Molekularne mechanizmy inicjacji biosyntezy białek

Transkrypt

Molekularne mechanizmy inicjacji biosyntezy białek - biochemiczne
i biomedyczne implikacje nowego modelu translacji wzmacnianej
przez element RNA odpowiedzi na hipoksję (rHRE)
STRESZCZENIE
I
nicjacja translacji jest kluczowym etapem decydującym o szybkości syntezy białek komórki. Najbardziej wydajny z mechanizmów inicjuje translację zależną od czapeczki 5’.
W pewnych jednak stanach, tak fizjologicznych (mitoza), jak i patologicznych (stres oksydacyjny) może dochodzić do przełączania klasycznego mechanizmu syntezy na mechanizmy
alternatywne, których inicjację regulują obecne w mRNA elementy, takie jak IRES, uORF,
IRE, CPE, DICE, AURE, CITE. Zaproponowany ostatnio model inicjacji translacji zależnej
od obecnego w sekwencji RNA elementu odpowiedzi na hipoksję (rHRE) zmienia obraz
regulacji translacji w stanie niedoboru tlenu i rzuca nowe światło na niewyjaśnione dotąd
procesy biochemiczne. Hipoksja jest jednym z lepiej poznanych czynników, które uruchamiają alternatywne mechanizmy inicjacji translacji. Czasowe niedotlenienie tkanek i narządów aktywuje procesy takie jak: angiogeneza, miogeneza, regeneracja, gojenie ran, jak
również sprzyja powstaniu odpowiedzi adaptacyjnej w chorobach sercowo-naczyniowych i
neurodegeneracyjnych. Cykliczna hipoksja towarzyszy rozwojowi guzów nowotworowych,
umożliwiając syntezę białek wymaganych do dalszej progresji nowotworowej. Niniejsza
praca dokonuje przeglądu zagadnień regulacji translacji białek, ujętych w kontekście alternatywnych modeli inicjacji translacji.
WPROWADZENIE
Translacja jest procesem tłumaczenia informacji genetycznej z sekwencji nukleotydów matrycowego RNA (mRNA) na sekwencję aminokwasów w białkach
[1,2]. Wydajność tego procesu zależy głównie od etapu inicjacji translacji [1], której szybkość ogranicza szereg systemów zabezpieczeń i punktów kontrolnych,
umożliwiających zmianę lub zatrzymanie przepływu informacji genetycznej
[3,4].
Dla większości komórkowych mRNA, najbardziej wydajnym mechanizmem
syntezy białek jest translacja zależna od czapeczki 5’ [2,5]. W warunkach takich
jak mitoza, różnicowanie, stres komórkowy lub apoptoza, mechanizm ten ulega
ograniczeniu lub wyłączeniu, a jego funkcje przejmują inne mechanizmy translacji [6]. Powszechnie akceptowanym modelem alternatywnej syntezy białek
jest inicjacja translacji zależna od wewnętrznego miejsca wiązania rybosomu
[3]. Cząsteczki mRNA, które dysponują zarówno czapeczką 5’ jak i elementem
IRES, umożliwiają ciągłą syntezę białek, niezależnie od fazy cyklu komórkowego i warunków otoczenia [6]. Zmiana mechanizmu translacji może wpływać na
stosunki ilościowe białek, w tym białek decydujących o życiu i śmierci komórek
[4,6]. Zaburzenie syntezy białek towarzyszy rozwojowi wielu chorób takich jak
choroby sercowo-naczyniowe [7], neurodegeneracyjne [8] i nowotworowe [4].
Kontrola inicjacji translacji ma szczególne znaczenie w kompleksowej odpowiedzi na stres, w którym dochodzi do ograniczenia wielu funkcji życiowych
komórek [9]. Stres może wywołać szok cieplny, osmotyczny, jak również ograniczona dostępność składników odżywczych, aminokwasów, surowicy, infekcja
wirusowa lub niedobór tlenu [6,9]. Hipoksja przełącza klasyczny mechanizm
inicjacji translacji zależnej od czapeczki 5’ na mechanizm alternatywny, ograniczający zużycie tlenu i energii [6]. Stan niedotlenienia stabilizuje czynniki indukowane hipoksją HIF-1α, HIF-2α oraz HIF-3α, które są odpowiedzialne między
innymi za aktywację transkrypcji genów związanych z procesami tworzenia nowych naczyń krwionośnych, regenerację tkanek, gojenie ran [10], czy też adaptację do czasowego niedotlenienia związanego z wysiłkiem fizycznym [11]. Cykliczne okresy niedotlenienia mogą także ułatwiać komórkom unikanie kontroli
translacji [5], towarzyszą rozwojowi guzów litych [12] i mogą prowadzić do syntezy specyficznych białek, wymaganych w progresji nowotworowej [4]. Jak dotąd, opisano około 1200 typów guzów litych, których rozwój zależy od 20009000 genów, w tym MYC, CCND1, VEGFA, TEK, EIF4E i około 100 innych genów, bezpośrednio zaangażowanych w kancerogenezę [13]. Ekspresja kluczowych w tym procesie genów supresorowych i protoonkogenów może być
Postępy Biochemii 60 (1) 2014
Adam Master
Alicja Nauman*
Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego, Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, Warszawa
Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego, Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, ul. Marymoncka 99/103, 01-813 Warszawa; tel.: (22) 569 38 18, e-mail: anauman@cmkp.
edu.pl
*
Artykuł otrzymano 29 lipca 2013 r.
Artykuł zaakceptowano 23 grudnia 2013 r.
Słowa kluczowe: czapeczka 5’ (m7G), HIF-2α,
hipoksja, IRES, kontrola translacji, nowotwór,
rHRE, stres oksydacyjny, UTR
Wykaz skrótów: eIF (ang. eukaryotic translation
Initiation Factor) – eukariotyczny czynnik inicjacji translacji; eIF4E2 (ang. eukaryotic translation Initiation Factor 4E type 2) – eukariotyczny
czynnik inicjacji translacji 4E typu drugiego,
kodowany przez gen EIF4E2 (NCBI Gene ID:
9470); HIF-2α (ang. Hypoxia-Inducible Factor
2-alpha) – czynnik indukowany hipoksją 2α,
kodowany przez EPAS1 (Gene ID: 2034), pełni
funkcję czynnika transkrypcyjnego oraz czynnika inicjacji translacji aktywowanej w warunkach niedotlenienia; IRES (ang. Internal Ribosome Entry Site) – wewnętrzne miejsce wiązania
rybosomu - element RNA; ITAF (ang. IRES
Trans-Acting Factor) – czynnik trans wiążący
się z IRES, rybonukleoproteina rozpoznająca
element cis RNA (IRES); czapeczka 5’ (kap)
– 7-metyloguanozyna (m7G), przyłączana w
trakcie transkrypcji do 5’ końca mRNA; RBM4
(ang. RNA-binding protein 4) – białko 4 wiążące
RNA, kodowane przez RBM4 (Gene ID: 5936)
wiąże element rHRE; rHRE – element RNA
odpowiedzi na hipoksję; uORF (ang. upstream
Open Reading Frame) – alternatywna, otwarta
ramka odczytu RNA, położona powyżej (w
kierunku 5’) właściwej ramki odczytu (ORF),
zlokalizowanej pomiędzy kodonem start i stop
translacji; UTR (ang. UnTranslated Region) – region nieulegający translacji (5’ lub 3’ końcowy
fragment sekwencji RNA)
Podziękowania: Praca powstała w trakcie realizacji projektów badawczych N N411073636
i N N401019940, finansowanych ze środków
przyznanych przez Narodowe Centrum Nauki
i jest częścią pracy doktorskiej Adama Mastera
pt. „Wpływ nieulegających translacji regionów
mRNA (UTR) na ekspresję izoformy beta-1
receptora jądrowego T3 (TRβ1) w raku nerki
typu jasnokomórkowego (ccRCC).
39
Rycina 1. Model inicjacji translacji zależnej od czapeczki 5’ (m7G). Mechanizm ten przeważa w komórkach eukariotycznych (85-90% inicjacji translacji) i jest aktywowany
przez kompleks 1 kinazy mTOR (mTORC1), który przeprowadza fosforylację kinazy p70S6K (S2) oraz białka 4E-BP (S1), którego fosforylacja umożliwia dimeryzację i
odblokowanie eukariotycznego czynnika inicjacji translacji (eIF4E). Aktywacja kinazy p70S6K prowadzi do fosforylacji białka S6 małej podjednostki rybosomu (rpS6) oraz
czynników inicjacji: eIF3 oraz eIF4B/eIF4A. p70S6K bierze także udział w kontroli eIF4G oraz eEF1A i eEF2K/eEF2. Mechanizm inicjacji obejmuje kolejno: asocjację podstawowych kompleksów białkowych (opisanych pomarańczową czcionką): a) czasowego kompleksu trójskładnikowego eIF2◦GTP◦Met-tRNAiMet (K. TC) zawierającego
czynnik inicjacji translacji eIF2 z zaznaczoną nieufosforylowaną podjednostką alfa, guanozyno-trifosforan (GTP) oraz inicjatorowy amino-acylo-tRNA (Met-tRNAiMet); b)
wieloczynnikowego kompleksu białkowego MCF (K. MCF) składanego na małej podjednostce rybosomu 40S, zawierającego szereg czynników inicjacji translacji tj.: eIF1,
eIF1A, eIF3, eIF5, c) kompleksu czynników eIF4F (K. eiF4F), formowanego wokół czynnika eIF4G, stanowiącego rusztowanie dla wiążącego się z czapeczką 5’ czynnika
eIF4E, eIF4B, eIF4H oraz helikazy eIF4A. Czynnik eIF4G wiąże również inne białka (spoza kompleksu eIF4F) tj. białko wiążące się do ogona poli(A) – PABP, kinazę Mnk1
i czynnik eIF3. Wymienione trzy kompleksy (podświetlone na kremowo) organizują się w bardziej złożone układy: wiążący się do RNA kompleks preinicjacyjny 43S (K.
PIC 43S), w którym czynnik eIF2 spaja kompleks TC z kompleksem MCF i małą podjednostką rybosomu, jak również kompleks preinicjacyjny 48S (K. PIC 48S), gdzie
czynnik eIF3 łączy kompleks PIC (43S) z czynnikiem eIF4G kompleksu eiF4F. Czynnik eIF2 odpowiada również za prawidłowe ustawienie inicjującego amino-acylo-tRNA
w pozycji P podjednostki rybosomu, zawierającego trzy miejsca wiązania tRNA (A, P i E). Natrafienie kompleksu PIC na kodon start (AUG) kończy proces skanowania
5’UTR i rozpoczyna etap uwalniania czynników inicjacji. Etap ten obejmuje kolejno: zależną od eIF5 hydrolizę GTP związanego z eIF2 (czasowego kompleksu TC), przyłączenie i hydrolizę GTP eIF5B, dysocjację czynników eIF1, eIF2-GDP, eIF5, a następnie eIF1A i eIF5B-GDP, przyłączenie dużej podjednostki rybosomu 60S, utworzenie
kompleksu elongacyjnego (80S) i rozpoczęcie syntezy na matrycy sekwencji kodującej (CDS), we właściwej ramce odczytu (ORF). Regeneracja składowych kompleksu
TC odbywa się przez wymianę nukleotydu z GDP na GTP eIF2, którą przeprowadza czynnik eIF2B. Na schemacie zaznaczono miejsca hamowania (H) inicjacji translacji
zależnej od czapeczki 5’ (czerwone gwiazdki), obejmujące: fosforylację eIF2α(Ser51) (H3), jak również zahamowanie fosforylacji białek efektorowych mTOR tj.: białek
4E-BP, które w formie nieufosforylowanej blokują eIF4E w miejscu wiązania czynnika eIF4G (H1) oraz kinazy p70S6K, która w formie nieufosforylowanej asocjuje z eIF3
(H2). Fosforylację mTOR hamuje stan hipoksji oraz inhibitory tj. rapamycyna. Białko RBM4 hamuje translację zależną od czapeczki 5’, wzmacniając jednocześnie syntezę
inicjowaną przez elementy IRES i rHRE. ISRIB - inhibitor zintegrowanej odpowiedzi na stres (ISR), który przywraca translację zależną od czapeczki 5’. Inne wyjaśnienia
w tekście pracy oraz na rycinie 6.
40
www.postepybiochemii.pl
regulowana potranskrypcyjnie, na poziomie syntezy ich
białek [4].
białek wiążących RNA rozpoznaje elementy cis przez dopasowanie do struktury przestrzennej mRNA [24,25].
Zahamowanie klasycznej inicjacji translacji zależnej od
czapeczki 5’ jest zwykle wynikiem fosforylacji reszty Ser51
podjednostki alfa eukariotycznego czynnika inicjacji translacji eIF2 (Ryc. 1) [9]. Fosforylacja ta blokuje katalizowaną
przez czynnik eIF2B reakcję wymiany nukleotydów GDP
na GTP, co w konsekwencji uniemożliwia ponowne wykorzystanie trójskładnikowego kompleksu TC (ang. Ternary
Complex) [14]. Podobnie, związanie czynnika eIF4E przez
nieufosforylowane białka 4E-BP, powoduje zahamowanie
wiązania eIF4G przez eIF4E i zatrzymanie klasycznego mechanizmu syntezy [6]. W obydwu przypadkach, zablokowanie translacji zależnej od czapeczki 5’ (Ryc. 1) może ułatwiać inicjację translacji kontrolowanej przez elementy IRES
[15] (Ryc. 2 i 3) lub uORF [16] (Ryc. 4). Szacuje się, że 10-15%
komórkowych mRNA dysponuje elementami umożliwiającymi translację niezależną od czapeczki 5’ [6]. Te alternatywne mechanizmy inicjacji translacji, nie wyjaśniają jednak
obserwowanego w stresie komórkowym, wysokiego poziomu syntezy białek, których mRNA nie zawiera wymienionych wyżej elementów [6,9].
Funkcję czynników trans mogą pełnić białkowe czynniki inicjacji translacji [4], rybonukleoproteiny ITAF [26], jak
również inne cząsteczki RNA, których związanie może
przesłaniać elementy cis [27], wpływać na energię tworzenia struktur II-rzędowych (ΔG, energię Gibbs’a) [28] lub
rekrutować specyficzne czynniki trans, prowadzące do
wzmocnienia [29] lub wyciszenia translacji [30]. W regulacji
tej biorą udział długie (>200nt), naturalnie występujące antysensowne transkrypty NAT, obejmujące długie niekodujące RNA (lncRNA) [26], jak również krótkie (< 90nt), niekodujące RNA (sncRNA) takie jak mikroRNA, tRNA, rRNA,
piRNA, komórkowe siRNA i saRNA [31,32]. Cząsteczki
mRNA mogą tworzyć funkcjonalne, dwuniciowe dupleksy [29], trójniciowe tripleksy [33], a także czteroniciowe
kwadrupleksy RNA [34], które w zależności od położenia i
konformacji, mogą hamować inicjację translacji zależną od
czapeczki 5’ lub wzmacniać syntezę białek inicjowaną przez
elementy IRES [6].
W 2012 roku, w Nature została opublikowana praca, w
której autorzy prezentują nowy mechanizm aktywowanej w hipoksji translacji zależnej od czapeczki 5’ i obecnej
w cząsteczkach RNA sekwencji regulatorowej nazwanej
przez nich elementem RNA odpowiedzi na hipoksję - rHRE
[17,18]. Jak wykazano, w obecności eukariotycznego czynnika inicjacji translacji 4E typu drugiego (eIF4E2), białka 4
wiążącego RNA - RBM4 oraz czynnika indukowanego hipoksją 2α (HIF-2α), w warunkach niedotlenienia dochodzi
do inicjacji wydajnej translacji zależnej od czapeczki 5’ na
matrycy cząsteczek mRNA, które dysponują elementem
rHRE [17,19]. Model ten zmienia obraz syntezy białek w
stresie oksydacyjnym i wskazuje na rolę mechanizmów
kontroli translacji w nabywaniu lekooporności na inhibitory
kinaz stosowanych w leczeniu nowotworów.
CZYNNIKI trans KONTROLUJĄ AKTYWNOŚĆ
TRANSLACYJNĄ ELEMENTÓW cis mRNA
W kontroli syntezy białek zasadniczą rolę odgrywają regiony nieulegające translacji - 5’UTR położony terminalnie
na 5’ końcu oraz 3’UTR zlokalizowany na 3’ końcu mRNA
[18,19]. Funkcjonalne właściwości tych regionów wynikają
z I-, II-, III- i IV-rzędowej struktury RNA (sekwencji, pofałdowania, budowy przestrzennej i organizacji międzycząsteczkowej), których zaburzenie obserwuje się np. w
zespole łamliwego chromosomu X, chorobie Huntington’a
i w chorobach nowotworowych [20,21]. Zmiany w sekwencji regionów UTR mogą prowadzić do nieprawidłowego
fałdowania mRNA, a w konsekwencji wadliwej prezentacji elementów cis (ang. cis-acting elements) [18]. Niewłaściwa konformacja tych elementów może następnie zaburzać
wiązanie ogólnych i specyficznych czynników trans (ang.
trans-acting factors), regulujących poszczególne fazy translacji [1,19]. Dla wielu czynników trans ważniejszy od sekwencji jest kontekst strukturalny prezentowanych przez RNA
elementów cis [22,23]. Najnowsze prace wskazują, że wiele
HELIKAZY RNA ROZPLATAJĄ STRUKTURY
5’UTR I REGULUJĄ DZIAŁANIE mikroRNA
Eukariotyczne czynniki inicjacji translacji eIF4A wykazują aktywność helikaz RNA zależnych od ATP i kodowane
są przez trzy geny: EIF4A1 i EIF4A2 oraz EIF4A3 [35]. Białka
te umożliwiają wiązanie małej podjednostki rybosomu 40S
do sekwencji 5’UTR i odpowiadają za rozplatanie dwuniciowych struktur RNA w trakcie skanowania rybosomu. Na
poziomie białka, eIF4A1 i eIF4A2 wykazują 90% zgodność
sekwencji i stanowią konieczny składnik kompleksu eIF4F,
inicjującego translację zależną od czapeczki 5’ (Ryc. 1) [35].
Czynnik eIF4A1 występuje zwykle w ilościowej przewadze względem eIF4A2 i jest preferencyjnie wiązany przez
eIF4G w kompleksie eIF4F (Ryc. 1) [36]. Długo uważano,
że helikazy eIF4A1 i eIF4A2 wykazują podobną specyfikę
działania i mogą być zamiennie włączane do kompleksów
eIF4F [36]. Ostatnio wykazano jednak, że mechanizm hamowania translacji przez mikroRNA wymaga obecności w
kompleksie eIF4F-5’UTR helikazy eIF4A2 (ale nie eIF4A1),
która jest jedynym składnikiem tego kompleksu, niezbędnym do zahamowania syntezy białek przez mikroRNA [36].
Mechanizm ten obejmuje rekrutację białek kompleksu wyciszającego RISC do miejsca wiązania mikroRNA w 3’UTR,
który może oddziaływać z czynnikami inicjacji translacji
wiązanymi przez 5’UTR (eIF4F) za pośrednictwem białek PABP (ang. poly(A)-binding protein) i deadenylującego
kompleksu Ccr4-NOT [37]. Meijer i wsp. w 2013 roku wykazali, że mechanizm wyciszania translacji przez związane
z 3’UTR mikroRNA jest bardziej skuteczny w przypadku
wariantów mRNA opatrzonych długimi, pofałdowanymi sekwencjami 5’UTR, które wydajnie rekrutują helikazy
RNA [36]. Badania te wskazują na specyficzną rolę eIF4A2
oraz ustrukturyzowanych 5’UTR w regulacji zależnego od
mikroRNA hamowania translacji białek [36].
Trzecia z helikaz, eIF4A3 zawiera zachowany w ewolucji motyw DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp), obecny również w sekwencji eIF4A1 i eIF4A2, względem których wykazuje 65%
41
homologię [35]. W przeciwieństwie do eIF4A1 i eIF4A2,
czynnik eIF4A3 obniża wydajność translacji zależnej od czapeczki 5’ i bierze udział w hamowaniu specyficznych selenoprotein takich jak dejodynaza jodotyroninowa typu pierwszego DIO1 [35]. W warunkach niedoboru selenu, eIF4A3
wiąże się do wewnętrznej i wierzchołkowej pętli elementu
SECIS (ang. SEleno-Cysteine Insertion Sequence) w 3’UTR selenoprotein, hamując tym samym wprowadzanie selenocysteiny do syntetyzowanego białka [25,35]. Czynnik eIF4A3
jest również akumulowany w jądrze komórkowym, gdzie
wchodząc w skład rdzenia białkowego kompleksu katalizującego łączenie eksonów EJC (ang. Exon Junction Complex)
reguluje proces różnicowego składania pre-mRNA [35,38].
CZAPECZKA 5’ ZWIĘKSZA
WYDAJNOŚĆ SYNTEZY BIAŁEK
Translacja zależna od czapeczki 5’ (m7G) jest najbardziej
wydajnym sposobem biosyntezy białek i obejmuje szereg
następujących po sobie zdarzeń [1]. Etap inicjacji poprzedza
aktywacja czynników translacji, która w przeważającej części związana jest z ich fosforylacją [5]. Formowanie pierwszego, wieloczynnikowego kompleksu MFC (ang. MultiFactor Complex) zbudowanego z białek eIF1, eIF1A, eIF3 i eIF5
rozpoczyna proces asocjacji czynników inicjacji translacji. W
kompleksie tym czynniki eIF1, eIF1A ułatwiają rozpoznanie kodonu start [18] (Ryc. 1). MFC pośredniczy w wiązaniu
czynnika eIF2, GTP oraz inicjatorowego tRNA Met-tRNAiMet
do małej podjednostki rybosomu 40S, tworzącej drugi - czasowy, trójskładnikowy kompleks TC (ang. Ternary Complex)
[5]. Spośród wszystkich tRNA, tylko Met-tRNAiMet może
wiązać się w pozycji P z małą jednostką rybosomu (Ryc. 1),
co sprawia, że każde zsyntetyzowane białko posiada na N-końcu metioninę, która w dalszej obróbce potranslacyjnej
jest usuwana [1]. Włączenie Met-tRNAiMet w miejscu peptydowym P rybosomu aktywuje miejsce akceptorowe A wiązania kolejnego amino-acylo-tRNA [2].
Czasowy kompleks TC i wieloczynnikowy kompleks
MFC tworzą podstawową jednostkę kompleksu preinicjującego (PIC 43S, ang. Pre-Initiation Complex), który następnie
przyłącza trzeci z komponentów, kompleks białek czynnika
eIF4F (eIF4E, eIF4G, eIF4A, eIF4B, eIF4H), nazywany również kompleksem wiążącym czapeczkę (mRNA-eIF4F) [1].
Kompleks PIC 43S (MCF i TC) wraz z kompleksem eIF4F
tworzą ostateczny kompleks preinicjujący PIC 48S [5]. Połączenie tych kompleksów następuje za pośrednictwem
czynnika eIF3 związanego z małą podjednostką rybosomu
(40S), który oddziałuje z czynnikiem eIF4G, integrującym
kompleks eIF4F z czapeczką 5’ mRNA. Takie połączenie
spaja podjednostkę 40S z 5’ końcem mRNA. Kompleks PIC
48S, w obecności białka PABP wiążącego ogon poli(A), inicjuje skanowanie regionu 5’UTR mRNA (od czapeczki 5’) w
poszukiwaniu właściwego kodonu start (AUG) [1]. W pewnych warunkach, włączenie kompleksu TC może nastąpić
po zakończeniu skanowania 5’UTR i po rozpoznaniu kodonu start, zawsze jednak przed przyłączeniem dużej podjednostki rybosomu 60S [39]. Podjednostka 60S nie bierze
udziału w skanowaniu 5’UTR i jest przyłączana dopiero po
rozpoznaniu właściwego kodonu start przez kompleks TC
związany z podjednostką 40S [2].
42
Rozpoznanie kodonu start rozpoczyna szereg zdarzeń
prowadzących do uwolnienia czynników inicjacji translacji
[5]. Niemniej, dysocjacja czynników możliwa jest dopiero
po dokładnym dopasowaniu antykodonu Met-tRNAimet do
kodonu start, znajdującego się w sekwencji konsensusowej
Kozak [1]. Sparowanie pierwszego kodonu i antykodonu
ułatwia hydrolizę związanej z eIF2 cząsteczki GTP (k. TC),
którą przeprowadza eIF5 - białko aktywujące GTPazę (GAP,
ang. GTPase activating protein) i podjednostka 40S rybosomu
(Ryc.1). Włączenie kolejnego czynnika eIF5B i hydroliza
związanej z nim cząsteczki GTP powoduje dysocjację eIF1,
eIF2-GDP, eIF5, zamknięcie rybosomu podjednostką 60S
(utworzenie rybosomu 80S) i aktywację trzeciego miejsca E
(ang. Exit), dzięki któremu możliwym jest usunięcie tRNA
metioniny. Uwolnienie czynników eIF5B-GDP, eIF1A oraz
pierwszego tRNA otwiera pozycję A i przesuwa rybosom
na miejsce kolejnego kodonu mRNA, umożliwiając włączenie kolejnego amino-acylo-tRNA do wydłużającego się łańcucha polipeptydowego (Ryc. 1) [5].
Regeneracja składowych kompleksu TC odbywa się
przez wymianę nukleotydu GDP związanego z eIF2 na
GTP, którą przeprowadza czynnik eIF2B wykazujący aktywność charakterystyczną dla czynników wymiany nukleotydów guaninowych GEF (ang. Guanine nucleotide Exchange Factors) [1,5].
Fazę wydłużania łańcucha polipeptydowego kontrolują
eukariotyczne czynniki elongacji translacji eEF1A, eEF1B,
eEF2 [2]. Prędkość syntezy szacuje się na 6-9 aminokwasów
na sekundę, natomiast częstość błędu 10-3-10-4 [2]. W trakcie
odczytywania kolejnych kodonów mRNA, aparat translacyjny może natrafić na przeszkody natury strukturalnej, takie jak sekwencje poślizgowe (ang. slippery sequences) [40].
Obecność tych elementów może prowadzić do przemieszczenia się rybosomów w inne miejsce mRNA, gdzie kontynuują translację w tej samej lub innej ramce odczytu, co
zmienia pierwotne znaczenie kodu genetycznego i prowadzi do zwiększenia różnorodności białek [40].
Po osiągnięciu kodonu stop, eukariotyczny czynnik terminacji translacji eRF1 wraz z eRF3 i GTP uwalniają nowo
syntetyzowane białko [41], umożliwiając jednocześnie
dysocjację podjednostki 60S i szybką reinicjację translacji
przez małą podjednostkę rybosomu [1]. Kompleks 5’UTR/
eIF4E/eIF4G/PABP/3’UTR zapętla mRNA i ułatwia ponowne związanie małej podjednostki rybosomu z 5’UTR
[39]. Translacja na pojedynczej cząsteczce mRNA może być
prowadzona przez wiele rybosomów oddalonych od siebie
o ok. 80 nukleotydów. Tworzą one polisom (polirybosom),
który wielokrotnie zwiększa wydajność translacji [1].
STRES KOMÓRKOWY AKTYWUJE ALTERNATYWNE
MECHANIZMY INICJACJI TRANSLACJI
Fosforylacja Ser51 czynnika eIF2α (Ryc. 1) hamuje wymianę GDP/GTP, co blokuje klasyczną translację zależną
od czapeczki 5’ i umożliwia uruchomienie jednego z mniej
energochłonnych mechanizmów inicjacji translacji [9]. Przełączenie tych mechanizmów prowadzić może do zmiany
programu ekspresji genów i selektywnej translacji wybrawww.postepybiochemii.pl
nych białek, które uczestniczą w zintegrowanej odpowiedzi
na stres (ISR, ang. Integrated Stress Response) [6].
ELEMENTY uORF MOGĄ INICJOWAĆ
ODPOWIEDŹ NA STRES
Czynniki stresu komórkowego obniżają wydajność fosforylacji oksydacyjnej i ograniczają produkcję energii (ATP),
co prowadzi do zmniejszenia wydajności procesu fałdowania białek, ich akumulacji we wnętrzu siateczki śródplazmatycznej (ER), a w konsekwencji, stresu siateczki śródplazmatycznej [6]. Ostry stres aktywuje odpowiedź prowadzącą do śmierci komórek, natomiast łagodny, chroniczny
stres uruchamia mechanizmy adaptacyjne, umożliwiające
ich przeżycie. Akumulacja białek w ER jest sygnałem dla
komórki do uruchomienia szlaku odpowiedzi na nieprawidłowo sfałdowane białka UPR (ang. Unfolded Protein Response) [42].
Warunki stresu komórkowego sprzyjają inicjacji translacji zależnej od alternatywnych ramek odczytu (uORF),
obecnych m.in. w sekwencji 5’UTR genów ATF4 [39] i ATF5
(ang. Activating Transcription Factor) [45]. Białka te, jako
czynniki transkrypcyjne biorą udział m.in. w transaktywacji białek efektorowych odpowiedzi na stres komórkowy [39]. Wariant pierwszy mRNA ATF4 (NCBI Acc. no.:
NM_001675.2) obejmuje 84 nukleotydy (nt) 3’UTR, 1056 nt
sekwencji kodującej (CDS) oraz 882 nt regionu 5’UTR, który
zawiera 7 alternatywnych kodonów start (uAUG). Dwa z
tych kodonów otwierają alternatywne ramki odczytu, które
kontrolują translację inicjowaną w pozycji ósmego kodonu
start ATF4. W warunkach stresu komórkowego, ograniczającego szybkość skanowania sekwencji 5’UTR, elementy
uORF umożliwiają zwiększenie częstości translacji inicjowanej z właściwej ramki odczytu [16].
Rodzina białek fosforylujących eIF2α obejmuje kilka kinaz aktywowanych w różnych rodzajach stresu. Kinaza
białkowa PERK przeprowadza fosforylację w odpowiedzi
na stres ER wywołany niedoborem glukozy lub tlenu, białko GCN2 w odpowiedzi na niedobór aminokwasów oraz
w hipoksji, która jednocześnie hamuje zależną od mTOR
fosforylację 4E-BP [1,42]. Kinaza PKR jest białkiem aktywowanym przez interferon, którego odpowiedź związana jest
z obecnością dwuniciowego RNA (dsRNA) w komórce (np.
RNA niektórych wirusów), natomiast białko HRI fosforyluje eIF2α w odpowiedzi na niedobór hemu [8,18].
Hem odgrywa kluczową rolę w synchronizacji mechanizmów inicjacji translacji i regulacji transkrypcji związanej z
cyklem okołodobowym, gdzie pełni funkcję liganda receptorów jądrowych Rev-erbα (NR1D1) i Rev-erbβ (NR1D2)
[32,43]. Aktywacja kinazy HRI, nazywanej także kinazą 1
eukariotycznego czynnika inicjacji translacji 2α (EIF2AK1)
wyłącza translację zależną od czapeczki 5’, umożliwiając
jednocześnie włączenie mechanizmu alternatywnego, w
tym zależnego od IRES [6]. Białko HRI jest zatem elementem systemu zabezpieczeń komórki, który w warunkach
niedoboru hemu nie pozwala na syntezę wszystkich białek
komórki. Inicjowane przez HRI reprogramowanie translacji
komórek może towarzyszyć zmianom ekspresji genów regulowanych przez zależne od hemu czynniki transkrypcyjne Rev-erbα i Rev-erbβ [27,32]. Transkrypt Rev-Erbα, niezależnie od funkcji regulatora rytmu dnia i nocy, pełni także
funkcję antysensownego transkryptu cis-NAT [43], który
kontroluje proces różnicowego składania pre-mRNA genu
THRA i reguluje stosunek izoform białkowych receptora
jądrowego trijodotyroniny TRα1/TRα2 [32]. Komplementarność sekwencji 3’UTR mRNA TRα2 i 3’UTR mRNA RevErbα ułatwia tworzenie kompleksów dwuniciowego RNA,
które z kolei mogą aktywować PKR [30,32].
Kinaza HRI, oraz inne, wymienione powyżej kinazy
podjednostki alfa czynnika eIF2, pełnią funkcję czujników
stresu komórkowego i zatrzymują translację zależną od czapeczki 5’. Zablokowanie tego mechanizmu jest wymagane
do aktywacji szeregu szlaków odpowiedzi na stres, w tym
aktywacji szlaku NF-κB [2,44].
Regulatorowe uORF ATF4 i ATF5 obejmują: położony
proksymalnie, pozytywny element uORF-1 oraz negatywny uORF-2, zlokalizowany bliżej miejsca startu właściwej
ramki odczytu (ORF) [16,45]. Element uORF-1, umożliwia szybką reinicjację i skanowanie w dół sekwencji aż
do miejsca występowania uORF-2, które spowalnia przejście rybosomu do położonego poniżej właściwego kodonu
start (AUG). W trakcie translacji zależnej od czapeczki 5’,
gdy eIF2α pozostaje nieufosforylowany, podjednostka rybosomu 60S dysocjuje po osiągnięciu kodonu stop ORF-1,
podczas gdy podjednostka 40S (wraz z czynnikami inicjacji) skanuje dalszą sekwencję 5’UTR. Po natrafieniu na kodon start uORF-2, 40S przyłącza trójskładnikowy kompleks
TC, tak by móc ponownie połączyć się z podjednostką 60S.
Przyłączenie tego kompleksu inicjuje translację uORF-2,
ograniczając tym samym translację inicjowaną na położonej
poniżej, właściwej ramce odczytu. W trakcie stresu ER, fosforylacja eIF2α prowadzi do obniżenia stężenia kompleksu
TC, co zmniejsza prawdopodobieństwo zależnego od TC
przyłączania podjednostki rybosomu 60S i zatrzymania całego rybosomu na uORF-2. W warunkach stresu komórkowego, deficyt kompleksu TC utrudnia małej podjednostce
składanie rybosomu 80S na uORF-2. Jednocześnie, wolna
reinicjacja i skanowanie sekwencji umożliwiają przejście
podjednostki 40S przez uORF-2 z pominięciem składania
całego rybosomu na tym elemencie. Przejście przez uORF-2
zwiększa z kolei częstość składania 80S w miejscu start właściwej ramki odczytu. Dalsza elongacja prowadzi do syntezy kompletnego białka ATF4 i ATF5 [45] (Ryc. 6). Elementy
uORF mogą także zwiększać wydajność translacji zależnej
od IRES, co wykazano na przykładzie mRNA białka Cat-1
[15].
W 2013 r. zidentyfikowano pierwszy inhibitor zintegrowanej odpowiedzi na stres komórkowy, trans-ISRIB (ang.
ISR Inhibitor - Bis-glycolamide). ISRIB jest stereospecyficznym
antagonistą (IC50, 5nM) odpowiedzi na stres, który hamuje
m.in. aktywowaną przez fosforylację eIF2α odpowiedź na
nieprawidłowo sfałdowane białka (UPR) [14]. Inhibitor ten
hamuje syntezę ATF4, zwiększa stężenie kompleksu TC i
przywraca translację zależną od czapeczki 5’. ISRIB ułatwia
konsolidację pamięci poznawczej myszy jak również obniża
43
tolerancję na stres komórkowy, sugerując jego potencjalnie
właściwości przeciwnowotworowe [14].
Mechanizm translacji ATF4 wskazuje na pozytywną rolę
alternatywnych ramek odczytu w syntezie tego białka w
warunkach stresu komórkowego. Pozostaje on także zgodny z prezentowaną w wielu pracach rolą uORF w hamowaniu klasycznej translacji zależnej od czapeczki 5’ [46]. Mechanizm ten nie tłumaczy jednak obserwowanego w stresie
komórek wzrostu poziomu translacji specyficznych białek,
które nie dysponują elementem uORF [17].
Rycina 2. Model ogólny inicjacji translacji zależnej od elementu IRES (niezależnej od czapeczki 5’). Wymagania białkowe jak i mechanizmy translacji inicjowanej przez IRES mogą różnić się istotnie między transkryptami różnych genów,
co wynika z różnych sekwencji IRES w 5’UTR jak również II- i III-rzędowych
struktur przestrzennych, schematycznie zaznaczonych na rycinie opisem IRES.
Większość jednak elementów IRES może być stymulowana przez specyficzne dla
IRES czynniki trans – ITAFs (ang. IRES-specific Trans-Acting Factors), obejmujące
rybonukleoproteiny. Ogólny model inicjacji zależnej od IRES zakłada: a) brak
konieczności przyłączenia do kompleksu preinicjującego czynnika eIF4E (wiążącego czapeczkę 5’), którego zablokowanie (np. przez białko 4E-BP) najczęściej
nie powoduje zahamowania translacji zależnej od IRES (czerwona gwiazdka);
b) brak konieczności usuwania reszty fosforanowej (P w kółku) podjednostki α
czynnika eIF2 na Ser51, której fosforylacja (np. w warunkach stresu komórkowego) powoduje zahamowanie inicjacji translacji zależnej od czapeczki 5’, ale nie
inicjacji zależnej od IRES (czerwona gwiazdka). Fosforylacja ta prowadzi do zahamowania aktywności trójskładnikowego kompleksu eIF2◦GTP◦Met-tRNAiMet
(K. TC) przez utrudnienie jego ponownego wykorzystania, polegającego na
zależnej od eIF2B wymianie nukleotydu GDP na GTP. W ogólnym modelu,
translacja inicjowana przez IRES nie wymaga również obecności całego białka
eIF4G, ale może wymagać zapętlenia (cyrkularyzacji) RNA, realizowanego przez
oddziaływania białek wiążących ogon poli(A – PABP) z eiF4G, co wpływa na
zwiększenie częstości reinicjacji translacji. Wymagania co do pozostałych czynników inicjacji mogą się różnić między poszczególnymi IRES – od żadnych do
wszystkich podstawowych czynników inicjacji translacji tj.: czasowego kompleksu trójskładnikowego TC (K. TC), wieloczynnikowego kompleksu MCF (K.
MCF) i kompleksu czynników eIF4F (K. eIF4F). Z pośród klasycznych czynników
inicjacji sekwencje IRES wymagają najczęściej obecności eIF4A oraz eIF3. Inne
wyjaśnienia w tekście pracy.
INICJACJA ZALEŻNA OD IRES NIE WYMAGA
SKANOWANIA CAŁEGO 5’UTR
Alternatywny, niezależny od czapeczki 5’ mechanizm
inicjacji translacji opisano po raz pierwszy w późnych latach
80-tych, kiedy to zauważono, że niektóre wirusy nie wymagają obecności czapeczki do inicjacji swojej translacji [47].
W późniejszym czasie zidentyfikowano również szereg kodujących komórkowych mRNA, których translacja przebiegała niezależnie od czapeczki 5’, a wiązanie podjednostki
rybosomu 40S następowało w najbliższym sąsiedztwie kodonu start [26]. Funkcjonalne elementy IRES zlokalizowane
są zwykle w obrębie 5’UTR, w niewielkiej odległości przed
44
właściwym kodonem start [6]. IRES mogą również znajdować się poniżej kodonu start, w sekwencji kodującej, co prowadzi do syntezy skróconych od 5’-końca białek (np. Notch)
[15,26]. Elementy te wykryto także w transkryptach uważanych za niekodujące (ncRNA), jakkolwiek ich rola pozostaje niejasna [48]. Sekwencja i struktura komórkowych IRES
jest jednak mocno zróżnicowana, choć niespodziewanie ich
wspólną cechą jest mniej ujemna energia Gibbs’a wpływająca na mniejszą stabilność II-rzędowych struktur w porównaniu do sekwencji otaczających IRES [49] (Ryc. 2).
Translację zależną od IRES ułatwiają czynniki ITAF, które obejmują heterogenną grupę różnych jądrowych rybonukleoprotein (RNPs: HnRNP A1, C1/C2, I, E1/E2, K i L) oraz
inne białka wykazujące aktywność czynników trans. Białka
tej grupy znane są z ich udziału w alternatywnym składaniu pre-mRNA, eksporcie RNA i innych formach transportu
wahadłowego między jądrem a cytoplazmą [2,26]. Wiążąc
się do elementów cis takich jak IRES, mogą efektywnie stymulować inicjację translacji [6]. Czynniki trans, ITAF stymulują translację niezależną od czapeczki 5’ przez ułatwienie podjednostce rybosomu 40S wiązania się z sekwencją
IRES oraz pomoc w dopasowaniu miejsca P rybosomu do
kodonu start [26]. Inne funkcje ITAF obejmują: przegrupowanie przestrzennej struktury IRES w celu zwiększenia lub
zmniejszenia powinowactwa do aparatu translacyjnego,
jak również modelowanie oddziaływań typu RNA-białko i
białko-białko [26].
Inicjacja zależna od IRES nie wymaga u eukariontów
związania rybosomu z kompleksem czapeczki m7G na 5’
końcu mRNA, a tym samym nie wymaga skanowania całej
długości sekwencji 5’UTR. IRES ma ograniczone, ale zróżnicowane wymagania co do podstawowych czynników inicjacji translacji lub, jak ustalono w kilku przypadkach, nie
wymaga żadnych czynników prócz podjednostki rybosomu
40S [26]. Wiele zidentyfikowanych dotąd elementów IRES
wykazuje jednak zwiększoną aktywność w obecności czynnika eIF4G, który w stresie komórkowym nie ulega proteolitycznemu cięciu przez kaspazy [6,26]. Translacja inicjowana przez IRES może być hamowana m.in. w warunkach
zwiększonej ekspresji czynników promujących niezależne
od IRES mechanizmy syntezy białek [14,50].
W badaniach z wykorzystaniem siRNA oraz inhibitorów czynników inicjacji translacji takich jak hippuristanol
(inhibitor helikazy eIF4A), wykazano, że stosunek różnych
białek Myc regulowany jest dostępnością poszczególnych
czynników inicjacji translacji [51]. Zależna od IRES synteza wariantów c-Myc i N-Myc wymaga jedynie czynników
eIF4A i eIF3, podczas gdy obecność eIF4E i eiF4G nie jest
konieczna, chociaż wymagana w translacji wariantu L-Myc
[6,26]. Podobne do N-Myc wymagania wykazuje IRES wirusa zapalenia wątroby typu A (HAV) [47]. Wiele genów
powiązanych z procesami nowotworowymi (MYC, TP53)
[4] i zapalnymi [44], w translacji swoich białek wykorzystuje
alternatywny mechanizm inicjacji translacji, który umożliwia prowadzenie syntezy w stanach, w których dochodzi
do wyłączenia translacji zależnej od czapeczki 5’ [15]. W
trakcie apoptozy, translacja białka p53 zachodzi nawet po
pocięciu DNA, po którym klasyczny mechanizm translacji
jest już nieaktywny [6,26].
Mimo, że szczegółowy mechanizm komórkowej translacji zależnej od IRES nie jest do końca poznany, zaproponowano kilka hipotetycznych modeli syntezy, inicjowanej
niezależnie od czapeczki 5’. Pierwszy z nich, prezentowany
w kontekście produktów genu MYC zakłada mechanizm typowy dla pikornawirusów [47,51]. Kolejny, opisywany na
przykładzie produktów genu IGF1R, zakłada oddziaływanie między sekwencją IRES i 18S RNA rybosomu, podobnie
jak ma to miejsce w przypadku oddziaływania sekwencji
Shine-Dalgarno z 16S rRNA prokariontów [52]. Należy jednak podkreślić, że nie ma jednego wspólnego modelu inicjacji translacji zależnej od IRES, co wynika z różnej sekwencji,
II-rzędowej struktury i odmiennego zapotrzebowania na
różne czynniki inicjacji translacji [47,51].
Podsumowując, cząsteczki RNA mogą formować struktury II i III-rzędowe, które mogą imitować białkowe czynniki inicjacji translacji, co częściowo tłumaczy zmniejszone
zapotrzebowanie IRES na te czynniki [49] (Ryc. 2 i 3). Wiele
komórkowych mRNA zawierających element IRES wymaga
związania czynników ITAF [26]. Pomimo mniejszej wydajności tego mechanizmu translacji, umożliwia on prowadzenie syntezy w stresie komórkowym i nie wymaga skanowania całej sekwencji 5’UTR [6,15]. Elementy IRES znajdują
zastosowanie m.in. w terapii genowej, w wektorach dwucistronowych, które umożliwiają jednoczesną translację
dwóch białek na matrycy jednej cząsteczki mRNA [7].
Zidentyfikowany ostatnio IRES kinazy c-Src jest pierwszym takim elementem, który podobnie jak IRES wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) może bezpośrednio wiązać
małą podjednostkę rybosomu, niezależnie od czynnika eIF2
[53]. Chociaż podjednostka α tego czynnika włącza i wyłącza translację zależną od czapeczki 5’, eIF2 nie jest niezbędny w translacji inicjowanej z elementu IRES. Zahamowanie
aktywności trójskładnikowego kompleksu TC (Ryc. 1) jest
częstą konsekwencją stresu komórkowego, który istotnie
obniża wydajność translacji zależnej od czapeczki 5’ [15,44].
Część wirusowych [47] i komórkowych [26] IRES nie wykazuje jednak wrażliwości na ten typ represji, co wskazuje na
podstawową różnicę między tymi mechanizmami translacji
[1,5]. W przypadku syntezy inicjowanej przez IRES, funkcję
eIF2 może przejmować czynnik eIF5B (ortolog prokariotycznego IF2), który promuje przyłączanie Met-tRNAiMet do
rybosomu [54]. Funkcję tą mogą podejmować również inne
białka takie jak protoonkogen MCT-1, białko ligatyna (ang.
Ligatin) i DENR [54] (Ryc. 3).
Element odpowiedzi na żelazo, IRE (ang. Iron-Response
Element) rozpoznawany jest przez białka IRP1 i IRP2, wiążące IRE w warunkach obniżonego stężenia wewnątrzkomórkowego żelaza [57]. Elementy te obecne są m.in. w 5’UTR
ferrytyny, której translację hamuje przyłączenie IRP1 oraz
w 3’UTR receptora transferyny, którego mRNA wykazuje
zwiększoną stabilność po związaniu IRP1 [57]. IRE zidentyfikowano także w regionie 5’UTR czynnika indukowanego hipoksją HIF-2α. W badaniach myszy IRP1-/- wykazano,
że kontrola zależnej od IRE translacji HIF-2α ma większy
wpływ na jego ekspresję niż regulacja jego stabilizacji/
degradacji w układzie O2/PHD/VHL [57]. Zahamowanie
syntezy IRP1 prowadzić może do zwiększenia aktywności
Niezależnie od stanu fosforylacji eIF2α, funkcję molekularnego przełącznika między translacją zależną i niezależną od czapeczki 5’ mogą pełnić dwa białka: 4E-BP i eIF4G.
Białko 4E-BP blokuje miejsce wiązania eIF4E do eIF4G, a
tym samym translację inicjowaną przez czapeczkę 5’ [1]. W
raku piersi IBC dochodzi do podniesienia poziomu zarówno czynnika eIF4G jak i 4E-BP-1, co ułatwia adaptację tych
komórek do warunków niedotlenienia [55]. W komórkach
IBC zwiększa się wydajność translacji zależnej od IRES, w
tym białek takich jak izoforma L-VEGF-A, odpowiedzialna za angiogenezę [56]. Translacja tej izoformy inicjowana
jest przez element IRES-B, który wymaga obecności czynnika eIF4G1 [55]. Zwiększenie ilości białka 4E-BP-1, które
zwykle blokuje czynnik eIF4E, prowadzi do zahamowania
translacji zależnej od czapeczki 5’, ale nie translacji inicjowanej przez IRES [56].
Wiele mRNA zawierających elementy IRES koduje białka, które zaangażowane są w ochronę komórek przed stresem i apoptozą [6]. Wśród tych transkryptów, istotną grupę
stanowią protoonkogeny, opatrzone długimi ustrukturyzowanymi sekwencjami 5’UTR [28,51], zawierającymi dodatkowo elementy uORF [16,56], które w warunkach sprzyjających translacji zależnej od czapeczki 5’, w naturalny sposób
utrudniają biosyntezę kodowanych przez nie białek [2].
ELEMENT IRE KONTROLUJE TRANSLACJĘ HIF-2α
Rycina 3. Model minimalny inicjacji translacji zależnej od IRES. Inicjacja translacji
niewielkiej grupy zidentyfikowanych komórkowych IRES nie wymaga żadnych
czynników (oddziałując wyłącznie z białkami rybosomu) lub też ich wymagania w tym zakresie są minimalne. Większość jednak elementów IRES może być
aktywowana przez specyficzne dla IRES czynniki trans, ITAFs, obejmujące heterogenną grupę nukleoprotein. Jak ostatnio wykazano, rolę represorowych
czynników ITAF mogą pełnić również małe niekodujące mikroRNA. IRES-B w
5’UTR transkryptu VEGF-A może być specyficznie hamowane przez miR-16.
Założenia minimalnego modelu w większości zbieżne są z ogólnym modelem
inicjacji translacji zależnej od IRES (Ryc. 2). Niemniej, zakłada on również, że
funkcję czynnika eiF2 (a.), polegającą na dostarczaniu specjalnego, pierwszego
amino-acylo-tRNA Met-tRNAiMet (pozycja P małej podjednostki rybosomu) mogą
również przejmować inne białka takie jak: czynnik eIF5B (b.), białko DENR (c.),
MCT-1 (d.), Ligatyna (e.) i wiele innych (f.), co może tłumaczyć niewrażliwość
systemów IRES na fosforylację podjednostki α czynnika eiF2. Translacja zależna
od IRES może być inicjowana zarówno przez główny kodon start (AUG), jak również kodon alternatywny (CUG) znajdujący się powyżej (w kierunku 5’) kodonu
AUG, umożliwiając translację w prawidłowej lub alternatywnej ramce odczytu
(uORF). Transkrypt VEGF-A, może kodować zarówno normalne białko, którego
translacja inicjowana jest z IRES-A, jak również wydłużone (bardziej aktywne)
białko L-VEGF-A, syntetyzowane z drugiego IRES-B, położonego powyżej, w sąsiedztwie alternatywnego kodonu start CUG.
45
HIF-2α, a w konsekwencji do podniesienia poziomu erytropoetyny (EPO), retikulocytozy i policytemii [57]. Wykazano także, że obniżenie poziomu żelaza w cytosolu na
skutek podniesienia produkcji mitochondrialnej ferrytyny
(MtFt), zwiększającej akumulację żelaza w mitochondriach,
powoduje zahamowanie wzrostu guzów nowotworowych
w mysim modelu przeszczepów ksenograficznych, co jest
zgodne z zależną od żelaza/IRP1 kontrolą translacji HIF-2α
i jego znaną rolą w rozwoju nowotworów [57,58]. Ponadto,
w doświadczeniach przeprowadzonych na 15 liniach raka
nerkowokomórkowego typu jasnokomórkowego (ccRCC) z
mutacjami supresora VHL wykazano skuteczność nitroksydu Tempol (aktywatora wiązania IRP1) w redukcji syntezy
HIF-2α [58]. Wyniki tych badań wskazywać mogą na potencjał terapeutyczny tego nitroksydu [58], jak również możliwość jego wykorzystania w hamowaniu translacji zależnej
od elementu rHRE.
ELEMENT CITE ZWIĘKSZA REKRUTACJĘ
CZYNNIKÓW INICJACJI TRANSLACJI
W warunkach stresu komórkowego, struktury 3’UTR nazwane elementami CITE (ang. Cap-Independent Translational
Enhancers) mogą w obrębie 5’UTR ułatwiać asocjację rybosomu i wymaganych czynników inicjacji translacji [59].
ELEMENT rHRE UMOŻLIWIA WYDAJNĄ
TRANSLACJĘ W HIPOKSJI
Odkrycie w 2012 r. przez Uniacke i wsp. mechanizmu
inicjacji translacji zależnej od czapeczki 5’ i elementu RNA
odpowiedzi na hipoksję rHRE wykazało, że transkrypty
posiadające element rHRE mogą ulegać wydajnej translacji
zarówno w warunkach normoksji, jak i hipoksji [17].
od elementu rHRE nie jest znany [17,18]. Wykazano jednak,
że kompleks ten nie oddziałuje z czynnikiem eIF4G, ani
eIF4E (eIF4E1), które wchodzą w skład kompleksu eIF4F,
wymaganego w translacji zależnej od czapeczki 5’ [17] (Ryc.
4).
rHRE jest elementem RNA odpowiedzi na hipoksję występującym w sekwencji setek transkryptów zawierających
kasety CGG lub CG [17], których liczbę wstępnie oszacowano na podstawie zdolności wiązania kompleksów HIF-2α/
RBM4 [60]. Obok receptora EGFR, do transkryptów dysponujących elementem rHRE mogą należeć także mRNA
PDGFRA i IGF1R [17,18]. Wyciszenie czynnika eIF4E2 i
RBM4, podobnie jak wprowadzenie mutacji punktowej do
kasety CGG rHRE istotnie obniża ogólny poziom translacji
w warunkach niedotlenienia, co dodatkowo podkreśla znaczenie elementu rHRE w regulacji wielu transkryptów komórki [17].
HIF-2α (EPAS1, HIF2A, NCBI Gene ID: 2034) jest białkiem wykazującym duże podobieństwo strukturalne i
funkcjonalne względem HIF1α, niemniej charakteryzuje go
większa specyficzność tkankowa, nieco odmienny profil regulowanych genów oraz odmienne oddziaływania z białkami [61]. Co ciekawe, populację Tybetańczyków zajmujących
wysokogórskie tereny charakteryzuje obecność polimorfizmu typu SNP w sekwencji HIF-2α, który może zwracać
uwagę na potencjalną rolę tego czynnika w adaptacji do
niskiego stężenia tlenu oraz życia na dużych wysokościach
[62]. Stabilizacja czynnika transkrypcyjnego HIF-2α w hipoksji [61], który w modelu translacji zależnej od elementu
rHRE występuje w nieznanej dotąd funkcji czynnika inicjacji translacji, może wyjaśniać zwiększenie poziomu syntezy
wielu białek w odpowiedzi na stres oksydacyjny [17,19].
Element ten zidentyfikowano w sekwencji wielu transkryptów, w tym receptora naskórkowego czynnika wzrostu
EGFR [17]. rHRE receptora EGFR zlokalizowano w obrębie
fragmentu sekwencji 3’UTR (4295–4861), zawierającego powtórzenia CGG, rozpoznawane m.in przez białko RBM4
[17]. Jak wykazano w warunkach obniżonej zawartości tlenu, kluczowe znaczenie dla wydajnej translacji ma powtórzenie CGG w pozycji 4557, które ponad 5-krotnie podnosi
poziom białka reporterowego w warunkach 1% O2, podczas
gdy mutacja tej pozycji CGG→AAA nie zmienia wydajności
translacji względem kontroli [17].
Autorzy pracy wykazują, że hipoksja nie musi wcale wyłączać translacji zależnej od czapeczki 5’, pod warunkiem,
że cząsteczka mRNA dysponuje elementem rHRE wiążącym białko RBM4. Proponowany mechanizm obejmuje: a)
przyłączenie białka adaptorowego wiążącego RNA, RBM4
do elementu rHRE w 3’UTR EGFR, czemu towarzyszy b)
związanie przez RBM4 czynnika indukowanego hipoksją HIF-2α, c) przyłączenie do kompleksu HIF-2α, RBM4
czynnika eIF4E2 (homologa eIF4E) wiążącego czapeczkę 5’,
d) utworzenie minimalnego kompleksu inicjującego: czapeczka 5’-eIF4E2-HIF-2α-RBM4-rHRE, zamykającego pętlę
mRNA [17]. Powstanie tego kompleksu ułatwia wielokrotną inicjację translacji, prowadzonej wraz z innymi czynnikami, w tym helikazą eIF4A, która mocno wiąże HIF-2α [17].
Ostateczny skład kompleksu inicjującego translację zależną
46
Rycina 4. Model inicjacji translacji zależnej od elementu rHRE. Mechanizm ten
zależy od czapeczki 5’ i jest inicjowany w warunkach hipoksji, kiedy dochodzi
do fosforylacji podjednostki α czynnika eIF2 (czerwona gwiazdka) w odpowiedzi na stres, który prowadzi do zahamowania klasycznej translacji zależnej od
czapeczki 5’. Inicjacja syntezy białek obejmuje kolejno: a) związanie białka adaptorowego wiążącego RNA, RBM4 do elementu rHRE w 3’UTR, czemu towarzyszy b) związanie przez RBM4 czynnika indukowanego hipoksją HIF-2α, c)
przyłączenie do kompleksu HIF-2α, RBM4 czynnika eIF4E2 (homologa eIF4E)
wiążącego czapeczkę 5’ (m7G), d) powstanie minimalnego kompleksu inicjującego: czapeczka 5’ – eIF4E2 – HIF-2α – RBM4 – rHRE, zamykającego pętlę mRNA,
co ułatwia wielokrotną reinicjację translacji, prowadzonej wraz z innymi podstawowymi czynnikami, w tym helikazą eIF4A, która mocno oddziałuje z HIF2-α.
Pytajnikami oznaczono oddziaływania pomiędzy czynnikami; oddziaływania te
nie zostały dotąd jasno zdefiniowane dla tego modelu translacji. Inne wyjaśnienia
w tekście pracy.
Drugi z istotnych składników kompleksu, czynnik
eIF4E2 (4EHP, NCBI Gene ID: 9470), podobnie jak eIF4E
(eIF4E1) może wiązać czapeczkę 5’, ale słabo oddziałuje z
białkami 4E-BP i nie łączy się z eIF4G [17,63], co może uniezależniać go od fosforylacji mTOR i klasycznego kompleksu
eIF4F. Chociaż wykazano, że wiązanie eIF4E2 do analogów
czapeczki 5’ mRNA jest znacznie słabsze w porównaniu z
eIF4E1 [64], w pewnych warunkach stresu komórkowego,
w procesie ISGylacji białek do Lys134 lub Lys222 eIF4E2 przyłączane jest białko ISG15 (ang. ubiquitin-like protein ISG15),
które wielokrotnie zwiększa zdolność eIF4E2 do wiązania
czapeczki 5’ [63]. Ponadto, hipoksja może podnieść poziom
ekspresji zarówno eIF4E1 jak i eIF4E2 [50]. W normoksji
(21% O2) funkcja czynnika eIF4E2 nie jest jednoznacznie
określona [63,64]. Niemniej, w kilku badaniach wykazano,
że czynnik ten, podobnie jak eIF4E3, może współzawodniczyć kompetycyjnie z eIF4E1 o dostęp do czapeczki 5’ i nie
aktywuje syntezy, pełniąc tym samym funkcję represora
klasycznej translacji tych białek [17,63]. Ten rodzaj hamowania kompetycyjnego jest kluczowym mechanizmem asymetrycznej dystrybucji białek w rozwoju embrionalnym
muszek z rodzaju Drosophila [65]. Ponadto, eIF4E2 oddziałuje z białkiem GIGYF2, tworząc z nim kompleks represora translacji eIF4E2-GIGYF2, którego rozbicie powoduje
śmierć embrionów myszy [65]. Badania lokalizacji eIF4E2 w
stresie komórek (HeLa i HEK293) traktowanych arsenianem
lub aktynomycyną D, wykazały, że czynnik ten, w przeciwieństwie do eIF4E1, nie akumuluje w cytoplazmatycznych
granulach stresowych ani w ciałkach P, w których dochodzi
zwykle do zahamowania translacji [64]. Wyniki tych badań
pozostają w zgodzie z przypisywaną eIF4E2 funkcją czynnika inicjacji translacji, aktywowanego co najmniej w warunkach stresu oksydacyjnego [18].
Białko RBM4 (RBM4, NCBI Gene ID: 5936) pełni wiele
funkcji związanych z regulacją różnicowego składania pre-mRNA, metabolizmem mRNA oraz kontrolą translacji
[17,66]. RBM4 zawiera motyw rozpoznający powtórzenia
CGG, CGGG i CG, które występują zwykle w ustrukturyzowanych fragmentach RNA, prezentowanych w otoczeniu
niesparowanych sekwencji [22]. Z drugiej strony, wykazano, że w procesie składania pre-mRNA α-tropomiozyny,
RBM4 wiąże się do intronowego elementu bogatego w CU,
umożliwiając wprowadzenie do mRNA alternatywnego
eksonu, specyficznego dla mięśni szkieletowych. W wiązaniu tego elementu RBM4 współzawodniczy kompetycyjnie
z białkiem PTB, wiążącym się do sekwencji polipirymidynowych, które blokuje wprowadzanie tego eksonu do
mRNA α-tropomiozyny [11,66]. RBM4 utrzymuje wysoki
poziom syntezy w komórkach mięśni i serca, gdzie bierze
udział w różnicowaniu komórek [25]. W trakcie tego procesu, ufosforylowane białko RBM4 ulega translokacji z jądra
do cytoplazmy. Cytoplazmatyczna akumulacja RBM4 zależy od fosforylacji Ser309 tego białka na szlaku MKK3/6-p38
[67]. Białko jest czasowo deponowane w ziarnistościach
cytoplazmatycznych, zawierających czynniki stabilizujące
mikrotubule, mRNA opatrzone ogonem poli(A), jak również mikrorybonukleoproteiny (mikroRNP) takie jak AGO2
(eIF2C2). RBM4 oddziałuje również z komórkowo-specyficznymi mikroRNA i promuje zależną od mikroRNP represję translacji [25].
Niezależnie od wiązania się RBM4 do rHRE [17], wykazano, że w warunkach stresu komórkowego białko to promuje przyłączanie czynnika inicjacji translacji eIF4A do cząsteczek mRNA dysponujących elementem IRES, wzmacniając w ten sposób inicjację translacji niezależną od czapeczki
5’ [67]. W normoksji, RBM4 specyficznie hamuje translację
zależną od czapeczki 5’ transkryptów, do których się wiąże
[25]. Podniesienie syntezy RBM4 może symulować warunki stresu komórkowego i uruchamiać mechanizmy inicjacji
translacji, aktywowane zwykle w odpowiedzi na stres [67].
Dalsze doświadczenia wykazały, że zastosowanie rapamycyny, inhibitora mTOR, blokuje akumulację eIF4E w
polisomach, ale nie ma wpływu na aktywność czynnika
eIF4E2 [17]. Jednocześnie, rapamycyna jak również wyciszenie eIF4E powodują zahamowanie translacji transkryptu
zawierającego element rHRE w normoksji, ale nie w hipoksji, gdzie zastosowanie inhibitorów eIF4E nie ma wpływu
na syntezę białek [18]. Z badań tych wynika, że w przypadku mRNA zawierającego element rHRE, zablokowanie fosforylacji zależnej od mTOR, wyłącza translację tych transkryptów w warunkach normoksji, ale nie w hipoksji [17].
W przeciwieństwie do transkryptów ulegających klasycznej
translacji zależnej od czapeczki 5’, te zawierające dodatkowo element rHRE mogą być wydajnie syntetyzowane zarówno w warunkach normoksji jak i hipoksji [17], uzupełniając tym samym pulę białek, których synteza zależy od
elementu IRES [18,19].
ELEMENT DICE POŚREDNICZY W KONTROLI
RÓŻNICOWANIA KOMÓREK
W przełączaniu alternatywnych mechanizmów inicjacji
translacji, białko RBM4 może współdziałać z hnRNP, w tym
hnRNP K (białkiem K). W zależności od lokalizacji, białka
te regulują procesy związane z aktywacją lub represją i terminacją transkrypcji, różnicowym składaniem pre-mRNA,
eksportem mRNA z jądra do cytoplazmy jak również translacją białek [68]. W warunkach stresu komórkowego, hnRNP
K ulega translokacji z jądra do cytoplazmy, gdzie podobnie
jak RBM4, może hamować klasyczną translację (zależną od
czapeczki 5’) [67,68]. Fosforylacja hnRNP K i RBM4 może
zwiększać akumulację tych białek w cytoplazmie [67], gdzie
pełnią funkcję platformy integrującej białka i RNA [68,69].
Trzy domeny KH białka K mogą wiązać RNA przy udziale trzech sekwencji konsensusowych bogatych w cytozynę:
CCAUCN , wCCCwN oraz UCAYC [69]. Związanie białka
K do elementu kontroli różnicowania DICE (ang. Differentiation-Control Element) w 3’UTR, wycisza translację lipooksygenazy r15-LOX, która odpowiada za inicjację procesu
degradacji mitochondriów w trakcie różnicowania retikulocytów [70]. Mechanizm ten obejmuje utworzenie kompleksu mRNP, zawierającego m.in. zapętlony mRNA i białko
K, które hamuje przyłączanie podjednostki rybosomu 60S
w 5’UTR, blokując tym samym składanie pełnego rybosomu 80S [70]. Kontrolowaną w czasie i przestrzeni aktywację
translacji r15-LOX inicjuje obniżający się poziom białka K
jak również jego potranslacyjna modyfikacja, polegająca na
odcinaniu C-terminalnej domeny KH3 przez kaspazę-3 [70].
Dodatkowo, zależna od c-Src fosforylacja Tyr458 w obrębie
KH3 odwracalnie blokuje wiązanie białka K do elemen2–7
7–18
47
tu DICE, umożliwiając tym samym podniesienie poziomu
translacji r15-LOX [70].
ELEMENT AURE REGULUJE TRANSLACJĘ
PRZEZ WPŁYW NA STABILNOŚĆ mRNA
HnRNP A2 i L negatywnie regulują stabilność cząsteczek mRNA zawierających element AURE (ARE, ang. AU-rich response element) [71,72]. Te bogate w adeninę i uracyl
sekwencje zidentyfikowano w 3’UTR wielu mRNA białek
związanych z odpowiedzią na stres tj. GLUT1, TNF-α,
IFN-α, COX-2, INOS c-Jun, c-Fos, c-Myc [72]. W warunkach umożliwiających prowadzenie klasycznej translacji
zależnej od czapeczki 5’, transkrypty te mają krótki czas
półtrwania, który ogranicza wydajność syntezy ich białek,
podczas gdy działanie czynników stresowych stabilizuje te
mRNA i zwiększa ich translację [72]. W hipoksji i hipoglikemii guzów mózgu zaobserwowano zmniejszenie udziału
hnRNP A2 i L w polisomach, czemu towarzyszyła stabilizacja mRNA i zwiększenie wydajności syntezy transportera glukozy 1 GLUT1 (SLC2A1) [71]. Niezależnie od translacji, ekspresja GLUT1 może być zwiększana na poziomie
transkrypcji m.in. przez czynnik HIF-1α [10,71], jak również
przez inicjowane pozagenomowo szlaki sygnałowe hormonu tarczycy, które prowadzą do aktywacji mTOR i podniesienia poziomu GLUT1 i HIF-1α [73,74]. Chociaż obniżenie
poziomu cytoplazmatycznej frakcji hnRNP A2 i L w guzach
mózgu mogło ograniczać zależną od AURE destabilizację
mRNA GLUT1 [71], mechanizm ten nie tłumaczy wysokiego poziomu syntezy tego białka w warunkach hipoksji
komórek, w których klasyczna inicjacja translacji jest hamowana, co sugeruje zaangażowanie alternatywnego mechanizmu syntezy GLUT1. Zwiększone pobieranie glukozy
przez komórki nowotworowe z nasiloną translacją GLUT1
pozwala zaspokoić głód energetyczny wynikający z zahamowania fosforylacji oksydacyjnej i niewydajnej glikolizy
w warunkach ograniczonych zasobów tlenu [71].
torem, który stymuluje elongację ogona poli(A) w trakcie
dojrzewania mRNA oraz pośredniczy w hamowaniu przedwczesnej translacji niedojrzałych cząsteczek mRNA, zawierających element CPE [75]. Element ten znajduje się za sygnałem poliadenylacji w 3’UTR (AAUAAA). W niedojrzałych oocytach żab, przed podziałem mejotycznym dominują hamujące kompleksy czapeczka-eIF4E-Maskina-CPEB-CPE, które ograniczają przedwczesną translację białek takich jak np. cyklina B. Fosforylacja CPEB jak również Maskiny w trakcie aktywacji końcowego etapu mejozy oocytów
żab, zmienia konformację kompleksu tych białek, prowadząc do przyłączenia dodatkowego białka CPSF z jednoczesnym uwolnieniem eIF4E, co w procesie dojrzewania komórek jajowych umożliwia utworzenie aktywnego translacyjnie kompleksu: 5’UTR-czapeczka-eIF4E-eIF4G-PABP-poli(A)-3’UTR [75,76]. Towarzyszy temu zamknięcie pętli
mRNA 5’-3’, które ułatwia kolejną inicjację translacji. Kompleks Maskiny powstaje prawdopodobnie w jądrze komórkowym w trakcie obróbki potranskrypcyjnej, której towarzyszy helikaza eIF4A3. Po zakończeniu składania pre-mRNA, eIF4A3 transportowana jest razem z mRNA do
cytoplazmy, gdzie w kompleksie z Maskiną reguluje translację [75] (Ryc. 5).
ISTNIENIE PRZEDZIAŁÓW KOMÓRKOWYCH
WPROWADZA DODATKOWY POZIOM
KONTROLI TRANSLACJI
W przedziałach cytoplazmatycznych, które umożliwiają
prowadzenie często przeciwstawnych procesów biochemicznych, translacja może być inicjowana i kontrolowana
Element AURE jest rozpoznawany przez wiele innych
białek, w tym białka stabilizujące HuR, destabilizujące
AUF1 jak również białka Ago2 i związane z nimi mikroRNA (np. Let-7) [37,72]. Zależne od mikroRNA wzmocnienie
lub wyciszenie translacji kontrolują dodatkowe czynniki
trans wiążące się z 3’ jak i 5’UTR [36,37].
ELEMENT CPE REKRUTUJE BIAŁKA HAMUJĄCE
PRZEDWCZESNĄ INICJACJĘ TRANSLACJI
Podobnie jak sekwencja DICE, element CPE (ang. Cytoplasmic Polyadenylation Element) opóźnia czas inicjacji translacji w procesie dojrzewania komórek. Mechanizm tej regulacji jest jednak nieco inny i polega na maskowaniu jednego
z czynników inicjacji translacji (Ryc. 5). W celu zablokowania translacji, białko CPEB wiążące się do elementu CPE rekrutuje Maskinę, która zawiera motyw oddziałujący z
eIF4E, podobny do tego, jakim dysponuje czynnik eIF4G
[75]. Maskina, która podobnie jak białko 4E-BP udaje czynnik eIF4G, może kompetycyjnie współzawodniczyć z eIF4G
o wiązanie eIF4E, co w konsekwencji prowadzi do ograniczenia dostępnej dla eIF4G puli eIF4E-czapeczka i zahamowania tworzenia kompleksu czapeczki 5’ z białkami kompleksu eIF4F [75]. Białko CPEB jest dwufunkcyjnym regula-
48
Rycina 5. Model kontroli aktywacji oraz inicjacji translacji przez Maskinę. A. Hamowanie inicjacji translacji przez Maskinę obejmuje jej podstawienie w miejscu
eukariotycznego czynnika inicjacji translacji eIF4G, co blokuje organizację kompleksu białek inicjujących translację, eIF4F (kremowe podświetlenie pola). eIF4G
może kompetycyjnie współzawodniczyć z Maskiną o dostęp do miejsca wiązania czynnika eIF4E, który rozpoznaje czapeczkę 5’ (m7G) na 5’ końcu mRNA.
W represji bierze udział także specyficzna rybonukleaza poli(A), PARN, która
uniemożliwia wydłużenie ogona poli(A). B. Inicjację translacji aktywuje fosforylacja białka CPEB jak również samej Maskiny, co prowadzi do: przegrupowania
czynników, związania białka CPSF rozpoznającego sygnał poliadenylacji (AAUAAA) oraz aktywacji polimerazy poli(A), Gld2. Jednocześnie, Maskina uwalnia
miejsce oddziaływania czynnika eIF4E z eIF4G i umożliwia formowanie pełnego
kompleksu eIF4F inicjującego proces translacji (rybosom – podjednostka 60S i
40S). W dalszej kolejności następuje przyłączenie białek PABP do ogona Poli(A) i
zamknięcie pętli mRNA, co zwiększa wydajność translacji m.in. przez ułatwienie
ponownego wiązania rybosomów. Kompleks Maskiny może zawierać także helikazę eIF4A3. Inne wyjaśnienia w tekście pracy.
przez różne mechanizmy prowadzące do zlokalizowanej
syntezy specyficznych białek i specjalizacji komórek [75,76].
W synapsach neuronów, białko wiążące się z poli(A),
CPEB kontroluje wydajność translacji w procesie cytoplazmatycznej poliadenylacji aktywowanych mRNA, dysponujących elementem CPE [75]. W neuronach, miejsce wiązania przez eIF4E czynnika eIF4G może być blokowane przez
komórkowe białko, neuroguidynę (NGDN), które wiążąc
się z eIF4E uniemożliwia utworzenie kompleksu czynników inicjacji translacji zależnej od czapeczki 5’ aksonów i
dendrytów [76].
W przeciwieństwie do frakcji cytoplazmatycznej, frakcja jądrowa hnRNP K może pośrednio sprzyjać translacji
zależnej od czapeczki 5’ przez zwiększanie wydajności
transkrypcji czynnika eIF4E wiążącego czapeczkę 5’ [67,77].
HnRNP K wiąże się do sekwencji poli-pirymidynowej
−25(TTACCCCCCCTT) w obrębie promotora EIF4E i aktywuje jego transkrypcję [77]. Podobnie, związanie tego białka
przez promotory protoonkogenów takich jak HIF1A, MYC
i SRC aktywuje ich transkrypcję [77]. Pozytywna regulacja
ekspresji tych genów wymaga obecności hnRNP K w jądrze
komórkowym, a więc może być ograniczana w stanie stresu
komórkowego, w którym dochodzi do translokacji hnRNP
K, jak również RBM4 do cytoplazmy, gdzie białka te mogą
uczestniczyć w hamowaniu klasycznego mechanizmu
translacji [25,67].
Kompartmentalizacja komórek umożliwia jednoczesne
hamowanie i aktywację syntezy specyficznych białek w
różnych przedziałach pojedynczej komórki. W regulacji
tej kluczową rolę odgrywa lokalizacja czynników inicjacji
translacji oraz innych białek wiążących RNA [67,76].
BIOMEDYCZNE IMPLIKACJE ALTERNATYWNYCH
MECHANIZMÓW INICJACJI TRANSLACJI
Poznanie mechanizmów kontroli translacji może pomóc
w zrozumieniu przyczyn wzrostu lekooporności nowotworów. Proces ten powiązano jak dotąd ze wzrostem poziomu
białek krypt komórkowych (MVP/LRP), zwiększoną aktywnością glikoproteiny P oraz białek posiadających kasetę wiążącą ATP, w tym z rodziny ABC [78]. Stosowane w
onkologii inhibitory mTOR mają na celu m.in. zahamowanie translacji nowotworów przez zablokowanie fosforylacji
białek efektorowych 4E-BP i p70S6K (Ryc. 1, H1 i H2). Nieufosforylowane 4E-BP wiążą czynnik eIF4E blokując miejsce wiązania eIF4G, podczas gdy brak fosforylacji p70S6K
prowadzi do asocjacji tej kinazy z czynnikiem eIF3, hamując tym samym inicjację translacji zależnej od czapeczki 5’
[71,79]. Zablokowanie sygnału na szlaku mTOR przez rapamycynę lub stan hipoksji nie musi mieć wpływu na wydajną translację białek kodowanych przez cząsteczki mRNA,
które posiadają element rHRE (tj. EGFR) [17]. Wyniki badań
aktywności kompleksu HIF-2α-RBM4-eIF4E2 inicjującego
translację zależną od rHRE potwierdziły, że rapamycyna
nie hamuje czynnika eIF4E2 [18], który w warunkach hipoksji, umożliwia wydajną syntezę specyficznych białek
(Ryc. 4) [17]. W przeciwieństwie do eIF4E (eIF4E1), czynnik eIF4E2 nie dysponuje miejscem wiązania eIF4G [63], co
uniezależnia inicjację translacji od klasycznego kompleksu
inicjacyjnego eIF4F, jak również mechanizmów kontroli
translacji przez mTOR/4E-BP1/eIF4E1/eiF4G oraz mTOR/
p70S6K/eIF3/eiF4G [18,79]. Mechanizm inicjacji translacji
zależnej od rHRE może odpowiadać na pytanie w jaki sposób w warunkach hipoksji syntetyzowane są białka, których
translacja teoretycznie jest niemożliwa z powodu braku elementów IRES [18,19].
Wysoki poziom syntezy specyficznych białek obserwuje
się w hipertrofii mięśni szkieletowych [80] w odpowiedzi
na stres mechaniczny i towarzyszącą mu cykliczną hipoksję
mięśni [11,80]. Intensywne ćwiczenia fizyczne mogą prowadzić do chwilowego wyczerpania lokalnych rezerw tlenowych [11], a w konsekwencji zmiany profilu syntezy białek
[9]. W dłuższym okresie, dochodzi do adaptacji polegającej
na zmianie składu włókien miozynowych [9,80]. W komórkach mięśni szkieletowych i serca, produkcja białka wiążącego rHRE, RBM4 utrzymywana jest na wysokim poziomie
[25,66]. Wykazano, że RBM4 hamuje translację zależną od
czapeczki 5’, włączając jednocześnie syntezę inicjowaną
przez aktywny w hipoksji element IRES [27,67], co może
wskazywać na jego potencjalne znaczenie w medycynie
sportowej.
Podobnie, zmienność przepływu krwi w guzach nowotworowych może prowadzić do cyklicznych zmian ciśnienia parcjalnego tlenu i stresu komórkowego związanego z
cykliczną hipoksją [81], przyspieszając angiogenezę i zwiększając zdolność do przerzutowania komórek [82]. W warunkach anoksji, w polisomach obserwuje się zwiększenie poziomu czynnika ATF4, który może uruchamiać odpowiedź
adaptacyjną [39,50]. Niedotlenienie stabilizuje także czynniki HIF-1α i HIF-2α, niemniej ich wpływ na syntezę i funkcję
c-Myc jest przeciwstawny, co w hipoksji może prowadzić
do zależnego od HIF-1α zatrzymania (G1/S) cyklu komórkowego lub jego progresji i przyspieszenia proliferacji komórek przez HIF-2α [83,42]. W kontekście jednak mechanizmu inicjacji translacji zależnej od elementu rHRE i HIF-2α
[17], wzmocnienie aktywności transkrypcyjnej c-Myc przez
HIF-2α w hipoksji może wynikać nie tylko z jego stabilizacji, ale także ze zwiększenia wydajności syntezy tego białka.
Jednocześnie, towarzyszące niedotlenieniu zaburzenie wewnątrzkomórkowej homeostazy żelaza może dodatkowo
wpływać na wydajność regulowanej przez IRE/IRP1 syntezy HIF-2α, niezależnie od kontroli PHD/VHL [57].
W mysim modelu przeszczepu obcogatunkowego (ksenograftów) ludzkich komórek raka piersi MDA-MB-231 i
komórek zrębu wykazano, że wzrost zawartości HIF-1α w
fibroblastach związanych z nowotworami promuje wzrost
guzów, natomiast HIF-2α nie ma wpływu na ich wzrost
[84]. Aktywacja HIF-1α w fibroblastach zahamowała fosforylację oksydacyjną i uruchomiła proces glikolizy tlenowej,
której towarzyszyło nasilone pobieranie glukozy, glutaminy oraz zwiększone uwalnianie kwasu mlekowego, odżywiającego następnie komórki nowotworowe [84]. Jednocześnie, w fibroblastach z aktywowanym HIF-1α zaobserwowano obniżenie syntezy białka PI3K i transportera MCT1,
któremu towarzyszył wzrost ekspresji MCT4 [84]. Przepływ
substancji odżywczych z glikolitycznych komórek zrębu do
nabłonkowych komórek raka piersi przypominał fizjologiczny proces metabolicznej współpracy pomiędzy astrocy-
49
tami i neuronami mózgu jak również transport kwasu mlekowego między szybkimi i wolnymi włóknami mięśni
szkieletowych [11,84]. Zależne od transportera MCT4 uwalnianie mleczanu produkowanego przez astrocyty wspomaga fosforylację oksydacyjną w mitochondriach neuronów,
pobierających mleczan z otoczenia przez MCT1 [84]. Podobny transport mleczanu obserwuje się między szybkimi, glikolitycznymi włóknami mięśniowymi typu IIB (charakteryzującymi się obecnością MCT4) i wolnymi oksydacyjnymi
włóknami typu I (MCT1), gdzie mleczan podtrzymuje fosforylację oksydacyjną w MCT1-pozytywnych mięśniach
[11,84]. Komórki tworzące mikrośrodowisko guza mogą
Rycina 6. Model przełączania mechanizmów inicjacji translacji zależnej od czapeczki 5’ i uORF. Alternatywne mechanizmy: inicjacji translacji zależnej od czapeczki 5’ (A) oraz elementów uORF (C), przełączane są przez kinazy aktywowane w stresie komórkowym (B), które fosforylują eIF2α (przełącznik), co zostało
przedstawione w uproszczeniu, przez analogię do skoków narciarskich. A. W
warunkach optymalnych (bez stresu komórkowego) w cytoplazmie prowadzona
jest wydajna, klasyczna translacja zależna od czapeczki 5’, którą charakteryzuje szybkie skanowanie 5’UTR (V↑) na sekwencji od uORF-1 (belka startowa) do
uORF-2 (próg skoczni). Zbyt duża prędkość skanowania aparatu translacyjnego
(skoczek narciarski), zawierającego rybosom oraz inne czynniki inicjacji translacji
(w tym eIF2α) powoduje wejście w nieprawidłową ramkę odczytu (próg skoczni)
i wybicie tego aparatu z elementu uORF-2 (z progu) poza sekwencję właściwej
ramki odczytu (ORF, znajdującej się tuż pod progiem), co uniemożliwia syntezę
białka czynnika transkrypcyjnego ATF4 (blokada). B. Warunki indukujące stres
komórkowy tj. hipoksja (O2↓), niski poziom glukozy (Gluk.↓), aminokwasów
(A.K↓), hemu (Hem↓), pojawienie się dwuniciowego, zwykle wirusowego RNA
(dsRNA↑). Warunki te aktywują odpowiednie kinazy eIF2α (B) tj. PERK, GCN2,
HRI, PKR, które fosforylują (P) serynę 51 (Ser51-◌) podjednostki alfa eIF2α, blokując w ten sposób klasyczny mechanizm inicjacji translacji zależnej od czapeczki
5’ i umożliwiając uruchomienie alternatywnego mechanizmu zależnego od elementu uORF (C) lub omówionych wcześniej elementów rHRE, IRES. Trans-ISRIB
(ang. Integrated Stress Response Inhibitor — Bis-glycolamide) hamuje zintegrowaną
odpowiedź na stres (IRS), uruchamianą przez fosforylację czynnika eIF2α. ISRIB
zwiększa stężenie kompleksu TC, przywraca translację zależną od czapeczki 5’ i
hamuje syntezę ATF4. . Stres komórkowy może uruchamiać mechanizm inicjacji
translacji zależnej od obecności alternatywnych ramek odczytu uORF (uORF-1,
uORF-2), położonych powyżej (w kierunku 5’) właściwej ramki odczytu (ORF).
Fosforylacja eIF2α (przełącznika) zwalnia skanowanie 5’UTR (V↓), tak, że aparat
translacyjny (skoczek) nie może wybić się z elementu uORF-2 i ślizgiem w dół
sekwencji dociera do punktu właściwego kodonu start (znajdującego się tuż pod
progiem skoczni). Spowolnienie częstości reinicjacji i ograniczona dostępność
kompleksu TC (Ryc.1.) umożliwiają przejście aparatu translacyjnego (zawierającego małą podjednostkę rybosomu 40S) przez uORF-2 z pominięciem składania
całego rybosomu na tym elemencie. Warunki stresu wiążą się z ograniczeniami zasobów energetycznych komórek (dostępności ATP), które odpowiadają
za spowolnienie szybkości skanowania i asocjacji całego rybosomu na uORF-2.
Pominięcie uORF-2 zwiększa częstość składania rybosomu (80S) w miejscu start
właściwej ramki odczytu (ORF). Dalsza elongacja prowadzi do syntezy kompletnego białka ATF4. Wydajność produkcji tego czynnika w stresie komórkowym
zwiększa się wielokrotnie, co umożliwia uruchomienie dalszych etapów zależnej
od ATF4 odpowiedzi na stres. Inne wyjaśnienia w tekście pracy.
50
wspomagać metabolizm nowotworów [84], ułatwiać przejście epitelialno-mezenchymalne (EMT) [85], jak również
stymulować ich migrację [86]. Z drugiej strony, zwiększony
poziom HIF-1α w komórkach MDA-MB-231 istotnie ograniczył wzrost ognisk nowotworowych (efekt supresji), podczas gdy aktywacja HIF-2α promowała wzrost guzów, w
których zaobserwowano zwiększenie wydajności fosforylacji oksydacyjnej jak również podniesienie poziomu produkcji białek EGFR, Ras, cykliny D1 i c-Myc [84]. Jakkolwiek
autorzy pracy zastrzegają, że opracowany przez nich mechanizm regulacji może przebiegać odmiennie w innych typach nowotworów [84], podkreśla on znaczenie HIF-2α w
progresji nowotworów (in vivo), w której może pełnić funkcję czynnika inicjacji translacji [18].
W guzach litych, translacja zależna od rHRE może ułatwiać selektywny wzrost wydajności syntezy specyficznych
białek tj. EGFR [17,81]. W 30-50% przypadków glejaka wielopostaciowego (GBM), obserwuje się zwiększoną syntezę
receptora EGFR [87,88]. Sugeruje się, że amplifikacja tego
genu oraz poziom syntezy jego białka koreluje ze stopniem
złośliwości glejaków [88]. Ponadto, w badaniach ekspresji
zmutowanego wariantu mRNA EGFRvIII wykazano większą częstość występowania tej zmiany u pacjentów powyżej
50 roku życia (48,6%) w porównaniu z młodszymi pacjentami (23,5%) [88]. Wyniki te wskazują na odmienne mechanizmy prowadzące do zaburzeń na różnych poziomach syntezy tego receptora, co sugeruje konieczność personalizacji
postępowania terapeutycznego [87,88]. Na poziomie syntezy białka EGFR, testowano skuteczność blokowania tego
receptora przez przeciwciała (cetuksymab, nimotuzumab),
które prócz hamowania transdukcji sygnału miały zwiększać wrażliwość komórek nowotworowych na działanie
promieniowania jonizującego [89]. Niemniej, ze względu na
obecność bariery krew-mózg skuteczność tych przeciwciał
in vivo nie została jednoznacznie wykazana [89]. W leczeniu
glejaka obiecujące wydaje się zastosowanie małych cząsteczek siRNA, które uruchamiają zjawisko interferencji RNA
(RNAi), uniemożliwiając syntezę białek receptorów takich
jak EGFR, VEGF, PDGF TGFβRII [89,90]. Punktem uchwytu
nowych leków może być również translacja białek uczestniczących w sygnalizacji międzykomórkowej za pośrednictwem TGFβ -TGFβRII [90]. Jak wykazano, komórki mikrogleju przyciągane przez złośliwe formy glejaka mogą uwalniać TGFβ, który za pośrednictwem receptora TGFβRII,
parakrynnie stymuluje inwazję glejaka [90]. Sygnał ten
może być przerwany przed translacją przez zastosowanie
siRNA→TGFβRII [90].
W glejakach wielopostaciowych, niskocząsteczkowe inhibitory kinazy tyrozynowej receptora EGFR takie jak erlotynib i gefitynib mogą skutecznie hamować translację aktywowaną na szlaku PI3K(p85)/ Akt/ mTOR [89]. Wykazano
jednak, że dłuższe stosowanie tych inhibitorów prowadzi
do wzrostu oporności [89] i podniesienia syntezy EGFR,
niezależnie od zahamowania mTOR [89,78]. Zgodnie z modelem translacji zależnej od rHRE, inhibitory szlaku mTOR
nie mogą trwale hamować translacji receptora EGFR z powodu naturalnej niewrażliwości tego mechanizmu syntezy
na fosforylację mTOR. Prawdopodobnie, w trakcie nabywania oporności przez komórki nowotworowe, może dochodzić do aktywacji alternatywnego mechanizmu, zastępuwww.postepybiochemii.pl
jącego klasyczną inicjację translacji, hamowaną przez brak
fosforylacji mTOR [17,18]. Podobny model przełączania
mechanizmów syntezy białek opisano w hipoksji i przeprogramowaniu metabolicznym nowotworów, gdzie obserwowano wyłączanie translacji zależnej od czapeczki 5’
i włączanie syntezy inicjowanej przez IRES [4]. Kompleks
HIF-2α-RBM4-eIF4E2 mógłby brać udział w nabywaniu
oporności na leki ukierunkowane molekularnie, prowadząc
w hipoksji do wydajnej translacji specyficznych białek, niezależnie od inhibitorów szlaku mTOR. Chociaż mechanizm
ten wskazuje na potrzebę rewizji dotychczasowych hipotez
dotyczących procesu nabywania lekooporności, wymaga
on jednak dalszych badań, ustalenia wszystkich czynników
wiążących rHRE oraz warunków inicjacji tej translacji.
Mimo klinicznie wykazanej aktywności inhibitorów receptorów VEGFR, PDGFR (TKI-VEGFR), stosowanych zarówno w pierwszej linii terapii (pazopanib i sunitynib), jak i
drugiej (po zastosowaniu cytokin), u większości chorych po
pewnym czasie rozwija się oporność na te leki [91]. Podobnie, zarejestrowany lek nowej generacji ewerolimus, stosowany po niepowodzeniu terapii TKI-VEGFR, może być
również nieskuteczny w leczeniu przerzutującego raka nerki opornego na inhibitory mTOR [91]. Jak wykazano w raku
prostaty, ta pochodna rapamycyny może wytwarzać oporność przez zwiększenie produkcji kompleksu cdk1-cyklina
B, co w cyklu komórkowym umożliwia przejście G2/M
[92]. Wzrost oporności na inhibitory szlaków VEGF i mTOR
stwierdzono u pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym
typu jasnokomórkowego [93]. W tym przypadku, wyłączenie klasycznej inicjacji translacji zależnej od czapeczki 5’
może uruchamiać mechanizm syntezy alternatywnej, inicjowanej przez elementy IRES-A oraz IRES-B [56] lub inny,
niezwiązany z IRES mechanizm translacji [50]. Niezależna
od szlaku PI3K/AKT/mTOR aktywacja RAS/RAF/MEK/
ERK może stanowić dodatkowy czynnik rozwoju oporności
na inhibitory kinazy tyrozynowej VEGFR w RCC [79].
Inna pochodna rapamycyny, RAD001, pomimo skutecznego blokowania fosforylacji kompleksu mTORC1, nie hamuje syntezy białek i proliferacji komórek AML w ostrej
białaczce mieloblastycznej [94], co sugeruje, że translacja
w tych komórkach może być inicjowana w sposób alternatywny [94]. Autorzy pracy proponują jednak mechanizm,
w którym kinaza Pim-2 mogłaby niezależnie od mTOR
przeprowadzać fosforylację Ser65 białka 4E-BP-1 (PHAS-I), umożliwiając tym samym aktywację klasycznej inicjacji
translacji. Zaproponowany mechanizm nie wyjaśnia jednak fosforylacji miejsc Thr37 Thr46 4E-BP-1, które fosforyluje mTOR (tu zahamowany przez RAD001). Ta zależna od
mTOR fosforylacja jest wymagana przed dalszą fosforylacją
Ser65 i Thr70, która umożliwia odblokowanie eIF4E i uruchomienie syntezy zależnej od czapeczki 5’ [5].
Rozwijana w wielu nowotworach oporność na inhibitory
mTOR może być związana z obchodzeniem tego szlaku i
aktywacją alternatywnych ścieżek sygnałowych, prowadzą-
cych do konstytutywnej fosforylacji 4E-BP-1 lub zwiększonej zawartości eIF4E1 [78,95]. Z drugiej strony, w ludzkiej
linii SKRC-39 raka nerkowokomórkowego typu brodawkowatego, charakteryzującego się podniesionym poziomem
eIF4E1, wykazano skuteczne zahamowanie wzrostu z wykorzystaniem jedynie rapamycyny [96]. Wyniki te wskazują, że zwiększona zawartość czynnika eIF4E1 może nie
wystarczać do niezależnego od mTOR podniesienia wydajności translacji. HIF-1α wpływa na zwiększenie zawartości
eIF4E1, chociaż hipoksja podnosi poziom zarówno eIF4E1
jak i eIF4E2 [50]. Wyciszenie HIF-1α obniża poziom eIF4E1,
ale nie wpływa na zawartość eIF4E2 [50], co sugeruje, że w
różnych typach nowotworów, wykazujących różny poziom
HIF-1α/2α, translacja może być odmiennie regulowana. W
warunkach niedotlenienia, które prowadzi do zahamowania mTOR, komórki ze zwiększony poziom HIF-2α mogłyby prowadzić wydajną translację inicjowaną w obecności
elementu rHRE [17], podczas gdy komórki z podniesionym
poziomem HIF-1α mogłyby utrzymywać klasyczną translację przez zależne od HIF-1α zwiększenie poziomu eIF4E1
[50]. Mechanizm ten wymagać może dodatkowych czynników inicjacji translacji, hamowanej w hipoksji przez fosforylację eIF2α (Ryc. 1) [42,96].
Skutecznym punktem uchwytu wydają się również
miejsca, które nie mogą być pominięte w trakcie inicjacji
translacji. Interesującym przykładem takiego podejścia jest
wykorzystanie małej cząsteczki 4EGI-1 [96], która imitując
aktywność nieufosforylowanego białka 4E-BP, hamuje oddziaływanie eIF4E-eIF4G i wyłącza klasyczną translację zależną od czapeczki 5’ (Ryc. 1). Miejsce wiązania przez eIF4E
czynnika eIF4G pełni funkcję punktu kontroli inicjacji translacji zależnej od czapeczki 5’ (Ryc. 1), a jego zablokowanie
obniża translację białek protoonkogenów takich jak c-Myc,
cykliny D1 [94] i aktywuje apoptozę w szpiczaku mnogim
[96]. Ten sam punkt uchwytu wykorzystywany jest przez
neurony w zależnej od białka Ngd kontroli zlokalizowanej
translacji w zakończeniach neuronów i filopodiach [76], jak
również przez wirusy takie jak polio, które na początku infekcji odcinają fragment eIF4G, co uniemożliwia oddziaływanie z eIF4E i wyłącza translację białek zainfekowanych
komórek [49]. Polio fosforyluje dodatkowo podjednostkę
α czynnika eIF2, włączając tym samym translację zależną
od IRES, która umożliwia syntezę jego białek [15,47]. Wirus
grypy pozyskuje czapeczkę 5’ przez jej przejęcie od innych
komórkowych mRNA [97]. Przykłady te ilustrują efekty kilku miliardów lat ewolucji życia na ziemi, które doprowadziły do weryfikacji najbardziej skutecznych metod kontroli
syntezy białek.
PODSUMOWANIE
Wydajność syntezy białek zależy głównie od etapu inicjacji translacji, która może być uruchamiana na kilka różnych
sposobów. Najbardziej widocznym przejawem tej kontroli
jest obserwowany w wielu badaniach brak korelacji między
poziomem białka i jego mRNA. Mechanizm inicjacji translacji zależnej od rHRE może wpływać na procesy takie jak:
angiogeneza, miogeneza, regeneracja, gojenie ran, sprzyjając także powstaniu odpowiedzi adaptacyjnej w chorobach
sercowo-naczyniowych i neurodegeneracyjnych. Element
rHRE może również ułatwiać wydajną translację specy-
51
ficznych białek w procesach nowotworowych. Dominujący
mechanizm syntezy białek zależy od typu oraz fazy rozwoju nowotworów, które na etapie promocji wymagać mogą
aktywacji mechanizmów translacji inicjowanej niezależnie
od czapeczki 5’, natomiast dalsza progresja nowotworów
może zależeć od wydajnej syntezy, inicjowanej przez rHRE
lub klasyczny mechanizm translacji. Właściwe rozpoznanie
tych mechanizmów wydaje się zatem warunkować skuteczność leków ukierunkowanych molekularnie.
PIŚMIENNICTWO
1. Myasnikov AG, Simonetti A, Marzi S, Klaholz BP (2009) Structure-function insights into prokaryotic and eukaryotic translation initiation. Curr Opin Struct Biol 19: 300-309
2. Mathews MB, Sonenberg N, Hershey JWB (2007) Translational control
in Biology and Medicine. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New
York, str. 1-35, 87-128, 155-172, 269-296, 345-368, 401-433, 855-870
3. Kasinath BS, Feliers D, Sataranatarajan K, Ghosh Choudhury G, Lee
MJ, Mariappan MM (2009) Regulation of mRNA translation in renal
physiology and disease. Am J Physiol Renal Physiol 297: F1153-1165
4. Silvera D, Formenti SC, Schneider RJ (2010) Translational control in
cancer. Nat Rev Cancer 10: 254-266
5. Jackson RJ, Hellen CU, Pestova TV (2010) The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol
Cell Biol 11: 113-127
6. Spriggs KA, Stoneley M, Bushell M, Willis AE (2008) Re-programming
of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to
predominate. Biol Cell 100: 27-38
7. Jazwa A, Tomczyk M, Taha HM, Hytonen E, Stoszko M, Zentilin L,
Giacca M, Yla-Herttuala S, Emanueli C, Jozkowicz A, Dulak J (2013)
Arteriogenic therapy based on simultaneous delivery of VEGF-A and
FGF4 genes improves the recovery from acute limb ischemia. Vasc
Cell 5: 13
16.Singleton DC, Harris AL (2012) Targeting the ATF4 pathway in cancer
therapy. Expert Opin Ther Targets 16: 1189-202
17.Uniacke J, Holterman CE, Lachance G, Franovic A, Jacob MD, Fabian
MR, Payette J, Holcik M, Pause A, Lee S (2012) An oxygen-regulated
switch in the protein synthesis machinery. Nature 486: 126-129
18.Gebauer F (2012) Versatility of the translational machinery during
stress: changing partners to keep dancing. Cell Res 22: 1634-1636
19.Szostak E, Gebauer F (2013) Translational control by 3’-UTR-binding
proteins. Brief Funct Genomics 12: 58-65
20.Almeida B, Fernandes S, Abreu IA, Macedo-Ribeiro S (2013) Trinucleotide repeats: a structural perspective. Front Neurol 4: 76
21.Bisio A, Nasti S, Jordan JJ, Gargiulo S, Pastorino L, Provenzani A,
Quattrone A, Queirolo P, Bianchi-Scarrà G, Ghiorzo P, Inga A (2010)
Functional analysis of CDKN2A/p16INK4a 5’-UTR variants predisposing to melanoma. Hum Mol Genet 19: 1479-1491
22.Kazan H, Ray D, Chan ET, Hughes TR, Morris Q (2010) RNAcontext:
a new method for learning the sequence and structure binding preferences of RNA-binding proteins. PLoS Comput Biol 6: e1000832
23.Budiman ME, Bubenik JL, Driscoll DM (2011) Identification of a signature motif for the eIF4a3-SECIS interaction. Nucleic Acids Res 39:
7730-7739
24.Lewis SM, Holcik M (2008) For IRES trans-acting factors, it is all about
location. Oncogene 27: 1033-1035
25.Lin JC, Tarn WY (2009) RNA-binding motif protein 4 translocates to
cytoplasmic granules and suppresses translation via argonaute2 during muscle cell differentiation. J Biol Chem 284: 34658-34665
26.Komar AA, Hatzoglou M (2011) Cellular IRES-mediated translation:
the war of ITAFs in pathophysiological state. Cell Cycle 10: 229-40
27.Master A, Nauman A (2014) Regulacja ekspresji genów przez długie
naturalnie występujące antysensowne transkrypty. Postepy Biol Kom,
praca w druku
28.Biro JC (2008) Correlation between nucleotide composition and folding energy of coding sequences with special attention to wobble bases.
Theor Biol Med Model 5: 14
8. Melo A, Monteiro L, Lima RM, Oliveira DM, Cerqueira MD, El-Bachá
RS (2013) Oxidative stress in neurodegenerative diseases: mechanisms
and therapeutic perspectives. Oxid Med Cell Longev 2011: 467180
29.Schwartz JC, Younger ST, Nguyen NB, Hardy DB, Monia BP, Corey
DR, Janowski BA (2008) Antisense transcripts are targets for activating
small RNAs. Nat Struct Mol Biol 15: 842-848
9. Muaddi H, Majumder M, Peidis P, Papadakis AI, Holcik M, Scheuner
D, Kaufman RJ, Hatzoglou M, Koromilas AE (2013) Phosphorylation
of eIF2α at serine 51 is an important determinant of cell survival and
adaptation to glucose deficiency. Mol Biol Cell 21: 3220-3231
30.Faghihi MA, Wahlestedt C (2009) Regulatory roles of natural antisense
transcripts. Nat Rev Mol Cell Biol 10: 637-643
10.Stachurska A, Florczyk U, Józkowicz A, Dulak J, Łoboda A (2010)
Nowe oblicza czynników indukowanych przez hipoksje: HIF-1 i HIF2 a stres oksydacyjny. Postepy Biochem 56: 156-164
32.Master A, Nauman A (2014) Genomowy kontekst i regulacja ekspresji
receptorów hormonu tarczycy przez długie naturalnie występujące
antysensowne transkrypty. Postepy Biol Kom, praca w druku
11.Mounier R, Pedersen BK, Plomgaard P (2013) Muscle-specific expression of hypoxia-inducible factor in human skeletal muscle. Exp Physiol 95: 899-907
12.Terman DS, Viglianti BL, Zennadi R, Fels D, Boruta RJ, Yuan H, Dreher MR, Grant G, Rabbani ZN, Moon E, Lan L, Eble J, Cao Y, Sorg B,
Ashcraft K, Palmer G, Telen MJ, Dewhirst MW (2013) Sickle erythrocytes target cytotoxics to hypoxic tumor microvessels and potentiate a
tumoricidal response. PLoS One 8: e52543
13.Huret JL, Ahmad M, Arsaban M, Bernheim A, Cigna J, Desangles F,
Guignard JC, Jacquemot-Perbal MC, Labarussias M, Leberre V, Malo
A, Morel-Pair C, Mossafa H, Potier JC, Texier G, Viguié F, Yau Chun
Wan-Senon S, Zasadzinski A, Dessen P (2013) Atlas of genetics and
cytogenetics in oncology and haematology in 2013. Nucleic Acids Res
41: D920-924
14.Sidrauski C, Acosta-Alvear D, Khoutorsky A, Vedantham P, Hearn
BR, Li H, Gamache K, Gallagher CM, Ang KK, Wilson C, Okreglak V,
Ashkenazi A, Hann B, Nader K, Arkin MR, Renslo AR, Sonenberg N,
Walter P (2013) Pharmacological brake-release of mRNA translation
enhances cognitive memory. Elife 2: e00498
15.Błaszczyk L, Dutkiewicz M, Ciesiołka J (2007) Proces translacji zachodzący niezależnie od obecności kapu na końcu 5’ eukariotycznych
mRNA. Postepy Biochem 53: 400-412
52
31.Stepniewski J, Józkowicz A, Dulak J (2013) Rola mikroRNA w reprogramowaniu komórek. Postepy Biochem 59: 157-163
33.Buske FA, Mattick JS, Bailey TL (2011) Potential in vivo roles of nucleic
acid triple-helices. RNA Biol 8: 427-439
34.Bugaut A, Balasubramanian S (2012) 5’-UTR RNA G-quadruplexes:
translation regulation and targeting. Nucleic Acids Res 40: 4727-41
35.Parsyan A, Svitkin Y, Shahbazian D, Gkogkas C, Lasko P, Merrick WC,
Sonenberg N (2011) mRNA helicases: the tacticians of translational
control. Nat Rev Mol Cell Biol 12: 235-245
36.Meijer HA, Kong YW, Lu WT, Wilczynska A, Spriggs RV, Robinson
SW, Godfrey JD, Willis AE, Bushell M (2013) Translational repression
and eIF4A2 activity are critical for microRNA-mediated gene regulation. Science 340: 82-85
37.Miller JE, Reese JC (2012) Ccr4-Not complex: the control freak of eukaryotic cells. Crit Rev Biochem Mol Biol 47: 315-333
38.Wiszomirska H, Piekiełko-Witkowska A, Nauman A (2011) Zaburzenia różnicowego składania pierwotnego transkryptu w kancerogenezie. Postepy Biochem 57: 257-265
39.Palam LR, Baird TD, Wek RC (2011) Phosphorylation of eIF2 facilitates
ribosomal bypass of an inhibitory upstream ORF to enhance CHOP
translation. J Biol Chem 286: 10939-10949
40.Dinman JD (2012) Mechanisms and implications of programmed
Translational frameshifting. Wiley Interdiscip Rev RNA 3: 661-673
41.Kutner J (2007) Terminacja translacji u Prokaryota i Eukaryota. Postepy Biochem 53: 420-430
61.Loboda A, Jozkowicz A, Dulak J (2010) HIF-1 and HIF-2 transcription
factors - similar but not identical. Mol Cells 29: 435-442
42.Wouters BG, Koritzinsky M (2008) Hypoxia signalling through mTOR
and the unfolded protein response in cancer. Nat Rev Cancer 8: 851864
62.Yi X et al (2010) Sequencing of 50 human exomes reveals adaptation to
high altitude. Science 329: 75-78
43.Lukat-Rodgers GS, Correia C, Botuyan MV, Mer G, Rodgers KR (2010)
Heme-based sensing by the mammalian circadian protein CLOCK. Inorg Chem 49: 6349-6365
44.Thakor N, Holcik M (2012) IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2α- independent manner during stress.
Nucleic Acids Res 40: 541-552
45.Zhou D, Palam LR, Jiang L, Narasimhan J, Staschke KA, Wek RC
(2008) Phosphorylation of eIF2 directs ATF5 translational control in
response to diverse stress conditions. J Biol Chem 283: 7064-7073
46.Master A, Wójcicka A, Piekiełko-Witkowska A, Bogusławska J,
Popławski P, Tański Z, Darras VM, Williams GR, Nauman A (2010)
Untranslated regions of Thyroid hormone receptor beta 1 mRNA are
impaired in human clear cell renal cell carcinoma. Biochim Biophys
Acta 1802: 995-1005
47.Balvay L, Soto Rifo R, Ricci EP, Decimo D, Ohlmann T (2009) Structural and functional diversity of viral IRESes. Biochim Biophys Acta
1789: 542-57
48.Plank TD, Kieft JS (2012) The structures of nonprotein-coding RNAs
that drive internal ribosome entry site function. Wiley Interdiscip Rev
RNA 3: 195-212
49.Xia X, Holcik M (2009) Strong eukaryotic IRESs have weak secondary
structure. PLoS One 4: e4136
50.Yi T, Papadopoulos E, Hagner PR, Wagner G (2013) Hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) promotes cap-dependent translation of selective mRNAs through up-regulating initiation factor eIF4E1 in breast
cancer cells under hypoxia conditions. J Biol Chem 288: 18732-18742
51.Spriggs KA, Cobbold LC, Jopling CL, Cooper RE, Wilson LA, Stoneley
M, Coldwell MJ, Poncet D, Shen YC, Morley SJ, Bushell M, Willis AE
(2009) Canonical initiation factor requirements of the Myc family of
internal ribosome entry segments. Mol Cell Biol 29: 1565-1574
52.Meng Z, Jackson NL, Shcherbakov OD, Choi H, Blume SW (2010) The
human IGF1R IRES likely operates through a Shine-Dalgarno-like interaction with the G961 loop (E-site) of the 18S rRNA and is kinetically
modulated by a naturally polymorphic polyU loop. J Cell Biochem
110: 531-544
53.Allam H, Ali M (2010) Initiation factor eIF2-independent mode of c-Src
mRNA translation occurs via an internal ribosome entry site. J Biol
Chem 285: 5713-5725
54.Skabkin MA, Skabkina OV, Dhote V, Komar AA, Hellen CU, Pestova
TV (2010) Activities of Ligatin and MCT-1/DENR in eukaryotic translation initiation and ribosomal recycling. Genes Dev 24: 1787-1801
55.Silvera D, Schneider RJ (2009) Inflammatory breast cancer cells are
constitutively adapted to hypoxia. Cell Cycle 8: 3091-3096
56.Bastide A, Karaa Z, Bornes S, Hieblot C, Lacazette E, Prats H, Touriol
C (2008) An upstream open reading frame within an IRES controls
expression of a specific VEGF-A isoform. Nucleic Acids Res 36: 24342445
57.Wilkinson N, Pantopoulos K (2013) IRP1 regulates erythropoiesis and
systemic iron homeostasis by controlling HIF-2α mRNA translation.
Blood 122: 1658-1668
58.Sourbier C, Srivastava G, Ghosh MC, Ghosh S, Yang Y, Gupta G, Degraff W, Krishna MC, Mitchell JB, Rouault TA, Linehan WM (2012)
Targeting HIF-2α translation with Tempol in VHL-deficient clear cell
renal cell carcinoma. Oncotarget 3: 1472-1482
63.Okumura F, Zou W, Zhang DE (2007) ISG15 modification of the eIF4E
cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes
Dev 21: 255-260
64.Kubacka D, Kamenska A, Broomhead H, Minshall N, Darzynkiewicz
E, Standart N (2013) Investigating the consequences of eIF4E2 (4EHP)
interaction with 4E-transporter on its cellular distribution in HeLa
cells. PLoS One 8: e72761
65.Morita M, Ler LW, Fabian MR, Siddiqui N, Mullin M, Henderson VC,
Alain T, Fonseca BD, Karashchuk G, Bennett CF, Kabuta T, Higashi S,
Larsson O, TopisirovicI, Smith RJ, Gingras AC, Sonenberg N (2012) A
novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for
mammalian development. Mol Cell Biol 32: 3585-3593
66.Lin JC, Tarn WY (2012) Multiple roles of RBM4 in muscle cell differentiation. Front Biosci (Schol Ed) 4: 181-189
67.Lin JC, Hsu M, Tarn WY (2007) Cell stress modulates the function
of splicing regulatory protein RBM4 in translation control. Proc Natl
Acad Sci USA 104: 2235-2240
68.Mikula M, Bomsztyk K, Goryca K, Chojnowski K, Ostrowski J (2013)
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (HnRNP) K genome-wide
binding survey reveals its role in regulating 3’-end RNA processing
and transcription termination at the early growth response 1 (EGR1)
gene through XRN2 exonuclease. J Biol Chem 288: 24788-24798
69.Ostrowski J (2011) Białko hnRNPK – wielofunkcyjna platforma integrująca sygnalizację komórkową. Postępy Pol Med Farm 1: 27-23
70.Naarmann-de Vries IS, Urlaub H, Ostareck DH, Ostareck-Lederer A
(2013) Caspase-3 cleaves hnRNP K in erythroid differentiation. Cell
Death Dis 4: e548
71.Jóźwiak P, Lipińska A (2012) Rola transportera glukozy 1 (GLUT1) w
diagnostyce i terapii nowotworów. Postepy Hig Med Dosw (Online)
66: 165-174
72.Stellato C (2012) Posttranscriptional gene regulation: novel pathways
for glucocorticoids’ anti-inflammatory action. Transl Med UniSa 3: 6773
73.Puzianowska-Kuznicka M, Pawlik-Pachucka E, Owczarz M,
Budzińska M, Polosak J (2013) Small-molecule hormones: molecular mechanisms of action. Int J Endocrinol 2013; 2013: 601246 doi
10.1155/2013/601246
74.Master A, Nauman A (2014) THRB (Thyroid hormone receptor, beta).
Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol (AGCOH, Internet journal/
encyclopaedia/ database: http://documents.irevues.inist.fr/handle/2042/15655), artykuł w trakcie wprowadzania do bazy AGCOH
[13]
75.Lin CL, Evans V, Shen S, Xing Y, Richter JD (2010) The nuclear experience of CPEB: implications for RNA processing and translational
control. RNA 16: 338-348
76.Udagawa T, Swanger SA, Takeuchi K, Kim JH, Nalavadi V, Shin J,
Lorenz LJ, Zukin RS, Bassell GJ, Richter JD (2012) Bidirectional control
of mRNA translation and synaptic plasticity by the cytoplasmic polyadenylation complex. Mol Cell 47: 253-266
77.Choi HS, Hwang CK, Song KY, Law PY, Wei LN, Loh HH (2009)
Poly(C)-binding proteins as transcriptional regulators of gene expression. Biochem Biophys Res Commun 380: 431-436
78.Szaflarski W, Nowicki M, Zabel M (2011) Budowa krypt komórkowych i ich rola w funkcjonowaniu komórki oraz w oporności wielolekowej nowotworów. Postepy Biochem 57: 266-273
59.Shatsky IN, Dmitriev SE, Terenin IM, Andreev DE (2010) Cap- and
IRES-independent scanning mechanism of translation initiation as an
alternative to the concept of cellular IRESs. Mol Cells 30: 285-293
79.Steelman LS et al (2011) Roles of the Raf/MEK/ERK and PI3K/PTEN/
Akt/mTOR pathways in controlling growth and sensitivity to therapy-implications for cancer and aging. Aging (Albany NY) 3: 192-222
60.Ray D, Kazan H, Chan ET, Peña Castillo L, Chaudhry S, Talukder S,
Blencowe BJ, Morris Q, Hughes TR (2009) Rapid and systematic analysis of the RNA recognition specificities of RNA-binding proteins. Nat
Biotechnol 27: 667-670
80.Drummond MJ, Fujita S, Abe T, Dreyer HC, Volpi E, Rasmussen BB
(2008) Human muscle gene expression following resistance exercise
and blood flow restriction. Med Sci Sports Exerc 40: 691-698
81.Rofstad EK, Gaustad JV, Egeland TA, Mathiesen B, Galappathi K
(2010) Tumors exposed to acute cyclic hypoxic stress show enhanced
53
angiogenesis, perfusion and metastatic dissemination. Int J Cancer
127: 1535-1546
82.Chaudary N, Hill RP (2009) Increased expression of metastasis-related
genes in hypoxic cells sorted from cervical and lymph nodal xenograft
tumors Lab Invest 9: 587-596
83.Florczyk U, Czauderna S, Stachurska A, Tertil M, Nowak W, Kozakowska M, Poellinger L, Jozkowicz A, Loboda A, Dulak J (2011) Opposite effects of HIF-1α and HIF-2α on the regulation of IL-8 expression
in endothelial cells Free Radic Biol Med 51: 1882-1892
84.Chiavarina B, Martinez-Outschoorn UE, Whitaker-Menezes D, Howell A, Tanowitz HB, Pestell RG, Sotgia F, Lisanti MP (2012) Metabolic
reprogramming and two-compartment tumor metabolism: opposing
role(s) of HIF-1α and HIF-2α in tumor-associated fibroblasts and human breast cancer cells. Cell Cycle 11: 3280-3289
85.Gos M, Miłoszewska J, Przybyszewska M (2009) Rola przejścia epitelialno-mezenchymalnego w progresji nowotworu. Postepy Biochem
55: 121-128
86.Sroka J, Madeja Z (2009) Udział reaktywnych form tlenu i reduktazy
tioredoksyny w regulacji migracji komórek. Postepy Biochem 55: 145152
87.Loew S, Schmidt U, Unterberg A, Halatsch ME (2009) The epidermal
growth factor receptor as a therapeutic target in glioblastoma multiforme and other malignant neoplasms. Anticancer Agents Med Chem
9: 703-715
88.Larysz D, Kula D, Kowal M, Rudnik A, Jarząb M, Blamek S, BierzyńskaMacyszyn G, Kowalska M, Bażowski P, Jarząb B (2011) Epidermal
growth factor receptor gene expression in high grade gliomas. Folia
Neuropathol 49: 28-38
89.Sierko E, Wojtukiewicz M (2011) Interferowanie z funkcją EGFR nowe możliwości leczenia chorych na glejaki mózgu? Onkologia w
Praktyce Klinicznej 7: 215-223
90.Wesolowska A, Kwiatkowska A, Slomnicki L, Dembinski M, Master
A, Sliwa M, Franciszkiewicz K, Chouaib S, Kaminska B (2008) Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion--an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against
human TGF-beta type II receptor. Oncogene 27: 918-930
91.Wysocki PJ, Żołnierek J, Krzemieniecki K, Drosik K, Potemski P, Krzakowski M (2011) Rak nerkowokomórkowy - aktualne możliwości drugiej linii leczenia ze szczególnym uwzględnieniem roli ewerolimusu.
Onkologia w Praktyce Klinicznej 7: 113-118
92.Tsaur I, Makarević J, Hudak L, Juengel E, Kurosch M, Wiesner C,
Bartsch G, Harder S, Haferkamp A, Blaheta RA (2011) The cdk1-cyclin
B complex is involved in everolimus triggered resistance in the PC3
prostate cancer cell line. Cancer Lett 313: 84-90
93.Rini BI, Atkins MB (2009) Resistance to targeted therapy in renal-cell
carcinoma. Lancet Oncol 10: 992-1000
94.Tamburini J, Green AS, Bardet V, Chapuis N, Park S, Willems L, Uzunov M, Ifrah N, Dreyfus F, Lacombe C, Mayeux P, Bouscary D (2009)
Protein synthesis is resistant to rapamycin and constitutes a promising
therapeutic target in acute myeloid leukemia. Blood 114: 1618-1627
95.Costa LJ, Gemmill RM, Drabkin HA (2007) Upstream signaling
inhibition enhances rapamycin effect on growth of kidney cancer cells.
Urology 69: 596-602
96.Descamps G, Gomez-Bougie P, Tamburini J, Green A, Bouscary D,
Maïga S, Moreau P, Le Gouill S, Pellat-Deceunynck C, Amiot M (2012)
The cap-translation inhibitor 4EGI-1 induces apoptosis in multiple
myeloma through Noxa induction. Br J Cancer 106: 1660-1667
97.Dias A, Bouvier D, Crépin T, McCarthy AA, Hart DJ, Baudin F, Cusack
S, Ruigrok RW (2009) The cap-snatching endonuclease of influenza virus polymerase resides in the PA subunit. Nature 458: 914-918
Molecular mechanisms of protein biosynthesis initiation - biochemical
and biomedical implications of a new model of translation
enhanced by the RNA hypoxia response element (rHRE)
Adam Master, Alicja Nauman
The Centre of Postgraduate Medical Education, Department of Biochemistry and Molecular Biology, ul. Marymoncka 99/103, 01-813 Warsaw,
Poland

e-mail: [email protected]
Key words: 5’ cap (m7G), cancer, IRES, HIF-2α, hypoxia, oxidative stress, rHRE, translational control, UTR
ABSTRACT
Translation initiation is a key rate-limiting step in cellular protein synthesis. A cap-dependent initiation is the most effective mechanism of
the translation. However, some physiological (mitosis) and pathological (oxidative stress) processes may switch the classic mechanism to an
alternative one that is regulated by an mRNA element such as IRES, uORF, IRE, CPE, DICE, AURE or CITE. A recently discovered mechanism
of RNA hypoxia response element (rHRE)-dependent translation initiation, may change the view of oxygen-regulated translation and give a
new insight into unexplained biochemical processes. Hypoxia is one of the better-known factors that may trigger an alternative mechanism
of the translation initiation. Temporal events of oxygen deficiency within tissues and organs may activate processes such as angiogenesis,
myogenesis, regeneration, wound healing, and may promote an adaptive response in cardiovascular and neurodegenerative diseases. On the
other hand, growth of solid tumors may be accompanied by cyclic hypoxia, allowing for synthesis of proteins required for further progression
of cancer cells. This paper provides a review of current knowledge on translational control in the context of alternative models of translation
initiation.
54

Molekularne mechanizmy inicjacji biosyntezy białek

Transkrypt

Podobne dokumenty

Wykład II Sieć krystaliczna

Temat: Synteza białka w warunkach szkolnych.