pobierz

Acta Haematologica Polonica 2008, 39, Nr 1, str. 73–86
PRACA ORYGINALNA – Original Article
ANNA KORYCKA1, MICHAŁ PLEWKA2, ANNA KRAWCZYŃSKA1, MARTA
ZUBKOWICZ1,
AGNIESZKA WIERZBOWSKA1, AGATA WRZESIEŃ1
KUŚ , AGNIESZKA PLUTA1, MARIA KRZEMIŃSKA-PAKUŁA 2, TADEUSZ ROBAK1
Ocena efektywności izolacji komórek CD34+ i CD133+, uzyskanych ze szpiku kostnego chorych ze świeŜym zawałem
mięśnia sercowego
The evaluation of efficacy of bone marrow CD34+ and CD133+ cells,
isolated from patients with acute myocardial infarction
1
Z Kliniki Hematologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Kierownik: Prof. dr hab. med. Tadeusz Robak
2
Z Kliniki Kardiologii II Katedry Kardiologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Kierownik: Prof. dr hab. med. Maria Krzemińska-Pakuła
STRESZCZENIE
U chorych ze świeŜym zawałem serca w ostatnich latach zainteresowanie budzi moŜliwość terapeutycznego wykorzystania szpikowych komórek macierzystych CD34+ oraz CD133+, potencjalnie zdolnych do regeneracji uszkodzonego miokardium. Wielu badaczy wykazało skuteczność przeszczepiania tych komórek do strefy zawału, jako bezpiecznej metody stanowiącej uzupełnienie farmakoterapii lub konwencjonalnej terapii inwazyjnej. Celem naszych badań była
ocena efektywności izolacji komórek CD34+ oraz CD133+ uzyskanych ze szpiku kostnego 38
chorych ze świeŜym zawałem mięśnia sercowego przed ich autotransplantacją do naczyń wieńcowych. Wykazaliśmy, Ŝe liczba wyizolowanych komórek CD34+ ze szpiku kostnego zmniejsza
się wraz z wiekiem chorych. Badania nasze wskazały ponadto, Ŝe izolacja komórek jednojądrowych ze szpiku w celu przeprowadzenia dowieńcowego przeszczepu moŜe być wykonywana
pomiędzy 3–11 dobą. Pomimo uzyskania największej liczby komórek CD34+ w 3–6 dobie zawału, wpływ zastosowanego leczenia na perfuzję i funkcję lewej komory będzie moŜna ocenić po
przeanalizowaniu wyników uzyskanych u chorych leczonych tą metodą po zakończeniu rocznego okresu obserwacji.
SŁOWA KLUCZOWE: Komórki macierzyste – Komórki CD34/CD45+ – Komórki CD133/CD45+
– ŚwieŜy zawał mięśnia sercowego
SUMMARY
In the last few years the possibility of therapeutic use of CD34+ and CD133+ bone marrow progenitor cells that are potentially capable of regenerating the damaged myocardium in patients
with acute myocardial infarction has been arousing more and more interest. Many authors have
demonstrated the efficacy of bone marrow progenitor cells autotransplantation as a safe method
supplementary to pharmacotherapy and to standard invasive therapy. The aim of our study was to
evaluate the efficacy of bone marrow CD34+ and CD133+ cells isolation in 38 patients with acute
74
A. KORYCKA i wsp.
myocardial infarction. We have demonstrated that the number of CD34+ cells isolated from bone
marrow decreases with the age of patients. Moreover, our study has demonstrated that the isolation of mononuclear cells for intracoronary transplantation can be performed between 3–11 day
after infarction. The number of CD34+ cells was found to be the highest when obtained at 3-6
days following infarction, however the efficacy of autotransplantation on the perfusion and left
vertricle performance can be assessed only after 12-month follow-up.
KEY WORDS: Progenitor cells – CD34/CD45+ cells – CD133/CD45+ cells – Acute myocardial
infarction
WSTĘP
Komórki macierzyste pnia stanowią pulę niewyspecjalizowanych komórek prekursorowych, zdolnych zarówno do róŜnicowania w komórki potomne, które będą pełniły
wyspecjalizowane funkcje, jak równieŜ do samoodnowy, zapewniającej uzupełnianie
i utrzymywanie stałej liczby komórek macierzystych, niezbędnej dla prawidłowego
funkcjonowania organizmu. Przez wiele lat uwaŜano, Ŝe jedynym źródłem krwiotwórczych komórek macierzystych jest szpik kostny, a przeszczepianie hematopoetycznych
komórek macierzystych szpiku stało się jedną z metod leczenia niektórych chorób
układu krwiotwórczego. Wyniki kolejnych badań wykazały jednak, Ŝe komórki macierzyste są takŜe obecne w tzw. „mobilizowanej” krwi obwodowej oraz we krwi pępowinowej. Zastosowanie cytokin lub leków cytostatycznych powoduje przesunięcie puli
macierzystych komórek hematopoetycznych ze szpiku kostnego do krwi obwodowej,
a autologiczne przeszczepy tych komórek stały się w wielu przypadkach alternatywą
dla przeszczepiania szpiku (1). Potencjalnym źródłem macierzystych komórek krwiotwórczych do celów przeszczepowych okazała się być takŜe krew pępowinowa (2,3).
Badania następnych lat wykazały, Ŝe w szpiku kostnym oprócz macierzystych komórek krwiotwórczych znajduje się równieŜ populacja macierzystych komórek podścieliska tzw. macierzystych komórek mezenchymalnych, nie związanych bezpośrednio z hematopoezą, natomiast zdolnych do róŜnicowania m.in. do hepatocytów, adipocytów, fibroblastów, osteocytów, miocytów, kardiomiocytów i neuronów (4–6).
W przeciwieństwie do macierzystych komórek krwiotwórczych, komórki te nie są
jednak wykrywane we krwi obwodowej i krwi pępowinowej i nie wykazują ekspresji
antygenów CD34 i CD45. Z komórek macierzystych szpiku wywodzą się ponadto
prekursorowe komórki śródbłonka (endotelialne), fenotypowo zbliŜone do komórki
hematopotycznej pnia i spokrewnione z angioblastami. RóŜnicują się one do komórek
śródbłonka i są odpowiedzialne za formowanie nowych naczyń z naczyń juŜ istniejących (angiogeneza) lub z naczyń powstałych de novo (neowaskularyzacja) (7). Prawdopodobnie macierzysta komórka krwiotwórcza, jak równieŜ prekursorowa komórka
śródbłonka wywodzą się ze wspólnej hemangioblastycznej komórki prekursorowej,
niezbędnej do rozwoju zarówno komórek hematopoetycznych, jak i naczyń krwionośnych (8). Macierzyste komórki śródbłonkowe zidentyfikowano w szpiku kostnym,
krwi obwodowej i pępowinowej oraz przestrzeni śródmiąŜszowej mięśni szkieletowych (9).
Ocena efektywności izolacji komórek CD34+ I CD 133+
75
Na powierzchni krąŜących prekursorowych komórkek endotelialnych wykazano
obecność antygenów CD34, CD31, CD45, HLA-DR, VE-kateryny, receptora R2 dla
naczyniowa-śródbłonkowgo czynnika wzrostu (VEGFR2) oraz receptora c-kit (7, 10)
Ekspresję antygenu CD34+, glikozylowanego białka transbłonowego, naleŜącego do
rodziny cząsteczek adhezyjnych i homologicznego z sialomucyną, wykryto takŜe na
powierzchni wczesnych macierzystych komórek krwiotwórczych (11). W szpiku kostnym osób zdrowych ekspresję tego antygenu obserwuje się na 1–3% komórek jednojądrowych, we krwi pępowinowej waha się ona w granicach 0,1–0,4%, natomiast we
krwi obwodowej wynosi zaledwie 0,01–01% (12). Około 1/10 populacji komórek
CD34+ stanowią mniej dojrzałe komórki CD34+CD38- i CD34+HLA-DR- (12). Wczesne komórki CD34+ charakteryzuje ponadto słaba ekspresja antygenu CD117, podczas
gdy komórki bardziej dojrzałe, wśród których znajdują się komórki HLA-DR+ wykazują wysoką ekspresję receptora c-kit (13). Ostatnio na pierwotnych macierzystych komórkach krwiotwórczych, jak równieŜ na prekursorowych komórkach endotelialnych
stwierdzono ponadto obecność transbłonowej glikoproteiny będącej homologiem promininy-5 i oznaczonej jako antygen CD133+. Przypuszcza się, Ŝe antygen ten moŜe
uczestniczyć w regulacji wzrostu i róŜnicowania komórek macierzystych. Wykazano,
Ŝe jego ekspresja gwałtownie maleje w miarę róŜnicowania i dojrzewania komórek
macierzystych. Antygen CD133 nie jest obecny na dojrzałych komórkach śródbłonka,
moŜe natomiast występować na komórkach młodszych zarówno samodzielnie, jak
i łącznie z antygenem CD34, który nie jest obecny na niezróŜnicowanych komórkach
macierzystych, z których wywodzą się prekursorowe komórki endotelialne (10, 11).
Dlatego teŜ obydwa antygeny są często wykorzystywane jako markery słuŜące do selekcji i oczyszczania prekursorowych komórek śródbłonkowych.
Odkrycia te, a w szczególności omówiona wyŜej zdolność wielokierunkowego
róŜnicowania komórek macierzystych, stały się podstawą do rozpoczęcia badań nad
zastosowaniem ich przeszczepiania w leczeniu chorób niehematologicznych, między
innymi w neurologii, w uszkodzeniach ośrodkowego układu nerwowego oraz w chirurgii ortopedycznej w celu regeneracji tkanki chrzestnej i kostnej (6, 9, 14). Od ponad
10 lat zainteresowanie budzi takŜe moŜliwość terapeutycznego wykorzystanie komórek
macierzystych, potencjalnie zdolnych do regeneracji uszkodzonego mięśnia sercowego
(15, 16). Wielu autorów wykazało skuteczność wykonywania przeszczepów komórek
macierzystych u ludzi, jako bezpiecznej metody stanowiącej uzupełnienie farmakoterapii lub konwencjonalnej terapii inwazyjnej u chorych ze świeŜym zawałem mięśnia
sercowego (17–19).
W następstwie zawału dochodzi do spontanicznej mobilizacji szpikowych komórek
macierzystych CD34+ i CD133+. Wśród izolowanej do autoprzeszczepu populacji komórek CD45+ znajdują się komórki wykazujące ekspresje antygenów CD34/45+ oraz
CD133/45+. Liczba uzyskanych komórek moŜe mieć istotne znaczenie dla efektywności neowaskularyzacji, a w konsekwencji poprawy funkcji mięśnia sercowego po zawale.
Celem naszych badań była ocena efektywności izolacji komórek CD34+ oraz
CD133+ uzyskanych ze szpiku kostnego chorych na świeŜy zawał mięśnia sercowego
76
A. KORYCKA i wsp.
przed ich autotransplantacją do naczyń wieńcowych. Podjęliśmy ponadto próbę odpowiedzi na pytanie czy efektywność izolacji komórek macierzystych jest zaleŜna od
wieku chorych oraz czy czas pomiędzy zawałem, a izolacją komórek macierzystych
ma wpływ na liczbę uzyskiwanych komórek.
MATERIAŁY I METODY
Pacjenci
Do badania zakwalifikowano 38 chorych (11 kobiet i 27 męŜczyzn) w wieku od
34 do 72 lat (średnia 56,3±8,9), którzy latach 2006–2007 byli hospitalizowani w Klinice Kardiologii II Katedry Kardiologii UM w Łodzi, z powodu świeŜego zawału mięśnia sercowego. Chorzy ci byli leczeni pierwotną angioplastyką z implantacją stentu
do gałęzi przedniej zstępującej lewej tętnicy wieńcowej, z napływem TIMI III bezpośrednio po zabiegu. Kryteriami włączenia do badania była nieobecność istotnych
zmian w pozostałych naczyniach wieńcowych oraz znaczna dysfunkcja skurczowa
lewej komory, z frakcją wyrzutową w ciągu pierwszych trzech dni zawału poniŜej
40%. Kryteriami wykluczenia były: niestabilność hemodynamiczna w okresie pozawałowym, czynna infekcja, choroba nowotworowa oraz przewlekła choroba układowa.
Wszyscy chorzy wyrazili świadoma zgodę na udział w badaniu. W 3-11 dobie zawału,
u chorych w znieczuleniu miejscowym i krótkotrwałej sedacji doŜylnej, z talerzy kości
biodrowej pobierano 100 ml szpiku kostnego.
Izolację komórek jednojądrowych szpiku kostnego, jak równieŜ ocenę ekspresji antygenów CD34 oraz CD133 metodą cytometrii przepływowej wykonywano u wszystkich chorych w Klinice Hematologii UM w Łodzi.
Izolacja komórek jednojądrowych
Procedurę izolacji komórek jednojądrowych wykonywano w warunkach jałowych
w przeznaczonej do tego celu i spełniającej kryteria bezpieczeństwa mikrobiologicznego komorze laminarnej Safe Flow 1.2 firmy Bioair (USA), stosując metodykę opisaną
przez Fotino i wsp. (20) oraz Boyum i wsp. (21) we własnej modyfikacji (22). Szpik
kostny w objętości 100ml pobierany w obecności antykoagulanta (10 ml cytrynianu
sodu) umieszczano w worku przeszczepowym firmy Baxter (USA) o pojemności 600
ml i rozcieńczano 20 ml jałowego, izotonicznego roztworu soli fizjologicznej firmy
Braun (Niemcy). W celu usunięcia szkodliwych mikrocząsteczek z materiału przeszczepowego, przeprowadzano wstępne filtrowanie z zastosowanie filtrów do transfuzji krwi, z membraną o porach o średnicy 40 µm, firmy PALL (PALL Co, USA).
Do wyjaławianych metodą gazową probówek firmy Sarstedt (Niemcy) o pojemności 50 ml pipetowano po 20 ml jałowego preparatu Ficoll-Paque Plus firmy Amersham
Biosciences (Wielka Brytania), a następnie delikatnie nawarstwiano po ok. 20 ml przefiltrowanego szpiku kostnego. Probówki umieszczano w uprzednio wysterylizowanych
i szczelnie zamykanych koszyczkach wirowniczych, które instalowano w rotorze wi-
Ocena efektywności izolacji komórek CD34+ I CD 133+
77
rówki Multifuge 1S-R firmy Heraeus (Niemcy) i wirowano w przez 20 min, w temp.
150 C przy szybkości 2600 obrotów/min.
Następnie izolowano pierścień komórek jednojądrowych, komórki dwukrotnie płukano, dodając jałowy roztwór soli fizjologicznej i wirując przez 10min.w temp. 150C
przy szybkości 1800 obrotów/min. Nadsącz usuwano, a pozostałe komórki jednojądrowe zawieszono w 32 ml soli fizjologicznej. Jednorodną zawiesinę zawierającą komórki jednojądrowe w objętości 30 ml filtrowano przez filtr PALL do worka przeszczepowego o pojemności 150 ml.
Tak przygotowaną zawiesinę komórek macierzystych przeszczepiano pacjentom
w Klinice Kardiologii, w ciągu 2–3 godzin od izolacji, wykonując ich dowieńcowe
podanie przez cewnik balonowy ze światłem wewnętrznym (typu over the wire, Ninja,
Cordis), dystalnie do miejsca uprzedniej okluzji naczynia. Podawano 20 ml zawiesiny
w 4 porcjach po 5 ml, w czasie 2 minut, z 2-minutową przerwą pomiędzy kolejnymi
inflacjami balonu.
Pozostałe 2 ml zawiesiny wykorzystywano w Klinice Hematologii w celu morfologicznej oceny uzyskanych komórek jednojądrowych, pod kątem ich całkowitej liczby,
z uwzględnieniem wzoru odsetkowego, jak równieŜ do cytofotometrycznej oceny ekspresji antygenów CD34+ i CD133+. śywotność komórek oceniano testem z uŜyciem
błękitu trypanu.
Cytofluorometryczna ocena antygenów CD34+ i CD133+
Do zawiesiny komórek jednojądrowych dodawano następujące przeciwciała monoklonalne: anty-45 (Becton Dickinson, USA) sprzęŜone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC), anty-CD34 (Becton Dickinson, USA) sprzęŜone z fikoerytryną (PE) oraz
anty-CD133 (Milteyi Biotec GmbH,Niemcy) sprzęŜone z fikoerytryną (PE). Jako kontrole stosowano przeciwciała: IgG1/IgG2. Próbki inkubowano w ciemności w temperaturze pokojowej i lizowano chlorkiem amonu. Zawiesinę komórek jednojądrowych
oceniano w cytometrze przepływowym Facs Calibur firmy Becton Dickinson, analizując 100.000 krwinek białych w jednej próbce (23–25). Bezwzględną liczbę uzyskanych
komórek CD34+ lub CD133+ obliczano wg wzoru (25):
Całkowita liczba wyizolowanych komórek [x109 /l] x liczna komórek CD34+ (CD133+)
100 000 komórek CD45+
Analiza statystyczna
Analizę statystyczną przeprowadzano za pomocą testów nieparametrycznych. Rozkład zmiennych ilościowych w badanych grupach porównywano testem MannaWhitneya lub Kruskala-Wallisa dla prób niezaleŜnych, natomiast współzaleŜność pomiędzy zmiennymi ilościowymi oceniano za pomocą testu Spearmana. Jako próg znamienności statystycznej przyjęto p<0,05.
78
A. KORYCKA i wsp.
WYNIKI
Chorych podzielono na dwie grupy wiekowe. Grupę poniŜej 55 rŜ stanowiło 16
chorych (3 kobiety i 13 męŜczyzn) w wieku 34–54 lata (mediana 49; x=47,7±5,5),
natomiast w grupie powyŜej 55 rŜ znajdowało się 22 chorych (7 kobiet i 15 męŜczyzn)
w wieku 56–72 lata (mediana 62,5; x=62,5±4,0). Materiał przeszczepowy oceniano
pod kątem Ŝywotności uzyskanych komórek oraz podstawowych parametrów hematologicznych, takich jak: wartość hematokrytu, całkowita liczba wyizolowanych komórek jednojądrowych, odsetek granulocytów obojętnochłonnych, limfocytów i monocytów oraz liczba płytek krwi. śywotność komórek wynosiła ok. 99%, natomiast wartość
hematokrytu we wszystkich przypadkach nie przekraczała 0,1%. Pozostałe parametry
nie róŜniły się statystycznie w obydwu grupach chorych (Tabela 1).
Tabela 1. Charakterystyka materiału przeszczepowego w zaleŜnosci od wieku chorych
Table 1. Characteristics of autograft dependence on the age of patients
Chorzy <55rŜ
Chorzy > 55rŜ
n=16
n= 22
P
Całkowita liczba wyizolowanych
7,54±2,3
6,57±2,7
0,18
komórek [x109 /l]
(3,2–11,02)
(1,3–12,3)
Granulocyty obojętnochłonne [%]
18,6±5,3
18,7±8,0
0,93
(9,2–28,8)
(6,6–39,3)
Limfocyty [%]
57,7±7,7
58,9±10,5
0,93
(46–69,4)
43,2±79,6)
Monocyty [%]
20,7±5,3
20,4±9,7
0,68
(12–29,8)
(4,8–41,9)
Płytki krwi [×109 /l]
51,0±30,7
57,0±28,6
0,65
(21–96)
(16–115)
Bezwzględna liczba
171,9±67,3
125,3±83,0
0,032
komórek CD34+ /µl
(60,8–280,7)
(47,1–347,8)
R= –0,37
Bezwzględna liczba
13,4±5,9
16,4±9,2
0,43
komórek CD133+ /µl
(5,7–24,4)
(4,1–39,1)
W odniesieniu do zmiennych ilościowych podano wartość średnią ± odchylenie standardowe oraz w
nawiasie zakres obserwowanych wartości.
W wyizolowanym materiale komórki CD34+ stanowiły 2,03±0,7% (0,7–3,8%),
a komórki CD133+ 0,21±0,1% (0,06–0,63%) komórek uzyskanych ze szpiku kostnego.
Bezwzględna liczba wyizolowanych komórek CD34+ była znamiennie wyŜsza w grupie chorych poniŜej 55 rŜ, niŜ w grupie starszych chorych (p=0,032) (Tabela 1)
(Ryc.1). Wykazano takŜe ujemną korelację pomiędzy wiekiem chorych, a bezwzględną
liczbą komórek CD34+ (R=-0,37; p=0,03) (Ryc.2). Bezwzględna liczba komórek
CD133+ nie róŜniła się natomiast istotnie w obydwu badanych grupach (Tabela 1)
(Ryc. 1).
Czas pomiędzy wystąpieniem zawału serca, a izolacją komórek jednojądrowych do
autotransplantacji wynosił 3–11 dni. Chorych podzielono na trzy grupy. Grupę pierwszą stanowiło 14 chorych (2 kobiety i 12 męŜczyzn), u których izolację komórek wy-
Ocena efektywności izolacji komórek CD34+ I CD 133+
79
260
p=0,032
Bezwzględna liczba CD34+/ul
220
180
140
100
60
±Odch. std.
±Błąd std.
20
1
Chorzy poniŜej 55rŜ
2
Średnia
Chorzy powyŜej 55rŜ
28
Bezwzględna liczba CD133+/ul
24
p=0,43
20
16
12
8
±Odch. std.
±Błąd std.
4
1
Chorzy poniŜej 55rŜ
2
Średnia
Chorzy powyŜej 55rŜ
Ryc. 1. Bezwzględna liczba komórek CD34+ i 133+ w zaleŜności od wieku chorych
Fig. 1. The absolute number of CD34+ and CD133+ cells dependence on the age of patients
konywano pomiędzy 3–6 dobą zawału, grupę drugą stanowiło 12 chorych (4 kobiety i
7 męŜczyzn), u których izolację wykonano w 7 dobie oraz trzecią grupę 12 chorych (4
kobiety i 8 męŜczyzn), u których izolację wykonywano pomiędzy 8–11 dobą zawału.
Pomimo, Ŝe liczba komórek CD34+ zmniejszała się wraz z wydłuŜaniem czasu od wy-
80
A. KORYCKA i wsp.
stąpienia zawału, uzyskane wartości nie róŜniły się statystycznie istotnie (Tabela 2)
(Ryc. 3). W przypadku komórek CD133+ nie uzyskano róŜnic w zaleŜności od doby, w
której wykonywano izolację komórek.
Tabela 2. Porównanie liczby komórek CD34+ i CD133+ w zaleŜności od czasu pomiędzy zawałem, a
izolacją komórek macierzystych do autotransplantacji
Table 2. The comparison of the absolute number of CD34+ and CD133+ progenitor cells dependence on
the time of their autotransplantation
Izolacja <7 doby
Izolacja w 7 dobie
Izolacja > 7 doby
p
n=14
n=12
n=12
Liczba komórek CD 34+
165,7±84,0
134,5±95,9
127,9±48,8
>0,05
(66,2-347,8)
(47,1-319,2)
(60,8-233,8)
Liczba komórek CD133+
16,0±9,6
14,7±7,3
15,4±6,9
>0,05
(4,1-39,1)
(5,2-28,7)
(5,2-28,7)
W odniesieniu do zmiennych ilościowych podano wartość średnią ± odchylenie standardowe oraz w
nawiasie zakres obserwowanych wartości.
347,8
LICZBA KOMÓREK CD34/ul
319,2
R=-0,37 p=0,03
270,5
222,9
189,4
156,8
121,4
81,7
47,1
30
35
40
45
50
55
60
65
70
WIEK
Ryc. 2. ZaleŜność pomiędzy wiekiem, a ilością uzyskanych komórek CD34+
Fig. 2. Dependence between age and number of CD34+ cells
75
Ocena efektywności izolacji komórek CD34+ I CD 133+
81
300
p>0,05
Bezwzględna liczba komórek CD34+/ul
260
220
180
140
100
60
±Odch. std.
±Błąd std.
20
<7
7
>7
Średnia
Doba po zawale
Ryc. 3. Bezwzględna liczba komórek CD34+ w zaleŜności od czasu wykonania izolacji komórek
Fig. 3. The absolute number of CD34+ cells dependence on the time of mononuclear cells isolation
DYSKUSJA
Znaczny rozwój nowoczesnych, inwazyjnych technik diagnostycznych i leczniczych umoŜliwił istotny postęp w leczeniu ostrych zespołów wieńcowych. Stosując
pierwotną angioplastykę wieńcowa, połączoną z farmakoterapią, u znacznego odsetka
chorych udaje się ograniczyć rozmiar strefy martwicy pozawałowej. JednakŜe, zawał
mięśnia sercowego nadal często prowadzi do rozwoju niewydolności serca. U części
chorych, pomimo zastosowania nowoczesnych metod terapeutycznych, dochodzi do
niekorzystnej przebudowy pozawałowej serca, dysfunkcji lewej komory, a w konsekwencji do rozwoju niewydolność mięśnia sercowego (26, 27).
W ostatnich latach wykazano, Ŝe prekursorowe komórki śródbłonka odgrywają
istotną rolę w naprawie naczyń wieńcowych uszkodzonych po zawale. Stało się to
przesłanką ich wykorzystania w kardiologii, w celu regeneracji martwiczo uszkodzonej
tkanki mięśnia sercowego, jak równieŜ w prewencji przebudowy serca. Ukazały się
liczne publikacje przedstawiające skuteczność tej metody, z wykorzystaniem róŜnych
dróg podawania komórek macierzystych (18, 19, 28). Obecnie, u pacjentów z ostrym
zespołem wieńcowym komórki macierzyste najczęściej podaje się drogą dowieńcową
przez balonowy cewnik ze światłem wewnętrznym dzięki czemu docierają one w obszar unaczynienia tętnicy odpowiedzialnej za zawał (28). Aktywacja cząsteczek adhezyjnych i cytokin umoŜliwia przenikanie komórek poza ścianę naczynia, co prawdopodobnie prowadzi do neowaskularyzacji mięśnia sercowego.
82
A. KORYCKA i wsp.
W naszych badaniach zarówno izolacja, jak i autotransplatacja komórek wykonywana była w pomiędzy 3–11 dobą po zawale. Uzyskane przez nas wyniki wskazują, Ŝe
czas wykonania izolacji nie wpływał na liczbę uzyskanych komórek CD34+ i CD133+,
mimo, Ŝe obserwowaliśmy tendencję do zmniejszania się liczby komórek CD34+ wraz
z wydłuŜeniem czasu od wystąpienia zawału do pobrania materiału. Wielu autorów
opublikowało wyniki badań, w których porównywano funkcję mięśnia sercowego u
chorych poddanych autotransplantacji komórek jednojądrowych izolowanych ze szpiku kostnego do naczynia wieńcowego odpowiedzialnego za zawał, ze stosowaniem
standardowej terapii inwazyjnej (19, 29, 30). Izolacja komórek, podobnie jak w naszych badaniach, odbywała się w róŜnym czasie od wystąpienia zawału, a autotransplantacja wpływała korzystnie na funkcję lewej komory i poprawę kurczliwości mięśnia sercowego. Strauer i wsp. podawali komórki jednojądrowe w 7 dobie zawału,
uzyskując poprawę w tym zakresie, w porównaniu z grupą kontrolną (28). W randomizowanym badaniu TOPCARE-AMI autotransplantacje wykonywano u 59 chorych w 4
dobie zawału, natomiast w randomizowanym badaniu BOOST u 60 chorych z ostrym
zawałem serca porównywano implantację komórek jednojądrowych szpiku kostnego
wykonaną w 4-8 dobie, ze standardową terapię inwazyjną (18, 19). Randomizowane
badanie REPAIR-AMI wykonane u 204 chorych, dotyczące wpływu przeszczepienia
szpikowych komórek jednojądrowych pobranych w 3–5 dobie zawału, wykazało poprawę frakcji wyrzutowej lewej komory w porównaniu z grupą kontrolną (29). Inni
badacze przedstawili pozytywne efekty podania komórek macierzystych szpiku kostnego nawet w 11 dobie po zawale serca, uzyskując poprawę frakcji wyrzutowej lewej
komory przy braku poprawy w grupie kontrolnej (30). W przeciwieństwie do zachęcających wyników badań przedstawionych powyŜej, Janssens i wsp., wykonując autoprzeszczep w 1 dobie po zawale, nie uzyskali poprawy funkcji lewej komory, ani poprawy perfuzji (31). Podobnie brak wpływu zastosowanego leczenia na parametry
hemodynamiczne serca przedstawił Lunde i wsp. (32).
Wyniki badań Schächinger i wsp. (29) oraz Janssens i wsp. (31) wskazują, Ŝe najlepsze efekty podawania komórek macierzystych uzyskano, gdy autotransplantacja
wykonywana była powyŜej 5 dnia zawału, natomiast nie powinna ona być stosowana
w 1 dobie zawału. MoŜe to wynikać z aktywnego procesu zapalnego w pierwszych
dobach zawału oraz z resorpcji komórek martwicy. Nie moŜna bowiem wykluczyć
negatywnego wpływu zbyt wczesnego podania zawiesiny komórek jednojądrowych, co
byłoby zgodne z hipotezą przedstawioną przez autorów badania REPAIR-AMI, Ŝe
podanie do strefy zawału komórek macierzystych wcześniej niŜ w 3 dobie moŜe
zmniejszać korzystny efekt terapii (29). Poczynioną przez nas obserwację, Ŝe maksymalną liczbę komórek CD34+ uzyskuje się pobierając szpik pomiędzy 3–6 dniem po
zawale moŜna tłumaczyć migracją komórek macierzystych do utraconego miokardium
podczas procesu określanego jako „homing”, w odpowiedzi na stres spowodowany
zawałem (33,34). W materiale uzyskiwanym w wyniku izolacji komórek jednojądrowych wykonywanych 7 dnia po zawale i później obserwowaliśmy natomiast tendencję
do obniŜenia bezwzględnej liczby komórek CD34+ w szpiku. Wyniki naszych badań
dotyczących komórek CD34 są zgodne z doniesieniami Turan i wsp. (35), którzy oce-
Ocena efektywności izolacji komórek CD34+ I CD 133+
83
niając czynniki spontanicznej mobilizacji komórek CD34+ i CD133+ wykazali, ze liczba obydwu populacji komórek wzrastała począwszy od 1-go dnia zawału, osiągając
najwyŜszą wartość 7 dnia, natomiast od 8 dnia zaczynała się zmniejszać (35). Obserwowana przez nas liczba komórek CD133+ nie róŜniła się jednak w zaleŜności od czasu wykonania autotransplsantacji. Turan i wsp. oceniali liczbę komórek prekursorowych śródbłonka, obecnych w mobilizowanej podczas zawału krwi obwodowej, podczas gdy nasze badania wykonywane były na podstawie izolacji komórek uzyskanych
ze szpiku.
Badania ostatnich lat wskazują ponadto, Ŝe procedura izolacji komórek ze szpiku
kostnego równieŜ wpływa na ilość i jakość uzyskiwanych komórek jednojądrowych, a
w konsekwencji na poprawę parametrów hemodynamicznych u chorych na zawał.
Izolację komórek jednojądrowych przeprowadzano stosując róŜne komercyjnie dostępne media, zawierające polisacharydy oraz antykoagulant, i umoŜliwiające rozdział
komórek krwi lub szpiku na drodze wirowania w gradiencie gęstości. Większość autorów wykonywała izolację na Ficollu (17, 18, 28, 29). JednakŜe autorzy radmonizowanego badania ASTAMI, wykonywali izolację komórek na limfoprepie, natomiast Wollert i wsp. jako jedyni zastosowali technikę sedymentacji na Ŝelu wielobursztynianowym (19, 36). Seeger i wsp. porównali skuteczność izolacji na Ficollu (Cambrex) i
limfoprepie (Axis Shield), wykazując, Ŝe z podobnej objętości szpiku kostnego, w wyniku izolacji na Ficollu uzyskiwana jest większa niŜ na limfoprepie liczba komórek
jednojądrowych, co wpływa korzystnie na zmniejszenie rozległości zawału i poprawę
parametrów hemodynamicznych (37). W przeprowadzonych przez nas badaniach do
izolacji komórek stosowaliśmy wirowanie w gradiencie gęstości, stosując Ficoll-Paque
Plus (Amersham Biosceinces, Wielka Brytania). Uzyskana przez nas liczba komórek
wykazujących ekspresję antygenu CD34+ wynosiła ok. 2%, natomiast komórek wykazujących ekspresję CD133+ ok. 0,21% wszystkich wyizolowanych komórek , co jest
zgodne z danymi piśmiennictwa (12). W badaniach naszych, podobnie jak w badaniach
TOPCARE-AMI (18), BOOST (19) oraz Janssen i wsp. (31) komórki przeszczepiano
w dniu izolacji, podczas gdy Strauer i wsp. (28) oraz Fernandez-Aviles i wsp. (17)
zawieszali je w 20% autologicznym osoczu i stosowali całonocną inkubację. Nie ma
jak dotąd jednoznacznych dowodów potwierdzających , Ŝe czas, po którym izolowane
komórki poddawane są autotransplantacji wpływa na efekt zastosowanego leczenia. W
celu zapewnienia maksymalnej Ŝywotności komórek przestrzegaliśmy jednak aby nie
przekraczać 3 godzin pomiędzy zakończeniem izolacji, a autoprzeszczepem.
W badaniach naszych wykazaliśmy ponadto, Ŝe liczba komórek CD34+ jest większa u ludzi młodszych (poniŜej 55 rŜ), niŜ u chorych starszych. Podobne wyniki uzyskali Turan i wsp, którzy oceniali tę zaleŜność w 1 dobie zawału (35). Wydaje się
prawdopodobne, Ŝe liczba komórek CD34+ w szpiku maleje wraz z wiekiem ze względu na spowodowane apoptozą postępujące uszkodzenie śródbłonka, prowadzące do
wyczerpywania się liczby macierzystych komórek szpiku.
Podsumowując, u chorych z ostrym zawałem mięśnia sercowego wydajność izolacji komórek CD34+ do celów autotransplantacji dowieńcowej zmniejsza się wraz
z wiekiem chorych. Izolacja tych komórek ze szpiku moŜe być wykonywana pomię-
84
A. KORYCKA i wsp.
dzy 3–11 dobą po zawale. Pomimo uzyskania największej liczby komórek CD34+ w 3–
6 dobie zawału, wpływ zastosowanego leczenia na perfuzję i funkcję lewej komory
będzie jednak moŜna ocenić dopiero po przeanalizowaniu wyników uzyskanych u chorych leczonych tą metodą i porównaniu z grupą leczoną standardowo, po zakończeniu
rocznego okresu obserwacji.
Praca finansowana ze środków Ministerstwa Nauki jako projekt badawczy nr 2
(PO5B 178 28)
PIŚMIENNICTWO
1. Arai S, Klingemann HG. Hematopoietic stem cell transplantation: bone marrow vs. mobilized
peripheral blood. Arch. Med. Res., 2003; 34: 545–553.
2. Broxmayer HE, Douglas GW, Hangoc G, Cooper S, Bard J, English D i wsp. Human umbilical
cord blood as a potential source of transplantable hematopoietic stem/progenitor cells. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1989; 86: 3828–3832.
3. Cairo M, Magner JE. Placental and /or umbilical cord blood: An alternative source of hematopoietic stem cells for transplantation. Blood, 1997; 90: 4665–4678.
4. Urbaniak-Kujda D, Wołowiec D, Tomaszewska-Toporska B, Kapelko-Słowik K, Kuliczkowski
K. Mezenchymalne komórki macierzyste: ich biologia i perspektywy zastosowań klinicznych. Acta.
Haematol. Pol., 2005; 36: 161–166.
5. Hui JH, Ouyang HW, Hutmacher DW, Goh JC, Lee EH. Mesenchymal stem cells in musculoskeletal tissue enginieering: a review of recent advances in National University of Singapore. Ann.
Acad. Med. Singapore, 2005; 34: 206–212.
6. Yen AH, Sharpe PT. Regeneration of teeth using stem cell-based tissue engineering. Expert
Opin. Biol. Ther., 2006; 6: 9–16.
7. Góra-Tybor J, Krawczyńska A. KrąŜące komórki śródbłonka - nieinwazyjny marker angiogenezy. Acta Haematol. Pol., 2007; 38: 195–202.
8. Asahara T, Nasuda H, Takahashi T i wsp. Bone marrow origin of endothelial progenitor cells
responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circ. Res.,
1999; 85: 221–228.
9. Brzozowski A, Dmoszyńska A. Perspektywy leczniczego zastosowania komórek macierzystych
szpiku w chorobach niehematologicznych. Acta Haematol. Pol., 2003; 34: 139–149.
10. Shaw JP, Basch R, Shamamian P. Hematopoietic stem cells and endothelial cell precursors
express Tie-2, CD31 and CD45. Blood Cells Mol. Dis., 2004; 32: 168–175.
11. He X, Gonzalez V, Tsang A, Thompson J, Tsang TC, Harris DT. Differential gene expression
profiling of CD34+ CD133+ umbilical cord blood hematiopoietic srem progenitor cells. Stem Cells Dev.,
2005; 14: 188–198.
12. D’Arena G, Musto P, Cascavilla N, Di Giorgio G, Zendoli F, Carotenuto M. Human umbilical
cord blood: Immunophenotypic heterogeneity of CD34+ hematopoietic progenitor cells. Haematologica,
1996; 81: 404–409.
13. Kopeć-Szlęzak J, Podstwka U. Komórki hematopoetyczne CD34+ krwi pępowinowej. Acta
Haematol. Pol., 2001; 32: 61–69.
14. Langston JW. The promise of stem cells in Parkinson disease. J. Clin. Invest., 2005; 115: 23-25.
15. Forrester JS, Price MJ, Makkar RR. Stem cell repair of infarcted myocardium. An overview for
clinicians. Circulation, 2003; 108: 1139–1145.
Ocena efektywności izolacji komórek CD34+ I CD 133+
85
16. Beeres S, Bengel F, Bartunek J i wsp. Role of imaging in cardiac stem cell therapy. J. Am. Coll.
Cardiol., 2007; 49: 1137–1148.
17. Fernández-Avilés F, San Roman JA, Garcia-Frade J. i wsp. Experimental and clinical regenerative capability of human bone marrow cells after myocardial infarction. Circ. Res., 2004; 95: 742–748.
18. Schachinger V, Assmus B, Britten MB i wsp. Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction: final one-year results of the TOPCARE-AMI Trial. J.
Am. Coll. Cardiol., 2004; 44: 1690–1696.
19. Wollert KC, Meyer GP, Lotz J i wsp. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after
myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet, 2004; 364: 141–148.
20. Fotino M, Merson EJ, Allen FH. Micromethod for rapid separation of lymphocytes from peripheral blood. Ann. Clin. Lab. Sci., 1971; 1: 131–133.
21. Boyum A. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand. J. Immunol., 1976; 5
supl. 5: 9–15.
22. Korycka A, Smolewski P, Robak T. The influence of farnesyl protein transferase inhibitor
R115777 (Zarnestra) alone and in combination with purine nucleoside analogs in vitro. Eur. J. Haematol.,
2004; 73: 418–426.
23. Keeney M, Chin-Yee I, Weir K, Popma J, Nayar R, Sutherland DR. Single platform flow cytometric absolute CD34+cell counts based on the ISHAGE guidelines. Cytometry, 1998; 34: 61–70.
24. Basso G, Timeus F. Cytofluorometric analysis of CD34 cells. Bone Marrow Transplant. 1998;
22, Supl. 5: 17–20.
25. Leuner S, Arland M, Kahl C, Jentsch-Ulrich K, Franke A, Hoffkes HG. Enumaration of CD34positice hematopoietic progenitor cells by flow cytometry: comparison of valumetric assay and ISHAGE
gating strategy. Bone Marrow Transplant. 1998; 22: 699–706.
26. Plewka M, Krzemińska-Pakuła M, Korycka A, JeŜewski T, Kasprzak JD. Transplantacja komórek macierzystych u pacjentów z zawałem serca- fakty i mity. Pol. Przegl. Kardiol., 2006; 8: 422–425.
27. Plewka M, Krzemińska – Pakuła M, JeŜewski T, Lipiec P, Wierzbowska K, Peruga JZ, Korycka
A, Robak T, Kasprzak JD. Wczesna ocena rezerwy wieńcowej w badaniu echokardiograficznym po dowieńcowym podaniu jednojądrzastych komórek szpiku kostnego w grupie pacjentów po zawale. Pol.
Przegl. Kardiol., 2008 (w druku).
28. Strauer BE, Brehm M, Zeus T, i wsp. Repair infarcted myecardium by autologous intracoronary
mononuclear bone marrow cells transplantation in humans. Circulation. 2002; 106: 1913–1918.
29. Schächinger V, Erbs S, Elsässer A i wsp. Improved clinical outcome after intracoronary administration of bone-marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction: final 1-year results of the
REPAIR-AMI trial. Eur. Heart J., 2006; 27: 2775–2783.
30. Bartunek J, Vanderheyden M, Vandekerckhove B i wsp. Intracoronary injection of CD133positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction; feasibility and safety. Circulation, 2005; 112 [suppl I]:178–183.
31. Janssens S, Dubois C, Bogaert J i wsp. Autologous bone marrow derived stem-cell transfer in
patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial.
Lancet, 2005; 367: 113–121.
32. Lunde K, Solheim S, Aakhus S i wsp. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells
in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med., 2006; 355: 1199 –1209.
33. Lapidot T, Dar A, Kollet O. How do stem cells find their way home? Blood, 2005; 106: 1901–
1910.
34. Laird D, von Andrian UH, Wagers AJ. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and
disease. Cell, 2008; 132: 612–630.
35. Turan RG, Brehm M, Koestering M i wsp. Factors influencing spontaneous mobilization of
CD34+ and CD133+ progenitor cells after myocardial infarction. Eur. J. Clin. Invest., 2007; 37: 842–851.
36. Lunde K, Solheim S, Aakhus S, Arnesen H, Abdelnoor M, Forfang K. Autologous stem cell
transplantation in acute myocardial infarction: The ASTAMI randomized controlled trial. Intracoronary
86
A. KORYCKA i wsp.
transplantation of autologous mononuclear bone marrow cells, study design and safety aspects. Scand.
Cardiovasc., 2005; 39: 150–158.
37. Seeger F, Tonn T, Krzossok N, Zeiher AM, Dimmeler S. Cell isolation procedures matter: a
comparison of different isolation protocols of bone marrow mono nuclear cells used for cell therapy in
patients with acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 2007; 28: 766–772.
Praca wpłynęła do Redakcji 14.02.2008 r. i została zakwalifikowana do druku 28.03.2008 r.
Adres Autorów:
Dr hab. med. Anna Korycka
Katedra i Klinika Hematologii UM w Łodzi
ul. Pabianicka 62
93-513 Łódź