Streszczenie w języku polskim Tutuł: Alternatywny splicing jako

Streszczenie w języku polskim Tutuł: Alternatywny splicing jako mechanizm odpowiedzi na stres herbicydowy u kukurydzy zwyczajnej W Zakładzie Biologii RNA od kilku lat badana jest reakcja roślin na warunki stresu herbicydowego (herbicyd systemowy Roundup®) u kukurydzy zwyczajnej. Składnikiem aktywnym herbicydu Roundup® jest glifosat, który inhibuje syntazę 5‐enolopirogroniano‐szikimo‐3‐fosforanu, EPSPS (ang. 5‐enolpyruvylshikimate‐3‐phosphate synthase), biorącą udział w syntezie aminokwasów aromatycznych (enzym ten nie występuje u ssaków). Mimo wyprowadzenia wielu odmian roślin coraz lepiej przystosowanych do warunków klimatycznych Polski, kukurydza pozostaje rośliną ciepłolubną, której należy zapewnić dostateczną ilość światła, wody i składników mineralnych. Na plantacjach aby zmniejszyć konkurencję, w początkowych fazach wzrostu roślin stosuje się herbicydy, w tym różnego typu inhibitory wzrostu siewek, produkcji pigmentów, fotosyntezy, syntezy aminokwasów czy regulatorów wzrostu. Wprowadzenie ich do uprawy jest silnym czynnikiem stresowym dla rozwijających się roślin. Stosowane herbicydy mogą powodować powstawanie nekrozy liści, przebarwienia lub zahamować wzrost roślin, co w skrajnych przypadkach może prowadzić do obniżenia plonu nawet o 20%. Jest wysoce prawdopodobne, że część genów biorących udział w odpowiedzi na niekorzystne warunki środowiskowe, może ulegać procesowi alternatywnego splicingu (AS). Dotychczas nie zbadano w jakim stopniu stosowanie herbicydów wpływa na proces alternatywnego splicingu. Celem prowadzonych badań było określenie różnic w profilach ekspresji wariantów transkryptów powstałych na drodze alternatywnego splicingu w dwóch liniach kukurydzy zwyczajnej, wykazujących zróżnicowaną wrażliwość na herbicyd Roundup – w linii S245, która charakteryzuje się tolerancją na oprysk herbicydem oraz linii S79757, która jest na niego wrażliwa. W pierwszym etapie przeprowadzono analizę bioinformatyczną chromosomu 1 (pierwszego) kukurydzy zwyczajnej pod kątem genów ulegających alternatywnemu splicingowi, której celem było oszacowanie skali zjawiska AS w genomie kukurydzy. Do analizy wykorzystano sekwencję chromosomu 1 oraz program AUGUSTUS. Proces alternatywnego splicingu udało się potwierdzić dla 113 genów z chromosomu 1 i zidentyfikować nowe zdarzenia AS dla 42 genów. Dla wybranych trzech genów, kodujących białka o znanej funkcji, przeprowadzono reakcje odwrotnej transkrypcji sprzężoną z reakcją PCR, dzięki czemu udało się potwierdzić zajście przewidzianych zdarzeń alternatywnego składania transkryptów dla dwóch genów (S‐metylotransferazy homocysteinowej i dehydrogenazy glutaminianu). W kolejnym przeprowadzono sekwencjonowanie mRNA drugiej generacji. Dla poszczególnych linii uzyskano od 3,5 do 76 mln 50 nt odczytów (1,75 do 3,8 Gbp). Porównanie uzyskanych sekwencji transkryptomów obu linii z transkryptomem referencyjnym kukurydzy (linia wsobna B73) pozwoliło zidentyfikować od 166 do 193 tys. transkryptów, w tym od 3,5 do 27 tys. nowych eksonów, od 1,7 do 11 tys. nowych intronów, które mapują do przeszło 11 tys. nowych loci. Porównanie zsekwencjonowanych transkryptomów z roślin poddanych działaniu stresu herbicydowego pozwoliło nam zidentyfikować 599 genów o znaczącej statystycznie różnicy w poziomie ekspresji, 424 transkryptów reprezentujących różne wzory splicingowe oraz 37 genów o zróżnicowanej regulacji (wybór innej sekwencji promotorowej) pomiędzy porównywanymi liniami zebranymi tydzień po oprysku herbicydem. Ponadto zidentyfikowano 71 genów ulegających zmienionej ekspresji po oprysku herbicydem w linii wrażliwej oraz 843 w linii tolerancyjnej, z czego odpowiednio 6 genów w linii wrażliwej i 61 genów w linii tolerancyjnej miało zmieniona ekspresję w obu badanych punktach czasowych (dzień i tydzień po przeprowadzeniu oprysku). Wykonano także analizę funkcjonalną 140 transkryptów o największych różnicach w poziomie ekspresji po oprysku herbicydem Roundup® z zastosowaniem programu MapMan. Udało nam się zmapować 96 transkryptów, z których 23 związane są z odpowiedzią rośliny na warunki stresowe. Wśród zmapowanych genów, liczną grupę stanowią także geny kodujące białka, biorące udział w fotosyntezie (14), metabolizmie wtórnym (11) czy metabolizmie białek (7). Duża ilość transkryptów została zmapowana do genów o nieznanych funkcjach (23) lub biorących udział w różnych szlakach metabolicznych (18). Aby określić liczbę genów ulegających AS zastosowano skrypt napisany w języku java. Po przebadaniu uzyskanych po sekwencjonowaniu transkryptomów określono, że AS dotyczył od 31 do 35% genów, które ulegały ekspresji w poszczególnych liniach i punktach czasowych. Rozkład typów splicingu w badanych liniach odbiegał od wcześniej opisanego – najliczniejsze zdarzenia AS dotyczyły wyboru alternatywnych miejsc splicingowych 3’ i 5’ , a nie jak dotychczas postulowano zatrzymania intronu. Po porównaniu genów różniących się wzorem AS między transkryptomami roślin poddanych opryskowi a roślinami kontrolnymi, wytypowano 58 genów w linii wrażliwej i 39 genów w linii tolerancyjnej, które różniły się sposobem składania transkryptów. Udało się zidentyfikować także 3 geny, które różniły się sposobem składania mRNA w obu liniach i punktach czasowych po oprysku herbicydem Roundup. Nie udało się zidentyfikować potencjalnego produkty jednego z tych genów, natomiast pozostałe dwa geny kodują najprawdopodobniej jeden z czynników splicingowych i kinazę białkową. W ten sposób zmiana we wzorze AS może wpływać na zmiany w przekazywaniu sygnałów i ekspresji genów docelowych regulowanych przez ten czynnik splicingowy. Zrealizowane badania potwierdzają wpływ herbicydów na zmianę metabolizmu roślin poddawanych opryskowi, a wytypowane w przedstawionej analizie geny i grupy białek mogą być obiektem dalszych badań funkcjonalnych oraz hodowlanych.