Synteza i analiza aktywności enzymatycznej pochodnych 2

&ARM0RZEGL.AUK†
3YNTEZAIANALIZAAKTYWNOuCIENZYMATYCZNEJPOCHODNYCH
†BENZOKSAZOLINONUJAKOPOTENCJALNYCHINHIBITORÌW
ESTERAZCHOLINOWYCHOPOTENCJALNYMZASTOSOWANIU
WTERAPIIILUBDIAGNOSTYCECHOROBY!LZHEIMERA
3YNTHESISANDBIOLOGICALEVALUATIONOF†BENZOXAZOLINONEDERIVATIVES
ASPOTENTIALCHOLINESTERASEINHIBITORSFOR!LZHEIMERlS$ISEASETHERAPY
ANDORDIAGNOSTIC
!GNIESZKA*ANIK0AWEŒ3ZYMAÊSKI%L˜BIETAˆUREK%L˜BIETA-IKICIUK†/LASIK
:AKŒAD#HEMII&ARMACEUTYCZNEJI!NALIZY,EKÌW+ATEDRA#HEMII&ARMACEUTYCZNEJI"IOCHEMII
7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNY5NIWERSYTETU-EDYCZNEGOW|ODZI
Streszczenie
Abstract
Otępienie typu alzheimerowskiego (choroba Alzheimera,
AD) jest najczęstszą formą demencji, występującą u osób
w wieku podeszłym. Należy do postępujących
i nieodwracalnych chorób mózgu, niszczących pamięć
i umiejętności poznawcze, co prowadzi do całkowitego
uzależnienia od opiekuna. Otępienie typu alzheimerowskiego jest chorobą nieuleczalną. Powszechnie stosowaną w
łagodzeniu objawów we wczesnej i średniej fazie tego schorzenia grupą leków są inhibitory acetylocholinoesterazy.
W poniższym artykule przedstawiamy nową serię pochodnych 6-acetylo-2-benzoksazolinonu jako potencjalnych
inhibitorów esteraz cholinowych. Związki te zostały zsyntetyzowane w reakcji 6-chloroacetylo-2-benzoksazolinonu
z odpowiednią 4-podstawioną piperydyną i zbadane w
celu określenia ich aktywności w kierunku hamowania
esteraz cholinowych przy użyciu kolorymetrycznej metody Ellmana. Obliczono następnie wartości ich IC50 oraz
określono selektywność wobec acetylo- oraz butyrylocholinoesterazy. Wszystkie otrzymane związki wykazywały
zbliżone do siebie aktywności w kierunku hamowania
esteraz cholinowych, ale charakteryzowały się różnymi
selektywnościami.
Senile dementia of the Alzheimer Type (Alzheimer Disease, AD) is the most common form of dementia in the
elderly. AD belongs to irreversible and progressive brain
diseases that slowly destroys memory and thinking skills
causing full dependency to a caregiver.
At present there is no effective therapy for AD. One of
groups of drugs – acetylcholinesterase inhibitors (AChEI)
– are applied for alleviating the symptoms in early and
middle stages of AD.
In the present study we propose a new serie of 6-acetyl2-benzoxazolinone derivatives as new potential cholinesterase inhibitors. The compounds were synthesized by
condensation of 6-chloroacetyl-2-benzoxazolinone with
the corresponding 4-substituted piperidine
and evaluated as cholinesterase inhibitors by using the
colorimetric method of Ellman.
For received derivatives the selectivity and the IC50 values for acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase
were calculated. All tested compounds exhibited similar
activities towards the inhibition of AChE and BChE, but
different selectivity.
Słowa kluczowe: Choroba Alzheimera, inhibitory cholinoesterazy, pochodne 2-benzoksazolinonu
Wstęp
Choroba Alzheimera jest jednym z najczęściej występujących schorzeń neurodegeneracyjnych centralnego układu
nerwowego. Według danych statystycznych cierpi na nią
około 5-7% populacji osób powyżej 65 roku życia, a liczba
ta wzrasta do około 50% wśród pacjentów w wieku około 85
roku życia. Szacuje się, że w Polsce na otępienie typu alzhe-
Key words: Alzheimer’s Disease, cholinesterase inhibitors, 2-benzoxazolinone derivatives
imerowskiego może cierpieć nawet 200 000 osób. Liczba
ta może sukcesywnie wzrastać w związku z postępującym
wydłużaniem się życia, niedostateczną wiedzą człowieka
na temat patogenezy choroby oraz braku ogólnodostępnych
i efektywnych metod diagnostycznych jak i skutecznych
metod terapii [1-3].
Choroba Alzheimera posiada charakterystyczny obraz
neuropatologiczny. W tkance mózgowej obserwuje się licz-
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
ne zmiany mikro- i makroskopowe,
które obejmują występowanie między innymi zewnątrzkomórkowych
złogów zawierających nierozpuszczalną formę białka β-amyloidu oraz
wewnątrzkomórkowe zwyrodnienie
neurowłókienkowe [1, 4].
O
NH2
H3C
H3C
O
O
N
N
takryna
donepezil
Hipoteza cholinergiczna
Na początku lat 80 ubiegłego stulecia amerykański naukowiec R. T. CH3
Bartus wysunął teorię nazwaną „teoCH3
H3C
N
rią cholinergiczną” podkreślającą
O
rolę dysfunkcji neuroprzekaźnictwa
CH3
O
O
układu cholinergicznego w patome- O
chanizmach zaburzeń pamięci u osób
CH3
starszych. Zakładała ona znaczne poN
wiązania między spadkiem aktywCH3
N
ności acetylotransferazy cholinowej,
CH
3
H3C
a występowaniem i nasilaniem się
problemów z zapamiętywaniem
u osób w wieku podeszłym. Podgalantamina
rivastygmina
stawowym wnioskiem będącym
efektem badań było stwierdzenie Ryc. 1. Inhibitory esteraz cholinowych.
o możliwościach farmakologicznego łagodzenia skutków zaburzeń
funkcjonowania układu cholinergicznego poprzez poprawę noesteraza posiada 14 takich reszt, butyrylocholinoesteraza
jakości neuroprzekaźnictwa - m.in. poprzez zahamowanie – 6) umożliwia katalizę większych fragmentów cząsteczek
degradacji acetylocholiny w szczelinie synaptycznej [5].
przez butyrylocholinoesterazę, a także wpływa na wrażliDziś już wiadomo, że jedna z najbardziej charaktery- wość obu enzymów na działanie inhibitora [9, 10].
stycznych a zarazem patologicznych zmian, jakie zachodzą
Acetylocholinoesteraza jest enzymem wysoce spew mózgu osoby chorej na otępienie typu alzheimerowskiego cyficznym a jej podstawową funkcją jest szybki rozkład
dotyczy spadku przekaźnictwa cholinergicznego związanego acetylocholiny w szczelinie synaptycznej. Butyrylocholiz postępującą degeneracją cholinergicznych neuronów i sy- noesteraza odznacza się mniejszą aktywnością, natomiast
naps. Skutkiem tego są przede wszystkim zaburzenia synte- obejmuje szerszy zakres hydrolizowanych związków. Rozzy i wychwytu acetylocholiny, spadek syntezy acetylocholi- kłada ona nie tylko substancje endogenne takie jak acetynotransferazy oraz upośledzenie wiązania neuroprzekaźnika locholina, ale również egzogenne zawierające ugrupowania
z receptorami [6, 7].
estrowe takie jak: butyrylocholina (syntetyczny związek
używany do różnicowania obu typów esteraz), niektóre
Esterazy cholinowe
leki (np.: aspiryna, amitryptylina, diazepam, fluoksetyna)
Cholinoesterazy należą do grupy hydrolaz serynowych. oraz związki toksyczne (np.: związki fosforoorganiczne
Katalizują one hydrolityczny rozkład związków endo- i eg- oraz niektóre narkotyki). Reguluje ona także przewodniczogennych, przede wszystkim estrów choliny. Dzieli się je two cholinergiczne przy niedoborze acetylocholinoestew zależności od między innymi specyficzności względem razy [9-11]. Zaobserwowano, że w przypadku pewnych
substratu, szybkości procesu hydrolizy, zachowania wobec schorzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alnadmiaru substratu, miejsca występowania oraz podatności zheimera, aktywność esterazy acetylocholiny może zostać
na działanie inhibitora. Wyróżnia się dwie formy cholinoeste- zredukowana do 67% normalnego poziomu (szczególnie
raz: acetylocholinoesterazę zwaną „prawdziwą cholineste- w hipokampie oraz płacie czołowym) przy jednoczesnym
razą” oraz butyrylocholinoesterazę zwaną „pseudocholino- wzroście aktywności esterazy butyrylocholiny nawet
esterazą” lub cholinoesterazą niespecyficzną. Oba enzymy do 165% jej normalnego poziomu [12].
wykazują 65% homologię w sekwencji aminokwasowej, mają
zbliżoną budowę strukturalną oraz podobną budowę miejsca
Inhibitory esteraz cholinowych (AChEI)
aktywnego [8-10]. Różnice w budowie centrum katalityczJak już wspomniano AChEI należą do związków stonego stanowią o różnicach w specyficzności substratowej sowanych w łagodzeniu objawów choroby Alzheimera
obu enzymów. Zamiana pierścieni aromatycznych dwóch (Ryc. 1). Pierwszym skutecznym lekiem z tej grupy była
ugrupowań fenyloalaninowych w „kieszeni wiążącej grupy takryna (Cognex), której liczne działania niepożądane oraz
acylowe” (ang. acyl binding pocket) na acylowe ugrupowa- wprowadzenie do lecznictwa nowych inhibitorów esteraz
nia leucyny (Leu 286) i waliny (Val 288) oraz mniejsza ilość cholinowych znacznie obniżyły znaczenie terapeutyczreszt aromatycznych umiejscowionych wzdłuż gardzieli cen- ne tego leku. Jest ona jednak nadal stosowana miedzy intrum katalitycznego butyrylocholinoesterazy (acetylocholi- nymi w Stanach Zjednoczonych Ameryki czy we Francji.
&ARM0RZEGL.AUK
H
N
+
O
O
Cl
O
H
N
O
a
HN
O
N
O
R
R
2a-2c
R: - H
b
2a, 3a
- CH2- Ph
2b, 3b
- OH
2c, 3c
H
N
O
O
N
* HCl
O
R
3a-3c
Ryc. 2. Schemat i warunki syntezy pochodnych 2-benzoksazolinonu.
(a) – aceton/60 ˚C/2h
(b) – HCl/metanol
W Polsce zarejestrowane są trzy związki: rivastygmina
(Exelon, Nimvastid), galantamina (Nivalin) oraz donepezil
(Alzepezil, Aricept, Cogiton, Donepex, Donesyn, Redumas,
Symepezil, Yasnal) [2].
Poniższa praca dotyczy nowych potencjalnych inhibitorów esteraz cholinowych. Struktura związków została opracowana na podstawie dostępnej wiedzy na temat budowy
enzymu, jakim była acetylocholinoesteraza oraz grup farmakoforowych stosowanych leków (takryna, donepezil).
Materiały i metody
Otrzymane związki należą do grupy pochodnych
2-benzoksazolinonu (Ryc. 2). Związki 2a-2c uzyskano
w wyniku kondensacji 6-chloroacetylo-2-benzoksazolinonu
z aminami, odpowiednio: piperydyną, 4-benzylopiperydyną
oraz 4-hydroksypiperydyną. Zastosowany przez nas sposób
postępowania stanowi modyfikację metod opracowanych
przez Calisa i wsp. [13] oraz Mentrupa, i wsp. [14]. Syntezę
prowadzono w acetonie w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika natomiast surowy produkt otrzymano przez wylanie gorącej mieszaniny reakcyjnej na mieszaninę wody z lodem. Reakcję prowadzono w atmosferze gazu obojętnego
(argon). Otrzymane pochodne krystalizowano z metanolu,
a następnie przeprowadzono w chlorowodorki za pomocą
metanolu nasyconego chlorowodorem (pochodne 3a-3c).
Otrzymane chlorowodorki zbadano pod względem aktywności w kierunku hamowania esteraz cholinowych: acetylocholinoesterazy (AChE) i butyrylocholinoesterazy (BuChE)
[13, 14].
Część eksperymentalna
Przebieg reakcji kontrolowano metodą chromatografii
cienkowarstwowej stosując płytki DC-Alufolien pokryte
żelem krzemionkowym 60F254. Widma IR (KBr) wykonano przy użyciu spektrofotometru firmy Mattson Infinity
Series FT-IR w Zakładzie Chemii Bioorganicznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi. Widma 1H NMR wykonano
w Zakładzie Syntezy i Technologii Środków Leczniczych
Uniwersytetu Medycznego w Łodzi przy użyciu spektrometru firmy Varian Mercury 300 MHz wobec tetrametylosilanu, jako wzorca. Analizę masową przeprowadzono w Centrum Badan Molekularnych i Makromolekularnych Polskiej
Akademii Nauk w Łodzi na aparacie Finnigan MAT 95.
Syntezy
6-[(piperydyn-1-ylo)acetylo]-1,3-benzoksazol-2(3H)-on
(2a)
Do
roztworu
6-chloroacetylo-2-benzoksazolinonu
(0,40 g; 1,89 mmol) w acetonie (40 ml; 544 mmol) dodano piperydynę (0,32 g; 3,78 mmol). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w 60°C pod chłodnicą zwrotną przez
2 godziny. Gorący roztwór wylano na wodę z lodem.
Otrzymany osad odsączono i suszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Gotowy produkt rekrystalizowano
z metanolu otrzymując biały osad o temperaturze topnienia
104-106 °C. Wydajność reakcji: 0,10 g; 54%; 1H NMR
(DMSO) (ð ppm): 7,11-7,25 (1H; m; ArH); 7,71-7,89
(2H; m; ArH); 5,10 (2H; s; NCH2CO); 1,55-1,72 (6H; m;
CH2CH2CH2); 3,11-3,42 (4H; m; CH2NCH2); 10,15 (1H; s;
NH); Analiza element. obl. (%): C: 64,60; N: 10,76; H: 5,84;
ozn.: C: 64,60; N: 10,66; H: 6,19
Otrzymane wyniki analizy IR oraz NMR są zbieżne
z odpowiednimi danymi literaturowymi.
6-[(4-benzylopiperydyn-1-ylo)acetylo]-1,3benzoksazol-2(3H)-on (2b)
Do
roztworu
6-chloroacetylo-2-benzoksazolinonu
(0,20 g; 0,94 mmol) w acetonie (20 ml; 27 mmol) dodano 4-benzylopiperydynę (0,33 g; 1,89 mmola). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w 60°C pod chłodnicą
zwrotną przez 2 godziny. Gorący roztwór wylano na mie-
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
m; ArH); 7,84-7,88 (2H; m; ArH);
5,021 (2H; s; NCH2CO); 1,60-1,84
(6H; m; CH2CH2CH2); 3,10-3,33
(4H; m; CH2NCH2); 10,10 (1H; s;
NH); MS (FAB) m/z (M+1): 261,2;
MS-HR obl.: 261,123369; MS-HR
(M+1) otrz.: 261,123917
Chlorowodorek 6-[(4-benzylopiperydyn-1-ylo)acetylo]-1,3benzoksazol-2(3H)-onu (3b)
Do roztworu 6-[(4-benzylopiperydyn-1-ylo)acetylo]-1,3benzoksazol-2(3H)-onu (2b) (0,2
g; 0,57 mmol) w metanolu (3 ml,
4,05 mmol), dodano metanol nasycony chlorowodorem (4 ml) i chłoRyc. 3. Wykres Lineweavera-Burke’a dla badanych inhibitorów 3a-3c wobec acety- dzono w wodzie z lodem. Otrzymany osad odsączono i suszono pod
locholinoesterazy (AChE).
zmniejszonym ciśnieniem. Gotowy
produkt rekrystalizowano z metaszaninę wody z lodem. Otrzymany osad odsączono i su- nolu otrzymując biały osad o temperaturze topnienia 231szono pod zmniejszonym ciśnieniem. Gotowy produkt re- 233 °C. Wydajność reakcji: 0,11 g; 48%; IR(KBr) v(cm-1):
krystalizowano z metanolu otrzymując żółty osad o tem- 1619,0; 1680,45; 1777,3; 2920,6; 3413,4; 1H NMR (DMSO)
peraturze topnienia 143-145 °C. Wydajność reakcji: 0,23 (ð ppm): 7,83-7,87 (2H; m; ArH); 7,19-7,34 (6H; m; ArH);
g; 69%; 1H NMR (DMSO) (ð ppm): 7,79-7,85 (2H; m; 4,99 (2H; s; CH2); 2,50-2,51 (2H; d, J=1,7; ArCH2); 3,01ArH); 7,19-7,36 (6H; m; ArH); 5,01 (2H; s; CH2); 2,61-2,72 3,46 (4H; m; CH2NCH2); 1,60-1,78 (5H; m; CH2CHCH2);
(2H; d; J=2,3; ArCH2); 3,11-3,52 (4H; m; CH2NCH2); 1,72- 9,96 (1H; s; NH); Analiza element. obl. (%): C: 65,19; N:
1,85 (5H; m; CH2CHCH2); 10,05 (1H; s; NH); MS (FAB) 7,24; H: 5,73; ozn.: C: 65,05; N: 7,53; H: 6,13
m/z (M+1): 351,2; 188,0; MS-HR obl.: 351,170319; MSHR (M+1) otrz.: 351,170867.
Chlorowodorek 6-[(4-hydroksypiperydyn-1-ylo)acetylo]
-1,3-benzoksazol-2(3H)-onu (3c)
6 - [ ( 4 - h y d ro k s y p i p e r y d y n - 1 - y l o ) a c e t y l o ] - 1 , 3 Do roztworu 6-[(4-hydroksypiperydyn-1-ylo)acetylo]benzoksazol-2(3H)-on (2c)
1,3-benzoksazol-2(3H)-onu (2c) (0,10 g; 0,36 mmol) w meDo
roztworu
6-chloroacetylo-2-benzoksazolinonu tanolu (3 ml; 4,05 mmol), dodano metanol nasycony chlo(0,15 g; 0,71 mmol) w acetonie (20 ml; 27 mmol) doda- rowodorem (4 ml) chłodząc mieszaninę w wodzie z lodem.
no 4-hydroksypiperydynę (0,33 g; 1,42 mmol). Miesza- Otrzymany osad odsączono i suszono pod zmniejszonym
ninę reakcyjną ogrzewano w 60 °C pod chłodnicą zwrot- ciśnieniem. Gotowy produkt rekrystalizowano z metanolu
ną przez 3 godziny. Gorący roztwór wylano na wodę otrzymując biały osad o temperaturze topnienia 235-237 °C.
z lodem. Otrzymany osad odsączono i suszono pod zmniej- Wydajność reakcji: 0,02 g; 19%; IR(KBr) v(cm-1): 1611,3;
szonym ciśnieniem. Gotowy produkt rekrystalizowano 1688,6; 1777,3; 2918,1; 3417,7; 1H NMR (DMSO) (ð ppm):
z metanolu otrzymując biały osad o temperaturze topnienia 7,85-7,88 (2H; m; ArH); 7,15-7,18 (1H; m; ArH); 4,8 (1H;
126-128 °C. Wydajność reakcji: 0,07 g; 37%; 1H NMR s; OH); 4,01 (2H; s; CH2); 3,30-3,48 (4H; m; CH2NCH2);
(DMSO) (ð ppm): 7,79-7,91 (2H; m; ArH), 7,06-7,20 (1H; 2,74-2,78 (1H; m; CHOH); 1,33-1,73 (4H; m; CH2CHCH2);
m; ArH); 4,6 (1H; s; OH); 3,78 (2H; s; CH2); 3,21-3,36 (4H; Analiza element. obl. (%): C: 53,76; N: 8,95; H: 4,51; ozn.:
m; CH2NCH2); 2,82-2,91 (1H; m; CHOH); 1,36-1,81 (4H; C: 53,65; N: 9,01; H: 5,01; MS (FAB) m/z (M+1): 277,2;
m; CH2CHCH2); Analiza element. obl. (%): C: 60,86; N: 114,0
10,14; H: 5,84; ozn.: C: 61,44; N: 10,95; H: 6,01
Badania enzymatyczne
Chlorowodorek 6-[(piperydyn-1-ylo)acetylo]-1,3-benzoAktywności otrzymanych pochodnych 3a-3c były oznaksazol-2(3H)-onu (3a)
czane spektrofotometrycznie przy użyciu kolorymetrycznej
Do roztworu 6-[(piperydyn-1-ylo)acetylo]-1,3-benzo- metody Ellmana. Szybkość procesu hydrolizy (v) mierzono
ksazol-2(3H)-onu (2a) (0,2 g; 0,77 mmol) w metanolu wobec 8 różnych stężeń substratu [S] – jodku acetylotiocho(5 ml; 6,75 mmol), dodano metanol nasycony chlorowodo- liny w 3 ml próbki zawierającej bufor fosforanowy (0,1M pH
rem (3 ml) i chłodzono w wodzie z lodem. Otrzymany osad 8,0), roztwór kwasu 5,5-ditionitrobenzoesowego (DTNB;
odsączono i suszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Gotowy 0,05 ml; 0,05 M), enzym oraz odpowiedni inhibitor 3a-3c
produkt rekrystalizowano z metanolu otrzymując biały osad (0,05 ml roztworu o odpowiednim stężeniu przy badaniu ako temperaturze topnienia 220-222 °C. Wydajność reakcji: tywności hamującej). Pomiar prowadzono po inkubacji próbki
0,11 g; 49%; IR(KBr) v(cm-1): 1620,5; 1691,4; 1768,1; w czasie 1 min w temp. 37 ˚C przy długości fali 412 nm.
2954,0; 3427,9; 1H NMR (DMSO) (ð ppm): 7,28-7,30 (1H; Oznaczanie próbki bez inhibitora pozwoliło obliczyć 100%
&ARM0RZEGL.AUK
cenie równania Michaelisa - Menten
do jego postaci liniowej - wykresu
Lineweavera-Burka (wykres podwójnych odwrotności: 1/v w stosunku do
1/[S]). Otrzymane wartości prędkości
maksymalnych (Vmax) oraz stałych
Michaelisa - Menten (Km) dla poszczególnych enzymów zebrano w tabeli I. Następnie określono wartości IC50
dla otrzymanych pochodnych (3a-3c) oraz
ich selektywności względem poszczególnych enzymów (Tab. II) [16, 17].
Wszystkie trzy związki wykazują
zdolności hamujące w kierunku zarówno acetylo- jak i butyrylocholinoesterazy. Zakres IC50 dla badanych związków wynosił: 7,253x10-3 – 4,620x10-2
Ryc. 4. Wykres Lineweavera-Burka dla badanych inhibitorów 3a-3c wobec butyry- dla AChE i 6,979x10-3 – 2,565x10-2
dla BuChE. Pochodna 3b zawieralocholinoesterazy (BChE).
jąca ugrupowanie benzylopiperydyny
wykazuje
największą
aktywność hamującą w stosunku
aktywność poszczególnych enzymów. IC50 dla stężeń bada-3
do
acetylo(7,253x10
) oraz butyrylocholinoesterazy
nych inhibitorów wyliczono stosując graficzne przekształ-3
(6,979x10
)
oraz
największą
selektywność w kierunku acecenie równania Michaelisa-Menten do postaci liniowej
tylocholinoesterazy
(0,962).
Związek
3a ma słabsze działanie
(równanie Lineweavera-Burka) dla acetylocholinoesterazy
hamujące
w
kierunku
obu
esteraz
(odpowiednio:
4,389x10-2
(Ryc. 3) oraz butyrylocholinoesterazy (Ryc. 4).
dla AChE i 1,104x10-2 dla BuChE), wykazuje jednak większą
selektywność w kierunku butyrylocholinoesterazy (3,975).
Wyniki badań
W wyniku opracowanej syntezy otrzymano trzy pochodne 2-benzoksazolinonu. Pierwsza z nich – pochodna 3a została opisana przez Poupaerta i wsp. [15],
nie była jednak badana w kierunku zdolności hamowania
esteraz cholinowych. Pozostałe dwie pochodne są związkami nieopisanymi w literaturze. Struktury otrzymanych
związków zostały potwierdzone analizą widm 1HNMR, IR,
MS oraz analizą elementarną.
Aktywność otrzymanych pochodnych 3a-3c oznaczona została przy pomocy kolorymetrycznej metody Ellmana
przy użyciu jednakowego stężenia inhibitora i enzymów
wobec różnych stężeń substratu, którym był jodek acetylotiocholiny. Do oznaczenia parametrów kinetycznych reakcji enzymatycznych wykorzystano graficzne przekształ-
Dyskusja
Otępienie typu alzheimerowskiego jest najczęściej występującym schorzeniem spośród opisanych zespołów otępiennych [2]. Choroba ta spowodowana jest przez postępującą degenerację i zanik neuronów określonych struktur
mózgowia. Badania prowadzone nad wyjaśnieniem podłoża
patologicznych zmian prowadzących do neurodegeneracji
u osób chorych na AD pozwoliły na sformułowanie kilku hipotez odnoszących się do przyczyn rozwoju tego schorzenia.
Najważniejszą rolę w patologii AD przypisuje się zaburzeniom w przewodnictwie cholinergicznym oraz glutaminergicznym. Założenia tej teorii dały podstawy do opracowania
inhibitorów acetylocholinoesterazy (AChEI), jako podsta-
Tab. I. Statystyczne parametry oraz wartości Km i Vmax dla acetylocholinoesterazy (AChE) i butyrylocholinoesterazy (BuChE)
Parametry
Km
Vmax
r2
Błąd standardowy
AChE
0,037073474μM
0,057937913 μM/ml/min
0,975
0,00619
BuChE
0,099303812 μM
0,089548768 μM/ml/min
0,989
0,00076
Tab. II. Wartości IC50 otrzymanych związków oraz selektywności wobec acetylocholinoesterazy (AChE) i butyrylocholinoesterazy (BuChE)
Inhibicja BuChE
Inhibicja AChE
(IC50, μM)
(IC50, μM)
-2
3a
4,389 x 10
1,104 x 10-2
-3
3b
7,253 x 10
6,979 x 10-3
-2
3c
4,620 x 10
2,565 x 10-2
a
Selektywność dla AChE określona jako IC50(BuChE)/IC50(AChE)
b
Selektywność dla BuChE określona jako IC50(AChE)/IC50(BuChE)
Związek
Selektywność
względem AChE a
0,251
0,962
0,555
Selektywność
względem BuChE b
3,975
1,039
1,801
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
wowej grupy leków stosowanej w różnych stadiach choroby
Alzheimera [18].
Inhibitory esteraz cholinowych stanowią obecnie podstawę w leczeniu objawowym choroby Alzheimera. Celem pracy było otrzymanie nowych związków charakteryzujących się określonymi właściwościami w zakresie
aktywności hamującej w kierunku esteraz cholinowych.
W wyniku opracowanej syntezy otrzymano trzy pochodne
2-benzoksazolinonu zawierające podstawniki: piperydynę,
4-benzylopiperydynę oraz 4-hydroksypiperydynę. Ich analiza enzymatyczna daje możliwość określenia powinowactwa
otrzymanych pochodnych do miejsca docelowego, jakim
są enzymy. Badania te zostały wykonane metodą Ellmana,
która wykorzystuje jodek acetylotiocholiny, jako substrat
i jon 5-tio-(2-nitrobenzoesowy) pochodzący od odczynnika
DTNB, który daje żółte zabarwienie badanego roztworu.
Przeprowadzona analiza enzymatyczna wskazuje na wysokie powinowactwo otrzymanych pochodnych zarówno do
enzymu acetylocholinoesterazy jak i butyrylocholinoesterazy.
Największą aktywnością w kierunku hamowania AChE oraz
BuChE wykazał się związek 3b. Był on także najbardziej selektywny względem acetylocholinoesterazy. Natomiast największą
selektywnością względem butyrylocholinoesterazy wykazał
się związek 3a, który miał jednak mniejszą aktywność hamującą niż związek 3b. Wyniki badań enzymatycznych sugerują
możliwość wykorzystania pochodnych 2-benzoksazolinonu,
jako potencjalnych inhibitorów esteraz cholinowych.
Wnioski
Wyniki badań przedstawiają się następująco:
1. Otrzymano trzy pochodne 2-benzoksazolinonu
2. Otrzymane pochodne wykazują zdolności hamujące zarówno w kierunku acetylo- jak i butyrylocholinoesterazy.
3. Największą aktywność w kierunku hamowania obu esteraz cholinowych wykazuje związek 3b – pochodna
benzylopiperydyny.
4. Najwyższą selektywność względem acetylocholinoesterazy wykazuje związek 3b – pochodna benzylopiperydyny, natomiast względem butyrylocholinoesterazy – związek 3a – pochodna piperydyny.
Badania finansowane: z programu “Stypendia wspierające innowacyjne badania naukowe doktorantów”, współfinansowanego ze środków Funduszu Społecznego oraz ze
środków budżetu państwa
4. Blennow K, de Leon M J, Zetterberg H. Alzheimer’s
Disease. Lancet 2006; 368: 387-403.
5. Sonkusare SK, Kaul CL, Ramarao P. Dementia of Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders memantine, a new hope. Pharmacol Res 2005; 51: 1-17.
6. Magierski R, Kłoszewska I, Sobów T. Farmakoterapia
otępienia
w
chorobie Alzheimera
i otępienia mieszanego w chorobie Alzheimera. Aktualn
Neurol 2004; 4 (3): 171-179.
7. Sugimoto H. The new approach in development of antiAlzheimer’s disease drugs via the cholinergic hypothesis. Chem Biol Interact 2008; 175: 204-208.
8. Talesa V. Acetylcholinesterase in Alzheimer’s disease.
Mech Ageing Dev . 2001; 122: 1961-1969.
9. Bukowska B i wsp. Acetylo- i butyrylocholinoesteraza – budowa, funkcje i ich inhibitory. Current Topics in
Biophysics 2007; 30: 11-23.
10. Cokugras A. Butyrylcholinesterase: Structure and Physiological Importance. Turk J Biochem 2003; 28: 54-61.
11. Giacobini E. Cholinesterase inhibitors: new roles and therapeutic alternatives. Pharmacol Res 2004; 50: 433-440.
12. Ellis JM. Cholinesterase Inhibitors in the Treatment of Dementia. J Am Osteopath Assoc 2005; 105 (3): 145-158.
13. Calis U i wsp. Synthesis of some novel 3-methyl-6-(2substituted propanoyl/propyl)-2-benzoxazolinone derivatives and anti-nociceptive activity. Il Farmaco 2001;
56: 719-724.
14. Mentrup A i wsp. Phenylalkanolamine. Patent niemiecki nr DT 24 29 253 z 1976 r.
15. Poupaert JH i wsp. AlCl3-DMF Reagent in the FriedelCrafts Reaction. The Behavior of Omega-halogenoacid
chlorides. Bulletin des Societes Chimiques Belges; English 1996; 105 (7): 397-402.
16. Ahmed M, Rocha JBT, Correa M. Inhibition of two
different cholinesterases by tacrine. Chem Biol Interact
2006; 162: 165-171.
17. Szymański P, Żurek E, Mikiciuk-Olasik E. New tacrinehydrazinonicotinamide hybrids as acetylcholinesterase
inhibitors of potential interest for the early diagnostics
of Alzheimer’s disease. Pharmazie 2006; 61: 269-273.
18. Sobów T. i wsp. Choroba Alzheimera. Aktualności Neurologiczne 2003; 3(2): 89-120.
data otrzymania pracy: 25.05.2010 r.
data akceptacji do druku: 25.08.2010 r.
Piśmiennictwo
1. Auld DS i wsp. Alzheimer’s disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Prog Neurobiol
2002; 68: 209-245.
2. Gabryelewicz T, Barcikowska M, Jarczewska DJ. Terapia choroby Alzheimera – teoria a praktyka. Wiad Lek
2005; 58 (9-10): 528-535.
3. Musiał A, Bajda M, Malawska B. Recent Developments
in Cholinesterases Inhibitors for Alzheimer’s Disease
Treatment. Curr Med Chem 2007; 14: 2654-2679.
Adres do korespondencji:
prof. dr hab. n. farm. Elżbieta Mikiciuk-Olasik
Zakład Chemii Farmaceutycznej i Analizy Leków
Uniwersytet Medyczny w Łodzi
ul. Muszyńskiego 1, 90-151 Łódź
tel./fax: +48 42 677 92 90
e-mail: [email protected]