Optymalizacja reakcji PCR. Część I: podstawy

Optymalizacja reakcji PCR. Część
I: podstawy
Jak przeprowadzić „optymalizację” reakcji PCR? Co zmienić w metodyce,
by pozbyć się produktów niespecyficznych? Jak poprawić plon reakcji? Od
czego zacząć? Czego unikać?
Proponujemy algorytm postępowania, który pozwoli na szybką i
bezbolesną poprawę wyników waszych reakcji PCR.
PCR jest metodą o wiele bardziej złożoną, niż na to wygląda!
Źródło: Wikimedia Commons, autor George Church, licencja CC BY SA 3.0
1. Podstawy -przede wszystkim należy zapoznać się z podstawowymi składnikami
MIXu reakcyjnego.
* Bufor : zawiera zoptymalizowany dla danej polimerazy skład jonowy,
warunkujący odpowiednią konformację enzymu podczas reakcji, wspomaga
inkorporację zasad, sprawia że DNA łatwiej uzyskuje liniową strukturę i nie
tworzy skomplikowanych struktur drugorzędowych. Bufor jest dostarczany jako
tzw. stock, stężony 2x, 5x lub 10x. W związku z tym musimy pamiętać o
otrzymaniu odpowiedniego stężenia końcowego tego odczynnika. Obecnie
większość buforów zawiera KCl lub Na2SO4 rozpuszczone w zbuforowanym
roztworze opartym o TRIS. Niektóre bufory zawierają już pewną ilość jonów
Mg2+, koniecznych jako kofaktor reakcji, inne są ich pozbawione i na to trzeba
wziąć poprawkę podczas dostosowywania metodyki literaturowej do swoich
potrzeb. Innym udogodnieniem jest obciążanie buforu do PCR odpowiednimi
neutralnymi barwnikami do elektroforezy, dzięki którym można od razu po PCRze
nakrapiać produkt na żele agarozowe. Niektórzy producenci produkują KITy
dedykowane do konkretnych zastosowań, wówczas skład buforu jest
modyfikowany np. w celu łatwiejszego topienia matryc bogatych w GC (więcej na
ten temat w rozdziale 4: Dodatki do trudnych matryc)
* MgCl2: jony magnezu są kofaktorem polimerazy, ich rola jest nie do
przecenienia. Im wyższe stężenie Mg2+ tym silniejsze oddziaływanie matrycaenzym, tym wydajniejsze wiązanie starterów i tym niższa optymalna temperatura
reakcji. Podwyższenie ilości MgCl2 zwykle dodatnio wpływa na reakcje multiplex i
allelospecyficzny PCR. Może jednak spowodować powstawanie niespecyficznych
produktów reakcji. Niestety każda matryca cechuje się innymi wymaganiami
magnezowymi i należy znaleźć empirycznie idealne stężenie dla naszego KITu i
naszego amplikonu.
*dNTP: trifosforany deoksyrybonukleozydów to paliwo i jednocześnie substrat
reakcji amplifikacji. Obecnie najczęściej dostarczane są w KIT’cie jako mieszanina
dATP, dGTP, dCTP i dGTP. Wysokoenergetyczne trojfosforany są dość labilne w
temperaturze pokojowej, dlatego dobrze jest dbać o to, by nie były poddawane
częstym cyklom rozmrażanie-zamrażanie, oraz by były trzymane na lodzie podczas
składania reakcji PCR.
* startery (primery): czynnik decydujący o tym, co amplifikujemy. Sekwencja
starterów, odpowiednio zaprojektowanych dla danego amplikonu, jest
komplementarna (w pełni albo przynajmniej w obrębie kilku(nastu) pierwszych
nukleotydów od końca 3′) do naszej matrycy i w odpowiedniej temperaturze
annealingu umożliwia hybrydyzację i prymowanie reakcji dla polimerazy. Jest to
kluczowe, ponieważ enzym nie przyłączy się do fragmentu jednoniciowego i nie
zacznie amplifikacji bez oligonukleotydu, który niejako jest dla niego kotwicą na
matrycy. Najczęściej korzystamy ze starterów w równych stężeniach, jednakże w
przypadku primerów o różnych długościach, różnej zawartości par GC czy też
różnej autokomplementarności można stosunek ich stężeń zmieniać, by otrzymać
optymalną amplifikację.
* polimeraza DNA: najważniejszy enzym w biologii molekularnej! Enzym jest
izolowany z termofilnych bakterii i rekombinowany dla zwiększenia
termostabilności, efektywności i wierności amplifikacji. Obecnie rodzajów
polimeraz w handlu jest kilkaset (jeśli nie więcej!). Niektóre posiadają specjalne
własności: brak aktywności 3′->5′ nukleolitycznej, aktywność korekcyjną proof
reading, czy też odporność na wysokie temperatury topnienia (98-99 stopni). Dla
podstawowej amplifikacji wystarczy jednak zwykły, poczciwy Taq.
* woda ultraczysta – do mieszaniny reakcyjnej do PCR nie możemy dodawać
wody z kranu. Musi to być woda odwrotnie osmozowana, pozbawiona jonów soli w
znaczący sposób mogą wpływać na niepowodzenie reakcji. Poza czystością
chemiczną, woda musi być wolna od mikroorganizmów i zanieczyszczeń
enzymatycznych, które powodują degradację matrycy (np. ciepłostabilnyvh DNAz
bakteryjnych)
* matryca – zwykle jest to oczyszczone DNA lub cDNA, jednakże dostępne rynku
zestawy umożliwiają także korzystanie bezpośrednio z lizatu komórkowego jako
matrycy. Wydajność reakcji PCR zależy bardzo silnie od jakości zastosowanego
kwasu nukleinowego, jego stężenia oraz obecności zanieczyszczeń takich jak
rozpuszczalniki organiczne lub sole.
W kolejnej części cyklu odpowiemy na pytanie, od czego zacząć podczas
wprowadzania nowej metodyki i jak modyfikacja stężeń wymienionych
reagentów może wpłynąć (pozytywnie lub negatywnie) na końcowy wynik
reakcji.
Piśmiennictwo:
Doświadczenia własne
Data publikacji: 08.02.2016r.