Ocena właściwości biologicznych kompozytów na bazie chitosanu

Ocena właściwości biologicznych kompozytów na bazie chitosanu

Ocena właściwości biologicznych kompozytów na bazie chitosanu do
stosowania w inżynierii tkankowej kości
Agata Przekora*, Grażyna Ginalska
Uniwersytet Medyczny w Lublinie, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki
Medycznej, Katedra i Zakład Biochemii i Biotechnologii, ul. Chodźki 1, 20-093 Lublin
*
E-mail: [email protected]
Streszczenie
Ceramika wapniowo-fosforanowa w formie granul, jak i porowatego rusztowania na bazie
biodegradowalnego biopolimeru jest materiałem powszechnie stosowanym jako substytut
tkanki kostnej w ortopedii i stomatologii. Właściwości biologiczne chitosanu sprawiają, że
jest on idealnym polisacharydowym składnikiem kompozytów na bazie hydroksyapatytu.
Celem
inżynierii
tkankowej
jest
produkcja
biodegradowalnego,
porowatego,
trójwymiarowego rusztowania, które miałoby zdolność wspierania, wzmacniania i
organizowania regenerującej się tkanki. Biomateriały powinny posiadać optymalną
porowatość, moduł sprężystości oraz mikrostrukturę aby zapewnić odpowiednie połączenie
implantu z otaczającym środowiskiem.
Celem niniejszej pracy było określenie właściwości biologicznych 2 typów kompozytów
na bazie krylowego chitosanu o potencjalnym zastosowaniu w inżynierii tkankowej kości.
Testy in vitro przeprowadzono z wykorzystaniem linii komórkowej hFOB 1.19 (ludzkie
płodowe osteoblasty). W celu określenia biokompatybilności kompozytów dokonano oceny
1
ich toksyczności względem osteoblastów metodą MTT, zobrazowano wzrost komórek na
powierzchni biomateriałów przy użyciu mikroskopu konfokalnego oraz określono aktywność
frakcji kostnej fosfatazy alkalicznej (b-ALP) komórek rosnących na powierzchni
biomateriałów.
Podsumowując, na podstawie uzyskanych wyników można wysnuć wniosek, że testowane
biokompozyty są nietoksyczne, sprzyjają zasiedlaniu komórek oraz powodują wzrost
aktywności b-ALP w czasie, a zatem stymulują procesy różnicowania osteoblastów.
WSTĘP
Głównym składnikiem części mineralnej kości i zębów jest hydroksyapatyt (HAp).
Ceramika wapniowo-fosforanowa w formie granul, jak i porowatego rusztowania jest
materiałem powszechnie stosowanym jako substytut tkanki kostnej w ortopedii i stomatologii
[1-3]. W celu polepszenia własności mechanicznych oraz poręczności chirurgicznej
hydroksyapatytu można wprowadzać do niego dodatkowy komponent organiczny np.
polisacharydowy [4,5]. Właściwości biologiczne chitosanu sprawiają, że jest on idealnym
polisacharydowym składnikiem kompozytów na bazie hydroksyapatytu. Chitosan jest szeroko
stosowany w inżynierii tkankowej dzięki swoim charakterystycznym właściwościom, takim
jak brak toksyczności, szybka biodegradacja, podatność na chemiczną i enzymatyczną
modyfikację, stymulacja adhezji i proliferacji komórek, strukturalne podobieństwo do
glikozaminoglikanów pozakomórkowej macierzy tkanki kostnej oraz osteoinduktywność [68].
2
W medycynie regeneracyjnej, kompozyty na bazie chitosanu często stosowane są w
formie hydrożeli, implantów, czy rusztowań mających zdolność dostarczania leków,
czynników wzrostu oraz komórek do miejsca implantacji [8].
Pod względem właściwości mechanicznych biokompozyty powinny charakteryzować się
optymalną porowatością oraz modułem sprężystości dostosowanymi do miejsca implantacji
(np. kość zbita lub gąbczasta) [9,10]. Optymalna mikrostruktura wszczepu umożliwia
wrastanie tkanek w zaimplantowany biomateriał przez co uzyskuje się dobre połączenie
implant-tkanka, zapewniając odpowiednią wytrzymałość zmęczeniową implantu i połączenia
[11].
Celem niniejszej pracy było określenie właściwości biologicznych kompozytów
składających się z krylowego chitosanu oraz dwóch typów ceramiki wapniowo-fosforanowej:
granul HAp (granule HA BIOCER, Ø 0,5-1,6 mm, Chema Elektromet Rzeszów) –
kompozyt oznaczony jako chitosan/HA BIOCER
mieszanki granul HAp/TCP (granule HT BIOCER, Ø 0,5-1,6 mm, Chema Elektromet
Rzeszów) – kompozyt oznaczony jako chitosan/HT BIOCER.
MATERIAŁY I METODY
Ocena cytotoksyczności metodą MTT
Cytotoksyczność biomateriałów oszacowano metodą pośrednią za pomocą płynnych
ekstraktów uzyskanych przez umieszczenie kompozytów w pełnym podłożu hodowlanym w
stosunku 0,1 g próbki/ml podłoża na 24 godziny w temperaturze 37°C (ISO 10993-5).
Kontrolę negatywną cytotoksyczności stanowiło podłoże hodowlane inkubowane w takich
samych warunkach, ale bez biomateriałów. Kontrolę pozytywną cytotoksyczności stanowił
3
0,1% roztwór fenolu. Żywotność komórek hFOB po 24 i 48-godzinnej ekspozycji na
działanie ekstraktów określono z użyciem testu MTT (ocena aktywności dehydrogenazy
mitochondrialnej). Wyniki testu MTT wyrażono jako procent kontroli oraz przedstawiono
jako wartości średnie ± odchylenie standardowe.
Ocena wzrostu komórek na powierzchni kompozytów
Wzrost komórek linii hFOB 1.19 na powierzchni biomateriałów określono prowadząc
długoterminową hodowlę osteoblastów bezpośrednio na biomateriałach. Po 16 dniach
hodowli, komórki barwiono barwnikiem fluorescencyjnym Hoechst 33342 (niebieska
fluorescencja jąder komórkowych) i obserwowano ich wzrost przy pomocy mikroskopu
konfokalnego (Olympus Fluoview FV1000).
Oznaczenie aktywności frakcji kostnej fosfatazy alkalicznej
Biokompatybilność kompozytów określono również poprzez pomiar aktywności frakcji
kostnej fosfatazy alkalicznej (b-ALP) – markera II stadium różnicowania osteoblastów. W
tym celu hodowlę komórek linii hFOB 1.19 prowadzono bezpośrednio na biomateriałach w
podłożu osteogennym przez okres 20 dni. Po 4,8,12,16 i 20 dniach oznaczono aktywność bALP poprzez pomiar ilości powstającego p-nitrofenolu (pNP).
WYNIKI
Wyniki testu MTT na oznaczanie cytotoksyczności jednoznacznie wykazały, że kompozyty
chitosan/HA BIOCER oraz chitosan/HT BIOCER nie wpływają negatywnie na żywotność
komórek linii hFOB 1.19 przez cały czas trwania doświadczenia.
4
MTT test
24 h
48 h
120
% kontroli
100
80
60
40
20
0
kontrola
chitosan/HA chitosan/HT 0.1 % fenol
BIOCER
BIOCER
Obserwacja wybarwionych fluorescencyjnie komórek w mikroskopie konfokalnym sugeruje,
że powierzchnia kompozytu chitosan/HA BIOCER bardziej sprzyja wzrostowi osteoblastów
niż powierzchnia kompozytu chitosan/HT BIOCER.
Hodowla komórek bezpośrednio na biomateriałach w podłożu osteogennym wykazała, że oba
kompozyty powodują wzrost aktywności b-ALP w czasie. Osteoblasty rosnące na
5
powierzchni kompozytu chitosan/HA BIOCER wykazywały nieznacznie wyższą aktywność
b-ALP w porównaniu do komórek kontrolnych rosnących na powierzchni płytki
polistyrenowej. Natomiast osteoblasty rosnące na powierzchni kompozytu chitosan/HT
BIOCER wykazywały obniżoną aktywność b-ALP w porównaniu do kontroli.
aktywność b-ALP
120
kontrola
chitosan/HA BIOCER
chitosan/HT BIOCER
pNP [µM]
100
80
60
40
20
0
0
4
8
12
16
20
24
dni inkubacji
WNIOSKI
Podsumowując, na podstawie uzyskanych wyników można wysnuć wniosek, że
kompozyty chitosan/HA BIOCER oraz chitosan/HT BIOCER są nietoksyczne, sprzyjają
zasiedlaniu przez osteoblasty oraz powodują wzrost aktywności b-ALP w czasie, a zatem
stymulują różnicowanie komórek. Jednakże, warto zaznaczyć, że kompozyt chitosan/HA
BIOCER wykazuje nieznacznie większą biokompatybilność niż kompozyt chitosan/HT
BIOCER i jest bardziej odpowiedni do stosowania jako rusztowanie dla komórek w inżynierii
tkankowej kości.
6
Podziękowania
Praca finansowana w ramach DS MNd 2. Badania przeprowadzono z wykorzystaniem sprzętu
zakupionego w projekcie realizowanym zgodnie z umową nr POPW.01.03.00-06-010/09-00
w ramach Programu Operacyjnego Rozwój Polski Wschodniej 2007-2013, Osi Priorytetowej
I, Nowoczesna Gospodarka, Działanie 1.3. Wspieranie Innowacji.
Literatura
1. Aronov D., Karlov A., Rosenman G., Hydroxyapatite nanoceramics: Basic physical
properties and biointerface modification, J. Eur. Ceram. Soc., 2007, 27, 4181-4186
2. Belcarz A., Ginalska G., Zalewska J., Rzeski W., Ślósarczyk A., Kowalczuk D., Godlewski
P., Niedźwiadek J., Covalent coating of hydroxyapatite by keratin stabilizes gentamicin
release, J. Biomed. Mater. Res. B Appl. Biomater., 2009, 89, 102-113
3. Sopyan Y.I., Mel M., Ramesh S., Khalid K.A., Porous hydroxyapatite for artificial bone
applications, Sci. Technol. Adv. Mater., 2007, 8, 116-123
4. Belcarz A., Ginalska G., Pycka T., Zima A., Slósarczyk A., Polkowska I., Paszkiewicz Z.,
Piekarczyk W., Application of β-1,3-glucan in production of ceramics-based elastic
composite for bone repair, Cent. Eur. J. Biol., 2013, 8(6), 534-548
5. Tsioptsias C., Panayiotou C., Preparation of cellulose-nanohydoxyapatite composite
scaffolds from ionic liquid solutions, Carbohydr. Polym., 2008, 74, 99-105
6. Kim E.S., Cho W.Y., Kang J.E., Kwon C.I., Lee B.E., Kim H.J., Chung H., Jeong Y.S.,
Three-dimensional porous collagen/chitosan complex sponge for tissue engineering, Fibers
and Polymers, 2001, 2(2), 64-70
7
7. Malafaya B.P., Reis L.R., Bilayered chitosanu-based scaffolds for osteochondral tissue
engineering: Influence of hydroxyapatite on in vitro cytotoxicity and dynamic bioactivity
studies in a specific double-chamber bioreactor, Acta Biomater., 2009, 5, 644-660
8. Muzzarelli A.A.R., Chitins and chitosans for the repair of wounded skin, nerve, cartilage
and bone, Carbohydr. Polym., 2009, 76, 167-182
9. Hannink G., Arts C.J.J., Bioresorbability, porosity and mechanical strength of bone
substitutes: What is optimal for bone regeneration?, Injury, 2011, 42, S22–S25
10. Schliephake H., Neukam F.W., Klosa D., Influence of pore dimensions on bone ingrowth
into porous hydroxylapatite blocks used as bone graft substitutes. Ahistometric study, Int. J.
Oral Maxillofac. Surg., 1991, 20, 53–58
11. Otsuki B., Takemoto M., Fujibayashi S., Neo M., Kokubo T., Nakamura T., Novel MicroCT based 3-dimentional structural analyses of porous biomaterials, Key Eng. Mater., 2007,
330-332, 967-970
8