Laboratorium nr 4 - Wydział Chemii UJ

Pracownia specjalizacyjna panelu Chemia Środowiska
Cwiczenie: Spektrofotometryczne badanie inhibicji enzymu na przykładzie ureazy glebowej
dr Mirosława Kot
Materiał teoretyczny do samodzielnego opracowania
1. Kinetyka reakcji chemicznych. Podstawowe pojęcia: szybkość reakcji, stała szybkości, rząd
reakcji, czynniki wpływające na szybkość reakcji.
2. Enzymy: podstawowe pojęcia i kinetyka. Kinetyka Michaelisa-Menten.
3. Inhibicja enzymatyczna, rodzaje inhibicji, inaktywacja.
4. Ureaza: występowanie, budowa, znaczenie biologiczne.
5. Spektrofotometria w świetle widzialnym (absorpcja promieniowania, prawa absorpcji, technika
oznaczeń).
Sugerowane pozycje literaturowe:
1. Krzysztof Pigoń, Zdzisław Ruziewicz – Chemia fizyczna (lub inna chemia fizyczna zawierająca
kinetykę reakcji)
2. Harold A. Harper - Zarys chemii fizjologicznej
3. Hubert Stryer - Biochemia
4. B. Krajewska - Wiadomości chemiczne (2002), 56, 3-4.
Wprowadzenie
I. Enzymy glebowe
Gleba to powierzchniowa warstwa skorupy ziemskiej powstała ze skały macierzystej w wyniku
oddziaływania czynników klimatycznych i organizmów żywych, o grubości ok. 1,5 m. Jako element
środowiska gleba pełni istotne funkcje: magazynuje i oczyszcza wodę, stanowi środowisko życia
roślin i zwierząt oraz kształtuje krajobraz. Gleba jest układem trójfazowym złożonym z fazy:
stałej – cząstki mineralne, organiczne i organiczno-mineralne o różnym stopniu rozdrobnienia,
tworzące kompleks sorpcyjny;
ciekłej – wodny roztwór związków mineralnych i organicznych (tzw. roztwór glebowy);
gazowej – powietrze i para wodna.
Złożoność składu gleby jest wynikiem procesów w niej zachodzących: przemiany materii
organicznej w nieorganiczną (mineralizacja) oraz proces przeciwny, humifikacja - przekształcenia
1
pierwotnej materii organicznej i wtórna synteza nowej (np. kwasów humusowych, kwasów
fulwowych).
Pod względem chemicznym gleba zawiera głównie następujące pierwiastki: tlen, krzem, glin,
żelazo, wapń, sód, magnez, potas.
Rośliny, mikroorganizmy oraz fauna glebowa są źródłem enzymów glebowych. Enzymy te mogą
występować
w
formie
wolnych
enzymów
(enzymy
zewnątrzkomórkowe),
enzymów
wewnątrzkomórkowych (w żywych organizmach) oraz jako enzymy zaadsorbowane przez glebowe
związki organiczne i mineralne. Wśród wszystkich enzymów glebowych największy udział mają
dehydrogenazy (ok. 20%), ureaza (ok. 17%) i fosfatazy (ok. 16%), glukozydazy (ok. 8%). Białkowy
charakter enzymów powoduje, iż są one podatne na czynniki środowiskowe, naturalne jak i
antropogeniczne. Z tego powodu aktywność enzymatyczna uważana jest za dobry wskaźnik
aktywności mikrobiologicznej gleby a także można traktować ją jako wskaźnik stanu środowiska
glebowego przy ocenianiu żyzności i produktywności gleby oraz wpływu zanieczyszczeń
glebowych (np. metali ciężkich, środków ochrony roślin, kwaśnych deszczy, ropopochodnych).
II. Ureaza
Ureaza (amidohydrolaza mocznikowa EC.3.5.1.5) katalizuje hydrolizę mocznika:
CO(NH2)2 + H2O ureaza
 2NH3 + CO2
Proces ten bez udziału enzymu zachodzi 1014 raza wolniej niż w jego obecności i prowadzi do
powstania odmiennych produktów (kwasu izocyjanowego i amoniaku). Okres połowicznego zaniku
mocznika bez udziału ureazy wynosi ok. 3,6 roku. Ureaza jest enzymem szeroko
rozpowszechnionym w przyrodzie, obecnym w komórkach roślin wyższych (np. w ziarnach fasoli
Jack bean, soi), grzybów, glonów, bakterii (np. Helicobacter pylori), bezkręgowców.
Substrat enzymu, mocznik, jest końcowym produktem metabolizmu białek u zwierząt
ureotelicznych (ssaki, cykl mocznikowy) i efektem biodegradacji kwasu moczowego u zwierząt
urykotelicznych (ptaki, owady, gady lądowe). Dzięki ureazie mocznik może ulec szybkiej hydrolizie
a powstające jony amonowe są źródłem azotu dla bakterii. Jony amonowe podlegają procesom
nitryfikacji do azotanów(III) i azotanów(V) a te z kolei stanowią źródło azotu dla roślin. Ureaza
pełni kluczową rolę w obiegu azotu w przyrodzie, bez jej udziału mogłoby dojść do akumulacji
mocznika w środowisku a tym samym zaburzenia cyrkulacji azotu w środowisku.
Cząsteczki ureazy w zależności od pochodzenia mają różne masy molowe i strukturę (są homo lub
heteromeryczne tzn. zbudowane z identycznych lub różnych podjednostek). Jednakże, pomimo
różnic w strukturze IV-rzędowej, sekwencje aminokwasów różnych ureaz wykazują wysokie
podobieństwo, w szczególności w odcinku odpowiadającym centrum aktywnemu. Centrum aktywne
enzymu to miejsce, w którym przyłączany jest substrat i uwalniany produkt reakcji enzymatycznej.
2
W centrum aktywnym ureazy znajdują się 2 jony Ni(II) koordynowane przez reszty histydynowe,
asparaginę i mostkującą lizynę. Wejście do centrum aktywnego "otwiera" mobilna reszta cysteiny.
Chemiczna modyfikacja istotnych katalitycznie reszt aminokwasowych prowadzi do obniżenia bądź
zahamowania aktywności katalitycznej enzymu.
Inhibicja ureazy
Budowa centrum aktywnego ureazy i grupy funkcyjne zaangażowane w proces katalityczny enzymu
warunkują, które substancje wpływają inhibicyjnie na działanie ureazy. Do podstawowych
inhibitorów
ureazy należą
analogi
jej
substratu
(analogi
mocznika)
np.
tiomocznik,
hydroksymocznik. Dużą grupę inhibitorów stanowią związki tiolowe (np. β-merkaptoetanol) ze
względu na strategiczną funkcję, którą w procesie katalizy pełni jedna z grup tiolowych. Amidy i
estry kwasu fosforowego jako analogi stanu przejściowego należą do jednych z najmocniejszych
inhibitorów ureazy o stałej inhibicji rzędu 10-7 mM.
Ureaza (podobnie jak wiele enzymów) jest podatna na inhibicję przez szereg polutantów m.in.
jonów metali: Hg(II), Cu(II), Zn(II), Cd(II), Ni(II), Pb(II), pestycydów, fungicydów.
Przygotowanie próbek gleby do oznaczenia aktywności ureazy
1) Procedura bez buforowania
Pobrane próbki gleby po przesianiu przez sito (2mm) przechowuje się w polietylenowych
workach ok. 3 tygodnie, w temperaturze 4 oC. Następnie próbkę gleby o określonej masie zadaje się
roztworem mocznika i inkubuje przez 2 godziny w temperaturze 37 oC w zamkniętych kolbach
Erlenmeyera. Po inkubacji dodawany jest roztwór KCl i HCl (następuje zablokowanie enzymu i
zahamowanie hydrolizy), mieszaninę wytrząsa się przez 30 min następnie przesącza przez bibułę i
oznacza zawartość amoniaku w przesączu.
2) Procedura z dodatkiem buforu
Określoną odważkę gleby zadaje się roztworem mocznika i roztworem buforu a następnie inkubuje
przez 2 godziny w temperaturze 37 oC w zamkniętych kolbach Erlenmeyera. Po inkubacji dodawany
jest roztwór KCl i HCl (następuje zablokowanie enzymu i zahamowanie hydrolizy), mieszaninę
wytrząsa się przez 30 min następnie przesącza przez bibułę i oznacza zawartość amoniaku w
przesączu.
W obu procedurach wyniki podaje się jako zawartość azotu, związanego w postaci jonów
amonowych wydzielonych pod wpływem ureazy glebowej aktywnej przez 2 godziny, zawartej w 1g
gleby: g N-NH3/g gleby/2h
W przypadku niskiej aktywności ureazy jako: g N-NH3/g gleby/24h
3
III. Spektrofotometryczne oznaczanie stężenia amoniaku metodą fenolowo-podchlorynową
Amoniak powstający w procesie hydrolizy mocznika wchodzi w reakcję z podchlorynem sodu
tworząc chloraminę, która w obecności tlenu przekształca się w p-chinonochloriminę, która z kolei
ulega utlenieniu z fenolem do barwnika indofenolowego o barwie niebieskiej. Katalizatorem reakcji
jest nitroprusydek sodu (pentacyjanonitrozylżelazian(III) sodu). Natężenie barwy niebieskiej jest
proporcjonalne do zawartości amoniaku w próbce.
NH 3
fenol, O2
+ NaOCl
NH 2Cl
chloramina
O
N
Cl
p-chinonochlorimina
+ fenol
O
N
O-
+ H+
- H+
O
N
OH
barwnik indofenolowy
WYKONANIE ĆWICZENIA
I. Odczynniki:

0,72 M roztwór CO(NH2)2

200 mM bufor fosforanowy pH=7,0

100 mM rozwór EDTA

1 M KCl w 0,01M HCl
II. Wykonanie
1. Przesiać próbkę gleby przez sito 2mm.
2. Odważyć 5,0 g gleby (2 porcje, każda po 5,0 g).
3. Przygotować w kolbach stożkowych (poj. 100 cm3, korek ze szlifem) 3 mieszaniny o składzie:
A) próba do oznaczenia amoniaku w glebie:
5,0 g gleby + 5,0 cm3 buforu fosforanowego + 1,0 cm3 r-ru EDTA + 2,5 cm3 H2O
B) próba do oznaczenia amoniaku powstałego w reakcji hydrolizy mocznika wprowadzonego do
układu pod wpływem ureazy zawartej w glebie:
5,0 g gleby + 5,0 cm3 buforu fosforanowego + 1,0 cm3 r-ru EDTA + 2,5 cm3 0,72 M mocznika
C) próba do oznaczenia amoniaku obecnego w roztworze mocznika:
5,0 cm3 buforu fosforanowego + 1,0 cm3 r-ru EDTA + 2,5 cm3 0,72 M mocznika.
4
W przypadku oznaczania próbek różnych gleb, mieszaninę C przygotować tylko raz (dotyczy
konkretnego roztworu mocznika).
2. Kolby z mieszaninami ogrzewać na łaźni wodnej przez 45 min, w temperaturze 37oC.
3. Po zdjęciu z łaźni wodnej każdą mieszaninę zadać 15,0 cm3 r-ru KCl w HCl.
5. Kolby pozostawić na 15 minut na wytrząsarce.
6. Mieszany przesączyć.
7. Oznaczyć N-NH3 w przesączach: pobrać 1,0 cm3 przesączu do kolby miarowej o obj. 50,00 cm3,
z dozownika dodać 5 cm3 roztworu fenolu oraz 5 cm3 roztworu podchlorynu, pozostawić na 60 min
w ciemnym miejscu. Następnie dopełnić kolby do kreski i zmierzyć absorbancję przy długości fali
=630nm. Spektrofotometr wyzerować na roztwór C.
8. Oznaczyć N-NH3 (analogicznie jak w pkt. 7) w przesączach przygotowanych dla następujących
próbek gleby:
I. z terenu Bielańsko-Tynieckiego Parku Krajobrazowego.
II. z pobocza ul. Grota-Roweckiego.
Opracowanie wyników
1. Obliczyć absorbancję odpowiadającą amoniakowi powstałemu pod wpływem działania ureazy
zawartej w glebie = absorbancja próby B  absorbancja próby A.
2. Korzystając z krzywej kalibracyjnej (Rys.1) obliczyć ilość azotu-NH3 mg/g gleby/2h.
3. Ocenić ureazową aktywność gleby w zależności od miejsca poboru próbki.
Rys.1
Absorbancja
Krzywa kalibracyjna
oznaczenie NH 3 metodą fenolowo-podchlorynową
y = 0,751x
R2 = 0,996
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
3
Stężenie, mg N/dm
5