwory: — rak płuca — ziarnica złośliwa — nowotwory sutka i jajników — gammapatia monoklonalna Leki: — warfaryna — olanzapina Choroby autoimmunologiczne: — choroba Gravesa-Basedowa — reumatoidalne zapalenie stawów — plamica małopłytkowa samoistna — toczeń rumieniowaty układowy Zakażenia: — HIV — różyczka — marskość wątroby w przebiegu WZW typu B — zapalenia płuc — mononukleoza zakaźna Inne: — cukrzyca — niewydolność nerek — oparzenia — ciąża — po podaniu surowicy anty-D W przypadku trombocytopenii o nieznanej etiologii, wynik należy potwierdzić wykonując ocenę rozmazu krwi obwodowej barwionego odczynnikami May Grünwald-Giemsa oraz oznaczenie liczby płytek we krwi pobranej na 10% cytrynian sodowy. Możliwe jest także zliczenie płytek w komorze Bürkera, co jednak może być obarczone dość dużym błędem. Innym zjawiskiem, występującym in vitro w obecności EDTA jest tzw. satelityzm czyli tworzenie rozet z przylegających do granulocytów płytek. Takie „zlepy” leukocytów i płytek nie są na ogół rozpoznawane przez analizatory. Należy zaznaczyć, że tworzenie podobnych agregatów może mieć miejsce in vivo na przykład w przypadku stanów zapalnych przy nasilonej ekspresji P-selektyny po aktywacji płytek. Pseudotrombocytopenia EDTA-zależna nie jest zjawiskiem nowym. Towarzyszy nam ona od wielu lat. Pierwsze doniesienia o niej zostały opisane przez Gowlanda w 1968 roku [2]. Meritum działania diagnostycznego stało się odróżnienie pseudotrombocytopenii wywołanej obecnością przeciwciał EDTA-zależnych od małopłytkowości rzekomej pojawiającej się w przebiegu niektórych zespołów klinicznych takich jak choroba von Willebranda typu IIB czy zespół Bernarda-Souliera. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Morfologia krwi powinna być oceniana z uwzględnieniem wieku pacjenta Źródło Flickr, autor Crystal, licencja CC BY 2.0 Morfologia krwi obwodowej Morfologia krwi obwodowej (ang. complete blood counts, CBC) to jedno z podstawowych badań dostarczających istotnych informacji na temat stanu zdrowia pacjenta poprzez ocenę liczby i budowy trzech podstawowych rodzajów krwinek: białych (leukocytów), czerwonych (erytrocytów) oraz płytek krwi (trombocytów). Badanie wykonuje się z krwi pełnej pobranej na antykoagulant: K2EDTA lub K3EDTA. Morfologia krwi obwodowej obejmuje szereg parametrów określających stan poszczególnych układów (3,4,7, 8,9): 1. Układ czerwonokrwinkowy – erytrocyty (ang. red blood cells, RBC)- wskazuje na ilość krwinek czerwonych w określonej jednostce objętości (n x106/µl) – hemoglobina (ang. hemoglobin, Hb)- wskazuje na ilość hemoglobiny – białka, barwnika krwi odpowiedzialnego za przenoszenie tlenu- w określonej jednostce objętości (g/dl) – hematokryt (ang. hematocrit, Hct)- jest to stosunek objętości erytrocytów do objętości pełnej krwi (%) – MCV (ang. mean cell volume) – określa średnią objętość krwinki czerwonej (fL) – MCH (and. mean corpuscular hemoglobin)- określa średnią masę hemoglobiny w erytrocycie (pg) – MCHC (ang. mean corpuscular hemoglobin concentration) – określa średnie stężenie hemoglobiny w krwinkach czerwonych (g/dl) – RDW (ang. red distibution width)- określa anizocytozę erytrocytów (fL) – retikulocyty (ang. reticulocyte, RET) – określa ilość młodych krwinek czerwonych, wyrażony w promilach lub jako wartość bezwzględna, czasami uwzględnia podział wg dojrzałości retikulocytów na frakcję młodych retikulocytów HFR (ang. high fluorescence reticulocytes), średnio dojrzałych retikulocytów MFR (ang.medium fluorescence reticulocytes) oraz dojrzałych retikulocytów LFR (ang. low fluorescence reticulocytes), przy czym HFR i MFR zliczane są razem jako niedojrzałe retikulocyty IFR (ang. immature red cell fraction). 2. Układ białokrwinkowy – leukocyty (ang. white blood cells, WBC)- określa całkowitą ilość krwinek białych w określonej jednostce objętości (n x103/ µl) – poszczególne frakcje leukocytarne (n x x103/ µl oraz w %) : granulocyty obojętnochłonne (and. neutrophils, NEUT)- z jądrem segmentowanym lub pałeczkowatym, granulocyty kwasochłonne (ang. eosinophils, EOS), granulocyty zasadochłonne (ang. basophils, BASO), limfocyty (ang. lymphocytes, LYMPH), monocyty (ang. monocytes, MONO). Dodatkowo w rozmazie krwi obwodowej mogą pojawić się atypowe limfocyty oraz różne młodsze formy (mielocyty, mieloblasty i inne). 3. Trombocyty – trombocyty (ang. platelets, PLT) – określa ilość płytek krwi w określonej 9 jednostce objętości (n x 10 /l) – PCT (ang. plateletcrit) – określa stosunek objętości masy płytkowej do całkowitej objętości krwi (%) – MPV (ang. mean platelet volume)- określa średnią objętość trombocyta (fL) – PDW (ang. platelet distribution width)- określa anizocytozę płytek krwi (fL) – P-LCR(ang.platelet large cell ratio)- określa odsetek dużych płytek o objętości powyżej 12 fL (%) Zmniejszenie lub zwiększenie liczby krwinek może wynikać zarówno z pojawienia się różnych chorób krwi jak i nieprawidłowości w obrębie innych układów i narządów. Wartości referencyjne zależą od wieku, płci oraz metody stosowanej w danym laboratorium. Przykładowo prawidłowe wartości leukocytów mogą wyglądać tj. przedstawiono w tabeli 1. Tabela 1. Przykładowe normy różnych parametrów morfologii krwi obwodowej w podziale na poszczególne układy oraz wiek (5,7,10) Poszczególne parametry morfologii krwi obwodowej ulegają pewnym fizjologicznym przejściowym wahaniom, a także określonym zmianom w niektórych stanach patologicznych. Mogą to być zarówno zmiany ilościowe jak i jakościowe. Tab.2. Wybrane przyczyny zmian parametrów morfologii krwi obwodowej (4,5,6,7). Morfologia podstawowa (znana także jako morfologia 3 diff) obejmuje analizę 3 frakcji krwinek białych, natomiast morfologia pełna (znana także jako 5 diff) dotyczy analizy 5 frakcji krwinek białych. Analizatory 8 diff wyodrębniają dodatkowo trzy populacje: niedojrzałych form neutrofili, limfocytów oraz monocytów (5). Analizatory hematologiczne oznaczają poszczególne frakcje leukocytów wykorzystując różne metody takie jak cytometria przepływowa, technika impedancyjna, cytochemia lub kombinacje tych metod (1). Metoda impedancyjna jest podstawową metodą wykorzystującą zmianę wartości pola magnetycznego, wykorzystywaną w analizatorach hematologicznych 3 diff (5). Pomimo faktu, iż podczas oceny leukocytów we krwi obwodowej to manualny rozmaz krwi wciąż uważany jest za złoty standard, metody automatyczne zaczynają powoli zastępować tą tradycyjną metodę, stając się podstawową metodą skriningową w wykrywaniu zaburzeń hematologicznych. Dzieje się tak głównie dlatego, że rozmaz ręczny jest metodą wymagającą stosunkowo dużego nakładu pracy oraz dużego doświadczenia, zwłaszcza przy rozróżnianiu patologii, natomiast metody automatyczne informują użytkownika o wielu nieprawidłowościach, oflagowując je i pozostawiając do dalszej oceny specjalisty (ocena histogramów, skategramów, sygnalizowanych nieprawidłowości). Czasami wyniki uzyskane z analizatora wymagają dodatkowo przygotowania rozmazu manualnego i poddania go wprawnemu oku diagnosty. Podczas interpretacji wyniku badania morfologii krwi należy pamiętać, że analizatory mierzą inne cechy komórek niż badanie mikroskopowe (2). Tab.3. Metody oznaczania poszczególnych komórek krwi przez analizatory hematologiczne 5-diff (5,7). Morfologia krwi powinna być oceniana z uwzględnieniem wieku pacjenta Źródło Flickr, autor Crystal, licencja CC BY 2.0 Konieczność uwzględniania kosztów w opiece medycznej zmusza do zlecania badań, które są stosunkowo tanie i niosą ze sobą szereg podstawowych informacji o zdrowiu pacjenta, pozwalając na ewentualne ukierunkowanie dalszej diagnostyki. Wiele chorób przebiega bezobjawowo lub skąpoobjawowo, stąd też wyłączne badanie fizykalne nie może być podstawą wykluczenia istnienia stanów chorobowych. Morfologia krwi obwodowej jest badaniem szybkim, tanim i szeroko dostępnym w laboratoriach, co stwarza możliwość regularnej podstawowej kontroli organizmu. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: 1. Van der Meer W. Blood Cell Morphology: Controversies and Alternatives. Thesis Radboud University Nijmegen, 2006,The Netherlands. Print. Quickprint BV Nijmegen. 2. Jung S. Differential Blast Counts Obtained by Automated Blood Cell Analyzers. Korean J Lab Med, 2010; 30: 540-546. 3. O’Neil P. et al. Performance Evaluation of the Complete Blood Count and White Blood Cell Differential Parameters on the AcT 5diff Hematology Analyzer. Laboratory Hematology, 7: 116–124. 4. Rapson D., Matthews J. Interpreting blond counts. Online available. 5. Mazur B. Rola analizatorów hematologicznych w różnicowaniu krwinek białych. Hematology Line, 2012; 1,13: 3-7. 6. Wrzyszcz A. Znaczenie makro- i mikrocytozy krwinek czerwonych w diagnostyce laboratoryjnej. Hematology Line, 2012, 1, 13: 8-15. 7. Lewandowski K. Płytki krwi w rutynowej diagnostyce hematologicznej. Hematology Line, 2012, 1, 13: 20-25. 8. Sysmex. Platelet distribution curves: interpretation, potentials and limitations. Sysmex Xtra Online, 2011: 1-6. Online available. 9.Sysmex. Principle for measuring reticulocytes with XE-5000 and XE-2100, making use of bioimaging technology. The Cell Analysis Center 2007, 3: 1-5. Online available. 10. Laboratory Reference Range Study, BCH, Adult values, 1996 HE1A. 696. Online available. Sekwencjonowanie nowej generacji w diagnostyce medycznej Sekwencjonowanie nowej generacji (ang. next generation sequencing, NGS) szturmem wkroczyło w dziedzinę nauk biomedycznych. Obecnie jakiekolwiek badania podstawowe, dotyczące genetyki i biologii molekularnej trudno opublikować, jeśli nie wykorzystano w nich analiz NGS. Powoli pojawiają się także możliwości wykorzystania tej technologii w rutynowej diagnostyce klinicznej. Gdzie znalazła już ona, albo ma szansę znaleźć w najbliższym czasie, zastosowanie? Jakie są ograniczenia jej stosowania praktyce klinicznej? Ograniczenia i szanse NGS w diagnostyce klinicznej Stosowanymi obecnie narzędziami w rutynowej laboratoryjnej genetyce medycznej są cytogenetyka (klasyczna i FISH) oraz cały wachlarz metod biologii molekularnej, bazujący na amplifikacji pojedynczych fragmentów DNA*. Cały ten warsztat badawczy pozwala albo na mało szczegółową analizę rearanżacji chromosomowych albo szczegółową analizę pojedynczych mutacji/rearanżacji genowych w skali średnio kilkuset par zasad. Większość chorób genetycznych może być spowodowana przez szereg mutacji punktowych, czynnikiem sprawczym niektórych są aberracje chromosomowe na tyle małe, że nie udaje się wykryć ich techniką klasyczną. W onkologii mutacje chorobotwórcze lub predysponujące do zachorowania są rozproszone w wielu różnych obszarach genomu. W mikrobiologii metody molekularne rzadko stosowane są w celach przesiewowych zwykle są jedynie narzędziem pomocniczym z uwagi na możliwość wykrycia niewielu patogenów w pojedynczej reakcji. To tylko niektóre wady testów cytogenetycznych i molekularnych, które nie pozwalają na tak szerokie ich zastosowanie, jakbyśmy sobie tego życzyli. Przezwyciężyć wiele z tych kwestii technicznych może technologia głębokiego sekwencjonowania, która w zależności od zastosowania może zamienić się w wysokorozdzielcze narzędzie analizy cytogenetycznej, technikę molekularną wykrywającą kilkaset lub kilka tysięcy mutacji naraz, czuły test przesiewowy na obecność konkretnych typów drobnoustrojów, czy też potężny panel badań, wykrywający jednocześnie wiele spośród onkogenów złego rokowania [1,2]. Problem z technologią głębokiego sekwencjonowania polega z jednej strony na konieczności zastosowania zupełnie nowego i kosztownego zaplecza aparaturowego (sekwenatory i ich urządzenia peryferyjne, niezwykle wydajny sprzęt komputerowy, software i ogromna pamięć dyskowa) a z drugiej strony wymaga zatrudnienia zupełnie nowego typu fachowców, wyszkolonych bioinformatyków, zajmujących się niełatwą analizą terabajtów danych. Zastosowanie NGS do diagnostyki in vitro musi także spełniać określone normy jakości, gwarantujące określone wartości graniczne parametrów analitycznych [1,2]. Według danych amerykańskich, pod koniec roku 2013 jedynie ok. 50 laboratoriów w całych Stanach Zjednoczonych posiadało możliwość wykonywania testów (certyfikowanych przez FDA) techniką NGS. Obecnie może to już być kilkaset placówek [3]. Morfologia krwi powinna być oceniana z uwzględnieniem wieku pacjenta Źródło Flickr, autor Crystal, licencja CC BY 2.0 Przyszłość jest teraz Na chwilę obecną są już dostępne testy diagnostyczne NGS z certyfikatem IVD i ich ilość stale rośnie. Illumina na przykład wypuściła gotowe testy przeznaczone na platformę MiSeq Dx, przeznaczone do diagnostyki mutacji warunkujących mukowiscydozę i wrodzone choroby serca. Chińska firma BGI specjalizuje się w produkcji testów przeznaczonych dla diagnostyki związanej z prokreacją – posiada w ofercie testy screeningowe na najczęstsze choroby genetyczne dla przyszłych rodziców czy też testy przesiewowe dla noworodków i niemowląt. Ich flagowym produktem jest zaś test Nifty do nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej, który można wykonać także w Polsce. Podobny test, Harmony, oferuje firma Ariosa Diagnostics. Kolejną ważną gałęzią diagnostyki, dla której dostępne są certyfikowane testy NGS, jest oczywiście onkologia. Propozycje Thermo Scientific pozwalają na przykład analizować mutacje w guzach litych, oraz ekspresję kilku newralgicznych onkogenów. Singapurska firma Vela wypuściła testy Sentosa SQ, które umożliwiają detekcję mutacji w komórkach czerniaka złośliwego, raka tarczycy, jelita grubego, raka płuca i białaczek. Inny test dla hematoonkologii, dedykowany dla diagnostyki chłoniaków, posiada w ofercie firma Invivoscribe. Służy on do wykrywania klonalności rearanżacji TCR i IGH. BGI w swojej ofercie posiada natomiast test przesiewowy do detekcji wariantów 21 genów predysponujących do zachorowania na raka jajników i sutka (w tym BRCA1 i 2). I co dalej? Podane przykłady nie wyczerpują długiej listy dostępnych obecnie zestawów diagnostycznych, a ich lista z dnia na dzień rośnie. NGS zyskuje uznanie szczególnie w badaniach mikrobiologicznych (genotypowanie wirusów, m.in. HIV, analizach epidemiologicznych i diagnostyce drobnoustrojów z płynów ustrojowych pacjenta) oraz w badaniach rearanżacji chromosomowych, które były dotychczas domeną cytogenetyków. Na etapie walidacji są testy skriningowe dla wielu jednogenowych chorób rzadkich, związanych zarówno z genomem jądrowym, jak i mitochondrialnym. Na chwilę obecną poważnym ograniczeniem technologii jest stopień skomplikowania analizy bioinformatycznej i wymóg otrzymania odpowiedniej gwarantowanej ilości odczytów dla analizowanych amplikonów, co powoduje, że firmy produkujące zestawy diagnostyczne nie wykorzystują całkowicie potencjału tego narzędzia (np. ograniczając się do panelu kilkudziesięciu wariantów genowych, zamiast umożliwić wykrywanie kilkuset lub kilku tysięcy mutacji) [4]. Prawdopodobnie nie ma takiego badania genetycznego, w którym nie znajdzie zastosowania głębokie sekwencjonowanie. Pytanie brzmi nie „czy”, ale „kiedy” technologia ta upowszechni się w każdej dziedzinie genetyki medycznej. * Bardzo rzadko korzysta się z metod porównawczej hybrydyzacji genomowej (CGH) ze względu na wysoki koszt oraz MLPA, za sprawą jej niszowości. Pozwalają one na przezwyciężenie niektórych trudności, o których mowa w tekście Piśmiennictwo: 1. Pant S. et al. Navigating the Rapids: The Development of Regulated NextGeneration Sequencing-Based Clinical Trial Assays and Companion Diagnostics. Front Oncol, 2014; 4: 78. 2. Meldrum C.et al. Next-Generation Sequencing for Cancer Diagnostics: a Practical Perspective Clin Biochem Rev. 2011; 32, 4: 177–195. 3. Hughes MD. Molecular Diagnostics Market Trends and Outlook. IVD MarketReach, 2013. 4. Rizzo JM., Buck MJ. Key Principles and Clinical Applications of “NextGeneration” DNA Sequencing. Cancer Prevention Research, 2012. Paragraf pod lupą- zgoda na badania genetyczne W poprzednim artykule omówiliśmy niektóre zagrożenia związane z bezprawnym wykorzystaniem wyników badań genetycznych. Dziś postaramy się przybliżyć Państwu podstawy prawne, według których w naszym kraju powinno się uzyskiwać zgodę pacjenta na wykonywanie badań do celów medycznych. Zgoda świadoma i swobodna W Polsce kwestie wyrażenia zgody na badania genetyczne regulują te same akty normatywne, które dotyczą jakiejkolwiek zgody na wykonanie procedury medycznej. Mamy więc art. 41 ust. 1 Konstytucji RP [1], mówiący o prawie do wolności osobistej, mamy także tzw.”Konwencję z Oviedo czyli Konwencja o prawach człowieka i biomedycynie [2], która podkreśla rolę swobodnej i świadomej zgody pacjenta na wykonanie procedury medycznej. W polskim prawodawstwie o świadomej zgodzie traktują także „Kodeks Etyki Lekarskiej [3], Ustawa o Zawodzie lekarza i lekarza dentysty [4] oraz Ustawa o Prawach Pacjenta i Rzeczniku Praw Pacjenta [5]. Czymże więc jest ta swobodna i świadoma zgoda? W świetle Prawa pacjent musi zostać powiadomiony o procedurze medycznej oraz o wszystkich dających się przewidzieć konsekwencjach (korzyści, ryzyko, dalsze postępowanie terapeutyczne) w sposób dla niego zrozumiały i jasny. Pacjent powinien mieć możliwość zapoznania się i podjęcia decyzji dotyczącej procedury w spokoju, bez nacisków i poganiania. Ważny jest też moment – pacjent powinien być przytomny i świadomy (a więc nie pod narkozą ani cierpiący z powodu silnego bólu). W przypadku badań genetycznych pacjent powinien być także poinformowany o celu badania, jego ograniczeniach oraz o sposobie zabezpieczania materiału i jego utylizacji po wykonaniu testu. Oczywiście, pacjent może takiej zgody nie udzielić i odmówić wykonania badania. Taka decyzja nie po inna w żaden sposób stygmatyzować pacjenta i wciąż powinien on otrzymać pomoc medyczną w zakresie, na jaki pozwala brak jego zgody. Kto może wyrazić zgodę w imieniu pacjenta i w jakich przypadkach? W pewnych przypadkach możemy mieć trudność z uzyskaniem świadomej i swobodnej zgody od pacjenta. Może być on nieprzytomny lub ubezwłasnowolniony, w przypadku dziecka także zgodnie z prawem procedura się komplikuje. Zacznijmy od dzieci. W przypadku osoby małoletniej, zgodę w jej imieniu wyraża przedstawiciel ustawowy. Przedstawicielem ustawowym jest rodzic lub inny opiekun formalnie wyznaczony przez sąd opiekuńczy (np. rodzice zastępczy, dziadkowie lub inni bliscy krewni, posiadający pełną zdolność do czynności prawnych, bywa także że jest to kurator). Musimy być także świadomi, że małoletni powyżej 16 roku życia musi także wyrazić zgodę, a w przypadku rozdźwięku między wolą jego i jego opiekunów o zgodzie decyduje sąd opiekuńczy. W przypadku osób ubezwłasnowolnionych analogicznie zgodę może wyrazić opiekun ustawowy (zwykle jest nim małżonek lub rodzic), chociaż w tym przypadku także trzeba się liczyć z opinią samego ubezwłasnowolnionego. W przypadku braku opiekuna ustawowego przy osobie nieprzytomnej lub ubezwłasnowolnionej, decydować czasami może tzw. opiekun faktyczny. Jest to osoba sprawująca realną opiekę nad pacjentem, która nie jest opiekunem ustanowionym wskazanym na drodze prawnej. Taki opiekun może wyrazić w imieniu pacjenta zgodę na pewne nieinwazyjne zabiegi (np badania lekarskie). W przypadku zabiegów inwazyjnych, orzeka sąd opiekuńczy. Podwójny status badania genetycznego jako próbki i dokumentacji medycznej w świetle zapisów Ustawy o Prawach Pacjenta oraz Kodeksu Etyki Lekarskiej pozwala na analizę za zgodą pacjenta lub opiekuna ustawowego. Wynik powinien być znany wyłącznie pacjentowi lub jego opiekunowi ustawowemu, oraz lekarzowi – Art 29 KEL [4], Art 26 UoPPiRzPP [5]. Jest jednak zastrzeżenie, że badania genetyczne predyspozycji i nosicielstwa bezobjawowego (np. pojedynczy allel recesywny) nie powinny być w ogóle wykonywane u małoletnich na podstawie wyłącznie żądania nawet opiekuna ustawowego [6, 7]. Oczywiście na wniosek sądu lub z przyczyn medycznych takie badania oczywiście się wykonuje. Co powinien zawierać formularz świadomej zgody? W formularzu świadomej zgody powinny znaleźć się dane osobowe pacjenta lub jego opiekuna ustawowego (imię, nazwisko, PESEL) oraz oświadczenie pacjenta. Powinno być ono sformułowane w ten sposób, by pacjent osobno mógł zadeklarować zgodę lub jej brak na analizę materiału, jego późniejsze przechowywanie oraz ewentualne badania naukowego. Ponadto do formularza powinien zostać dołączony informator o celu badania. Na jakie badania musimy mieć zgodę pacjenta? Definicja badania genetycznego na całym świecie budzi liczne wątpliwości. Nie została ona klarownie sformułowana w żadnym kraju, co z jednej strony otwiera pole do nadużyć, z drugiej budzi obawy klinicystów, czy mogą konkretne badanie wykonać bez zgody, czy jednak jest ona konieczna. Problem dotyczy głównie diagnostyki chorób nowotworowych, w której pozyskiwany materiał jest materiałem unikatowym (a więc jego zniszczenie jest niekorzystne dla pacjenta pod kątem przyszłej analizy porównawczej rozwoju choroby). Ponadto tkanka guza różni się genetycznie od DNA wrodzonego np. aberracjami cytogenetycznymi, licznymi mutacjami itd. W tkankach nowotworowych często oceniamy nie DNA, ale profil ekspresji genów, miRNA czy też profil metylacji. Trudno uznać takie badania za diagnostykę genetyczną, mimo że operujemy na kwasach nukleinowych, więc zgodnie z najostrzejszymi kryteriami powinniśmy taki materiał traktować na równi z DNA. Analogicznie jak w diagnostyce nowotworów, ten sam problem dotyczy diagnostyki mikrobiologicznej, w której analizujemy genomy drobnoustrojów, a nie pacjenta. Osobiście proponuję, by zgoda na badania genetyczne funkcjonowała we wszystkich przypadkach, w których zamierzenie lub przez przypadek możemy wykryć klinicznie istotną zmianę wrodzoną. Dotyczy to więc wszystkich przypadków diagnostyki prenatalnej, poszukiwania predyspozycji i przyczyn dziedzicznych schorzeń, a także (uwaga!) każdej analizy katriotypu metodą prążkową (nawet w onkologii!), analizy mutacji metodą sekwencjonowania, czy też genotypowania (do celów sądowych lub medycznych). Analiza kariotypu, nawet onkologiczna, czasami pozwala odkryć wrodzone translokacje wzajemne i choroby genetyczne o łagodnej manifestacji fenotypowej (np. zespół Klinefeltera czy XYY). Nie zawsze pacjent życzy sobie tego, by poznać prawdę na temat swoich zaburzeń kariotypowych, które mogą rzutować na jego życie rodzinne i pożycie małżeńskie. Pacjent który ucierpi (w swoim odczuciu) z powodu ujawnienia wady może pozwać placówkę, która taki wynik wydaje bez jego zgody, choćby intencją badania była diagnostyka nowotworów. Analogicznie wyniki genotypowania lub analizy HLA u rodzeństwa przed transplantacją mogą wykazać zdradę małżeńską lub fakt adopcji donora materiału (a przecież nie był to cel wykonania badania!). Odkrycie tego faktu także może zmienić na zawsze ludzkie życie i o tym ryzyku osoba „genotypowana” powinna wiedzieć. Piśmiennictwo: 1. Konstytucja Rzeczpospolitej Polskiej 2. Konwencja o ochronie praw człowieka i godności istoty ludzkiej wobec zastosowań biologii i medycyny 3. Kodeks Etyki Lekarskiej 4. Ustawa o Zawodzie lekarza i lekarza dentysty 5. Ustawa o Prawach Pacjenta i Rzeczniku Praw Pacjenta 6. Kapelańska – Pęgowska J. Prawe i bioetyczne aspekty testów genetycznych, LEX, 2011. 7. Florencio PS. Genetics, Parenting and Children’s Rights in the Twenty-First Century, McGill Law Journal, 2000. Rusza pierwsza w Polsce poradnia bioetyczna 19 marca w Krakowie zostanie uruchomiona Poradnia Bioetyczna. Jest ona adresowana do specjalistów i osób prywatnych potrzebujących pomocy w rozwiązaniu trudnych dylematów bioetycznych. Zapytania dotyczące między innymi tematyki badań na pacjentach, bioetyki w diagnostyce, zapłodnienia in vitro, pracy z embrionalnymi komórkami macierzystymi, badań na ludzkich embrionach, uporczywej terapii, eutanazji, etc. – można składać drogą elektroniczną lub poprzez kontakt osobisty. Organizatorami inicjatywy są Międzywydziałowy Instytut Bioetyki Uniwersytetu Papieskiego Jana Pawła II w Krakowie i fundacja Jeden z Nas. W Poradni będzie można też konsultować aspekty bioetyczne dotyczące transplantacji, etyki lekarskiej, a także opieki nad pacjentem w stanach terminalnych. W ramach działania poradni będzie można również uzyskać bezpłatną poradę prawną. Kto udziela porad? Porad w zakresie bioetyki udzielać będzie wykwalifikowany zespół bioetyków, wśród których znajdują się pracownicy służby zdrowia (lekarze, pielęgniarki, farmaceuci), prawnicy, teolodzy i filozofowie. Morfologia krwi powinna być oceniana z uwzględnieniem wieku pacjenta Źródło Flickr, autor Crystal, licencja CC BY 2.0 Jak uzyskać poradę? Poradnia Bioetyczna będzie świadczyła swoje usługi nieodpłatnie. Informacje lub poradę będzie można uzyskać osobiście w siedzibie poradni przy ul. Bernardyńskiej 3 w Krakowie lub elektronicznie, za pomocą formularza dostępnego na stronie www.poradniabioetyczna.pl . W przyszłości poradnia planuje uruchomienie poradnictwa drogą telefoniczną. Diagnostyka reumatoidalnego zapalenia stawów Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) to przewlekła, zapalna, immunologicznie zależna układowa choroba tkani łącznej. Charakteryzuje się nieswoistym, przeważnie symetrycznym, zapaleniem stawów, które prowadzi do powikłań układowych, niepełnosprawności, inwalidztwa i przedwczesnej śmierci. RZS występuje u ok. 1% populacji ogólnej, kobiety chorują 3-4 razy częściej niż mężczyźni, a szczyt zapadalności przypada na wiek 40 – 50 lat. Choroba może mieć postać serologicznie dodatnią – gdy w surowicy stwierdza się przeciwciała czynnika reumatoidalnego (RF; ang. rheumatoid factor) w klasie IgM i/lub przeciw cytrulinowemu peptydowi (anty-CCP; ang. anti-cyclic citrullinated peptide antibodies) lub ujemną, gdy przeciwciała te nie są występują [1, 2]. Rozpoznanie RZS ustala się według kryteriów Amerykańskiego Kolegium Reumatologicznego (ACR; ang. American College of Rheumatology) i Europejskiej Ligi do Walki z Chorobami Reumatycznymi (EULAR; ang. European League Against Rheumatism) z 2010 roku (Tabela 1). Kryteria zostały opracowane w celu wyselekcjonowania chorych na RZS we wczesnej fazie choroby i chorych na postać przewlekłą, erozyjną RZS. Tabela 1. Kryteria klasyfikacyjne ACR i EULAR z 2010 roku dotyczace RZS [2]. Punktacja ma zastosowanie tylko do osób z zapaleniem błony maziowej w co najmniej jednym stawie. Pewne RZS rozpoznaje się, gdy otrzymamy sumę punktów ≥ 6. Pacjenci z punktacją < 6 nie mogą zostać zakwalifikowani jako chorzy na RZS, ale w późniejszym czasie mogą spełnić kryterium dla pewnego RZS. Punktacja nie ma zastosowania diagnostycznego, tylko klasyfikacyjne. W diagnostyce choroby niezbędny jest dokładny wywiad lekarza z pacjentem, badania laboratoryjne (Tabela 2) oraz obrazowe (Tabela 3). Tabela 2. Badania laboratoryjne w diagnostyce RZS [3]. Tabela 3. Badania obrazowe w diagnostyce RZS [3]. Istotne jest jak najszybsze wykrycie choroby i wdrożenie odpowiedniego leczenia, które może opóźnić zmiany destrukcyjne w tkankach stawowych. Ponieważ początek RZS jest niespecyficzny i objawia się ogólnym osłabieniem, stanem podgorączkowym, rozbiciem, spadkiem apetytu i chudnięciem, jego diagnoza jest utrudniona. U 30% pacjentów nie stwierdza się obecności czynnika reumatoidalnego, markery stanu zapalnego mogą być nieznacznie podwyższone, a zmiany radiologiczne mogą być niewykrywalne nawet u połowy chorych. Z tego względu poszukiwano innego markera wczesnego RZS. Spośród kilku, (m.in. przeciwciało przeciwko czynnikowi okołojądrowemu, keratynie, wimentynie) do powszechnej diagnostyki wszedł jeden o dużej swoistości i specyficzności, a mianowicie anty-CCP. Początkowo, do oznaczania, stosowano test I generacji (anty-CCP-1), którego czułość wynosiła 68%, a swoistość 98%. Test polegał na wbudowaniu cyklicznego peptydu do cząsteczki filagryny. Zastąpienie filagryny peptydem zawierającym cytrulinę, tzw. test II generacji (anty-CCP-2), zwiększyło czułość testu do 80%. Oba testy są oparte o metodę ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) [4, 5, 6]. We wczesnym etapie choroby przeciwciała te są stwierdzane u 30-60% pacjentów, ich obceność jest także wykazywana u 35-40% osób z seronegatywna postacią RZS (RF-). Co więcej obecność przeciwciał anty-CCP może wyprzedzać pierwsze symptomy choroby, a jego stężenie we krwi koreluje z rozwojem nadżerkowej postaci RZS [5, 6]. Tabela 4. Markery syntezy i degradacji, wykorzystywane w diagnostyce RZS [6, 7]. Przy ocenie progresji zmian stawowych wykorzystywane są markery zaburzeń metabolizmu chrząstki stawowej: syntezy i degradacji oraz stanu zapalnego błony maziowej (Tabela 4). Wskaźniki te są wykorzystywane do oceny stopnia zaawansowania choroby lub monitorowania skuteczności leczenia. Ze względu na toksyczność leków, w trakcie farmakoterapii RZS, należy oceniać czynność nerek (kwas moczowy, kreatynina we krwi) i wątroby (aktywność aminotransferaz) [7, 8]. Morfologia krwi powinna być oceniana z uwzględnieniem wieku pacjenta Źródło Flickr, autor Crystal, licencja CC BY 2.0 Reumatoidalne zapalenie stawów należy do chorób przewlekłych. Charakteryzuje się okresami zaostrzeń i remisji, których długość trwania zależy od typu choroby i skuteczności leczenia. Zmiany w obrębie stawów mają charakter symetryczny i dotyczą w pierwszej kolejności stawów dłoni, następnie stawów kolanowych, barkowych, skokowych i odcinka kręgosłupa. Ze względu na skutki, które wywołuje RZS ogromny nacisk kładzie się na jak najszybszą diagnostykę i ocenę aktywności choroby. Uzyskane dane mają umożliwić odpowiednią farmakoterapię i opóźnić progresję choroby. Ewelina Olech Piśmiennictwo 1. Filipowicz-Sosnowska A. Wczesne zapalenia stawów – diagnoza, prognoza, terapia.Voice, 2007; 2,16, 4-13. 2. Głuszko P. i wsp. Reumatoidalne zapalenie stawów. Reumatologia, 2012; 50, 2: 83-90. 3. Filipowicz-Sosnowska A. i wsp. Choroby układowe tkanki łącznej, Interna Szczeklika 2012, red. Gajewski P. Kraków, 2012, 1788-1801. 4. Marceletti J, Nakamura R. Assessment of serological markers associated with rheumatoid arthritis. Clin Appl Immun Rev, 2003; 4, 109-123. 5. Wisłowska M. i wsp. Stare i nowe metody oceny aktywności choroby, stopnia uszkodzenia tkanek i utraty funkcji w reumatoidalnym zapaleniu stawów. Prob Lek, 2006; 45: 52-56. 6. Kuligowska M, Odrowąż-Sypniewska G. Nowe standardy laboratoryjne w diagnostyce i monitorowaniu progresji zmian kostno-stawowych w reumatoidalnym zapaleniu stawów. Voice, 2007; 2,16: 16-19. 7. Garnero P, Landewe R. Biochemical markers of joint tissue turnover in early rheumatoid arthritis. Clin Exp Rheumatol, 2003; 21: S54-D58. 8. Lis KK. CTx-II jako nowy wskaźnik degradacji chrząstki stawowej. Studia Med, 2008; 9: 37-40. Nowoczesna diagnostyka laboratoryjna raka jajnika W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat zapadalność na nowotwory złośliwe znacznie wzrosła. Wśród kobiet w średnim wieku nowotwory są przyczyną co drugiego zgonu. Rak jajnika jest jednym z nowotworów najczęściej występujących u kobiet, tuż po nowotworach piersi, płuca i jelita grubego, będąc przyczyną 6% zachorowań i 8% zgonów. W Polsce w 2011 roku odnotowano 3527 nowych zachorowań na raka jajnika, podczas gdy dekadę wcześniej zachorowalność wynosiła 3193. Na przestrzeni lat 2001-2011 śmiertelność wzrosła o ponad 18%. Amerykańska agencja National Cancer Institute oraz Centers for Disease Control and Prevention we współpracy z National Center for Health Statistics oceniły, że zapadalność na raka jajnika w Stanach Zjednoczonych w 2014 roku wyniesie 22 tysiące nowych przypadków, natomiast śmiertelność utrzyma się na poziomie ponad 14 tysięcy zgonów. W porównaniu do 1997 roku liczba nowych zachorowań zmniejszy się o 18%, natomiast śmiertelność wzrośnie o 0,5% [1,2,3].Trudna sytuacja epidemiologiczna zmusza do poszukiwania nowych metod wykrywających nowotwór we wczesnym stadium choroby. Aktualnie w skriningu raka jajnika wykorzystuje się zwykle dwa podstawowe badania: USG dopochwowe oraz marker CA125. USG pozwala na wykrycie masy, która może być guzem, ale nie stwierdza czy zmiana jest łagodna czy złośliwa. Ca125 to białko, którego poziom znacznie wzrasta raku jajnika. Marker jest pomocny w monitorowaniu leczenia i progresji nowotworu. Spadek poziomu CA125 świadczy o skuteczności leczenia. Niestety istnieje szereg czynników, niezwiązanych z rakiem jajnika, które mogą podwyższać poziom CA125. Zastosowanie CA125 ogranicza fakt, że rzadko wzrasta on w raku śluzówkowym i jasnokomórkowym oraz w guzach granicznych. Co więcej, jego poziom może być podwyższony w przebiegu innych nowotworów (płuc, wątroby i trzustki) oraz w innych chorobach (mięśniaki macicy, endometrioza, niezłośliwe guzy jajników, marskość wątroby, choroby zapalne w obrębie miednicy). Poziom CA125 u kobiet waha się w przebiegu cyklu miesiączkowego. Wartością graniczną jest 35 U/mL [4,5,6,8,14 ]. Niektóre nowotwory zarodkowe jajników powodują uwalnianie do krwi dużych ilości innych czynników takich jak gonadotropina kosmówkowa (HCG) oraz alfafetoproteina (AFP), stąd można wykorzystać te parametry do monitorowania leczenia [4,7]. Ponieważ oznaczenie poziomu Ca125 nie jest idealnym narzędziem diagnostycznym, naukowcy i klinicyści poszukiwali innych rozwiązań, czego efektem było zarejestrowanie w 2008 roku przez FDA antygenu HE4 jako nowego markera nowotworów jajnika. Pokładano w nim duże nadzieje na poprawę diagnostyki różnicowej oraz skriningowej [5,6]. Czułość HE4 ocenia się na 67%, a specyficzność na 96%. Marker ten ulega zwiększonej ekspresji w nabłonkowych rakach jajnika. Pomimo faktu, że czułość HE4 jest porównywalna do czułości CA 125, stężenie HE4 rzadziej bywa zwiększone u kobiet z chorobami nienowotworowymi i pozostaje stałe u 75% kobiet bez progresji choroby. Wartością graniczną HE4 jest 150 pmol/L. Marker ten może być wykorzystywany w różnych stadiach zaawansowania nowotworu. Jego poziom wzrasta o 25% lub więcej u 60% kobiet z nawrotem raka jajnika lub progresją choroby.Ponieważ niektóre histologiczne rodzaje raka jajnika nie wykazują ekspresji HE4 (nowotwory śluzowe i zarodkowe), oznaczenie poziomu HE4 nie może być stosowane jako bezwzględny dowód na obecność lub brak procesu nowotworowego. Ogranicza to zastosowanie testu w ustalaniu rozpoznania [5,8,14,16]. Dalszy postęp w diagnostyce nowotworów doprowadził do wprowadzenia dwóch nowych testów o dużej przydatności diagnostycznej: testu OVA1 oraz algorytmu ROMA [7]. Algorytm ROMA klasyfikuje kobiety z guzem przydatków do grup ryzyka raka nabłonkowego jajnika. Algorytm jest modelem matematycznym, łączącym oznaczanie HE4 i CA125, z uwzględnieniem statusu menopauzalnego pacjentki. Został on po raz pierwszy zaproponowany w 2009 roku przez Moore i wsp. [17]. Czułość testu jest wysoka i szacuje się ją na 92% u kobiet po menopauzie i 76% przed menopauzą, natomiast swoistość wynosi 75%. Wartości graniczne algorytmu różnią się w zależności od laboratorium oraz stosowanej metody analitycznej. Rozważa się wykorzystanie CA125 i HE4 jako wskaźników odpowiedzi na chemioterapię. Ich zastosowanie w tym zakresie jest ograniczone, niemniej jednak uzupełnienie oznaczeń o markery epigenetyczne, może znacznie zwiększyć czułość i specyficzność badania [6,10,15,16]. Test OVA1 jest nowoczesnym narzędziem diagnostycznym, wprowadzonym w 2009 roku, służącym do wykrywania raka jajnika. Test wykorzystuje fakt, że u chorych na raka jajnika poziom CA125 oraz β2-mikroglobuliny wzrasta, natomiast stężenie apolipoproteiny A1, prealbuminy i transferryny jest niższe, niż u zdrowych kobiet. OVA1 łączy oznaczenie tych 5 parametrów, pozwalając na określenie prawdopodobieństwa rozpoznania złośliwego nowotworu jajnika, zgodnie z uzyskaną liczbą punktów: u kobiet przed menopauzą 5,0 punktów oraz u kobiet po menopauzie 4,4 lub więcej punktów świadczy o wysokim ryzyku. Czułość testu określa się na 96%. Test jest rzadko wykorzystywany w diagnostyce, nie tylko ze względu na wysoką cenę, ale także fakt, że zarówno swoistość jak i powtarzalność wyników nie jest zadowalająca [9,11,16]. Wciąż trwają poszukiwania doskonalszych narzędzi diagnostycznych. W ciągu ostatnich dwóch lat ukazało się wiele badań dotyczących obiecujących kandydatów na markery nowotworowe raka jajnika. Wśród nich należy wymienić osteopontynę (sOPN), wariant 6 sCD44 (sCD44-v6) oraz białko adhezyjne sVCAM-1. Jerman i wsp. proponują określenie ich poziomu w płynie z jamy otrzewnej i płynie z zatoki Douglasa jako markerów wczesnego stadium raka jajnika oraz wskaźników progresji nowotworu [18]. Zespół badawczy Park zwraca uwagę na tioredoksynę 1 jako marker raka jajnika, który może być badaniem uzupełniającym CA125 [19]. Pojawiają się także sugestie wykorzystania markerów znanych i wykorzystywanych w innych nowotworach. Takim przykładem jest określenie stężenia CA19-9 w surowicy jako markera uzupełniającego CA125 w przypadkach wymagających różnicowania zmian łagodnych od złośliwych w obrębie jajników oraz braku wzrostu poziomu CA125 [20]. Li i wsp. sugerują wykorzystanie oznaczenia poziomu HMGB1 (ang. high mobility group box chromosomal protein 1) w surowicy jako markera oceny progresji choroby oraz wykorzystania go w celach prognostycznych [21]. Pojawiło się również wiele doniesień dotyczących wartości prognostycznych markerów molekularnych takich jak ekspresja białka Fli-1 (ang. Friend leukemia integration 1 transcription factor), mRNA APOA1 (ang. mRNA apolipoprotein A1), ROR1 (ang. receptor-tyrosine-kinase-like orphan receptor 1) i wielu innych [22,23,24]. Wiedza na temat immunologii nowotworów doprowadziła do opracowania nowych strategii leczenia. W latach 80. XX wieku klinicyści zainteresowali się rodziną przezbłonowych receptorów czynników wzrostu z własną aktywnością kinazy tyrozynowej. Do nadekspresji receptorów HER/ErbB dochodzi w nowotworach pochodzenia nabłonkowego, co wiąże się ze złym rokowaniem. Wykrywanie nadekspresji HER2/NEU w tkance stało się pomocne w stosowaniu przeciwciała monoklonalnego (znane jako herceptyna – trastuzumab), które blokuje przekazywanie sygnału aktywacji podziałów komórkowych. Pomimo, że większość doniesień związanych z nadekspresją receptorów HER2 dotyczy raka piersi, to amplifikację genu HER2/NEU z towarzyszącą nadekspresją receptorów p185 HER2 obserwowano także w nowotworach nabłonkowych jajnika, zwykle w zaawansowanych stadiach choroby oraz w rakach nisko zróżnicowanych. Ocena stężenia HER2/NEU w płynach torbieli i wysiękach istniejących w rakach jajnika jest dobrym wskaźnikiem biologicznej agresji nowotworu. Nadekspresję HER2 stwierdza się u 18-43 % chorych na raka jajnika. Obecnie ekspresję HER2 określa się rutynowo dzięki zastosowaniu immunohistochemii (IHC) oraz fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Dzięki temu możliwa jest weryfikacja wątpliwych wyników IHC. Przy pomocy metody IHC wykrywa się obecność wewnątrzkomórkowej domeny receptora, natomiast FISH pozwala na bezpośrednią detekcję amplifikacji genu HER2 kodującego białko receptorowe. Nowoczesnymi metodami, alternatywnymi do FISH, jest chromogenna hybrydyzacja in situ (CISH) oraz hybrydyzacja srebrem in situ (SISH). Obie metody to kombinacja cech IHC oraz fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ [25,26]. Odkrycie w latach 90-tych XX wieku genu BRCA1 oraz BRCA2 rzuciło nowe światło na diagnostykę dziedzicznych nowotworów piersi i jajnika. Powyższe geny są zaangażowane we wzrost komórek, ich podział oraz w naprawę uszkodzeń DNA. Pojawienie się mutacji w obrębie genów powoduje brak naprawy uszkodzonego DNA i może prowadzić do rozwoju niektórych typów nowotworów. Mutacje w BRCA1 oraz BRCA2 wiążą się zazwyczaj z nowotworami piersi i jajnika. Niemniej jednak, mogą one pojawiać się także w innych nowotworach. Przykładem są mutacje BRCA2 i ich związek z rakiem prostaty czy rakiem trzustki. Szacuje się, że 39% kobiet z mutacją w obrębie BRCA1 i 11-17% z mutacją BRCA2 zachoruje na raka jajnika, podczas gdy powyższe prawdopodobieństwo u kobiet ogólnej populacji wynosi zaledwie 1,4% [12,13]. Najnowsze badania kliniczne dowodzą, że uszkodzenia epigenetyczne takie jak metylacja DNA są ściśle powiązane z zapoczątkowaniem procesu nowotworowego w obrębie jajników. Hipermetylacja promotora genu BRCA1, RASSF1A, APC, p14ARF, p16INK4A lub DAPK była obserwowana w 41 na 50 przypadków raka jajnika. Określenie miejsc metylacji może pomóc w ukierunkowaniu badań na nowe biomarkery o dużym znaczeniu w prewencji, ocenie ryzyka, szybkim wykrywaniu zmian oraz wartościach prognostycznych [15]. Morfologia krwi powinna być oceniana z uwzględnieniem wieku pacjenta Źródło Flickr, autor Crystal, licencja CC BY 2.0 Wybiórcze zastosowanie w diagnostyce oznaczania markerów nowotworowych oraz szersze wykorzystanie możliwości biologii molekularnej może przyczynić się do wykrywania złośliwych zmian nowotworowych na wczesnym etapie rozwoju. Pomimo faktu, że diagnostyka i monitorowanie nowotworów jajnika wciąż nie są doskonałe, już w chwili obecnej klinicysta posiada do dyspozycji szereg badań, które analizowane równocześnie mogą skutecznie ukierunkować leczenie. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: 1.National Cancer Institute. New directions in Ovarian Cancer Research. Report of the strategic planning conference, monograph, Dec 8-9, 1997. 2.Dane Zakładu Epidemiologii i Prewencji Nowotworów Centrum Onkologii – Instytut w Warszawie. 3.Didkowska J et al. Nowotwory złośliwe w Polsce w 2011 roku. Wyd. Studio Mediana, Warszawa 2013. 4.National Cancer Institute. Ovarian epithelial cancer treatment. Access: 24-06-2014. 5.Kulpa JK. i wsp. HE4 i CA125 – porównanie metod oznaczeń. Diagn Lab, 2012; 48: 41-49. 6.Nowak-Markwitz E. Oznaczanie HE4, CA 125 i algorytm ROMA w diagnostyce i różnicowaniu guzów jajnika. LabForum, 2013; 55: 3-5. 7.National Cancer Institute. Genetics of breast and ovarian cancer. Access: 11-07-2014. 8.ARUP Laboratories. Human Epididymis Protein 4 (HE4). For monitoring recurrence of progressive disease in women with epithelial ovarian cancer. Salt Lake City, 2014. 9.Li AJ. Nowe markery biologiczne w raku jajnika. Przydatność OVA1 i ROMA w ustaleniu rozpoznania. Ginekologia po dyplomie, 2012; 7: 14-19. 10.Woźniak S. i wsp. Guz jajnika u kobiety w późnym wieku rozrodczym – jak ocenić ryzyko onkologiczne.Przegl Menopauzalny, 2013; 1: 78-82 . 11.Toss A. et al. Ovarian cancer: Can proteomics give new insights for therapy and diagnosis? Int J Mol Sci, 2013; 14: 8271-8290. 12.National Cancer Insitute. BRCA1 and BRCA2: Cancer Risk and Genetic Testing. Access: 22-01-2014. 13.Petrucelli N. et al. BRCA1 and BRCA2 Hereditary Breast and Ovarian Cancer [In:] Gene Reviews, ed. Pagon RA. et al. University of Washington, Seattle, 1993-2014. 14.Zhen S. et al. Comparison of serum human epididymis protein 4 and carbohydrate antigen 125 as markers in ovarian cancer: A meta-analysis. Mol Clin Oncol, 2014; 2, 4: 559-566. 15.Koukoura O. et al. DNA methylation profiles in ovarian cancer: Implication in diagnosis and therapy. Mol Med Rep, 2014; 10, 1: 3-9. 16.Menon U. et al. Ovarian cancer screening—Current status, future directions. Gynecol Oncol, 2014; 132, 2: 490-195. 17.Moore RG. et al. A novel multiple marker bioassay utilizing HE4 and CA125 for the prediction of ovarian cancer in patients with a pelvic mass. Gynecol Oncol, 2009; 12, 1: 40-46. 18.Jerman KG. et al. Control values of ovarian cancer tumor markers and standardisation of a protocol for sampling peritoneal fluid and performing washing during laparoscopy. World J Surg Oncol, 2012; 12: 278. 19.Park BJ. Et al. Thioredoxin 1 as a serum marker for ovarian cancer and its use in combination with CA125 for improving the sensitivity of ovarian cancer diagnoses. Biomarkers, 1 Sep 2014: 1-7. 20.Cho HY., Kyung MS. Serum CA19-9 as a predictor of malignancy in primary ovarian mucinous tumors: a matched case-control study. Med Sci Monit, 2014; 20: 1334-1339. 21.Li Y. et al. Serum high mobility group box protein 1 as a clinical marker for ovarian cancer. Neoplasma, 2014;61,5: 579-584. 22.Song W. et al. Oncogenic Fli-1 is a potential prognostic marker for the progression of epithelial ovarian cancer. BMC Cancer, 2014, 14: 424. 23.Tuft Stavnes H et al. APOA1 mRNA expression in ovarian serous carcinoma effusions is a marker of longer survival. Am J Clin Pathol, 2014; 142, 1: 51-57. 24.Zhang H. et al. ROR1 expression correlated with poor clinical outcome in human ovarian cancer. Sci Rep, 2014; 4:5811. 25.Sedlaczek P., Sobańska E., Gryboś M. i wsp. Ocena zależności między ekspresją HER2/NEU (C−ERBB−2) w tkance a stężeniem w surowicy i płynach nowotworowych u chorych na raka jajnika. Adv Clin Exp Med 2005; 14, 4: 663–669. 26. English DP., Roque DM., Santin AD. HER2 Expression Beyond Breast Cancer: Therapeutic Implications for Gynecologic Malignancies. Mol Diagn Ther, PMC 1 Apr 2014.
