zjazdy / congresses
Transkrypt
zjazdy / congresses
E P ENDOKRYNOLOGIA POLSKA POLISH JOURNAL OF E NDOCRINOLOGY MATERIAŁY ZJAZDOWE CONGRESSIONAL PAPERS Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Prace przedstawione podczas III KONFERENCJI SEKCJI ENDOKRYNOLOGII MOLEKULARNEJ Polskiego Towarzystwa Endokrynologicznego Poznań, 11 - 12 października 2002 Pod redakcją: Dr hab. Med. Katarzyny Łąckiej Dr med. Ilony Gradeckiej-Kubik KOMITET HONOROWY KOMITET NAUKOWY Wojewoda Wielkopolski Prof. dr hab. Barbara Jarząb Prof. dr hab. Andrzej Lewiński Dr hab. Katarzyna Łącka Prof. dr hab. Alicja Macke-Nauman Prof. dr hab. Wiesław H. Trzeciak Andrzej Nowakowski J M Rektor Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Prof. dr hab. Grzegorz Bręborowicz KOMITET ORGANIZACYJNY Prezydent Miasta Poznania Ryszard Grobelny Przewodniczący: dr hab. med. Katarzyna Łącka Sekretarz: dr med. Ilona Gradecka-Kubik Członkowie: dr med. Agata Czarnywojtek dr Hanna Komarowska dr Marta Ociepa-Zawal mgr Błażej Rubiś dr Aneta Rzepka dr Joanna Szarzyńska dr Maciej Wawrzyniak Sekretariat: Jolanta Jurek, Barbara Torz Dziekan Wydziału Lekarskiego II MATERIAŁY ZJAZDOWE Prof. dr hab. Honorata Limanowska-Shaw Prezes Polskiego Towarzystwa Endokrynologicznego Prof. dr hab. Stefan Zgliczyński Konsultant Krajowy w dziedzinie endokrynologii Prof. dr hab. Janusz Nauman Przewodniczący Oddziału Poznańskiego Polskiego Towarzystwa Endokrynologicznego Prof. dr hab. Eugeniusz Korman PRO G RAM Piątek - 11 października 2002 OTWARCIE KONFERENCJI Wykład inauguracyjny prof. B. Jarząb (Gliwice) Molekularne obrazowanie ekspresji genów nowa metoda badania ekspresji genów. 8.00-9.20 SESJA 1 9.30-11.40 Analiza mutacji genów – tarczyca Przewodniczący: prof. dr hab. med. Andrzej Lewiński (Łódź) prof. dr hab. med. Janusz Nauman (Warszawa) prof. dr hab. med. Jerzy Sowiński (Poznań) 9.30-10.00 wykład Katarzyna Łącka (Poznań) Molekularne i kliniczne aspekty zaburzeń białek wiążących hormony tarczycy. Dyskusja. 428 10.00-10.30 wykład Marek Niedziela (Poznań) Rola peroksydazy tarczycowej w fizjologii i patologii gruczołu tarczowego. Dyskusja 10.30-10.40 Dedecjus M, Masson D, Lewiński A, Brzeziński J, Gambert Ph, Lagrost L (Łódź, Dijon) Stężenie oraz skorygowana i specyficzna aktywność CETP w surowicy pacjentów z różnymi zaburzeniami stanu tyreometabolicznego. Dyskusja 10.40-10.50 Pachucki J, Ambroziak M, Nauman A, Nauman J, (Warszawa) Poziom ekspresji czterech genów tarczycowych zlokalizowanych w tym samym odcinku chromosomu 15: ThOX1, ThOX2, revThOX1 i revThOH2 wykazuje wzajemną korelację. Dyskusja Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) 10.50-11.00 Ambroziak M, Pachucki J, Gereben B, Łuczak J, Nauman J, Nauman A, (Warszawa, Budapeszt) Obecność transkryptu ludzkiego genu dio2, zawierającego dodatkowy ekson w części kodującej, prawdopodobnie nie wpływa na aktywność dejodynazy typu II w tarczycy. Dyskusja 13.35-13.45 Rabska-Pietrzak B, Obara-Moszyńska M, Kędzia A, Korman E, (Poznań) Ocena progresji wzrastania u dzieci leczonych rekombinowanym hGH z powodu somatotropinowej niedoczynności przysadki, współistniejącej z wrodzonym przerostem kory nadnerczy. Dyskusja 11.00-11.10 Pawlaczek A, Kula D, Jarząb M, Gondek Ł, Staszel M, Jurecka-Lubieniecka B, (Gliwice) Związek polimorfizmu promotora genu interleukiny 4 – 589 C/T z chorobą Gravesa Basedowa. Dyskusja 13.45-15.00 przerwa - lunch 11.20-11.30 Kula D, Stęchły T, Jurecka-Lubieniecka B, Hasse-Lazar K, Krawczyk A, Szpak S, Jarząb M, Pawlaczek A, Gubała E, (Gliwice) Predyspozycja genetyczna do choroby Hashimoto w populacji polskiej: związek z polimorfizmem genów TNF i CTLA-4. Dyskusja 11.30-11.40 Dedecjus M, Masson D, Lewiński A, Brzeziński J, Gambert Ph, Lagrost L, (Łódź, Dijon) Cząsteczki HDL – budowa, rozkład subfrakcji i ładunek elektrostatyczny - w hipotyreozie - wpływ leczenia L-tyroksyną. 11.40-12.15 przerwa SESJA 2 12.15–13.45 Analiza mutacji genów – nadnercza, gonady Przewodniczący: prof. dr hab. med. Barbara Czarnocka (Warszawa) prof. dr hab. med. Jerzy Kosowicz (Poznań) prof. dr hab. med. Wiesław H. Trzeciak (Poznań) 12.15-12.45 wykład Monika Lewicka (Heidelberg) Cardiac aldosterone synthesis – current concepts. Dyskusja. 12.45-13.15 wykład Tomasz Lehmann, Justyna Biernacka-Łukanty, Jacques Y. Li, Wiesław H. Trzeciak (Poznań) Regulation of transcription of genes involved in steroid hormone synthesis in the adrenal cortex. Dyskusja 13.15-13-25 Lecybyl R, Rubis B, Trzeciak W H, (Poznań) Regulacja ekspresji dehydrogenazy 11ßhydroxysteroidowej typu II w komórkach nabłonkowych nerki szczura. Dyskusja 13.25-13.35 Ignacak M, Oksza Strzelecki N, Trzeciak WH, (Poznań) Mutacje genu receptora androgenów u chorych z zespołem niewrażliwości na androgeny. Dyskusja Przewodniczący: prof. dr hab. med. Barbara Jarząb (Gliwice) prof. dr hab. med. Alicja Macke-Nauman (Warszawa) prof. dr hab. med. Maciej Gembicki (Poznań) 15.00-15.30 wykład Monika Puzianowska–Kuźnicka, Alicja Macke-Nauman, Janusz Nauman, (Warszawa) Potencjalny udział hormonów drobnocząsteczkowych i ich jądrowych receptorów w procesie nowotworzenia. Dyskusja 15.30-15.40 Czarnocka B, Pastuszka D, Łyczkowska A, Lange D, Nikiel B, Goraj-Zając A , Włoch J, (Warszawa, Gliwice) Ekspresja symportera sodowo-jodowego (NIS) i peroksydazy tarczycowej (TPO) w rakach tarczycy rozwiniętych z komórek nabłonkowych tarczycy. Dyskusja 15.40-15.50 Wiench M, Krawczyk A, Lisowska K, Jarząb B,. (Gliwice) Badanie profilu ekspresji genów w raku brodawkowatym tarczycy. Dyskusja 15.50-16.00 Krawczyk A, Handkiewicz-Junak D, Chmielik E, Wiench M, Gubała E, Jarząb B, (Gliwice) Ekspresja genu kodującego kalcytoninę w bioptatach węzłów chłonnych u chorych na raka rdzeniastego tarczycy. Dyskusja 16.00-16.10 Czyż W, Kołomecki K, Pasieka Z, Balcerzak E, Rudowicz M, Jakubiak M, Kuzdak K, Mirowski M, (Łódź) Ocena ekspresji genu HMGI (y) w nowotworach pęcherzykowych tarczycy z zastosowaniem metody RT PCR. Dyskusja 16.10-16.20 Kołomecki K, Stępień H, Czyż W, Stępień T, Kuzdak K, (Łódź) Ocena stężenia czynników adhezyjnych u chorych z guzami nadnercza nieczynnymi hormonalnie (incidentaloma). Dyskusja 16.20-16.30 Słowikowska-Hilczer J, Kula K, (Łódź) Aspekty molekularne przedinwazyjnego raka jądra: badania immunohistochemiczne i hormonalne. Dyskusja 16.30-16.50 przerwa - kawa 429 MATERIAŁY ZJAZDOWE 11.10-11.20 Jurecka-Lubieniecka B, Kula D, Hasse-Lazar K, Stęchły T, Krawczyk A, Szpak S, Jarząb M, Pawlaczek A, Gubała E, (Gliwice) Współudział polimorfizmu TNF i CTLA4 w predyspozycji genetycznej do choroby Gravesa Basedowa. Dyskusja SESJA 3 15.00-16.30 Nowotwory gruczołów dokrewnych Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE SESJA 4 16.50–18.00 Diagnostyka molekularna Przewodniczący: prof. dr hab. med. Jan Komorowski (Łódź) dr hab. med. Katarzyna Łącka (Poznań) 16.50–17.05 Gubała E, Handkiewicz-Junak D, Zeman M, Chmielik E, Wiench M, Wołoszańska K, Jarząb B, (Gliwice) RT-PCR – technika molekularna wspierająca wykrywanie wznowy węzłowej raka tarczycy. Dyskusja 17.05-17.20 Pasieka Z, Kuzdak K, Czyż W, Stępień H, Komorowski J, (Łódź) Cytokinowe cząsteczki adhezyjne (sVCAM-1, sICAM-1) we krwi u chorych z rakiem tarczycy. Dyskusja 17.20-17.35 Krześlak A , Pomorski L, Gaj Z, Lipińska A, (Łódź) Czy glikoproteiny komórkowe mogą być markerem diagnostycznym odróżniającym nowotwory łagodne tarczycy od złośliwych? Dyskusja MATERIAŁY ZJAZDOWE 17.35-17.45 Łącka K, Kwintkiewicz J, Szarzyńska J, Wiktorowicz K, Majewski K, Gembicki M, (Poznań) Przydatność oznaczeń zawartości DNA w różnicowaniu i prognozowaniu nowotworów tarczycy wywodzących się z komórki pęcherzykowej. Dyskusja 17.45-18.00 Sromek M, Wiśniewska A, Paszko Z, Jagielska A, Skasko E, Czapczak D, Czetwertyńska M, Kozłowicz–Gudzińska I, Prokurat A, Łyczek M, Kaniewski M, Stachlewska-Nasfeter E, (Warszawa) Podsumowanie czteroletnich badań nad występowaniem patogennych mutacji w genie RET u chorych na rdzeniastego raka tarczycy. Dyskusja 19.00 Wieczór Towarzyski Sobota - 12 października 2002 SESJA 5 8.30-10.30 Etiopatogeneza cukrzycy i otyłości Przewodniczący: prof. dr hab. med. Ida Kinalska (Białystok) prof. dr hab. med. Bogna WieruszWysocka (Poznań) 9.30–9.45 Bogdański P, Jagodziński P, Kujawa A, Pupek-Musialik D, (Poznań) Ocena ekspresji receptora chemokinowego CCR5 u chorych z cukrzycą typu 2. Dyskusja 9.45-10.00 Siewko K, Szelachowska M, Krętowski A, Stępień A, Kinalska I, (Białystok) Autoimmunologiczne i metaboliczne markery ryzyka rozwoju cukrzycy u krewnych I stopnia chorych na cukrzycę - badanie retrospektywne. Dyskusja 10.00-10.15 Szepietowska B, Szelachowska M, Górska M, Kinalska I, (Białystok) Ocena markerów humoralnej odpowiedzi immunologicznej oraz parametrów biochemicznych u dorosłych pacjentów ze świeżo rozpoznaną cukrzycą. Dyskusja 10.15-10.30 Bogdański P, Pupek-Musialik D, Łącki JK, Łuczak M, Bryl W, Jabłecka A, (Poznań) Ocena stężenia czynnika martwicy guza (TNF) u pacjentów z klinicznymi cechami insulinooporności. Dyskusja 10.30-11.30 przerwa - kawa SESJA 6 11.30-13.30 Czynniki genetyczne niepłodności Osteoporoza Gonady Przewodniczący: prof. dr hab. med A. Warenik–Szymankiewicz (Poznań) dr hab. med. Józef Krzysiek (Kraków) 11.30-12.00 wykład A. Śpik, A. Wojda, A. LatosBieleńska, P. Jędrzejczak, L. Pawelczyk, J. Jaruzelska, (Poznań) Diagnostyka genetyczna niepłodności męskiej. Dyskusja 12.00-12.30 wykład Wanda Horst-Sikorska (Poznań) Genetyczne uwarunkowania gęstości kości. Dyskusja 12.30-13.00 wykład Alina Warenik-Szymankiewicz (Poznań) Genetyczne uwarunkowania zespołu PCO. Dyskusja 8.30-9.00 wykład Ida Kinalska, Małgorzata Szelachowska, (Białystok) Wybrane zagadnienia immunopatologii cukrzycy. Dyskusja 13.00–13.10 Ociepa M, Warenik-Szymankiewicz A, Trzeciak W H, (Poznań) Warianty splicingowe transkryptu genu receptora pregnanowego X w jajnikach policystycznych. Dyskusja 9.00-9.30 wykład Stanisław Czekalski, Andrzej Oko, Krzysztof Pawlaczyk, Ilona IdasiakPiechocka, (Poznań) Genetyczne i środowiskowe uwarunkowania nefropatii cukrzycowej. Dyskusja 13.10-13.20 Kocki J, Wołowiec A, Putowski L, KorszeńPilecka I, Wojcierowski J, (Lublin) Badania mutacji genu cftr u pacjentów z niepłodnością. Dyskusja 13.20-14.30 przerwa - lunch 430 Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) SESJA 7 14.30-16.00 Zaburzenia dojrzewania i różnicowania płci 14.30-15.00 wykład Krzysztof Kula, J. SłowikowskaHilczer, (Łódź) Badania kliniczne nad różnicowaniem płci w endokrynologii. Dyskusja 15.30–15.40 Wawrzyniak M, Krysińska I, Ruchała M, Wojda A, Łącka K, (Poznań) Aberracje chromosomu X a obecność patologii w obrębie tarczycy u chorych z zespołem Turnera. Dyskusja 15.40-15.50 Kusz K, Szarras-Czapnik M, WarenikSzymankiewicz A, Latos-Bieleńska A, Jaruzelska J, (Poznań) Poszukiwanie duplikacji regionu DSS powodujących zespół Swyera. Dyskusja 15.00-15.30 wykład Lucjusz Jakubowski (Łódź) Uwarunkowania genetyczne wad rozwojowych narządów płciowych. Dyskusja 15.50-16.00 Łącka K, Rzepka A, Andrzejewska J, Wojda A, (Poznań) Płodność w zespole Turnera. Dyskusja Przewodniczący: prof. dr hab. med Eugeniusz Korman (Poznań) prof. dr hab. med Krzysztof Kula (Łódź) 16.00–16.30 Zakończenie Konferencji Odkrycie struktury DNA przez J.D. Watsona i F. Cricka w roku 1953 było kluczowym momentem dla rozwoju genetyki. Z kolei szybki rozwój technik biologii molekularnej i inżynierii genetycznej w latach 70-tych i 80-tych, uwieńczony opracowaniem metody szybkiego powielania wybranych fragmentów DNA czyli PCR, błyskawicznie przyspieszył badania nad poznaniem genomu ludzkiego oraz zintensyfikował badania nad etiopatogenezą schorzeń na poziomie molekularnym. Tymczasem określenie defektów molekularno-genetycznych chorób umożliwia ciągłe doskonalenie diagnostyki, w tym diagnostyki prenatalnej, prowadzenie poradnictwa genetycznego z wykrywaniem nosicieli choroby, a także na podjęcie prób terapii genowej. Szczególnie wdzięczną dziedziną dla genetyki i biologii molekularnej jest endokrynologia. Wynika to z faktu, że znakomita większość struktur niezbędnych dla prawidłowego funkcjonowania gruczołów dokrewnych wykazuje strukturę białkową, a tym samym jest zakodowana w genach. Zainteresowania endokrynologów wykorzystaniem metod biologii molekularnej datują się od lat 70-tych, kiedy to uzyskano za pomocą inżynierii genetycznej syntetyczną somatostatynę (1977) i insulinę (1979). W chwili obecnej nie ma takiej choroby endokrynnej, w etiopatogenezie której nie byłyby zaangażowane zmiany molekularne na poziomie DNA i RNA. Notuje się olbrzymi postęp w diagnostyce molekularnej endokrynopatii, a także produkcji rekombinowanych hormonów dla celów diagnostycznych i leczniczych. Doceniając potrzebę rozwoju endokrynologii molekularnej i genetyki w Polsce, decyzją Zarządu Głównego PTE, w roku 1997 została powołana Sekcja Endokrynologii Molekularnej. Już w następnym roku odbyła się I Konferencja Sekcji, a następnie, w odstępach dwuletnich, kolejno II i III Konferencja (1998, 2000, 2002). Dotychczasowymi tematami przewodnimi naszych spotkań były: molekularno-genetyczne aspekty etiopatogenezy chorób tarczycy, nadnerczy, gonad, układu podwzgórzowo-przysadkowego, zaburzeń dojrzewania płciowego, dysgenezji gonad, osteoporozy, cukrzycy, otyłości, nadciśnienia tętniczego, a także zespoły wielogruczołowe i nowotwory gruczołów dokrewnych. Ponadto wiele sesji było poświęconych diagnostyce molekularnej oraz leczeniu rekombinowanymi hormonami chorób gruczołów dokrewnych. W naszym kraju istnieje kilkanaście bardzo prężnych ośrodków zajmujących się endokrynologią molekularną, co znalazło swój wyraz w programach naszych spotkań. Wszystkie one obejmowały zarówno wykłady plenarne o bardzo różnorodnej tematyce z dziedziny endokrynologii molekularnej jak i prace oryginalne cenzurowane każdorazowo przez Komitet Naukowy. Spośród wykładowców gościliśmy m. in. z kraju: prof. S. Czekalskiego, prof. B. Jarząb, prof. I. Kinalską, prof. J. Kosowicza, prof. K. Kulę, prof. A. Lewińskiego, prof. A. Midro, prof. A. Nauman, prof. M. Pawlikowskiego, prof. D. Pupek-Musialik, prof. T. Romera, prof. WH. Trzeciaka, prof. A. Warenik-Szymankiewicz, doc. T. Ferenca, doc. L. Jakubowskiego, doc. J. Jaruzelską, doc. Z. Krawczyka, doc. K. Łącką, doc. M. Niedzielę, doc. M. PuzianowskąKuźnicką, a z zagranicy: prof. R. Bernhardta, prof. I. Huhtaniemi, prof. M. Lewicką, prof. JI. Masona. III konferencja naszej sekcji została włączona do grupy kursów zalecanych dla specjalistów i osób specjalizujących się w dziedzinie endokrynologii, a posiadanie Certyfikatu Uczestnictwa uprawnia do uzyskania 20 punktów edukacyjnych przez Naczelną Izbę Lekarską. W trakcie ostatniej konferencji w obecności Wojewody Wielkopolskiego Pana Andrzeja Nowakowskiego, JM Rektora AM w Poznaniu prof. Grzegorza Bręborowicza oraz Prezesa Polskiego Towarzystwa Endokrynologicznego prof. Stefana Zgliczyńskiego nastąpiło uroczyste wręczenie Krzyża Komandorskiego panu profesorowi Jerzemu Kosowiczowi oraz Dyplomu Honorowego Członka Polskiego Towarzystwa Endokrynologicznego panu profesorowi Januszowi Naumanowi. 431 MATERIAŁY ZJAZDOWE SZANOWNI PAŃSTWO! Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Serdecznie dziękuję Zarządowi Głównemu Polskiego Towarzystwa Endokrynologicznego, Komitetowi Naukowemu i Organizacyjnemu, Sponsorom i Firmom za wydatną pomoc w organizacji naszych konferencji i wyrażam głęboką nadzieję, że będą one nadal kontynuowane. Oddając do rąk Czytelników Endokrynologii Polskiej materiały z III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej Polskiego Towarzystwa Endokrynologicznego zapraszam Wszystkich Państwa do wzięcia udziału w kolejnym, czwartym, spotkaniu naszej Sekcji jesienią 2004 roku. Z pozdrowieniami Katarzyna ŁĄCKA MATERIAŁY ZJAZDOWE Wręczenie Krzyża Komandorskiego panu profesorowi Jerzemu Kosowiczowi Profesor Janusz Nauman odbiera gratulacje 432 Komitet Organizacyjny Konferencji. Przewodnicząca Sekcji Endokrynologii Molekularnej Polskiego Towarzystwa Endokrynologicznego Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) WYKŁAD Y Barbara Jarząb, Elżbieta Gubała, Zbigniew Wygoda Molecular imaging of gene expression Summary: The human genome project has enabled a more comprehensive understanding of the molecular basis of disease and simultaneously has increased demand for non-invasive measurement of biological processes in living beings on both the cellular and molecular level. Molecular imaging develops in response to this demand and is a rather young discipline that bridges basic and clinical research. Two main directions of its development may be specified. First is imaging of cellular metabolism which has been widened significantly by the introduction of PET. Imaging of molecular signatures of cancer cells, detected by profiling of gene expression, may be in future a very significant task for this type of molecular imaging. The second direction is monitoring of gene therapy, necessary for animal studies but before all indispensable to assess human patients undergoing clinical trials with gene therapy vectors. This type of approaches will be presented in the lecture. The successful application of gene therapy requires stable expression of the introduced gene in target cells. In animals, this has been controlled after isolation of RNA from the targeted tissue. When repeated measurements are needed or human approaches are considered, in vivo imaging becomes necessary. When the transgene product exhibits enzymatic activity, its presence may be validated after administration of a radioactive substrate, traced either with positron tracers or with 123 iodine. Gene therapies with herpes simplex virus thymidine kinase gene (HSV – TK) have used this possibility of monitoring. Because direct imaging of expression of many other genes is impossible, reporter genes may be applied per analogy to green fluorescence protein, used in animal studies. This is done by co-expressing marker genes, which can be visualized without the need to sacrifice the experimental animal, along with the therapeutic transgenes. HSV1 – TK and other enzyme genes may serve as reporter genes. Type 2 dopamine receptor gene, somatostatin receptor gene and NIS gene also are considered among genes which may serve for this goal . Using such reporter genes for the control of gene therapy has essential advantages for human applications, as commercially available radiotracers with known tissue distribution in humans are applied and PET scanners are not necessary for their detection. Alternate imaging modalities to detect expression of reporter genes include optical or near infra-red optical systems with luciferase as the reporter gene or nuclear magnetic resonance based methods of detection, which have been however analyzed only in animal systems until now. NMR molecular imaging is still less sensitive than PET. There is a gap between the quick development of functional genomics which provides the molecular targets and the demands and expectations of clinical medicine. The development of technologies of non-invasive detection and measurement of the expression of genes of interest may help to fill this gap. To report expression of many genes simultaneously still remains a challenge for further research. Barbara Jarząb, Elżbieta Gubała, Zbigniew Wygoda Obrazowanie molekularne: nowa metoda badania ekspresji genów Zakład Medycyny Nuklearnej i Endokrynologii Onkologicznej Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej – Curie, Oddział w Gliwicach Streszczenie: W pracy omówiono zasady obrazowania molekularnego jako metody badania ekspresji genów in vivo. Później omówiono możliwości medycyny nuklearnej w obrazowaniu ekspresji genów, ze szczególnym uwzględnieniem roli PET. Przestawiono możliwości monitorowania terapii genowej tymi metodami, po czym krótko zarysowano perspektywy dalszego rozwoju technik obrazowania molekularnego. n Obrazowanie molekularne jest nowym pojęciem, jakie pojawiło się w biologii i medycynie zaledwie kilka lat temu i w najbliższym czasie zawita tak do endokrynologii molekularnej jak i klinicznej. Potrzeba obrazowania in vivo ekspresji genów wynikła przede wszystkim z rozwoju terapii genowej, ale postęp, jaki dokonał się w badaniu ekspresji genów in vitro, nadał tej gałęzi biologii i medycyny molekularnej nowe znaczenie. Obydwa kierunki zastosowań wynikają z potrzeby nieinwazyjnego, przyżyciowego badania ekspresji genów i wymagają tych samych metod, niezależnie od faktu, czy chcemy zbadać ekspresję genu wprowadzonego do komórek w wyniku terapii genowej czy też potrzebujemy charakteryzować zmianę w ekspresji wynikłą z różnych chorób (Ryc.1). Nowe metody badania ekspresji genów in vitro Do znanych wszystkim i szeroko stosowanych metod badania ekspresji genów należą metody immunohi- 433 MATERIAŁY ZJAZDOWE Department of Nuclear Medicine and Endocrine Oncology Center of Oncology, Maria Skłodowska-Curie Memorial Institute, Gliwice Branch Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Ryc.1 Możliwości obrazowania procesów molekularnych in vivo informacja mRNA struktura gen DNA Liczba cząsteczek w komórce Gen (DNA) 2 mRNA 10 - 1000 Biaáko 100 – 1.000.000 Funkcja b. silne wzmocnienie biaáko funkcja MATERIAŁY ZJAZDOWE Poziom stochemiczne czy cytofluorymetria, które oceniają ekspresję na poziomie produktu białkowego oraz jakościowa i ilościowa reakcja odwrotnej transkrypcji i łańcuchowej reakcji polimerazy (RT-PCR i QPCR) czy metody hybrydyzacji in situ, oceniające obecność lub ilość informacyjnego RNA. Ostatnio dołączyły do nich metody genomiki funkcjonalnej i proteomiki [1-4]. W odróżnieniu od klasycznych metod biologii molekularnej, którymi w jednym doświadczeniu można analizować ekspresję jednego, a najwyżej kilku genów, metody te oceniają jednocześnie ekspresję wielu – nawet tysięcy – genów. Jednoczesna analiza obecności większości lub wręcz wszystkich rodzajów informacyjnych RNA w komórce prowadzona jest na mikromacierzach DNA. Mikromacierze DNA (DNA microarrays), zwane również chipami, mikropanelami lub mikroukładami DNA, są zestawami tysięcy zminiaturyzowanych sond, gęsto umieszczonych na powierzchni szkiełka podstawowego. Dzięki ich upakowaniu wystarczy niewielka ilość RNA wyizolowanego z tkanki (zazwyczaj 5-20 µg), żeby przeprowadzić reakcję hybrydyzacji z sondami obecnymi na mikromacierzy. Dokonana hybrydyzacja sygnalizowana jest za pomocą barwników fluorescencyjnych i wymaga odczytu za pomocą skanera laserowego. Sygnał z lasera przetwarzany jest przez specjalne oprogramowanie, tak żeby uzyskana informacja odnosiła się już bezpośrednio do badanych genów. Uzyskany w ten sposób profil ekspresji może stać się źródłem informacji o nowych genach istotnych dla analizowanego zjawiska fizjologicznego czy chorobowego czy reakcji na stosowane leki, może być także użyteczny w diagnostyce chorób, gdyż dostarcza informacji nie tyle o poszczególnych markerach, co o całych zestawach genów markerowych, określanej jako profil molekularny danej tkanki. W piśmiennictwie anglosaskim szczególnie często używa się w tym kontekście określenia „molecular signature”, co przekłada się bezpośrednio na język polski jako „podpis molekularny” lub „piętno molekularne” danej tkanki [5, 6]. Szczególnie często stosuje się obecnie tę metodę w badaniach z zakresu onkologii, gdyż pozwala ona na trafniejszą klasyfikację nowotworów w stosunku do metod używanych dotychczas, a jednocześnie umożliwia typowanie nowych celów molekularnych dla terapii [1, 6, 7, 8]. Coraz większe zastosowanie znajduje ona także w endokrynologii, na razie głównie w badaniach podstawowych, gdyż w ten 434 sposób można analizować, jak zmienia się ekspresja genów w komórce czy tkance pod wpływem działania hormonów. Można się spodziewać, że badania te przyspieszą przede wszystkim nasze rozumienie mechanizmu działania tych hormonów, które oddziałują z receptorami pełniącymi funkcję czynników transkrypcyjnych –a więc hormonów steroidowych, hormonów tarczycy, kalcidiolu czy retinoidów [9, 10]. Aktywacja czy hamowanie transkrypcji określonego genu i powstawania RNA nie przekłada się w sposób liniowy na ostateczną ilość produktu białkowego. Dlatego badaniom obecności cząsteczek informacyjnych RNA w komórce muszą towarzyszyć badania obecności kodowanych przez nie białek. Możliwe są dwa podejścia do jednoczesnego badania ekspresji wielu białek w danym typie tkanek. Jedno z nich zakłada, że przyspieszamy analizę poprzez ułożenie na jednym szkiełku podstawowym wielu różnych skrawków, pochodzących od różnych chorych. Na przykład, jeżeli chcemy sprawdzić, czy zwiększonej ekspresji mRNA dla wytypowanych przez nas genów w raku brodawkowatym tarczycy towarzyszy zwiększona ekspresja białek, możemy posłużyć się mikromacierzami tkankowymi raka tarczycy (tissue microarrays) [11]. Przygotowuje się je poprzez ułożeniu w jednym bloku parafinowym długich walcowatych wycinków z wielu raków brodawkowatych. Każdy z tych walców ma średnicę mniejszą od 1 mm, więc na jednym szkiełku podstawowym zmieści się ich kilkadziesiąt, jeżeli tak powstały blok będziemy kroić poprzecznie na mikrotomie. Nałożenie na tak powstałą mikromacierz tkankową odczynu immunohistochemicznego umożliwia zminimalizowanie ilości przeciwciała i czasu potrzebnego do badania ekspresji jednego antygenu w wielu próbkach tkankowych jednocześnie. Wobec tego, dysponując panelem przeciwciał, możemy szybko uzyskać informację o ekspresji interesujących nas antygenów w wielu rakach. Inne, bardzo szerokie możliwości konfrontowania wyników uzyskanych przez badanie profilu ekspresji uzyskuje się dzięki metodom proteomicznym. Proteomika jest de facto działem genomiki funkcjonalnej. Jednoczesna analiza obecności wielu białek jest prowadzona metodami dwuwymiarowej elektroforezy – ale wówczas można rozróżnić najwyżej kilkaset białek - lub metodami spektrometrii masowej (np. MALDITOF) [12], której możliwości są znacznie większe. Można się spodziewać, że w przyszłości opracowanie rutynowych metod proteomicznych zaowocuje licznymi zastosowaniami diagnostycznymi, na razie jednak techniki te znajdują się w fazie rozwoju i są mniej zaawansowane, jeśli chodzi o wprowadzenie ich do badań stosowanych, niż mikromacierze DNA czy mikromacierze tkankowe. Obrazowanie molekularne jako badanie ekspresji genu in vivo Obrazowanie molekularne oznacza uwidocznienie rozkładu obecności markera ekspresji danego genu w badanym organizmie [13]. Najłatwiej zastosować w tym celu metody medycyny nuklearnej (Ryc. 2) [14]. Ryc. 2 Obrazowanie funkcjonalne metodami medycyny nuklearnej Scyntygrafia zawsze była traktowana jako obrazowanie funkcji, a nie struktury narządu. Najstarsze ze znanych badań scyntygraficznych, jakim jest scyntygrafia tarczycy, opiera się na wybiórczym wychwycie jodu przez komórki pęcherzykowe gruczołu tarczowego. Jeżeli uświadomimy sobie, że jodochwytność wynika z obecności symportera sodowo-jodkowego (NIS) w błonie komórki tarczycowej, łatwo jest przełożyć badany proces na język współczesnej biologii molekularnej: scyntygrafia tarczycy jest możliwa tylko wtedy, gdy dochodzi do ekspresji genu NIS [15]. Oczywiście, każdy endokrynolog doda, że przecież obok ekspresji genu NIS konieczne są inne warunki, (np. enzymy organifikacji jodu), ale jeżeli spojrzymy na scyntygrafię klatki piersiowej u chorego na raka tarczycy, u którego doszło do przerzutów do płuc, przełożenie na język molekularny staje się bardziej oczywiste: albo komórki raka wykazują ekspresję NIS i można je uwidocznić przez podanie izotopu promieniotwórczego jodu (Ryc. 3), albo nie ma ekspresji NIS i nie stwierdza się jodochwytności przerzutów. Wykazanie ekspresji NIS in vivo ma w raku tarczycy bezpośrednie przełożenie terapeutyczne, gdyż pozwala na lecznicze zastosowanie dużych dawek jodu promieniotwórczego. Ryc. 3 Scyntygrafia jodowa jako obrazowanie molekularne ekspresji genu NIS stwierdzamy w TK guz nadnercza i w ramach dalszej diagnostyki decydujemy się podać MIBG (meta-jodobenzylgwanidynę) znakowaną jodem promieniotwórczym, to de facto badamy, czy w guzie tym znajduje się błonowy transporter dla katecholamin. MIBG, jako związek o zbliżonej budowie, jest wówczas wychwytywana przez komórki guza. Wnioskowanie pośrednie pozwala nam rozpoznać guza chromochłonnego nadnerczy, ale gdyby guz znajdował się w innym umiejscowieniu, nie moglibyśmy jednoznacznie na tej podstawie różnicować, czy mamy do czynienia z pozanadnerczowym guzem chromochłonnym, rakowiakiem czy przerzutem raka rdzeniastego tarczycy, żeby wymienić tylko niektóre przykłady nowotworów narządów wydzielania wewnętrznego, które charakteryzują się ekspresją transportera katecholamin. Immunoscyntygrafie, w których obrazuje się cechy molekularne przez detekcję znakowanymi przeciwciałami, także można zaliczyć do obrazowania molekularnego (Ryc.4). Inny dobry przykład zastosowania scyntygrafii do badania ekspresji in vivo to scyntygrafia receptorowa przy zastosowaniu analogów somatostatyny, głównie oktreotydu znakowanego indem promieniotwórczym (oktreoskan) [16]. Możemy w ten sposób wykryć na przykład przerzuty złośliwego wyspiaka trzustki, czy znaleźć małe ognisko rakowiaka. W jednym i drugim przypadku wnioskujemy pośrednio, bo bezpośrednim celem badania jest wykrycie ekspresji receptora dla somatostatyny typu 2 w guzie (sstr2) . Nie zawsze ma ono znaczenie czysto diagnostyczne, jak w tym przypadku. Jeżeli u chorego z orbitopatią tarczycową scyntygrafia receptorowa wykaże obecność sstr2 w tkankach oczodołu, informacja ta będzie miała znaczenie predykcyjne – ponieważ dodatnia scyntygrafia receptorowa świadczy o aktywnej fazie zapalenia tworzy wskazania do podjęcia leczenia glikosteroidami. Ryc. 4 Możliwości obrazowania ekspresji genów poprzez scyntygrafię SPECT lub PET Immunoscyntygrafia (SPECT) ANTYGEN TRANSPORTER DNA przeciwciaáo EKSPRESJA 1:1 Scyntygrafia 131I, 123I (SPECT) ENZYM ligand RECEPTOR substrat produkt Scyntygrafia receptorowa (SPECT) PET 1:1000 Czy w endokrynologii można znaleźć inne przykłady obrazowania molekularnego za pomocą scyntygrafii? Oczywiście tak. Na przykład, jeżeli W onkologii wykazanie receptorów somatostatyny na błonach komórkowych guza nowotworowego – bez względu na znaczenie tego faktu dla czynności komórki nowotworowej, tworzy możliwość celowanej terapii przez zastosowanie oktreotydu czy innego analogu somatostatyny sprzężonego z leczniczymi dawkami izotopu promieniotwórczego, emitującego 435 MATERIAŁY ZJAZDOWE Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE promieniowanie jonizujące beta o działaniu kancerobójczym, na przykład itru 90 czy galu 67 [17]. W ten sposób zaczynamy leczyć nie tylko guzy neuroendokrynne, ale i inne nowotwory, które mogą charakteryzować się ekspresją receptora dla somatostatyny, na przykład rozsianego raka piersi czy zaawansowanego chłoniaka, w którym zawiodły inne metody leczenia. Także sprzęganie swoistych przeciwciał ze znacznikami izotopowymi służy obrazowaniu molekularnemu ekspresji tych antygenów, przeciwko którym skierowane są przeciwciała (Ryc. 5), a potem w konsekwencji ich celowanej terapii. Ryc. 5 Obrazowanie ekspresji genu w komórkach guza może prowadzić do nowego typu terapii - immunoscyntygrafia antygenów nowotworowych anty-CEA MATERIAŁY ZJAZDOWE - scyntygrafia receptorowa: analogi somatostatyny Octreoscan® terapia raka rdzeniastego tarczycy przeciwciaáami 90 Y-anty CEA terapia guzów neuroendokrynnych znakowanymi analogami somatostatyny 90 Y-DOTATOC Niestety, klasyczne znaczniki scyntygraficzne rozpoznają tylko nieliczne ligandy komórkowe, stąd badanie ekspresji większości genów jest w ten sposób niemożliwe. Dlatego też przełom w obrazowaniu molekularnym wiąże się w medycynie nuklearnej z wprowadzeniem badań PET. Obrazowanie molekularne w pozytronowej tomografii emisyjnej Pozytronowa tomografia emisyjna (PET) zrewolucjonizowała metody badania procesów molekularnych in vivo [18]. Jest to możliwe przede wszystkim dzięki temu, że izotopy emitujące pozytony (czyli cząstki beta naładowane dodatnio) można znaleźć także wśród izotopów pierwiastków budujących podstawowe związki organiczne. I tak dysponujemy izotopem węgla C-11, tlenu O-15, azotu N-13. Jeżeli wprowadzimy te izotopy do związków normalnie użytkowanych w naszym organizmie, takich jak aminokwasy, nukleotydy itp., możemy in vivo obrazować przemiany metaboliczne zachodzące w naszym ustroju. Ponieważ znaczniki są często substratami dla enzymów ulegających ekspresji w komórce, dzięki ich aktywności katalitycznej uzyskujemy znaczne wzmocnienie sygnału (Ryc.4). Do tego, fizyczne własności emitowanego promieniowania sprawiają, że skaner PET pozwala na znacznie czulsze i bardziej rozdzielcze obrazowanie nawet niewielkich ognisk gromadzenia w porównaniu do klasycznej gamma-kamery. Za jego pomocą można obrazować ogniska o średnicy około 5 mm. Jakkolwiek rozdzielczość tomografii komputerowej czy rezonansu magnetycznego jest nawet wyższa, to w praktyce rozpoznawanie zmian o średnicy kilku mm jest w tych klasycznych technikach obrazowania bardzo trudne – na przykład nie można wówczas na podstawie cech anatomicznych różnicować między prawidłowym a przerzutowym węzłem chłonnym. Zastosowanie PET 436 i znacznika swoistego dla komórki nowotworowej ma tu wówczas znaczenie decydujące. Przełomowe znaczenie dla badań PET miało wprowadzenie jako znacznika deoksyglukozy znakowanej fluorem-18 (FDG) [19]. Fluor-18, jako chlorowiec, łatwo wchodzi do związków organicznych w miejsce atomu wodoru i nie zmienia w sposób istotny własności molekuł. Jednocześnie jego półokres trwania wynosi około 1 godziny, jest więc dłuższy niż dla wielu istotnych znaczników pozytonowych. FDG, jako analog glukozy, jest transportowana do większości komórek i rozpoznawana przez heksokinazę, enzym przeprowadzający glukozę do jej fosforanu w pierwszym etapie glikolizy (Ryc. 6). Proces ten jest szczególnie wydajny w komórkach nowotworowych, które traktują beztlenową glikolizę jako podstawowe źródło energii. W przystosowaniu do swojego wysokiego zapotrzebowania na energię wykazują one wysoką ekspresję zarówno transporterów glukozy w błonie komórkowej jak i heksokinazy wewnątrz komórki. Dla obrazowania komórki nowotworowej konieczny jest mechanizm pułapki molekularnej, która pojawia się już na następnym etapie: fosforan deoksyglukozy (a więc również FDG-P) nie jest przeprowadzany do kolejnych etapów glikolizy, nie może również dyfundować na zewnątrz komórki ani ulegać defosforylacji do FDG. W szybkim czasie gromadzi się więc w komórkach nowotworowych w znacznie większej ilości niż w otaczających komórkach zdrowych i ujawnia się na scyntygramie. Mimo, że obrazowanie molekularne dotyczy tu bardzo pospolitego procesu metabolicznego, aktywnego w większości tkanek, różnice w ekspresji transporterów glukozy i heksokinazy między tkanką zdrową a tkanką nowotworową ułatwiają swoiste obrazowanie tej ostatniej, co więcej, pozwalają na monitorowanie żywotności komórek. Ryc. 6 Medycyna nuklearna w onkologii: 18FDG-PET 18 FDG odzwierciedla intensywnoĞü glikolizy w guzie puáapka molekularna 18 F-deoksyglukoza 18 F-deoksyglukozo-6-P heksokinaza Glukozo-6-P glukoza glukozo-6-fosfataza glikoliza MiĊsak uda z przerzutami do páuc i Ğródpiersia cykl Krebsa energia Scyntygrafia FDG-PET staje się powoli niezbędna w rozpoznaniu wielu nowotworów [14]. Siła obrazowania molekularnego w badaniach PET wychodzi jednak daleko poza stosowanie FDG. W tabeli 1 przedstawiono szereg znaczników pozytonowych i procesy molekularne, które można w ten sposób obrazować. Obrazowanie rozkładu receptorów estrogenowych w komórkach raka piersi i jego przerzutów za pomocą estradiolu znakowanego fluorem 18 jest bezpośrednim badaniem ekspresji tych białek in vivo o potencjalnym wielkim znaczeniu dla wyboru optymalnej terapii raka piersi. Trudno przecenić przyszłe zastosowanie markerów hipoksji guza, apoptozy czy oporności wielolekowej [20, 21, 22]. Trzeba jednak zaznaczyć, że wymienione w tabeli znaczniki znajdują się w fazie badań i jeszcze nie zostały wprowadzone do praktyki klinicznej. wani, ale którego ekspresji nie możemy obrazować, odczytywany jest w sposób wydajny. Gen GFP pełni więc w tym przypadku funkcję genu reporterowego. Podobne znaczenie mogą mieć geny zapisujące białka pobudzające bioluminescencję, na przykład gen lucyferazy – enzymu, którego produktem jest barwnik luminescencyjny (czyli świecący bez potrzeby wzbudzania, jak to ma miejsce przy fluorescencji). Inne metody obrazowania molekularnego Obrazowanie molekularne terapii genowej Spośród metod obrazowania diagnostycznego, stosowanych obecnie w medycynie, największe nadzieje wiąże się z rezonansem magnetycznym, ze względu na doskonałą czułość i rozdzielczość uzyskiwanych w ten sposób obrazów [23]. Klasyczne badanie MR dostarcza jednak głównie informacji anatomicznej, obrazowanie funkcjonalne, a tym bardziej obrazowanie molekularne za pomocą MR znajduje się dopiero w fazie rozwoju. Jeden z kierunków rozwijanych dla uzyskania informacji o znaczeniu funkcjonalnym zakłada spektroskopię rezonansu magnetycznego. Najwcześniej rozwinęła się spektroskopia protonów, ostatnio coraz szerzej wprowadza się spektroskopię jąder fosforu. Dla obrazowania molekularnego większe znaczenie będzie miało jednak wprowadzenie specjalnych znaczników, na przykład nanocząstek żelaza, którymi będzie się znakować przeciwciała czy inne związki organiczne. Jakkolwiek prowadzi się obecnie wiele badań nad takimi zastosowaniami MR, w praktyce czułość MR w obrazowaniu molekularnym jest o 4-6 rzędów wielkości niższa niż czułość PET i stąd kliniczne zastosowanie obrazowania molekularnego jest o wiele bliższe realizacji w tej ostatniej technice, mimo że wymaga specjalnego skanera i cyklotronu dla produkcji krótkożyciowych izotopów pozytonowych (podczas gdy dostępność badań MR w klinice jest oczywiście o wiele większa). W badaniach na zwierzętach wykorzystuje się także szereg metod optycznych, wykorzystujących bądź zjawisko fluorescencji bądź luminescencji [24]. Te metody nie mogą na dzisiejszym etapie rozwoju techniki znaleźć zastosowania u ludzi, gdyż grubość ich tkanek jest zbyt duża. U małych zwierząt doświadczalnych barwnik fluorescencyjny będzie przeświecał przez cienkie powłoki, możliwe też jest wzbudzenie tej fluorescencji w tkankach przez działanie źródłem światła ultrafioletowego z zewnątrz. Takie obrazowanie jest szczególnie często potrzebne dla sprawdzania ekspresji genów u zwierząt transgenicznych – a więc zwierząt, u których metodami inżynierii genetycznej wprowadziliśmy dodatkowy nowy gen i chcemy sprawdzić, czy ulega on wydajnej ekspresji. Jeżeli pod tym samym promotorem wprowadzimy gen kodujący barwnik fluorescencyjny (na przykład zielone białko fluorescencyjne, GFP), to pojawienie się zielonego świecenia we wszystkich tkankach myszy transgenicznej lub tylko w wybranych narządach przy bardziej wybiórczych metodach transgenezy (np. metoda CrE-Loc) będzie dowodem, że również drugi gen, którego wprowadzeniem jesteśmy zaintereso- Terapia genowa, która polega na wprowadzaniu brakujących lub dodatkowych genów do komórek (Ryc.7), dzięki czemu zmieniamy ich właściwości – przywracamy im brakującą funkcję albo stymulujemy nowa funkcję, jest przedmiotem ogromnych oczekiwań ze strony wszystkich specjalności medycznych. W endokrynologii myślimy przede wszystkim o uzupełnieniu produkcji hormonów białkowych i o efektach przeciwnowotworowych, żeby wymienić tylko próby terapii genowej cukrzycy czy terapii agresywnych raków tarczycy – raka anaplastycznego czy raka rdzeniastego. Niemniej, oczekiwania jakie wiążemy od co najmniej 10 lat z wprowadzeniem terapii genowej, nie wypełniły się dotąd i rutynowych protokołów opracowano niewiele, a w endokrynologii jeszcze żadnego. Wynika to między innymi z niewielkiej wydajności transfekcji albo nietrwałości ekspresji wprowadzonego genu. Dlatego niezwykle ważnym elementem dalszych prac nad terapią genową staje się wprowadzenie skutecznych, nieinwazyjnych metod badania ekspresji genów in vivo, co dostarczyło silnego impulsu dla rozwoju obrazowania molekularnego [25]. Ryc. 7 Schemat terapii genowej gen inĪynieria genetyczna wektor (plazmid) transfekcja nowy gen transfekcja komórki pakujące komórka docelowa transdukcja retrowirusy, adenowirusy wirus pozbawiony zdolnoĞci do replikacji Jak obrazować skuteczność terapii genowej? Przeanalizujmy to na przykładzie kinazy tymidynowej wirusa opryszczki zwykłej (HSV1TK), jednego z genów najczęściej używanych w terapii genowej nowotworów (Ryc. 8). Ta kinaza, w przeciwieństwie do endogennej kinazy tymidynowej ssaków, charakteryzuje się nieco szerszym powinowactwem substratowym – fosforyluje nie tylko tymidynę, ale również zbliżone nukleozydy, w tym gancyklowir, zamieniając go w silny środek genotoksyczny. Jeżeli więc gen HSV1TK wprowadzimy do komórek guza, a następnie podamy 437 MATERIAŁY ZJAZDOWE Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Ryc. 8 Obrazowanie molekularne terapii genowej na przykładzie genu kinazy tyrozynowej („gen samobójczy”) Terapia genem samobójczym Ogromne zainteresowanie metodami obrazowania molekularnego, jakie notujemy ostatnio zarówno w badaniach doświadczalnych jak i w klinice, wynika z wielkich gen komórki komórki nowotworowe możliwości poszerzenia spektrum prawidáowe nie poddane terapii zawierają HSV1-TK enzym genowej HSV1-TK badań diagnostycznych, lepszego zrozumienia patofizjologii chorób „bystander effect” dotychczas nieuleczalnych i perspekb stander effect tywy stosowania tych metod w rozwoju terapii celowanej („targeted therapy”). Można się spodziewać, Ğmierü komórki Ğmierü komórki że w najbliższych latach klinicznie nowotworowej prawidáowej użyteczne obrazowanie molekuuáapka metaboliczna) larne będzie prowadzone przede wszystkim metodami medycyny nuklearnej, zarówno choremu gancyklowir, to dla innych komórek ciała przez badania SPECT jak i PET. W porównaniu do będzie on środkiem nietoksycznym, gdyż nie będzie klasycznych metod obrazowania, dających przede ulegał fosforylacji. Jedynie w tych komórkach guza, w wszystkim informację anatomiczną (Ryc. 9), rozszerzy których doszło do wydajnej transfekcji, będzie zachoto nasz horyzont o badania funkcjonalne na poziomie dziła reakcja uczynniania cytostatyku i te komórki molekularnym. W przyszłości można się spodziezostaną śmiertelnie zagrożone. Niestety, możemy wać, że także za pomocą rezonansu magnetycznego liczyć się też z tak zwanym efektem sąsiedztwa (bybędziemy mogli obrazować ekspresję określonych stander effect) – z jednej strony gen może przejść także białek i śledzić wybrane procesy molekularne. do zdrowych komórek z sąsiedztwa guza, z drugiej strony może dojść do przenikania uczynnionego Ryc. 9 Obrazowanie może odbywać się na różnych poziomach cytostatyku (Ryc. 8). informacyjnych Jeżeli po przeprowadzeniu terapii genowej informacja podamy najpierw znakowany analog gancyklowiru Technika anatomiczna fizjologiczna metaboliczna molekularna (dysponujemy zarówno znacznikiem pozytonowym, jak i klasycznym znacznikiem gamma), to wykonując CT scyntygrafię możemy uwidocznić zarówno pożądaną ekspresję genu w komórkach nowotworowych – i przy US okazji przynajmniej półilościowo ocenić jej nasilenie – MRI jak i ekspresję niepożądaną, zachodzącą w komórkach zdrowych [26]. Nuklearna Znacznie częstsza, i trudniejsza jest sytuacja, w Optyczne której wprowadzany gen wcale nie jest enzymem albo nie ma możliwości uwidocznienia powstająNanosensorowa cego produktu reakcji. Wówczas można zastosować wspomniany powyżej model genu reporterowego. Doświadczalnie wykorzystuje się wówczas najczęMetody optyczne pozostają dzisiaj w kręgu zainteściej również gen HSV1TK, wyprowadzając go resowań medycyny doświadczalnej, gdyż możliwe pod wspólnym promotorem z genem docelowym. są tylko w stosunku do małych zwierząt. Ich rozwój Ostatnio rozważa się również gen symportera wynika dzisiaj również faktu, że tomografy kompusodowo-jodkowego jako gen reporterowy, ze względu terowe czy skanery PET optymalizowane są do badań na znaczną prostotę i dostępność wymaganych na ludziach i nie można za pomocą zwykłych obrazów radiofarmaceutyków – jodu lub technetu promieuzyskiwać obrazów małych zwierząt. Stąd wynika niotwórczego [25]. W przyszłych badaniach u ludzi albo potrzeba budowy specjalnych aparatów TK i PET myśli się również w tym kontekście o genie receptora dla myszy – i takie aparaty zresztą już powstają [28] somatostatynowego sstr2, gdyż ligandy receptora są – albo konieczność szukania innych metod obrazowajuż dopuszczonymi na rynku radiofarmaceutykami, nia. Dlatego obrazowanie terapii genowej, która dziś co w badaniach na ludziach ma duże znaczenie [27]. odbywa się jeszcze na ogół na modelu zwierzęcym, W badaniach zwierzęcych wykorzystuje się też gen dokonywane jest często poprzez geny reporterowe dla receptora dopaminowego, ze względu na bardzo produktów wykazujących zdolność fluorescencji czy wysoką swoistość tego obrazowania – z gromadzeluminescencji. Można się jednak spodziewać, że także niem fizjologicznym mamy do czynienia wyłącznie w w medycynie rozwój nowych technik obrazowania mózgu. Co więcej, przy wieloetapowej terapii genowej molekularnego nie ograniczy się tylko do techniki można na każdym etapie stosować inny gen reportePET, SPECT czy MR. rowy, co ułatwia kontrolę nad jej przebiegiem. substrat leku (gancyklowir) MATERIAŁY ZJAZDOWE Terapia genem samobójczym moĪe byü monitorowana bezpoĞrednio Perspektywy obrazowania molekularnego 438 znakowany analog leku 18 123 FMBG IVFRU 123 IFIRU Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Piśmiennictwo: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. Golub TR, Slonim DK, Tamayo P et al. Molecular Classification of Cancer: Class Discovery and Class Prediction by Gene Expression Monitoring. Science 1999; 286: 531-537 Marx J. DNA arrays reveal cancer in its many forms. Science 2000; 289: 1670-1672 Blohm DH, Guiseppi-Elie A. New developments in microarray technology Current Opinion in Biotechnology 2001; 12: 41-47 Jarząb B, Włoch J, Gubała E. DNA microarrays in oncology – description of a new tool. Annals Diag Paediatric Pathol 2003; 7: 21-27 Dhanasekaran SM, Barrette TR, Ghosh D, Shah R, Varambally S, Kurachi K, Pienta KJ, Rubin MA, Chinnaiyan AM. Delineation of prognostic biomarkers in prostate cancer. Nature 2001; 412: 822-826 Van’t Veer LJ, De Jong D. The microarray way to tailored cancer treatment. Nat Med 2002; 8: 68-74 Vant’t Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 2002; 415: 530-6 Monni O, Hyman E, Mousses S et al. From chromosomal alterations to target genes for therapy: integrating cytogenetic and functional genomic views of the breast cancer genome. Cancer Biol 2001; 11: 395-401 Gruvberger S, Ringnér M, Cehn Y et al. Estrogen receptor status in breast cancer is associated with remarkably distinct gene expression patterns. Can Res 2001; 51: 5979-5984 Weitzel JM, Radtke C, Seitz HJ. Two thyroid hormonemediated gee expression patterns in vivo identified by cDNA expression arrays in rat. Nucl Acid Res 2001; 29:5148-5155 DNA Microarrays. A molecular cloning manual. Bowtell D, Sambrook J (eds.) 2003 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York Celis JE, Kruhöffer M, Gromova I et al. Gene expression profiling: monitoring transcription and translation products using DNA microarrays and proteomics. FEBS Lett 2000; 480: 2-16 Lok C. Picture perfect. Nature 2001; 412(6845): 372-374 Bishof DA. Progress in the diagnosis and treatment of disease by nuclear medicine and molecular imaging: highlights of the European Association of Nuclear Medicine Congress, Naples 2001. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2002; 29: 139-159 Dohan O, De L, Paroder V, Riedel C, Artani M, reed M et al. The sodium/iodide symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocr Rev 2003; 24: 48-77 Ugur O, Kothari PJ, Finn RD, Zanzonico P, Ruan S, Guenther I et al. Ga-66 labeled somatostatin analogue DOTA-Dphe1Tyr3-octreotide as a potential agent for positron emission tomography imaging and receptor mediated internal radiotherapy of somatostatin receptor positive tumors. Nucl Med Biol 2002; 29: 147-157 Froidevaux S, Erlebe AN, Christe M, Sumanovski L, Heppeler A, Shmitt JS et al. Neuroendocrine tumor targeting: study of novel gallium-labeled somatostatin radiopeptides in a rat pancreatic tumor model. Int J Cancer 2002; 98(6): 930-937 Czernin J, Phelps ME. Positron emission tomography scanning: current and future applications. Annu Rev Med 2002; 53: 89-112 Brady F, Luthra SK, Brown GD, Osman S, Aboagye E, Seleem A et al. Radiolabelled tracers and anticancer drugs for assessment of therapeutic efficacy using PET. Curr Pharm Des 2001; 7: 1863-1892 20. Chapman JD, Schneider RF, Urbain JL, Hanks GE. Singlephoton emission computed tomography and positronemission tomography assays for tissue oxygenation. Semin Radiat Oncol 2001; 11: 47-57 21. Engelhardt EL, Schneider RF, Sheeholzer SH, Stobbe CC, Chapman JD. The synthesis and radiolabeling of 2nitroimidazole derivatives of cyclams and their preclinical evaluation as positive markers of tumor hypoxia. J Nucl Med 2002; 43: 837-850 22. Mier W, Haberkorn U, Eisenhut M. [18F] FLT; portrait of a proliferation marker. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2002; 29: 165-169 23. Hogemann D, Basilion JP. ‚Seeing inside the body’: MR imaging of gene expression. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2002; 29: 400-408 24. Weissleder R. Scaling down imaging: molecular mapping of cancer in mice. Nat Rev Cancer 2002; 2: 11-18 25. Heberkorn U, Altman A. Imaging methods in gene therapy of cancer. Curr Gene Ther 2001; 1: 163-182 26. Wiebe LI, Knaus EE, Enzyme-targeted, nucleoside-based radiopharmaceuticals for scintigraphic monitoring of gene transfer and expression. Curr Pharm Des 2001; 7: 1893-1906 27. Zinn KR, Chaudhuri TR. the type 2 human somatostatin receptor as a platform for reporter gene imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2002; 29: 388-399 28. Chatziioannou AF. Molecular imaging of small animals with dedicated PET tomographs. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2002; 29: 98-114 29. Brown VM, Ossadtchi A, Khan AH et al. High-throughput imaging of brain gene expression. Genome Res 2002; 12: 244245 MATERIAŁY ZJAZDOWE Obrazowanie molekularne odnosi się na razie do jednego lub najwyżej 2-3 genów jednocześnie. Rozwój wysokowydajnych metod genomiki stwarza pytanie o obrazowanie profilu ekspresji genów. In vivo jest to na razie nie możliwe, ale podejmuje się już pierwsze próby trójwymiarowej wizualizacji danych uzyskanych in vitro [29]. 439 Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Katarzyna Łącka Molecular and clinical aspects of thyroid hormones binding protein defects Department of Endocrinology, Metabolism and Internal Medicine, K. Marcinkowski University of Medical Sciences, Poznań, Poland Summary: Data of thyroid hormones binding protein with special respect to thyroxine binding globulin (TBG) have been presented. Their properties and clinical abnormalities which lead to their disturbances (excess and deficiency) have been described. An attention is drawn to congenital defects of thyroxine binding globulin; describing changes in TBG gene leading to various TBG types. Key words: thyroid hormone protein binding, TBG, congenital defect of TBG, TBG gene mutations, TBG types Katarzyna Łącka Molekularne i kliniczne aspekty zaburzeń białek wiążących hormony tarczycy MATERIAŁY ZJAZDOWE Katedra Endokrynologii, Przemiany Materii i Chorób Wewnętrznych Akademia Medyczna im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu Streszczenie: W pracy przedstawiono informacje na temat białek wiążących hormony tarczycy, ze szczególnym uwzględnieniem globuliny wiążącej tyroksynę (TBGThyroxine Binding Globulin). Omówiono właściwości tychże białek i stany kliniczne prowadzące do ich zaburzeń (nadmiaru i niedoboru). Zwrócono uwagę na wrodzone zaburzenia białek wiążących hormony tarczycy; opisując zmiany w genie kodującym TBG a prowadzące do różnych wariantów białka TBG Słowa kluczowe: białka wiążące hormony tarczycy, TBG, wrodzone defekty TBG, mutacje genu TBG, warianty TBG Wstęp Tabela 1. Białka transportujące hormony tarczycy w surowicy krwi. Hormony tarczycy w surowicy krwi występują w postaci wolnej, stanowiącej 0,03%-0,05% ogólnej ilości tyroksyny i około 0,3% ogólnej ilości trijodotyroniny oraz w postaci związanej z nośnikami białkowymi (całkowite hormony tarczycy). Białka nośnikowe, syntetyzowane w wątrobie, oprócz funkcji transportującej, stanowią ważny magazyn hormonów tarczycy. Wśród białek wiążących hormony tarczycy (TBP-Thyroxine Binding Protein) wyróżnia się: białko wiążące tyroksynę (TBG-Thyroxine Binding Globulin), prealbuminę oraz albuminę wiążącą hormony tarczycy (odpowiednio: TBPA-Thyroxine Binding Prealbumin oraz TBA-Thyroxine Binding Albumin). Tyroksyna jest związana w 70% z TBG, w 20% z TBPA i w 10% z TBA; natomiast trijodotyronina związana jest w 70-80% z TBG, w 10-20% z TBPA i w minimalnych ilościach z TBA. Globulina wiążąca tyroksynę (TBG) TBG, główne białko wiążące hormony tarczycy, zostało opisane i częściowo scharakteryzowane w roku 1952 przez Gordona i wsp. [1]. Jest to αglobulina o ciężarze cząsteczkowym około 54 000D, produkowana przez komórki wątroby [2, 3]. TBG jest glokiproteiną o zawartości węglowodanów około 15%. Pojedynczy łańcuch polipeptydowy składa się z 395 aminokwasów i wykazuje homologię w 55-56% 440 Dr hab. Katarzyna Łącka Katedra Endokrynologii, Przemiany Materii i Chorób Wewnętrznych Akademia Medyczna im. K. Marcinkowskiego Przybyszewskiego 49, 60355 Poznań E-mail: [email protected] %LDäNR 0DVD F]ñVWHF]NRZD 5R]PLHV]F]HQLH 7 7 *OREXOLQD ZLññFD W\URNV\Qö 7%*7K\UR[LQH %LQGLQJ *OREXOLQ 3UHDOEXPLQD ZLññFD W\URNV\Qö 7%3$7K\UR[LQH %LQGLQJ 3UHDOEXPLQ $OEXPLQD ZLññFD W\URNV\Qö 7%$7K\UR[LQH %LQGLQJ $OEXPLQ QLH]QDF]QH LORFL z globuliną wiążącą kortyzol (CBG, transkortyna), α1-antytrypsyną i antychemotrypsyną [4, 5]. Opracowanie radioimmunologicznej metody oznaczania TBG w surowicy przez Refetoffa i wsp. w roku 1984 umożliwiło badania tego nośnika hormonów tarczycy w różnych stanach patologicznych oraz określenie ich przydatności w diagnostyce [6]. Stężenie TBG w surowicy przy użyciu metody fluoroimmunometrycznej (FIA; Delphia kits) u osób zdrowych wynosi od 13,6 do 36,6 mg/l. Stężenie TBG w surowicy ulega zmianom pod wpływem hormonów, leków oraz w niektórych chorobach. Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) 1. hiperestrogenizacja (ciąża, antykoncepcja, guzy wydzielające estrogeny) 2. u noworodków 3. wiek podeszły 4. ostre i przewlekłe zapalenia wątroby 5. pierwotna marskość żółciowa wątroby 6. porfiria 7. chłoniaki 8. niektóre leki: klofibrat, estrogeny, metadon 9. heroina 10. genetycznie uwarunkowany nadmiar TBG Tabela 3. Przyczyny niedoboru TBG (TBG deficiency: TBG-D) 1. 2. 3. 4. 5. 6. zespół cushinoidalny akromegalia marskość wątroby zespół nerczycowy wyniszczenie, niedożywienie leki: glikokortykosteroidy, androgeny (m.in. danazol), L-asparaginaza 7. genetycznie uwarunkowany niedobór TBG Zaburzenia TBG Wyróżnia się trzy typy genetycznie uwarunkowanych zaburzeń TBG. Są to całkowity niedobór TBG (TBG complete deficiency: TBG-CD), częściowy niedobór TBG (TBG partial deficiency: TBG-PD) oraz nadmiar TBG (TBG excess: TBG-E) [7, 8]. Tabela 4 przedstawia krótki rys historyczny badań nad defektami TBG. Tabela 4. Główne etapy badań zaburzeń TBG 1952–Gordon et al.[1] – odkrycie TBG 1959–Beierwaltes et Robbins [9] – pierwszy opis rodziny ze wzrostem TBG 1964–Nicloff et al. [10] – pierwszy opis rodziny z niedoborem TBG 1966–Nikolai et al. [11] – powiązanie rodzinnie występującego niedoboru TBG z chromosomem X 1967–Nikolai et al. [12] – powiązanie rodzinnie występującego nadmiaru TBG z chromosomem X 1968–Refetoff et Selenkow [13] – opis rodzinnie występującego niedoboru TBG u chorej z zespołem Turnera (45,X) Nadmiar TBG. Postać dziedziczna nadmiaru TBG występuje bardzo rzadko, a przekazywana jest potomstwu jest jako cecha związana z chromosomem X. Częstość występowania tego zespołu waha się w szerokich granicach od 1:6000 w regionie Bermingham w Wielkiej Brytanii do 1: 40 000 w USA [14, 15, 16]. Klinicznie występuje wole bez zaburzeń czynności tarczycy. Opisywane są przypadki z tarczycą niepowiększoną, a także współistniejącym limfocytarnym zapaleniem tarczycy. U niektórych chorych obserwuje się niski wzrost. W badaniach dodatkowych w surowicy stwierdza się podwyższone stężenie TBG i całkowitych hormonów tarczycy (cT4 i cT3), obniżony współczynnik wiązania trijodotyroniny oraz prawidłowe stężenie wolnych hormonów tarczycy, indeksu wolnych hormonów, stężenia TSH w warunkach podstawowych i po stymulacji TRH, a także prawidłową jodochwytność tarczycy [7, 8, 17]. Niedobór TBG. Samoistne zmniejszenie stężenie TBG w surowicy lub jego brak jest chorobą uwarunkowaną genetycznie i występuje z częstością 1:5000 do 1 :13 000 wśród rasy kaukaskiej oraz 1:1200 do 1:9000 wśród japończyków [14]. Sposób dziedziczenia określa się jako dominujący, związany z chromosomem X. Stąd zupełny brak TBG występuje u mężczyzn-homozygot, natomiast zmniejszona pojemność TBG może się pojawić u kobiet heterozygot. Badanie kliniczne chorych z niedoborem TBG ujawnia wole; wyjątkowo rzadko może występować tarczyca prawidłowej wielkości. U przeważającej części osób stwierdza się prawidłową czynność tarczycy, niekiedy mogą pojawić się objawy hipo- lub hipertyreozy [18]. Badania biochemiczne wykazują obniżenie lub całkowity brak TBG w surowicy, spadek stężenia całkowitych hormonów tarczycy przy podwyższonej wartości indeksu trijodotyroniny oraz prawidłowe stężenie wolnych hormonów tarczycy i TSH. Ponadto stwierdza się brak wzrostu stężenia TBG po podaniu estrogenów i prawidłową reakcję poziomu TSH po podaniu TRH [7, 8, 17]. Spośród zaburzeń białek wiążących hormony tarczycy defekty TBG są najczęstsze. Jednak opisywane są rzadkie przypadki zaburzeń albuminy i Gen TBG Gen kodujący globulinę wiążącą tyroksynę TBG zlokalizowany jest na długim ramieniu chromosomu (Xq21-22) [19]. Stąd pełna ekspresja fenotypowa defektów TBG występuje u płci męskiej. cDNA dla TBG (SERPINA 7) długości 5.5 kpz składa się z pięciu eksonów. Rycina 1 przedstawia lokalizację genu TBG oraz jego strukturę [20,21]. Warianty TBG Zmiany w genie TBG prowadzą do powstania różnych wariantów białka TBG, które biochemiczne powodują całkowity lub częściowy niedobór TBG, nadmiar TBG lub dają stany przebiegające z prawidłowym stężeniem TBG. Są one wynikiem różnego typu mutacji zlokalizowanych w eksonach genu kodującego białko TBG lub, rzadziej, jego promotorze. Warianty TBG prowadzące do całkowitego wrodzonego niedoboru TBG w surowicy (TBG-CD). TBG-CD5 [22] Leu227Pro (CTA→CCA) Leu283Phe (TTG→TTT) (opisano u Francuzów Kanadyjskich, zmiany w eksonie 2 i 3) TBG-CD6 [23] delecja nukleotydu 165 (opisano u Anglików, zmiany w eksonie 1, zmiana ramki odczytu prowadząca do skrócenia łańcucha do 441 MATERIAŁY ZJAZDOWE Tabela 2. Przyczyny nadmiaru TBG (TBG excess: TBG-E) Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE 167 aminokwasów zamiast 395) TBG-CDJ (Japan) [23,28] delecja I zasady eksonu 352 w eksonie 4 (częsta mutacja u Japończyków) TBG-CD-Yonago [24] mutacja punktowa w eksonie 144 i 145 (zamiana cytozyny i tyminy na adeninę w eksonie 1 prowadząca do zmiany ramki odczytu; stop kodon w kodonie 51) TBG-CD-Buffalo [25] Trp280Stop (TGG→TAG) w eksonie 3 Leu283Phe ( TTG→TTT) w eksonie 3 (prowadzi do braku 116 wminokwasów) TBG-CD-Kankakee [26] insercja w eksonie 2 TBG-CD-Negev [27] delecja w kodonie 38 (ekson 1) (u Beduinów w Izraelu) Warianty TBG prowadzące do częściowego wrodzonego niedoboru TBG w surowicy TBG-PD). TBG-PD-Kumamoto) [28] Prol363Leu (CCT→CTT) MATERIAŁY ZJAZDOWE TBG-PDJ (Japan) [29] Prol363Leu (CCT→CTT) TBG-S [30] Asp171Asn (GAC→AAC) TBG-San Diego [31] Ser23Thr (TCA→ACA) TBG-A [32] Thr191Ala (ACA→GCA) Phe283Leu (TTT→TTG) TBG-Quebec [33] His331Tyr (CAT→TAT) TBG-Montreal [34] Ala113Prol (GCC→CCC) TBG-G Gary [35] Ile96Asn (ATC→AAC) Warianty TBG prowadzące do nadmiaru TBG. Powstają w wyniku amplifikacji genu (duplikacji lub triplikacji) [36,37]. Warianty TBG przebiegające z prawidłowym jego stężeniem w surowicy. TBG-Poly [38] Leu283Phe (TTG→TTT) defektu genetycznego, który byłby odpowiedzialny za niedobór TBG [39]. Do chwili obecnej opisano zmiany o charakterze mutacji punktowych prowadzących do zamiany aminokwasów zmieniających właściwości lub stężenie TBG w surowicy (np. w TBG-PD), zmiany o charakterze duplikacji lub triplikacji genu (np. TBG-E) lub zmian, w wyniku których dochodzi do przedwczesnego zakończenia procesu translacji (np. skrócenie łańcucha TBG o 116 aminokwasów w przypadku TBG-CD-Buffalo) [22-38]. Rodzinnie izolowana hipertyroksynemia (hipertyroksynemia dysalbuminemiczna). Choroba ta została po raz pierwszy opisana w roku 1979 przez Hennemanna i wsp. oraz Lee i wsp.[40,41]. Występuje bardzo rzadko, częściej u rasy kaukaskiej. Dziedziczy się w sposób autosomalny, dominujący. Przyczyną choroby są zmiany ilościowe lub jakościowe albuminy wiążącej tyroksynę (TBA) powstające w wyniku mutacji w obrębie genu kodującego to białko. Spośród opisanych mutacji genu TBA najczęstsze są zlokalizowane w kodonie 218. Są to: 218CGC→CAC prowadząca do zamiany aminokwasów A218H [42, 43] oraz 218CGC→CCC dająca zamianę A218P [44]. Choroba charakteryzuje się eutyreozą przy następujących parametrach biochemicznych: ↑cT4, ↑cT3, →T3I, ↑wT4I, →wT3, →wT4, oraz zwiększeniem wiązania T4 przez albuminy. Wzrost TBPA Ta postać zaburzeń białek wiążących hormony tarczycy występuje wyjątkowo rzadko. Przyczyną schorzenia jest wzrost stężenia prealbuminy wiążącej tyroksynę. Dziedziczy się w sposób autosomalny, dominujący. Chorobę rozpoznaje się na podstawie następujących zmian w surowicy krwi: wzrostu stężenia tyroksyny i indeksu wolnej tyroksyny przy prawidłowej wartości współczynnika wiązania trijodotyroniny, indeksu wolnej trijodotyroniny oraz prawdiłowym stężeniu trijodotyroniny. W Polsce brak precyzyjnych danych na temat częstości występowania wrodzonych defektów TBG. Brak również danych na temat zmian molekularnogenetycznych prowadzących do powstania zaburzeń ilości i jakości TBG u chorych. W chwili obecnej prowadzone są badania nad ustaleniem mutacji w obrębie genu kodującego białko TBG w dwóch rodzinach z całkowitym wrodzonym niedoborem TBG (w opracowaniu). Piśmiennictwo TBG-Chicago [33] Tyr 309Phe (TAT→TTT) 1. W roku 2002 Reutrakul i wsp. opisali przypadki chorych z wrodzonym całkowitym niedoborem TBG w surowicy, u których nie znaleziono żadnych mutacji zarówno w eksonach jak i w promotorze, co sugerowałoby możliwość występowania jeszcze innego 2. 442 3. Gordon AH, Gross J, O’Connor D, Pitt-Rivers R. Nature of the circulating thyroid hormone-plasma protein complex. Nature 1952; 169:19-25 Marshall JS, Pensky J, Green AM. Studies on human thyroxine-binding globulin. IV The nature of slow thyroxinebinding globulin. J Clin Invest 1972; 51: 3173-3179 Bartalena L, Tata JR, Robbins J. Characterization of nascent and secreted thyroxine-binding globulin in cultured human hepatoma (Hep G2) cells. J Biol Chem 1984; 259:13605-609 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. Flink IL, Bailey TJ, Gustefson TA, Markham BE, Morkin E. Complete amino aced sequence of human thyroxine-binding globulin (TBG) deduced from cloned DNA:close homology to the serine antiproteases. Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83: 7708-7712 Hammond GL, Smith CL, Goping IS, Underhill DA, Harley MJ, Reventos J, Musto NA, Gunsalus GL, Bardin CW. Primary structure of human corticosteroid binding globulin deduced from hepatic and pulmonary cDNAs, exhibits homology with serine protease inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84: 5153-5158 Refetoff S, Murata Y, Vassart G, Chandromouli V, Marshall JS. Radioimmunoassays specific for the tertiary and primary structures of thyroxine-binding globulin (TBG): measurement of denatured TBG in serum. J Clin Endocrinol Metab 1984; 59:269-278 Refetoff S. Inherited thyroxine-binding globulin abnormalities in man. Endocr Rev 1989; 10:275-293 Burr WA, Ramsden DB, Hoffenberg R. Hereditary abnormalities of thyroxine-binding globulin concentration. Quart J of Med, 1980; 49: 295-313 Beierwaltes WH, Robbins J. Familial increase in the thyroxine-binding sites in serum alpha globulin. J Clin Invest 1959; 38: 1683-89 Nicoloff JT, Dowling JT, Patton DD. Inheritance of decreased thyroxine-binding by the thyroxine-binding globulin. J Clin Endocrinol Metab 1964; 24: 294-298 Nikolai TF, Seal US. X-chromosome linked familial decrease in thyroxine-binding globulin deficiency. J Clin Endocrinol Metab 1966; 25: 835-839 Nikolai TF, Seal US. X-chromosome linked inheritance of thyroxine-binding globulin deficiency. J Clin Endocrinol Metab 1967; 27: 1515-1522 Refetoff S, Selenkow HA. Familial thyroxine-binding globulin deficiency in a patient with Turner’s syndrome (XO): genetic study of a kindred. N Engl J Med 1968; 278: 1081-1089 Jenkins MB, Steffes MW. Congenital thyroxine binding globulin deficiency: incidence and inheritance. Hum Genet 1987; 77:80-84 Mandel S, Hamma C, Boston B, Sesser D, LaFranchi S. Thyroxine-binding globulin deficiency detected by newborn screening. J Pediatr 1993, 122:227-230 Carta-Soorcini M, Moschini L, Fiore L, et al. Familial thyroxine-binding globulin deficiency detected in a pilot screening program for congenital hypothyroidism. J Endocrinol Invest 1982; 5:21-25 Łącka K. Choroby tarczycy. Rozpoznawanie i leczenie. PZWL, Wyd II. 2001: 148-150 Tojo K, Miura Y, Mori Y, Yano M, Tanaka H, Hosoya T, Sakai O. Familial thyroxine-binding globulin deficiency associated with hyperthyreoidism. Inter Med 1995; 34(5): 413-417 Trent JM, Flink IL, Morkin E, Van Tuinen P, Ledbetter DH. Localization of the human thyroxine-binding globulin gene to the long arm of the X-chromosome (Xp21-22). Am J Hum Genet 1987; 41:428-435 Hayashi Y, Mori Y, Janssen OE, Sunthornthepvarakul T, Weiss RE, Takeda K, Weinberg M, Seo H, Bell GI, Refetoff S. Human thyroxine-binding globulin gene: complete sequence and transcriptional regulation. Mol Endocrinol 1993; 7:10491060 Refetoff S, Murata Y, Mori Y, Janssen OE, Takeda K, Hayashi Y. Thyroxine-binding globulin: organization of the gene and variants. Hor Res 1996; 45:128-138 Mori Y, Takeda K, Charboneeau M, Refetoff S. Replacement of Leu227 by Pro in thyroxine-binding globulin (TBG) is associated with complete TBG deficiency in three of eight families with this inherited defect. J Clin Endocrinol Metab 1990; 70: 804-809 Takeda K, Iyota K, Mori Y, Tamura Y, Suehiro T, Kubo Y, Refetoff S, Hashimoto K. Gene screening in Japanese families with complete deficiency of thyroxine-binding globulin demonstrates that a nucleotide deletion at codon 352 may be a race specific mutation. Clin Endocrinol (Oxf) 1994; 40:221226 24. Ueta Y, Mitani Y, Yoshida A, Taniguchi S, Mori A, Hattori K, Husatome I, Manabe I, Takeda K, Sato R, Ahmmed GU, Tsuboi M, Ohtahara A, Hiroe K, Tanaka Y, Shigemasa C. A novel mutation causing complete deficiency of thyroxinebinding globulin. Clin Endocrinol (Oxf) 1997; 47: 1-5 25. Carvalho GA, Weaiss RE, Vladutiu AO, Refetoff S. Complete deficiency of thyroxine-binding globulin (TBG-CD Buffalo) caused by a new nonsense mutation in the thyroxine-binding globulin gene. Thyroid 1998; 8: 161-165 26. Carvalho GA, Weiss RE, Refetoff S. Complete thyroxinebinding globulin (TBG) deficiency produced by a mutation in acceptor splice site causing frameshift and early termination of translation (TBG-Kankakee). J Clin Endocrinol Metab 1998; 83: 3604-3608 27. Miura Y, Hershkovitz E, Ingaki A, Parvari R, Oiso Y, Phillip M. A novel mutation causing complete thyroxine-binding globulin deficiency (TBG-CD-Negev) among the Bedouins in Southern Israel. J Clin Endocrinol Metab 2000; 85: 3687-3689 28. Shirotani T, Kishikawa H, Wake N, Miyamura N, Hashimoto Y, Motoyoshi S, Yamaguchi K, Shichiri M. Thyroxine-binding globulin variant (TBG-Kumamoto): identification of a point mutation and genotype analysis of its family. Endocrinol Jpn 1992; 39:577-584 29. Miura Y, Mori Y, Yamammori I, Tani Y, Murata Y, Yoshimoto M, Kinoshita E, Matsumoto T, Oiso Y, Seo H. Sequence of a variant thyroxine-binding globulin (TBG) in a family with partial TBG deficiency in Japanese (TBG-PDJ). Endocr J 1993; 40:127-132 30. Waltz MR, Pullman TN, Takeda K. Molecular basis for the properties of the thyroxine-binding globulin-slow variant in American Blacks. J Endocrinol Invest 1990; 13:343-349 31. Bertenshaw R, Sarne D, Tornari J, Weinberg M, Refetoff S. Sequencing of the variant thyroxine-binding globulin (TBG) San Diego reveals two nucleotide substitutions. Biochem Biophys Acta 1992; 1139:307-310 32. Takeda K, Mori Y, Sobieszczyk S, Seo H, Dick M, Watson F, Flink IL, Seino S, Bell GI, Refetoff S. Sequence of the variant thyroxine-binding globulin of Australian Aborigines: only one of two amino acid replacements is responsible for its altered properties. J Clin Invest 1989; 83:1344-1348 33. Bertenshaw R, Takeda K, Refetoff S. Sequencing of the variant thyroxine-binding globulin (TBG)-Quebec reveals two nucleotide substitutions. Am J Hum Genet 1991; 48:741744 34. Janssen OE, Takeda K, Refetoff S. Sequence of the variant thyroxine-binding globulin (TBG) in a Montreal family with partial TBG deficiency. Hum Genet 1991; 87:119-122 35. Kambe F, Seo H, Mori Y,Murata Y, Janssen OE, Refetoff S, Matsui N. An additional carbohydrate chain in the variant thyroxine-binding globulin Gary (TBGAsn-96) impairs its secretion. Mol Endocrinol 1992; 6:443-449 36. Mori Y, Miura Y, Takeuchi H, Igarashi Y, Sugiura J, Saito H, Oiso Y. Gene amplification as a cause of inherited thyroxinebinding globulin excess in two Japanese families. J Clin Endocrinol Metab 1995; 80: 3758-3762 37. Mori Y, Jing P, Kayama M, Fujieda K, Hasegawa T, Nagimori T, Hirooka Y, Mitsuma T. Gene amplification as a common cause of inherited thyroxine- binding globulin excess: analysis of one familial and two sporadic cases. Endocr J 1999; 46: 613-619 38. Takamatsu J, Refetoff S. Inherited heat stable variant thyroxine-binding globulin (TBG Chocago). J Clin Endocrinol Metab 1986; 63: 1140-1145 39. Reutrakul S, Dumitrescu A, Macchia PE, Moll GW Jr, Vierhapper F, Refetoff S. Complete thyroxine-binding globulin (TBG) deficiency in two families without mutations in coding or promoter regions of the TBG genes: in vitro demonstration of exon skipping. J Clin Endocrinol Metab 2002; 87: 1045-1051 40. Hennemann G, Docter R, Krenning EP, Bos G, Otten M, Visser TJ. Raised total thyroxine and free thyroxine index but normal free thyroxine. A serum abnormality due to inherited increased affinity of iodothyronines for serum binding protein. Lancet 1979; 1: 639-642 443 MATERIAŁY ZJAZDOWE Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE 41. Lee WNP, Golden MP, Van Herle AJ, Lippe BM, Kaplan SA. Inherited abnormal thyroid hormone-binding protein causing selective increase of total serum thyroxine. J Clin Endocrinol Metab 1979; 49: 292-299 42. Peterson CE, Scottolini AG, Cody LR, Mandel M, Reimar N, Bhagavan NV. A point mutation in the human serum albumin gene results in familial dysalbuminaemic hyperthyroxinemia. J Med Genet 1994; 31: 355-359 43. Southornthepvarakul T, Angkeow P, Weiss RE, Hayashi Y, refetoff S. An identical missense mutation in the albumin gene results in familial dysalbuminemic hyperthyroxinemia in 8 unrelated families. Bioch Biohys Res Commun 1994; 202: 781-787 44. Wada N, Hitoshi C, Chikara S, Hiromichi K, Mitsumasa K, Takao K. A novel missense mutation in codon 218 of the albumin gene in a distinct phenotype of familial dysalbuminemic hyperthyroxinemia in a Japanese kindred. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82: 3246-3250 Marek Niedziela The role of thyroid peroxidase in physiology and pathology of thyroid gland Department of Pediatric Endocrinology and Diabetes, Karol Marcinkowski University of Medical Sciences in Poznan, Poland. Abstract: Thyroid peroxidase (TPO) is a key-enzyme in thyroid hormone (TH) biosynthesis in humans. The human TPO gene is located on chromosome 2p25 covers about 150 kb of DNA, divided into 17 exons. TPO is consisted of 933 aminoacids and its molecular weight is 103 kd. The physiological role of TPO is the organification of intrathyroidal iodide and iodination of thyrosyl residues within TH precursors. The significant role of TPO was found in the following pathological states: (1) congenital hypothyroidism (CH), (2) thyroid neoplasia and (3) autoimmune thyroiditis (AIT). Key words: thyroid peroxidase, congenital hypothyroidism, autoimmune thyroiditis - Thyroid neoplasia MATERIAŁY ZJAZDOWE Marek Niedziela Rola peroksydazy tarczycowej w fizjologii i patologii gruczołu tarczowego Klinika Endokrynologii i Diabetologii Wieku Rozwojowego Instytutu Pediatrii Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu. Streszczenie: Peroksydaza tarczycowa (TPO) jest kluczowym enzymem w syntezie hormonów tarczycy u człowieka. Gen dla ludzkiej TPO zlokalizowany na chromosomie 2p25 posiada około 150 kb DNA, podzielonych na 17 eksonów. Białko to zbudowane jest z 933 aminokwasów a jego masa cząsteczkowa wynosi 103 kd. Fizjologiczna rola TPO obejmuje organifikację wewnątrztarczycowego jodu i jodowanie reszt tyrozylowych prekursorów hormonów tarczycy. Znacząca rola TPO została poznana w takich stanach chorobowych jak: (1) wrodzona niedoczynność tarczycy (WNT), (2) nowotwory tarczycy oraz (3) autoimmunologiczne zapalenie tarczycy (AIZT). n Peroksydaza tarczycowa (TPO), enzym obecny w komórce pęcherzykowej tarczycy, odgrywa kluczową rolę w procesie biosyntezy hormonów tarczycy i stąd jej niedobór lub brak jest jedną z przyczyn wrodzonej niedoczynności tarczycy (WNT). TPO to także najważniejszy autoantygen w patogenezie autoimmunologicznego zapalenia tarczycy (AIZT), które prowadzi do nabytej niedoczynności tarczycy oraz jeden z potencjalnych markerów procesu nowotworowego w tarczycy. Rycina 1 ukazuje organizację pojedynczej komórki pęcherzykowej tarczycy z uwzględnieniem kaskady procesów wewnątrzkomórkowych i systemu 444 Słowa kluczowe: peroksydaza tarczycowa, wrodzona niedoczynność tarczycy, autoimmunologiczne zapalenie tarczycy, nowotwór tarczycy, Dr n. med. Marek Niedziela Klinika Endokrynologii i Diabetologii Wieku Rozwojowego Instytut Pediatrii Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu ul. Szpitalna 27/33; 60-572 Poznań; Tel.: (061) 848 0291, 849 1481, 849 1420; Fax: 848 0291 Podziękowanie: Praca była finansowa w części z projektu Akademii Medycznej w Poznaniu nr 501-1-05-22/2002. regulacyjnego zewnątrzkomórkowego. Obraz ultrasonograficzny prawidłowego gruczołu tarczowego przedstawiono na Fot. 1. Schemat funkcjonowania pojedynczej komórki pęcherzykowej tarczycy przedstawiono na rycinie 1 a prawidłowy obraz ultrasonograficzny gruczołu tarczowego na fotografii 1. Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Ryc. 1. Schemat funkcjonowania pojedynczej komórki pęcherzykowej tarczycy 5\F6FKHPDWIXQNFMRQRZDQLDSRMHG\QF]HMNRPyUNLS FKHU]\NRZHMWDUF]\F\ 775 β α FKU T FKU ;T 7%* 75+ 75 βZWURED QHUNL 75 β2SU]\VDGND SRGZ]JyU]H - $$ HJ]RF\WR]D 76+ ,*), (*) 7*)α 7*)β 3/& α γ 7 - 3, - 7\U 76+5 β $$ '- α FKU β FKU S WUDQVIRUPXM F\ 3U]\VDGND JVSFKU T γ α $& β F$03 '$* &D 3.& )RVIRU\ODFMD ELDáHN 3.$ 77) FKU T 77) FKU T 3$; FKU TT 0,7',7 $* 5(5 FKU T 3L+ $73 77)1.; 77) 3$; '+ 7J WUDQVIRUPXM F\ ILEUREODVWyZ FKU T ,3 7 -GUR NRPyUNRZH W\URNV\Q 3, IRVIRLQR]\WRO ,3 WULIRVIRLQR]\WRO '$* GLDF\OJOLFHURO 77)1.; 77)3$; F]\QQLNL WUDQVNU\SF\MQH 75+ W\UHROLEHU\QD 76+ W\UHRWURSLQD JVS JHQ GOD ELDáND *V 3.$ NLQD]D ELDáNRZD $ 3.& NLQD]D ELDáNRZD & &$ F\NOD]D DGHQ\ORZD 3/& IRVIROLSD]D & 1,6 V\PSRUWHU 7J W\UHRJOREXOLQD 732 SHURNV\GD]D WDUF]\FRZD 3'6 SHQGU\QD SRPSD MRGNRZRFKORUNRZD $$ DPLQRNZDV\ '- GHMRG\QD]\ W\S 7+2; RNV\GD]D JHQHUXMFD +2 HQGRF\WR]D 3U]HG]LDá DGOXPLQDOQ\ 3RGZ]JyU]H E)*) 1,6 FKU SS 7 FKU TT 75+5FKU ,QVXOLQD 77 3U]HG]LDá SU]\SRGVWDZQ\ FKU S 75 α1 2) FHUE Αα I7 LQVXOLQRSRGREQ\ QDVNyUNRZ\ 7+2; 732 FKUT FKU S -4 " '+ GHKDORJHQD]D 3L+ SURWHD]\ L K\GUROD]\ 5(5 VLDWHF]ND 3'6 FKU T ZLDWáRS FKHU]\NDWDUF]\F\ -W\U7J7 UyGSOD]PDW\F]QD V]RUVWND $* DSDUDW *ROJLHJR SRáF]HQLH FLVáH PL G]\NRPyUNRZH Głównym regulatorem funkcji enzymu jest hormon tyreotropowy (TSH). Fot. 1. Obraz ultrasonograficzny prawidłowego gruczołu tarczowego - przekrój poprzeczny. Izoformy peroksydazy tarczycowej PEROKSYDAZA TARCZYCOWA TPO to kluczowy enzym (glikoproteina) w biosyntezie hormonów tarczycy. Gen ludzkiej TPO zlokalizowany jest na chromosomie 2 (2p25) [1]. Gen ten zbudowany jest z ~150 kilo par zasad (kb) DNA i składa się z 17 eksonów oraz 16 intronów [2-3]. Eksony 8-9-10 kodują podjednostkę katalityczną enzymu i w tym części genu wykryto najwięcej dotąd mutacji [Ryc. 2]. Ryc. 2 Schemat organizacji genu peroksydazy tarczycowej [2-3]. W 1987 r. trzej badacze: Kimura [2], Libert [4-5] i Seto [6] opisali niezależnie dwie formy TPO występujące w prawidłowej tarczycy jako wyraz alternatywnego splicingu RNA tego samego genu - Ryc. 3 (warianty różnych transkryptów ludzkiej TPO – hTPO mRNA). Ostatecznym produktem translacji są dwie izoformy białka: (1) hTPO-1 933 aminokwasy – główna postać TPO (2) hTPO-2 876 aminokwasów (brak eksonu 10 powoduje delecję 171 par zasad w mRNA (nukleotydy 1670-1840), w konsekwencji w cząsteczce brakuje 57 aminokwasów Rola hTPO-2 nie jest poznana, raczej jest formą nieaktywną, gdyż nie posiada dystalnych reszt histydyny niezbędnych dla aktywności TPO. ES F'1$K732 +,6 +,6 +,6 32/,$6,*1$/ 445 MATERIAŁY ZJAZDOWE I7 '- /HJHQGD &]\QQLNLZ]URVWRZH ,*), (*) 7*)α E)*) 7*)β 7%* JOREXOLQD ZL*FD Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Ryc. 3. Różnorodne transkrypty ludzkiego mRNA [2, 4-10]. K732 K732 =DQHOOLHWDO K732,, NE (NVRQ\ K732 :LOGW\SH K732, ES (NVRQ (NVRQ\ $EUDPRZLF] 7DUJRYQLNHWDO (NVRQ\ ,QWURQ (NVRQ ,QWURQ" (NVRQ\ K732P51$ Ekspresja peroksydazy tarczycowej MATERIAŁY ZJAZDOWE Pozytywną ekspresję TPO, tj. >80% spośród minimum 200 analizowanych komórek, zaobserwowano w dwóch przedziałach komórkowych: (a) cytoplazmatycznym (i bardziej intensywnie w błonie szczytowej komórki pęcherzykowej – od strony światła pęcherzyka) – u płodów, dzieci i młodych dorosłych, oraz (b) okołojądrowym – starsi dorośli oraz w podeszłym wieku [11]. Rola peroksydazy tarczycowej w fizjologii gruczołu tarczowego Rola TPO dotyczy: - organifikacji jodu (przekształcenie J- do Jo), - wbudowywania jodu do reszt tyrozylowych tyreoglobuliny i tworzenia jod-tyreoglobuliny (formy magazynowej hormonów tarczycy), oraz - wewnątrztarczycowego sprzęgania jodowanych tyrozyn, prowadząc do wytworzenia T4 i T3. Tabela 1. Przyczyny wrodzonej niedoczynności tarczycy. A. PIERWOTNA (90-95%) 1. Dysgenezja tarczycy (TTF-1, TTF-2, PAX-8) a) agenezja (22-42%) b) dysplazja i ektopia (35-42%) 2. Tarczyca o prawidłowym położeniu (24-36%) a) genetyczne zaburzenia biosyntezy hormonów tarczycy (TPO, NIS, pendryna, Tg, oksydaza, dejodynaza, inne enzymy) b) hipoplazja jako wynik nieaktywnej mutacji receptora TSH lub działania przeciwciał blokujących TBII B. WTÓRNA (5-10%) Podwzgórzowo-przysadkowa (pit-1, prop-1, TRH, TSH) C. Inne (oporność na hormony tarczycy, utrata hormonów tarczycy - zespół utraty białek, interakcja hormonów tarczycy (z lekami) na poziomie receptora W związku z różnorodnością przyczyn WNT obserwujemy odmienny obraz ultrasonograficzny w różnych postaciach WNT: - postać bez wola (aplazja/hipoplazja – Fot. 2), - postać z wolem (blok syntezy – Fot. 3) oraz - nieprawidłową lokalizację gruczołu (ektopia). Na fot. 4 przedstawiono obraz kliniczny ciężkiej postaci WNT w przebiegu całkowitego bloku syntezy hormonów tarczycy [14]. Fot. 2. Wrodzona niedoczynność tarczycy – postać bez wola (aplazja/hipoplazja). ROLA PEROKSYDAZY TARCZYCOWEJ WE WRODZONEJ NIEDOCZYNNOŚCI TARCZYCY Pierwotna wrodzona niedoczynność tarczycy jest jednym z najczęstszych zaburzeń endokrynologicznych w okresie rozwojowym. Kliniczna manifestacja tej choroby może obejmować szerokie spektrum zaburzeń, od formy łagodnej aż do ciężkiej postaci. Istnieje szereg przyczyn WNT jakkolwiek wole noworodkowe stwierdza się tylko u 15-20% dzieci z WNT i te dzieci podejrzewane są o blok syntezy [12-13]. Jeśli wystąpi nieprawidłowość w jakimkolwiek miejscu kaskady czynnościowej wówczas oczekiwać możemy różnych postaci klinicznych wrodzonej niedoczynności tarczycy (Tabela 1) a defekt TPO stanowi statystycznie najważniejszą przyczynę bloku syntezy hormonów tarczycy i może objawiać się wolem noworodka. 446 Fot. 3. Wrodzona niedoczynność tarczycy – postać z wolem (blok syntezy). Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Defekt peroksydazy tarczycowej obejmuje: - brak aktywności enzymu, - niezdolność TPO do wiązania kofaktora hemowego, - niezdolność do interakcji z tyreoglobuliną jako substratem, - nieprawidłową wewnątrzkomórkową lokalizację TPO. Efektem klinicznym ww. nieprawidłowości jest wrodzona niedoczynność tarczycy a jej fenotyp zależny jest od stopnia zaburzeń organifikacji, który może być: (a) łagodny, (b) ciężki bądź (c) całkowity. Wg Bakker [15] najczęstszymi mutacjami są tzw. frameshift mutation (ok. 57% w populacji holenderskiej) m.in. 20 bp duplikacja [16] oraz GGCC duplikacja [9]. Najczęstszą zaś pojedynczą mutacją jest duplikacja GGCC w eksonie 8 (36% badanych alleli w tej samej populacji) [15]. ROLA PEROKSYDAZY TARCZYCOWEJ W NOWOTWORACH TARCZYCY. Wrodzona niedoczynność tarczycy w przebiegu dyshormonogenezy a rak tarczycy. Dwaj badacze, Morris i Medeiros-Neto wykazali odpowiednio u myszy [17] i człowieka [18], że zaburzenie biosyntezy hormonów tarczycy jest stanem predysponującym do transformacji nowotworowej w tarczycy, jeśli podwyższone stężenie TSH utrzymuje się przez długi okres. Obraz kliniczny zmian guzkowych w takim gruczole może być różnorodny i dotyczyć może zmian dostępnych palpacyjnie oraz tzw. zmian niepalpacyjnych (Fot. 5 i Fot. 6) [14]. Na podstawie pracy przeglądowej Medeiros-Neto i Stanbury [18] można wnioskować, że 8 z opublikowanych do tamtej chwili ogólnej liczby 15 raków tarczycy u pacjentów z WNT spełniało bezwzględnie kryteria raka tarczycy. Z wyjątkiem 1 przypadku, w którym stwierdzono raka brodawkowatego [19], wszystkie pozostałe były rakami pęcherzykowymi [20-25]. Dodatkowo w dwóch późniejszych przypadkach, pierwszym opisanym przez Medeiros-Neto [26] i drugim, z obserwacji własnych (pacjentka naszej Fot. 5. Obraz ultrasonograficzny tarczycy dziecka z wrodzoną niedoczynnością tarczycy i współistniejącym palpacyjnym pojedynczym guzkiem tarczycy w płacie prawym (ognisko litobezechowe - gruczolak pęcherzykowy w pooperacyjnym badaniu histopatologicznym). Fot. 6. Obraz ultrasonograficzny tarczycy dziecka z wrodzoną niedoczynnością tarczycy i współistniejącym niepalpacyjnym guzkiem tarczycy w płacie lewym (ognisko lite hiperechogeniczne; miąższ pozaguzkowy hipoechogeniczny). Kliniki po 2 zabiegach: 1989 – gruczolak płodowy, 1996 – rak pęcherzykowy + 2 gruczolaki) [14] potwierdzają tę regułę. U trojga dalszych pacjentów naszej Kliniki z WNT stwierdzono pooperacyjnie nowotwory łagodne (gruczolaki pęcherzykowe) [14]. W ostatnim czasie odnotowano w literaturze przypadek raka anaplastycznego u pacjenta z zespołem Pendreda, a więc defektem białka pendryny, które również odgrywa rolę w organifikacji jodu i może być przyczyną bloku syntezy hormonów tarczycy [27]. W związku z powyższym pojawia się pytanie czy TPO może odgrywać ważną rolę w transformacji nowotworowej u dzieci z WNT i współistniejącą chorobą guzkową (pojedynczy guzek lub guzki mnogie)? WNT może występować rodzinnie i rodzinnie może występować choroba guzkowa tarczycy w takich przypadkach stąd tym istotniejsze jest sprecyzowanie przyczyny WNT dla możliwie jak najdokładniejszego określenia ryzyka wystąpienia zmian guzkowych [14]. Peroksydaza tarczycowa jako marker molekularny raka tarczycy pochodzenia pęcherzykowego Znaczenie TPO w raku tarczycy wspierane jest przez szereg publikacji ukazujących silne hamowanie ekspresji genu tego białka jak również obniżonej aktywności enzymu w raku zróżnicowanym [28]. 447 MATERIAŁY ZJAZDOWE Fot. 4. Obraz kliniczny dziecka z ciężką postacią wrodzonej niedoczynności tarczycy przebiegającej z wolem od urodzenia. Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Ujemną reakcję immunohistochemiczną na obecność TPO zaobserwowano we wszystkich pojedynczych guzkach zimnych, które przy zastosowaniu konwencjonalnego barwienia histologicznego, rozpoznane były jako złośliwe pooperacyjnie. Dla kontrastu, zmiany łagodne prezentowały dodatni model barwienia w kierunku TPO [29]. Lima [30] wykazał ekspresję TPO w 100% zmian nienowotworowych, 80% gruczolaków, 20% raków i opierając się na tych spostrzeżeniach wnioskował, że badanie to nie pozwala odróżnić zmian łagodnych od złośliwych. Badania immunohistochemiczne i immunocytochemiczne mogą zatem polepszyć dokładność w diagnostyce nowotworów [31-36]. Aktualnie TPO wespół z onkogenem RET, telomerazą i galektyną-3 stanowią grupę najbardziej obiecujących markerów procesu złośliwego w tarczycy [37]. MATERIAŁY ZJAZDOWE Mechanizm molekularny predysponujący do rozwoju nowotworu u dzieci z WNT W literaturze spotkać można kilka przypadków raka tarczycy u dzieci z WNT [19-24], jakkolwiek najbardziej prawdopodobny mechanizm molekularny jest postulowany tylko w dwóch publikacjach. Mutację w obrębie eksonu 14 (C-insercję) wykryto u noworodka z rakiem tarczycy i z odległymi mnogimi przerzutami do płuc i kości [26]. Tę samą nieprawidłowość wykryto również u innego dziecka z WNT i gruczolakiem pęcherzykowym [38]. Z kolei u dziewczynki z WNT diagnozowanej w naszej Klinice a następnie leczonej operacyjnie z powodu mnogich guzków wykazano gruczolaka pęcherzykowego oraz guzki rozrostowi oraz T-delecję w pozycji 2512 eksonu 14 genu TPO [39]. Czy więc ta T-delecja może być także odpowiedzialna za rozwój zmiany nowotworowej w tarczycy? Kotani [40] wykazał, że T-delecja 2512 eksonu 14 (frameshift mutation) prowadzi do przedwczesnego zakończenia transkrypcji (stop kodon) a transfekowana do komórek CHO-K(1) generowała powstanie zmutowanego mRNA oraz tworzenie mniejszej nieaktywnej cząsteczki TPO, w przeciwieństwie do transfekcji z wild-type allele, która generowała aktywną formę TPO. Nie wykazano dotąd czy transfekcja T-delecji jest przyczyną powstania guza tarczycy. Region 2505-2512 w eksonie 14 genu TPO wydaje się odgrywać istotną rolę w predyspozycji do rozwoju nowotworu (hot spot) jak wynika z ww. prac [26, 38-41] nawet jeśli mutację stwierdza się w formie heterozygoty [26, 41]. Ocena funkcjonalności T-delecji tj. czy prowadzi w istocie do rozwoju guza in vitro może ostatecznie dowieść prawdopodobnego związku z rozwojem nowotworu u dzieci z WNT. W takich przypadkach szybkie badanie przesiewowe pacjentów z WNT byłoby niezbędne. Bardzo prawdopodobne jest, że rozwój nowotworu jest wynikiem działania kilku czynników, jak np.: (1) niedostateczna kontrola substytucyjna L-tyroksyną z następowym wzrostem stężenia TSH, (2) podwyższone stężenie TSH przez długi okres czasu, 448 (3) defekt genu TPO, i (4) aktywacja onkogenu(ów) lub nieaktywne mutacje genów supresorowych. Badanie ultrasonograficzne, klasyczne badanie cytologiczne wzbogacone o badania immunocytochemiczne oraz badania molekularne mogą znacząco pomóc w monitorowaniu wszystkich dzieci z WNT nawet, jeśli żaden guzek się jeszcze nie pojawił [41]. PEROKSYDAZA JAKO AUTOANTYGEN TPO to najważniejszy antygen mikrosomalny [42] i najważniejszy potencjalny autoantygen [3]. Autoprzeciwciała TPO-Ab korelują ze stanem uszkodzenia gruczołu tarczowego oraz jego infiltracją limfocytarną w AIZT [43]. Ostatnie badania Niccoli-Sire i wsp. [44] wskazują, że alternatywny splicing RNA może odgrywać rolę zarówno w patogenezie WNT jak i AIZT. Autoimmunologiczne zapalenie tarczycy może przebiegać w formie zanikowej (bez wola) lub jako postać z hiperplazją (Hashimoto) (z wolem) – Fot. 7. Wole u chorych z zapaleniem tarczycy typu Hashimoto może rozwijać się w kierunku wola guzowatego, tak formy uogólnionej jak i zmian o charakterze ogniskowym. W tym ostatnim przypadku pamiętać należy, że pojedyncza zmiana może być ogniskową zmianą zapalną, a także gruczolakiem – Fot. 8 [14, 45] czy nawet rakiem. Prowadzone badania molekularne pozwoliły wykazać ekspresję galektyny-3 w aspirantach pochodzących zarówno z uogólnionej guzowatej postaci choroby, jak i w przypadkach współistnienia pojedynczych guzków i zapalenia tarczycy. Pozwala to stwierdzić, że interpretacja tych badań w świetle współwystępowania dwóch postaci choroby Fot. 7. Obraz ultrasonograficzny zapalenia autoimmunologicznego tarczycy typu Hashimoto (gruczoł niejednorodny o przeważająco obniżonej echogeniczności). Fot. 8. Obraz ultrasonograficzny zapalenia autoimmunologicznego tarczycy typu Hashimoto (miąższ jednorodny o obniżonej echogeniczności) współistniejącego z pojedynczym guzkiem tarczycy (lito-bezechowy; pooperacyjna ocena histopatologiczna – gruczolak pęcherzykowy). guzkowej, jest niezwykle trudna i wymaga dalszych dociekań diagnostycznych [45]. 11. Podsumowanie: 12. 1. 2. 3. 4. TPO jako kluczowy enzym w biosyntezie hormonów tarczycy odgrywa istotną rolę w fizjologii gruczołu oraz w takich stanach chorobowych jak: wrodzona niedoczynność tarczycy (WNT), nowotwory tarczycy i autoimmunologiczne zapalenie tarczycy. Analiza genu TPO we krwi obwodowej dzieci z WNT i współistniejącą (lub nie) chorobą guzkową może potwierdzić przyczynę WNT oraz może wskazać na istniejące ryzyko wystąpienia nowotworu tarczycy w przyszłości. Badanie ekspresji TPO jest przydatną metodą uzupełniającą klasyczne badanie cytologiczne i histopatologiczne w aspekcie wykrywalności nowotworów tarczycy. P/ciała p/peroksydazie tarczycowej (TPOAb) to najważniejsze p/ciała w patogenezie autoimmunologicznego zapalenia tarczycy, którego występowanie może wzrastać w okresie przejścia ze stanu niedoboru jodu do jego wyrównania. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Piśmiennictwo 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Endo Y, Onogi S, Umeki K, Yamamoto I, Kotani T, Ohtaki S, Fujita T. Regional localization of the gene for thyroid peroxidase to human chromosome 2p25 and mouse chromosome 12C. Genomics 1995; 25: 760-761. Kimura S, Kotani T, McBride OW, Umeki K, Hirai K, Nakayama T, Ohtaki S. Human thyroid peroxidase: complete cDNA and protein sequence, chromosome mapping, and identification of two alternatively spliced mRNAs. Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84: 5555-5559. Magnusson RP, Chazenbalk GD, Gestatutas J, Seto P, Filetti S, DeGroot LJ, Rapoport B. Molecular cloning of the complementary dezoxyribonucleic acid for human thyroid peroxidase. Mol Endocrinol 1987; 1: 856-861. Libert F, Ruel J, Ludgate M, Swillens S, Alexander N, Vassart G, Dinsart C. Thyroperoxidase, an auto-antigen with a mosaic structure made of nuclear and mitochondrial gene module. Eur Mol Biol Organ 1987; 6: 4193-4196. Libert F, Ruel J, Ludgate M, Swillens S, Alexander N, Vassart G, Dinsart C. Complete nucleotide sequence of the human thyroperoxidase-microsomal antigen cDNA. Nucleic Acid Res 1987, 15: 6735. Seto P, Hirayu H, Magnusson RP, Gestatutas J, Portmann L, DeGroot LJ, Rapoport B. isolation of a complementary DNA clone for thyroid microsomal antigen. Homology with the gene for thyroid peroxidase. J Clin Invest 1987; 80: 1205-1208. McLachlan SM, Rapoport B. The molecular biology of thyroid peroxidase: cloning, expression and role as autoantigen in autoimmune thyroid disease. Endocr Rev 1992; 13: 192-206. Zanelli E, Henry M, Charvet B, Malthiery Y. Evidence for an alternate splicing in the thyroperoxidase messenger from patients with Graves’ disease. Biochem Biophys Res Commun 1990; 170: 735-741. Abramowicz MJ, Targovnik HM, Varela V, Cochaux P, Krawiec L, Pisarev MA, Propato FVE, Juvenal G, Chester HA, Vassart G. Identification of a mutation in the coding sequence of the human thyroid peroxidase gene causing congenital goiter. J Clin Invest 1992; 90: 1200-1204. Medeiros-Neto GA, Billerbeck AE, Waichenberg BL, Targovnik HM. Defective organification of iodide causing 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. hereditary goitrous hypothyroidism. Thyroid 1993; 3: 143159. Lima MA, Gontijo VA, Schmitt FC. Thyroid peroxidase and thyroglobulin expression in normal human thyroid glands. Endocr Pathol 1998; 9: 333-338. Grüters A. Congenital hypothyroidism. Pediatric Annals 1992, 21: 15-21. Macchia PE. Recent advances in understanding the molecular basis of primary congenital hypothyroidism. Mol Med Today 2000; 6: 36-42. Niedziela M. Choroba guzkowa tarczycy u dzieci i młodzieży w regionie wielkopolskim – analiza klinicznych i genetycznych czynników występowania nowotworu. Rozprawa habilitacyjna, Akademia Medyczna im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu. Dział Wydawnictw Uczelnianych Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, 2002. Bakker B, Bikker H, Vulsma T, De Randamie JSE, Wiedijk BM, De Vijlder JJM. Two decades of screening for congenital hypothyroidism in the Netherlands: TPO gene mutations in total iodide organification defects (an update). J Clin Endocrinol Metab 2000; 85: 3708-3712. Bikker H, Den Hartog MT, Baas F, Gons MH, Vulsma T, De Vijlder JJM. A 20-basepair duplication in the human thyroid peroxidase gene results in a total iodide organification defect and congenital hypothyroidism. J Clin Endocrinol Metab 1994; 79: 248-252. Morris HP, Dalton AJ, Green GD. Malignant thyroid tumors occurring in the mouse after prolonged hormonal unbalance during the ingestion of thiuracil. J Clin Endocrinol Metab. 1951; 11: 1281-1285. Medeiros-Neto G, Stanbury JB. Inherited disorders of the thyroid system. Boca Raton 1994; CRC Press, 207-218. Yashiro T, Ito K, Akiba M., Kamaji Y, Obara T, Fujimoto Y, Hirayama A, Nakajima H. Papillary carcinoma of the thyroid arising from dyshormonogenetic goiter. Endocrinol Jpn 1987; 34: 955-964. Cooper DS, Axelrod L, De Groot LJ, Vickery AL Jr, Maloof F. Congenital Goiter and the development of metastatic follicular carcinoma with evidence for a leak of nonhormonal iodide: clinical, pathological, kinetic, and biochemical studies and a review of the literature. J Clin Endocrinol Metab 1981; 52: 294-306. McGirr EM, Clement WE, Currie AR, Kennedy JS. Impaired dehalogenasae activity as a cause of goiter with malignant changes. Scot Med. J 1959; 4, 232-240. Crooks J, Greig WR, Branwood AW. Dyshormonogenesis and carcinoma of the thyroid gland. Scot Med J 1963; 8: 303. Medeiros-Neto GA, Oliveira NRC. Follicular adenocarcinomas of thyroid associated with congenital hyperplastic goiter. Acta Endocrinol Panam 1970; 1: 73-89. Watanabe I. Dyshormonogenesis. Horumon to Rinsho 1983; 31: 627-636. Potter EB, Morris WR. Carcinoma of the thyroid gland. Report of five cases in young individuals. Am J Surg 1935; 27: 546-550. Medeiros-Neto G, Gil-da-Costa MJ, Santos CLS, Medina AM, Costa e Silva J, Tsou RM, Sobrinho-Simoes M. Metastatic thyroid carcinoma arising from congenital goiter due to mutation in the thyroperoxidse gene. J Clin Endocrinol Metab 1998; 83: 4162-4166. Camargo R, Limbert E, Gillam M, Henriques MM, Fernandes C, Catarino AL, Soares J, Alves VA, Kopp P, Medeiros-Neto G. Aggressive metastatic follicular thyroid carcinoma with anaplastic transformation arising from a long-standing goiter in a patient with Pendred’s syndrome. Thyroid 2001; 11(10): 981-988. Tanaka T, Umeki K, Yamamoto I, Sugiyama S, Noguchi S, Ohtaki S. Immunohistochemical loss of thyroid peroxidase in papillary thyroid carcinoma: strong suppression of peroxidase gene expression. J Pathol 1996; 179: 89-94. Christensen L, Blichert-Toft M, Brandt M, Lange M, Sneppen B, Rawnsbaek J, Mollerup CL, Strange L, Jensen F, Kirkegaard J, Hansen HS, Sorensen SS, Feldt-Rasmussen U. 449 MATERIAŁY ZJAZDOWE Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. MATERIAŁY ZJAZDOWE 37. Thyroperoxidase (TPO) immunostaining of the solitary cold thyroid nodule. Clin Endocrinol 2000; 53: 161-169. Lima MA, Gontijo VA, Santos MC, Schmitt FC. Thyroid peroxidase expression in Diseased human thyroid glands. Endocr Pathol 1999; 10: 223-228. De Micco C, Ruf J, Chrestian MA, Gros N, Henry JF, Carayon P. Immunohistochemical study of thyroid peroxidase in normal, hyperplastic, and neoplastic human thyroid tissues. 1991; 67: 3036-3041. Bar-Andziak EB, Faryna J, Nauman J, De Micco C. Immunocytochemical staining with monoclonal antibody MoAb47 in the diagnosis of thyroid neoplasms (preliminary communication). Pol J Pathol 1996; 47: 79-82. Umeki K, Tanaka T, Yamamoto I, Aratake Y, Kotani T, Sakamoto F, Noguchi S, Ohtaki S. Differential expression of dipeptidil peptidase IV (CD26) and thyroid peroxidase in neoplastic thyroid tissues. Endocrinological J 1996; 43: 53-60. Faroux MJ, Theobald S, Pluot M, Patey M, Menzies D. Evaluation of the monoclonal antibody antithyroperoxidase MoAb47 in the diagnostic decision of cold thyroid nodules by fine-needle aspiration. Pathol Res and Practice, 1997; 193: 705-712. Czarnocka B Pastuszka D, Lyczkowska A, Stepien M, Jarzab B, Gubala E, Lange D, Nikiel B, Wloch J. Iodide symporter and thyroid peroxidase (TPO) expression in thyroid epithelial cancer. J Endocrinol Invest 2001; 24 (Suppl. To no. 6), 48. Czarnocka B, Pastuszko D, Janota-Bzowski M, Weetman AP, Watson PF, Kemp EH, McIntosh RS, Asghar MS, Jarzab B, Gubala E, Wloch J, Lange D. Is there a loss or qualitative changes in the expression of thyroid peroxidase protein in thyroid epithelial cancer? Br J Cancer 2001; 85: 875-880. Haugen BR, Woodmansee WW, McDermott MT. 2002 Toward improving the utility of fine needle aspiration biopsy for the diagnosis of thyroid tumours. Clin Endocrinol. 56(3): 281-290. 38. Kotani T, Umeki K, Yamamoto I, Maesaka H, Tachibana K, Ohtaki S. A novel mutation in the human thyroid peroxidase gene resulting in a total iodide organification defect. J Endocrinol 1999; 160: 267-273. 39. Niedziela M, Ambrugger P, Krude H, Biebermann H, Schnabel D, Korman E. Grueters A. TPO gene as a candidate gene in the pathogenesis of thyroid neoplasia of patients with congenital hypothyroidism. J Endocrinol Invest 2001; 24, suppl. to No 6, 43.) 40. Kotani T, Umeki K, Yamamoto I, Ohtaki S, Adachi M., Tachibana K. Iodide organification defects resulting from cosegregation of mutated and null thyroid peroxidase alleles. Mol Cell Endocrinol 2001; 182(1): 61-68. 41. Niedziela M, Ambrugger P, Biebermann H, Krude H, Schnabel D, Korman E, Grueters A. TPO gene as a candidate gene in the pathogenesis of thyroid neoplasia in patients with congenital hypothyroidism. J Clin Oncol 2002 (przesłane do redakcji). 42. Czarnocka B, Ruf J, Ferrand M, Carayon P, Lissitzky S. Purification of the human thyroid peroxidase and identification as the microsomal antigen in thyroid disease. FEBS Lett 1985; 109: 147-152. 43. Mariotti S, Caturegli P, Piccolo P, Barbesino G, Pinczera A. Antithyroid peroxidase autoantibodies in thyroid diseases. J Clin Endocrinol Metab 1990; 71: 661-669. 44. Niccoli-Sire P, Fayadat L, Siffroi-Fernandez S, Mathierry Y, Franc JL. Alternatively spliced form of human thyroperoxidase, TPOzanelli: activity, intracellular trafficking, and role in hormonogenesis. Biochemistry 2001; 40: 2572-2579. 45. Niedziela M, Maceluch J, Korman E. Galectin-3 is Not an Universal Marker of Malignancy in Thyroid Nodular Disease in Children and Adolescents. J Clin Endocrinol Metab 2002; 87(9): 4411-4415. Lewicka M, Liu X, Hettinger U, Malisova L, Hilgenfeldt U, Cardiac aldosterone synthesis – current concepts Dept. Of Pharmacology and Pharmaceutical Pharmacology, University of Heidelberg, Heidelberg, Germany n Aldosterone (Aldo) is clasically synthesized in the zona glomerulosa of the adrenal cortex by sequential enzymatic transformation of cholesterol and acts via epithelial mineralocorticoid receptor (MR) to promote sodium and water retention. Recently, however, aldosterone has been reported to mediate effects in non-epithelial tissues such as the central nervous system and vessels. Over 30 years ago a substance called ‘heart factor’, with physiological activity similar to aldosterone, was isolated from the hearts of cats, pigs, rats and sheep. Later demonstration of mineralocorticoid receptor and 11β-hydroxysteroid dehydrogenase, and specific actions (tissue remodelling and fibrosis) of Aldo in the heart implicated its potential role in the regulation of cardiac tissue function. Recently Silvestre et al. detected the terminal enzymes of corticosterone and aldosterone synthesis (11β-hydroxylase and aldosterone synthase, respectively) in the rat heart and evidenced acute and chronic stimulation of both enzymes by angiotensin II (Ang II). Chronic treatment with either low Na+ or high K+ diet (which increased aldosterone synthase 450 mRNA level only) or ACTH (which stimulated the 11β-hydroxylase gene exclusively) indicated independent regulation of cardiac 11β-hydroxylase and aldosterone-synthase. The cardiac production of Aldo, turned out to be small compared with that of adrenal, but regulated by the same classical stimuli of adrenal steroid biosynthesis. Futher studies indicated that myocardial infarction (MI) is associated with tissue-specific selective activation of myocardial aldosterone synthesis at the expense of cardiac corticosterone production. This increase, mediated primarily by cardiac Ang II via AT1-subtype receptor, possibly involved in post-MI ventricular fibrosis and in control of tissue norepinephrine, could be prevented by AT1 antagonist. In contrast to the cardiac system, the adrenal steroidogenesis was not activated under these conditions. These informations reinforced the idea that mineralocorticoids have functions, in physiologic as well as in pathologic conditions, in cardiovascular tissue. The phenomenon of ischemic preconditioning (IPC) refers to the repeated brief coronary occlusion rendering the myocardium more resistant to injury from subsequent prolonged ischemia. To date, preconditioning has been documented to be the most powerful strategy known for protecting the heart against ischemia/reperfusion in various species (dogs, pigs, rabbits, rats) and, subsequently, the concept of preconditioning has been adapted to human studies. The precise mechanisms by which IPC protects the heart against ischemia/reperfusion injury are not fully understood. A participation of numerous vasoactive factors like adenosine, heat shock proteins, ATPsensitive K-channels and kinins, has been postulated. The peculiar mutant Brown-Norway-Katholiek (BNK) rat strain secreting little if any high molecular weight (HMW)-kininogen into plasma is known for showing only limited cardioprotective effect of EPC in vivo comparing to other strains. Furthermore this rat strain also showed particularly high aldosterone release and subsequent sodium accumalation in the body in response to non-pressor dose of Ang II. Given all these findings we have investigated the course of the release of Aldo during perfusion of the isolated BNK rat hearts during brief IPC and compared that with other rat strains: Brown-Norway (BN), Sprague Dawley (SD) and Wistar Kyoto (WKY) - in which preconditioning induced significant protection. The basal Aldo as well as the increase of Aldo release following IPC, was markedly higher in BNK rats than in all other strains. Short perfusion with kinins (kallidin, bradykinin), instead of IPC, resulted in moderate increase of Aldo release in BNK rats with none or minimal effect in other strains. The increase in Aldo release could be abolished by perfusion woth both, captoril and B2 receptor antagonist (HOE 140). The course of the release of Aldo is obviously qualitatively and quantitatively different in the perfused HMWkininogen deficient BNK rats hearts comparing to other rat strains. Since kinins modulate the aldosterone synthesis, the lack of endogeneous kinins in BNK rats resulted in markedly higher basal, IPC-stimulated and exogeneous-kinin-stimulated aldosterone synthesis. In other strains, with a normal endogeneous kinin levels, effect of IPC and of exogeneous kinins on cardiac Aldo synthesis was low. Blockade of the BK-receptors abolished the steroid increase in BNK but intensified release in SD rats, probably due to the blockade of the endogeneous kinins. Since HOE was reported to reduce completely the beneficial effect of ischemic preconditioning it may be speculated that this is due to pathological increase of the aldosterone synthesis similar to that observed in BNK rats during IPC. The oversized aldosterone stimulation during IPC and its strong inhibition during perfusion with captopril may be due to an increased sensitivity to the angiotensin stimulation known for BNK rats. Considering deleterious effects of aldosterone on the heart tissue, higher basal and IPC-stimulated local aldosterone release in BNK comparing to other strains, may contribute to the reduction of the cardioprotective effects of the ischemic preconditioning in BNK rats. Furthermore, in BNK rats the release of Aldo was abolished with ACE inhibitor. Since no beneficial effect of ACE inhibitors was observed in chronic heart failure of this rat strain one can speculate that just moderate increase of the aldosterone synthesis (as observed in other rat strains, or stimulated in BNK with exogeneous kinins) is necessary for the adequate preconditioning. Lehmann T., Biernacka-Łukanty J., Jacques Y Li*., Trzeciak W.H. Regulation of transcription of genes of steroid hormone synthesis in the adrenal cortex Department of Biochemistry and Molecular Biology University of Medical Sciences, Poznań *INSERM U369 Faculte de Medecine, Lyon, France. n Synthesis of steroid hormones in the adrenal cortex is regulated mainly at the level of transcription of genes encoding cytochromes P450-componentes of steroid hydroxylase enzyme complexes: cholesteroldesmolase (CYP11A1 gene) and 17A-hydroxylase, 1720-lyase (CYP 17 gene). These hydroxylases catalyse rate limiting steps in glucocorticoid and adrenal androgen biosynthesis. The expression of CYP genes is stimulated by corticotropin (ACTH) acting through a specific receptor and using a signal transduction pathway involving cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and protein kinase A. The effect of ACTH is modulated by transforming growth factor β (TGFβ) acting through a specific receptor and Smad protein. The principal transcription factor that controls genes expression, and indirectly steroid hormone synthesis in the adrenal cortex, is steroideoggenic factor-1 (SF-1)Ftz-f1 gene product that, in a dephosphorylated form, acts with a specific nucleotide sequencein promotores of target genes. The action of SF-1 also regulat expression of StAR gene encoding a protein participating in cholesterol transport from cytosol to mitochondria. Ourinvestigations were conducted with the use of adrenocortical carcinoma cells, lines Y-1 or H295R, as well as Bavine adrenocortical cells in primary culture, as model systems. The investigations concerned the effects of corticotropin and/or TGFβ on the expression of CYP11A1, CYP17 and StAR genes at the level of specific mRNAs. Under these conditions, the expression of genes encoding SF-1, COUP-TF, N-CoR, DAX1, CBP and SRC-1 was also monitored. In addition, luciferase reporter-gene expression was investigated 451 MATERIAŁY ZJAZDOWE Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE in the sells transfected with recombinant plasmids harbouring promoters of CYP11A1, StAR or Ftz-f1 genes, directing expression of the reporter. It was evidenced that corticotropin stimulated not only the expression of CYP11A1, CYP17 abd StAR, but also Ftz-f1 gene. TGFβ strongly inhibited CYP17 and Ftz-f1 gene expression and did not affect transcription of CYP11A1 gene, while depending on theexperimental model used, this cytokine either inhibited or was without an effect onn the expression of StAR gene. The expression of N-CoR was stimulated by corticotropin, whereas this hormone did not affect transcription of the remaining factors, participating in the interaction with SF-1. These result led to a conclusion that in the adrenocortical cells, stimulation of signal transduction pathway involving protein kinase A results not only in an increased expression of CYP11A1, CYP17, StAR genes, essential for steroidogenesis, but also in an enhanced transcription of Ftz-f1 gene, coding for transcription factor SF-1. The stimul.ation of signal transduction pathway involving Smad proteins caused an inhibition of CYP17 and Ftz-f1 gene expression. Lehmann Tomasz, Biernacka-Łukanty Justyna, Jacques Y. Li*, Trzeciak W.H. Regulacja transkrypcji genów uczestniczących w syntezie hormonów steroidowych w korze nadnerczy MATERIAŁY ZJAZDOWE Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej AM w Poznaniu *INSERM U369 Faculte de Medecine, Lyon, Francja n Synteza hormonów steroidowych w korze nadnerczy jest regulowana na etapie transkrypcji genów kodujących cytochromy P 450 wchodzące w skład kompleksów enzymatycznych hydroksylaz steroidowych: desmolazy cholesterolowej (gen CYP11A1) i 17a-hydroksylazy steroidowej/17,20liazy (gen CYP17). Hydrolazy te katalizują reakcje ograniczające wydajność biosyntezy glukokortykoidów i androgenów nadnerczowych. Ekspresję genów CYP pobudza kortykotropina (ACTH), działająca za pośrednictwem specyficznego receptora i układu przekaźników sygnałów, w którym uczestniczą cykliczny adenozynomonofosforan (cAMP) i kinaza białkowa A. Działanie ACTH moduluje m.in. transformujący czynnik wzrostu b (TGF b), działający za pośrednictwem specyficznego receptora i białek Smad. Głównym czynnikiem transkrypcyjnym kontrolującym ekspresję genów, a pośrednio hormonów steroidowych w korze nadnerczy jest steroidogenny czynnik-1 (SF-1) – produkt białkowy genu Ftz-f1, który w formie defosforylowanej wiąże się ze specyficzną sekwencją w promotorach genów docelowych, pobudzając ich ekspresję. W działaniu SF-1 pośredniczą czynniki COUP-TF, N-CoR, DAX1, CBP oraz SRC-1. Czynnik SF-1 reguluje taże ekspresję genu StAR dla białka uczestniczącego w transporcie cholesterolu do wnętrza mitochondriów. Badania własne, przeprowadzono z zastosowaniem komórek nowotworu nadnerczy linii Y-1, lub H295R oraz komórek nadnerczy bydlęcych w hodowli pierwotnej, jako układów modelowych. Badania dotyczyły wpływu kortykotropiny i/lub TGFb na ekspresję genów CYP11A1, CYP17 i StAR na poziomie specyficznych mRNA. W tych warunkach zbadano także ekspresję genów dla czynników transkrypcji: SF1, COUP-TF, N-CoR, DAX1, CBP oraz SRC-1. Ponadto badano transkrypcję genu lucyferazy jako „receptora” w komórkachtransferowanych plazmidami, zawierającymi promotory genów CYP17, Ftz-ft i StAR regulujące ekspresję „receptora”. 452 Z przeprowadzonych badań wynika, że kortykotropina pobudza ekspresję genów CYP11A1, CYP17, Ftz-f1 i StAR. TGF b silnie hamuje transkrypcję genu CYP17 i Ftz-f1, natomiast nie wywiera wpływu na ekspresję genu CYP11A1, podczas gdy zależnie od modelu doświadczalnego cytokina ta hamuje, lub nie wywiera wpływu na transkrypcję genu StAR. Ekspresja genu czynnika N-Cor jest stymulowana przez kortykotropinę podczas gdy hormon ten nie wywiera wpływu na transkrypcję genów dla pozostałych czynników uczestniczących w oddziaływaniu z SF-1. Z przeprowadzonych badań wyciągnięto wniosek, że w komórkach kory nadnerczy, pobudzenie ścieżki sygnałowej kinazy białkowej A powoduje nie tylko zwiększenie ekspresji genów Cyp11A1, CYP17 oraz StAR, kl;uczowych dla syntezy hormonów steroidowych, lecz także pobudzenie ekspresji genu Ftz-f1, kodującego czynnik transformujący SF-1. Stymulacja ścieżki sygnałowej Smad powoduje natomiast zahamowanie ekspresji genów CYP17 i Ftz-f1. Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) 1,2 Monika Puzianowska-Kuźnicka*, 2Alicja Nauman, 1Janusz Nauman Potential role of small–molecule hormones and their nuclear receptors in process of neogenesis 2 Department of Endocrinology, Medical Research Center PAN, Warszawa, Department of Biochemistry, Medical Center of Postgraduate Education, Warszawa Summary: Most of the small-molecule hormones (vitamin A derivatives, vitamin D, triiodothyronine, estrogens, androgens, etc.) that exert their influence on genome via nuclear receptors regulating transcription of target genes, promote cellular differentiation and apoptosis. Typically, they also exert anti-proliferative effect, but in some pathophysiological states as well as in some tissues during development they can intensify cell divisions. Incorrect hormonal control of these processes found in cancer tissues could be a result of low hormone accessibility, or a result of abnormal function of its receptor. On the molecular level, receptor abnormalities could appear due to the inactivation of its gene (promoter methylation), the presence of disadvantageous polymorphism, chromosomal aberration (e.g. translocation, deletion, inversion), or mutation within the receptor coding sequence (point mutation, deletion, insertion). For example, it has been shown that RARB and ER gene promoters were highly methylated in breast cancer (both promoters), and lung cancer (RARB) that resulted in low levels of RARb2 and ER proteins, respectively. Loss of heterozygosity of TRB gene was found in 100% of smallcell lung cancer cases, while loss of heterozygosity of TRA gene was present in 79% of breast cancers. A relationship between the presence of a given polymorphism, and the chance to develop a given cancer, clinical advancement of the disease, as well as prognosis has been noticed. For example, polymorphism introducing BsmI restriction site into VDR gene while homozygotic (bb) decreases 1,2 breast cancer risk 2.3 – 3.9-fold in comparison to VDR genotype without this polymorphism (BB). Another VDR polymorphism – two short polyA (A14-A17) alleles within 3’UTRs – reduces the risk of prostate cancer 4.61 times while compared to the genotype with at least one long polyA (A18–A22) allele. One of the molecular mechanisms of acute promyelotic leukemia development is the occurrence of PML/RAR rearrangement that is a result of translocation between chromosome 17 (where RAR gene is located), and chromosome 15 (PML). PML/RAR fusion protein effectively blocks retinoid-dependent promyelocyte differentiation. In hepatocellular carcinoma, clear cell kidney cancer, and in papillary thyroid carcinoma a high frequency (up to approximately 90% of the cases) of somatic TRA and TRB mutations leading to amino acid substitutions, as well as transactivation function impairment and dominant-negative features of the encoded receptors was detected. Data available so far allow hypothesizing that physiological hormonedependent regulation of proliferation, apoptosis and differentiation in cancer tissues could be markedly impaired due to abnormal function of nuclear hormonal receptors that incorrectly control downstream genes’ expression that co-regulate these processes in cancer tissues. Key words: Small-molecule hormones, nuclear hormone receptors (HRs), proliferation, differentiation, apoptosis, target gen, transcription regulation, neogenesis Monika Puzianowska-Kuźnicka*, 2Alicja Nauman, 1Janusz Nauman Potencjalny udział hormonów drobnocząsteczkowych i ich jądrowych receptorów w procesie nowotworzenia 1 2 Zakład Endokrynologii Instytutu Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej PAN im. M. Mossakowskiego, Warszawa; Zakład Biochemii Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego, Warszawa. Streszczenie: Większość hormonów drobnocząsteczkowych (pochodne witaminy A, witamina D, trijodotyronina, estrogeny, androgeny, itd.) za pośrednictwem oddziałujących na genom jądrowych receptorów, regulujących transkrypcję genów docelowych danego hormonu, promuje różnicowanie komórek i nasila apoptozę. Hormony te najczęściej działają antyproliferacyjnie, ale w niektórych stanach patofizjologicznych oraz w procesie rozwoju w niektórych tkankach nasilają podziały komórkowe. Stwierdzana w nowotworach nieprawidłowa kontrola hormonalna tych procesów może być wynikiem niskiej dostępności danego hormonu lub upośledzonej funkcji jego receptora. Nieprawidłowości dotyczące receptora mogą być skutkiem dezaktywacji jego genu (metylacja promotora), obecności niekorzystnego polimorfizmu, aberracji chromosomalnych (np. translokacji, delecji, inwersji) lub mutacji genu w obrębie części kodującej (mutacji punktowej, delecji, insercji). Rzeczywiście, stwierdzono na przykład wysoki poziom metylacji promotora RARB w raku sutka i raku płuca oraz ER w raku sutka, czego skutkiem był niski poziom białek RARb2 i ER. W 100% przypadków raka owsianokomórkowego płuca stwierdzono utratę heterozygotyczności genu TRB, zaś w 79% przypadków raka sutka – utratę heterozygotyczności genu TRA. Zaobserwowano również związek pomiędzy występowaniem poszczególnych polimorfizmów a podatnością na zachorowanie na dany typ nowotworu, nasileniem objawów klinicznych i rokowaniem. Przykładowo, polimorfizm VDR polegający na wprowadzeniu miejsca restrykcyjnego BsmI, u homozygot (bb) zmniejsza ryzyko zachorowania na raka sutka 2.3 – 3.9x w porównaniu z genotypem bez tego polimorfizmu (BB). Polimorfizm VDR polegający na posiadaniu dwóch 453 MATERIAŁY ZJAZDOWE 1 Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE krótkich alleli poliA (A14 - A17) w 3’UTR genu wiąże się z 4.61-krotnym zmniejszeniem ryzyka zachorowania na raka prostaty w porównaniu z genotypem zawierającym co najmniej jedno długie allele poliA (A18 – A22). Jednym z molekularnych mechanizmów powstania ostrej białaczki promielocytarnej jest rearanżacja PML/RAR polegająca na translokacji pomiędzy chromosomem 17 (lokalizacja RAR) i 15 (lokalizacja PML). Powstałe białko fuzyjne blokuje zależne od retinoidów różnicowanie promielocytów. W raku pierwotnym wątroby, raku jasnokomórkowym nerki i raku brodawkowatym tarczycy stwierdzono bardzo wysoką częstotliwość (aż do około 90% przypadków) mutacji somatycznych genów TR? i TR?, prowadzących do zmiany sekwencji kodowanego receptora, upośledzenia jego funkcji transaktywacyjnej i nabycia cech dominujących-negatywnych. Uzyskane do tej pory wyniki badań pozwalają na sformułowanie hipotezy, że fizjologiczna regulacja hormonalna proliferacji, apoptozy MATERIAŁY ZJAZDOWE Wstęp Hormony drobnocząsteczkowe biorą udział w regulowaniu proliferacji, różnicowania komórek i dojrzewania narządów oraz apoptozy komórkowej. Ich szczególna rola ujawnia się nie tylko podczas embriogenezy, ale również w utrzymywaniu homeostazy dojrzałego organizmu, a zwłaszcza tkanek dzielących się. Hormony te zwykle hamują proliferację, stymulują różnicowanie i promują apoptozę. Istnieją jednak wyjątki od tej reguły, najczęściej spotykane w przebiegu procesów niefizjologicznych. Przykładowo, trijodotyronina typowo hamująca proliferację, w procesie regeneracji po usunięciu części wątroby proces ten nasila [1]. Najbardziej nasilone zaburzenia proliferacji, dojrzewania i apoptozy spotyka się w tkankach nowotworowych. Hipotezy mówiące, że zaburzenia te mogą być (przynajmniej częściowo) skutkiem nieprawidłowegodziałania hormonów w chorych tkankach, powstały wiele lat temu. Od tego czasu, a zwłaszcza od czasu sklonowania licznych jądrowych receptorów hormonalnych, ukazało się kilka tysięcy publikacji, opisujących różnego rodzaju nieprawidłowości dotyczące tych receptorów. Uwagę zwraca olbrzymia różnorodność stosowanych metod i uzyskiwanych wyników. Nie udało się jednak do tej pory znaleźć konkretnej anomalii konkretnego receptora hormonalnego, która występowałaby w każdym typie nowotworu. Przeciwnie, wydaje się, że rodzaj zaburzeń i typ dotkniętych nimi receptorów są różne w różnych nowotworach. Analiza opublikowanych danych wykazuje, że można wyróżnić pewne wspólne mechanizmy molekularne prowadzące do tak różnorodnych skutków. Mechanizmy te wraz z przykładami opisane są poniżej. Uproszczony schemat działania receptorów hormonalnych. jądrowych Hormony drobnocząsteczkowe wywierają swe różnorodne działanie za pośrednictwem jądrowych receptorów, będących czynnikami transkrypcyjnymi regulującymi aktywność genów docelowych. 454 i różnicowania w tkankach nowotworowych może być zaburzona wskutek nieprawidłowości dotyczących hormonalnych receptorów jądrowych, które w sposób odbiegający od normy kontrolują ekspresję genów biorących udział w regulowaniu tych procesów w tkance nowotworowej. Słowa kluczowe: Hormony drobnocząsteczkowe, jądrowe receptory hormonalne (HR), proliferacja, różnicowanie, apoptora, gen docelowy, regulacja transkrypcj - nowotworzenie Praca finansowana przez Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego, grant nr. 501-2-1-01-69/02 Monika Puzianowska-Kuźnicka, Zakład Endokrynologii ICMDiK PAN, ul. Banacha 1a, 02-097 Warszawa; email: [email protected]; tel (48) 22 82364 11 wew. 3206 Pierwszym elementem koniecznym do specyficznego rozpoznawania genu przez receptor jest sekwencja DNA w obrębie elementów regulatorowych tego genu (HRE). Typowy HRE składa się z dwóch elementów – sekwencji heksamerowych (np. AGGTCA dla receptora trijodotyroniny) ułożonych symetrycznie względem siebie, tworzących tzw. bezpośrednie powtórzenia (DR), palindromy (P) lub odwrócone palindromy (IP). Istnieją liczne odstępstwa od tej generalnej zasady. Drugim elementem jest określona budowa domeny wiążącej DNA receptora. Domena ta zawiera dwa tzw. „palce cynkowe”, w skład których wchodzą specyficzne sekwencje, zwane „pudełkiem P” i „pudełkiem D”. „Pudełko P” odpowiedzialne jest za identyfikację heksameru, zaś „pudełko D” odpowiada za rozróżnianie odległości pomiędzy heksamerami (Ryc. 1). Dopiero dopasowanie domeny wiążącej DNA o konkretnej budowie do konkretnej sekwencji w genie docelowym pozwala na związanie się receptora z DNA i specyficzną regulację transkrypcji genu. Ryc. 1. Schemat budowy domeny wiążącej DNA jądrowych receptorów drobnocząsteczkowych Domena wiążąca DNA składa się z dwóch „palców cynkowych”, w obrębie których znajdują się dwie charakterystyczne sekwencje: „pudełko P” odpowiedzialne za rozpoznawanie sekwencji heksamerów i „pudełko D” odpowiedzialne za rozpoznawanie odstępu pomiędzy heksamerami. P – pudełko P, D – pudełko D, HRE – element odpowiedzi na hormon (specyficzna sekwencja w obrębie części regulatorowych genu docelowego), C – cysteiny, Zn – atom cynku. & & 3 =Q & & . ' +5( & & =Q & & Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Gwiazdką oznaczono specyficzne dla danej grupy receptorów reszty aminokwasowe w obrębie „pudełka P” Grupa I II III IV Aminokwasy różnicujące (*) ** * cGSckV ** * cEGckG ** * cEGckS ** * cEGckA Ear-2 knirps estrogenowy Receptory (przykłady) glikokortykosterydów trijodotyroniny progesteronu retinoidów androgenów witaminy D Na podstawie różnic w budowie domeny wiążącej DNA receptory jądrowe zostały podzielone na 4 grupy. Z klinicznego punktu widzenia najważniejsze są grupy I i IV, o podobnym mechanizmie działania w komórce, oraz grupa II (Tabela 1). Należy jednak pamiętać, że cała rodzina receptorów jądrowych liczy znacznie więcej niż 100 członków, aczkolwiek większość z tych receptorów to tzw. receptory sieroce (orphan receptors) o nieznanych ligandach i tym bardziej – funkcjach. Receptory hormonów steroidowych należące do grupy I (np. glikokortykoidów GR, progesteronu PR, androgenów AR) i IV (np. estrogenu ER) w postaci niezwiązanej z ligandem tworzą kompleksy z białkami szoku termicznego (HSP), które zlokalizowane są w cytoplazmie komórkowej. Przyłączenie liganda powoduje zmianę konformacji receptora, wskutek czego odłącza się on od HSP i przedostaje do jądra komórkowego. Tam, najczęściej w postaci homodimera, wiąże się z DNA i aktywuje transkrypcję genu docelowego (Ryc. 2A). Z kolei receptory grupy II (np. trijodotyroniny TR, witaminy D VDR, kwasu all-trans retinowego RAR, kwasu 9-cis retinowego RXR, peroxisome-proliferator activated receptor PPAR) regulują transkrypcję w sposób bardziej złożony. Receptory z grupy II w sposób niezależny od obecności liganda przemieszczają się do jądra komórkowego. Mogą tam pozostawać w stanie wolnym lub związanym z hormonem, mogą tworzyć dimery – najczęściej heterodimery z RXR (uniwersalnymi partnerami heterodimeryzacyjnymi innych receptorów jądrowych z grupy II) [2, 3, 4], które albo pozostają w formie rozpuszczalnej, albo wiążą się z DNA (Ryc. 2B). Najdokładniej poznano mechanizm działania receptorów trijodotyroniny. TR są rzadkimi przykładami czynników transkrypcyjnych posiadających dwojaką funkcję – w sposób zależny od obecności liganda mogą aktywować lub hamować ekspresję genu docelowego. Typowo heterodimer składający się z aktywowanego hormonem receptora T3-TR i RXR aktywuje ekspresję genu docelowego, zaś TR/RXR związany z DNA w nieobecności hormonu – transkrypcję hamuje. W ostatnich latach poznaje się i charakteryzuje coraz więcej genów regulowanych przez TR w sposób odwrotny. Duże przyspieszenie w tej dziedzinie notuje się dzięki zastosowaniu metody chipów (mikromacierzy). Przykładowo, analiza 2225 cDNA przygotowanych na matrycy RNA izolowanego z wątroby mysiej po stymulacji T3 wykazała, że na 55 genów, których poziom ekspresji uległ zmianie, aż 41 było przez ten hormon hamowanych [5]. Istnieją dane, że taki dwoisty mechanizm działania może być prawdziwy również w przypadku niektórych innych Ryc. 2. Uproszczony schemat działania jądrowych receptorów hormonalnych w komórce A. Schemat działania receptorów z grupy I i IV. Bez liganda receptory tworzą w cytoplazmie kompleksy z białkami szoku termicznego. Po przyłączeniu liganda uwalniają białko szoku termicznego i przedostają się do jądra komórkowego, gdzie w postaci homodimerów wiążą się ze specyficznymi miejscami odpowiedzi na hormon w obrębie części regulatorowych genów docelowych, aktywując ich transkrypcję. B. Schemat działania receptorów z grupy II. Receptory te zawsze znajdują się w jądrze komórkowym. Najczęściej tworzą heterodimery z receptorem kwasu 9-cis retinowego. Niezależnie od obecności liganda mogą się wiązać ze specyficznymi sekwencjami regulatorowymi w genach docelowych. Bez liganda hamują transkrypcję tych genów, zaś w jego obecności aktywują ją znacznie ponad poziom podstawowy. HSP – białko szoku termicznego, HR – jądrowy receptor hormonalny, RXR – receptor kwasu 9-cis retinowego, HRE – miejsce odpowiedzi na hormon, POL RNA – Polimeraza RNA typu II. +63 +5 +63 +5 +5 +5( MATERIAŁY ZJAZDOWE Tabela 1. Podział jądrowych receptorów hormonalnych na grupy w zależności od budowy domeny wiążącej DNA 32/ 51$ +5 +5 5;5 +5 +5( 32/ 51$ członków II grupy receptorów jądrowych. Receptory jądrowe połączone z ligandem przyjmują konformację umożliwiającą im łączenie się z zespołem białek koaktywatorowych, wśród których znajduje się acetyltransferaza histonowa. Acetylacja końców aminowych histonów prowadzi do rozluźnienia struktury chromatyny, co w efekcie ułatwia czynnikom transkrypcyjnym dostęp do promotora i nasila transkrypcję. Receptor bez liganda łączy się z kolei z korepresorami, które rekrutują deacetylazę histonową usuwającą reszty acetylowe z histonów, co prowadzi do utrwalenia struktury chromatyny i zahamowania transkrypcji [6]. 455 Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Mechanizmy zakłócające prawidłowe funkcjonowanie jądrowych receptorów hormonalnych w tkankach nowotworowych Nieprawidłowy poziom ekspresji jądrowych receptorów hormonalnych lub ich odbiegająca od normy funkcja mogą upośledzać fizjologiczną hormonalną kontrolę proliferacji, dojrzewania i apoptozy w tkance nowotworu. Co więcej, nieprawidłowości receptorowe mogą osłabiać skuteczność uzupełniającej hormonalnej terapii różnicującej (np. pochodnymi kwasu retinowego, pochodnymi witaminy D) lub terapii analogami hormonów (np. tamoxifenem w raku sutka). Znanych jest wiele mechanizmów, które mogą prowadzić do takich skutków. Ważną rolę odgrywają: A. hipermetylacja promotorów, B. anomalie chromosomalne: rearanżacje (wskutek translokacji, delecji lub inwersji), utrata heterozygotyczności (LOH, wskutek delecji), C. polimorfizmy, D. mutacje genów w obrębie części kodujących białka receptorowe. MATERIAŁY ZJAZDOWE A. Hipermetylacja promotorów Metylacja (Ryc. 3) genów jest procesem niezbędnym dla prawidłowego rozwoju embrionalnego i funkcjonowania dojrzałego organizmu. Między innymi dzięki temu procesowi w danej komórce ekspresji ulegają jedynie konieczne dla jej specyfikacji geny. Nieprawidłowa metylacja DNA jest zjawiskiem częstym w nowotworach ludzkich. Obserwuje się w nich tzw. hipermetylację wysp GpC oraz hipometylację innych rejonów DNA. Hipermetylacja prowadzi do zahamowania ekspresji genu, czemu najczęściej towarzyszy zmniejszenie ilości białka przez ten gen kodowanego (ocena histopatologiczna lub immunoblot). Jeżeli hipermetylacja dotyczy genów biorących udział w regulacji proliferacji lub apoptozy, skutkiem tego procesu może być niekontrolowana proliferacja i zahamowanie autodestrukcji nieprawidłowych komórek. Stosunkowo dużo informacji zdobyto na temat nadmiernej metylacji receptorów estrogenu w różnych typach nowotworów. Koronnym przykładem są zmiany rozrostowe prostaty, gdzie hipermetylację genu ER stwierdzono w 60% łagodnej hiperplazji, w 80% raka I i II stopnia oraz w 95% raków zaawansowanych III i IV stopnia [7]. Równie liczne przypadki (86%) hipermetylacji tego genu stwierdzono w rakach układu białokrwinkowego, zarówno w białaczkach limfatycznych jak i szpikowych [8]. Nadmierną metylację promotora ER stwierdzono w ponad 20% przypadków raka endometrium, przy czym przytłaczająca większość raków z tą anomalią nie wykazywała obecności białka ER [9]. Z kolei w raku sutka, w grupie raków ER- (bez ekspresji białka receptorowego) w 25% przypadków stwierdzono hipermetylację wysp CpG w obrębie promotora genu ER, podczas gdy w żadnym przypadku raków ER+ ani w żadnej zdrowej kontroli zjawiska takiego nie obserwowano. Ponadto w raku sutka obserwowano hipermetylację promotora genu PR: wystąpiła ona w 456 43% raków PR- (bez ekspresji białka receptorowego), ale była nieobecna w rakach PR+ i w zdrowych kontrolach [10]. Ryc. 3 Metylacja reszt cytozynowych w genomie ssaków A. Schemat budowy reszty cytozyny. B. Schemat budowy metylowanej pochodnej cytozyny – 5-metylocytozyny. F\WR]\QD PHW\ORF\WR]\QD 1+ 1+ 1 2+ &+ 1 1 2+ 1 Białkiem uważanym obecnie za jeden z supresorów nowotworzenia jest RARb2. Jego ilość ulega znaczącemu obniżeniu w różnych nowotworach i wydaje się, że hipermetylacja promotora genu RARB znacząco się do tego przyczynia. Zjawisko to stwierdzono m. in. w 64% linii komórkowych wywodzących się z raków płuca [11], 40% pierwotnych raków szyjki macicy, 64% raków żołądka z niskim poziomem białka RARb2 [12] oraz w licznych przypadkach raka sutka [13, 14]. Hipermetylacja dotyczyć może również genów innych receptorów hormonalnych, na przykład TRB. We wczesnych stadiach raka sutka obserwowano inaktywację obydwu alleli tego genu wskutek utraty heterozygotyczności (utrata 3p24.3) połączonej z hipermetylacją drugiego allele [15]. Zarówno hipermetylacja, jak i zaburzenia struktury chromatyny wskutek nieprawidłowej acetylacji histonów, niestabilność lub nadmierna stabilność RNA, nieprawidłowa translacja mRNA na białka, zaburzenia modyfikacji i stabilności białek itd., prowadzą do znaczących zaburzeń ekspresji receptorów hormonalnych w tkankach nowotworowych. Wynik „netto” działania takich różnorodnych czynników może być odmienny w różnych typach nowotworów, co sugeruje, że na poziom ekspresji danego receptora mają znaczący wpływ czynniki tkankowo specyficzne. Przykłady dotyczące poziomów ekspresji receptorów TR w różnych typach nowotworów zamieszczono w Tabeli 2 [16, 17, 18, 19, 20]. B. Anomalie chromosomalne Nieprawidłowości dotyczące dużych fragmentów chromosomów w tkankach nowotworowych występują bardzo często. Mogą one dotyczyć praktycznie każdego odcinka każdego chromosomu. Ich liczba narasta wraz z postępem choroby. Do ich powstania przyczyniają się różne mechanizmy, spośród których najczęstsze są: translokacje („odłamanie” dużego fragmentu chromosomu i przyłączenie go do innego chromosomu; Ryc. 3A), delecje (utrata fragmentu chromosomu; Ryc. 3B) i inwersje (zmiana pozycji części chromosomu w obrębie tego samego chromosomu; Ryc. 3C). Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) 5RG]DM QRZRWZRUX +RUPRQDOQLH QLHF]\QQ\ JX] SU]HGQLHJR SäDWD SU]\VDGNL 5DN MDVQRNRPÑUNRZ\ QHUNL (NVSUHVMD %# P51$ ELDäNR 75, 75- 75, 75- 5DN EURGDZNRZDW\ WDUF]\F\ 75, 75- 2VWHRVDUFRPD Z\VRNR ]UÑQLFRZDQ\ 2VWHRVDUFRPD QLVNR ]UÑQLFRZDQ\ 5DN SLHUZRWQ\ ZñWURE\ 75, 75- 75, 75- Ryc. 4 Schematyczne przedstawienie niektórych anomalii chromosomalnych A. Translokacja zrównoważona. B. Delecja wewnętrzna. C. Inwersja. (NVSUHVMD %# P51$ ELDäNR W nowotworach litych różnych narządów bardzo często spotyka się delecję części ramienia krótkiego chromosomu 3 (3p) [21]. Jest to tym bardziej istotne, że na 3p lokalizują się geny kilku znanych lub potencjalnych supresorów nowotworzenia: NRC1 (3p12), FHIT (3p14.2), nieznanego jeszcze supresora raka płuca (3p21), RARB (3p24), VHL (3p25-26). Tam też zlokalizowany jest gen TRB (3p21-25). Najbardziej znaną rearanżacją chromosomalną, która dotyczy jądrowego receptora hormonalnego jest rearanżacja powstająca wskutek translokacji pomiędzy chromosomami 15 (lokalizacja genu PML, promyelocytic leukemia) i 17 (lokalizacja genu RARA). Wskutek tego defektu w większości przypadków ostrej białaczki promielocytarnej stwierdza się występowanie fuzyjnego białka PML/RARa, które posiada cechy czynnika onkogennego. Kluczowym „błędem” wydaje się być nieprawidłowa funkcja RARa, jako że w rzadszych przypadkach tej białaczki opisano również inne rearanżacje, zawsze jednak dotyczące genu RARA [22]. Molekularny mechanizm onkogennego działania białka fuzyjnego polega, przynajmniej częściowo, na rekrutacji metylotransferaz i indukowaniu hipermetylacji promotorów genów docelowych kwasu all-trans retinowego. Skuteczne działanie kwasu all-trans retinowego w terapii ostrej białaczki promielocytarnej polega na odwróceniu tego procesu [23]. Innym sugerowanym mechanizmem działania kwasu all-trans retinowego jest aktywowanie prote- olizy PML/RARa, czemu towarzyszy degradacja samego RARa [24]. Terapia kwasem retinowym alltrans nie jest ukierunkowana na niszczenie komórek nowotworowych, ale na stymulację ich prawidłowego różnicowania. Jej połączenie z tradycyjną chemioterapią dramatycznie poprawiło wyniki leczenia ostrej białaczki promielocytarnej. Ocenia się, że w 80% przypadków można uzyskać całkowitą remisję lub/i wyleczenie [25]. Bardzo częstą anomalią chromosomalną obserwowaną w nowotworach jest utrata heterozygotyczności (LOH, Ryc. 5). Jeżeli w tkance prawidłowej dany osobnik posiada dwa różne allele danego genu (heterozygota), zaś w nowotworze wywodzącym się z tej tkanki obecne jest tylko jedno z nich, wówczas stwierdza się właśnie utratę heterozygotyczności tego genu. Anomalia ta jest szczególnie istotna w przypadku, gdy pozostałe allele są zmutowane, tak więc jedyna kopia danego genu (np. supresora nowotworzenia) jest nieprawidłowa. W nowotworach może również dojść do delecji obydwu alleli genu. Ryc. 5 Schemat utraty heterozygotyczności genu w tkankach nowotworowych WNDQND SUDZLGáRZD KRPR]\JRWD KHWHUR]\JRWD WNDQND QRZRWZRURZD /2+ XWUDWD KHWHUR]\JRW\F]QRFL Przykłady najczęściej występujących anomalii tego typu, dotyczących genów TR, zamieszczono w Tabeli 3 [26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35]. Inne anomalie chromosomalne, obecne niekiedy w nowotworach, to duplikacje i amplifikacje. Szczególnie groźne stają się wówczas, gdy na ich skutek w komórce pojawiają się dodatkowe kopie genów kodujących onkoproteiny. 457 MATERIAŁY ZJAZDOWE Tabela 2. Nieprawidłowa ekspresja receptorów trijodotyroniny na poziomie mRNA i białka w różnych nowotworach Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Tabela 3. Utrata heterozygotyczności fragmentów chromosomów zawierających geny TR w różnych nowotworach TRA (17q21) Rodzaj nowotworu LOH w 100% przypadków Czerniak oka LOH w 60% przypadków Rak nerki LOH w 64% przypadków Rak pęcherzykowy tarczycy LOH Rak sutka Rak okrężnicy Rak prostaty LOH w 79% przypadków LOH LOH MATERIAŁY ZJAZDOWE C. Polimorfizmy Polimorfizmy genetyczne dzieli się na jednonukleotydowe (SNP, single nucleotide polymorphism) oraz dłuższe, liczące nawet do kilkuset par zasad. SNP powstają wskutek mutacji punktowych, podczas gdy polimorfizmy długie są wynikiem delecji, włączenia, duplikacji, amplifikacji itd. Na podstawie wstępnej analizy wyników sekwencjonowania genomu kilku osobników w ramach Human Genome Project ocenia się, że polimorfizmy występują średnio co 1000 par zasad i jest ich około 1,5 miliona (jednakże ich liczba wzrasta w miarę poznawania sekwencji genomów następnych osób). Wydaje się, że około 60 tysięcy polimorfizmów zlokalizowanych jest w obrębie eksonów (których znaczna część koduje białka). Badanie polimorfizmów w nowotworach jest dość rozpowszechnione. Uzyskane wyniki mogą znacząco się od siebie różnić w zależności od badanej populacji. Zjawisko to pozostaje w zgodzie z ewolucyjną zasadą przekazywania polimorfizmów następnym pokoleniom w obrębie własnej grupy etnicznej. Wynika z tego, że związek pomiędzy konkretnym polimorfizmem i zapadalnością na dany typ nowotworu w jednej populacji nie musi występować w populacji odmiennej etnicznie. Liczne badania dotyczą polimorfizmów genu VDR. W obrębie nieprzetłumaczalnego odcinka 3’ (3’UTR) znajduje się polimorficzna sekwencja poli-A (ciąg adenin). Wykazano, że u rasy kaukaskiej posiadanie co najmniej jednego długiego allelu (A18–A22) w porównaniu z dwoma krótkimi allelami (A14–A17) zwiększa ryzyko zachorowania na raka prostaty aż 4,61-krotnie. W tym samym badaniu stwierdzono, że polimorfizm w genie receptora androgenu (AR) polegający na posiadaniu mniej niż 20 powtórzeń sekwencji CAG w porównaniu z allelem zawierającym 20 i więcej takich powtórzeń zwiększa ryzyko zachorowania na tę chorobę 2,1-krotnie [36]. Polimorfizm TaqI genu VDR w raku prostaty po normalizacji względem poziomu PSA (prostate specific antigen), nie wykazał związku z ryzykiem zachorowania, aczkolwiek bez tej normalizacji genotyp tt (obecność miejsca restrykcyjnego w obu allele) w porównaniu z genotypem TT wiązał się ze zwiększeniem ryzyka zachorowania do 1,76 [37]. Powyżej opisany polimorfizm poli-A oraz polimorfizm BsmI wiążą się z ryzykiem zachorowania na raka sutka. W przeciwieństwie do wyników dotyczących raka prostaty, obecność jednego krótkiego allelu poli-A zwiększa to ryzyko 1,5-krotnie, zaś posiadanie dwóch krótkich alleli zwiększa je aż 3,2-krotnie. Brak 458 TRB (3p21-25) Rak owsianokomórkowy płuca LOH w 30% przypadków Mikrodelecja obydwu alleli – 20% miejsca restrykcyjnego BsmI w obydwu allelach genu VDR (homozygota BB) zwiększa ryzyko zachorowania na raka sutka 2,2 – 2,32-krotnie w porównaniu z homozygotą bb [38; 39]. Badania innych autorów nie wykazują różnicy pomiędzy częstością występowania polimorfizmów BsmI typu bb, Bb i BB u chorych z rakiem sutka w porównaniu ze zdrowymi kontrolami, ale stwierdzają 4-krotny wzrost ryzyka powstania przerzutów u osób o genotypie bb w porównaniu z genotypem BB [40]. Stosunkowo często badane są również polimorfizmy genu receptora estrogenu (ER). W przypadku ERA wykazano na przykład, że polimorficzna zmiana C na G w kodonie 325 występowała w 42,8% badanych przypadków raka sutka i jedynie u 24,6% zdrowych kontroli, co oznaczało, że względne ryzyko zachorowania na ten nowotwór wynosiło 2,3 [41]. Z kolei zmiana T na C w kodonie 10 zwiększa ryzyko zachorowania na raka nerki 2,51 razy w porównaniu z genotypem T [42]. Polimorfizm XbaI w ER wydaje się wiązać ze zmniejszoną podatnością na raka endometrium: ryzyko zachorowania na tę chorobę przez kobietę z genotypem XX (nie posiadającą ww. miejsca restrykcyjnego w żadnym allelu ER) w porównaniu z homozygotą xx wynosi 0,52. Polimorfizm PvuII w ER również wydaje się mieć działanie ochronne (genotyp PP versus genotyp pp zmniejsza ryzyko zachorowania do 0,7) [43]. D. Mutacje genów w obrębie części kodujących białka receptorowe Najczęściej spotykane mutacje punktowe w obrębie kodujących białka receptorowe części genów mogą powodować zamianę prawidłowej reszty aminokwasowej na inną, wprowadzać przedwczesny kodon STOP lub powodować przesunięcie ramki odczytu. W zależności od rodzaju i lokalizacji mutacji jej skutkiem może być utrata jednej lub kilku funkcji (np. wiązania DNA, wiązania liganda, heterodimeryzacji, itd.) i w efekcie – zaburzenie (utrata lub wzmocnienie) funkcji receptora jako regulatora transkrypcji genów docelowych. Największa stwierdzona dotychczas częstość mutacji jądrowych receptorów hormonalnych w nowotworach dotyczy receptorów trijodotyroniny. Jak pokazano w Tabeli 4, w nowotworach narządów ważnych dla metabolizmu hormonów tarczycy, czyli samego gruczołu tarczowego, wątroby i nerki, mutacje stwierdza się w kilkudziesięciu procentach badanych przypadków, przy czym częstość mutacji TRB jest Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Tabela 4. Mutacje genów TRA i TRB w różnych nowotworach Rodzaj nowotworu Mutacje TRA Mutacje TRB Rak jasnokomórkowy nerki LBD TRa1 – 13,6% przypadków LBD TRb1 – 31,8% przypadków Rak brodawkowaty tarczycy ORF TRa1 – 62,5% przypadków ORF TRb1 – 93,65% przypadków Pierwotny rak wątroby ORF TRb1 – 76,0% przypadków ORF TRa1 – 67,0% przypadków Hormonalnie nieczynny guz 13% (TRa1 i TRa2) przedniego płata przysadki Podsumowanie W nowotworach tkanek ludzkich stwierdza się liczne nieprawidłowości dotyczące jądrowych receptorów hormonalnych. Obserwuje się zaburzenia poziomu ich ekspresji (na poziomie mRNA i białka) wskutek hipermetylacji promotorów genów je kodujących oraz modyfikacji potranskrypcyjnych, zaburzeń translacji i modyfikacji potranslacyjnych. Częstym zjawiskiem są różnorodne anomalie chromosomalne, a zwłaszcza delecje i rearanżacje dotyczące fragmentów chromosomów zawierających geny receptorów jądrowych. Coraz częściej znajduje się również mutacje punktowe, wskutek których funkcja kodowanego receptora staje się nieprawidłowa. Opisuje się również coraz więcej związków pomiędzy występowaniem zmian polimorficznych i ryzykiem zachorowania na dany typ nowotworu. Częstość oraz fakt współwystępowania co najmniej kilku takich nieprawidłowości w praktycznie każdym dotychczas analizowanym typie nowotworu sugeruje, że wywierana przez hormony drobnocząsteczkowe kontrola proliferacji, różnicowania i apoptozy może być znacząco zaburzona. Wciąż jednak nie wyjaśniono (z wyjątkiem ostrej białaczki promielocytarnej z rearanżacją PML/RARa), czy zaburzenia takie inicjują proces nowotworzenia, czy też odgrywają swoją rolę później, zaostrzając przebieg kliniczny choroby i pogarszając rokowanie. Piśmiennictwo: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Pibiri M, Ledda-Columbano GM, Cossu C, Simbula G, Menegazzi M, Shinozuka H, Columbano A. Cyclin D1 is an early target in hepatocyteproliferation induced by thyroid hormone (T3). FASEB J. 2001; 15: 1006-1013 Yu VC, Delsert C, Andersen B, Holloway JM, Devary OV, Naar AM, Kim SY, Boutin JM, Glass CK, Rosenfeld MG. RXR beta: a coregulator that enhances binding of retinoic acid, thyroid hormone, and vitamin D receptors to their cognate response elements. Cell 1991; 67: 1251-1266 Zhang XK, Hoffmann B, Tran PB, Graupner G, Pfahl M. Retinoid X receptor is an auxiliary protein for thyroid hormone and retinoic acid receptors. Nature 1992; 355: 441446 Bugge TH, Pohl J, Lonnoy O, Stunnenberg HG. RXR alpha, a promiscuous partner of retinoic acid and thyroid hormone receptors. EMBO J 1992; 11: 1409-1418 Feng X, Jiang Y, Meltzer P, Yen PM. Thyroid hormone regulation of hepatic genes in vivo detected by complementary DNA microarray. Mol Endocrinol 2000; 14: 947-955 Wolffe AP, Collingwood TN, Li Q, Yee J, Urnov F, Shi YB. Thyroid hormone receptor, v-ErbA, and chromatin. Vitam Horm 2000; 58: 449-492 Li LC, Chui R, Nakajima K, Oh BR, Au HC, Dahiya R. Frequent methylation of estrogen receptor in prostate cancer: 459 MATERIAŁY ZJAZDOWE wyższa niż TRA [44, 20, 45]. Nieliczne mutacje stwierdzono w hormonalnie nieczynnych guzach przysadki [46]. Co ciekawe, nowotwory są jedyną dotychczas znaną patologią ludzką, w której stwierdza się mutacje genu TRA. Inne cechy charakterystyczne dla mutacji TR w rakach to: obecność mutacji na całej długości części kodującej białka receptorowe (brak typowych hot spots, aczkolwiek w przypadku genu TRA mutacje S183N, H184Q i R228H stwierdzono w kilku przypadkach, co może sugerować większą podatność tych miejsc na mutagenezę – nowotworowe hot spots?) i obecność kilku mutacji w obrębie tego samego allelu. Przytłaczająca większość zmutowanych receptorów nieprawidłowo aktywuje transkrypcję genów docelowych, zachowując od 0% do około 70% (najczęściej od 0% do 40%) aktywności odpowiadającej im izoformy dzikiego typu oraz posiada cechy dominujące negatywne [44, 20, 46]. Tak więc wszystkie te mutacje prowadzą do utraty prawidłowej funkcji (loss-offunction). Na podstawie funkcjonalnego podobieństwa zmutowanych TR do wirusowego onkogenu v-ErbA [47, 48, 6] stworzono hipotezę mówiącą, że pod wpływem mutacji TR nabierają cech onkogennych i mogą brać udział w procesie neogenezy. Mutacje genu VDR w nowotworach ludzkich są wyjątkowo rzadkie. Podczas badania 68 kostniakomięsaków, 23 mięsaków innego typu, 34 niedrobnokomórkowych raków płuc i 44 nowotworowych linii komórkowych wywodzących się z różnych narządów znaleziono jedynie dwie mutacje, w tym jedną niemą (bez zmiany sekwencji kodowanego receptora) [49]. Równie rzadko stwierdza się mutacje genu ER. Podczas badania tkanek pobranych od 30 pacjentek chorych na raka sutka jedynie w 3 przypadkach (10%) stwierdzono obecność mutacji, z czego dwie kodowały receptory o funkcji porównywalnej z dzikim typem ER. Tylko w jednym przypadku (3,3%) w wyniku mutacji powstał receptor, który w sposób konstytutywny (nie wymagający obecności estrogenu) aktywował transkrypcję genu docelowego (typu gain-of-function) [50]. Dwa inne mutanty ER znalezione w raku sutka również charakteryzowały się aktywnością wyższą niż receptor dzikiego typu: jeden z nich był typowym mutantem typu gain-of-function, drugi aktywował transkrypcję genu docelowego już w obecności niższych niż fizjologiczne stężeń estrogenu [51]. Podobnie – mutacje genu PPARg nie są częste w nowotworach ludzkich. Stwierdzono, że występują jedynie 7,3% przypadków raka okrężnicy, a ich skutkiem jest obniżenie aktywności transkrypcyjnej receptora [52]. Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. MATERIAŁY ZJAZDOWE 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. correlation with tumor progression. Cancer Res 2000; 60: 702706 Issa JP, Zehnbauer BA, Civin CI, Collector MI, Sharkis SJ, Davidson NE, Kaufmann SH, Baylin SB. The estrogen receptor CpG island is methylated in most hematopoietic neoplasms. Cancer Res 1996; 56: 973-977 Shiozawa T, Itoh K, Horiuchi A, Konishi I, Fujii S, Nikaido T. Down-regulation of estrogen receptor by the methylation of the estrogen receptor gene in endometrial carcinoma. Anticancer Res 2002; 22: 139-143 Lapidus RG, Ferguson AT, Ottaviano YL, Parl FF, Smith HS, Weitzman SA, Baylin SB, Issa JP, Davidson NE. Methylation of estrogen and progesterone receptor gene 5’ CpG islands correlates with lack of estrogen and progesterone receptor gene expression in breast tumors. Clin Cancer Res 1996; 2: 805-810 Suh YA, Lee HY, Virmani A, Wong J, Mann KK, Miller WH Jr, Gazdar A, Kurie JM. Loss of retinoic acid receptor beta gene expression is linked to aberrant histone H3 acetylation in lung cancer cell lines. Cancer Res 2002; 62: 3945-3949 Hayashi K, Yokozaki H, Goodison S, Oue N, Suzuki T, Lotan R, Yasui W, Tahara E. Inactivation of retinoic acid receptor beta by promoter CpG hypermethylation in gastric cancer. Differentiation 2001; 68: 13-21 Sirchia SM, Ferguson AT, Sironi E, Subramanyan S, Orlandi R, Sukumar S, Sacchi N. Evidence of epigenetic changes affecting the chromatin state of the retinoic acid receptor beta2 promoter in breast cancer cells. Oncogene 2000; 19: 1556-1563 Widschwendter M, Berger J, Muller HM, Zeimet AG, Marth C. Epigenetic downregulation of the retinoic acid receptor-beta2 gene in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia 2001; 6: 193-201 Li Z, Meng ZH, Chandrasekaran R, Kuo WL, Collins CC, Gray JW, Dairkee SH. Biallelic inactivation of the thyroid hormone receptor beta1 gene in early stage breast cancer. Cancer Res 2002; 62: 1939-1943 Lin KH, Lin YW, Parkison C, Cheng SY. Stimulation of proliferation by 3,3’,5-triiodo-L-thyronine in poorly differentiated human hepatocarcinoma cells overexpressing beta 1 thyroid hormone receptor. Cancer Lett 1994; 85: 189194 Williams GR, Bland R, Sheppard MC. Characterization of thyroid hormone (T3) receptors in three osteosarcoma cell lines of distinct osteoblast phenotype: interactions among T3, vitamin D3, and retinoid signaling. Endocrinology 1994; 135: 2375-2385 Gittoes NJ, McCabe CJ, Verhaeg J, Sheppard MC, Franklyn JA. Thyroid hormone and estrogen receptor expression in normal pituitary and nonfunctioning tumors of the anterior pituitary. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82: 1960-1967 Puzianowska-Kuznicka M, Nauman A, Madej A, Tanski Z, Cheng S, Nauman J. Expression of thyroid hormone receptors is disturbed in human renal clear cell carcinoma. Cancer Lett 2000; 155: 145-152 Puzianowska-Kuznicka M, Krystyniak A, Madej A, Cheng SY, Nauman J. Functionally impaired TR mutants are present in thyroid papillary cancer. J Clin Endocrinol Metab 2002; 87: 1120-1128 Kok K, Naylor SL, Buys CH. Deletions of the short arm of chromosome 3 in solid tumors and the search for suppressor genes. Adv Cancer Res 1997; 71: 27-92 Zelent A, Guidez F, Melnick A, Waxman S, Licht JD. Translocations of the RARalpha gene in acute promyelocytic leukemia. Oncogene 2001; 20: 7186-7203 Di Croce L, Raker VA, Corsaro M, Fazi F, Fanelli M, Faretta M, Fuks F, Lo Coco F, Kouzarides T, Nervi C, Minucci S, Pelicci PG. Methyltransferase recruitment and DNA hypermethylation of target promoters by an oncogenic transcription factor. Science 2002; 295: 1079-1082 Zhu J, Gianni M, Kopf E, Honore N, Chelbi-Alix M, Koken M, Quignon F, Rochette-Egly C, de The H. Retinoic acid induces proteasome-dependent degradation of retinoic acid receptor alpha (RARalpha) and oncogenic RARalpha fusion 460 proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 1999; 96: 14807-14 25. Randolph TR. Acute promyelocytic leukemia (AML-M3)-Part 2: Molecular defect, DNA diagnosis, and proposed models of leukemogenesis and differentiation therapy. Clin Lab Sci 2000; 13: 106-116 26. Dobrovic A, Houle B, Belouchi A, Bradley WE. erbA-related sequence coding for DNA-binding hormone receptor localized to chromosome 3p21-3p25 and deleted in small cell lung carcinoma. Cancer Res 1988; 48: 682-685 27. Drabkin H, Kao FT, Hartz J, Hart I, Gazdar A, Weinberger C, Evans R, Gerber M. Localization of human ERBA2 to the 3p22----3p24.1 region of chromosome 3 and variable deletion in small cell lung cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 1988; 85: 9258-9262 28. Ali IU, Lidereau R, Callahan R. Presence of two members of c-erbA receptor gene family (c-erbA beta and c-erbA2) in smallest region of somatic homozygosity on chromosome 3p21-p25 in human breast carcinoma. J Natl Cancer Inst 1989; 81: 1815-1820 29. Herrmann MA, Hay ID, Bartelt DH Jr, Ritland SR, Dahl RJ, Grant CS, Jenkins RB. Cytogenetic and molecular genetic studies of follicular and papillary thyroid cancers. J Clin Invest 1991; 88: 1596-1604 30. Futreal PA, Soderkvist P, Marks JR, Iglehart JD, Cochran C, Barrett JC, Wiseman RW. Detection of frequent allelic loss on proximal chromosome 17q in sporadic breast carcinoma using microsatellite length polymorphisms. Cancer Res 1992; 52: 2624-2627 31. Sisley K, Curtis D, Rennie IG, Rees RC. Loss of heterozygosity of the thyroid hormone receptor B in posterior uveal melanoma. Melanoma Res 1993; 3: 457-461 32. Foster K, Crossey PA, Cairns P, Hetherington JW, Richards FM, Jones MH, Bentley E, Affara NA, Ferguson-Smith MA, Maher ER. Molecular genetic investigation of sporadic renal cell carcinoma: analysis of allele loss on chromosomes 3p, 5q, 11p, 17 and 22. Br J Cancer 1994; 69: 230-234 33. Gao X, Zacharek A, Grignon DJ, Sakr W, Powell IJ, Porter AT, Honn KV. Localization of potential tumor suppressor loci to a < 2 Mb region on chromosome 17q in human prostate cancer. Oncogene 1995; 11: 1241-1247 34. Van den Berg A, Dijkhuizen T, Draaijers TG, Hulsbeek MM, Maher ER, van den Berg E, Storkel S, Buys CH. Analysis of multiple renal cell adenomas and carcinomas suggests allelic loss at 3p21 to be a prerequisite for malignant development. Genes Chromosomes Cancer 1997; 19: 228-232 35. Diakoumis E, Sourvinos G, Kiaris H, Delakas D, Cranidis A, Spandidos DA. Genetic instability in renal cell carcinoma. Eur Urol 1998; 33: 227-232 36. Ingles SA, Ross RK, Yu MC, Irvine RA, La Pera G, Haile RW, Coetzee GA. Association of prostate cancer risk with genetic polymorphisms in vitamin D receptor and androgen receptor. J Natl Cancer Inst 1997; 89: 166-170 37. Gsur A, Madersbacher S, Haidinger G, Schatzl G, Marberger M, Vutuc C, Micksche M. Vitamin D receptor gene polymorphism and prostate cancer risk. Prostate 2002; 51: 30-34 38. Ingles SA, Garcia DG, Wang W, Nieters A, Henderson BE, Kolonel LN, Haile RW, Coetzee GA. Vitamin D receptor genotype and breast cancer in Latinas (United States). Cancer Causes Control 2000; 11: 25-30 39. Bretherton-Watt D, Given-Wilson R, Mansi JL, Thomas V, Carter N, Colston KW. Vitamin D receptor gene polymorphisms are associated with breast cancer risk in a UK Caucasian population. Br J Cancer 2001; 85: 171-175 40. Ruggiero M, Pacini S, Aterini S, Fallai C, Ruggiero C, Pacini P. Vitamin D receptor gene polymorphism is associated with metastatic breast cancer. Oncol Res 1998; 10: 43-46 41. Vasconcelos A, Medeiros R, Veiga I, Pereira D, Carrilho S, Palmeira C, Azevedo C, Lopes CS. Analysis of estrogen receptor polymorphism in codon 325 by PCR-SSCP in breast cancer: association with lymph node metastasis. Breast J 2002; 8: 226-229 42. Tanaka Y, Sasaki M, Kaneuchi M, Fujimoto S, Dahiya R. Single nucleotide polymorphisms of estrogen receptor Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) 43. 44. 45. 46. 47. alpha in human renal cell carcinoma. Biochem Biophys Res Commun 2002; 296: 1200-1206 Weiderpass E, Persson I, Melhus H, Wedren S, Kindmark A, Baron JA. Estrogen receptor alpha gene polymorphisms and endometrial cancer risk. Carcinogenesis 2000; 21: 623-627 Lin KH, Shieh HY, Chen SL, Hsu HC. Expression of mutant thyroid hormone nuclear receptors in human hepatocellular carcinoma cells. Mol Carcinog 1999; 26: 53-61 Kamiya Y, Puzianowska-Kuznicka M, McPhie P, Nauman J, Cheng SY, Nauman A. Expression of mutant thyroid hormone nuclear receptors is associated with human renal clear cell carcinoma. Carcinogenesis 2002; 23: 25-33 McCabe CJ, Gittoes NJ, Sheppard MC, Franklyn JA. Thyroid receptor alpha1 and alpha2 mutations in nonfunctioning pituitary tumors. J Clin Endocrinol Metab 1999; 84: 649-653 Barlow C, Meister B, Lardelli M, Lendahl U, Vennstrom B. Thyroid abnormalities and hepatocellular carcinoma in mice transgenic for v-erbA. EMBO J 1994; 13: 4241-4250 48. Thormeyer D, Bahniamad A. The v-ErbA oncogene. Int J Mol Med 1999; 4: 351-358 49. Miller CW, Morosetti R, Campbell MJ, Mendoza S, Koeffler HP. Integrity of the 1,25-dihydroxyvitamin D3 receptor in bone, lung, and other cancers. Mol Carcinog 1997; 19: 254257 50. Zhang QX, Borg A, Wolf DM, Oesterreich S, Fuqua SA. An estrogen receptor mutant with strong hormone-independent activity from a metastatic breast cancer. Cancer Res 1997; 57: 1244-1249 51. Lemieux P, Fuqua S. The role of the estrogen receptor in tumor progression. J Steroid Biochem Mol Biol 1996; 56: 8791 52. Sarraf P, Mueller E, Smith WM, Wright HM, Kum JB, Aaltonen LA, de la Chapelle A, Spiegelman BM, Eng C. Loss-of-function mutations in PPAR gamma associated with human colon cancer. Mol Cell 1999; 3: 799-804 Ida Kinalska Wybrane zagadnienia immunopatologii cukrzycy Streszczenie W większości przypadków cukrzyca typu 1 jest następstwem autoimmunologicznego uszkodzenia komórek beta wysp trzustkowych. W ostatnich latach wykazano, że autoimmunogenność wobec antygenów komórek beta można wykryć także w innych postaciach cukrzycy. Niektóre przypadki cukrzycy typu 1 naśladują lub uchodzą za cukrzycę typu 2, z później postępującym deficytem insuliny, co dało podstawę do zdefiniowania utajonej postaci autoimmunologicznej cukrzycy (Latent Autoimmune Diabetes in Adults – LADA). Ponadto podobny profil zaburzeń może wystąpić w cukrzycy ciężarnych. Przebieg autoimmnulogicznej destrukcji wysp jest zmienny i manifestuje się rożnymi objawami klinicznymi, od asymptomatycznego z zaznaczoną jedynie obecnością przeciwciał, do doprowadzającego w szybkim czasie ujawnienia się cukrzycy. W cukrzycy typu 1 występują liczne przeciwciała skierowane przeciwko rożnym antygenom wysp trzustkowych. Niektóre z nich są wykorzystywane do identyfikacji osób z dużym ryzykiem ujawnienia się cukrzycy, szczególnie krewnych pierwszego stopnia pacjentów z cukrzycą. Należą do nich cytoplazmatyczne przeciwciała przeciwwyspowe (Islet Cell Antibodies– ICA), przeciwciała skierowane przeciwko izoformie 65k dekarboksylazy kwasu glutaminowego (Glutaminic Acid Decarboxylase Antibodies – GAD65-Ab), białkowej fosfatazie tyrozynowej (anty- IA2) oraz przeciwciała przeciwinsulinowe (IAA). Częstość występowania rożnych przeciwciał jest różna i charakteryzuje się heterogennością. Obecność kilku rożnych autoprzeciwciał ma dużą wartość dyskryminacyjną w rozpoznawaniu stanu zagrożenia cukrzycą autoimmunologiczną. Badania epidemiologiczne udowodniły, ze na obecność we krwi autoprzeciwciał wpływają czynniki środowiskowe, etniczne i czynniki genetyczne. Stanisław Czekalski, Andrzej Oko, Ilona Idasiak-Piechocka, Krzysztof Pawlaczyk Genetic and environmental factors in diabetic nephropathy Department of Nephrology, Transplantology and Internal Medicine, K. Marcinkowski University of Medical Sciences, Poznań Summary Diabetic nephropathy develops in about 30-35% of caucasion patients with type 1 and type 2 diabetes. Actual results of the studies evaluating the genetic predysposition to development of this complication of diabetes were characterized. These results indicate the polygenic background for susceptibility to diabetic nephropathy with marked effect of the environmental factors. Key words: diabetic nephropathy, genetic predisposition, effect of environmental factors 461 MATERIAŁY ZJAZDOWE Klinika Endokrynologii, Diabetologii i Chorób Wewnętrznych AM Białystok. Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Stanisław Czekalski, Andrzej Oko, Ilona Idasiak-Piechocka, Krzysztof Pawlaczyk Genetyczne i środowiskowe uwarunkowania nefropatii cukrzycowej MATERIAŁY ZJAZDOWE Katedra i Klinika Nefrologii, Transplantologii i Chorób Wewnętrznych Akademii Medycznej w Poznaniu. Streszczenie: Nefropatia cukrzycowa rozwija się u około 30-35% chorych na cukrzycę typu 1 i typu 2 rasy kaukaskiej. Scharakteryzowano dotychczasowe wyniki badań oceniających predyspozycję genetyczną do występowania tego powikłania. Wyniki te wskazują na wielogenowe uwarunkowanie podatności na rozwój nefropatii cukrzycowej przy wyraźnym wpływie czynników środowiskowych. n Arbitralnie przyjętym kryterium rozpoznawczym wczesnej (zagrażającej) nefropatii cukrzycowej jest występowanie utrzymującej się mikroalbuminurii, czyli wydalania 20-200 µg/min (30-300 mg/dobę) albumin w moczu u chorego na cukrzycę, po wykluczeniu innych przyczyn zwiększonego wydalania albumin, spośród których najczęstszymi są: zakażenie układu moczowego, nefropatie niecukrzycowe, w tym nefropatia miażdżycowa (niedokrwienna) i zastoinowa niewydolność serca. Wydalanie albumin w moczu (urinary albumin excretion rate, UAER), przekraczające 200 µg/min (300 mg/dobę) jest określane mianem makroalbuminurii, łączy się z występowaniem wykrywalnego białkomoczu, przekraczającego 0,5 g/dobę i stanowi kryterium rozpoznania kolejnego, bardziej zaawansowanego stadium nefropatii cukrzycowej, nazywanego stadium jawnej nefropatii. [1] Zasadniczą rolę w rozwoju zmian w nerkach u chorych na cukrzycę przypisuje się hiperglikemii. Jej działanie na nerki zarówno bezpośrednie jak i pośrednie omówiono dokładniej w innych opracowaniach [2, 3, 4]. W skrócie: w badaniach doświadczalnych wykazano bezpośrednie działanie podwyższonych stężeń glukozy na komórki kłębuszków nerkowych. W komórkach mezangium hiperglikemia indukuje transkrypcję i wydzielanie przekształcającego czynnika wzrostowego beta (TGF-β), aktywuje kinazę białkową C (PKC), zwiększa zawartość diacyloglicerolu i prowadzi do zwiększenia stężenia produktów lipooksygenazy. Towarzyszy temu zwiększenie stężenia zasadowego czynnika wzrostowego fibroblastów (β FGF) i czynnika wzrostowego pochodzenia płytkowego (PDGF). Równolegle z proliferacją komórek mezangium obserwuje się zwiększenie ilości płytek krwi w kapilarach kłębuszkowych, które również uwalniają β FGF i PDGF, co może spełniać rolę pośrednika we wczesnym okresie proliferacji mezangium, a także do przejściowego, znacznego podwyższenia stężenia insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (IGF-1) z równoległym wzrostem stężenia białek wiążących ten czynnik, co sugeruje udział IGF-1 w procesie indukowania przerostu nerek. W cukrzycy doświadczalnej wcześnie dochodzi ponadto do zwiększenia liczby makrofagów w kłębuszkach nerkowych, które mogą być, obok komórek mezangialnych ważnym źródłem TGF-β. Unikalne właściwości TGF-β w porównaniu z innymi cytokinami polegają na tym, że prócz pobudzania syntezy macierzy pozakomórkowej przez komórki kłębuszka nerkowego wywiera on działania hamujące degradację macierzy mezangialnej oraz jest silnym inhibitorem proliferacji komórek mezangium wywołanej hiperglikemią. Ta właściwość TGF-β może tłumaczyć brak wyraźnych cech przerostu komórek mezangialnych, przy znacznym zwiększeniu macierzy mezangium w cukrzycowej chorobie nerek. Kolejnym czynnikiem wzrostowym, któremu przypisuje się rolę w pobudzaniu przerostu nerek u chorych na cukrzycę jest czynnik wzrostowy naskórka (EGF), choć brak przekonujących dowodów świadczących o jego istotnym znaczeniu. Zwiększenie stężeń czynników wzrostowych w kłębuszkach nerkowych wyprzedza zmiany ekspresji genów kodujących białka strukturalne kłębuszków nerkowych. Nasilenie ekspresji tych genów prowadzi do zwiększenia wytwarzania macierzy pozakomórkowej i przerostu kłębuszków. W długotrwałym utrzymywaniu się przerostu nerek w cukrzycy pośredniczyć może także czynnik martwicy guza (TNF-α). Jego działanie obejmuje między innymi aktywację granulocytów obojętnochłonnych, indukcję wykrzepiania na śródbłonku naczyniowym i stymulację wydzielania kolagenazy. Zmieniająca się w przebiegu cukrzycy aktywność licznych czynników wzrostowych i ich interakcje decydują o rozwoju i przebiegu przerostu kłębuszków i nerek. Jednym z dwóch pośrednich patomechanizmów indukowanych przez hiperglikemię, a prowadzących do rozwoju cukrzycowej choroby nerek jest nieenzymatyczna glikozylacja białek. Białka macierzy pozakomórkowej kłębuszka kontaktują się bezpośrednio z podwyższonymi stężeniami glukozy we krwi i podlegają procesowi glikacji, w którym grupy karbonylowe glukozy tworzą nieenzymatyczne wiązania kowalencyjne z wolną grupą aminową dowolnego białka. W pierwszym, szybkim i odwracalnym etapie glikacji powstaje aldimina, w drugim – wolnym i nieodwracalnym – fruktozamina. Nasilenie glikacji zależy od okresu półtrwania danego białka i średniego stężenia glukozy we krwi chorego, co powoduje, że przewlekła hiperglikemia spełnia ważną rolę w tym procesie. Wolny rozkład glikowanych białek, zwłaszcza tych o długim okresie półtrwania powoduje powstanie późnych końcowych produktów glikozylacji (“AGE-products”). Produkty te powodują 462 Słowa kluczowe: nefropatia cukrzycowa, predyspozycja genetyczna, wpływ czynników środowiskowych prof. dr hab. Stanisław Czekalski, Katedra i Klinika Nefrologii, Transplantologii i Chorób Wewnętrznych AM, ul. Przybyszewskiego 49, 60-355 Poznań dalszą modyfikację właściwości białka, na przykład tworzenie nowych wiązań krzyżowych między cząsteczkami kolagenu oraz wiążą się ze specyficznymi receptorami na powierzchni komórek mezangialnych, endotelialnych i makrofagów w kłębuszkach nerkowych, pobudzając syntezę i wydzielanie wielu cytokin: interleukiny 1 (Il-1), czynnika martwicy guza (TNF-α), IGF-1, PDGF. Cytokiny te indukują geny kontrolujące syntezę składowych macierzy pozakomórkowej i pobudzają komórki kłębuszka nerkowego do wytwarzania zwiększonych ilości kolagenu typu IV i lamininy przyczyniając się do przerostu kłębuszków. Wykazano jednak, że przy przedłużonej ekspozycji macierzy mezangium na wysokie stężenia glukozy dochodzi do zmniejszenia syntezy kolagenu, zmniejszenia wytwarzania siarczanu heparanu i obniżenia ujemnego ładunku elektrycznego proteoglikanów. Proces nieenzymatycznej glikacji białek może też przyczyniać się do zaburzeń hemodynamiki w mikrokrążeniu nerki i zwiększać przepuszczalność naczyń poprzez mechanizmy, które prowadzą do rozwoju wszystkich przewlekłych powikłań cukrzycy o typie mikroangiopatii. Drugim pośrednim patomechanizmem pobudzanym przez hiperglikemię, który może współdziałać w rozwoju cukrzycowej choroby nerek jest aktywacja szlaku poliolowego przemiany glukozy powodująca nagromadzenie sorbitolu i niedobór mioinozytolu w komórkach nerek. Zaburzenia te mogą przyczyniać się do zmniejszenia zawartości sodu wewnątrzkomórkowego, chociaż zdolność przeciwregulacji niedoboru inozytolu wykazana w komórkach mezangialnych pomniejsza znaczenie tego patomechanizmu w rozwoju zmian w nerkach. Wszystkie trzy scharakteryzowane pokrótce patomechanizmy uruchamiane przez hiperglikemię prowadzą do przerostu kłębuszków nerkowych i powiększenia objętości nerek. W kłębuszkach nerkowych stwierdza się powiększenie obszaru macierzy mezangialnej ze słabo wyrażonym zwiększeniem ilości komórek mezangialnych oraz pogrubienie błony podstawnej w pętlach kłębuszkowych. Zmiany te nasilają się stopniowo z długością trwania choroby. Zwiększona objętość nerek jest zjawiskiem powszechnym w cukrzycy typu 1 i utrzymuje się u chorych, u których rozwija się nefropatia cukrzycowa. U chorych na cukrzycę typu 2 jest zazwyczaj słabiej wyrażona, a u 10-25% chorych na nefropatię cukrzycową w przebiegu cukrzycy tego typu nie stwierdza się tego objawu. Wiąże się to z długim subklinicznym rozwojem choroby u osób często w wieku podeszłym, ze współistnieniem nefropatii niedokrwiennej i z częstym występowaniem pierwotnych chorób nerek. Patomechanizmy powodujące przerost kłębuszków nerkowych w cukrzycy współdziałają także w wywoływaniu hiperfunkcji kłębuszkowej. Hiperglikemia poprzez działanie osmotyczne na śródbłonek włośniczek, nasilenie tworzenia kalikreiny i tlenku azotu (NO), przy modyfikującym udziale prostacykliny, powoduje rozszerzenie kapilarów kłębuszkowych, zmniejszenie wewnątrznerkowego oporu naczynio- wego i zwiększenie włośniczkowego przepływu krwi w kłębuszkach. W cukrzycy typu 1 przed rozpoczęciem leczenia insuliną filtracja kłębuszkowa (GFR) jest większa o 40% w porównaniu z osobami zdrowymi, a w warunkach przeciętnego wyrównania metabolicznego cukrzycy trwającej 12-15 lat GFR jest o 1520% większa niż u osób zdrowych. Przepływ krwi przez nerki jest także większy niż u osób zdrowych, ale w mniejszym stopniu niż GFR. Oba te zjawiska występują również, choć są słabiej wyrażone u chorych na cukrzycę typu 2. Nawet przy prawidłowych wartościach ustrojowego ciśnienia tętniczego rozwija się nadciśnienie wewnątrzkłębuszkowe, gdyż opór naczyniowy w tętniczce doprowadzającej do kłębuszka jest proporcjonalnie mniejszy niż w tętniczce odprowadzającej, do czego przyczyniać się może zmniejszona ilość receptorów dla angiotensyny II (Ang II) i tromboksanu oraz zwiększona aktywność nerkowych prostaglandyn i bradykinina. Nadciśnienie wewnątrzkłębuszkowe i hiperglikemia powodują wzrost ładunku filtrowanego zawierającego większe stężenia glukozy niż u osób zdrowych i nasilenie kanalikowej reabsorbcji sodu zwłaszcza przy endogennej lub jatrogennej hiperinsulinemii. Prowadzi to do zwiększenia puli wymiennego sodu i objętości płynu pozakomórkowego oraz podwyższenie stężenia w osoczu przedsionkowego czynnika natriuretycznego (ANF), co staje się istotnym czynnikiem podtrzymującym zwiększoną filtrację kłębuszkową u chorych na cukrzycę. W zjawisku tym pośredniczą także wczesne produkty glikacji białek, prawdopodobnie niedobór mioinozytolu, nadmierne spożywanie białka, a w niewyrównanej metabolicznie cukrzycy także hormon wzrostu, IGF-1, glukagon i ciała ketonowe. Omówione mechanizmy patofizjologiczne działają u wszystkich chorych na cukrzycę, natomiast powodują większe nasilenie zmian w nerkach i rozwój nefropatii cukrzycowej u około 30% - 35% chorych na cukrzycę zarówno typu 1 jak i typu 2. Badania epidemiologiczne dostarczyły dowodów, że występowanie nefropatii cukrzycowej u chorych na cukrzycę typu 1 rasy kaukaskiej stwierdza się najczęściej w drugiej dekadzie po rozpoznaniu choroby, po czym częstość występowania tego powikłania maleje [5]. Spostrzeżenie to wskazywało, że tylko około 33% chorych na cukrzycę typu 1 jest podatnych na występowanie nefropatii cukrzycowej. Stwierdzono także, iż występuje rodzinna podatność na występowanie nefropatii cukrzycowej [6, 7]. Wyniki tych badań zapoczątkowały lawinę poszukiwań genów, których polimorfizmy czy mutacje mogą wpływać na podatność na rozwój nefropatii cukrzycowej, a jako potencjalne geny kandydaci zakwalifikowano prawie wszystkie geny kodujące białka o potencjalnym znaczeniu patofizjologicznym w rozwoju nefropatii cukrzycowej, przy wykorzystaniu różnych metod badawczych [8]. Intensywne badania dotyczyły potencjalnego związku między mutacjami genów kodujących białka układu renina-angiotensyna i podatnością na rozwój nefropatii cukrzycowej. Wykluczono znaczącą rolę genu reniny jako czynnika determinującego rozwój 463 MATERIAŁY ZJAZDOWE Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) MATERIAŁY ZJAZDOWE Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE nefropatii cukrzycowej u chorych na cukrzycę typu 1 [9]. W genie angiotensynogenu (zlokalizowanym na chromosomie 1q42) wykryto liczne polimorfizmy, spośród których szczególną uwagę poświęcono mutacji warunkującej zamianę metioniny w pozycji 235 na treoninę (M235T) w kodowanym białku. Występowanie allelu T warunkuje fenotyp pośredni charakteryzujący się wyższymi stężeniami angiotensynogenu w osoczu niż u posiadaczy allelu M i prawdopodobnie predyspozycją do rozwoju samoistnego nadciśnienia tętniczego. Poszukiwania związku między polimorfizmem M235T angiotensynogenu a występowaniem nefropatii cukrzycowej dostarczyły kontrowersyjnych wyników. W jednym badaniu obejmującym 95 chorych na cukrzycę typu 1 powikłaną nefropatią cukrzycową stwierdzono istotnie częstsze występowanie genotypu TT niż genotypów MM i MT w porównaniu z dobraną grupą kontrolną bez nefropatii cukrzycowej. Zgodnie z wynikami tego badania współczynnik ryzyka występowania nefropatii cukrzycowej u chorych na cukrzycę typu 1 posiadaczy genotypu TT wynosił 2,7 (przy 95% przedziale ufności 1,04-7,52) w porównaniu z posiadaczami genotypów MM i MT. Wyników tych nie potwierdzono w innych badaniach obejmujących chorych na cukrzycę typu 1 jak również na cukrzycę typu 2 [9]. W świetle badań rodzinnych wydaje się jednak prawdopodobne, że polimorfizm M235T genu angiotensynogenu, a zwłaszcza posiadanie allelu T może spełniać rolę w predyspozycji do rozwoju nefropatii cukrzycowej u chorych na cukrzycę typu 1 [10]. Mniej wiadomo o potencjalnym wpływie innych polimorfizmów tego genu. Liczne badania poświęcono poszukiwaniu związku między polimorfizmem genu konwertazy angiotensyny, zlokalizowanego na chromosomie 17q23 i polegającego na liczącej 287 par zasad insercji (I) lub delecji (D) tego fragmentu intronu 16 genu. Homozygotyczny genotyp DD konwertazy angiotensyny wiąże się z istotnie wyższymi aktywnościami kodowanego enzymu w osoczu co warunkuje występowanie określonego fenotypu pośredniego. Z przeprowadzonej ostatnio metaanalizy [9] dotychczasowych badań wynika, że u chorych na cukrzycę typu 1 powikłaną nefropatią cukrzycową, rasy kaukaskiej, istotnie częściej stwierdza się występowanie allelu D niż u chorych bez tego powikłania. Podobnej zależności nie wykazano u chorych na cukrzycę typu 2 rasy kaukaskiej, natomiast istniała ona u rasy azjatyckiej, u której częstość występowania allelu D w populacji jest mniejsza niż u rasy kaukaskiej. Na tej podstawie przyjmuje się że posiadanie allelu D genu konwertazy angiotensyny, a zwłaszcza genotypu DD, predysponuje do rozwoju nefropatii cukrzycowej chorych na cukrzycę typu 1 rasy kaukaskiej i chorych na cukrzycę typu 2 rasy azjatyckiej. U chorych na cukrzycę typu 1 rasy kaukaskiej posiadających genotyp DD wykazano ponadto szybsze upośledzenie filtracji kłębuszkowej i słabszą odpowiedź na nefroprotekcyjne działanie inhibitorów konwertazy angiotensyny. Nowsze badania wskazują, że polimorfizm I/D genu konwertazy angiotensyny nie ma znaczenia czynnościowego, ale może być wskaźnikiem czynno- 464 ściowo istotnej mutacji w innym miejscu (lokus) tego genu, z którą pozostaje w niezrównoważonym sprzężeniu (linkage disequilibrium). Uważa się, że ten niezidentyfikowany dotychczas polimorfizm może być odpowiedzialny za tkankową aktywność enzymu konwertującego angiotensynę, a inna mutacja w genomie, być może o odległej lokalizacji w stosunku do genu konwertazy angiotensyny, może odpowiadać za transfer tkankowy i eliminację z krążenia enzymu konwertującego [9]. Czynnościowo istotne mutacje genu konwertazy angiotensyny powodujące zwiększoną aktywność tego enzymu w tkance nerkowej i nasilenie lokalnego wytwarzania angiotensyny II mogą wiązać się z predyspozycją do rozwoju nefropatii cukrzycowej: wytwarzana lokalnie w nadmiarze angiotensyna może powodować preferencyjne obkurczenie tętniczek odprowadzających kłębuszka, co wywołuje nadciśnienie wewnątrzkłębuszkowe, któremu przypisuje się istotne znaczenie w rozwoju zmian nerkowych u chorych na cukrzycę, nasila reabsorpcję sodu w cewkach nerkowych i może działać jako czynnik pobudzający przerost mięśniówki gładkiej naczyń i komórek mezangialnych z nasileniem wytwarzania macierzy pozakomórkowej. Poza polimorfizmem I/D genu konwertazy angiotensyny zidentyfikowano istnienie szeregu innych polimorfizmów tego genu. Dwa z nich występujące w promotorowej części genu (-240A/T i -93A/T) są w słabym niezrównoważonym sprzężeniu z polimorfizmem I/D, ale ich znaczenie czynnościowe nie zostało poznane. Spośród innych polimorfizmów genu konwertazy angiotensyny znaczenie w predyspozycji do rozwoju nefropatii cukrzycowej przypisuje się polimorfizmowi I-Dde. Polimorfizm ten warunkuje występowanie w intronie 7 genu alleli oznaczonych jako +, - i =. Wykazano częstsze występowanie alleli + u chorych na cukrzycę typu 1 powikłaną nefropatią cukrzycową niż u chorych bez tego powikłania, a ryzyko występowania nefropatii cukrzycowej było czterokrotnie większe u osób posiadających allele + i = w porównaniu z posiadaczami innych genotypów I-Dde. U chorych na cukrzycę typu 2 rasy kaukaskiej nie stwierdzono podobnej zależności [9]. Dla potwierdzenia związku pomiędzy polimorfizmem I-Dde genu konwertazy angiotensyny i predyspozycją do rozwoju nefropatii cukrzycowej konieczne są dalsze badania. Liczne badania doświadczalne i kliniczne poświęcono analizie potencjalnego wpływu genów kodujących receptory dla późnych produktów glikacji białek (AGEs) genów wpływających na regulację wytwarzania białek kłębuszków nerkowych, czynników wzrostu, cytokin i innych genów na podatność do występowania późnych powikłań cukrzycy o typie mikroangiopatii, w tym nefropatii cukrzycowej. Dotychczasowe wyniki, nie potwierdzone w większości przypadków, podsumowano ostatnio w piśmiennictwie polskim [4]. W nowszych badaniach stwierdzono istotnie zwiększoną częstość występowania allelu 825T, uwarunkowanego polimorfizmem genu podjednostki β3 białka G, u leczonych dializami chorych na cukrzycę typu 2 (36,2%) w porównaniu z chorymi na cukrzycę typu 2 nie powikłaną mikroangiopatią (28,6%), co może sugerować, że posiadanie tego allelu predysponuje do występowania lub szybszego rozwoju nefropatii cukrzycowej u chorych na cukrzycę typu 2 [11]. Nie stwierdzono natomiast różnic w częstości występowania allelu 825T podjednostki β3 białka G u chorych na cukrzycę typu 1 powikłaną nefropatią cukrzycową i nie wykazujących tego powikłania [12]. Zwiększonej aktywności wymiennika sodowo-protonowego przypisuje się znaczenie w podatności na rozwój otyłości, nadciśnienia tętniczego, natomiast sugerowana rola w predyspozycji do szybszego rozwoju nefropatii cukrzycowej u chorych na cukrzycę typu 2 wymaga potwierdzenia w dalszych badaniach [13]. Prowadzone są także badania związku między polimorfizmem innych genów i występowaniem nefropatii cukrzycowej [4]. Jedna z atrakcyjnych hipotez zakłada, że predyspozycja do rozwoju nefropatii cukrzycowej może być uwarunkowana przez główny efekt genetyczny [14]. Niedawno na podstawie badań przeprowadzonych u 66 par rodzeństwa chorującego na cukrzycę typu 1, z których tylko u jednego rozwinęła się nefropatia cukrzycowa, wykazano występowanie sprzężenia między regionem chromosomu 3q, zawierającym gen receptora typu 1 angiotensyny II (AT1R) a rozwojem nefropatii cukrzycowej [15]. Badany region ma długość około 20 centyMorganów (cM). Wykorzystując test niezrównoważonej transmisji (transmission disequilibrium test, TDT) nie wykazano jednak powiązania między żadnym z poznanych polimorfizmów genu AT1R i wystąpieniem nefropatii cukrzycowej. Nie jest jednak wykluczone, że dalsze badania sekwencji całego genu AT1R, łącznie z odcinkami niekodującymi (introny i część promotorowa), gdzie mogą się znajdować elementy regulujące ekspresję, doprowadzą do identyfikacji polimorfizmów, które predysponują do rozwoju nefropatii cukrzycowej. W oparciu o cytowaną hipotezę przedstawiono możliwość, że mikroalbuminuria, będąca wyrazem wczesnej nefropatii cukrzycowej może być objawem uwarunkowanego genetycznie uszkodzenia nerek [16]. Sugerowany związek między nieokreślonym dotychczas polimorfizmem genu AT1R lub genu zlokalizowanego w jego sąsiedztwie i podatnością na rozwój nefropatii cukrzycowej jest zgodny z hipotezą, że nerkowe przewlekłe powikłania cukrzycy mogą być uwarunkowane genetyczną predyspozycją do nadciśnienia tętniczego. Opublikowanego także wyniki badań wskazujące, że polimorfizm A1166C genu AT1R może być markerem genetycznym zwiększonej podatności na nerkowe powikłania w cukrzycy typu 2 [17]. Przytoczone w skróconej formie wyniki dotychczasowych badań wskazują, że predyspozycja do występowania nefropatii cukrzycowej jest uwarunkowana wielogenowo, być może z decydującym wpływem jednego, głównego defektu genetycznego, ale nie została dotychczas jednoznacznie określona. Istnieją uzasadnione przesłanki, że nawet u osób cechujących się genetyczną predyspozycją do wystąpienia nefro- patii cukrzycowej, gdy pojawia się u nich cukrzyca, to o rozwoju tego powikłania w znacznym stopniu decydują polegające modyfikacji czynniki środowiskowe, z których najważniejszym jest optymalna kontrola metaboliczna cukrzycy z jej składowymi: optymalną kontrolą glikemii i optymalną kontrolą ciśnienia tętniczego, zapobiegające także rozwojowi innych przewlekłych powikłań cukrzycy. W analizie retrospektywnej przebiegu cukrzycy u osób, u których rozwinęła się nefropatia cukrzycowa wykazano, że wyrównanie metaboliczne cukrzycy i kontrola ciśnienia tętniczego były gorsze niż u osób bez nefropatii. Dane te wskazują, że o rozwoju nefropatii cukrzycowej, oprócz predyspozycji genetycznej decyduje także kontrola metaboliczna cukrzycy i ciśnienie tętnicze, a zwłaszcza ciśnienie wewnątrzkłębuszkowe. W powszechnie cytowanym badaniu DCCT [18], wykazano u chorych na cukrzycę typu 1, że intensywna kontrola glikemii zmniejszała występowanie mikroalbuminurii o 39% (95 % przedział ufności 21-52%) i białkomoczu (albuminurii) o 54% (95% przedział ufności 19-74%). Dobowe wyniki uzyskano u chorych na cukrzycę typu II w badaniu przeprowadzonym w Japonii [19]. W badaniach brytyjskich wykazano także, iż u chorych na cukrzycę typu 2 leczenie hipotensyjne, relatywnie nawet bardziej, niż kontrola glikemii hamuje występowanie nefropatii cukrzycowej. Wyniki tych badań, a także wielu innych, dostarczają dowodów, że optymalna kontrola metaboliczna cukrzycy zarówno typu 1 jak i typu 2 od chwili rozpoznania może skutecznie zapobiegać występowaniu nefropatii cukrzycowej lub wydatnie opóźnia jej wystąpienie nawet u osób posiadających predyspozycję genetyczną do rozwoju tego powikłania. Ponadto przestrzeganie standardów postępowania u chorych na cukrzycę w odniesieniu do ryzyka wystąpienia nefropatii cukrzycowej i z zastosowaniem odpowiedniego leczenia [20] może zmniejszyć o około 50% liczbę chorych na cukrzycę wymagających w końcowym etapie kosztownego leczenia nerkozastępczego. Piśmiennictwo: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Czekalski S. How to diagnose and how to interpret microalbuminuria in the diebetic patients. Nephrol Dial Transplant 1996; 11: 1509-1511. Czekalski S, Majkowska L, Fuchs H. Patofizjologiczne i kliniczne podstawy zapobiegania nefropatii cukrzycowej. Diabetol Pol 1999; 3: 6-19. Czekalski S. Nefropatia cukrzycowa. W: Nefrologia praktyczna, red. Z. Hruby, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2001: 191-208. Czekalski S. Podłoże molekularne powikłań cukrzycy, W: Genetyka chorób układu krążenia, red. A. Ciechanowicz, A. Januszewicz, W Różyłło. Medycyna Praktyczna, Kraków 2002: 277-280. Królewski AS, Warram JH, Chriestlieb AR, Bysick EJ, Kolln CR. The changing natural history of nephropathy in type 1 diabetes. Am J Med 1985; 78: 785-794. Quinn M, Angelico MC, Warram JH, Krolowski AS. Familial factors determine the development of diabetic nephropathy in pantients with IDDM. Diabetologia 1996; 39: 940-945. 465 MATERIAŁY ZJAZDOWE Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Seagnist ER, Goetz FC, Rich SS, Barbosa J. Familial clustering of diabetic kidney disease: Evidence for genetic susceptibility to diabetic nephropathy. N Engl J Med. 1989; 320: 1161-1165. Moczulski DK, Królewski AS. Poszukiwanie genów dla nefropatii cukrzycowej. Nefrol Dial Pol 2000; 4: 5-9. Grzeszczak W. Epidemiologia i genetyka nefropatii cukrzycowej. I Katowickie Seminarium „Postępy w nefrologii i nadciśnieniu tętniczym” Katowice 8-10;11: 2001. Ragus JJ, Moczulski DK, Beatritz MB et al. Diabetic nephropathy is associated with AAGT polymorphism T235. Results of family-based study. Hypertension 1998; 31: 627631. Blüthner M, Schmidt S, Siffert W, et al. Increased frequency of G-protein beta 3-subunit 825T allele in dialyzed patients with type 2 diabetes. Kidney Int 1999; 55: 1247-1250. Fogarty DC, Zychma MJ, Scott LJ, et al. The C825T polymorphism in the human G-protein beta 3 subunit gene is not associated with diabetic nephropathy in Type 1 diabetes mellitus. Diabetologia 1998; 41: 1304-1308. Siffert. G protein β3 subunit 825T allele, hypertension, obesity, and diabetic nephropathy. Nephrol Dial Transplant 2000; 15: 1298-1306. Królewski AS, Warram JH, Rand LL, Khan CR. Epidemiologic approach to the etiology of Type 1 diabetes mellitus and its complications. N Engl J Med. 1987; 317: 1390-1398. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Moczulski DK, Rogus JJ, Antonellis A, et al. Major susceptibility locus for nephropathy in type 1 diabetes on chromosome 3q: results of novel discordant sib-pair analysis. Diabetes 1998; 47: 1164-1169. Oko A, Pawlaczyk K, Czekalski S. Mikroalbuminuria jako objaw uwarunkowanego genetycznie uszkodzenia nerek. Pol Arch Med. Wewn 2002; 57: 581-587. Buraczyńska M, Książek, Łopatyński J, Spasiewicz D, Nowicka T, Książek A. Związek polimorfizmów genów układu renina-angiotensyna z nefropatią w przebiegu cukrzycy typu 2. Pol Arch Med Wewn 2002; 57: 725-730. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group: Effet of intensive therapy on the development and progression of diabetic nephropathy in the diabetic control and complications trial. Kidney Int 1995; 47: 1703-1720. Ohkubo Y, Kishikawa H, Araki E et al. Intensive insulin therapy prevens the progression of diabetic microvascular complications in Japanese patients with non-insulindependent diabetes mellitus. A randomized prospective 6-year study. Diabetes Res Clin Pract 1995; 28: 103-117. Czekalski S, Grzeszczak W, Ciechanowski K, Renke M. Rozpoznawanie i leczenie nefropatii cukrzycowej. W: Standardy postępowania w rozpoznawaniu i leczeniu chorób nerek. Red. B. Rutkowski, S. Czekalski, Wydawnictwo Medyczne Mak Med., Gdańsk 2001: 120130. Spik A1, Wojda A1, Latos-Bieleńska A2, Jędrzejczak P3, Pawelczyk L3, Jaruzelska J1 MATERIAŁY ZJAZDOWE Genetic diagnosis of the male infertility 1 2 3 Institute of Human Genetics Polish Academy of Sciences, Poznań Department of Medical Genetics University of Medical Sciences, Poznań Clinics of Infertility and Endocrinology of Reproduction, Poznań Summary Infertility is one of major medical and social problems because the number of couples that fail to conceive is very high (15%). About half of the infertility cases are caused by a male factor. Although there are many factors causing male infertility these factors are not known in over 60% of the patients. This large group of cases is called idiopathic sterility and much attention is paid to the genetic etiology within this group of patients. This study was aimed to estimate frequency of genetic defects in 120 males with azoospermia or severe oligospermia and idiopathic non-obstructive infertility. Patients we selected for the study were candidates for ICSI. We first performed the karyotype analysis on blood lymphocytes in all the patients followed by molecular analysis of AZF region of the Y-chromosome. Using these two approaches we found that genetic defect was present in as much as 11% of patients: We identified AZF deletions in 6 (5%) of patients and chromosomal aberrations in 7 (6%) of patients. This study shows that genetic diagnosis and genetic counseling of the patients undergoing assisted reproduction procedures should be provided. Spik A1, Wojda A1, Latos-Bieleńska A2, Jędrzejczak P3, Pawelczyk L3, Jaruzelska J1 Genetyczna diagnostyka niepłodności męskiej 1 2 3 Zakład Genetyki Człowieka PAN, Katedra i Zakład Genetyki Medycznej AM, Klinika Niepłodności i Endokrynologii Rozrodu AM, Poznań. Streszczenie Niepłodność jest jednym z ważnych problemów medyczno-społecznych. Wskazuje na to wysoki, wciąż wzrastający odsetek małżeństw, które nie mogą uzyskać potomstwa (15%). Mniej więcej połowa przypadków niepowodzeń rozrodu jest spowodowana czynnikiem męskim. Etiologia niepowodzeń rozrodu nie jest znana 466 u ponad 60% niepłodnych mężczyzn (niepłodność idiopatyczna) i coraz więcej uwagi poświęca się jej przyczynom genetycznym. Celem niniejszej pracy było określenie częstości defektu genetycznego w grupie 120 mężczyzn z azoospermią lub ciężką postacią oligospermii charakteryzujących się Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) niezaporową niepłodnością idiopatyczną i będących kandydatami do ICSI. U wszystkich pacjentów badano kariotyp na podstawie krwi obwodowej oraz przeprowadzono molekularną analizę regionu AZF chromosomu Y. Zastosowanie tylko tych dwóch podejść badawczych pozwoliło wykazać, że defekt genetyczny występował aż u 11% pacjentów: delecje AZF stwierdzono u 6 (5%) pacjentów, natomiast aberracje chromosomowe występowały u 7 (6%) pacjentów. Niniejsze badania wskazują, że diagnostyka obejmująca molekularną analizę regionu AZF oraz kariotypu a także udzielenie fachowej porady genetycznej niepłodnym, chcącym skorzystać z metod wspomaganego rozrodu są bardzo potrzebne. Wanda Horst-Sikorska1, Katarzyna Ziemnicka2, Liliana Celczyńska-Bajew1 Osteoporosis - genetic desease 1 2 Department of Familial Medicine, K. Marcinkowski University of Medical Sciences, Poznań Department of Endocrinology, Metabolism and Internal Medicine, K. Marcinkowski University of Medical Sciences, Poznań Summary: Osteoporosis is a multifactorial disorder. Apart from environmental influences, particularly genetic factors determine normal bone mass. The numerous studies have identified several candidate genes which products can be involved in the regulation of bone remodeling: vitamin D receptor (VDR), estrogen receptor (ER), type I collagen, testosterone aromatase, TGFα, IGF I, calcitonin and parathyroid hormone receptors, osteoprotegerin and many others. Interaction between environmental and genetic factors let to achieve and maintain proper bone mass, but also lead to different fenotype. Genetic factors essentially determine peak bone mineral density (BMD), which is then modified by environmental factors. Key words: osteoporosis, genetics, gene polymorphisms, bone mineral density Osteoporoza - choroba genetycznie uwarunkowana? 1 2 Zakład Medycyny Rodzinnej AM w Poznaniu Katedra i Klinika Endokrynologii, Przemiany Materii i Chorób Wewnętrznych AM Streszczenie: Osteoporoza jest chorobą wieloczynnikową. Obok istotnego wpływu wielu czynników środowiskowych podkreśla się udział czynników genetycznych warunkujących osiągnięcie prawidłowej masy kostnej. Wśród nich szczególnie podkreśla się udział genów determinujących syntezę: receptora witaminy D (VDR), receptora estrogenowego (ER), kolagenu typu 1α1 i 1α2, aromatazy testosteronu, TGFβ, IGF I, receptorów dla kalcytoniny i parathormonu, osteoprotegeryny i wielu innych. Wzajemne oddziaływanie czynników środowiskowych i genetycznych pozwala na osiągnięcie i utrzymywanie określonej masy kostnej, ale i prowadzi n Osteoporoza jest chorobą szkieletu doprowadzającą do wzmożonej łamliwości kości. Ryzyko wystąpienia złamania kości zależy od aktualnej mikroarchitektury kości, stopnia jej mineralizacji, mikrouszkodzeń, nasilenia resorpcji i jakości macierzy organicznej kości. Nadal jednak masa kostna (BMD – z ang. bone mineral density) pozostaje na czele czynników, które należy ocenić w czasie badania chorego [1]. Na jej wartość wpływają uwarunkowania genetyczne, ogólny stan zdrowia, sposób odżywiania oraz styl życia (m.in. aktywność fizyczna czy nałogi) i stan hormonalny [2, 3]. Z powodu podwyższania się średniego wieku populacji wzrasta liczba osób w wieku starszym. do różnego obrazu fenotypowego. Czynniki genetyczne istotnie warunkują szczytową masę kostną, którą modyfikują następnie czynniki środowiskowe działające w ciągu całego życia. Słowa kluczowe: osteoporoza, genetyka, polimorfizm genów, gęstość mineralna kości Prof. dr hab. Wanda Horst-Sikorska, Zakład Medycyny Rodzinnej AM w Poznaniu, ul. Dąbrowskiego 79, 60-529 Poznań To z kolei powoduje, że problemy związane ze zmianami w ustroju typowymi dla tego okresu życia są coraz poważniejsze. Złamania bliższego końca kości udowej i kręgów u starszych kobiet w 90% wynikają z osteoporozy. Zadania służby zdrowia wynikające z występowania powikłań osteoporozy są ogromne, zarówno organizacyjnie jak i finansowo i są związane z opieką nad ludźmi niepełnosprawnymi, po złamaniach, zabiegach ortopedycznych czy w trakcie rehabilitacji. Poznanie fizjologicznych mechanizmów metabolicznych zachodzących w tkance kostnej ma szansę spowodować istotny postęp w rozpoznawaniu indywidualnego zagrożenia rozwojem osteoporozy a być może również i jej skutecznej terapii [4]. 467 MATERIAŁY ZJAZDOWE Wanda Horst-Sikorska1, Katarzyna Ziemnicka2, Liliana Celczyńska-Bajew1 MATERIAŁY ZJAZDOWE Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE W ponad 100 jednostkach badania z wykorzystaniem technik biologii molekularnej pozwoliły na wykrycie defektu w jednym genie będącego przyczyną choroby. Przypuszczalnie znacznie więcej zaburzeń zdeterminowanych jest jednak defektem w więcej niż jednym miejscu genomu. Do nich zalicza się również osteoporozę [5]. Czynniki dziedziczne warunkujące osiągnięcie i utrzymanie określonej masy kostnej wynikają z determinacji genetycznej aktywności procesu różnicowania oraz dojrzewania komórek kościotwórczych (osteoblastów) i resorpcyjnych (osteoklastów), aktywność metaboliczna osteoblastów i osteoklastów (apoptoza) a także synteza i aktywność czynników zaangażowanych w procesy metaboliczne, które mają wpływ na masę kostną (cytokiny, witaminy, kolagen, białka niekolagenowe). Strategia poszukiwania chorobotwórczych mutacji w genomie polega na: 1. określeniu patologicznego białka - poznaniu jego struktury - poszukiwaniu zmutowanego genu, 2. poszukiwaniu markerów genetycznych w obrębie genów, których funkcja jest związana z określonymi stanami (tzw. geny kandydaci) i próby ich powiązania z fenotypem [5]. Wśród kandydujących czynników warunkujących predyspozycję do występowania osteoporozy wymienia się następujące geny determinujące syntezę: receptora witaminy D3, receptora estrogenowego, kolagenu 1α1, 1α2, aromatazy testosteronu, TGF b, IGF I, receptora dla kalcytoniny, osteoprotegeryny, IL6, IL-1, receptora typu 1 dla parathormonu, osteokalcyny, apolipoproteiny E [24] i wiele innych [6-24]. Obecnie przeważa pogląd, że szczytowa masa kostna jest zdeterminowana aktywnością wielu genów, ale dodatkowo poważnie modyfikowana przez działające w różnym czasie czynniki środowiskowe. Poniżej przedstawiono poglądy na wpływ produktów wymienionych genów na przemiany metaboliczne w tkance kostnej. Gen receptora witaminy D3 (VDR) Zależność masy kostnej od działania witaminy D3 została już dawno zauważona. Pierwsze doniesienia o związku pomiędzy osteoporozą a polimorficzną zmiennością genu VDR były bardzo entuzjastyczne. W badaniach Morrisona i wsp. wykazano wpływ polimorfizmu dla enzymu BsmI genu VDR na osiągnięcie określonej szczytowe masy kostnej (BMD). Genotyp Bb, bb był związany z wysoką BMD natomiast genotyp BB z niską BMD [25]. Jednak inni autorzy badając różne populacje tymi samymi metodami uzyskali odmienne wyniki [26]. Takich zależności nie wykazano również dla wariantów allelicznych VDR i masy kostnej u mężczyzn [27]. Pojawiły się doniesienia o roli witaminy D3 w regulacji tempa resorpcji kości. W badaniach Obermayer-Pietsch stwierdzono, że genotyp bb, Bb może odpowiadać za wolną a genotyp BB za szybka utratę masy kostnej [28]. Możliwe wydaje się także, że procesy aktywacji witaminy D3 mogą mieć wpływ na syntezę białek nośniko- 468 wych dla wapnia i tą drogą regulować transport tego pierwiastka z przewodu pokarmowego, a w konsekwencji wpływać na możliwość jego wbudowywania lub utraty z kości [6]. Rola witaminy D3 w metabolizmie kostnym jest z pewnością kluczowa, jednak nie do końca poznane są mechanizmy jej oddziaływania na kość w różnych sytuacjach metabolicznych. Wiadomo, że na aktywność witaminy D3 ma wpływ szereg innych związków, np. estrogeny. Gen receptora estrogenowego (ER) Innym genem, który odgrywa istotną rolę w metabolizmie kostnym jest gen receptora estrogenowego. U kobiet wykazano, że hipoestrogenizm zarówno pomenopauzalny, jak również powstający na skutek zaburzeń wydzielania przez jajnik w przebiegu anorexia nervosa czy przedwczesnego wypadania funkcji jajników (ang. premature ovarian failure) wpływa na zmniejszenie masy kostnej. Prawdopodobnie mechanizmem za ten fakt odpowiedzialnym jest przyspieszenie tempa rekrutacji i dojrzewania oraz nadaktywność osteoklastów związana m.in. z ich opóźnioną apoptozą. W rezultacie dochodzi do szybkiej utraty masy kostnej [29]. Dodatkowo wykazano, że rola polimorfizmu genu ER nie ogranicza się jedynie do kobiet. Wykazano, że polimorfizm ten (dla enzymów Xba I, Pvu II) ma również wpływ na BMD u młodych chłopców. Warianty genu ER: xx i PP były wyraźnie związane z wyższą masą kostną, natomiast wariant Xx oraz Pp i pp z niższą masą kostną [30]. Inne geny, których warianty alleliczne mają wpływ na metabolizm kostny to: Gen syntetazy kolagenu 1α1 Obserwacja licznych złamań u chorych na osteogenesis imperfecta i przeprowadzone badania genetyczne doprowadziły do wykrycia, że odpowiedzialnym za tę gorszą jakościowo kość jest wariant genu syntetazy kolagenu 1α1. Kolagen jest jednym z czynników determinujących masę i jakość kości. Wynika z tego, ze warianty genu syntetazy kolagenu mogą wpływać na predyspozycję do osteoporozy. Wykazano m.in., że wariant SS pozostaje w związku z prawidłową BMD, wariant ss z BMD o 2% niższą, a wariant ss z BMD o 4% niższą [10]. Gen osteoprotegeryny Analiza wariantów allelicznych osteoprotegeryny (białka, które po związaniu czynnika różnicowania osteoklastów – ODF, hamuje rozwój osteoklastów) wykazała wyraźną przewagę genotypów z allelem C (substytucja w eksonie 1 9G›C) w grupie chorych z osteoporozą i osteopenią w porównaniu z grupą osób zdrowych [19]. Geny: TGF β, IL-6, ApoE TGF β jest znanym czynnikiem odgrywającym rolę w mechanizmie aktywacji preosteoblastów. Badania genu wykazały, że wariant z delecją C w pozycji 7138 wiąże się z niską masą kostną, wzrostem aktyw- ności fosfatazy zasadowej i zwiększonym wydalaniem hydroksyproliny. Może to zaburzać procesy osteogenezy idoprowadzać do obniżenia BMD [15]. Badania ewentualnego wpływu innych genów na wartość BMD wykazały, że polimorfizm genu IL-6, cytokiny biorącej udział w metabolizmie kostnym, może być niezależnym czynnikiem warunkującym tę wartość w późnym okresie dojrzewania oraz wpływającym na szczytową masę kostną u dorosłych [20]. Kolejnym analizowanym genem, który może być odpowiedzialny za rozwój osteoporozy jest apolipoproteina E (ApoE). Obecność allelu genu ApoE*4 wiązała się z szybszą utratą masy ciała i nasiloną resorpcją kości u badanych kobiet (w ocenie BMD szyjki kości udowej i kości promieniowej) [ 24]. Skomplikowany i niezmiernie ściśle powiązany układ aktywacji oraz hamowania procesów syntezy i resorpcji kości sprawia, że szczegółowe wyjaśnienie mechanizmów doprowadzających do różnego rodzaju patologii w tym zakresie jest niezmiernie utrudnione. W ciągu życia metabolizm kostny można podzielić na trzy okresy: z przewagą syntezy kości, względnej równowagi (proporcjonalne procesy niszczenia i odbudowy kości) oraz z przewagą procesu resorpcji. Jest więcej niż prawdopodobne, że BMD zależy od aktywności wielu genów. Obserwacja tych zjawisk jest jednak bardzo trudna ze względu na nakładanie się działania produktów wielu genów w procesie regulacji metabolizmu tkanki kostnej. Przykładem jest tutaj sytuacja, kiedy obserwujemy niską szczytową BMD a dodatkowo osoba badana jest nosicielem wariantu genu odpowiedzialnego za defekt działania OPG co skutkuje brakiem lub zakłóceniem hamowania osteoklastów. Chory ten ma już w młodym wieku wyraźnie obniżoną masę kostną. Z kolei gdy niska szczytowa BMD współistnieje z prawidłowym wariantem genu OPG to u ludzi młodych BMD może być nawet prawidłowe, a następnie jedynie nieco obniżone do okresu późnej starości. Można bowiem założyć, że w każdym kolejnym obrocie kostnym niekorzystne zjawiska ulegają sumowaniu i przez to znajdują wcześniej czy później swój obraz fenotypowy. Można zobrazować ten proces następująco: 1. osoba z niską szczytową masą kostną i jednocześnie wysoką aktywnością resorpcji kości z powodu defektu w genie OPG i w konsekwencji brakiem hamowania osteoklastów wykazuje cechy osteoporozy. 2. osoba z niską szczytową masą kostną i małą aktywnością resorpcji kości (gen OPG prawidłowy) ma prawidłowe BMD w wieku młodzieńczym i okresie wczesnej dorosłości. 3. osoba z niską szczytową masą kostną i małą aktywnością resorpcji kości (gen OPG prawidłowy) wykazuje osteopenię w wieku starszym. Dalszym utrudnieniem w interpretacji uzyskanych wyników jest niewątpliwy wpływ czynników zewnętrznych na jakość kości. Stwarza to problemy w kwalifikacji chorych z aktualnym pomiarem gęstości mineralnej kości wskazującym na jej znaczne obniżenie do grupy z pierwotną niską BMD lub przeciwnie chorych z prawidłową wyjściową szczytową masą kostną, która ulega obniżeniu na skutek sumowania się w ciągu życia niekorzystnych wpływów środowiska. Ilustrują to podane niżej przykłady: 1. pacjent z niską szczytową masą kostną i wysoką aktywnością resorpcji kości (brak hamowania OPG) ale przy prawidłowej podaży witaminy D3 i produktów wapniowych w pożywieniu oraz z dużą aktywnością fizyczną może mieć BMD w normie lub nieco obniżoną, 2. z kolei pacjent z niską szczytową masą kostną i małą aktywnością resorpcji kości (hamowanie OPG prawidłowe) nieprawidłowo odżywiający się i nie wykazujący systematycznej aktywności fizycznej będzie prezentował cechy densytometryczne osteopenii w młodszym wieku i zaawansowanej osteoporozy w wieku starszym. Problem polega na tym, że pacjent badany w wieku 50-60 lat może mieć niską masę kostną, ale przyczyny tego stanu mają różną etiologię. Mimo podobnego fenotypu podstawy genetyczne są zupełnie odmienne. Wyłania się z tego problem związany z błędną kwalifikacją osób (poprzez badanie BMD) z określonym polimorfizmem dotyczącym jednego lub dwóch genów do grupy osobników z genotypem ochronnym lub predysponującym do rozwoju osteoporozy. W rzeczywistości mamy do czynienia z wzajemnym oddziaływaniem czynników genetycznych i środowiskowych. Czynniki genetyczne stanowią podstawę do osiągania szczytowej masy kostnej i obserwacje wskazują, że mają one szczególnie duże znaczenie w okresie wzrostu i dojrzewania. Z kolei korzystny lub niekorzystny wpływ czynników zewnętrznych w istotny sposób modyfikuje BMD w ciągu całego życia. Należy brać dodatkowo pod uwagę czynniki komplikujące możliwość interpretacji bezpośredniego związku powszechnego wariantu sekwencji DNA z masą kostną (osteoporozą, osteopenia lub prawidłową BMD) z następujących powodów: 1. obecność polimorfizmu w obrębie genów jest zjawiskiem powszechnym, o ich znaczeniu decyduje lokalizacja mutacji co ma różne następstwa w procesie transkrypcji i translacji, 2. obecność zmienności międzypopulacyjnej, co powoduje, że określone chorobotwórcze warianty genotypu są w innej populacji bez znaczenia klinicznego, 3. zależność końcowego efektu fenotypowego od aktywacji wielu genów (brak koniecznego substratu lub obecność patologicznego produktu może uniemożliwić syntezę finalnego białka), 4. występowanie innych chorób, które w różnych mechanizmach zmieniają metabolizm kości (jak np. nadczynność tarczycy na skutek przyspieszenia resorpcji lub zespół złego wchłaniania z powodu braku substratów dla tworzenia kości), 5. czas, intensywność i długość trwania określonego czynnika środowiskowego modyfikującego w stopniu silnym, umiarkowanym lub łagodnym metabolizm kostny (np. nikotynizm w okresie 469 MATERIAŁY ZJAZDOWE Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE dojrzewania, alkoholizm, bądź alkoholu choćby tylko okazjonalnie). spożywanie Podsumowując można stwierdzić, że dla uzyskania szczytowej masy kostnej istotne przeważające znaczenie ma determinacja genetyczna, natomiast na stan metaboliczny kości w ciągu całego życia i w rezultacie stwierdzaną w późniejszych latach masę kostną mają znaczny wpływ czynniki środowiskowe. Stąd na pytanie czy osteoporoza jest chorobą uwarunkowaną genetycznie można odpowiedzieć, że występuje genetyczna predyspozycja do wystąpienia choroby – (zależność: BMD a wystąpienie osteoporozy), ale modyfikująca rolę należy przypisać czynnikom środowiskowym. Czynniki te wraz z wiekiem zyskują coraz to większy wpływ na jakość kości. MATERIAŁY ZJAZDOWE Piśmiennictwo 1. Delmas PD. Treatment of postmenopausal osteoporosis. Lancet 2002; 359: 2018-2026. 2. Greenfield EM, Goldberg VM. Genetic determination of bone density. Lancet 1997; 350: 1263-1264. 3. Baudoin C, Cohen-Solal ME, Beaudreuil J, De Vernejoul MC. Genetic and environmental factors affect bone density variances of families of men and women with osteoporosis. J Clin Endocrinol Metab 2002; 87: 2053-2059. 4. Melton LJ, Thamer M, Ray N. Fractures attributed to osteoporosis. Report from National Osteoporosis Foundation. J Bone Miner Res 1997; 12: 16-23. 5. Prockop D. The genetic trail of osteoporosis. N Eng J Med 1998; 338: 1061-1062. 6. Eisman JA. Genetics of osteoporosis. Endocr Rev 1999; 20: 788-804. 7. Houston LA, Grant SFA, Reich DM, Ralston SH. Vitamin D receptor polymorphism, bone mineral density, and osteoporotic vertebral fracture: Studies in a UK population. Bone 1996; 18: 249-252. 8. Ralston SH. Genetic markers of bone metabolism and bone disease. Scand J Clin Lab Invest 1997; 57: 114-121. 9. Viitanen AM, Karkkainen M, Laitinen K, Lambergallardt C, Kainulainen K, Rosanen C, Viikari J, Valimaki MJ, Kontula K. Common polymorphism of the vitamin D receptor gene is associated with variation of peak bone mass in young Finns. Calcif Tissue Int 1996; 59: 231-234. 10. Uitterlinden AG, Weel AE, Burger H, Fang Y, van Dujin CM, Hofman A, van Leewen JP, Pols HA. Interaction between the vitamin D receptor gene and collagen type Ialpha1 gene in susceptibility for fracture. J Bone Miner Res 2001; 16: 379385. 11. Mueller SO, Korach KS. Estrogen receptors and endocrine disaeses: lessons from estrogen receptor knockout mice. Curr Opin Pharmacol 2001; 1: 613-619. 12. Kobayashi N, Fujino T, Shirogawa T, Furuta I, Kobamatsu Y, Yaegashi M, Sakaguri N, Fujimoto S. Estrogen receptor alpha polymorphism as a genetic marker for bone loss, vertebral fractures and susceptibility to estrogen. Maturitas 2002; 41(3): 193-201. 13. Keen RW, Woodford-Richens KL, Grant SF, Ralston SH, Lanchbury JS, Spector TD. Association of polymorphism at the type I collagen (COL1A1) locus with reduced bone mineral density, increased fracture risk, and increased collagen turnover. Arthritis Rheum 1999; 42: 285-290. 14. Nawata H, Tanaka S, Tanaka S, Takayanagi N, Sakai Y, Yanase T, Ikuyama S, Haji M. Aromatase in bone cell: association with osteoporosis in postmenopausal women. J Steroid Biochem Mol Biol 1995; 53: 165-174. 15. Langdahl BL, Knudsen JY, Jensen HK, Gregersen N, Eriksen EF. A sequence variation: 713-8delC in the transforming 470 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. growth factor-beta 1 gene has higher prevalence in osteoporotic women than in normal women and is associated with very low bone mass in osteoporotic women and increased bone turnover in both osteoporotic and normal women. Bone 1997; 20: 289-294. Miyao M, Hosoi T, Inoue S, Hoshino S, Shiraki M, Orimo H, Ouchi Y. Polymorphism of insulin-like growth factor I gene and bone mineral density. Calcif Tissue Int 1998; 63: 306311. Masi L, Becherini L, Colli E, Gennari L, Mansani R, Falchetti A, Becorpi AM, Cepollaro C, Gonnelli S, Tanini A, Brandi ML. Polymorphisms of the calcitonin receptor gene are associated with bone mineral density in postmenopausal Italian women. Biochem Biophys Res Commun 1998; 248: 190-195. Hofbauer LC, Schoppet M. Osteoprotegerin gene polymorphism and the risk of osteoporosis and vascular disease. J Clin Endocrinol Metab 2002; 87: 4080-4084. Kalak R, Jura J, Horst-Sikorska W, Kwiatkowski W, Słomski R. Molecular diagnosis of genetic diseases. Experience from studies of DMPAPc, TSC and OPG genes. J Clin Biochem Nutr 2000; 28(3): 129-141. Lorentzon M, Lorentzon R, Nordstrom P. Interleukin-6 gene polymorphism is related to bone mineral density during and after puberty in healthy white meales. A cross-sectional and longitudinal study. J Bone Miner Res 2000; 15: 1944-1949. Keen RW, Woodford-Richens KL, Lanchbury JS, Spector TD. Allelic variation at the interleukin-1 receptor antagonis gene is associated with early postmenopausal bone loss at the spine. Bone 1998; 23: 367-371. Duncan EL, Brown MA, Sinsheimer J, Bell J, Carr AJ, Wordsworth BP, Wass JA. Suggestive linkage of parathyroid receptor type 1 to osteoporosis. J Bone Miner Res 1999; 14: 19993-1999. Gustavsson A, Nordstrom P, Lorentzon R, Lerner UH, Lorentzon M. Osteocalcin gene polymorphism is related to bone density in healthy adolescent females. Osteoporosis Int 2000; 11: 847-851. Cauley JA, Zmuda JM, Yaffe K, Kuller LH, Ferrel RE, Wisniewski SR, Cummings SR. Apolipoprotein E polymorphism: A new genetic marker of hip fracture risk - The study of osteoporotic fractures. J Bone Miner Res 1999; 14: 1175-1181. Morrison NA, Qi JC, Tokita A, Kelly PJ, Crofts L, Nguyen TV, Sambrook PN, Eisman JA. Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles. Nature 1994; 20: 284-287. Obermayer-Pietsch BM, Fruhauf GE, Chararas K, MikhailReinisch S, Renner W, Berghold A, Kenner L, Lackner C. Association of the vitamin D receptor genotype BB with low bone density in hyperthyroidism. J Bone Miner Res 2000; 15: 1950-1955. Ban Y, Ban Y, Taniyama M, Katagiri T. Vitamin D receptor initiation codon polymorphism in Japanese patients with Graves’ disease. Thyroid 2000; 10(6): 475-80. Francis RM, Harrington F, Turner E, Papiha SS, Datta HK. Vitamin D receptor gene polymorphism in men and its effect on bone density and calcium absorption. Clin Endocrinol 1997; 46: 83-86. Riggs BL, Spelsberg TC. Mechanisms of estrogen actions on bone. Postgraduate Med 1989; 13-14. Lorentzon M, Lorentzon R, Backstrom T, Nordstrom P. Estrogen receptor gene polymorphism, but not estradiol levels, is related to bone density in healthy adolescent boys: a cross-sectional and longitudinal study. J Clin Endocrinol Metab 1999; 84: 4597-4601. Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Alina Warenik-Szymankiewicz Podłoże genetyczne zespołu policystycznych jajników Streszczenie Zespół Policystycznych Jajników opisany po raz pierwszy przez Steina i Leventhala w 1939 roku obejmował pierwotnie zespół objawów – niepłodność, zaburzenia cyklu miesiączkowego, nieprawidłowe, nasilone owłosienie typu męskiego (hirsutyzm). Przy charakterystycznych objawach klinicznych stwierdzano zaburzenia profili stężeń hormonalnych: nieprawidłowy stosunek LH/FSH powyżej 2, wysokie poziomy stężeń testosteronu, pozostające na dolnej granicy normy poziomy stężeń 17β-estradiolu. Od czasów Steina i Leventhala, bardzo wielu badaczy starało się bliżej poznać zaburzenia występujące w tym zespole, przede wszystkim poznać przyczynę wystąpienia objawów klinicznych. Można więc śmiało powiedzieć, że w tym okresie czasu, postęp wiedzy o mechanizmach zaburzeń i możliwość coraz szerszej w nie ingerencji, zmienił całkowicie spojrzenie na Zespół Policystycznych Jajników (PCOS). Z drugiej jednak strony musimy jednoznacznie przyznać, że najważniejszy cel nie został jeszcze osiągnięty. Mimo zaangażowania ogromnych środków i nieustających dociekań już pokoleń badaczy, ciągle nie znamy jednoznacznej przyczyny inicjującej rozwój zespołu. Gdzie należy upatrywać przyczyn tych niepowodzeń? Odpowiedz z pewnością nie jest jednoznaczna, tym niemniej wydaje się, że głównej przyczyny należy upatrywać w różnorodności przypadków PCOS. Tą heterogenność zespołu można prześledzić nieomal na każdej płaszczyźnie zaburzeń. W sferze objawów klinicznych, jako przykład może posłużyć doskonale, kwestia występowania otyłości. Ciągle trwają spory, czy występuje ona w 30%, czy raczej w 50%, a może procent ten sięga aż do 70% wszystkich przypadków PCOS. Nie podlega jednak dyskusji, że otyłość nie jest dostrzegana jako objaw niezbędny do rozpoznania zespołu, czyli może występować, ale nie musi. Kolejnym doskonałym przykładem różnorodności przypadków PCOS, tym razem na poziomie zaburzeń hormonalnych, jest występowanie insulinooporności. Może ona występować, wielu badaczy uważa, że jest wręcz typowa dla zespołu, ale jeśli nie występuje, to wcale nie wyklucza obecności PCOS. Bardzo istotnym przykładem wydaje się również obecność różnorodności przypadków PCOS na poziomie patomorfologicznym. Wyodrębniono wręcz podtyp zespołu określany jako hyperthecosis, charakteryzujący się patomorfologicznie przede wszystkim przerostem wnęki jajnika, w odróżnieniu od typowego obrazu PCOS z przerostem kory gruczołu z licznymi drobnymi, ułożonymi wianuszkowato pęcherzykami. Zasygnalizowania różnorodność objawów, zaburzeń, czy obrazu patomorfologicznego, sugeruje możliwość istnienie wielu, a nie jednej, przyczyn inicjujących rozwój PCOS. Jak się wydaje można już dziś powiedzieć, że badania na poziomie molekularnym, ukierunkowane na poszukiwanie zaburzeń genetycznych, potwierdzają tę tezę. Zaledwie kilka lat temu, bardzo wiele nadziei wiązano z odkryciem polimorfizmu regionu regulatorowego genu CYP17, odpowiedzialnego za syntezę cytochromu P450c17, wchodzącego w skład kluczowego enzymu steroidogenezy - 17α-hydroksylazy steroidowej. Zamiana w 34 parze nukleotydowej, tyrozyny na cytozynę, miała być odpowiedzialna za zmianę poziomu ekspresji genu, co w konsekwencji miałoby się przekładać na modyfikację aktywności enzymu. W jednej chwili wszystko w PCOS miało stać się jasne i przejrzyste. Niestety, okazało się, że częstość występowania wspomnianego polimorfizmu w grupie chorych z PCOS jest taka sama jak w populacji kobiet zdrowych. Innym przykładem mogą być badania dotyczące genu CYP11A. Zainteresowano się nim w trakcie badań 20 rodzin z występującym, jak się wydaje, rodzinnie uwarunkowanym zespołem PCOS. Wykryto polimorfizm dotyczący 528 pary nukleotydów, który zdaniem badaczy występował bardzo rzadko u kobiet z hyperandrogenizmem. Znów niestety okazało się, że omawiany polimorfizm nie wpływa zdecydowanie na poziom stężeń testosteronu we krwi, podczas badań na większej populacji kobiet, nie wykazano różnic statystycznie istotnych, pomiędzy chorymi z PCOS i grupą kontrolną. Należy podkreślić, że wspomniane odkrycia zaburzeń genetycznych, nie należy rozpatrywać jako porażki. Ich poznanie, opracowanie techniki szybkiej i łatwej diagnostyki, są bardzo cennym krokiem przybliżającym nas wszystkich do pełniejszego poznania, ale i również zrozumienia zaburzeń występujących w PCOS. Dla lekarza pozostaje jeszcze dodatkowo, poszukiwanie lepszych, bardziej przyczynowych metod leczenia. Tym niemniej nie sposób nie oprzeć się wrażeniu, że znalezienie pojedynczej mutacji, czy zaburzenia nawet o innym charakterze, jak na przykład modyfikacja ekspresji genu, jednoznacznie odpowiedzialne za inicjację zespołu wydaje się mało prawdopodobne. PCOS dziś, to zespół dość szeroko rozumianych zaburzeń, prowadzących do wystąpienia bardzo różnie manifestujących się objawów klinicznych, wynikających, jak się wydaje z wielu nakładających się na siebie przyczyn, w tym również genetycznych. 471 MATERIAŁY ZJAZDOWE Klinika Endokrynologii Ginekologicznej AM w Poznaniu Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Krzysztof Kula, Jolanta Słowikowska-Hilczer Clinical studies on sex differences in endocrinology Department of Andrology and Reproductive Endocrinology, Institute of Endocrinology, Medical University of Łódź Summary: Normal sexual development consists of the compatibility between genetic sex, sex of gonads (testes or ovaries), genital sex (sex organs), somatic sex (body characteristics) and psychic sex (gender). Gender consists of gender identity (self-estimation), gender role (objective estimation of sex behaviour). In addition, a sexual psycho-orientation (hetero-, bi- or homosexual) has been distinguished. It was believed that gender depends on the socio-environmental influences such as rearing, learning and individual choice. Although, the process of sexual differentiation of human brain is not completely elucidated, it has become recently evident that endogenous hormones more than socio-environmental factors influence gender differences. Experimental studies on animals revealed that transient action of sex steroids during perinatal period of life is crucial for the development of male sexual behavior in adulthood. Also in human male neonates testosterone, produced by testes during fetal life and perinatally, plays the main role in the masculinisation of the brain i.e. creation of the differences versus female brain. Disturbances of sexual differentiation of external genitalia (the lack of testosterone production or action in peripheral tissues of men or the inborn excess of androgens in women) affect the formation of gender. In these individuals the legal sex established according to somatic sex and/or genetic sex at birth may be incompatible with their actual gender identity and role. The knowledge about gender identity is necessary for the decision of the direction of surgical correction (if at all) of sex organs in children with ambiguous genitalia. This decision should depend not on the expected but on the actual gender identity of the patient. This decision should not be taken early in life without an active consent of the patient. Key words: gonads, genitalia, psychic sex, sex determination, hermaphroditism Krzysztof Kula Jolanta Słowikowska-Hilczer MATERIAŁY ZJAZDOWE Badania kliniczne i doświadczalne nad różnicowaniem płci mózgu Zakład Andrologii i Endokrynologii Płodności, Instytut Endokrynologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi Streszczenie: Przy prawidłowym rozwoju płciowym występuje zgodność między płcią genetyczną, a gonadalną (jądro lub jajnik), genitalną (wewnętrzne i zewnętrzne narządy płciowe), somatyczną (cechy płciowe budowy ciała), oraz psychiczną. Płeć psychiczna składa się z identyfikacji płciowej (poczucie przynależności płciowej), roli płciowej (zachowanie) i psychoorientacji płciowej (ukierunkowanie popędu płciowego hetero-, bi- i homoseksualne). Uważano, że płeć psychiczna zależy wyłącznie od wychowania lub/i świadomego wyboru. Koncepcje te zostały jednak podważone dzięki badaniom nad zaburzeniami rozwoju płciowego u ludzi (interseksualizm) oraz nad patogenezą dezaprobaty płci (transseksualizm). Doświadczalnie wykazano, że krótkotrwałe działanie steroidów płciowych w obrębie mózgu w okresie noworodkowym decyduje o samczym typie zachowań płciowych zwierząt w okresie dojrzałości. Różnicowanie płciowe mózgu odbywa się w czasie ciąży i w okresie noworodkowym, i jest zależne od obecności steroidów płciowych u samców i ich nieobecności u samic. U genetycznych chłopców z obojnaczymi narządami płciowymi z powodu braku wytwarzania i przemian tkankowych testosteronu lub u genetycznych dziewczynek z obojnaczymi narządami płciowymi z powodu nadmiaru testosteronu może wystąpić niezgodność między płcią metrykalną (ustanowioną na podstawie wyglądu narządów płciowych po urodzeniu) a płcią psychiczną. W postępowaniu lekarskim należy uwzględniać niezmienność płci psychicznej i podejmować decyzje co do korekcji operacyjnych wad wrodzonych narządów płciowych po rozpoznaniu płci psychicznej dziecka, a także pozwolić mu czynnie uczestniczyć w podejmowaniu tak ważnych decyzji. Słowa kluczowe: gonady, narządy płciowe, płeć psychiczna, różnicowanie płciowe, obojnactwo Prof. dr hab. med. Krzysztof Kula, 91-425 Łódź, ul. Sterlinga 5 tel/fax: (42) 633 07 05, e-mail: [email protected] Wstęp Prawidłowy rozwój łączy się z kaskadowym i sekwencyjnym rozwojem cech płciowych. W okresie płodowym płeć genetyczna (chromosomy płciowe: XX lub XY), determinuje płeć gonadalną (jądro lub jajnik), a ta z kolei determinuje płeć genitalną (męskie lub żeńskie narządy płciowe) i somatyczną (cechy płciowe budowy ciała). Na płeć psychiczną składają się: poczucie przynależności płciowej (identyfi- 472 kacja płciowa), rola płciowa (typ zachowania – płeć społeczna) i psychoorientacja płciowa (ukierunkowanie popędu płciowego: heteroseksualne, biseksualne, homoseksualne). Założenie, że ludzie są zawsze dymorficzni płciowo (dwupłciowi) jest głęboko zakorzenione w nowożytnej kulturze europejskiej. Według takiego poglądu każdy zdrowy człowiek powinien charakteryzować się wyraźnymi cechami żeńskimi lub męskimi, z pełną zgodnością pomiędzy płcią psychiczną, somatyczną i genitalną. Osoby z odstępstwami od tego stereotypu nie są tolerowane przez społeczeństwo i traktowane jako zagrożenie dla wzorca „kobiecości” lub „męskości”. Złożone pojęcie płci jest rzadko brane pod uwagę także w praktyce lekarskiej. Jeżeli nawet zwraca się uwagę na budowę i czynność gonad oraz możliwość zaburzeń rozwoju narządów płciowych, to psychiczne aspekty płci nie doczekały się odpowiedniego zrozumienia. Tymczasem zdarza się, że identyfikacja płciowa jest przeciwstawna płci gonadalnej i genitalnej. Rozbieżność ta występuje u ludzi z transseksualizmem (żeńska identyfikacja płciowa u mężczyzn a męska u kobiet), a także u ludzi z interseksualizmem (międzypłciowość), którego przyczyną mogą być zaburzenia rozwoju gonad (dysgenezja gonad), zaburzenia działania androgenów, takich jak zespół niewrażliwości na androgeny i brak aktywności 5-alfa-reduktazy oraz u kobiet z wrodzonym hiperandrogenizmem nadnerczowym (wrodzony przerost nadnerczy). I. Ruch obrony praw osób interseksualnych W latach 50-tych ustalono schemat medycznego postępowania z dziećmi z interseksualizmem tj. z tymi, które urodziły się z zaburzeniami rozwoju narządów płciowych („obojnacze” narządy płciowe). U podłoża tego schematu leżało powszechne przekonanie, że w przypadku niezróżnicowanych („obojnaczych”) narządów płciowych człowiek nie może rozwinąć się w osobę pełnowartościową dla społeczeństwa. Zaleca się więc jak najwcześniejszą chirurgiczną korekcję „obojnaczych” narządów płciowych, zanim jeszcze dziecko rozwinie swoją świadomość płci. Wymagane jest nie udzielanie szczegółowych informacji rodzicom, a także pacjentowi na temat jego stanu, aby nie wywoływać „niepotrzebnych zaburzeń psychicznych”. Paradoksalnie, ten schemat postępowania obowiązuje do dzisiaj [1, 2]. Tymczasem od początku lat 90-tych pojawia się wobec niego, coraz szerszy i silniejszy społeczny ruch sprzeciwu. Uczestniczą w nim przede wszystkim osoby poddane w dzieciństwie chirurgicznej korekcji narządów płciowych z powodu wad rozwojowych („obojnactwa”). Osoby te jednoznacznie twierdzą, że zostały okaleczone i pozbawione ważnej dla funkcjonowania emocjonalnego sfery odczuć seksualnych. Między innymi stwierdzają oni, że zbliznowaciałe kikuty zewnętrznych i usunięte wewnętrzne narządy płciowe uniemożliwiają uzyskanie orgazmu. Ponadto są to osoby, u których nie brano pod uwagę płci psychicznej, ponieważ wykonywano operacje we wczesnym dzieciństwie. Tak więc, wytworzone chirurgicznie narządy płciowe często były w niezgodzie z identyfikacją płciową pacjenta. Lekarze kierowali się też naciskiem rodziców i własnymi, często nietrafnymi przypuszczeniami na temat sprawności czynnościowej narządów płciowych w życiu dorosłym. Szczególnie aktywne w działalności na rzecz obrony praw dzieci i dorosłych z zaburzeniami różni- cowania płciowego do świadomego wyboru płci oraz na rzecz walki z wczesną „korekcją” obojnaczych narządów płciowych jest Północno-Amerykańskie Towarzystwo Osób Interseksualnych – ISNA (Intersexual Society of North America, strona internetowa: www.isna.org.html). Do ruchu tego powoli, ale coraz częściej przyłączają się ci lekarze, którzy u dorosłych pacjentów obserwują konsekwencje postępowania chirurgów/urologów dziecięcych. W istocie, z punktu widzenia lekarskiego pierwszoplanowym zabiegiem nie jest operacja narządów płciowych a obustronna gonadektomia jako postępowanie profilaktyczne przeciwko rozwojowi raka zarodkowego gonady. W dalszym ciągu opracowania przedstawione zostaną dane wspierające pogląd o konieczności wczesnej gonadektomii u wszystkich pacjentów z dysgenezją gonad i obojnaczymi narządami płciowymi. Tymczasem operacja zewnętrznych narządów płciowych jest zawsze jedynie próbą korekcji kosmetycznej i mimo sprawności chirurgów operowane narządy płciowe nigdy nie uzyskują pełnej czynności. Interwencja chirurgiczna nie jest też postępowaniem dla ratowania życia czy zdrowia dziecka. Ważnym argumentem wskazującym na konieczność rewizji dotychczasowych schematów postępowania chirurgicznego z osobami interseksualnymi są wyniki badań klinicznych i doświadczalnych, które wskazują na biologiczne uwarunkowanie płci mózgu (płci psychicznej), odrębne od kształtowania się narządów płciowych w życiu płodowym, a także okresie pourodzeniowym. II. Teoria seksualnej neutralności Zanim pojawiły się sugestie, że powstanie identyfikacji płciowej jest determinowane biologicznie, uważano, że zależy ono jedynie od oddziaływania otoczenia i od wychowania. Psycholog Money i współautorzy [3] zaproponowali teorię seksualnej neutralności. Według niej początkowo niezdeterminowane seksualnie dzieci rozwijają się w kierunku męskim lub żeńskim pod wpływem doświadczeń życiowych. Okres między 1-ym a 4-tym rokiem życia dziecka uważano za zasadniczy dla wykształcenia u dziecka identyfikacji płciowej. Autorzy sugerowali, że najlepszym czynnikiem prognostycznym dla późniejszego rozwoju płciowego jest płeć wcześnie przypisana dziecku przez osoby z otoczenia oraz prowadzony konsekwentnie sposób wychowania w kierunku męskim lub żeńskim. Zaliczono tutaj konieczność odpowiedniego ubioru i fryzury oraz odpowiednio kształtujące osobowość zabawy. Money [3] prowadził m.in. badania bliźniąt jednojajowych. U jednego z nich, u którego wystąpiła martwica prącia, wymusił zmianę płci na żeńską poprzez kastrację i zalecenia dla rodziców co do wychowania, ubioru, uczesania itp. Po upływie kilkunastu lat okazało się, że poniósł on dotkliwą dla pacjenta porażkę. „Pacjentka” miała zawsze męską identyfikację płciową. Money odrzucał polemikę z biologami i lekarzami wskazując na ich niekompetencje w dziedzinie psychologii. Koncepcja Money’a została jednak podważona m. in. przez 473 MATERIAŁY ZJAZDOWE Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Diamonda [4], który prowadził podobne badania bliźniąt jednojajowych, ale z zaburzeniami różnicowania płciowego (z interseksualizmem). Diamond, a później i inni wskazali na możliwość biologicznego, utrwalonego wczesnorozwojowo charakteru identyfikacji i roli płciowej człowieka. Teoria seksualnej neutralności została podważona także dzięki wynikom doświadczeń na zwierzętach. Krótkotrwałe podawanie steroidów płciowych (androgenów lub estrogenów) w okresie okołoporodowym decyduje o trwale męskich zachowaniach płciowych u zwierząt w okresie dojrzałości, niezależnie od czynników płynących ze środowiska [5, 6]. Stwierdzono, że w okresie okołourodzeniowym pod wpływem steroidów płciowych następuje ustalenie charakterystycznego dla płci męskiej acyklicznego typu wydzielania gonadoliberyny przez podwzgórze. Androgeny podawane samicom szczurów w okresie okołourodzeniowym powodują trwały brak owulacji oraz typowy dla samców sposób zachowania płciowego (przewaga odruchu „krycia” nad odruchem „lordozy”). Z kolei podanie antyandrogenów męskim noworodkom szczura powodowało, że zachowywały się one w sposób charakterystyczny dla samic (np. przewaga odruchu „lordozy” w odpowiedzi na bodźce seksualne). MATERIAŁY ZJAZDOWE III. Płeć psychiczna przy zaburzeniach różnicowania narządów płciowych A) Brak 5-alfa-reduktazy u mężczyzn U osób z zaburzeniami rozwoju narządów płciowych występuje często niezgodność między płcią ustanowioną w metryce urodzenia (płeć metrykalna ustalana w zależności od budowy zewnętrznych narządów płciowych) a płcią genetyczną i gonadalną. Jednym z takich zaburzeń jest niedobór enzymu 5-alfareduktazy. Wilson i Lasnitzki [7] oraz ImperatoMcGinley i Peterson [8] wykazali obecność defektu enzymatycznego formowania dihydrotestosteronu (DHT) z testosteronu w skórze zewnętrznych narządów płciowych u osobników męskich z płcią genetyczną i gonadalną męską. Brak 5-alfa-reduktazy uniemożliwia pełny rozwój zewnętrznych męskich narządów płciowych z zatoki moczowo-płciowej u płodów genetycznie męskich, pomimo obecności jąder i wydzielania przez nie testosteronu. Przy tym zaburzeniu wydzielanie testosteronu jest prawidłowe lub podwyższone, a mózg poddawany jest ekspozycji na działanie androgenów. Obraz kliniczny jest taki, że dzieci o kariotypie męskim, posiadające jądra, rodzą się z żeńskimi zewnętrznymi narządami płciowymi [9]. Chłopcy ci uważani są przez otoczenie za dziewczynki i zgodnie z tym wychowywani. Podczas dojrzewania płciowego następuje jednak pewna maskulinizacja zewnętrznych narządów płciowych (wydłużenie łechtaczki, kształtowanie moszny i zstępowanie jąder). W tym okresie ujawnia się najczęściej poczucie męskiej identyfikacji płciowej. Rola płciowa, pomimo wychowania jako dziewczynki, okazuje się także męska, a popęd płciowy heteroseksualny przy męskiej płci genetycznej i gonadalnej 474 (w kierunku kobiet). Na podstawie tych obserwacji wysnuto pogląd, że poczucie przynależności płciowej, rola płciowa i ukierunkowanie popędu płciowego zależą od działania steroidów płciowych w okresie rozwojowym, a nie zależą od wychowania. Z ograniczoną ekspresją działania DHT wiąże się także słaby rozwój prącia tzw. mikropenis. W takich przypadkach identyfikacja płciowa jest prawie zawsze męska. Pomimo tego niektórzy eksperci w sprawach endokrynologii dziecięcej [1] zalecają ustalenie płci żeńskiej i korekcję narządów płciowych w kierunku żeńskim przed 18 miesiącem życia, jeśli prącie u noworodka jest krótsze niż 1,9 cm. Ustalenie męskiej płci można rozważać dopiero wtedy, gdy nastąpi wzrost prącia powyżej 2,5 cm po 4-miesięcznej terapii preparatami testosteronu (enantat lub cypionian testosteronu w dawce 25 mg domięśniowo, co 3 tygodnie). Stanowisko takie wydaje się co najmniej kontrowersyjne. B) Zespół niewrażliwości na androgeny u mężczyzn (kobiety z kariotypem 46,XY) Deficyt obwodowego działania androgenów występuje też w innych formach. Występują różnice w ilości i jakości receptora dla androgenów [10]. Całkowity brak tego receptora występuje w klasycznym zespole niewrażliwości na androgeny (CAIS – ang. complete androgen insensitivity syndrome), wcześniej zwany zespołem feminizacji jądrowej. Przy kariotypie 46,XY zewnętrzne narządy płciowe, budowa ciała, a także identyfikacja płciowa są żeńskie pomimo wysokich stężeń androgenów wydzielanych przez prawidłowo zbudowane jądra znajdujące się w jamie brzusznej. U mężczyzn przy częściowej niewrażliwości na androgeny (PAIS – ang. partial androgen insensitivity syndrome) płeć psychiczna może być męska lub żeńska. C) Wrodzony przerost nadnerczy u dziewcząt Dziewczynki z wrodzonym przerostem nadnerczy rodzą się z męskimi lub obojnaczymi narządami płciowymi. W zaburzeniu tym istnieje defekt jednego z enzymów steroidogenezy (najczęściej 21-hydroksylazy), uczestniczącego w biosyntezie mineralo- i glikokortykoidów w korze nadnerczy, w wyniku czego w nadmiarze syntetyzowane są tam androgeny. Po urodzeniu rozpoczyna się substytucyjne podawanie mineralo- i glikokortykoidów, które zapobiega objawom ich niedoboru i powoduje zahamowanie wydzielania androgenów przez nadnercza. W ciągu kilku pierwszych miesięcy życia wykonuje się korekcję chirurgiczną krocza, aby wytworzyć żeńskie narządy płciowe (głównie wycięcie powiększonej łechtaczki). Tak leczone dziewczynki są wychowywane zgodnie ze swoją płcią gonadalną i genitalną. Większość z nich ma żeńską identyfikację płciową i żyje w żeńskiej roli płciowej. W zachowaniu tych dziewczynek obecne są jednak pewne cechy typowe dla chłopców np. małe zainteresowanie lalkami i niemowlętami, a większe uprawianiem sportów wymagających siły i wytrzymałości, częste inicjowanie bójek, a w okresie dojrzałości pełne poświęcanie się karierze zawodowej i rezygnacja Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) D) Dysgenezja gonad Dysgenezją gonad określa się brak lub zaburzenia organogenezy gonady, zwykle jądra, z czym łączy się brak lub zaburzenia prawidłowej czynności hormonalnej w okresie płodowym i dojrzewania płciowego [13]. Wyróżnia się czystą, mieszaną oraz częściową dysgenezję jąder. W czystej dysgenezji obustronnie zamiast gonad obecne są pasma łącznotkankowe przypominające zrąb jajnika, ale bez pęcherzyków jajnikowych. Do mieszanej dysgenezji zalicza się przypadki, w których po jednej stronie znajduje się pasmo łącznotkankowe, a po drugiej jądro. Częściową dysgenezję jąder rozpoznaje się, gdy oprócz obojnaczych narządów płciowych stwierdza się obustronnie strukturę histologiczną jądra. W czystej dysgenezji gonad narządy płciowe wewnętrzne i zewnętrzne, a także identyfikacja płciowa są zwykle typu żeńskiego, gdyż gonada taka nie wydziela testosteronu. Jeżeli w gonadzie obecne są komórki Leydiga, to wydzielane przez nie androgeny mogą spowodować rozwój męskiej płci psychicznej. W mieszanej i częściowej dysgenezji narządy płciowe wewnętrzne i zewnętrzne mogą być różnie ukształtowane w zależności od aktywności hormonalnej jądra. W takich przypadkach trudno jest przewidzieć płeć psychiczną w okresie niemowlęcym. Dzieci z zaburzeniami różnicowania płciowego, zwłaszcza z chromosomem Y w kariotypie, stanowią grupę wysokiego ryzyka rozwoju raka gonady. Stwierdzono, że w 50-100% przypadków u osób tych powstaną raki zarodkowe wywodzące się z pierwotnych płodowych komórek płciowych tzw. gonocytów, które przetrwały do okresu dojrzałości płciowej [14, 15]. Wysokie ryzyko rozwoju choroby nowotworowej jest wskazaniem do wczesnego usuwania gonad u tych dzieci. Substytucyjne podawanie hormonów płciowych po takiej kastracji rozpoczyna się dopiero w czasie odpowiadającym prawidłowemu rozpoczęciu dojrzewania płciowego tj. około 14-ego roku życia. Leczenie substytucyjne powinno uwzględniać identyfikację płciową dziecka. IV. Czynność układu podwzgórze-przysadkagonada przy zaburzeniach płci somatycznej i psychicznej Kiedy odkryto, że istotną cechą odrębnej czynności układu hormonalnego kobiety jest zdolność wyrzutu przysadkowego LH pod wpływem estrogenów (zjawisko dodatniego sprzężenia zwrotnego), zaczęto badać to zjawisko u mężczyzn z homoseksualizmem i transseksualizmem. Przez wiele lat utrzymywała się, a obecnie nie jest całkowicie odrzucona teoria Dörnera [16], która mówi, że mężczyźni z homoseksualizmem odpowiadają wzrostem wydzielania LH po podaniu estrogenów tak jak kobiety (dodatnie sprzężenie zwrotne u mężczyzn). Istnienie tego zjawiska zanegował Gooren i współaut. [17]. Kompromisowe wyniki uzyskali Goh i współaut. [18], którzy wykazali, że wprawdzie mężczyźni z zaburzeniami identyfikacji płciowej (transseksualizm mężczyzna/kobieta) nie wykazują zjawiska dodatniego sprzężenia zwrotnego, ale pojawia się ono pod wpływem uprzedniego leczenia estrogenami. Wykazano też, że u kobiet z transseksualizmem estrogeny nie indukują wzmożonej odpowiedzi przysadki na GnRH, którą obserwuje się u kobiet wykazujących akceptację własnej płci. Upodabniało to kobiety z transseksualizmem do mężczyzn z prawidłowym zachowaniem płciowym [19]. W naszych badaniach [20-23] wykazaliśmy, że podobnie jak u mężczyzn z cięższymi formami niepełnego rozwoju prącia (spodziectwo), także u mężczyzn z transseksualizmem występuje względny nadmiar podstawowego stężenia LH, przy prawidłowych poziomach FSH we krwi. Zarówno u mężczyzn z tym zaburzeniem fenotypu zależnym od niepełnego działania androgenów jak i u mężczyzn z zaburzeniami identyfikacji płciowej w dynamicznym teście z GnRH obserwuje się wzmożoną rezerwę wydzielniczą w zakresie LH i FSH. Mężczyźni z transseksualizmem nie wykazywali zaburzeń czynności gonad. Wszyscy mieli prawidłowe parametry nasienia i prawidłowy lub podwyższony poziom testosteronu w surowicy, co wskazuje, że zmiany regulacji wydzielania gonadotropin były odosobnionym zaburzeniem związanym ze zmniejszoną wrażliwością podwzgórza na hamowanie zwrotne gonadotropin przez testosteron. Wykazaliśmy więc, że zaburzenie wrażliwości na hormony steroidowe może być przyczyną zaburzeń maskulinizacji mózgu i rozwoju transseksualizmu u mężczyzn. Zaburzenie takie opisano uprzednio w odniesieniu do interseksualizmu z męskim genotypem (46,XY), ale z zespołem niewrażliwości na androgeny (fenotypowe i psychiczne kobiety). Za tym, że zjawisko 475 MATERIAŁY ZJAZDOWE z roli żon i matek. Mąż nie jest postrzegany jako partner seksualny, a raczej jako przyjaciel i towarzysz życiowy. Większość kobiet z wrodzonym przerostem nadnerczy, u których w okresie wczesnego dzieciństwa dokonano usunięcia powiększonej łechtaczki, bez względu na to, w jakiej roli płciowej żyły po dojrzewaniu płciowym, zgłasza niezadowolenie z powodu braku odczuć seksualnych na skutek okaleczenia zewnętrznych narządów płciowych [11, 12]. Ponadto wiele dorosłych pacjentek wymaga kilkakrotnych reoperacji pochwy, którą „korygowano” w okresie niemowlęcym. Informacje na temat późnych konsekwencji korekcji „obojnaczych” narządów płciowych u dzieci z niewrażliwością na androgeny rzadko docierają do lekarzy pediatrów endokrynologów i urologów, którzy podjęli decyzję o płci dziecka po urodzeniu i obserwują go tylko do okresu dojrzewania. W 2002 roku odbyło się w Glouchster w Stanach Zjednoczonych spotkanie 40 ekspertów - lekarzy pediatrów endokrynologów, chirurgów i psychologów, którzy ustalili kosensus w sprawie postępowania z dziećmi z niedoborem 21-hydroksylazy (wrodzonym przerostem nadnerczy). Według niego w każdym przypadku powinno się usuwać powiększoną łechtaczkę i wytwarzać operacyjnie pochwę między 2 a 6 miesiącem życia. Konsensus ten wymaga na pewno rewizji przed ostatecznym opublikowaniem w czasopismach naukowych i wprowadzeniem go do praktyki. MATERIAŁY ZJAZDOWE Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE zaburzeń efektywności działania androgenów może mieć znaczenie w patogenezie transseksualizmu przemawiają dane, które wskazują, że progesteron i octan cyproteronu (antyandrogen), efektywne w hamowaniu wydzielania LH u mężczyzn, nie są w stanie hamować wydzielania LH u mężczyzn z transseksualizmem [18]. Izolowane zaburzenia wydzielania LH u mężczyzn z transseksualizmem wykazali także Aiman i Boyar [24]. Stwierdzili oni w tych przypadkach podwyższenie średniego, dobowego stężenia LH w surowicy, większą częstość pulsów wydzielniczych, wyższą amplitudę tych pulsów oraz zwiększony półokres trwania LH w surowicy. Podobnie jak w naszych pracach, Boyar i Aiman [25] nie wykazali zmian w zakresie poziomów testosteronu i estradiolu we krwi. W kolejnych badaniach wykazaliśmy, że u kobiet z transseksualizmem częściej niż u kobiet zdrowych występuje hiperandrogenizm, obniżenie poziomu estradiolu, anowulacyjne cykle jajnikowe oraz podwyższony poziom LH [22]. Zmiany takie obecne są jednak także u kobiet z zespołem wielotorbielowatych jajników bez zaburzeń identyfikacji płciowej, występującym wielokrotnie częściej niż transseksualizm u kobiet [26]. Tym niemniej związek nadmiernego wydzielania androgenów w okresie różnicowania płciowego mózgu z rozwojem transseksualizmu u kobiet został ponownie zaproponowany przez Bosinskiego i współaut. [27] 11 lat później. Badacze ci wykazali, że u kobiet z transseksualizmem znacznie częściej niż u kobiet zdrowych występował zespół policystycznych jajników oraz nieklasyczny zespół wrodzonego przerostu nadnerczy. V. Wpływ podawania steroidów płciowych w ciąży na płeć psychiczną u noworodków Istnieją dane, że u człowieka różnicowanie płciowe mózgu przypada na okres noworodkowy i wczesnego dzieciństwa i jest ono zależne od działania steroidów płciowych [16]. U noworodków ludzkich płci męskiej stwierdzono wysoki poziom testosteronu we krwi między 2 a 5 miesiącem życia [28, 29], a w ślinie już w dniu urodzenia [30]. Przypuszcza się, że wydzielany wtedy testosteron ma znaczenie fizjologiczne. Prawdopodobnie w tym okresie determinowana jest acykliczna czynność podwzgórza, a być może także rozwój struktur mózgu odpowiedzialnych za męską identyfikację płciową. Poczucie przynależności płciowej ujawnia się zwykle między drugą połową drugiego, a pierwszą połową trzeciego roku życia. Stwierdzono jednak, że u dzieci jeszcze w ciągu kilku następnych lat występują zmiany budowy tych jąder podwzgórza, które wykazują różnice międzypłciowe, a więc być może odpowiedzialnych za płeć psychiczną [31]. Wykazano, że raz wykształcone poczucie przynależności płciowej jest nieodwracalne. Nawet obustronna kastracja w okresie przeddojrzewaniowym nie zmienia kierunku rozwoju identyfikacji płciowej [32]. Steroidy płciowe o typie progestagenów są podawane kobietom w ciąży zagrożonej poronie- 476 niem. Aarskog [33] był jednym z pierwszych, którzy wykazali, że progesterono-podobne progestageny powodują demaskulinizację płodów męskich, ujawniającą się głównie w postaci spodziectwa. Natomiast w 1984 roku wykazano, że androgenopodobne progestageny mają wpływ maskulinizujący na płody żeńskie, ujawniający się przeważnie powiększeniem łechtaczki [34]. Stwierdzono, że dziewczynki, których matki otrzymywały androgeno-podobne progestageny wykazywały pewne męskie cechy w zachowaniu np. uprawiały bardziej wysiłkowe sporty, były bardziej samodzielne, mniejsze było ich zainteresowanie macierzyństwem. Natomiast dziewczynki i chłopcy poddani ekspozycji wewnątrzmacicznej na progesterono-podobne progestageny wykazywali bardziej żeńskie zachowania w porównaniu z grupą kontrolną [35, 36]. Syntetyczny estrogen diethylstilbestrol (DES) był stosowany w USA u ciężarnych kobiet z cukrzycą, dopóki nie stwierdzono w 1975 roku jego działania rakotwórczego. Dzieci tych matek były bardziej łagodne, spokojne i posłuszne niż ich rodzeństwo nie poddawane działaniu DES [36]. Ponadto stwierdzono, że prenatalna ekspozycja na DES wpływa na ukierunkowanie orientacji seksualnej. Wśród kobiet, których matki otrzymywały DES, obserwowano większą częstość występowania homo- i biseksualizmu [37]. VI. Neurony dymorficzne płciowo A) Motoneurony rdzenia kręgowego Niektóre grupy motoneuronów rdzenia kręgowego wykazują dymorfizm płciowy. Na poziomie L5-L6 występują u samców szczura dwie grupy motoneuronów, które unerwiają mięśnie prącia i okolicy kroczowej. Do pierwszej grupy zaliczono neurony unerwiające mięsień opuszkowo-jamisty i mięsień dźwigacz odbytu. Do drugiej grupy należą neurony unerwiające mięsień kulszowo-jamisty. U samic nie występuje pierwsza grupa motoneuronów, a druga zawiera znacznie mniej komórek nerwowych niż u samców [38]. Pod wpływem androgenów podawanych samicom w okresie noworodkowym pojawia się rozwój mięśni unerwianych przez obie grupy motoneuronów oraz rozwój samych motoneuronów. Wydaje się, że androgeny działają bezpośrednio na mięśnie, a rozwój motoneuronów jest wtórny [39]. Podobną zależność motoneuronów rdzenia kręgowego od hormonów znaleziono u psów i ludzi [40]. B) Neurony kontrolujące śpiew ptaków Mechanizm śpiewu samców u wróblowatych jest bardziej skomplikowany niż śpiew samic. Śpiew u tych gatunków stanowi silną grę seksualną i odgrywa krytyczną rolę w rozrodzie. Droga neuronalna śpiewu zaczyna się w kresomózgowiu a kończy w jądrze nerwowym XII nerwu czaszkowego. Neurony tej drogi są znacznie większe u samców niż u samic. Ponadto wykazują one zmiany sezonowe ściśle związane z poziomem androgenów oraz intensywnością śpiewu [41, 42]. C) Okolica przedwzrokowa u kręgowców Milowym krokiem w ustaleniu dymorfizmu płciowego mózgu były badania anatomiczne mózgu szczura. Okolica przedwzrokowa i podwzgórze regulują zarówno dokrewne jak i behawioralne składniki rozrodu tj. wydzielanie gonadotropin przez przysadkę oraz odruchy krycia (samcze) i lordozy (samicze). Morfogeneza tej okolicy jest zależna od steroidów płciowych a szczególnie dymorficzna część środkowa nazwana została dymorficznym płciowo jądrem okolicy przedwzrokowej (sexual dymorphic nucleus of the preoptic area - SDN-POA) [43]. Jest ono dwukrotnie większe u samców i mężczyzn niż u samic i kobiet [44], a jego uszkodzenie powoduje zaburzenia w zachowaniu kopulacyjnym samców. Stwierdzono ponadto, że testosteron indukuje zarówno męskie zachowania płciowe jak i wzrost jądra przedwzrokowego przyśrodkowego podwzgórza. Wymagane jest jednak tutaj przekształcenie testosteronu do estradiolu przy udziale enzymu aromatazy, który znajduje się w tej okolicy mózgu [26]. Podwzgórze i układ limbiczny, które kontrolują zachowania płciowe u kręgowców, zawierają enzymy metabolizujące androgeny do estrogenów oraz receptory dla steroidów płciowych [37, 45, 46]. W 1989 i 1990 roku Jarząb i współaut. [47-49] potwierdzili, że morfogeneza SDN-POA u samców szczura zależy od testosteronu, a także że maskulinizujący wpływ testosteronu można naśladować podawaniem leków agonistów receptora beta-2adrenergicznego. Zarówno testosteron jak i agoniści receptora beta-2-adrenergicznego odpowiadają za samcze rozmiary SDN-POA (objętość jest wielokrotnie większa u samców niż u samic). Leki beta-2adrenergiczne, podawane w okresie noworodkowym, wywołują nawet silniejszy efekt w okresie dojrzałości płciowej niż podawany w tym okresie testosteron. Autorzy nazwali to beta-2-adrenergiczną hipermaskulinizacją SDN-POA u samców. Następnie wykazali, że stymulacja beta-2-adrenergiczna w okresie noworodkowym wywołuje maskulinizację SDN-POA u samic szczura, czemu towarzyszy powstanie tonicznego, acyklicznego wydzielania LH oraz samczy typ zachowania płciowego. D) Dymorficzne płciowo struktury mózgu u człowieka Po badaniach Swaaba i Fliersa [50] dotyczących dymorfizmu płciowego SDN-POA u człowieka, Allen i współaut. [51] wyodrębnili cztery grupy komórek okolicy przedwzrokowej podwzgórza i jądra nadwzrokowego na podstawie badań mózgów 11 mężczyzn i 11 kobiet. Nazwali je jądrami śródmiąższowymi przedniego podwzgórza (interstitial nuclei of the anterior hypothalamus – INAH). INAH-3 jest ok. trzy razy większe, a INAH-2 dwa razy większe u mężczyzn niż u kobiet. Le Vay [52] wykazał, że homoseksualiści męscy mają taką samą wielkość INAH-3 jak kobiety. Za kluczowe odkrycie w dziedzinie neuronalnych, biologicznych podstaw psychoorientacji płciowej człowieka uważa się wykazanie, że jądro nadskrzy- żowaniowe (nucleus suprachiasmaticus) ma objętość 1,7-razy większą i zawiera 2,1-raza więcej komórek nerwowych u mężczyzn homoseksualnych [53]. Swaab i współaut. [31] dostarczyli także dane, że psychoorientacja płciowa u człowieka zależeć może od różnic w wielkości części centralnej jądra przedwzrokowego przyśrodkowego podwzgórza. Wykorzystali oni materiał z sekcji mózgów u homoseksualistów męskich zmarłych na AIDS i wykazali, że homoseksualiści mają objętość tej struktury podobną do kobiet tj. mniejszą niż heteroseksualni mężczyźni. Najbardziej doniosłe wyniki zostały opublikowane w roku 2000. Kruijver i współaut. [54] badali mózgi 42 osób, wśród których było m.in. 9 homoseksualistów męskich, 6 transseksualistów mężczyzna/kobieta, 1 transseksualista kobieta/mężczyzna oraz 9 heteroseksualnych mężczyzn i 10 kobiet. Autorzy badali immunohistochemicznie liczbę i wielkość neuronów wykazujących ekspresję somatostatyny w obrębie bed nucleus of the stria terminalis (BSTc). Uzyskano następujące wyniki: 1) u mężczyzn występuje 71% więcej neuronów niż u kobiet, 2) liczba neuronów u transseksualistów mężczyzna/kobieta jest taka sama jak u kobiet, 3) liczba neuronów u transseksualisty kobieta/mężczyzna jest taka sama jak u mężczyzn, 4) zmiany te nie zależą od przyjmowania hormonów lub od ich poziomów we krwi co wskazuje, że zaburzenia identyfikacji płciowej mają trwałą rozwojową podstawę neurobiologiczną, 5) nie stwierdzono ilościowych różnic w obrębie BSTc pomiędzy mężczyznami homosekualnymi a heteroseksualnymi. Podsumowanie Z przeglądu dotychczasowych danych z różnych ośrodków wynika, że u ludzi z zaburzeniami różnicowania płciowego („obojnaczymi” narządami płciowymi) żeńska identyfikacja płciowa rozwija się najczęściej przy kobiecej budowie ciała i obecności jajników lub dysgenetycznych gonad tj. przy braku czynności hormonalnej płodowych gonad. Męska identyfikacja rozwija się zaś najczęściej przy obecności jąder pomimo częściowo żeńskich narządów płciowych (np. niedobór 5-alfa-reduktazy). Przy całkowitej niewrażliwości na androgeny u osób płci genetycznej męskiej (kobieca budowa ciała przy kariotypie 46,XY) identyfikacja płciowa jest zwykle żeńska. Natomiast w przypadkach, gdzie u podłoża niepełnego uformowania narządów płciowych u mężczyzn leży częściowe zaburzenie receptora androgenowego lub steroidogenezy jąder, przewidywanie identyfikacji, roli i psychoorientacji płciowej w okresie wczesnorozwojowym jest niemożliwe. Sygnały hormonalne działające w płodowym okresie różnicowania płciowego mają ważne znaczenie nie tylko dla rozwoju narządów płciowych, ale także dla różnicowania płciowego zachowań i reakcji płciowych. Obserwacje te powinny mieć zastosowanie w postępowaniu lekarskim przy wystąpieniu obojnaczych narządów płciowych u dzieci. Przy wyborze płci nie należy kierować się naciskiem rodziców i perspektywą sprawności czynnościowej 477 MATERIAŁY ZJAZDOWE Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE narządów płciowych (przypuszczalną „sprawnością członka”), ale trzeba brać pod uwagę identyfikację płciową pacjenta. Chirurgiczna korekcja narządów płciowych nie ratuje życia ani nie poprawia zdrowia, a więc usunięcie mikropenisa lub wytworzenie pochwy przy obojnaczych narządach płciowych nie muszą odbywać się we wczesnym dzieciństwie. Można nadać płeć metrykalną (jako przypuszczalną płeć dziecka), co jest niezbędne dla dopełnienia zobowiązań prawnych. Korekcje chirurgiczne narządów płciowych powinno się wykonać (jeżeli w ogóle) w okresie przeddojrzewaniowym lub nawet po dojrzewaniu płciowym po zapoznaniu się z identyfikacją i rolą płciową, a także z udziałem tej osoby dla uświadomienia wszystkich konsekwencji pooperacyjnych. Należy odróżnić rolę wczesnej gonadektomii dla profilaktyki przeciwnowotworowej gonad od roli chirurgicznej korekcji narządów płciowych. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. MATERIAŁY ZJAZDOWE Piśmiennictwo 1. Danon M, Friedman SC. Ambiguous genitalia, micropenis, hypospadias, and cryptorchidism. In: Pediatric endocrinology (Lifshitz F, ed), Marcel Dekker, Inc., New York, 1996. 2. Ritzen M. Consensus statement on management of 21hydroksylase deficiency, March 2002. 41st Annual Meeting of the European Society for Paediatric Endocrinology, Madrid, 2002 (abstr.). 3. Money J, Schwartz M. Biosocial determinants of gender identity, differentiation and development. In: Biological Determinants of Sexual Behaviour (Hutchison JB, ed). John Wiley and Sons, New York, 1978: 765-782. 4. Diamond M. Sexual identity, monozygotic twins reared in discordant sex roles and a BBC follow-up. Arch Sex Behav 1982; 11: 181-186. 5. Phoenix CH, Goy RW, Gerall AA, Young WC. Organizing action of prenatally administered testosterone propionate on the tissues mediating behaviour in the female guinea pig. Endocrinol 1959; 65: 369-382. 6. Rebar R, Judd HL, Yen SSC, Rakoff J, Vandenberg G, Naftolin F. Characterization of the inappropriate gonadotropin secretion in polycystic ovary syndrome. J Clin Invest 1976; 57: 1320-1329. 7. Wilson JD, Lasnitzki I. Dihydrotestosteron formation in fetal tissues of rabbit and rat. Endocrinol 1971; 89: 659-668. 8. Imperato-McGinley J, Peterson RE. Male pseudohermaphroditism: the complexities of male phenotypic development. Am J Med 1976; 61: 251-272. 9. Fratianni CM, Imperato-McGinley J. The syndrome of 5 alfareductase deficiency. Endocrinologist 1994; 302-310. 10. Pinsky L, Trifiro M, Kaufman M, Beitel LK, Mhatre A, Kazemi-Esfarjani P, Sabbogian N, Lumbroso R, Alvarado L. Androgen resistance due to mutation of the androgen receptor. Clin Invest Med 1992; 15: 456-472. 11. Wilson JD. Gonadal hormones and sexual behaviour. Clinical Neuroendocrinol 1982; 2: 1-9. 12. Zucker KJ, Bradley SJ, Oliver G, Blake J, Fleming S, Hood J. Psychosexual development of women with congenital adrenal hyperplasia. Hormones and Behaviour 1996; 30: 300318. 13. Słowikowska-Hilczer J, Kula K. Kliniczne konsekwencje zaburzeń organogenezy jądra i obwodowego działania steroidów płciowych. End. Diab Chor Przem Mat 2000; 6, supl. 1: 51-56. 14. Słowikowska-Hilczer J, Szarras-Czapnik M, Kula K. Testicular pathology in 46,XY dysgenetic male pseudohermaphroditism. An approach to pathogenesis of testicular cancer. J Androl 2001; 22: 781-791. 15. Słowikowska-Hilczer J, Walczak-Jędrzejowska R, Kula K. 478 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. Immunohistochemical diagnosis of preinvasive germ cell cancer of the testis. Folia Histochem Cytobiol 2001; 39: 67-72. Dőrner G. Hormone-dependent brain development and preventive medicine. Monogr Neural Sci 1986; 12: 17-27. Gooren LJ, Rao BR, Van Kassek H, Harmsen-Louman W. Estrogen positive feedback on LH secretion in transsexuality. Psychoneuroendo 1984; 9: 249-259. Goh HH, Ratnam SS, London DR. The feminization of gonadotrophin responses in intact male transsexuals. Endocrinology 1984; 20: 591-596. Seyler LE, Canalis E, Spare S, Reichlin S. Abnormal gonadotropin secretory responses to LHRH in transsexual women after diethylstilbestrol priming. J Clin Endocrinol Metab 1978; 47: 176-183. Kula K. Changes in gonadotropin regulation in both behavioural and phenotypic disturbances of sexual differentiation in men. Psychoneuroendocrinol 1986; 11: 6167. Kula K, Pawlikowski M. Gonadotropins and gonadal function in transsexualism and hypospadias. W: Systemic hormones, neurotransmitters and brain development (Dőrner G, Martini L, ed). Karger, Basel, 1986: 69-74. Kula K, Dulko S, Pawlikowski M, Imieliński K, Słowikowska J. A nonspecific disturbances of gonadostat in women with transsexualism and isolated hypergonadotropism in male-tofemale disturbances of gender identity. Clin Exp Endocrinol 1986; 1, 87: 8-14. Kula K, Słowikowska J. Podwyższona gotowość wydzielnicza estradiolu u mężczyzn z transseksualizmem. Endokrynol Pol 1987; 38: 82. Aiman J, Boyar RH. Testicular function in transsexual men. Arch Sex Behav 1982; 11: 171-179. Boyar RM, Aiman J. The 24-hour secretory pattern of LH and the response to LHRH in transsexual men. Arch Sex Behav 1982; 11: 157-169. Roselli CE, Klosterman SA, Fasasi TA. Sex differences in androgen responsiveness in the rat brain: regional differences in the induction of aromatase activity. Neuroendocrinol 1996; 64: 139-145. Bosinski HAG, Peter M, Bonatz G, Arndt R, Haidenreich M, Sippel WG, Wille R. A higher rate of hyperandrogenic disorders in female-to-male transsexuals. Psychoneuroendocrinol 1997; 22: 361-380. Forest M, Cathiard AM. Patterns of plasma testosterone and 4-androstendione in normal newborns: evidence for testicular activity at birth. J Clin Endocrinol Metab 1975; 41: 977-980. Hawkins JR. Sex determination. Hum Mol Gen 1994; 14631467. Huhtaniemi I, Dunkel L, Perheentupa J. Transient increase in postnatal testicular activity is not revealed by longitudinal measurements of salivary testosterone. Pediatric Res 1986; 12: 1324-1332. Swaab DF, Gooren LJG, Hofman MA. The human hypothalamus in relation to gender and sexual orientation. In: Progress in brain research (Swaab DF, Hofman MA, Mirmiran M, Ravid R, Van Leeuven FW, ed). Elsevier, Amsterdam, 1992: 205-215. All-Issa J. Gender, hormones and psychopathology. In: Gender and Psychobiology, Academic Press Inc, New York, 1982: 279-285. Aarskog D. Clinical and cytogenetic studies in hypospadias. Acta Paed Scand 1970; 203: 116-120. Meyer-Bahlburg HFL. Psychoneuroendocrine research on sexual orientation. Current status and future options. Prog Brain Res 1984; 61: 375-398. Ehrhardt AA, Meyer-Balburgh FL. Effects of prenatal sex hormones on gender related behaviour. Science 1981; 211: 1312-1318. Reinisch JM. Prenatal exposure of human foetuses to synthetic progestin and oestrogen affects personality. Nature 1977; 266: 561-562. Pfaff DW. Estrogens and brain function. Springer Verlag, New York, 1980. Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) 38. Jordan CL, Breedlove SM, Arnold AP. Sexual dimorphism and the influence of neonatal androgen in the dorsolateral motor nucleus of the rat lumbar spinal cord. Brain Res Rev 1982; 18: 51-72. 39. Breedlove SM, Arnold AP. Hormonal control of developing neuromuscular system. II. Sensitive period for the androgeninduced masculinization of the rat spinal nucleus of the bulbocavernosus. J Neurosci 1983; 3: 417-423. 40. Forger NG, Breedlove SM. Sexual dimorphism in human and canine spinal cord: role of early androgen. Procl Natl Acad Sci USA 1986; 83: 7527-7534. 41. Nottebohm F, Stokes TM, Leonard CM. Central control of song in the canary, Serinus canarius. J Comp Neurol 1976; 165: 457-463. 42. Nottebohm F. Testosterone triggers growth of brain vocal control nuclei in adult canaries. Brain Res 1980; 189: 429-440. 43. Panzica GC, Aste N, Viglietti-Panzica C, Ottinger MA. Structural sex differences in the brain: Influence of gonadal steroids and behavioral correlates. J Endocrinol Invest 1995; 18: 232-252. 44. Gorski RA, Harlan RE, Jacobson CD, Shryne JE, Southam AM. Evidence for the existence of a sexually dimorphic nucleus in the preoptic area of the rat. J Comp Neurol 1980; 193: 529-239. 45. Morrell JI, Pfaff DW. A neuroendocrine approach to brain function: Localization of sex steroid concentrating cells in vertebrate brains. Amer Zool 1978; 18: 447-457. 46. Pfaff DW, Zigmond RE. Neonatal androgen effects on sexual and non-sexual behaviour of adult rats tested under various hormone regimes. Neuroendocrinol 1971; 7: 129-133. 47. Jarząb B, Gubala E, Achtelik W, Lindner G, Pogorzelska E, Dőhler KD. Exp Clin Endocrinol 1989; 94: 61-67. 48. Jarząb B, Kamiński M, Gubala E, Achtelik W, Wagiel J, Dőhler KD. Postnatal treatment of rats with beta2-adrenergic agonist salbutamol influences the volume of the sexually dimorphic nucleus in the preoptic area. Brain Research 1990; 516: 257-262. 49. Jarząb B, Kokocińska D, Kamiński M, Gubala E, Achtelik W, Wagiel J, Dőhler KD. Influence of neurotransmitters of the brain: relationship between the volume of the SDN-POA and functional characteristics. Comparat Physiol 1990; 8: 41-50. 50. Swaab DF, Fliers E, Partiman TS. The suprachiasmatic nucleus of the human brain in relation to sex, age and senile dementia. Brain Res 1985; 342: 37-44. 51. Allen LS, Hines M, Shryne JE, Gorski RA. Two sexually dimorphic cell groups in the human brain. J Neurosci 1989; 9: 497-506. 52. Le Vay S. A difference in hypothalamic structure between heterosexual and homosexual men. Science 1991; 253: 10341037. 53. Swaab DF, Hofman MA. Sexual differentiation of the human brain: A historical perspective. Progress in Brain Research 1990; 61: 361-373. 54. Kruijver FP, Jiang-Ning Z, Pool CHW, Hofman MA, Gooren LJG, Swaab DF. Male-to-female transsexuals have female neuron numbers in a limbic nucleus. J Clin Endocrinol Metab 2000; 5: 2034-2041. Genetic factors in cases of the sexual organs birth defects Department of Genetics, Polish Mother’s Memorial Hospital-Research Institute, Łódź Abstract: Development of reproductive system and its function depends upon activity of over 150 genes. The first step, gonadal determination, is connected with the action of WT1, SF1, SRY, SOX9, DAX1. Other genes may also be involved in this process, i.e. DMRT1, DMRT2, DHCR7, ATRX, MID1, MID2, XH2 and others. Their possible role in testes hypoplasia and agonadism (as for example DMRT genes) or other congenital defects of sexual organs is presented. Sexual differentiation is the next step of reproductive system development under genetic control. The significance of several genes in the etiopathogenesis of the sexual organs congenital defects is discussed. These are the following genes: androgen resistance gene (AR gene), anti-Müllerian hormone gene and its receptor (AMH i AMH-RII), 5-alfa-reductase gene (SRD5A2), 17-beta-hydroxysteroid oxidoreductase gene (HSD17B3), KAL1 gene in Kallmann syndrome, the genes connected with several forms of adrenal hyperplasia and their different expression leading to sexual organs congenital defects (CYP genes family), genes controlling female sexual organs development from Müllerian ducts (HMCS, HOXA13). Essential groups of genetic syndromes connected with abnormal sex differentiation are presented. Detailed physical examination, as well as hormonal tests and DNA analysis, is important for the correct clinical diagnosis, prognosis of the early and late effects of the disease, therapeutic indications and genetic counseling in such cases. Key words: Sex determination, Sex differentiation, Sexual organs congenital defects, Gonadal dysgenesis, Sex reversal Lucjusz Jakubowski Uwarunkowania genetyczne wad rozwojowych narządów płciowych Zakład Genetyki, Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki, Łódź Streszczenie: Rozwój układu płciowego i jego czynność zależy od sprawnej interakcji ponad 150 genów. Pierwszym etapem jest determinacja gonady, z udziałem genów WT1, SF1, SRY, SOX9, DAX1. Również inne geny mogą być zaangażowane w ten proces tj. DMRT1, DMRT2, DHCR7, ATRX, MID1, MID2, XH2 i inne. Zwrócono uwagę na ich prawdopodobną rolę w niektórych przypadkach niedorozwoju jąder, agonadyzmu (geny DMRT) lub innych wad narządów płciowych. Różnicowanie cech płciowych jest następnym etapem znajdującym się pod kontrolą genetyczną. Omówiono znaczenie w etiopatogenezie szeregu wad 479 MATERIAŁY ZJAZDOWE Lucjusz Jakubowski Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE oraz zespołów chorobowych wiążących się z wadami narządów płciowych genów: wrażliwości na androgeny (gen AR), czynnika litycznego dla kanałów Müllera i jego receptora (AMH i AMH-RII), aktywności 5alfa-reduktazy (SRD5A2), 17-beta-oksydoreduktazy hydroksysteroidowej (HSD17B3), genu KAL1 w zespole Kallmanna, genów odpowiedzialnych za szereg form przerostu kory nadnerczy z różną ekspresją kliniczną w zakresie narządów płciowych (geny z rodziny CYP), genów biorących udział w rozwoju żeńskich narządów płciowych z kanałów Müllera (HMCS, HOXA13). Przedstawiono zasadnicze grupy zespołów chorobowych w których rozpoznaje się wady rozwojowe narządów płciowych. Dokładne badanie przedmiotowe, drobiazgowe badania hormonalne oraz analiza DNA w takich przypadkach ma znaczenie dla postawienia prawidłowego rozpoznania klinicznego, prognozowania skutków choroby, zaleceń terapeutycznych oraz poradnictwa genetycznego. Wstęp Typ gonady wyznacza kierunek różnicowania się wewnętrznych i zewnętrznych narządów płciowych (różnicowanie cech płciowych – sex differentiation), zależnie od profilu jej aktywności hormonalnej. W badaniach eksperymentalnych u zwierząt możliwe jest zahamowanie lub nawet odwrócenie kierunku determinacji gonady i/lub rozwoju narządów płciowych, zarówno z wykorzystaniem manipulacji genetycznych (np. poprzez uzyskiwanie odpowiednich konstruktów genowych), jak i stosowaniem czynników pozagenetycznych, w tym także hormonalnych. Również we wczesnych etapach rozwoju embrionalnego u człowieka istnieją bipotencjalne możliwości rozwoju gonady i układu płciowego. Zależnie od kariotypu, typu gonady i konsekwencji fenotypowych podejmowanej przez nią czynności hormonalnej, wyróżnia się dla celów praktycznych pojęcia płci chromosomowej (chromatynowej), gonadalnej, hormonalnej, fenotypowej i metrykalnej. W przypadkach zaburzeń determinacji gonady oraz wad rozwojowych narządów płciowych granice tego podziału mogą być nieostre. Przypomina on jednak o niezbędnych kierunkach diagnostycznych w postępowaniu różnicującym. Powinno ono prowadzić do postawienia rzeczywistego rozpoznania klinicznego, z uniknięciem pojęć będących jedynie objawem. Przykładem może być pseudoobojnactwo (obojnactwo rzekome; pseudohermafrodytyzm) typu żeńskiego (kariotyp 46,XX) lub męskiego (kariotyp 46,XY), stanowiące jedynie zespół objawów mogących mieć podobny charakter w wybranych przypadkach (typach) zespołu niewrażliwości na androgeny, wrodzonego przerostu kory nadnerczy, aberracji chromosomowych, mieszanej dysgenezji gonad i innych. Nie dość, że rozpoznanie takie może prowadzić do zaniechania właściwych kroków diagnostycznych, terapeutycznych lub braku porady genetycznej, to ma dodatkowo charakter pejoratywny. Podobnie jest w przypadkach niezgodności płci fenotypowej z chromosomową i/lub gonadalną. Stwierdzenie, że pacjentka z czystą dysgenezją gonad (część przypadków) lub zespołem niewrażliwości na androgeny ma męski kariotyp (46,XY), może przyczynić się do powstania u niej poważnych problemów natury psychologicznej, niezależnie od różniących się skutków fenotypowych w obu wymienionych zespołach chorobowych. MATERIAŁY ZJAZDOWE Znaczenie determinacji gonady i rozwoju narządów płciowych. Rozwój cech płciowych, pozwalających na rozmnażanie się, jest niezbędnym warunkiem utrzymania ciągłości gatunku. Ma umożliwić posiadanie zdrowego potomstwa, zdolnego do dalszego rozrodu. Te proste stwierdzenia dotyczą także gatunku Homo sapiens. Naturalne mechanizmy kontroli rozrodu zapewniają przekazanie cech genetycznych specyficznych dla gatunku, z zapewnieniem jednak zmienności osobniczej w jego obrębie, gwarantującej możliwość przystosowań do warunków zmieniającego się środowiska, co jest jednym z zasadniczych warunków ewolucji. Mechanizmy te prowadzą również do stworzenia barier zapobiegających kumulowaniu się w obrębie gatunku cech niekorzystnych z punktu widzenia genetycznego. Szeroko pojęte techniki zapłodnienia pozaustrojowego prowadzą niejednokrotnie do ominięcia tych barier co może mieć daleko idące znaczenie biologiczne, niezależnie od problemów etyczno-moralnych wiążących się z tym zagadnieniem. Zapłodnienie in vitro stawia także nowe wyzwania w ramach diagnostyki genetycznej pojedynczych komórek płciowych lub badań preimplantacyjnych blastomerów uzyskanych z zarodka. Kształtowanie się układu płciowego przebiega wieloetapowo, z zaangażowaniem szeregu genów zlokalizowanych zarówno w chromosomach płciowych jak i chromosomach autosomalnych. Można zaryzykować stwierdzenie, że narządy płciowe są „składane” w procesie embriogenezy jak z „puzzli” odpowiadających elementom różnego pochodzenia tkankowego, przy zaangażowaniu szeregu genów (Ryc. 1). Znajduje to odzwierciedlenie także w różnorodności klinicznej zespołów lub stanów chorobowych wiążących się z nieprawidłową determinacją gonad, wadami narządów płciowych, niepłodnością, niepowodzeniami o charakterze położniczym, zaburzeniami hormonalnymi itp. Pierwszym etapem jest proces determinacji gonady (determinacja płci – sex determination). Dla jego przebiegu kluczowe znaczenie ma skład chromosomów płciowych w kariotypie. Współudział w tym procesie mają jdnak także geny autosomalne. 480 Słowa kluczowe: Determinacja płci, różnicowanie cech płciowych, wady rozwojowe narządów płciowych, dysgenezja gonad, odwrócenie płci, L. Jakubowski Zakład Genetyki I CZMP ul. Rzgowska 281/289 93-338 Łódź tel.: 0-42/271-11-83; e-mail: [email protected] Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) 2. Proces determinacji gonady Pierwotna gonada powstaje u płodu w wyniku zasiedlenia listewki płciowej przez komórki prapłciowe co ma miejsce w 6 - 7 tygodniu ciąży. Może ona różnicować się zarówno w kierunku jądra jak i jajnika. Naturalną tego konsekwencją wydaje się być istnienie we wczesnym okresie życia płodowego zawiązków wewnętrznych narządów płciowych zarówno żeńskich (kanały Müllera) jak i męskich (ciała i przewody Wolffa). Fakt ten ma praktyczne znaczenie w symptomatologii niektórych zespołów wrodzonych wad narządów płciowych z możliwością współistnienia u pacjenta struktur anatomicznych wywodzących się z obu typów tych zawiązków. Uważa się, że powstanie listewki płciowej i migracja komórek prapłciowych jest niezależna od genów znajdujących się obrębie chromosomów płciowych X i Y. Udział w tym procesie mają natomiast geny WT1 (Wilms Tumour gene 1; MIM 607102) [1] i SF1 (Steroidogenic Factor 1 lub AD4BP ADrenal 4 Binding Protein; MIM 184757), zlokalizowane odpowiednio w chromosomach 11 i 9 (Tabela I, Ryc. 1). U myszy stwierdzono, że brak choćby jednego z nich jest równoznaczny z brakiem gonad, co określa ich pierwszorzędną rolę w gonadogenezie. Poza listewką płciową we wczesnej embriogenezie gen WT1 podlega ekspresji przede wszystkim w nerkach i gonadach (w komórkach Sertoliego w jądrze lub komórkach ziarnistych jajnika). Jego mutacje lub delecje mają znaczenie kliniczne w przypadkach guzów Wilmsa oraz zespołów WAGR, Denys-Drasha i Frasiera, a także w regulacji ekspresji czynnika litycznego dla kanałów Müllera (AMH - Anti Müllerian Hormone). Ekspresja SF1 odgrywa kluczową rolę w tkankach, w których ma miejsce steroidogeneza – korze nadnerczy, komórkach Leydiga w jądrze, komórkach osłonki i warstwy ziarnistej pęcherzyków jajnika oraz w ciałku żółtym. Podobnie jak WT1 także SF1 odgrywa rolę w regulacji ekspresji genu AMH, co zostanie omówione niżej. 2.1. Znaczenie chromosomów płciowych w procesie determinacji gonady Prawidłowy kariotyp człowieka ustalono w roku 1956. Stwierdzenie dimorfizmu chromosomów płciowych – XX u kobiety (kariotyp 46,XX) oraz XY u mężczyzny (kariotyp 46,XY), a w trzy lata później opisanie pierwszych aneuploidii 45,X i 47,XXY w przypadkach zespołów Turnera i Klinefeltera pozwalało sugerować, że w procesie rozwoju gonady istotny jest skład chromosomów płciowych. Stwierdzonym aberracjom chromosomowym towarzyszył nieprawidłowy rozwój gonad. Dalsze badania wykazały, że kluczową rolę odgrywa chromosomu Y. Jego obecność w kariotypie wiąże się w warunkach prawidłowych z różnicowaniem się jądra (poniżej zostaną omówione odstępstwa od tej reguły). Dzieje się tak nawet w przypadkach towarzyszącej polisomii chromosomu X (przykładowe kariotypy 47,XXY, 48,XXXY, 49,XXXXY), choć prowadzi ona do dysgenezji różnicującej się gonady męskiej. Tego typu obserwacje pozwalały na założenie, że w chromosomie Y zlokalizowany jest hipotetyczny czynnik warunkujący różnicowanie się jądra (TDF Testis Determining Factor). Analiza mapy delecyjnej w przypadkach aberracji strukturalnych chromosomu Y wiązała się z wielokrotnymi zmianami lokalizacji TDF. Ostatecznie stwierdzono, że warunki stawiane TDF spełnia gen SRY (Sex Determining Region Y) zlokalizowany w obrębie ramion krótkich chromosomu Y (Yp) na granicy regionu pseudoautosomalnego (PARY) i Y-specyficznej euchromatyny Yp [2] (Ryc. 2). Gen SRY koduje białko o charakterze czynnika transkrypcyjnego, zawierającego wysoce konserwatywny region odpowiadający 79 aminokwasom, określający znaczną predyspozycję do łączenia się z homologicznym motywem DNA (HMG-box: High mobility group). Kompleks taki może swoiście aktywować lub hamować funkcje innych genów, w ramach wzajemnych interakcji. Gonada pierwotna samoistnie różnicuje się w kierunku jajnika gdy w kariotypie nie ma chromosomu Y. Nie są do tego także niezbędne dwa chromosomy X. Dzieje się tak bowiem również u płodów z kariotypem 45,X. Oba prawidłowe co do struktury chromosomy X są jednak niezbędne do utrzymania prawidłowych cech morfologicznych jajnika i tym samym jego sprawności funkcjonalnej w późniejszym okresie życia prenatalnego jak i w życiu postnatalnym. Aberracje strukturalne jednego z dwóch chromosomów X powodują zróżnicowane skutki kliniczne zależnie od punktów uszkodzeń (złamań) charakteryzujących analizowaną aberrację. Szereg z nich wiąże się z dysgenezją gonad. Należy jednak podkreślić, że szereg aberracji strukturalnych chromosomów X współistnieje w kariotypach mozaikowych z linią 45,X. Są to niekiedy mozaikowości „ukryte” (ang: hidden mosaicism), o charakterze międzytkankowym. Utrudnia to poszukiwanie korelacji genotypowo-fenotypowych, gdyż cechy kliniczne, w tym także dysgenezja gonad zależeć może wówczas w pierwszym rzędzie od aneuploidii, a nie 481 MATERIAŁY ZJAZDOWE Odrębnym zagadnieniem jest uzyskanie przez układ płciowy sprawności czynnościowej. Szacuje się, że na rozwój układu płciowego i jego prawidłowe funkcjonowanie ma bezpośredni wpływ ponad 150 różnych genów współdziałających, konkurujących ze sobą, wchodzących w różnego typu interakcje. Do najistotniejszych należą geny zaangażowane w proces gametogenezy, geny znaczące dla powstania odpowiednich osi hormonalnych – decydujące zarówno o wydzielaniu odpowiednich czynników hormonalnych lub wzrostowych jak i powstaniu receptorów specyficznych dla tych czynników, geny mające znaczenie dla rozwoju jaja płodowego i dalszego przebiegu ciąży, geny odpowiedzialne za prawidłową budowę anatomiczną dróg rodnych itp. W postępowaniu różnicującym przyczyny zaburzeń rozwoju i czynności układu płciowego konieczna jest staranna ocena kliniczna oraz skrupulatne badania hormonalne, cytogenetyczne, molekularne, diagnostyka obrazowa dróg rodnych i szereg innych. Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE MATERIAŁY ZJAZDOWE od typu stwierdzonej aberracji struktury chromosomu X w innej linii komórkowej. O skutkach klinicznych mogą decydować także ujęte procentowo wzajemne proporcje rozpoznanych linii komórkowych. Przypadki czystej dysgenezji gonad u kobiet z kariotypem 46,XX (w tym także występujące rodzinnie) dowodzą z kolei, że niezależnie od genów zlokalizowanych w chromosomach X istnieje grupa genów autosomalnych mających znaczenie dla utrzymania prawidłowej struktury morfologicznej jajnika. Wśród nich wymienia się między innymi geny dla gonadotropin FSH i LH oraz ich receptorów [3]. W wielu przypadkach zaburzeń determinacji gonady oraz nieprawidłowego rozwoju narządów płciowych, mimo stwierdzonych aberracji liczbowych i strukturalnych chromosomów płciowych X i Y, nie stwierdza się bezpośrednich korelacji między fenotypem, a rozpoznaniem cytogenetycznym. Szczególne znaczenie ma wówczas wykluczenie wspomnianych już wyżej ukrytych mozaikowości w odniesieniu do chromosomu Y [4]. W przypadkach dysgenezji lub mieszanej dysgenezji gonad, w tym także u dziewcząt z zespołem Turnera, obecność chromosomu Y lub jego fragmentów (zidentyfikowanych cytogenetycznie lub molekularnie), powoduje ryzyko wystąpienia zmian nowotworowych wywodzących się z gonad i jest wskazaniem do profilaktycznej, obustronnej gonadektomii. 2.2. Determinacja gonady w świetle współzależności między szeregiem genów zaangażowanych w ten proces. Białko SRY należy do dużej rodziny spokrewnionych białek określanych jako SOX (SRY-box related). Prawdopodobnie różne białka z grupy SOX i tym samym odpowiadające im geny, mogą spełniać funkcje przypisywane wcześniej genowi SRY. W różnicującym się jądrze gen SRY współdziała z genem SOX9 (SRY-like HMG box containing gene 9). Gen SOX9 jest zlokalizowany w chromosomie 17. W badaniach doświadczalnych obserwuje się mniej więcej równoczesną ekspresję Sry i Sox9 w komórkach prekursorowych dla komórek Sertoliego. Zakłada się, że gen SOX9 może mieć udział w aktywacji genu SRY, który zwrotnie wzmacnia ekspresję genu SOX9 [5]. Odpowiedni poziom ekspresji SOX9 w komórkach Sertoliego ma w dalszym etapie istotne znaczenie w procesie aktywacji genu odpowiedzialnego za wydzielanie przez te komórki AMH (Anti Müllerian Hormone). Zagadnienie to jest szerzej omówione w części 3.1.4. Wśród genów wpływających na przebieg determinacji pierwotnej gonady wymienia się także gen DAX1 [Dosage sensitive sex reversal - Adrenal hypoplasia congenita (AHC) critical region on the X, gene 1] lokalizowany w ramionach krótkich chromosomu X (Xp21-22), w obrębie DSS [Dosage Sensitive Sex Reversal] [6]. Podobnie jak w przypadku SOX9 jednym z miejsc ekspresji genu DAX1 są komórki prekursorowe dla komórek Sertoliego. Istnieją dowody na to, że ekspresja SRY i DAX1 ma miejsce nie tylko w tych 482 samych komórkach lecz także w przybliżeniu w tym samym czasie. W doświadczeniach u myszy udowodniono, że konstrukt złożony z sekwencji kodującej genu Sry i promotora genu Dax1 indukuje różnicowanie się pierwotnej gonady w kierunku jądra. Nie można zatem wykluczyć antagonistycznego działania obu genów w miejscu ich ekspresji. Na modelach doświadczalnych wykazano, że znaczenie mogą mieć subtelne wzajemne różnice tej ekspresji w godzinowych (!) przedziałach embriogenezy [7]. Uważa się, że DAX-1, którego ekspresję stwierdzono także w korze nadnerczy, w jajniku, czy też w komórkach Leydiga, pośredniczy w regulacji transkrypcji szeregu genów hydroksylaz steroidowych. Szczególne znaczenie ma to w odniesieniu do czynnika SF-1 [8], mającego także istotny wpływ także na różne etapy różnicowania pierwotnej gonady i rozwoju narządów płciowych. Niezależnie jednak od tego czy współzależności między DAX-1 i SRY są bezpośrednie czy pośrednie, istnieje zgodność poglądów, że duplikacje DAX1 zahamowują różnicowanie się jądra. 2.3. Przypadki niezgodności między płcią chromosomową a fenotypową (sex reversal). Do klasycznych przykładów niezgodności między składem chromosomów płciowych (płcią chromosomową), a typem gonady (płcią gonadalną) należą mężczyźni z kariotypem 46,XX (XX-mężczyźni), XX-hermafrodyci oraz kobiety z kariotypem 46,XY (XY-kobiety) i dysgenezją gonad. Do grupy tej nie należą fenotypowe kobiety z zespołem niewrażliwości na androgeny, mimo rozpoznanego u nich kariotypu 46,XY. Z chwilą zidentyfikowania genu SRY jego obecność potwierdzono u 80% XX-mężczyzn. W większości takich przypadków może być to efekt nieuprawnionego crossing-over między chromosomami X i Y w czasie spermatogenezy ojca pacjenta. Objęcie w tym procesie fragmentu wykraczającego poza region pseudoautosomalny (PARY) ramion krótkich chromosomu Y [9], może spowodować przeniesienie genu SRY na chromosom X. Zapłodnienie z udziałem plemnika zawierającego chromosom X z genem SRY zaowocuje różnicowaniem się gonady w kierunku jądra ze wszystkimi dalszymi skutkami fenotypowymi tego faktu. U części chorych rozpoznaje się translokacje większego fragmentu ramion krótkich chromosomu Y (Yp), zawierającego gen SRY, na chromosom X. Gen SRY stwierdza się w znacznie mniejszym odsetku przypadków XX-hermafrodytów. Różnice mogą zależeć od ukrytej mozaikowatości międzytkankowej z udziałem linii komórkowych SRY-pozytywnych w grupie hermafrodytów. Opisywano też rodzinne współistnienie przypadków XX-mężczyzn i XX-hermafrodytów SRY-pozytywnych. W przypadkach XX-hermafrodytyzmu SRY(+) przyczyną nieprawidłowej determinacji gonady (gonad) może być preferencyjna inaktywacja chromosomu X pochodzenia ojcowskiego [10]. Również w przypadkach translokacji Yp na chromosom X, jego inaktywacja może być przyczyną nieprawidłowego różnicowania Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) 2.4. Inne przyczyny „sex reversal”. Tommerup i wsp. [14] analizując przypadki translokacji z udziałem ramion długich chromosomu 17 zakładał, że w regionie 17q24.3-q25.1 znajduje się locus SRA1 (autosomal sex reversal locus 1) odpowiedzialny za przypadki dysplazji campomelicznej (CD) z jednoczesnym zjawiskiem sex reversal. Foster i wsp. [15] sprecyzowali te obserwacje wykazując mutacje genu SOX9 jako przyczynę CD i sex reversal. Jednakże tylko ¾ przypadków CD powiązanych z kariotypem 46,XY przebiega z jednoczesnym sex reversal. Dotychczas nie stwierdzono natomiast żadnych mutacji SOX9 w przypadkach XY-sex reversal bez CD [16]. Zwraca się uwagę, że kolejną przyczyną niezgodności cech fenotypowych z kariotypem 46,XY, mogą być duplikacje w obrębie Xp21→p22.11 mogące spowodować supresję genu SRY [6]. Przypadki XY-sex reversal opisywano także w powiązaniu z monosomiami 9p [17] [18] lub 10q [19]. Zwraca się też uwagę na zaburzenia rozwoju gonady współistniejące w zespole Denys-Drasha lub zespole Frasiera z guzem Wilmsa [20] i mutacjami odpowiedzialnego za to genu WT1 lokalizowanego w obrębie chromosomu 11 (11p13) lub jego delecjami w zespole WAGR (Wilms’ tumour, Aniridia, Genitourinary Malformations, Mental Retardation) [21] [22]. 3. Rozwój narządów płciowych Jak już wspomniano we wczesnym okresie rozwoju embrionalnego współistnieją ze sobą zawiązki wewnętrznych narządów płciowych zarówno żeńskich (kanały Müllera) jak i męskich (ciała i przewody Wolffa). Wewnętrzne narządy płciowe męskie rozwijają się z ciał i przewodów Wolffa pod wpływem testosteronu (T) wydzielanego przez różnicujące się jądro (Ryc. 1). Rozwój zewnętrznych narządów płciowych męskich odbywa się przede wszystkim pod wpływem dihydrotestosteronu (DHT), pod warunkiem sprawnej konwersji T do DHT dzięki 5-alfa-reduktazie. Niezbędna jest także obecność receptora dla obu androgenów. Gen receptora dla androgenów (AR gene) zlokalizowany jest w ramionach długich chromosomu X (Xq11-q12). Komórki Sertoliego różnicującego się jądra wydzielają czynnik lityczny dla kanałów Müllera (AMH - Anti Müllerian Hormone) dla którego gen zlokalizowany jest w chromosomie 19. Jego ekspresja jest możliwa pod warunkiem obecności także swoistego receptora AMH-RII (AMH Receptor type II gene) będącego produktem genu znajdującego się w chromosomie 12. Jądro aktywnie wpływa zatem zarówno na rozwój narządów płciowych męskich jak i zanik struktur kanałów Müllera. Różnicujący się jajnik nie wpływa bezpośrednio na kanały Müllera, które samoistnie dają początek wewnętrznym narządom płciowym żeńskim. Nie określono jednoznacznie do chwili obecnej czynnika odpowiedzialnego za ten proces. Postuluje się natomiast zaangażowanie wybranych genów w proces łączenia parzystych struktur kanałów Müllera w nieparzyste formy anatomiczne jakimi są macica i górny odcinek pochwy (gen HOXA13). Kontroli genetycznej podlega zapewne także zjawisko udrażniania dróg rodnych poprzez połączenie górnego odcinka pochwy z wyodrębniającym się z zatoki moczowo-płciowej jej odcinkiem dolnym. Przypuszcza się, że znaczenie dla tego procesu może mieć gen MKKS odpowiedzialny za wystąpienie cech zespołu McKusicka-Kaufmana, którego elementem może być przegroda poprzeczna pochwy [23]. 3.1. Wady rozwojowe narządów płciowych. Każda z wad narządów płciowych (np. wnętrostwo, spodziectwo, wady rozwojowe macicy, pochwy itp) może mieć charakter wady izolowanej, o uwarunkowaniach wieloczynnikowych. W części przypadków wada rozwojowa jest wynikiem niekorzystnych zdarzeń w czasie embriogenezy lub życia płodowego. Może to dotyczyć aplazji lub atrofii jądra w wyniku 483 MATERIAŁY ZJAZDOWE się gonady. Nie można także pominąć znaczenia duplikacji regionu Xp21→Xp22 w analizie przyczyn niektórych przypadków XX-hermafrodytyzmu, co wiąże się z disomią wspomnianego wyżej regionu DSS reprezentowanego przez gen DAX1 [11]. Pozostaje jednak grupa ok. 20% XX-mężczyzn i większości XX-hermafrodytów, w części przypadków także występujących rodzinnie, u których nie potwierdzono obecności żadnych fragmentów chromosomu Y mimo różnicowania się struktur morfologicznych jądra W świetle tych obserwacji szczególnie intrygujące jest stwierdzenie przez Huanga i wsp. [12] duplikacji genu SOX9 u fenotypowego SRY(-) chłopca, co może potwierdzać udział genów autosomalnych w etiopatogenezie tego typu przypadków. Kobiety z kariotypem 46,XY w powiązaniu z czystą dysgenezją gonad (CDG), stanowią kolejny przykład niezgodności między płcią chromosomową, gonadalną i fenotypową. Wyodrębniono wśród nich zarówno grupy pacjentek SRY(+) jak i grupy SRY(-). U niektórych spośród tych pacjentek udowodniono, że przyczyną braku SRY mogą być aberracje strukturalne z utratą ramion krótkich chromosomu Y (Yp), a także rekombinacje między Xp i Yp. Analiza sekwencji genu SRY u SRY(+) XY-kobiet pozwoliła na sporządzenie listy ponad 30 różnego typu mutacji w jego obrębie, w części przypadków rozpoznawanych także rodzinnie. Znaczenie praktyczne mają te mutacje, które uniemożliwiają lub osłabiają zdolność wiązania z DNA SRY-specyficznego białka działającego jako czynnik transkrypcyjny. Ogółem mutacje genu SRY stwierdza się jednak jedynie u 10-15% XY-kobiet, w kolejnych 10-15% pacjentek CDG jest wyrazem nieprawidłowej wymiany materiału między Xp i Yp prowadzącej do utraty genu SRY. W pozostałych 70-80% przypadkach SRY(+) CDG badania genu SRY nie wyjaśniają przyczyny zaburzeń [13]. Sugeruje się, że w etiopatogenezie CDG mogą mieć swój udział inne geny zaangażowane w proces determinacji gonady. MATERIAŁY ZJAZDOWE Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE skrętu powrózka nasiennego, także przypadków agonadyzmu w wyniku różnie uwarunkowanych incydentów naczyniowych o podłożu hematologicznym itp. Przyczyny takie pozostają często w sferze przypuszczeń. Badanie podmiotowe powinno być przeprowadzone pod kątem możliwości działania czynników teratogennych. Konieczne jest również zebranie danych niezbędnych do analizy rodowodu. W wielu przypadkach wady narządów płciowych nie rzutują na dalszy rozwój płciowy i możliwość posiadania potomstwa, choć pacjent wymaga prawidłowego nadzoru i postępowania lekarskiego. Nawet błaha z pozoru wada może być jednak jedynym zewnętrznym objawem poważnych zaburzeń układowych. Przykładem mogą być przypadki spodziectwa w zespole XX-mężczyzn, wnętrostwa w powiązaniu z różnego typu aberracjami chromosomowymi lub zespołami chorobowymi, których elementem jest hipogonadyzm itd. Wnętrostwo (i/lub spodziectwo) może wystąpić również w przypadkach niekompletnych postaci zespołu niewrażliwości na androgeny u fenotypowych chłopców (mężczyzn). W innych wariantach klinicznych ten sam zespół u fenotypowych dziewcząt (kobiet) może objawiać się różnie lokalizowanymi przepuklinami (pachwinowymi, kroczowymi, sromowymi). Wady rozwojowe narządów płciowych mogą być skutkiem nieprawidłowego różnicowania się i/lub funkcjonowania gonad (przykładowo różnego typu dysgenezje gonad, ich aplazje, niektóre przypadki hermafrodytyzmu prawdziwego itp.), ale prowadzić mogą do nich także czynniki pozagonadalne. Klasycznym tego przykładem są różnego typu defekty metabolizmu sterydów kory nadnerczy u płodów z kariotypem 46,XX, prowadzące do jej wrodzonego przerostu (WPKN – wrodzony przerost kory nadnerczy), a wtórnie do różnie manifestującej się maskulinizacji zewnętrznych narządów płciowych. Szereg innych defektów steroidogenezy może prowadzić do wad narządów płciowych ograniczonych tylko do tego układu lub będących w części przypadków elementem bardziej złożonych zespołów chorobowych. Jednym z przykładów jest zespół Smith-Lemli-Opitz z szeregiem różnego typu mutacji, delecji, duplikacji genu DHCR7 (chromosom 11; 11q13) kodującego reduktazę 7-dehydrocholesterolu, jednego z głównych prekursorów cholesterolu. Opisano szereg innych zespołów wad rozwojowych z wchodzącymi w ich skład wadami narządów płciowych. Diagnostyka molekularna może w takich przypadkach przyczyniać się nie tylko do poznania etiopatogenezy tych zespołów lecz stanowić drogę do lepszego zrozumienia mechanizmów interakcji między poszczególnymi genami. 3.1.1. Hipogonadyzm hipogonadotropowy. Pierwotne uszkodzenie gonady związane z jej niedoczynnością hormonalną, przy sprawnym układzie wydalania gonadotropin, odpowiada z reguły cechom hipogonadyzmu hipergonadotropowego. Drugi biegun problemów klinicznych związanych z cechami niedojrzałości płciowej stanowi hipogona- 484 dyzm hipogonadotropowy (HH). Rozpoznawany jest u chorych reprezentujących szerokie spectrum objawów somatycznych i hormonalnych, zróżnicowanych także z punktu widzenia genetycznego. Podział kliniczny nie jest jednoznaczny i trwają dyskusje dotyczące jego kryteriów. Nazewnictwo obejmuje przykłady HH idiopatycznego (IHH – idiopathic hypogonadotropic hypogonadism), wrodzonego (CHH – congenital HH), nabytego (AHH - acquired HH). Omówienie etiopatogenezy HH zostanie ograniczone jedynie do zespołu Kallmanna (KMS) oraz mutacji genu receptora GnRH (GNRHR). Zespół Kallmanna wiąże się z HH oraz anosmią. Jest to niejednorodna grupa przypadków. Z klinicznego punktu widzenia nie jest jednoznaczne nawet to, czy anosmia jest cechą niezbędną do rozpoznania KMS, czy też nie (MIM 308700). Mutacje genu KAL1 zlokalizowanego w chromosomie X (Xp22.3) mogą wiązać się w zakresie układu moczowo-płciowego z jednostronną aplazją nerek, niedorozwojem prącia, wnętrostwem, atrofią jąder, niezależnie od innych wad rozwojowych i cech dysmorficznych. Delecje w obrębie Xp mogą wiązać się z kombinacją cech zależnych od genów przyległych obejmując zespół rybiej łuski, KMS, niedobór sulfatazy steroidowej oraz chondrodysplazję punktową. Na podstawie analizy przypadków rodzinnych nie można wykluczyć innych uwarunkowań genetycznych KMS przy dziedziczeniu autosomalnym dominującym lub recesywnym (KAL2; KAL3). Nie zidentyfikowano jednoznacznie genów mogących odpowiadać za tego typu zdarzenia. Przypadkom KAL3 mogą towarzyszyć dodatkowo m. in. rozszczepy warg lub podniebienia. Przypadki IHH z prawidłowym węchem powinny być analizowane pod kątem mutacji genu GNRHR zlokalizowanego w chromosomie 4 (4q21.2). Beranova i wsp. [24] stwierdzają, że zakres cech fenotypowych u chorych z rozpoznanymi mutacjami tego genu jest bardzo szeroki oraz że częstość tych mutacji w IHH, szczególnie w przypadkach występujących rodzinnie. Może być znacznie wyższa niż dotąd przypuszczano. 3.1.2. Zespół niewrażliwości na androgeny. Poznano kilkaset mutacji i innych defektów strukturalnych genu receptora dla androgenów (AR) związanych z różniącymi się klinicznie postaciami zespołu niewrażliwości na te hormony. W postaci kompletnej (CAIS - Complete Androgen Insensitivity Syndrome) u fenotypowych kobiet z kariotypem 46,XY różnicuje się jądro. Defekt lub brak receptora androgenowego nie pozwala jednak na rozwój narządów płciowych męskich. Jednocześnie wydzielanie AMH przez komórki Sertoliego przyczynia się do lizy kanałów Müllera i braku jajowodów, macicy oraz górnego odcinka pochwy. Z punktu widzenia etiopatogenezy zaburzeń niewłaściwe jest używanie w stosunku do nich pojęcia zespołu feminizujących jąder. W starszej nomenklaturze używane jest niekiedy miano zespołu Morrisa. Quigley i wsp. [25] proponują dość praktyczny podział zespołu niewrażliwości na androgeny na 7 stopni (typów). Typy 1-3 to zespoły niepełnej wrażli- wości z męskim fenotypem: Typ 1 - prawidłowy rozwój narządów płciowych, ze słabo wyrażonymi cechami dojrzewania płciowego (do tej grupy zalicza się też zespół Kennedy’ego); Typ 2 - przypadki spodziectwa w przebiegu zespołu; Typ 3 - znaczne spodziectwo, często kroczowe, wnętrostwo, niekiedy podzielona moszna; cytowani autorzy umieszczają w tej grupie także zespół Reifensteina. Typ 4 - dotyczy pacjentów, u których trudno jest zdefiniować płeć fenotypową. Typy 5 - 6 obejmują przypadki różnie zaawansowanej maskulinizacji narządów płciowych zewnętrznych (przerost łechtaczki, hirsutyzm, zrosty warg sromowych) przy jednoczesnym rozwoju gruczołów piersiowych. Typ 7 to postać pełna zespołu niewrażliwości na androgeny u fenotypowych kobiet z brakiem owłosienia łonowego i pachowego, dobrze rozwiniętymi gruczołami piersiowymi oraz ślepo zakończonym zachyłkiem pochwowym. W części przypadków wymagane są zabiegi plastyczne mające na celu pogłębiebnie pochwy. Mogą występować także różnie lokalizowane przepukliny, zawierające u niektórych pacjentek zstępujące jądra. Diagnostyka molekularna genu AR powinna być wykonana w każdym przypadku zespołu niewrażliwości na androgeny celem odróżnienia przypadków sporadycznych od występujących rodzinnie. Umożliwia to identyfikację lub wykluczenie nosicielstwa mutacji genu i udzielenie porady genetycznej zainteresowanym nią członkom rodziny. 3.1.3. Wady rozwojowe narządów płciowych będące efektem wybranych defektów steroidogenezy (Tabela II) Szczególne znaczenie w praktyce klinicznej mają wady rozwojowe stwierdzane w okresie noworodkowym lub niemowlęcym, utrudniające określenie płci fenotypowej, a tym samym metrykalnej. Celowo unikane są w tym miejscu pojęcia obojnaczych narządów płciowych lub obojnactwa rzekomego, ze względów określonych powyżej. Jeśli istnieją trudności z postawieniem rozpoznania końcowego, a różnicowanie przyczyn wad rozwojowych jest trudne, to rozpoznanie wstępne, nawet wieloczłonowe, powinno odpowiadać stwierdzonym wadom i być skonstruowane w sposób nie mający znaczenia pejoratywnego. W każdym przypadku jednym z pierwszych kroków diagnostycznych powinna być ocena kariotypu dziecka. Cechy różnie zaawansowanej maskulinizacji zewnętrznych narządów płciowych w powiązaniu z kariotypem 46,XX nasuwają przede wszystkim podejrzenie wrodzonego przerostu kory nadnerczy (WPKN). Diagnostyka poszczególnych postaci tego zespołu, z wykorzystaniem także badań molekularnych jest zagadnieniem samym w sobie, opisanym w różnych źródłach literaturowych i szeroko wykraczającym poza niniejszy wykład. Należy jedynie podkreślić, że współczesna diagnostyka szeregu defektów enzymatycznych prowadzących do WPKN, dziedziczących się w sposób autosomalny recesywny, w określonych ich typach daje możliwości udzielenia miarodajnej porady genetycznej z uwzględnieniem badań przedurodzeniowych i w efekcie z szansą przeprowadzenia u matki terapii hormonalnej, pozwalającej w określonych przypadkach na uniknięcie u płodu szeregu powikłań choroby. Do rzadkich przypadków należą mutacje syntetazy estrogenowej (aromatazy; EC 1.14.14.1) prowadzące u dziewcząt XX do maskulinizacji narządów płciowych w wyniku nadmiaru androgenów C19 nie przetwarzanych do estrogenów. Późnymi powikłaniami tego defektu może być pierwotny brak miesiączki oraz zespół policystycznych jajników. Gen CYP19 (Cytochrome P450, subfamily XIX) kodujący ten enzym zlokalizowany jest w chromosomie 15 (15q21.1). Trudnym zagadnieniem w postępowaniu klinicznym i diagnostycznym są wady rozwojowe narządów płciowych u dzieci z kariotypem niemozaikowym 46,XY. Wyżej omówiono już zespoły chorobowe z grupy „sex-reversal”, wspomniano o znaczeniu kariotypów mozaikowych w przypadkach dysgenezji lub mieszanych dysgenezji gonad (w części dotyczącej determinacji gonad), a także o niepełnej maskulinizacji w niekompletnych postaciach zespołu niewrażliwości na androgeny. Wady takie mogą być efektem niedoboru androgenów w wyniku hipoplazji komórek Leydiga spowodowanej mutacjami receptora dla LH [26]. Klinicznie, podobnie jak w zespole niewrażliwości, przy kariotypie 46,XY stwierdzić można żeński fenotyp, z brakiem jajowodów, macicy, górnego odcinka pochwy (obecność czynnika AMH wydzielanego przez komórki Sertoliego). Kolejna grupa przypadków to błędy w steroidogenezie, objawiające się brakiem rozwoju zewnętrznych narządów płciowych lub zaburzeniem tego procesu. Defektom tym towarzyszą innego rodzaju problemy kliniczne u dziewcząt i kobiet z kariotypem 46,XX. Z przerostem nadnerczy i wadami narządów płciowych u chłopców XY przebiegają niedobory dehydrogenazy 3-β-hydroksysteroidowej oraz P450SCC (20,22-desmolazy). Dehydrogenaza 3-β-hydroksysteroidowa powoduje konwersję ∆5-steroidów w ∆4-steroidy. Towarzyszący jej niedoborowi zespół utraty soli (częsta przyczyna zgonu) nie musi wystąpić w postaciach lżejszych (niepełnych) (MIM, 201810). U chłopców dodatkowo może wystąpić spodziectwo z kroczowym włącznie, a także poważniejsze wady rozwojowe zewnętrznych narządów płciowych z wnętrostwem i wadami moszny. U dziewcząt obserwuje się cechy nieznacznej wirylizacji, a w postaciach łagodniejszych dopiero po okresie dojrzewania hirsutyzm, zaburzenia miesiączkowania czy sporadycznie także wielotorbielowatość jajników. Gen HSD3B2 dla tego enzymu lokalizowany jest w chromosomie 1 (1p13.1). Niedobór enzymu P450SCC (20,22-desmolazy) powoduje lipidowy (lipoidowy) przerost nadnerczy, należący do jednych z najcięższych w tej grupie jednostek chorobowych (OMIM, 201710). Zakłócona jest konwersja cholesterolu do pregnenolonu. Tak „wczesny” w procesie steroidogenezy blok metaboliczny powoduje niedobór szeregu pośrednich form metabolicznych lub hormonów docelowych. Niezależnie od objawów ciężkiego niedoboru glikokorty- 485 MATERIAŁY ZJAZDOWE Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) MATERIAŁY ZJAZDOWE Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE koidów, u chłopców dojść może do poważnych wad rozwojowych zewnętrznych narządów płciowych lub do całkowitego ich braku (fenotyp żeński). U prawidłowo leczonych dziewcząt w okresie dojrzewania może wystąpić miesiączkowanie oraz rozwój cech płciowych, czemu towarzyszy jednak często zespół policystycznych jajników. Za część przypadków lipoidowego przerostu nadnerczy odpowiadają mutacje genu CYP11A zlokalizowanego w chromosomie 15 (15q23-q24), w innych tego nie potwierdzono. Zjawisko może mieć zasięg etniczny. W innych przypadkach podnosi się znaczenie mutacji genu STAR (steroidogenic acute regulatory protein; chromosom 8; 8p11.2) w etiopatogenezie choroby. Jednym z ważnych problemów klinicznych jest deficyt 5-α-reduktazy (MIM, 264600), biorącej udział w konwersji testosteronu (T) do dihydrotestosteronu (DHT). Różnicowanie się jądra, prawidłowe poziomy testosteronu oraz wydzielanie przez jądro AMH powoduje rozwój wewnętrznych narządów płciowych męskich przy jednoczesnym braku struktur wywodzących się z kanałów Müllera. Do cech klinicznych należy małe prącie, podzielona moszna, wspólna zatoka moczopłciowa, spodziectwo kroczowe i ślepo zakończony zachyłek pochwowy. Orientacja seksualna jest zwykle męska (opisywano wyjątki). Defekt nie wyklucza płodności choć nasienie charakteryzuje się wysoką lepkością i skrajnie niekiedy małymi objętościami w wyniku zaburzonej czynności sekrecyjnej prostaty i pęcherzyków nasiennych. Stwierdzono, że spośród genów dla dwóch izoenzymów – SRD5A1 (chromosom 5) i SRD5A2 (chromosom2; 2p23), za cechy kliniczne niedoboru 5-α-reduktazy odpowiadają defekty tego drugiego. Choroba dziedziczy się autosomalnie recesywnie. Stwierdzono przypadki jednorodzicielskiej (ojcowskiej) disomii. Na marginesie warto wspomnieć, że aktywność SRD5A1 i SRD5A2 może być wzmożona w zespole policystycznych jajników (PCOS), a obniżenie aktywności SRD5A2 analizuje się pod kątem znaczenia tego zjawiska w etiopatogenezie raka prostaty. Niedobór 5-α-reduktazy wymaga różnicowania z niedoborem oksydoreduktazy 17-β-hydroksysteroidowej (reduktaza 17-ketosteroidowa; HSD17B3) [27] (MIM, 264300). Obraz kliniczny jest podobny. Do zasadniczych różnic należy rozwój ginekomastii oraz niepłodność w przypadkach deficytu HSD17B3. Stosunek androstendionu do testosteronu jest 20-25 razy wyższy od prawidłowego. Mimo to rozwijają się struktury narządowe wywodzące się z przewodów Wolffa. Stwierdza się zwykle brak prostaty. Nie wyklucza się, że część przypadków kobiet z hirsutyzmem (prawdopodobny wzrost wydzielania przez jajnik androstendionu i jego konwersja do T), wtórnym brakiem miesiączki i PCOS, to efekt deficytu HSD17B3. Opisano szereg mutacji genu HSD17B3, dziedziczących się autosomalnie recesywnie. Nieprawidłowa aktywacja 17-α-hydroksylazy (hydroksylacja pregnenolonu i progesteronu) oraz 17,20-desmolazy (17,20-liazy; konwersja 17-α-pregnenolonu w C-19 steroidowe prekursory testosteronu i estrogenu) przez należący do grupy cytochromów 486 P450 enzym mikrosomalny P450C17, to kolejny przykład zaburzeń przebiegających z nieprawidłowym rozwojem płciowym [28] (MIM, 202110). Niezależnie od nadprodukcji 11-deoksykortykosteronu, z nadciśnieniem, hipokaliemią, zahamowaniem wydzielania reniny i aldosteronu, u chłopców dochodzi do różnego stopnia niedorozwoju zewnętrznych narządów płciowych, u dziewcząt do pierwotnego braku miesiączki i drugorzędowych cech płciowych. Opisano przypadki bez nadciśnienia i hipokaliemii. Gen CYP17 dla P450C17 zlokalizowany jest w chromosomie 10 (10q24.3). Opisano szereg jego mutacji prowadzących zarówno do łączonego niedoboru 17-α-hydroksylazy i 17,20-desmolazy, a także do izolowanego niedoboru każdego z nich. Wykazano znaczną homologię między genem CYP17 i CYP21B, odpowiadającym za niedobór 21-hydroksylazy (najczęstszy powód WPKN) co może przemawiać za ich wspólnym pochodzeniem w toku ewolucji. 3.3.1.4 Zespół przetrwałych struktur po kanałach Müllera (PMDS - Persistent Müllerian Duct Syndrome). Komórki Sertoliego różnicującego się jądra wydzielają w warunkach prawidłowych czynnnik lityczny dla kanałów Müllera (AMH - Anti Müllerian Hormone). Jego zadaniem jest doprowadzenie do zaniku zawiązków wewnętrznych narządów płciowych żeńskich w przypadkach płci gonadalnej męskiej. Gen AMH jest zlokalizowany w chromosomie 19 (19p). Warunkiem działania AMH jest obecność odpowiedniego receptora AMH-RII, dla którego gen lokalizuje się w obrębie chromosomu 12 (12q; AMH Receptor type II gene). Wykazano, że dla odpowiedniej ekspresji AMH istotne znaczenie ma synergistyczne współdziałanie SF1 oraz izoformy WT1 (-KTS) genu WT1. Antagonistycznie w stosunku do nich zachowuje się DAX1. Przypuszcza się, że DAX1 i WT1 znajdują się w opozycji w stosunku do siebie w modulacji procesów transaktywacji zależnych w różnicującym się jądrze od SF1 [29]. W ekspresji AMH odgrywa także znaczącą rolę SOX9. Białko SOX9 przypuszczalnie konkuruje z DAX-1 w miejscach wiązania z SF-1 i w ten sposób “toruje” drogę działania WT1 (-KTS) [30] [31]. Niezależnie od tej ”kaskady” zależności istotnej dla rozwoju drugorzędowych cech płciowych rozpoznano także około 30 mutacji genu AMH oraz ponad 20 mutacji genu jego receptora [32]. Efektem w większości przypadków jest brak lizy lub innymi słowy przetrwanie struktur po kanałach Müllera u osobników o płci chromosomowej i gonadalnej męskiej. Zespół ten jest dziedziczony autosomalnie recesywnie. Rozpoznaje się go u chłopców, najczęściej z obu- lub jednostronnym wnętrostwem, w sporadycznych przypadkach z jądrami położonymi ektopowo, a niekiedy także przepuklinami zawierającymi pochodne kanałów Müllera (jajowód, szczątkową macicę). Jądra wykazują dużą mobilność, gdyż w wielu przypadkach nie są przytwierdzone do wzgórka pochwowego za pomocą jądrowodu lecz również nie zawsze są połączone z najądrzem i nasieniowodem. Mimo to są trudne do sprowadzenia do moszny. Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) 3.1.5. Wady rozwojowe narządów płciowych wywodzących się z kanałów Müllera. Grupa ta obejmuje szereg zróżnicowanych klinicznie wad izolowanych lub stanowiących element innych zespołów chorobowych [23]. Do najistotniejszych należy aplazja kanałów Müllera. (MA – Müllerian Aplasia.) z brakiem trzonu i szyjki macicy oraz górnego odcinka pochwy. W nazewnictwie istnieje tendencja do wprowadzania pojęcia MA w miejsce zespołu Rokitansky-Küstner-Hauser. W MA nie stwierdzono zmian w genie HOXA13 (poniżej omówione będzie jego znaczenie w embriogenezie macicy i pochwy), ale nie wyklucza się udziału w etiopatogenezie tych nieprawidłowości innych genów z grupy HOX (HOXA10 i HOXA11) [22] [29]. MA może być również elementem innych zespołów dziedziczących się autosomalnie dominująco lub o etiologii poligenowej (np. zespół Goldenhara), autosomalnie recesywnie (np. zespół Al-Awadi), będących skutkiem aberracji chromosomowych (np. zespół Wolf-Hirschorn). Możliwy jest izolowany brak lub atrezja pojedynczych elementów dróg rodnych - górnego odcinka pochwy, szyjki macicy, trzonu macicy. Odrębne zagadnienie stanowią wady wynikające z niepełnego połączenia się kanałów Müllera (Incomplete Müllerian Fusion – IMF). IMF powinno być różnicowane z duplikacjami narządów wywodzących się z kanałów Müllera (macicy, pochwy). Podobnie jak w MA znanych jest szereg zespołów chorobowych przebiegających z IMF, dziedziczących się autosomalnie dominująco (przykładowo zespoły: Halala, Aperta, Beckwitha-Wiedemanna), recesywnie (zespoły: Bardet-Biedl, Donahoue, Frasera, Frynsa, Meckela, Rüdigera itp.), w powiązaniu z aberracjami chromosomowymi (trisomia 13, trisomia 18) lub innych o nieznanej etiologii. Szczególne miejsce w poznaniu etiopatogenezy IMF zajmuje zespół “handfoot-uterus”, ze względu na jego związek z dość częstymi mutacjami w obrębie genu HOXA13 zlokalizowanego w ramionach krótkich chromosomu 7 (7p). Innym problemem klinicznym są przegrody poprzeczne w obrębie pochwy. Wymagają one różnicowania z innymi klinicznymi przyczynami niedrożności dróg rodnych u dziewcząt. W przypadkach takich podkreśla się znaczenie badań genu MKKS, którego mutacje rozpoznawane są w zespołach McKusick-Kaufman (MKS) oraz BardetBiedl (rzadziej). Nie wyklucza się zresztą udziału tego genu w etiopatogenezie zespołu Pallister-Hall, przebiegającego m.in. z brakiem perforacji odbytu. Interesujące jest także, że zespół MKS, dziedzicząc się autosomalnie recesywnie, u chłopców może się manifestować m. in. spodziectwem żołądziowym oraz uwypuklonym szwem moszny. Powyższe przykłady nie wyczerpują oczywiście listy wad rozwojowych żeńskich narządów płciowych. 4. Podsumowanie Zróżnicowane przyczynowo zaburzenia determinacji gonady i wady rozwojowe narządów płciowych znajdują się w kręgu zainteresowań pediatrów, endokrynologów, ginekologów, chirurgów, urologów, genetyków klinicznych, a także lekarzy innych specjalności. Konieczne jest zatem wspólne zrozumienie uwarunkowań genetycznych tych zaburzeń, uwzględnienie jednolitej nomenklatury klinicznej, a w postępowaniu różnicującym przyjęcie określonych zasad diagnostycznych. W badaniach musi być uwaględniona ocena cytogenetyczna, diagnostyka hormonalna z możliwością różnicowania błędów w zakresie steroidogenezy, staranna diagnostyka obrazowa narządów rodnych. W przypadkach wad rozwojowych narządów płciowych jednym z problemów jest zgodne z oczekiwaniami rodziny dziecka szybkie ustalenie płci metrykalnej. Diagnostyka różnicująca i porada genetyczna powinna uwzględniać w takich przypadkach ewentualną przyszłą orientację seksualną pacjenta. Wiedza w tym zakresie ma w części charakter empiryczny i wymaga wymiany doświadczeń między różnymi środowiskami lekarskimi. Konieczne jest też właściwe zabezpieczenie materiału badawczego, zwłaszcza w przypadkach rzadkich zaburzeń determinacji gonady i wad narządów płciowych. Sprzyja temu przyjęcie różnego typu algorytmów postępowania lekarskiego i diagnostycznego. Jeden z przykładów podano niżej. 5. Proponowany tryb postępowania lekarskiego i diagnostycznego w przypadkach zaburzeń determinacji gonady i wad rozwojowych narządów płciowych [33]. Tok postępowania powinien uwzględniać zarówno bieżące potrzeby lekarskie i diagnostyczne jak i zabezpieczenie materiału dla celów badawczych, co jest niezwykle istotne ze względu na rzadkość występowania wielu zespołów chorobowych związanych z zaburzeniami determinacji gonady i określonymi typami wad rozwojowych narządów płciowych. 1. 2. Badanie podmiotowe (wywiad) – przeszłość położnicza matki, okresy leczonej lub nie leczonej niepłodności, ewentualne zaburzenia miesiączkowania u matki i ich leczenie, inne zaburzenia o charakterze hormonalnym, inne choroby matki (ojca); przebieg ciąży, otrzymywane leki, zwłaszcza preparaty hormonalne, inne czynniki środowiskowe; wywiad rodzinny pod kątem wystąpienia cech chorobowych u innych członków rodziny (ważne przykładowo w zespole niewrażliwości na androgeny, wrodzonym przeroście kory nadnerczy, u XX-mężczyzn lub XX-hermafrodytów itp.). Badanie przedmiotowe – w zakresie narządów płciowych staranne odnotowane wszystkich, nawet 487 MATERIAŁY ZJAZDOWE Ulegać mogą również skrętom, co wtórnie prowadzi do atrofii częstej w przypadkach PMDS. Ocenia się, że płodnych pozostaje nie więcej niż 11% mężczyzn z PMDS. Jeśli struktury po kanałach Müllera nie stanowią zawartości worka przepuklinowego to wykrywa się je najczęściej przypadkowo, w czasie zabiegów operacyjnych z innych wskazań. Część chorych w ogóle nie jest identyfikowana. Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE 3. MATERIAŁY ZJAZDOWE 4. 5. 6. 7. 488 z pozoru drobnych nieprawidłowości (u dziewcząt niedorozwój sromu, zrosty warg sromowych, skrócenie warg sromowych większych i/lub mniejszych, wspólna zatoka moczowopłciowa, brak wejścia do pochwy, niedorozwój lub powiększenie łechtaczki, przepukliny pachwinowe lub sromowe itd; u chłopców - niedorozwój prącia i/lub moszny, wszystkie typy spodziectwa, wady rozwojowe moszny, jedno- lub obustronne wnętrostwo itp. W części dotyczącej ogólnego badania somatycznego zwrócenie uwagi nieprawidłowości rozwojowe i cechy dysmorficzne, które nawet przy braku anomalii rozwojowych zewnętrznych narządów płciowych, mogą stanowić wczesny sygnał zaburzeń w procesie różnicowania gonady i cech płciowych (np. cechy zespołu Turnera przed okresem potencjalnego pokwitania). Niektóre z nich mogą być wykazane ultrasonograficznie jeszcze w czasie ciąży. Przeprowadzenie wstępnych badań cytogenetycznych – testy chromatyny X (rozmaz z nabłonka jamy ustnej) i chromatyny Y (limfocyty krwi obwodowej) w laboratoriach dysponujących zapleczem do badań cytologicznych lub wykorzystanie w laboratoriach o profilu molekularnym sekwencji specyficznych dla chromosomów płciowych pod kątem ustalenia ich składu (płeć chromosomowa). Pełne badania cytogenetyczne – badania kariotypu minimum z wykorzystaniem technik barwień prążkowych o wysokiej rozdzielczości, a w razie potrzeb także badania z użyciem hybrydyzacji „in situ” (np. FISH) w diagnostyce aberracji strukturalnych chromosomów X i Y (w tym także translokacji fragmentów submikroskopowych), dla celów oceny mozaikowości w jądrach komórek w okresie interfazy, mozaikowości międzytkankowych (limfocyty krwi obwodowej, fibroblasty skóry, fibroblasty gonad, skrawki histologiczne gonad), dla celów wykrycia części przypadków ukrytych mozaikowości; FISH w ocenie niestabilności strukturalnej chromosomu Y [34]. Równolegle do p. 3 podstawowe badania hormonalne – zależnie od potrzeb i roboczego rozpoznania wstępnego: 17 – KS i 17 – OHCS w moczu, estrogeny, testosteron, dihydrotestosteron, 17-OH-progesteron, androstendion, dehydroepiandrosteron, kortyzol, inne badania hormonalne i elektrolitowe niezbędne w diagnostyce wrodzonego przerostu kory nadnerczy, inne badania hormonalne, w tym testy dynamiczne celem różnicowania przypadków wnętrostwa od przypadków anorchii lub atrofii jąder. Inne badania hormonalne i/lub immunohistochemiczne, enzymatyczne celem wykrycia rzadkich defektów steroidogenezy; wykluczenie ewentualnych niedoborów 5-α-reduktazy; badania AMH w diagnostyce zespołu przetrwałych struktur po kanałach Müllera (PMDS - Persistent Müllerian Duct Syndrome) Równolegle do pp. 3 i 5 diagnostyka obrazowa narządów jamy brzusznej i miednicy mniejszej 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. (USG, MR, urogenitografia, ...) pod kątem lokalizacji i ewentualnej identyfikacji gonad, macicy, innych pochodnych kanałów Müllera, oceny typu wad rozwojowych narządów płciowych, umiejscowienia ujścia cewki moczowej itp. Zależnie od wskazań diagnostyczna laparotomia (laparoskopia) połączona z ewentualnymi biopsjami gonad do dalszej diagnostyki histopatologicznej. Izolacja i zabezpieczenie DNA z dostępnego materiału komórkowego (tkankowego) – krew obwodowa, hodowle fibroblastów, tkanki uzyskane śródoperacyjnie, bloczki parafinowe. Przeprowadzenie badań wybranych genów i sekwencji: a. genu SRY – dla celu oceny obecności lub braku chromosomu Y w kariotypie (jak w p. 3); w diagnostyce przypadków sex reversal; w diagnostyce ukrytych mozaikowości np. w zespole Turnera lub innych przypadkach dysgenzji gonad lub hipogonadyzmu; użycie PCR, SSCP, sekwencjonowanie. b. innych genów lub sekwencji specyficznych dla chromosomu Y – ze względów j.w. Factor) c. czynnika AZF (Azoospermia reprezentowanego m. in. przez rodzinę genów RBM i gen DAZ w obrębie ramion długich chromosomu Y (Yq) – w diagnostyce wybranych przypadków niepłodności męskiej. d. genów SOX9 i DAX1 w diagnostyce przypadków sex reversal, zwłaszcza przy prawidłowym strukturalnie genie SRY lub w przypadkach SRY (-) (konieczna współpraca z wyspecjalizowanymi ośrodkami). e. genu AR w diagnostyce zespołu niewrażliwości na androgeny, zwłaszcza pod kątem udzielenia porady genetycznej zainteresowanym członkom rodziny, z możliwością przeprowadzenia diagnostyki przedurodzeniowej (konieczna współpraca z wyspecjalizowanymi ośrodkami). f. genów cytochromu P450 oraz haplotypów HLA w diagnostyce wrodzonego przerostu kory nadnerczy, zwłaszcza pod kątem udzielenia porady genetycznej zainteresowanym członkom rodziny, z możliwością przeprowadzenia diagnostyki przedurodzeniowej (konieczna współpraca z wyspecjalizowanymi ośrodkami). Lokalizacja genów (sekwencji) wykrytych w genomowym DNA przy pomocy techniki FISH (np. potwierdzenie translokacji Xp;Yp u XXmężczyzn lub XX-hermafrodytów). Ustalenie rozpoznania klinicznego. Określenie zaleceń terapeutycznych w tym wskazań do zabiegów chirurgicznych (np. gonadektomii, plastyki narządów płciowych itp.). Wykonanie dokumentacji fotograficznej oraz odręcznego szkicu narządów i/lub struktur odsłanianych w polu operacyjnym. Właściwe zabezpieczenie materiału pobieranego śródoperacyjnie z uwzględnieniem wszelkich warunków technicznych do dalszej diagnostyki dla celów klinicznych i badawczych – tkanki umieszczone w płynie Bouina lub w 10% buforowanej formalinie nie nadają się do hodowli tkankowych; dla celów FISH do skrawków histologicznych korzystniejsze może być utrwalenie fragmentów tkankowych w szeregu alkoholowym niż w 10% formalinie; zagadnienia te muszą być uzgodnione z zespołem chirurgów przed planowanym zabiegiem operacyjnym tak aby zabezpieczone zostały interesy pacjenta lecz aby możliwe było przeprowadzenie badań o charakterze poznawczym; brak takich ustaleń powoduje bezpowrotną niekiedy utratę wartościowego materiału badawczego. 16. Ewentualna weryfikacja rozpoznania klinicznego na podstawie przeprowadzonych badań cytogenetycznych, histopatologicznych i/lub molekularnych w tkankach uzyskanych śródoperacyjnie lub drogą biopsji. 17. Opracowanie i wydanie karty informacyjnej określającej zakres wykonanych badań, ich wyniki, zalecenia dotyczące dalszej opieki nad chorym. 18. Udzielenie na podstawie wyników badań porady genetycznej zainteresowanym członkom rodziny, zależnie od typu końcowego rozpoznania klinicznego 14. 15. 16. 17. 18. 19. Piśmiennictwo 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM); http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/. Sinclair AH, Berta Ph, Palmer MS, Hawkins JR, Griffiths BL, Smith MJ, Foster JW, Frischauf A-M, Lovell-Badge R, Goodfellow PN. A gene from the human sex-determining region encodes a protein with homology to a consereved DNA-binding motif. Nature 1990; 346: 240-244. Simpson JL, Rajkovic A. Ovarian differentiation and gonadal failure. Am J Med Genet 1999; 89: 224-239. Binder G, Koch A, Wajs E, Ranke MB. Nested polymerase chain reaction study of 53 cases with Turner’s syndrome: is cytogenetically undetected Y mosaicism common? J Clin Endocrinol Metab 1995; 80: 3532-3536. O’Neill MJ, O’Neil RJW. Whatever happened to SRY? Cell Mol Life Sci 1999; 56: 883-893. Bardoni B, Zanaria E, Guioli S, Floridia G, Worley KC, Tonini G, Ferrante E, Chiumello G, McCabe ERB, Fraccaro M, Zuffardi O, Camerino G A. Dosage sensitive locus at chromosome Xp21 is involved in male to female sex reversal. Nature Genet 1994; 7: 497-501. Swain A, Narvaez V, Burgoyne P, Camerino G, LovellBadge R. Dax1 antagonizes Sry action in mammalian sex determination. Nature 1998; 391: 761-767. Lalli E, Melner MH, Stocco M., Sassone-Corsi P. DAX-1 blocks steroid production at multiple levels. Endocrinology 1998; 139: 4237-4243. Ferguson-Smith MA. X-Y chromosomal interchange in the aethiology of true hermaphroditism and of XX Klinefelter’s syndrome. Lancet 1966; II: 475-476. Boucekkine C, Nafa D, Casanova-Bettane M, Latron F, Fellous M, Benmiloud M. Evidence of a preferential inactivation of the paternally derived X chromosome in a 46,XX true hermaphrodite. Hum Genet 1985; 69: 91-93. Baumstark A, Barbi G, Djalali M, Geerkens C, Mitulla B, Mattfeldt T, Cabral-de-Almeida JC, Vargas FR, Llerena JC, Vogel W, Just W. Xp-duplications with and without sex reversal. Hum Genet 1996; 97: 79-86. Huang B, Wang S, Ning Y, Lamb AN, Bartley J. Autosomal XX sex reversal caused by duplication of SOX9. Am J Med Genet 1999; 87: 349-353. Scherer G, Held M, Erdel M, Meshede D, Horst J, Lesniewicz R, Midro AT. Three novel SRY mutations in XY gonadal dysgenesis and the enigma of XY gonadal dysgenesis cases 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. without SRY mutations. Cytogenet Cell Genet 1998; 80: 188192. Tommerup N, Schempp W, Meinecke P, Pedersen S, Bolund L, Brandt C, Goodpasture C, Guldberg P, Held KR, Reinwein H, Saugstad OD, Scherer G, Skjeldal O, Toder R, Westvik J, van der Hagen CB, Wolf U. Assignment of an autosomal sex reversal locus (SRA1) and campomelic dysplasia (CMPD1) to 17q24.3-q25.1. Nature Genet 1993; 4: 170-173. Foster J, Dominguez-Steglich MA, Guioli S, Kwok Ch, Weller PA, Stevanović M., Weissenbach J, Mansour S, Young ID, Goodfellow, Brook JD, Schafer AJ. Campomelic dysplasia and autosomal sex reversal caused by mutations in an SRYrelated gene. Nature 1994; 372: 525-530. Kwok C, Goodfellow PN, Hawkins JR. Evidence to exclude SOX9 as a candidate gene for XY sex reversal without skeletal malformation. J Med Genet 1996; 33: 800-801. Veitia R, Nunes M, Brauner R, Doco-Fenzy M, JoannyFlinois O, Jaubert F, Lortat-Jacob S, Fellous M, McElreavy K. Deletions of distal 9p associated with 46,XY male to female sex reversal: definition of the breakpoints at 9p23.3-p24.1. Genomics 1997; 41: 271-274. Flejter WL, Fergestad J, Gorski J, Varvill T, Chandrasekharappa S. A gene involved in XY sex reversal is located on chromosome 9, distal to marker D9S1779. Am J Hum Genet 1998; 63: 794-802. Wilkie AOM, Campbell FM, Daubeney P, Grant DB, Daniels RJ, Mullarkey M, Affara NA, Fitchett M, Huson SM. Complete and partial XY sex reversal associated with terminal deletion of 10q: Report of 2 cases and literature review. Am J Med Genet 1993; 46: 597-600. Barbosa AS, Hadjiathanasiou CG, Theodoridis C, Papathanasiou A, Tar A, Merksz M, Györvári B, Sultan C, Dumas R, Jaubert F, Niaudet P, Morira-Filho CA, Cotinot C, Fellous M. The same mutation affecting the splicing of WT1 gene is present on Frasier syndrome Patients with or without Wilms’ tumor. Hum Mutat 1999; 13: 146-153. Pritchard-Jones K, Fleming S, Davidson D, Bickmore W, Porteous D, Gosden Ch, Bard J, Buckler A, Pelletier J, Housman D, van Heyningen V, Hastie N. The candidate Wilm’s tumour gene is involved in genitourinary development. Nature 1990; 346: 194-197. Pelletier J, Bruening W, Li FP, Haber DA, Glaser T, Housman DE. WT1 mutations contribute to abnormal genital system development and hereditary Wilm’s tumour. Nature 1991; 353: 431-434. Simpson JL. Genetics of the female reproductive ducts. Am J Med Genet 1999; 89: 224-239. Beranova M, Oliveira LMB, Bédécarrats GY, Schipani E, Vallejo M, Ammini AC, Quintos JB, Hall JE, Martin KA, Hayes FJ, Pitteloud N, Kaiser UB, Crowley WF-Jr, Seminara SB. Prevalence, phenotypic spectrum, and modes of inheritance of gonadotropin-releasing hormone receptor mutations in idiopathic hypogonadotropic hypogonadism. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86: 1580-1588. Quigley CA, de Bellis A, Marschke KB, El-Awady MK, Wilson EM, French FS. Androgen receptor defects: historical, clinical, and molecular perspectives. Endocr Rev 1995; 16: 271-321. Kremer H, Kraaij R, Toledo SPA, Post M, Fridman JB, Hayashida CY, Reen van M, Milgrom E, Ropers HH, Mariman E, Themmen APN, Brunner HG. Male pseudohermaphroditism due to a homozygous missense mutattion of the luteinizing hormone receptor gene. Nat Genet 1995; 9: 160-164. Geissler WM, D DL, Wu L, Bradshaw KD, Patel S, Mendonca BB, Elliston KO, Wilson JD, Russell DW, Andersson S. Male pseudohermaphroditism caused by mutattions of testicular 17β-hydroxysteroid dehydrogenase 3. Nat Genet 1994; 7: 3439. Satoh M, Yokoya S, Hashiguchi R, Katsumata N. Long term follow-up of a 46,XY phenotypic girl with 17α-hydroxylase deficiency treated with alternate-day dexamethasone. Endocrine J 1998; 45: 285-290. Nachtigal MW, Hirokawa Y, Enyeart-VanHouten DL, Flanagan JN, Hammer GD, Ingraham HA. Wilms’ tumor 1 489 MATERIAŁY ZJAZDOWE Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE 30. 31. 32. 33. 34. 35. and Dax-1 modulate the orphan nuclear receptor SF-1 in sexspecific gene expression. Cell 1998; 93: 445-454. de Santa Barbara P, Bonneaud N, Boizet B, Desclozeaux M, Moniot B, Sudbeck P, Schreder G, Poulat F, Berta P. Direct interaction of SRY-related protein SOX9 and steroidogenic factor 1 regulates transcription of the human anti-Müllerian hormone gene. Mol Cell Biol 1998; 18: 6653-6665. Chan WY, Rennert OM. Molecular aspects of sex differentiation. Curr Mol Med 2002; 2: 25-37. Belville C, Josso N, Picard JY. Persistence of Müllerian derivatives in males. Am. J. Med Genet 1999; 89: 218-223. Jakubowski L. Propozycje postępowania diagnostycznego w przypadkach zaburzeń procesu determinacji gonady oraz wad rozwojowych narządów płciowych. Biuletyn Informacyjny Komisji Genetyki Człowieka Komitetu Patologii Komórkowej i Molekularnej PAN 2001, 7: 37 – 50. Jakubowski L, Jeziorowska A, Constantinou M., Kałużewski B. Molecular analysis of Y chromosome long arm structural instability in patients with gonadal dysfunction. Clin Genet 2000; 57: 291-295. Vergnaud G, Page DC, Simmler M-Ch, Brown L, Rouyer F, Noel B, Botstein D, de la Chapelle A, Weissenbach J (1986): A deletion map of the human Y chromosome based on DNA hybridization. Am J Hum Genet 38: 109-124. MATERIAŁY ZJAZDOWE Praca finansowana w części z projektu badawczego KBN nr 6 PO5E 135 21 Podziękowania: Napisanie tej pracy nie byłoby możliwe bez nabywania doświadczenia we współpracy z: M. Ignacak (Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej AM w Poznaniu; Kierownik: W. H. Trzeciak); O. Hiortem (Molekularendokrino logisches Labor, Klinik für Pädiatrie, Medizinische Universität zu Lübeck); I. Bobeff, M. Hilczerem, A. Jeziorowską, B. Pniewską, A. Sobieszczańską-Jabłońską, R. Stawerską (Klinika Endokrynologii I CZMP w Łodzi: Kierownik A. Lewiński); E. Kostyk (Poradnia Genetyczna, S. P. Dziecięcy Szpital Kliniczny, Collegium Medicum, UJ; Kierownik: J. Pietrzyk); A. Bielakiem (Klinika Medycyny Matczyno-Płodowej I CZMP; Kierownik J. Wilczyński); J. Słowikowską-Hilczer (Samodzielna Pracownia Andrologii i Endokrynologii Płodności, Instytut Endokrynologii AM w Łodzi; Kierownik: K. Kula). 490 Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) S TRESZCZEN IA 11.10.2002, piątek Sesja 1 Stężenie oraz skorygowana i specyficzna aktywność CETP w surowicy pacjentów z różnymi zaburzeniami stanu tyreometabolicznego 1 Zakład Tyreologii, Instytut Endokrynologii, Akademia Medyczna w Łodzi Laboratoire de Biochimie des Lipoprotéines, INSERM U 498, Faculté de Médecine, Dijon 3 Klinika Chirurgii Endokrynologicznej i Ogólnej, Instytut Endokrynologii, Akademia Medyczna w Łodzi 2 t Zaburzenia stanu tyreometabolicznego mają bardzo istotny wpływ na metabolizm lipoprotein. Celem obecnej pracy jest ocena stężenia i aktywności białka przenoszącego estry cholesterolu (CETP - Cholesteryl Ester Transfer Protein) w surowicy pacjentów z różnymi zaburzeniami stanu tyreometabolicznego. Aktywność i stężenie CETP oraz szczegółowy profil lipidowy zostały oznaczone u pacjentów w stanie hipotyreozy [N=30], tyreotoksykozy [N=30] oraz w grupie kontrolnej [N=30]. W warunkach niedoboru hormonów tarczycy stężenia w surowicy: całkowitego cholesterolu, triglicerydów, cholesterolu-LDL (Low Density Lipoprotein-cholesterol), cholesterolu-HDL (High Density Lipoprotein-cholesterol) oraz apolipoprotein (apo) A-I i B były istotnie wyższe niż u pacjentów w tyreotoksykozie i w grupie kontrolnej. W obecnej pracy aktywność CETP oceniano mierząc, we wszystkich badanych surowicach, transfer („przenoszenie”) znakowanych estrów cholesterolu z egzogennych HDL do endogennych lipoprotein zawierających apo B. Na wynik przeprowadzonego w ten sposób pomiaru aktywności CETP szereg czynników ma wpływ, m.in. skład i stężenie podklas lipoprotein oraz stężenie samej CETP. Zmierzona aktywność CETP była istotnie większa u pacjentów w stanie hipotyreozy niż u pacjentów w stanie tyreotoksykozy, czy w grupie kontrolnej. Aby ocenić wpływ stężenia lipoprotein i białka przenoszącego lipidy na transfer znakowanych estrów cholesterolu, oznaczono stężenie CETP przy użyciu metody ELISA. Stwierdzono, że stężenie CETP jest istotnie mniejsze u pacjentów w hipotyreozie, co wskazuje, że to zwiększenie stężenia lipoprotein zawierających apo B, a nie zmiany stężenia CETP, są odpowiedzialne za wzrost transferu znakowanych estrów cholesterolu w warunkach niedoboru hormonów tarczycy. Obliczenie skorygowanej aktywności CETP (iloraz aktywności CETP do stężenia apo B) potwierdziło powyższą hipotezę. Stwierdzono, że skorygowana aktywność CETP była istotnie mniejsza u pacjentów w stanie hipotyreozy i uległa zwiększeniu ze wzrostem stężenia hormonów tarczycy. Ponadto, obliczono specyficzną aktywność CETP (iloraz skorygowanej aktywności CETP do stężenia CETP w surowicy), która nie różniła się pomiędzy badanymi grupami. Parametr ten stanowi przybliżenie warunków, w których aktywność CETP byłaby oznaczana w różnych stanach tyreometabolicznych, jednakże przy takim samym stężeniu zarówno lipoprotein, jak i CETP. Uzyskany wynik pozwala wykluczyć zaburzenia funkcji lipoprotein w różnych stanach tyreometabolicznych jako przyczynę zmian aktywności CETP. Co więcej, zarówno stężenie jak i skorygowana aktywność CETP pozytywnie korelowały ze stężeniem wolnych hormonów tarczycy (FT3 i FT4), a negatywnie ze stężeniem tyreotropiny. Podsumowując, należy stwierdzić, że hormony tarczycy wydają się pełnić kluczową rolę w regulacji stężenia i aktywności CETP u ludzi. Dedecjus M1,3, Masson D2, Lewiński A1, Brzeziński J3, Gambert Ph2, Lagrost L2 Mass concentration, corrected and specific CETP activity in serum of patients with different disorders of thyreometabolic states 1 Department of Thyroidology, Institute of Endocrinology, The University School of Medicine at Łódź Laboratoire de Biochimie des Lipoprotéines, INSERM U 498, Faculté de Médecine, Dijon 3 Departement of Endocrinological and General Surgery, Institute of Endocrinology, The University School of Medicine at Łódź 2 t Thyreometabolic status disorders are associated with multiple changes in lipoprotein metabolism. The aim of present study was to determine whether the mass concentration and the activities of the serum cholesteryl ester transfer protein (CETP) could be modified in different thyreometabolic states. To this end, serum lipid profile, cholesteryl ester transfer rates and CETP mass concentration levels were measured in control [N=30], hypothyroid [N=30] and hyperthyroid [N=30] patients. During hypothyroidism, serum concentrations of total cholesterol, triglyceride, LDL-cholesterol, VLDLcholesterol, HDL-cholesterol, apolipoproteins (apo) AI and B were higher than that in control and thyreotoxic patients. In the former attempt to evaluate CETP activity, the rate of transfer of radiolabeled cholesteryl esters from exogenous HDL towards unlabeled endogenous apo B-containing lipoproteins was measured in total serum samples. This activity is known to reflect serum CETP activity, as modulated by a number of serum parameters, including the composition and concentrations of individual lipoprotein subclasses, and CETP mass concentrations. By using the latter experimental approach, CETP activity in hypothyroid state was significantly higher than that in controls. In order to determine the relative contribution of CETP mass levels and endogenous lipoproteins to increased cholesteryl ester transfer activity, CETP mass levels were measured by using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Serum CETP mass concentration was lower in hypothyroidism than in controls or in patients with thyreotoxicosis, indicating that increased concentration of apo B-containing lipoproteins, but not increased serum CETP levels, account for elevated cholesteryl ester transfer rates in hypothyroid serum. 491 MATERIAŁY ZJAZDOWE Dedecjus M1,3, Masson D2, Lewiński A1, Brzeziński J3, Gambert Ph2, Lagrost L2 Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE In further support of the latter view, corrected CETP activity (i.e. the ratio of serum cholesteryl ester transfer rate to serum apoB level) was significantly lower in hypothyroid patients than that in controls or thyreotoxic patients. Finally, when cholesteryl ester transfer rates were corrected simultaneously for the alterations in both endogenous lipoprotein concentrations and CETP mass levels. The resulting specific transfer activities (i.e. the ratio of corrected activity to CETP mass concentration) were remarkably similar in-patients in the status of hypothyroidism, thyreotoxicosis and in control subjects. The latter point allowed ruling out the involvement of possible lipoprotein dysfunction in abnormal rates of cholesteryl ester exchanges in patients in different thyreometabolic states. Moreover, CETP mass levels, as well as corrected CETP activity correlated positively with the concentrations of thyroid hormones (FT3 and FT4), and negatively with TSH levels. It is concluded that thyroid hormones play a key role in the regulation of CETP mass concentration and activity in humans. MATERIAŁY ZJAZDOWE Pachucki J1, Ambroziak M2, Nauman A2, Nauman J1 Poziom ekspresji czterech genów tarczycowych zlokalizowanych w tym samym odcinku chromosomu 15: THOX1, THOX2, REVTHOX1 i REVTHOH2 wykazuje wzajemną korelację. 1 2 Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych i Endokrynologii AM, Warszawa Zakład Biochemii Klinicznej Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego, Warszawa t Główną reakcją w procesie syntezy tyroksyny jest inkorporacja atomu jodu do tyroglobuliny. Substratem w tej reakcji, poza atomem jodu, jest cząsteczka nadtlenku wodoru (H2O2). Niedawno udało się scharakteryzować dwa homologiczne geny ThOX, których ekspresja jest swoista dla tarczycy, i których produkty należą do grupy oksydaz NADPH, enzymów biorących udział w produkcji H2O2. Jednym z głównych czynników stymulujących syntezę tyroksyny jest TSH. Działanie to jest głównie związane z pośrednim wpływem cAMP na ekspresje genów tarczycowych. Początkowe badania przeprowadzone na hodowlach ludzkich i psich komórek tarczycowych, czy też na szczurzej linii komórkowej FRTL5 wskazywały, że ekspresja genów ThOX jest stymulowana przez TSH. Badania in vitro z użyciem genu dla lucyferazy wykazały, że aktywność promotorów obu ludzkich genów ThOX jest raczej hamowana przez cAMP, zarówno w komórkach tarczycowych jak i nie tarczycowych. Oba ludzkie geny ThOX zostały zlokalizowane w tym samym odcinku chromosomu 15. Analiza sekwencji tego fragmentu chromosomu wykazała, że w tym samym miejscu zlokalizowane są dwa dodatkowe geny o nieznanej funkcji, których przewidywana budowa nie jest podobna do znanych białek. Produkt mRNA dla obu genów tymczasowo nazwanych revThOX jest obecny głównie w tarczycy. Celem obecnej pracy było zbadanie ekspresji dwóch genów ThOX i dwóch genów revThOX 492 w tkance tarczycowej. W tym celu użyto 63 skrawków tarczycy pobranych podczas zabiegu operacyjnego od 47 pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa (GB), wolem guzkowatym toksycznym, wolem obojętnym lub rakiem brodawkowatym tarczycy (PTC). Stwierdzono dobrą korelację pomiędzy ekspresją wszystkich czterech genów (p=0,001). Poziom ekspresji każdego z czterech genów nie różnił się w tkankach pochodzących z grupy GB w porównaniu z grupą kontrolną ani pomiędzy grupą PTC, a grupą kontrolną. Wyniki badań wskazują że wszystkie cztery geny mogą posiadać ten sam czynnik lub czynniki regulujące specyficzną ekspresje tkankową, np. metylacja DNA lub wspólny element regulacyjny. Ekspresja tarczycowych ludzkich genów ThOX i revThOX nie koreluje ze stopniem aktywacji receptora TSH. Pachucki J1, Ambroziak M2, Nauman A2, Nauman J1 The expression levels for four thyroidspecific human genes located in the same chromosomal region: THOH1, THOX2, REVTHOX1 and REVTHOX2 are strongly correlated with each other 1 2 Department of Int ernal Medicine and Endocrinology, Medical University of Warsaw Department of Biochemistry, Medical Centre of Postgraduate Education, Warsaw t The central reaction in thyroid hormone synthesis is the incorporation of iodine into thyroglobulin. The substrate required for this reaction, besides iodine, is hydrogen peroxide (H2O2). Recently two homologous thyroid specific genes were cloned, which predicted products belong to NADPH oxidazes, enzymes responsible for H2O2 production. The major regulatory factor for thyroid hormone synthesis is TSH. TSH regulates thyroid gene expression mainly by increasing cAMP synthesis. Initial studies on human or dog primary cell culture and rat thyroid cell line (FRTL5) showed that TSH stimulates ThOX gene expression through cAMP pathway. Human ThOX gene functional promoter studies, using luciferase reporter gene, showed that both ThOX gene promoters are rather inhibited by cAMP, either in thyroid or non-thyroid cell lines. Both ThOX genes were localized in the same region of chromosome 15. Sequence analyses reviled that two additional unknown genes are localized in the same region, herein called revThOX. The predicted structure of both revThOX gene products does not resemble any known protein. The mRNA for both revThOX genes, similarly to ThOX genes, are present mostly in thyroid. The goal of this work was to evaluate the expression of two ThOX genes and two revThOX genes in thyroid tissues. We used 63 thyroid tissue fragments collected during surgery from 43 patients with: Graves’ disease (GB), toxic multinodular goiter, non-toxic goiter or papillary thyroid carcinoma (PTC). The mRNA expression level for all 4 genes parallels closely within all tested tissues (bivariate correlation for all possible pars p=0,001). There was no difference in expression level between GD and control groups or between PTC and control groups. Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Ambroziak M1, Pachucki J2, Gereben B3, Łuczak J1, Nauman J2, Nauman A1 The presence of D2 mrna transcript including additional exon within coding region probably does not affect D2 activity 1 1 2 3 1 Ambroziak M , Pachucki J , Gereben B , Łuczak J , Nauman J2, Nauman A1 Obecność transkryptu ludzkiego genu DIO2, zawierającego dodatkowy ekson w części kodującej, prawdopodobnie nie wpływa na aktywność dejodynazy typu ii w tarczycy 1 2 3 Zakład Biochemii Klinicznej, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego, Warszawa; Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych i Endokrynologii AM, Warszawa; Instytut Medycyny Eksperymentalnej, Węgierska Akademia Nauk, Budapeszt, Węgry. t Jodotyroninowa 5’ dejodynaza typu II (D2) katalizuje konwersję tyroksyny do trijodotyroniny. W badaniach ekspresji D2 w różnych schorzeniach tarczycy zwraca uwagę brak korelacji między aktywnością i poziomem mRNA. Zjawisko to tłumaczono dotychczas zmiennym wbudowaniem selenocysteiny do łańcucha białkowego lub modyfikacjami post-trtanslacyjnymi. Również różnice w części nie-kodującej 5’ ludzkiego genu dejodynazy typu II (hdio2), wynikające z obecności alternatywnego miejsca startu transkrypcji, mogą wpływać na poziom ekspresji D2. Ostatnio zwrócono także uwagę na możliwość alternatywnego składania w obrębie części kodującej genu hdio2. W efekcie tego procesu mogą powstawać dwa transkrypty, których produkty białkowe różniłyby się budową i prawdopodobnie aktywnością enzymatyczną. Celem niniejszej pracy była ocena, czy brak korelacji między aktywnością i poziomem mRNA dla D2 wiąże się z obecnością różnych wariantów regionu kodującego genu dio2 oraz czy różnice w kinetyce enzymatycznej są związane z obecnością dodatkowego eksonu. Badania z zastosowaniem techniki RT-PCR i klonowania przeprowadzono w wybranych tkankach, gdzie wspomniany brak korelacji był szczególnie wyraźny. Skrawki tarczycy pochodziły od pacjentów operowanych z powodu: choroby Gravesa-Basedowa, wola guzkowego toksycznego oraz raka brodawkowatego. Stosując trzy różne pary primerów, obejmujące przypuszczalne miejsce alternatywnego składania, uzyskaliśmy dwa oddzielne produkty, różniące się długością około 100 par zasad, które zostały uwidocznione w rozdziale elektoforetycznym na 2% żelu agarozowym. Obecność obydwu produktów była stwierdzona w każdej z badanych tkanek tarczycowych. We wszystkich przypadkach dominującym prążkiem był ten, odpowiadający krótszemu transkryptowi, pozbawionemu dodatkowego eksonu. Na podstawie braku różnic w stosunku ekspresji dwóch transkryptów między poszczególnymi tkankami stwierdziliśmy, że obecność dodatkowego eksonu nie wpływa na zmiany ekspresji D2 na poziomie mRNA i aktywności enzymatycznej. 2 3 Department of Biochemistry, Medical Centre of Postgraduate Education, Warsaw, Poland Department of Internal Medicine and Endocrinology, Medical University of Warsaw, Poland Institute of Experimental Medicine, Hungarian Academy of Sciences, Budapest, Hungary t Iodothyronine deiodinase type II (D2) catalyses the thyroksyn to triiodothyronine conversion. The D2 expression studies showed the lack of correlation between D2 activity and mRNA level in different human thyroid tissues. The differences in selenocystein incorporation to the protein or posttranslational modifications might be potential explanation. Nevertheless, earlier reported the presence of different D2 transcripts due to alternative start sites suggest the significance of pretranslational mechanism in D2 expression alterations. The alternative splicing within coding region of type II deiodinase gene (dio2) was lastly reported. It might lead to form two transcripts expressing proteins with different structure and enzymatic activity. The purpose of this study was to evaluate if the lack of correlation between D2 activity and mRNA level is associated with the presence of different spliced variants of dio2 as well as if different D2 kinetics are associated with the presence of additional exon. Using RT-PCR and cloning techniques we examined selected tissue samples with the marked discrepancies between D2 activity and mRNA level. The samples came from patients with Graves’ disease, toxic multinodular goitre and papillary thyroid cancer. Two separate products, differing by about 100 bp, were identified using three different sets of primers flanking the alternative splicing site and detected by 2% agarose gel electrophoresis in all investigated tissue samples. The dominant band was the shorter transcript without additional exon. In spite of differences in D2 mRNA level and activity in particular tissues there were no differences in the expression level of two distinct transcripts. Our results suggest that the presence of dio2 coding region spliced variant probably does not affect D2 activity and T4 deiodination in the human thyroid. Pawlaczek A, Kula D, Jarząb M2, Gondek Ł, Staszel M, Jurecka-Lubieniecka B., Związek polimorfizmu promotora genu interleukiny 4 –589 C/T z chorobą GravesBasedowa Zakład Medycyny Nuklearnej i Endokrynologii Onkologicznej, 2 Zakład Biologii Nowotworów, Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej – Curie, Gliwice Wstęp: Ważnym czynnikiem w patogenezie chorób autoimmunizacyjnych jest zachwianie równowagi pomiędzy odpowiedzią immunologiczną typu Th1 493 MATERIAŁY ZJAZDOWE These results indicate that all four genes might have similar regulatory unit or its expression might be regulated by common mechanism like DNA methylation. The expression of ThOX genes do not correlate with the activation of cAMP pathway. MATERIAŁY ZJAZDOWE Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE i Th2 i produkcją charakterystycznych dla nich cytokin. Choroba Graves-Basedowa jest autoimmunologicznym zaburzeniem funkcji tarczycy, w którym nie udało się jednoznacznie wykazać polaryzacji ani w kierunku Th1, ani w kierunku Th2. Hunt i wsp. (JCEM 200; 85: 1984-1988) wykazali związek pomiędzy polimorfizmem promotora genu IL4 C/T (-589) a chorobą Gravesa Basedowa. Stwierdzili rzadsze występowanie allelu T u pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa i postulują, że zmniejszenie syntezy IL4 wskutek zmniejszonej aktywności promotora może zaburzać równowagę Th1/Th2. Cel pracy: Celem pracy jest określenie związku promotora genu interleukiny 4 (w pozycji –589) z rozwojem choroby Graves-Basedowa. Materiał i metody: Analizę polimorfizmu przeprowadzono w grupie chorych i w grupie kontrolnej. Do grupy badanej kwalifikowano pacjentów u których stwierdzono nadczynność tarczycy i obecność przeciwciał TRAb we krwi. Grupa liczy 152 osób (127 kobiet i 25 mężczyzn). Grupę kontrolną stanowią zdrowe osoby u których po przeprowadzeniu badania USG oraz po oznaczeniu stężenia TSH wykluczono jakąkolwiek chorobę tarczycy. U wszystkich osób z grupy kontrolnej wykluczono też występowanie chorób tarczycy w rodzinie. Grupa kontrolna liczy 87 osób (60 kobiet i 27 mężczyzn). DNA wyizolowano z krwi obwodowej metodą wysalania białek. Fragment promotora genu IL-4 o długości 194bp otrzymano w reakcji PCR, następnie produkt reakcji poddawano trawieniu enzymem restrykcyjnym Ava II. Wyniki: W grupie badanej stwierdzono 104 homozygoty C/C (68,4%), 45 heterozygoty C/T (29,6%), 3 homozygoty T/T (2%). W grupie kontrolnej obecne były 59 homozygoty C/C ( 67,8%), 26 heterozygoty C/T (29,9%), 2 homozygoty T/T (2,3%). Allel T występował więc z podobną częstością w obydwu grupach 16,8% w grupie kontrolnej 17,2%. Wniosek: Dotychczas otrzymane wyniki nie wskazują na związek polimorfizmu promotora genu IL4 z chorobą Graves-Basedowa w populacji polskiej. Pawlaczek A1, Kula D1, Jarząb M2, Gondek Ł1, Staszel M1, Jurecka-Lubieniecka B1 Association of interleukin-4 promoter gene polymorphism – 589 C/T with autoimmune thyroid disease 1 2 Department of Nuclear Medicine and Endocrine Oncology, Center of Oncology- Maria Skłodowska-Curie Memorial Institute, Gliwice Department of Tumour Biology, Center of Oncology - Maria Skłodowska-Curie Memorial Institute, Gliwice Introduction: The most important factor of autoimmune disease pathogenesis is shake of balance between immunological response type Th1 and Th2 and production of specific cytokines. Graves’ disease is an autoimmunological disruption of thyroid function. In case of this disease no unambiguous demonstration of polarization toward neither Th1 nor Th2 is observed. Hunt et al. (JCEM 2000; 85: 1984-1988) demonstrated association between promoter gene polymorphism IL-4 C/T (-589) and Graves’ disease. They stated rare occurrence of T 494 allele in-patients with Graves’ disease and they postulated that decreased synthesis of IL4 owing to decreased promoter activity can disrupt balance of Th1/Th2. Aim of the study: The aim of this work is to define association between promoter gene IL4 polymorphism (position –589) and Graves’ disease occurrence. Material and Methods: Polymorphism’s analysis was carried out in patients and control group. 152 patients (127 women and 27 men) with diagnosed hyperthyroidism and presence of TSH receptor autoantibodies were qualified to the analyzed group. The control group consists of 87 (60 women and 27 men) healthy persons in whom no thyroid disease was stated after USG examination and after mean TSH measurement. Familial anamnesis was also negative. DNA was isolated from whole blood by the method of saline precipitation.194 bp fragment of IL-4 gene promoter was PCR amplified and subsequently digested with restriction enzyme Ava I to distinguish between C and T allele. Results: In the analyzed group 104 C/C homozygotes (68.4%), 54 heterozygotes C/T (29.6%), 3 homozygotes T/T (2%) were stated. In the control group we observed 59 C/C homozygotes (67.8%), 26 heterozygotes C/T (29.9%), 2 homozygotes T/T (2.3%). Allele T was found with similar frequency both in patients group (16.8 %) and control group (17.2%). Conclusion: Up to now, obtained results do not indicate an association of polymorphism promoter gene IL4 with Graves’ disease in Polish population. Jurecka-Lubieniecka B1, Kula D1, Hasse-Lazar K1, Stęchły T1, Krawczyk A1, Szpak S1, Jarząb M2, Pawlaczek A1, Gubała E1, Współudział polimorfizmu TNF I CTLA4 w predyspozycji genetycznej do choroby GravesBasedowa 1 2 Zakład Medycyny Nuklearnej i Endokrynologii Onkologicznej, Zakład Biologii Nowotworów, Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej – Curie, Gliwice t W predyspozycji genetycznej do choroby GravesaBasedowa (GB) wśród genów kandydackich wymienia się m.in. geny TNF i CTLA-4. Geny dla TNF (czynnik martwicy nowotworów) i LTα (limfotoksyny α) zlokalizowane są na chromosomie 6 w obrębie kompleksu MHC. Cytokiny kodowane przez te geny biorą udział w regulacji procesów immunologicznych. Gen dla CTLA-4 znajduje się na chromosomie 2. CTLA-4 bierze udział w regulacji odpowiedzi immunologicznej poprzez łączenie się z cząsteczką kostymulacyjną B7 i hamowanie aktywacji limfocytów T. Celem pracy była ocena związku polimorfizmu genów TNF i CTLA-4 z chorobą Gravesa-Basedowa i jej przebiegiem klinicznym w populacji polskiej, szczególnie w aspekcie jednoczesnego występowania wariantów polimorficznych badanych genów. Do badań zakwalifikowano 222 pacjentów z chorobą GB. Grupę kontrolną stanowiło 208 osób zdrowych, dobranych według płci i wieku w stosunku do grupy osób z chorobą GB, u których nie stwierdzono choroby tarczycy i z ujemnym wywiadem dotyczącym chorób tarczycy u krewnych pierwszego stopnia. Badania Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) TNF(A) Graves Basedow 22,7 Graves’ disease group consists of 222 patients. In control group there were 208 healthy persons without history of thyroid disease, with negative familial anamnesis in first degree relatives and with normal thyroid sonography in women over 30 years old. The clinical analysis concerned ophtalmopathy (N=198, 70 persons with ophtalmopathy – 35%), TRAb value (median 11.6 IU/l) and time of treatment (time from the diagnose to remission – mean value 4.7 years) The genotyping was performed by PCR/RFLP analysis. TNF gene (polymorphism located in promotor sequence at position -308) and LTA gene (polymorphism in the 1 intron at position 252) were digested with NcoI restriction enzyme. CTLA-4 gene polymorphism, located in 1 ekson at position 49 was detected by BbvI enzyme. The allelic frequency of rarer TNF2 (A), LT 1 (G) and CTLA-4 (G) allele is placed below in the table. LTA(G) 36,3 CTLA4(G) 50,7 TNF2 (A) Graves’ disease 22,7% LT 1 (G) 36,3% CTLA-4 (G) 50,7% Kontrola 12,7 26,9 38,7 Control group 12,7% 26,9% 38,7% P p<0,001 p<0,05 p<0,001 P p<0,001 p<0,05 p<0,001 OR 2,52 ( 95% CI: 1,75 (95% CI: 1,65-3,83) 1,19-2,56) OR 2,52 ( 95% CI: 1,75 (95% CI: 2,27 (95% CI: 1,65-3,83) 1,19-2,56) 1,5-3,45) W analizie współwystępowania genów predysponujących wykazano, że w grupie GB osoby posiadające co najmniej jeden allel TNF2 (A) i jednocześnie co najmniej jeden allel CTLA-4 (G) występują z częstością 33,78%, natomiast w grupie osób zdrowych z częstością 12,02%, (p<0,001) a OR wzrasta do wartości 3,73 (95% CI: 2,266,17). Nie wykazano związku jednoczesnego występowania polimorfizmów TNF i CTLA-4 z występowaniem oftalmopatii, wartością TRAb oraz czasem leczenia. Wniosek: Współwystępowanie polimorfizmu TNF i CTLA4 nasila ryzyko choroby Graves-Basedowa. 2,27 (95% CI: 1,5-3,45) The analysis of simultaneous presence of rarer allele TNF and CTLA-4 genes revealed in the GD higher frequency (33,78%) of persons carrying at least one rarer TNF2 (A) and simultaneous at least one rarer CTLA-4 (G) comparing to the control group (12.02%) (p<0,001). The OR value was increased to 3.73 (95% CI: 2.26-6.17). There is no association between ophtalmopathy, TRAb value and time of the GD treatment with TNF and CTLA-4 genes polymorphism. Conclusion: simultaneous presence of rarer alleles TNF and CTLA-4 genes increases the risk of GD onset. 1 Beata Jurecka-Lubieniecka, 1Dorota Kula, 1Kornelia 1 1 Hasse-Lazar, Tomasz Stęchły, Aleksandra Krawczyk, 1Sylwia Szpak, 2Michał Jarząb, 1 Agnieszka Pawlaczek, 1Elżbieta Gubała Kula D,1 Stęchły T1, Jurecka-Lubieniecka B1, HasseLazar K,1 Krawczyk A,1 Szpak S1, Jarząb M2, Pawlaczek A1, Gubała E1, TNF and CLTA-4 gene participation in Graves’ disease genetics predisposition Predyspozycja genetyczna do choroby Hashimoto w populacji polskiej: związek z polimorfizmem genów TNF I CTLA-4 1 2 Department of Nuclear Medicine and Endocrine Oncology, Center of Oncology- Maria Skłodowska-Curie Memorial Institute, Gliwice Department of Tumour Biology, Center of Oncology - Maria Skłodowska-Curie Memorial Institute, Gliwice t Genetics predisposition to Graves’ disease (GD) is considered to be connected with TNF and CTLA-4 genes. TNF genes (TNF – tumor necrosis factor gene, and LTA – lymphotoxin α gene) are located on 6 chromosome, between MHC genes. TNF and LT α are immunoregulatory cytokines. CTLA-4 gene is situated on 2 chromosome. CTLA-4 co-stimulatory molecule takes part in immunoregulation by binding of B7 and down regulation of T cell activation. The aim of the study was to estimate the association of TNF and CTLA-4 genes polymorphism, with special focus on simultaneous presence of rarer allele TNF and CTLA-4 genes with GD and clinical manifestations of GD. 1 2 Zakład Medycyny Nuklearnej i Endokrynologii Onkologicznej, Zakład Biologii Nowotworów, Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej – Curie, Gliwice t Celem pracy była ocena związku polimorfizmu genów TNF i CTLA-4 z chorobą Hashimoto (H) w populacji polskiej oraz ocena związku z tych polimorfizmów z następującymi cechami klinicznymi: obecnością przeciwciał przeciwko TPOAb, wartością TSH w momencie rozpoznania choroby, objętością tarczycy oraz dawką substytucyjną tyroksyny. Do badań zakwalifikowano 89 pacjentów. Grupę kontrolną stanowiło 208 osób zdrowych, u których nie stwierdzono choroby tarczycy, z ujemnym wywiadem dotyczący chorób tarczycy u krewnych pierwszego stopnia oraz z prawidłowym obrazem USG u kobiet po 30 roku życia. Badania prowadzono techniką PCR/RFLP. Polimorfizm genu TNF, zlokalizowany w promotorze genu, 495 MATERIAŁY ZJAZDOWE kliniczne dotyczyły analizy całego dotychczasowego przebiegu choroby pod względem wystąpienia oftalmopatii (N=198, 70 czyli 35% z oftalmopatią), stężenia TRAb (mediana 11,6 IU/l) oraz czasu leczenia, tj. czasu od rozpoznania do wykazania trwałej remisji (średnia 4,7 lat). Badania prowadzono techniką PCR/RFLP. Polimorfizm genu TNF, zlokalizowany w miejscu promotorowym w pozycji –308 i polimorfizm genu LTA, zlokalizowany w pierwszym intronie w pozycji 252, oznaczono z wykorzystaniem enzymu restrykcyjnego NcoI. Polimorfizm genu CTLA-4, zlokalizowany w pierwszym eksonie w pozycji 49, badano z wykorzystaniem enzymu restrykcyjnego BbvI. Częstości rzadkich alleli TNF(A), LTA(G), CTLA4(G) zaobserwowane w grupie badanej i kontrolnej przedstawiono w tabeli. Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE w pozycji –308 i polimorfizm genu LTA, zlokalizowany w pierwszym intronie w pozycji 252, oznaczono z wykorzystaniem enzymu restrykcyjnego NcoI. Polimorfizm genu CTLA-4, zlokalizowany w pierwszym eksonie w pozycji 49, badano z wykorzystaniem enzymu restrykcyjnego BbvI. MATERIAŁY ZJAZDOWE Choroba Kontrola P Hashimoto TNF 2/2 allel rzadki 5,62 % 2,9 % TNF 2/1 19,7 % 25,84 % OR P=0,23 1,56 (95% CI: 0,9-2,71) TNF 1/1 allel częsty 68,54 % 77,4 % Częstość alleliczn 18,54 % 12,7 % P=0,69 LT 1/1 allel rzadki 42,53 % 55,3 % LT 2/1 43,68 % 35,6 % LT 2/2 allel częsty 13,73 % 9,1 % P=0,13 1,65 (95% CI: 0,99-2,75) Hashimoto Control p value OR disease group 35,9 % 26,9 % P<0,05 TNF 2/2 5.62 % 2.9 % CTLA4 G/G allel rzadki 27,38 % 17,8 % TNF 2/1 25.84 % 19.7 % CTLA4 A/G 46,43 % 41,8 % P<0,05 1,89 (95% CI: 0,99-2,75) TNF 1/1 68.54 % 77.4 % CTLA4 A/A allel częsty 26,19 % 40,4 % Allelic frequency of rarer TNF2 allele 18.54 % 12.7 % 0.69 Częstość alleliczn 50,59 % 38,7 % 0.13 P<0,05 Kula D,1 Stęchły T1, Jurecka-Lubieniecka B1, HasseLazar K,1 Krawczyk A,1 Szpak S1, Jarząb M2, Pawlaczek A1, Gubała E1, Genetic predisposition to Hashimoto disease in polish population: association with TNF and CTLA-4 genes polymorphism 2 The genotyping was performed by PCR/RFLP analysis. TNF gene (polymorphism located in promotor sequence at position -308) and LTA gene (polymorphism in the 1 intron at position 252) were digested with NcoI restriction enzyme. CTLA-4 gene polymorphism, located in 1 ekson at position 49 was detected by BbvI enzyme. Częstość alleliczn W przypadku genów TNF i LT różnice w średnich wartościach TPOAb, TSH początkowego, objętością tarczycy oraz średnią dawką tyroksyny w zależności od genotypu nie były znamienne statystycznie. Dla genu CTLA-4 nie wykazano znamiennych różnic w średniej wartości TPOAb w zależności od genotypu wykazano natomiast związek z nasileniem niedoczynności tarczycy i jej objętością. U homozygot CTLA-4 G/G średnia wartość TSH początkowego wynosiła 62,4 µIU/ml (mediana 44,0 µIU/ml), u heterozygot G/A 34,9 µIU/ml (mediana 19,5 µIU/ml), a u homozygot A/A 38,8 µIU/ml (mediana 19,03 µIU/ml) (p<0,05). Średnia objętość tarczycy w grupie homozygot CTLA-4 G/G wynosiła 7,75 ml (mediana 7,1 ml), w grupie heterozygot G/A 14,1 ml (mediana 10,0 ml) a homozygot A/A 13,4 ml (mediana 10,0 ml) (p<0,05). Również średnia dawka przyjmowanej tyroksyny wykazywała znamienny związek z genotypem. Otrzymane wyniki wskazują, że najsilniejszy związek z występowaniem i obrazem klinicznym choroby Hashimoto w populacji polskiej wykazuje polimorfizm genu CTLA-4. 1 Hashimoto disease and some clinical features (presence of TPO antibody, TSH value at the onset, thyroid gland volume and substitution thyroxin dose) in Polish population. The Hashimoto group consists of 89 patients. They were compared to 208 healthy persons without history of thyroid disease, with negative familial anamnesis in first degree relatives and with normal thyroid sonography in women over 30 years old. Department of Nuclear Medicine and Endocrine Oncology, Center of Oncology- Maria Skłodowska-Curie Memorial Institute, Gliwice Department of Tumour Biology, Center of Oncology - Maria Skłodowska-Curie Memorial Institute, Gliwice t The purpose of the study was to estimate the association TNF and CTLA-4 genes polymorphism with 496 LT 1/1 13.73 % 9.1 % LT 2/1 43.68 % 35.6 % 0.23 LT 2/2 42.53 % 55.3 % Allelic frequency of rarer LT 1 allele 35.7 % 26.9 % <0.05 CTLA4 G/G 27.38 % 17.8 % <0.05 CTLA4 A/G 46.43 % 41.8 % CTLA4 A/A 26.19 % 40.4 % Allelic frequency of 50.59 % rarer CTLA-4 (G) allele 38.7 % 1.56 (95% CI: 0.9-2.71) 1.65 (95% CI: 0.99-2.75) 1.89 (95% CI: 0.99-2.75) <0.05 There were no significant differences between mean values of TPO antibodies, TSH, thyroid gland volume and substitution thyroxin dose for TNF and LTA genes. Mean value of TPO antibody did not depend on CTLA4 gene significantly. For CTLA-4 G/G genotype mean value TSH was 62.4 µIU/ml (median 44.0 µIU/ml), for CTLA-4 G/A it was 34.9 µIU/ml (median 19.5 µIU/ml), and for CTLA-4 A/A 38.8 µIU/ml (median 19.03 µIU/ ml) (p<0.05). Significant differences in mean volume of thyroid gland were observed for CTLA-4 G/G genotype (7.75 ml, median 7.1 ml), CTLA G/A (14.1 ml, median 10.0 ml) and CTLA-4 A/A genotype (13.4 ml, median 10.0 ml) (p<0.05). Mean value of substitution thyroxin dose was also significantly associated with CTLA-4 gene genotype. Our results speak for the strongest association of Hashimoto disease with CTLA-4 gene polymorphism, which moreover, is associated with some clinical features of Hashimoto disease. Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Cząsteczki HDL – budowa, rozkład subfrakcji i ładunek elektrostatyczny w hipotyreozie – wpływ leczenia L-tyroksyną 1 Zakład Tyreologii, Instytut Endokrynologii, Akademia Medyczna w Łodzi Laboratoire de Biochimie des Lipoprotéines, INSERM U 498, Faculté de Médecine, Dijon, France 3 Klinika Chirurgii Endokrynologicznej i Ogólnej, Instytut Endokrynologii, Akademia Medyczna w Łodzi 2 t W wielu badaniach klinicznych, doświadczalnych i epidemiologicznych udowodniono, że frakcja cholesterolu lipoprotein o dużej gęstości [High Density Lipoprotein (HDL)-cholesterol] ma działanie ateroprotekcyjne. W warunkach niedoboru hormonów tarczycy obserwuje się wzrost stężenia cholesterolu-HDL, pomimo że stan ten sprzyja rozwojowi miażdżycy. Celem obecnej pracy była analiza budowy, rozkładu subfrakcji i ładunku elektrostatycznego cząsteczek HDL w hipotyreozie oraz wpływu leczenia L-tyroksyną (L-T4) na powyższe parametry. Materiał: Analizie poddano surowicę krwi pacjentów po wykonanej operacji tyreoidektomii z powodu zróżnicowanego raka tarczycy. Krew (na czczo) została pobrana w dwóch punktach czasowych: 1) w okresie tzw. stymulacji endogenną tyreotropiną (TSH) - kiedy pacjenci byli przygotowywani do scyntygrafii całego ciała (WBS) w celu wykrycia ewentualnych przerzutów nowotworu i pozostawali w niedoczynności tarczycy (n=66) oraz 2) w okresie supresji L-T4- ci sami pacjenci po 2-3 miesiącach leczenia tym hormonem (n=66). We wszystkich badanych surowicach oznaczono stężenia: TSH, wolnej trójjodotyroniny (FT3), wolnej tyroksyny (FT4), oraz parametrów profilu lipidowego łącznie z apolipoproteinami (apo) A-I, A-II i B. Ponadto określono procentowy rozkład subfrakcji HDL oraz potencjał powierzchniowy i gęstość ładunku powierzchniowego HDL. Wyniki: Terapia L-T4 spowodowała, statystycznie istotny, spadek procentowego udziału subfrakcji HDL2b i HDL2a, a jednocześnie wzrost HDL3a, HDL3b i HDL3c. W jej przebiegu doszło do spadku stężenia apo AI, nie zaobserwowano natomiast zmian stężenia apo AII. Iloraz stężeń (apo AI)/(apo AII) pozytywnie korelował z poziomem TSH (a negatywnie ze stężeniami wolnych hormonów tarczycy). Jednocześnie parametr ten pozytywnie korelował z procentowym udziałem „dużych” HDL (klasa HDL2), a negatywnie z procentowym udziałem „małych” HDL (klasa HDL3). Terapia L-T4 nie miała wpływu na potencjał powierzchniowy cząsteczek HDL, lecz spowodowała statystycznie istotny wzrost gęstości ładunku powierzchniowego. Wnioski: W hipotyreozie dochodzi do wzrostu stężenia „dużych” cząsteczek HDL (subfrakcje HDL2b i HDL2a), co może powodować zmniejszony wychwyt zwrotny cholesterolu i sprzyjać rozwojowi miażdżycy. Hormony tarczycy mają wpływ na metabolizm apolipoprotein AI i AII, co - poprzez zmianę ilorazu (apo AI)/(apo AII) w cząsteczkach HDL - może powodować zmianę dystrybucji subfrakcji HDL. Powyższe efekty są odwracalne pod wpływem leczenia L-tyroksyną. Niedoczynność tarczycy powoduje zmiany gęstości ładunku powierzchniowego cząsteczek HDL, które mogą mieć wpływ na interakcje tych cząsteczek z CETP i PLTP i innymi białkami i enzymami biorącymi udział w metabolizmie lipoprotein. Dedecjus M1,3, Masson D2, Lewiński A1, Brzeziński J3, Gambert Ph2, Lagrost L2 HDL particles – composition, subfractions distribution and electrostatic charge in hypothyroid patients; influence of L-thyroxine therapy 1 Department of Thyroidology, Institute of Endocrinology, The University School of Medicine at Łódź, Poland 2 Laboratoire de Biochimie des Lipoprotéines, INSERM U 498, Faculté de Médecine, Dijon, France 3 Department of Endocrinological and General Surgery, Institute of Endocrinology, The University School of Medicine at Łódź, Poland t In many clinical, experimental and epidemiological trials, the atheroprotective role of HDL-cholesterol (High Density Lipoprotein-cholesterol) was proven. Despite the fact that, in conditions of thyroid hormones deficiency increased HDL-cholesterol is observed, the development of atherosclerosis in hypothyroid status is accelerated. The aim of the present study was to analyze the composition, size and electrostatic charge of HDL particles in hypothyroidism and the influence of Lthyroxine (L-T4) on the above parameters. Material: Venous blood samples of patients, thyroidectomized because of differentiated thyroid carcinoma, were submitted to analysis. Blood samples were collected in two time intervals: 1) at the time of so-called stimulation with endogenous thyrotropin (TSH), i.e. when the patients – remaining in hypothyroid state (n=66) – were prepared to whole body scintigraphy (WBS), and 2) 2) after two months of L-T4 administration in order to suppress TSH concentration (n=66). In all the patients serum lipid profile [including apolipoproteins (apo) A-I, A-II and B concentrations), FT3, FT4, and TSH concentrations were measured. Moreover, HDL subfraction distribution, surface potential and the density of surface charge of HDL were analyzed in all the patients. Results: L-T4-therapy produced a shift of HDL subfractions toward a small-sized range, with significant decreases in the relative abundance of HDL2b and HDL2a and significant increases in the relative abundance of HDL3a and HDL3b in treated patients. During the therapy, a decrease of apo A-I was observed but L-T4 administration had no influence on apo A-II concentration. In effect, the therapy caused decrease of the apo A-I/apo A-II ratio. This parameter correlated positively with TSH levels (and negatively with free thyroid hormones concentrations). Furthermore, the apo A-I/apo A-II ratio correlated positively with “large” HDL particles (HDL2) concentration and negatively with “small” HDL particles (HDL3) concentrations. L-T4 therapy had no influence on HDL surface potential but caused significant increase of HDL density of surface charge. 497 MATERIAŁY ZJAZDOWE Dedecjus M1,3, Masson D2, Lewiński A1, Brzeziński J3, Gambert Ph2, Lagrost L2 Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Conclusions: 1) During hypothyreosis an increase of “large” HDL particles (HDL2a and HDL2b) is observed which may cause decrease in reverse cholesterol transfer and acceleration of atherosclerosis development. 2) Thyroid hormones demonstrate influence on apo A-I and apo A-II metabolism that, via changes in apo A-I/ apo A-II ratio, may cause changes in HDL subfraction distribution 3) The above effects are reversible by L-T4 therapy 4) Hypothyreosis causes changes in the density of surface charge, which may influence interactions among HDL and CETP, PLTP and other enzymes and proteins, taking part in lipoprotein metabolism. forbolu (TPA) – aktywację ścieżki PKC. Immunoprecypitacja wykazała, że wpływowi forskoliny na akumulację transkryptu HSD11B2 towarzyszy wzrost syntezy białkowego produktu tego genu. Wyniki wskazują, że aktywacja ścieżki sygnałowej PKA pobudza, a ścieżki sygnałowej PKC hamuje ekspresję genu HSD11B2. Lecybyl R, Rubis B, Trzeciak WH Regulation of 11ß-hydroxysteroid dehydrogenase type II expression in the renal epithelial cells Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Medical Sciences, Poznan Sesja 2 Lecybyl R, Rubis B, Trzeciak WH Regulacja ekspresji dehydrogenazy 11ß-hydroxysteroidowej typu II w komórkach nabłonkowych nerki szczura MATERIAŁY ZJAZDOWE Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, Akademia Medyczna, Poznań, t Dehydrogenaza 11ß-hydroxysteroidowa typu II (HSD11B2) katalizuje utlenianie aktywnych glukokortykoidów, kortyzolu i kortykosteronu, do nieaktywnych 11-keto-metabolitów – odpowiednio: 11-dehydrokortyzolu (kortyzon) i 11-dehydrokortykosteronu. Obecność enzymu stwierdzono w komórkach docelowych mineralokortykoidów (kanaliki dalsze nerki, jelito grube, pęcherzyk żółciowy, ślinianki, gruczoły potowe, przewód pęcherzykowy, trofoblast) gdzie ochrania słabo selektywny receptor mineralokortykoidów przed wiązaniem glukokortykoidów. Kortyzol działa jako agonista mineralokortykoidów i może wywoływać objawy hiperaldosteronizmu. Mutacje w ludzkim genie HSD11B2 mogą wywołać postać nadciśnienia, któremu towarzyszy niski poziom reniny i duża wrażliwość na sól co związane jest z defektem nerkowego metabolizmu kortyzolu i wysokim stosunkiem metabolitów kortyzolu/ kortyzonu w moczu. Zbadano regulację ekspresji dehydrogenazy 11ßhydroksysteroidowej typu II (HSD11B2) na poziomie specyficznego mRNA oraz białka HSD11B2 w pierwotnej linii komórek nabłonkowych nerki szczura. Wykazano, że w komórkach nerki szczura transkrypcja genu HSD11B2 jest indukowana przez ACTH. Dotychczas nie badano jeszcze mechanizmów regulacji ekspresji genu HSD11B2 w komórkach docelowych mineralokortykoidów. Nasze badania miały na celu wykazanie, które ścieżki sygnałowe biorą udział w regulacji tego procesu. Wyniki półilościowej reakcji RT-PCR w komórkach nabłonkowych nerki szczura in vitro wykazały, że stymulacja ścieżki cyklazy adenylanowej powoduje w komórkach nerkowych szczura wzrost ekspresji HSD11B2 na poziomie specyficznego mRNA. Efekt ten jest znacząco redukowany poprzez stymulację estrem 498 t The enzyme 11ß-hydroxysteroid dehydrogenase type II (HSD11B2) catalyses the oxidation of hormonally active glucocorticoides, cortisol and corticosterone, to inactive 11-keto-metabolites: 11-dehydrocortisol (cortisone) and 11-dehydrocorticosterone respectively. The enzyme is localised in the mineralocorticoid target cells (distal nephrons, large intestine, salivary glands and trophoblast) where it protects the non-selective mineralocorticoid receptor against binding of glucocorticoides. Cortisol acts as a mineralocorticoid agonist and can cause symptoms of hyperaldosteronism. Mutations in human HSD11B2 gene result in a low-renin, saltsensitive form of severe hypertension, associated with defects in renal cortisol metabolism and high ratio of the urinary cortisol/cortisone metabolites The regulation of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type II (HSD11B2) expression at the level of specific mRNA and HSD11B2 protein was investigated in the primary culture of rat renal epithelial cells. We have demonstrated that in the adrenocortical cells of the rat transcription of the HSD11B2 ACTH induces gene. However, the regulation of HSD11B2 gene expression in the mineralocorticoid target cells has not been studied yet. Present studies were designed to investigate which transduction pathway participates in this process. Semiquantitative RT-PCR revealed that the adenyl cyclase activator increases specific mRNA accumulation in rat adrenocortical cells. The effect of forskolin was attenuated by the addition of the phorbol ester, tetradecanoyl phorbol acetate (TPA), an activator of protein kinase C (PKC) pathway. Immunoprecipitation study has revealed that the effect of forskolin on the accumulation of HSD11B2 gene transcript is accompanied by increased synthesis of the protein product of the gene. It is concluded that activation of PKA signalling pathway up-regulates whereas PKC pathway downregulates HSD11B2 gene expression. Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Ignacak M, Oksza Strzelecki N, Trzeciak WH, Ignacak M, Oksza Strzelecki N, Trzeciak WH, Mutacje genu receptora androgenów u chorych z zespołem niewrażliwości na androgeny Mutations in the androgen receptor gene in patients with androgen insensitivity syndrome t Receptor androgenów (AR, NR3C4) należy do rodziny receptorów jądrowych i jest klasyfikowany wraz z receptorem glukokortykoidów (GR), receptorem mimineralokortykoidów (MR) i receptorem progesteronu (PR) do grupy C w podrodzinie trzeciej. Jego masa cząsteczkowa w formie ufosforylowanej wynosi 112 kD. AR podlega fosforylacji (przypuszczalnie na resztach Ser 641i 653) bezpośrednio po translacji, gdyż tylko w ufosforylowanej formie receptor jest zdolny do wiązania liganda. Zespół niewrażliwości na androgeny (AIS) jest zaburzeniem różnicowania się płci uwarunkowanym pojawieniem się mutacji genu AR i występującym u chorych o kariotypie 46XY. Na podstawie fenotypów chorych wyróżniono trzy postacie tej choroby: pełnoobjawowy zespół niewrażliwości na androgeny (CAIS), niepełnoobjawowy zespół niewrażliwości na androgeny (PAIS) i zespół niepłodnych mężczyzn (MAIS). Celem badań było ustalenie rodzaju i umiejscowienia mutacji w genie AR u chorych o kariotypie 46XY z rozpoznanym lub podejrzeniem zespołu niewrażliwości na androgeny (AIS) o różnym stopniu nasilenia objawów. Badaniami objęto również członków rodzin. W wyniku rozdziału elektroforetycznego PCRamplifikowanych eksonów od 2 do 8 genu AR, uzyskano jednorodne produkty o oczekiwanej długości. Ampilifikowane fragmenty nie wykazywały różnic w migracji, co świadczy o niewystępowaniu w nich większych insercji lub delecji. Poszukując mutacji punktowych o charakterze tranzycji i transwersji lub niewielkich delecji metodą SSCP ujawniono nieprawidłową ruchliwość elektroforetyczną pojedynczych nici DNA. Stwierdzono także zmiany ruchliwości elektroforetycznej amplifikowanych eksonów 5, 6 i 7, świadczące o zmianie sekwencji nukleotydowej. Natomiast analiza elektroforetyczna zdenaturowanych produktów amplifikacji eksonów 2, 3 i 8 u wszystkich chorych nie wykazała wyraźnych różnic w migracji pojedynczych nici DNA w porównaniu z osobą zdrową (próba kontrolna), co wskazuje na niewystępowanie mutacji w badanych fragmentach. W celu ustalenia rodzaju i umiejscowienia mutacji w genie AR wykorzystano technikę sekwencjonowania eksonów, w których wykazano różnice w migracji amplifikowanych fragmentów. W ten sposób wykryto tranzycje A2476G, G2655A, C2535T, C2718T oraz C2754T, delecję pojedynczego nukleotydu (∆T2600) oraz jedną transwersję C2754G. Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Medical Sciences, Poznan t The androgen receptor (AR, NR3C4) belongs to the nuclear receptor family and is classified in group C of the third subfamily, together with glucocorticoid receptor (GR), mineralocorticoid receptor (MR) and progesterone receptor (PR). In a phosphorylated form its molecular weight equals 112 kD. The AR undergoes phosphorylation (presumably at Ser 641 and 653) directly after translation, since only in this form it can bind the ligand. Androgen Insensitivity Syndrome (AIS) is due to impaired sex differentation caused by mutations in the AR gene and occurs by patients with 46XY karyotype. On the basis of patients’ phenotypes, three forms of this disease were distinguished: Complete Androgen Insensitivity Syndrome (CAIS), Partial Androgen Insensitivity Syndrome (PAIS) and Minimal Androgen Insensitivity Syndrome (MAIS). The aim of the work was to analyse the type and localization of the mutation in the AR gene in 46XY patients with diagnosed or suspected Androgen Insensitivity Syndrome (AIS) of different degree of symptome intensity. The families of patients were also diagnosed. As a result of PCR amplification of exon 2 through 8, electrophoretically homogenous products were obtained. Amplified fragments did not reveal any differences in migration, indicating that there were no major insertions or deletions in those fragments. The search for point mutations such as transitions, transversions or minor deletions by SSCP method revealed single strand migration changes in exons 4, 5, 6 and 7 suggesting mutations in the nucleotide sequence. However, these changes did not appear in the amplification products of exons 2, 3 and 8, indicating that there are no mutations in the investigated fragments. The sequencing method was used to establish the localization and type of mutations in the AR gene, in exons where migration changes were revealed. By this method, A2476G, G2655A, C2535T, C2718T, C2754T transitions, deletion of a single nucleotide (∆T2600) and one C2754G transversion were detected. Our investigations are the first attempt in this country to diagnose Androgen Insensitivity Syndrome, basing on the analysis of patients’ DNA. Badania nasze stanowią pierwszą w kraju próbę ustalenia rozpoznania zespołu niewrażliwości na androgeny w oparciu o badania DNA chorych. 499 MATERIAŁY ZJAZDOWE Katedra I Zakład Biochemii I Biologii Molekularnej AM w Poznaniu MATERIAŁY ZJAZDOWE Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Rabska-Pietrzak B, Obara-Moszyńska M, Kędzia A, Korman E Rabska-Pietrzak B, Obara-Moszyńska M, Kędzia A, Korman E, Ocena progresji wzrastania u dzieci leczonych rekombinowanym hGH z powodu somatotropinowej niedoczynności przysadki, współistniejącej z wrodzonym przerostem kory nadnerczy The estimation of height progression in children with growth hormone deficiency coexisting with congenital adrenal hyperplasia treated with recombinated hGH Klinika Endokrynologii i Diabetologii Wieku Rozwojowego Instytutu Pediatrii AM w Poznaniu Department of Pediatric Endocrinology and Diabetes, Institute of Pediatrics, University of Medical Sciences, Poznań t Wrodzony przerost kory nadnerczy (WPKN) wywołany jest defektem enzymów uczestniczących w sterydogenezie. Najczęstszą jego przyczyną jest deficyt 21-hydroksylazy, prowadzący do niedoboru glikoi mineralokortykoidów z jednoczesnym nadmiarem androgenów. Leczenie WPKN polega na uzupełnianiu sterydów nadnerczowych. Wiadomo jest, że nadmiar egzogennych glikokortykosterydów jak również ich niedobór prowadzący do androgenizacji ustroju działają hamująco na proces wzrastania. Dla uzyskania zadawalającej progresji wzrastania istotne jest ustalenie optymalnej dawki terapeutycznej sterydu. Cel pracy: Analiza tempa wzrastania u dzieci z WPKN i SNP leczonych hGH. Materiał: Dwie dziewczynki Dz.I (A.S) w wieku 16 i Dz.II (M.A.) – 12,5 lat z rozpoznanym WPKN i SNP. Metody: Badanie kliniczne: wzrost, dojrzewanie płc. wg Tannera, wirylizacja wg Pradera. Bad. lab.: fT4, TSH, LH, FSH, PRL, estradiol – met.MEIA, hGH, 17αOHprogesteron, kortyzol – RIA; WK wg. GP. Wyniki: Wywiad okołoporodowy prawidłowy. Dz.I – WPKN z utratą soli rozpoznany w I tyg.ż., wirylizacja n. pł. zew. – IV stop. wg Pradera, Od urodzenia niedobór masy ciała i wzrostu (<3 centyla, -3SDS) z obniżonym tempem wzrastania. Do 7 r.ż WK=WM, leczona Hydrocortisonem (HC) i Cortineffem. Od 8 r.ż. akceleracja WK i dojrzewania płc.–włączono leczenie analogiem LH-RH. W 11 r.ż. zahamowanie tempa wzrastania (2 cm/r), rozpoznano SNP i rozpoczęto leczenie hGH, uzyskując w I roku leczenia progresję wzrostu (7 cm/r), w kolejnych latach powolny spadek tempa wzrastania:II rok leczenia – 6 cm/r., w III roku z powodu zahamowania tempa wzrastania (2 cm/r.) zakończono terapię hGH z końcowym wzrostem 150,5 cm przy prognozie wzrostowej 165 cm. Dawka hGH wynosiła 1,0 µIU/kg/tyg. Dz.II – w 5 r.ż rozpoznano WPKN bez utraty soli, leczone HC. Do 7 r. ż. wzrost na 75 centylu.W 7 r.ż pojawiły się cechy przedwczesnego dojrzewania płciowego – zastosowano leczenie analogiem LH-RH. Mimo tego tempo wzrastania spadło (0,6 cm/r) i w 10 r.ż wzrost mieścił się między 3-10 cent. Rozpoznano SNP. Włączono leczenie hGH uzyskując progresję wzrostu; w I roku –5 cm/r, w następnym – 3,8 cm/r (obecnie w trakcie terapii, aktualny wzrost – 140,9 cm, przy prognozowanym 170,9 cm). Dawka hGH – 0,7 µIU/kg/tyg. Wnioski: 1. Dzieci z WPKN i SNP wymagają większych dawek terapeutycznych hGH niż pacjenci z izolowaną SNP. 2. Mimo stosowania wyższych dawek terapeutycznych hGH u badanych dzieci tempo wzrastania jest stosunkowo niskie. 3. Ostateczny wzrost po zakończeniu leczenia hGH tych dzieci jest niższy niż prognozowany. t Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is caused by a defect of enzymes acting in steroidogenesis. Mostly the defect concerns the 21-hydroxylase, leading to the lack of mineralo-and glucocorticoids with increased levels of adrenal androgens. There is known that too high dose of exogenous glucocorticoides and also too low dose of glucocorticoids leading to androgenization inhibit the growth process. It’s very important to choose the optimal therapeutic dose of steroids to observe a progession of growth. The aim of the study: the analysis of growth velocity in children with CAH and hGH deficiency (GHD). Material: Two girls: G.I (AS) aged 16 years and G.II (MA) – 12.5 years with diagnosed CAH and GHD. Methods: Clinical exam.: growth, puberty ac. to Tanner, virilization ac. to Prader. Lab. test: fT4, TSH, LH, FSH, PRL, estradiol – MEIA met., hGH, 17αOHprogesterone, cotisol – RIA, bone age ac. to GP. Results: Perinatal history normal. G.I – CAH with salt loss recognized in the first week of life, virilization of sex organ IV degree ac. to Prader. Since birth a weight and height deficiency (<3 pcent., -3 SDS) with decreased height velocity. Until 7th year of life BA=CA, treated with Hydrocortisone (HC) and Cortineff. Since 8th year of life acceleration of BA and puberty – the treatment with analogue of LH-RH was started. In 11th year of life a decrease of height velocity (2 cm/y), hGH deficiency was recognized, GH treatment was started. In the I year of treatment – an increase of height velocity (7 cm/y), in following years a slow decrease of height velocity: II year of treat. – 6 cm/y, in the III year because of growth inhibition (2 cm/y) the GH treatment was stopped with the final height 150.5 cm, by predicted height 165cm. The GH dose was 1.0 µIU/kg/week. In G.II in 5th year of life there was CAH without salt loss recognized, treated with HC. Until 7th year of life the growth on 75 pcent. In 7th year of life the precocious puberty occured and the treatment with analogue of LH-RH were started. Although this, height velocity decreased (0.6 cm/y) and in 10th year of life the growth was between 3-10 pcent. hGH deficiency was recognized. The GH treatment was started, a growth progression was observed: in I year – 5 cm/y, in following – 3.8 cm/y (actually during treatment, the present growth 140.9 cm, predicted height 170.9cm). GH doses 0.7 µIU/kg/week. Conclusions: 1. Children with CAH and hGH deficiency have to be treated with higher doses of GH than children with isolated hGH deficiency. 2. Although higher doses of GH in studied children the height velocity is relatively lower. 3. Final height after GH treatment is lower than the predicted height. 500 Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Czarnocka B1, Pastuszka D1, Łyczkowska A1, Lange D2, Nikiel B2, Goraj-Zając A2 , Włoch J2 Ekspresja symportera sodowo-jodowego (NIS) i peroksydazy tarczycowej (TPO) w rakach tarczycy rozwiniętych z komórek nabłonkowych tarczycy 1 2 NIS i TPO. Cytoplazmatyczna lokalizacja NIS i różnice w detekcji TPO stosowanymi metodami sugerują, że transformacja nowotworowa w niektórych rakach tarczycy może interferować z prawidłowym transportem białka NIS do błony plazmatycznej oraz, że konformacyjne zmiany mogą pojawić się w cząsteczce TPO, po jej wbudowaniu w błonę szczytową tyreocyta. Dalsze badania są konieczne dla wyjaśnienia molekularnych i biologicznych defektów związanych z wychwytem I- i TPO w błonie. Zakład Biochemii Klinicznej Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego, Warszawa; Centrum Onkologii, Instytut - Gliwice. t Peroksydaza tarczycowa (TPO) i symporter sodowojodowy (NIS) są kluczowymi białkami kompleksu procesów prowadzących do biosyntezy hormonów tarczycy T3 i T4. Zróżnicowane raki tarczycy, brodawkowate (ang. papillary, thyroid carcinoma, PTC) i pęcherzykowe (ang. follicular thyroid carcinoma, FTC) zachowują często wiele cech funkcjonalnych normalnych tyreocytów, w tym ekspresję TPO i zdolność do wychwytu jodków. Zmiany w ekspresji lub funkcjonalnej/strukturalnej aktywności obu białek mogą być odpowiedzialne za zaburzone gromadzenie jodków i hormonogenezę obserwowane w części raków tarczycy. Badania dotyczące ekspresji NIS i TPO w zróżnicowanych rakach tarczycy dostarczają kontrowersyjnych danych. W pracy badano ekspresję i lokalizację komórkową białek NIS i TPO w 43 zróżnicowanych rakach tarczycy (38 brodawkowatych i 5 pęcherzykowych), 32 tkankach kontrolnych pobranych z przeciwległego bieguna tarczycy nie objętego procesem chorobowym oraz w 6 tarczycach pobranych od pacjentów z chorobą GravesBasedowa. Detekcję białek prowadzono metodami PAGE/ Western blotingu i immunohistochemiczną, stosując swoiste przeciwciała. TPO wykrywano i analizowano jej antygenowość stosując panel 13 przeciwciał monoklonalnych. Białko NIS wykrywano stosując przeciwciała anty-peptydowe (C-koniec ludzkiego NIS). W analizowanej serii raków tarczycy białko NIS było wykrywane w 66% tkanek. W większości raków białko NIS było zlokalizowane w cytoplazmie. W około 30% pozytywnych przypadków obserwowano zarówno cytoplazmatyczną jak i błonową lokalizację. Typową dla NIS lokalizację błonową obserwowano w 5 badanych tkankach. Ekspresja NIS % w rakach tarczycy była większa w porównaniu do otaczającej „normalnej” tkanki, w której heterogenna lokalizacja była obserwowana. Sugeruje to, że w zróżnicowanych rakach tarczycy jest ekspresja białka NIS, w niektórych przypadkach nawet nad-ekspresja w porównaniu z tkanką prawidłową. TPO była obecna w 29 badanych tkanek. Poziom białka TPO różnił się między tkankami i wahał się od bardzo niskiego do wysokiego. Immunohistochemicznie TPO wykrywano w 1/3 badanych tkanek. Jeżeli TPO była obecna w zróżnicowanych rakach tarczycy, jej aktywność antygenowa nie różniła się od obserwowanej w tkankach prawidłowych lub w tkankach pochodzących od pacjentów z chorobą Graves-Basedowa. Otrzymane wyniki wskazują, że większość zróżnicowanych raków tarczycy zachowuje zdolność ekspresji Grant CMKP 501 – 1– 1– 01 – 01/ 99 Czarnocka B1, Pastuszka D1, Łyczkowska A1, Lange D2, Nikiel B2, Goraj-Zając A2, Włoch J2 Iodide symporter (NIS) and thyroid peroxidase (TPO) expression in thyroid epithelial cancer 1 Department of Biochemistry, Medical Center of Postgraduate Education, Warsaw, Poland; 2 Oncology Center, Gliwice, Poland. t Thyroid peroxidase (TPO) and sodium iodide symporter (NIS) are a keys protein in the complex machinery of thyroid hormone synthesis. A variety of abnormalities have been demonstrated in differentiated thyroid cancer including TPO activity and qualitative changes of its molecule as well as variations in the ability to accumulate iodide. There are controversial data on both NIS and TPO expression in differentiated thyroid carcinoma. In the present study we investigated NIS and TPO expression in thyroid tumors by immunoblot analysis and immunohistochemistry, using site-directed, polyclonal antibodies against C terminus of hNIS, and murine monoclonal antibodies against hTPO. 43 differentiated thyroid carcinomas were analyzed by both methods used. 24 out of 37 papillary thyroid tumors were positive, and 4 out of 6 follicular carcinomas were also positive for NIS in both immunohistochemistry and immunoblot analysis. In majority of tissues studied the location of NIS protein was intracellular, whereas in normal surrounding part mostly baso-lateral. Thyroid peroxidase protein was detected n 2/3 of all tumor tissues by immunoblot analysis with mAb#47, suggesting that isolated TPO molecule express and expose this mAb epitope. However immunohistochemical staining with mAb#47 showed positive reaction in 12 tissues, suggesting that the changes of TPO molecule anchorage made it unrecognizable in immunohistochemical staining with mAb#47. Even when NIS and TPO expression was observed in tumoral tissues it was consistently decreased with respect to normal tissues in majority of cases studied. Our data indicate that the frequency of NIS protein expression in differentiated thyroid cancer may be higher that that reported in previous studies; and that TPO protein although detected in minority of cancer tissues by immunohistochemical staining with mAb#47, when analyzed by immunmoblot with the same antibody is expressed in most of epithelial thyroid tumors however to variable extent. Grant CMKP 501 – 1– 1– 01 – 01/ 99 501 MATERIAŁY ZJAZDOWE Sesja 3 Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Wiench M1, Krawczyk A1, Lisowska K2, Jarząb B1 Wiench M1, Krawczyk A1, Lisowska K2, Jarząb B1 Badanie profilu ekspresji genów w raku brodawkowatym tarczycy Gene expression profiling in papillary thyroid carcinoma 1 1 MATERIAŁY ZJAZDOWE 2 Zakład Medycyny Nuklearnej i Endokrynologii Onkologicznej, Zakład Biologii Nowotworów, Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Sklodowskiej-Curie, Gliwice 2 Department of Nuclear Medicine and Endocrine Oncology, Department of Tumor Biology, Center of Oncology - Maria Skłodowska-Curie Memorial Institute, Gliwice t Praca przedstawia wstępne wyniki pierwszych analiz profilu ekspresji genów metodą mikromacierzy DNA w raku brodawkowatym tarczycy. t The study presents preliminary results of the gene expression profiling experiments by the use of DNA microarray technique. Analizie poddano trzy tkanki raka brodawkowatego tarczycy oraz trzy tkanki zdrowej tarczycy od tych samych osób. Tkanki zostały pobrane śródoperacyjnie i natychmiast zamrożone. Całkowity RNA izolowano odczynnikiem TRIZOL (Gibco BRL), a następnie oczyszczano (RNeasy Total RNA Mini Kit + DNaza I, Qiagen). Próbki hybrydyzowano z mikromacierzą U95A ver.2 firmy Affymetrix oraz znakowano kompleksem streptawidyna-fikoerytryna. Intensywność fluorescencji analizowano w czytniku HP GeneArray Scanner G2500A. Ilość oraz jakość całkowitego RNA, cDNA i cRNA sprawdzano poprzez analizę spektrofotometryczną i elektroforezę w żelu agarozowym. W badanych tkankach nowotworowych nie wykazano obecności rearanżacji RET/PTC metodą RT-PCR. Three samples of papillary thyroid carcinomas (PTC), verified by a pathological examination, together with the corresponding normal tissues were deep-frozen immediately after excision. Total RNA was isolated with TRIzol (GibcoBRL) and then repurificated with RNeasy Total RNA Mini Kit + DNase I treatment (Qiagen). The samples were hybridized to the U95A ver.2 array (Affymetrix) and stained with streptavidin phycoerythrin conjugate. The intensity of fluorescence was measured with HP GeneArray Scanner G2500A. The amount and quality of total RNA, cDNA and cRNA were controlled by spectrophotometric analysis and agarose gel electrophoresis. All tumor samples were negative for RET gene rearrangements. Analizę otrzymanych wyników przeprowadzano przy pomocy programów MicroArray Suite 4.0 (Affymetrix) i DNA-Chip Analyzer (dChip). W celu wyselekcjonowania genów, których różnice w ekspresji pomiędzy tkanką guza a tkanką zdrową były najbardziej interesujące wyniki poddano filtrowaniu, przy następujących założeniach: ekspresja zwiększona/ zmniejszona w tkance guza, stosunek zwiększenia/ zmniejszenia ekspresji wynosił 0,5 ze średnią różnicą >500 lub <500 i krotnością zmiany >2,5 lub <2,5. Jedna para: guz-tkanka zdrowa została wykluczona z analizy ze względu na dużą heterogenność guza (tkanki te różniły się ekspresją jedynie 8 genów). W pozostałych przypadkach różną ekspresję zaobserwowano w przypadku 164 i w 236 genów. Spośród genów, których ekspresja była zwiększona, szczególną uwagę zwrócono na geny SSX, które należą do grupy genów jądrowo-specyficznych i których rearanżacje są charakterystyczne dla maziówczaków. Niemniej, metodą RTPCR ekspresję genu SSX4 wykazano jedynie w jednej z 20 analizowanych próbek raka brodawkowatego, a genu SSX2 – w żadnym przypadku. Spośród genów, których ekspresja była obniżona w badaniu metodą mikromacierzy, najsilniejszy spadek ekspresji w tkance raka dotyczył genu peroksydazy tarczycowej. Wstępne badania przeprowadzone przy pomocy metody mikromacierzy DNA wskazują na potrzebę dalszej analizy roli genów SSX w kancerogenezie raka tarczycy i potwierdzają dotychczasowe obserwacje, iż utrata ekspresji genu dla peroksydazy tarczycowej w zróżnicowanym raku tarczycy jest większa niż w przypadku innych tarczycowo-swoistych genów. 502 The analyses were performed with MicroArray Suite 4.0 and DNA-Chip Analyzer (dChip) softwares. The filtering of genes was applied to identify specific genes of interest. We took into consideration only those genes of which expression was increased or decreased in cancer tissue, the increased and decreased ratios were above 0.5, with average difference >500 or <500 and fold change >2.5 or <2.5. One pair of cancer tissue and normal tissue had to be excluded because of the heterogeneity of the tumor (the samples differed in the expression of eight genes only). In two remaining cases 164 and 236 genes had changed expression in tumor tissue in comparison to normal thyroid. Among genes of which expression was most significantly increased there were SSX genes (which belong to testis-specific genes and which rearrangements were described in synovial sarcomas). However, we were not able to confirm those results by the RT-PCR: the expression of SSX4 was detected in one out of 20 analyzed PTC samples, SSX2 – in none of them. Among genes of which expression was decreased in cancer tissues the most significant change was observed in thyroid peroxidase gene. Our preliminary microarray analysis indicates a necessity of further analysis of SSX genes’ role in papillary thyroid carcinogenesis and confirms that the loss of thyroid peroxidase gene expression in differentiated thyroid cancer is much more distinct than of other thyroid-specific genes. Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Krawczyk A1, Handkiewicz-Junak D1, Chmielik E2, Wiench M1, Gubała E1, Jarząb B1 Krawczyk A1, Handkiewicz-Junak D1, Chmielik E2, Wiench M1, Gubała E1, Jarząb B1 Ekspresja genu kodującego kalcytoninę w bioptatach węzłów chłonnych u chorych na raka rdzeniastego tarczycy Expression of calcitonin coding gene in the lymph nodes of patients with medullary thyroid carcinoma 1 1 Zakład Medycyny Nuklearnej i Endokrynologii Onkologicznej, Zakład Patologii Nowotworów, Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Sklodowskiej-Curie, Gliwice t Rak rdzeniasty tarczycy (RRT) jest nowotworem wywodzącym się z komórek okołopęcherzykowych tarczycy (komórki C), produkujących kalcytoninę. Gen kodujący kalcytoninę w warunkach fizjologicznych ulega ekspresji wyłącznie w tych komórkach. Jego ekspresja jest również zachowana w komórkach raka rdzeniastego tarczycy oraz w jego przerzutach i dlatego kalcytonina stosowana jest jako marker biochemiczny w monitorowaniu RRT. Celem pracy jest opracowanie metody wykrywania komórek raka rdzeniastego tarczycy w węzłach chłonnych poprzez wykrywanie transkryptów genu dla kalcytoniny metodą RT-PCR i porównanie uzyskanych wyników z wynikami klasycznego badania cytologicznego. Dotychczas przebadano 26 bioptatów pobranych z węzłów chłonnych (szyjnych i nadobojczykowych) od 16 pacjentów leczonych w Instytucie Onkologii w latach 2000-2002. U wszystkich pacjentów po leczeniu operacyjnym potwierdzono rozpoznanie raka rdzeniastego tarczycy w badaniu histopatologicznym. Grupę kontrolną stanowiło 30 chorych na inne nowotwory (zróżnicowane raki tarczycy, nowotwory innych narządów) oraz nienowotworowe choroby tarczycy. Materiał uzyskiwano w trakcie biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej wykonywanej pod kontrolą USG. Do badań wykorzystywano pozostałości z igły biopsyjnej po pobraniu materiału do badania cytologicznego, co pozwala na bezpośrednie porównanie obu metod. Z próbek izolowano RNA zestawem RNeasy Mini Kit (Qiagen), preparaty trawiono DNazą I (Qiagen), a następnie dokonywano odwrotnej transkrypcji (cDNA Cycle Kit, Invitrogen). Uzyskany cDNA używano jako matrycę do reakcji PCR. Jednocześnie przeprowadzano reakcję RT-PCR dla referencyjnego genu GAPDH. W grupie kontrolnej nie wykryto obecności mRNA dla kalcytoniny w żadnym wypadku. Ekspresji genu dla kalcytoniny nie stwierdzono również w 11 badanych próbkach, w których nie wykryto przerzutów raka w badaniu cytologicznym. Wynik dodatni reakcji RT-PCR zaobserwowano natomiast w 7 z 15 bioptatów, w których po wykonaniu tradycyjnego rozmazu cytologicznego wykryto obecność komórek nowotworowych. Tak więc dotychczas uzyskane wyniki wskazują na niezadowalającą czułość opracowanej metody (46,67%) przy dobrej swoistości (100%). W dalszej części pracy planowane jest powiększenie grupy badanej oraz grupy kontrolnej oraz określenie czułości metody przez prowadzenie badań na komórkach pochodzących z linii wyprowadzonych od chorych na raka rdzeniastego. 2 Department of Nuclear Medicine and Endocrine Oncology, Department of Pathology, Center of Oncology – Maria Skłodowska-Curie Memorial Institute, Gliwice t Medullary thyroid carcinoma (MTC) derives from parafollicular cells of the thyroid (C cells) which produce calcitonin. In normal conditions these are the only cells which express CT gene. Expression of this gene takes place also in the MTC cells and in its metastases. This is the reason why calcitonin is used as a biochemical marker of disease progression. The aim of this study is to establish a method of detecting MTC cells in the lymph nodes by detecting calcitonin mRNA transcript and comparing the results with the results of cytology. Material: 26 samples obtained from lymph nodes (cervical and supraclavicular) of 16 patients monitored in the Institute of Oncology in the years 2000-2002. All patients had MTC diagnosed histopathologically after surgery. The control group consisted of 30 patients with tumors other than MTC (differentiated thyroid cancer, tumors of other organs) and other diseases of the thyroid. Material was obtained during the USG-guided fine needle aspiration biopsy (FNAB). We have used the leftover cells from FNAB needle in the examination, so it was possible to compare both methods. RNA was isolated by the use of RNeasy Mini Kit (Qiagen) together with DNase I digestion (Qiagen). The reverse transcription was carried out by the use of cDNA Cycle Kit (Invitrogen). cDNA was subsequently used in the polymerase chain reaction (PCR). PCR was also carried out for GAPDH gene (referring gene). In the control group mRNA for calcitonin was detected in none of the samples. Expression of calcitonin gene was also not observed in 11 samples, which were cytologically negative. The positive result of RT-PCR was observed in 7 samples from 15 samples cytologically positive. It means that the sensitivity of our method is not yet satisfactory (46.67%), but the specificity is good (100%). In the future we intend to examine more samples from MTC patients and the control group. We also plan to evaluate the sensitivity of the method by use of cell lines derived from medullary thyroid carcinoma. 503 MATERIAŁY ZJAZDOWE 2 Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Czyż W1, Kołomecki K1, Pasieka Z1, Balcerczak E2, Rudowicz M2, Jakubiak M3, Kuzdak K1, Mirowski M2 Ocena ekspresji genu HMGI(Y) w nowotworach pęcherzykowych tarczycy z zastosowaniem metody RT-PCR 1 2 MATERIAŁY ZJAZDOWE 3 Klinika Chirurgii Endokrynologicznej i Ogólnej Instytutu Endokrynologii A.M w Łodzi Pracownia Biologii Molekularnej Zakładu Biochemii Farmacji A.M w Łodzi Zakład Patologii Wojewódzkiego Szpitala Specjalistycznego im. M. Kopernika w Łodzi t HMGI(Y) jest niehistonowym białkiem zawartym w jądrze komórkowym. Związane jest ono z regulacją struktury i funkcji DNA. Białko to jest nieobecne w prawidłowych tkankach, podczas gdy występuje w tkankach w czasie rozwoju embrionalnego i w komórkach nowotworów złośliwych. Celem pracy była ocena ekspresji genu HMGI(Y) w komórkach pochodzących z gruczolaków pęcherzykowych i raków pęcherzykowych tarczycy oraz tkankach gruczołu tarczowego bez cech wymienionych nowotworów. Badaniom poddano chorych z pooperacyjnym rozpoznaniem histopatologicznym 20 gruczolaków i 42 raków pęcherzykowych tarczycy. Grupę kontrolną stanowili chorzy z rozpoznaniem wola koloidowego, bez cech nowotworów pęcherzykowych. Wszyscy chorzy poddani zostali leczeniu chirurgicznemu w latach 1999 – 2001 w Klinice Chirurgii Endokrynologicznej i Ogólnej Instytutu Endokrynologii A.M. w Łodzi. Chorzy z rozpoznaniem raka pęcherzykowego zostali podani całkowitemu usunięciu gruczołu tarczowego i wybranych przedziałów węzłów chłonnych, a chorzy z rozpoznaniem gruczolaka pęcherzykowego prawie całkowitemu usunięciu tarczycy. Chorzy z rozpoznaniem zmiany złośliwej mieścili się według klasyfikacji TNM w przedziale: pT1N0,M0 – pT1N1M0. Wiek chorych z rozpoznaniem raka wahał się od 28 do 69 lat (średnio: 39), a rozpoznaniem gruczolaka pęcherzykowego od 33 do 61 lat (średnio: 44). Tkanki pobierane do badań śródoperacyjnie były natychmiast zamrażane do temperatury -800C. Po ich rozmrożeniu wyodrębniono i analizowano RNA używając techniki RT-PCR. Tkanki wszystkich chorych z rozpoznaniem raka pęcherzykowego tarczycy ujawniły ekspresję genu HMGI(Y), podczas gdy chorzy z rozpoznaniem gruczolaka i wola koloidowego takiej ekspresji nie wykazały. Ocena ekspresji genu HMGI(Y) może być pomocna w różnicowaniu nowotworów pęcherzykowych tarczycy. Czyż W1*, Kołomecki K1, Pasieka Z1, Balcerczak E2, Rudowicz M2, Jakubiak M3, Kuzdak K1, Mirowski M2 Assessment of the HMGI (Y) gene expression in thyroid follicular neoplasm with use of RTPCR method 1 Department of Endocrinological and General Surgery, Medical University of Lodz, Poland 2 Department of Pharmaceutical Biochemistry, Molecular Biology Laboratory, Medical University of Lodz, Poland 3 Department of Pathology, Copernicus Memorial Hospital in Łódź t The nuclear non-histone protein HMG (Y) is involved in regulation of DNA structure and function. In normal 504 tissue there is no evidence of expression of these proteins in contrast with embryo cells and malignant tissue lesions. The aim of present study was to investigate HMGI (Y) gene expression in normal, hyperplastic and malignant thyroid tissue. There were analyzed 20 thyroid follicular adenomas, 42 thyroid follicular carcinomas. All patients underwent surgery in 1999 – 2001 years in Endocrinological Surgery Department of Medical University in Łódź. The standard procedure in malignant lesions was thyreoidectomy with elective excision of regional lymph nodes and in benign tumors subtotal strumectomy was performed. According to TNM classification malignant tumors were clustered from pT1N0M0 to pT2N1M0. Age of patients with thyroid follicular carcinoma ranged from 18 to 69 years (mean 39) and patients with thyroid follicular adenoma ranged from 33 to 61 years (mean: 44). Tissue samples, which have been taken during the operation, were immediately deeply frozen for RNA extraction. HMGI (Y) gene expression was analyzed by RT-PCR technique. All thyroid carcinomas showed expression of HMGI (Y) whereas thyroid follicular adenomas and control tissues were negative. Assessment of HMGI (Y) gene expression may be helpful in distinguishing of follicular thyroid neoplasms. Kołomecki K, Stępień H1, Czyż W, Stępień T, Kuzdak K Ocena stężenia czynników adhezyjnych u chorych z guzami nadnercza nieczynnymi hormonalnie (incidentaloma) Klinika Chirurgii Endokrynologicznej i Ogólnej 1 Zakład Diagnostyki Hormonalnej Instytutu Endokrynologii Akademii Medycznej w Łodzi t Wiele doniesień naukowych z ostatnich lat podnosi problem znaczenia czynników adhezyjnych w rozwoju choroby nowotworowej. Wydaje się, że czynnikami, które pełnią bardzo ważną rolę w tym procesie są czynniki immunoglobulinopodobne: komórkowy (ICAM) i naczyniowy (VCAM). Celem pracy była ocena stężenia rozpuszczalnych postaci tych czynników we krwi u chorych z guzami nadnercza nieczynnymi hormonalnie (tzw. incidentaloma), łagodnymi i złośliwymi. Badaniami objęto grupę 12 chorych z rakami kory nadnercza oraz 22 chorych z łagodnym gruczolakiem kory. Grupę kontrolną stanowiło 10 zdrowych ochotników. Wykonano oznaczenie, metodą ELISA, sVCAM-1 i sICAM-1 we krwi chorych. Uzyskano następujące wyniki (wszystkie wyniki podane są w ng/ml). sVCAM sICAM Raki kory nadnercza 1159,7 589,0 Gruczolaki kory nadnercza 567,2 398,9 Grupa kontrolna 642,0 301,0 Stwierdzono istotnie statystycznie (p<0,01) większe stężenie we krwi obydwu badanych czynników u chorych z rakiem kory nadnercza niż u chorych z gruczolakiem kory nadnercza i osób z grupy kontrolnej. Uzyskane dane sugerują, że immunoglobulinopodobne czynniki adhezyjne mogą odgrywać rolę w rozwoju raków kory nadnercza i tym samym mogą być ewentualnie traktowane jako marker złośliwości guzów kory nadnercza nieczynnych hormonalnie. Kołomecki K, Stępień H*, Czyż W, Stępień T, Kuzdak K The estimation of concentration of chosen adhesive factors with adrenal tumours „incidentaloma” 2. Department of Endocrine and General Surgery, *Department of Hormonal Diagnostics Institute of Endocrinology, Medical University of Łódź t Many of medical papers originated from the last few years, arise the problem of adhesive molecules in the development of neoplasmatic disease. These factors are: immunoglobulinlike factors – ICAM and VCAM. The aim of this work estimated the concentration of these factors in blood at the patients with tumour of adrenal glands inactive hormonally like “incidentaloma” malignant or benign. Researches included: a group of 12 patients with cancer of adrenal cortex, a group of 22 patients with benign adenoma of adrenal cortex and a control group of good health people. The concentration of factors sVCAM-1 and sICAM-1 in the blood was made by means of ELISA assay. All values are presented in ng/ml. Reached the following results: sVCAM-1 sICAM-1 Adrenal cortical carcinoma 1159.7 589.0 Adrenal cortical adenoma 567.2 398.9 Control group 642.0 301.0 It was estimated a indeed higher concentration of investigated adhesive factors among the patients of adrenocortical carcinoma in comparison of patients suffered from benign adrenocortical adenoma and controlled group (p<0.01). These results suggest that adhesive factors ICAM and VCAM fulfill a serious role in development of adrenocortical carcinoma. Słowikowska-Hilczer J, Kula K, Aspekty molekularne przedinwazyjnego raka jądra: badania immunihistochemiczne i hormonalne Dział Andrologii i Endokrynologii Płodności, Instytut Endokrynologii Akademii Medycznej W Łodzi t Badano 40 pacjentów z dysgenezją gonad (DG) i 6 z hermafrodytyzmem prawdziwym w wieku od 3 miesięcy do 19 lat. 1. Antygeny płodowe i kariotyp. Swoisty dla płodowych komórek płciowych oraz komórek inwazyjnego i przedinwazyjnego raka jądra (carcinoma in situ – CIS) antygen fosfatazy alkalicznej typu łożyskowego (PLAP) obecny był w gonadach u 61,5% pacjentów z DG i u 16,7% pacjentów z hermafrodytyzmem 3. 4. 5. prawdziwym. Biorąc pod uwagę kariotyp, CIS stwierdzano częściej u pacjentów z 46,XY (70,4% przypadków) niż w przypadkach z aberracjami liczbowymi i strukturalnymi chromosomów płciowych (40%). Wskazuje to, że CIS rozwijać się może przy DG bez zmian liczbowych i strukturalnych chromosomów płciowych. Antygeny TRA-1-60 i M2A obecne były tylko w okresie dziecięcym, co wskazuje, że wraz z wiekiem zmieniają się właściwości antygenowe komórek CIS. Marker ekspresji genów regionu AZF-b chromosomu Y. Białko kodowane przez RNA-binding motif chromosomu Y (RBM) obecne jest tylko w prawidłowych płodowych i dojrzałych komórkach plemnikotwórczych. Przy DG komórki CIS, które były PLAP+, były równocześnie RBM-. RBM- były również te komórki CIS, które były PLAP-. Wskazuje to, że komórki CIS zarówno PLAP+ jak i PLAP- są nowotworowymi komórkami płciowymi. Aneuploidyzacja i potencjał proliferacyjny. Potwierdzenie, że komórki CIS są komórkami nowotworowymi uzyskano poprzez pomiary DNA. Stwierdzono, że 42-97% komórek CIS ma aneuploidalną zawartość DNA. Ekspresja proliferating cell nuclear antigen (PCNA) występowała w 53-62% komórek CIS, co wskazuje na ich dużą aktywność proliferacyjną. Komórki Sertoliego przy CIS. Cytokeratyna-18 (CK18) i hormon antymüllerowski (AMH) są markerami niedojrzałych komórek Sertoliego. U dzieci z DG stwierdzono cechy typowe dla wieku. Większość komórek wykazywała ekspresję AMH, ale ekspresję CK-18 stwierdzano w pojedynczych komórkach. Obecność wimentyny wskazuje na mezenchymalne pochodzenie komórki. Wszystkie komórki Sertoliego wykazywały ekspresję wimentyny. CIS a hormony. Obecności CIS towarzyszyło obniżenie wydzielania testosteronu, a podwyższenie wydzielania gonadotropin u dzieci. Poziomy FSH i LH dodatnio korelowały z liczebnością komórek CIS. Prawdopodobnie utrzymywanie i namnażanie CIS już w okresie przeddojrzewaniowym zależą od FSH, a sprzyja temu obniżona biosynteza testosteronu. Słowikowska-Hilczer J, Kula K, Molecular aspects of preinvasive testicular carcinoma: immunohistochemical and hormonal studies Department of Andrology and Reproductive Endocrinology, Instit. Of Endocrinol., Medical University of Łódź t 40 patients with gonadal dysgenesis (GD) and 6 with true hermaphroditism, aged 3 months to 19 tears, were studied. 1. Fetal antigens and karyotype. Placental like alkaline phosphatase (PLAP) antigen, which is specific for fetal germ cells, invasive and preinvasive testicular germ cell cancer (carcinoma in situ – CIS), was present in gonads of 61.5% patients with GD and 16.7% of patients with true hermaphroditism. According to karyotype, CIS was found more frequently in patients with 46,XY karyotype (70.4% of cases) than in patients with numerical and structural aberrations of sex chromosomes (40%). This indicates that CIS 505 MATERIAŁY ZJAZDOWE Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE 2. 3. 4. MATERIAŁY ZJAZDOWE 5. can develop in GD without numerical and structural aberrations of sex chromosomes. TRA-1-60 and M2A antigens are present only in childhood what indicates features of CIS cells change with the progression of age. Gene expression of AZF-b region of Y chromosome. Protein encoded by RNA-binding motif of Y chromosome (RBM) is present only in normal fetal and mature germ cells. In GD patients CIS cells that were PLAP+ they simultaneously were RBM-. RBM- were also these CIS cells which were PLAP-. This indicates that both PLAP+ and PLAP- CIS cells are neoplastic germ cells. Aneuploidisation and proliferation. The neoplastic character of CIS cells was confirmed by DNA measurements. 42-97% of CIS cells was found to have aneuploid DNA pattern. Expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was revealed in 53-62% of CIS cells, what indicates their high proliferative activity. Sertoli cells in CIS. Cytokeratin-18 (CK-18) and antimüllerian hormone (AMH) are the markers of immature Sertoli cells. In children with GD the specific for the age features were found i.e. most of Sertoli cells revealed AMH expression, but the expression of CK18 was found in single cells. The presence of vimentin indicates the mesenchymal origin of the cell. All Sertoli cells revealed the expression of vimentin. CIS and hormones. In children with GD the presence of CIS was accompanied by decreased secretion of testosterone and increased secretion of gonadotropins. Quantitive study of germ cells showed that the levels of FSH an LH positively correlates with the number of CIS cells. Maintenance and proliferation of CIS cells may depend on the secretion of FSH already in Prebulteral period of life. The decreased biosynthesis of testosterone associated with impaired organogenesis of sex cords may be favorable for these processes. 39 chorych na inne nowotwory (45 węzłów). Reakcję RT-PCR wykonywano z materiału pozostałego w igle po wykonaniu tradycyjnego rozmazu cytologicznego. Obecność mRNA oceniano dla tyreoglobuliny stosując startery obejmujące eksony 3-5 i 39 cykli reakcji po trawieniu DNA-zą. Kontrolę izolacji RNA i amplifikacji cDNA przeprowadzono stosując startery dla GADPH. Wyniki: W pierwszym badaniu cytologicznym rozpoznano przerzuty do węzłów chłonnych u 52 chorych na ZRT. W 50 przypadkach wykonane równoległe badanie RT-PCR dało wynik dodatni. Badanie to było również dodatnie u 7 innych chorych, u których wynik badania cytologicznego był ujemny. Te wyniki traktowano początkowo jako wyniki fałszywie dodatnie, a chorych tej grupy poddano dalszej wnikliwej analizie. W toku dalszej obserwacji u trzech chorych rozpoznano przerzuty do węzłów chłonnych. Przy czym prawdziwie dodatni wynik badania RT-PCR wyprzedzał cytologiczne rozpoznanie przerzutu o 5-10 miesięcy. U pozostałych 4 chorych dotychczasowa obserwacja, trwająca kilka miesięcy, nie wskazuje na wznowę raka. W grupie kontrolnej w 10 badaniach uzyskano cytologiczne rozpoznanie przerzutu innego nowotworu niż ZRT, a w 35 przypadkach badanych węzłów wynik badania cytologicznego był ujemny, niemniej we wszystkich próbkach tej grupy nie wykazano ekspresji mRNA dla Tg. W posumowaniu, czułość RT-PCR określono wobec badania cytologicznego na 96%, a swoistość na 97%. Wnioski: Metoda RT-PCR Tg wykazuje dobrą czułość i wystarczającą swoistość i może być zastosowana w diagnostyce wczesnych przerzutów nowotworowych zróżnicowanych raków tarczycy do węzłów chłonnych. Dodatni wynik badania molekularnego kwalifikuje chorego do grupy wysokiego ryzyka. Gubała E1, Handkiewicz-Junak D1, Zeman M2, Chmielik E3, Wiench M1, Wołoszańska K3, Jarząb B1 Sesja 4 1 1 2 Gubała E , Handkiewicz-Junak D , Zeman M , Chmielik E3, Wiench M1, Wołoszańska K3, Jarząb B1 RT-PCR molecular techique of the detection of thyroid cancer nodular resistance 1 Department of Nuclear Medicine and Endocrine Oncology, Clinic of Oncologic Surgery, 3 Department of Tumor Pathology, Center of Oncology, Maria Skłodowska-Curie, Memorial Institute, Gliwice Branch 2 RT-PCR – technika molekularna wspierająca wykrywanie wznowy węzłowej raka tarczycy 1 2 3 Zakład Medycyny Nuklearnej i Endokrynologii Onkologicznej, Klinika Chirurgii Onkologicznej, Zakład Patologii Nowotworów, Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie, Oddział w Gliwicach Cel pracy: Komórki zróżnicowanych raków tarczycy (ZRT) zachowują zdolność zdrowych tyreocytów do produkcji tyreoglobuliny (Tg). Wykrycie mRNA dla Tg w węzłach chłonnych szyi jest więc dowodem obecności przerzutów raka tarczycy. Zastosowanie techniki molekularnej – odwrotnej transkrypcji reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR) do wykrywania ekspresji genu dla Tg może stanowić badanie uzupełniające klasyczną cytologię. Celem pracy była ocena przydatności oznaczania mRNA tyreoglobuliny dla wczesnego wykrywania przerzutów ZRT do węzłów chłonnych szyi. Materiał i metodyka: Badaniem objęto 125 chorych na ZRT (174 węzły chłonne). Grupę kontrolną stanowiło 506 t In patients with a suspicion of differentiated thyroid cancer lymph node recurrence, detection of thyroglobulin (Tg) mRNA in fine needle biopsy material may support the interpretation of classical cytological examination in cases where it fails to detect lymph node involvement early enough. Aim: Prospective study of thyroglobulin mRNA detection in neck lymph nodes in patients with suspected differentiated thyroid cancer metastases. Material: 174 nodes from 125 patients with suspected DTC recurrence were investigated. Patients (39) with suspicion of lymph node metastases of other types of cancer were included as a control group. Thyroglobulin RT-PCR was conducted in residual material left after preparation of cytological smears from fine needle biopsy specimens. Primer spanning exons 3-5 were used with 39 cycles of PCR. RNA isolation control and cDNA amplification were carried out using GAPDH starters Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Supported by the Polish State Committee of Scientific 4PO5B 043 19. Pasieka Z, Kuzdak K, Czyż W, Stępień H, Komorowski J Cytokinowe cząsteczki adhezyjne (SVCAM1, SICAM-1) we krwi u chorych z rakiem tarczycy Instytut Endokrynologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi t Proces nowotworowy jest zjawiskiem złożonym i zależy od wielu mechanizmów uruchamiających uwalnianie różnych mediatorów regulujących czynność układu odpornościowego jak i powstawanie nowych naczyń krwionośnych (angioinwazja). Celem pracy była ocena przydatności klinicznej pomiarów niektórych czynników adhezji komórkowej w krwi żylnej u chorych z rakiem tarczycy. Badaniami objęto 48 pacjentów (38 kobiet i 10 mężczyzn; wiek: 53,69 ± 16,23 lata) z rozpoznanym rakiem tarczycy w aspiratach z biopsji cienkoigłowej, u których przed operacyjnym usunięciem gruczołu tarczowego pobierano krew żylną dla oceny cytokinowych czynników adhezji (sVCAM-1, sICAM-1). Wyniki stężeń badanych cytokin konfrontowano z ostatecznym rozpoznaniem histopatologicznym typu nowotworu (grupa z rakiem brodawkowatym – 35; z rakiem oksyfilnym – 5; z rakiem anaplastycznym – 4; z rakiem rdzeniastym – 4 przypadki). Grupę kontrolną stanowiło 26 zdrowych ochotników (18 kobiet i 8 mężczyzn; wiek: 26,59 ± 1,47 lat). Stężenia cVCAM-1 i sICAM-1 w surowicy krwi oceniano metodą ELISA (R&D Systems, USA). Zwiększone stężenia sICAM-1 (p<0,05) ujawniono we wszystkich badanych grupach osób z rakiem tarczycy (rak brodawkowaty: 455,23 ± 28,66 vs. 299,62 ± 11,54 ng/ml; rak oksyfilny: 455,60 ± 95,21 ng/ml; rak anaplastyczny: 570,00 ± 170,89 ng/ml; rak rdzeniasty: 512,00 ± 11,46 ng/ml). Stwierdzono natomiast podwyższone stężenia sVCAM-1 tylko u chorych z rakiem anaplastycznym (1033,75 ± 86,30 vs. 644,58 ± 27,30 ng/ ml; p<0,05). Podwyższenie stężeń niektórych czynników adhezyjnych we krwi żylnej u chorych z rakiem tarczycy może wskazywać na złe rokowanie dla życia chorego. Pasieka Z, Kuzdak K, Czyż W, Stępień H, Komorowski J Soluble intracellular adhesion molecules (SICAM-1, SVCAM-1) in peripheral blood of thyroid cancer patients Institute of Endocrinology, Medical University of Łódź t The growth of a neoplasm and its ability to form metastases is a multistep process dependent on angiogenesis and immunological reactions of the organism. In this process adhesive factors are also involved. The aim of this work was estimation of the concentration of soluble intercellular adhesion molecules (sICAM1) and vascular cellular adhesion molecules (sVCAM-1) in the serum of peripheral blood of patients with thyroid cancer before operation. The study comprised 48 patients (38 women and 10 men; aged from 18 to 87 years; 53.69 ±16.23) in whom thin needle aspiration biopsy revealed cancer of the thyroid. Postoperative histopathological examination showed papillary cancer in 35 patients, oxyphilic cancer in 5 patients, anaplastic cancer in 4 and medullary cancer in 4 patients. In those patients, using the immunoenzymatic method ELISA, the concentration of sICAM-1 and sVCAM-1 in the serum of peripheral blood was determined. The control group comprised 26 healthy persons (18 women and 8 men; aged from 21 to 44 years; 26.59 ± 1.47). We have found statistically significant increase of sICAM-1 concentration in serum in all forms of cancer, in comparison with the control group. Mean concentrations of sICAM-1 were as follows: in papillary cancer patients 455.23 ± 28.66 vs. 299.62 ± 11.54 ng/ml, p< 0.05; in oxyphilic cancer 455.60 ± 95.21 vs. 299.62 ± 11.54 ng/ml, p<0.05; in anaplastic cancer 570.00 ± 170.89 vs. 299.62 ± 11.54 ng/ml, p<0.05; and in medullary cancer 512.00 ± 11.46 vs. 299.62 ± 11.54 ng/ml, p<0.05. The mean concentration of sVCAM-1 in serum was statistically significantly higher than in the control group only in case of anaplastic cancer (1033.75 ± 86.30 vs. 644.58 ± 27.30 ng/ml; p<0.05). The obtained results confirm essential role of the investigated adhesive factors in the process of thyroid cancer growth. Krześlak A1, Pomorski L2, Gaj Z1, Lipińska A1 Czy glikoproteiny komórkowe mogą być markerem diagnostycznym odróżniającym nowotwory łagodne tarczycy od złośliwych? 1 2 Katedra Cytobiochemii Uniwersytetu Łódzkiego, Klinika Chirurgii Endokrynologicznej i Ogólnej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, Wstęp: Transformacja nowotworowa prowadzi do głębokich zmian komórkowej glikozylacji. Wspólną cechą większości komórek nowotworowych jest zwiększenie rozgałęzień N-glikozydowo przyłączonych do białek oligosacharydów. Znaczna korelacja między zmianami w glikozylacji białek i klinicznymi prognozowaniami sugeruje, że analiza glikoprotein komórkowych 507 MATERIAŁY ZJAZDOWE Results: Classical cytology confirmed nodal involvement in 52 of DTC patients, RT-PCR Tg was positive in 50 of them. Among 70 patients with a suspicion of DTC recurrence and negative cytology, Tg mRNA was found in seven cases. Three positive RT-PCR results were confirmed by repeated cytology conducted 5-10 months later and followed by surgery. No positive result of RTPCR was obtained with other head and neck malignancies. Conclusions: RT-PCR Tg shows sufficient specificity to be applied in further studies estimating its usefulness in fine needle biopsy for early detection of lymph node metastases in differentiated thyroid cancer. MATERIAŁY ZJAZDOWE Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE może być jednym z podejść metodycznych służących ulepszeniu diagnozowania nowotworów. Celem pracy była analiza porównawcza glikoprotein cytosolowych nowotworów łagodnych oraz złośliwych tarczycy. Materiał i metody: Badaniami objęto 13 przypadków gruczolaka pęcherzykowego, 5 – raka pęcherzykowego, 14 – raka brodawkowatego oraz 2 przypadki raka anaplastycznego. Kontrolę stanowiło 14 przypadków zmian nienowotworowych tarczycy. Do analizy glikoprotein zastosowano lektynę z koralodrzewu (Erythrina cristagalli agglutinin – ECA, specyficznie rozpoznającą reszty galaktozy połączone wiązaniem α 1,4 z N-acetyloglukozaminą) oraz lektynę z rącznika pospolitego (Ricinus communis agglutinin – RCA-120, wykazującą specyficzność względem terminalnych reszt galaktozy). Identyfikację glikoprotein cytosolowych przyłączających ECA przeprowadzono metodą immunodetekcji zastosowaną po uprzednim rozdziale białek techniką jednowymiarowej elektroforezy w płytkach 8% żelu poliakrylamidowego zawierającego sól sodową kwasu dodecylosulfonowego i elektrotransferze na membrany Immobilonu-P. Do analizy ilościowej glikoprotein cytosolowych wiążących ECA i RCA-120 zastosowano metodę ELLSA (ang. enzyme linked lectino-solid-phase assay – płytkowy test immunoenzymatyczny fazy stałej z wykorzystaniem lektyn). Wyniki: Główne glikoproteiny cytosolowe badanych preparatów przyłączające ECA charakteryzowały się masami cząsteczkowymi (m.cz.) 40 i 50 kDa oraz w zakresie 72-140 kDa.. Stwierdzono występowanie różnic jakościowych i ilościowych wśród glikoprotein o m. cz. w przedziale 72-140 kDa. Intensywność natężenia barwy pasm odpowiadających glikoproteinom o m.cz. 72 i 140 kDa była wyższa w przypadku zmian nienowotworowych i gruczolaków w porównaniu z rakami. Badania z wykorzystaniem metody ELLSA wykazały znaczące różnice ilościowe w wiązaniu ECA przez glikoproteiny frakcji cytosolowej nowotworów łagodnych oraz złośliwych tarczycy. Przyłączanie lektyny do glikoprotein w większości preparatów raka było wyraźnie słabsze niż w przypadku gruczolaków i zmian nienowotworowych. Analogiczne rezultaty uzyskano po zastosowaniu w metodzie ELLSA lektyny z rącznika. Wniosek: Wyniki otrzymane w toku wstępnej analizy glikoprotein komórek nowotworowych tarczycy, sugerują istnienie różnic w glikozylacji białek cytosolowych. Niewykluczone, że dokładniejsze poznanie tych różnic może mieć znaczenie praktyczne w diagnozowaniu nowotworów gruczołu tarczowego. Krześlak A1, Pomorski L2, Gaj Z1, Lipińska A1 Could cellular glycoproteins be a diagnostic marker differentiating benign from malignant thyroid neoplasms? 1 2 Department of Cytobiochemistry, University of Łódź, Department of Endocrinological and General Surgery, Medical University of Łódź, Introduction: Neoplastic transformation leads to profound alterations of cellular glycosylation. A common feature of most malignant cells is increased 508 branching of N-linked glycans of glycoproteins. Significant correlational patterns between altered glycosylation and clinical prognosis suggest that analysis of cellular glycoproteins can be one of the methodical tools useful for improvement of neoplasm diagnostics. The aim of this study was comparative analysis of cytosolic glycoproteins of benign and malignant thyroid neoplasms. Material and methods: The studies were performed on 13 specimens of follicular adenomas, 5 – follicular carcinomas, 14 – papillary carcinomas and 2 – anaplastic carcinomas. 14 cases of non-neoplastic specimens were used as a control. In cytosolic glycoproteins analysis, Erythrina cristagalli agglutinin (ECA, specifically recognizes galactose bound to N-acetylglucosamine by α 1,4 linkage) and Ricinus communis agglutinin (RCA120, specifically binds terminal galactose residues) were used. Identification of cytosolic glycoproteins binding ECA was performed by immunodetection method after separation of proteins in 8% polyacrylamide slab gels containing sodium dodecyl sulfate and electrotransfer onto Immobilon-P membranes. In quantitative analysis of cytosolic glycoproteins binding ECA and RCA-120 enzyme linked lectino-solid-phase assay (ELLSA) was used. Results: The main cytosolic glycoproteins binding ECA were characterized by molecular masses 40 and 50 kDa and in the range from 72 to 140 kDa. Qualitative and quantitative differences were observed among glycoproteins with molecular masses 72-140 kDa. The intensity of the bands corresponding to glycoproteins with molecular masses 72 and 140 kDa was higher in the case of non-neoplastic specimens and adenomas than in cancers. The studies using ELLSA method showed significant quantitative differences in ECA binding by cytosolic glycoproteins of benign and malignant carcinomas. In the case of majority samples of cancers lectin binding was definitely weaker in comparison with adenomas and non-neoplastic specimens. Similar results were obtained with use of RCA-120 in ELLSA method. Conclusion: The results of the preliminary analysis of glycoproteins from thyroid neoplastic cells suggest the presence of some differences between benign and malignant carcinomas. It is conceivable that more detailed knowledge of these differences may be of great importance for thyroid cancer diagnosis. Łącka K, Kwintkiewicz J1, Szarzyńska J, Wiktorowicz K,1 Majewski P,2 Gembicki M. Przydatność oznaczeń zawartości dna w różnicowaniu i prognozowaniu nowotworów tarczycy wywodzących się z komórki pęcherzykowej Katedra Endokrynologii, Przemiany Materii i Chorób Wewnętrznych; 1 Katedra Biologii i Ochrony Środowiska; 2 Katedra i Zakład Patomorofologii, Akademia Medyczna im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu t Badania ostatnich lat zmierzają do znalezienia skutecznego markera molekularno-genetycznego w różnicowaniu i w prognozowaniu nowotworów wywodzących się z komórki pęcherzykowej tarczycy. Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) K. Łącka1, J. Kwintkiewicz2, J. Szarzyńska3, K. Wiktorowicz2, P. Majewski4, M. Gembicki1 Usefulness of dna ploidy, selected proliferating markers and p53 estimation for differentiation and prognosis of thyroid neoplasms derived from follicles cells 1 Department of Endocrinology, Metabolism and Internal Diseases, K. Marcinkowski University of Medical Sciences, Poznań; Department of Biology and Environment Protection, K. Marcinkowski University of Medical Sciences, Poznań; 3 Outpatients Department, Poznań-Nowe Miasto; 4 Department of Pathomorphology, K. Marcinkowski University of Medical Sciences, Poznań 2 Abstract The purpose of this study was to analyze the correlation between clinical and histological characteristics of thyroid neoplasms derived from follicle cells and DNA content, p53 overexpression, and expression of selected proliferating markers such as: proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and nuclear antigen Ki-67. The DNA ploidy was investigated by flow cytometry. Overexpression of p53 protein, PCNA, and Ki-67 were analyzed by immunohistochemistry using paraffin blocks. Eighty four patients who underwent surgery were studied. Aneuploidy was indicated in 14/84 (16.7%) lesions. The percentage of aneuploid DI cases per category were: none of nodular goiter 0/30 (0%), 2/25 (8%) follicular adenoma, 9/26 (34.6%) well-differentiated carcinoma and 3/3 (100%) anaplastic carcinoma. DI value of all anaplastic carcinoma and 3/26 (11.5%) well-differentiated carcinoma was triploid, 6/26 (23.1%) well-differentiated carcinoma and 2/25 (8%) follicular adenoma was hyperdiploid/hypotriploid. Diploid DNA was observed in all cases of nodular goiter, 23/25 (92%) follicular adenoma and 17/26 (65.4%) well-differentiated carcinoma. Immunopositive reaction to p53 was present in all anaplastic carcinoma and 4/26 (15.4%) well-differentiated carcinoma (p<0.0045). PCNA and Ki67 immunostaining were found in each category. There is a noticeable increase in the frequency of the PCNA (p<0.001) and Ki-67 (p<0.0001), greater malignancy of lesions. Probability of aneuploidy is higher in malignant neoplasms. Key words: Thyroid neoplasms, Carcinoma, DNA ploidy, Proliferating markers (PCNA, Ki-67), p53 overexpression - Prognosis Sromek M, Wiśniewska A, Paszko Z, Jagielska A, Skasko E, Czapczak D, Czetwertyńska M, Kozłowicz–Gudzińska I, Prokurat A, Łyczek M, Kaniewski M, Stachlewska-Nasfeter E Podsumowanie czteroletnich badań nad występowaniem patogennych mutacji w genie RET u chorych na rdzeniastego raka tarczycy Centrum Onkologii w Warszawie i Centrum. Zdrowia Dziecka t Diagnostykę molekularną rdzeniastego raka tarczycy (RRT) podjęto w Centrum Onkologii w Warszawie w 1998 r. Przedmiotem obecnego doniesienia jest podsumowanie całości przeprowadzonych przez nasz zespół badań. Zbadano 87 chorych z rozpoznaniem RRT oraz spokrewnione z nimi 54 osoby. Materiałem badawczym było DNA izolowane z limfocytów krwi obwodowej. Metodą PCR powielano następujące eksony genu RET: 10, 11, 13, 14 i 16. Następnie poddawano je reakcji sekwencjonowania używając do tego fluorescencyjnie znakowanych deoksynukleotydów. Elektroforezę posekwencyjną wykonano aparatem ABI PRISM 377. Otrzymane wyniki badań przedstawiono w poniższej tabeli. Charakter i częstość mutacji występujących w genie RET u chorych na raka rdzeniastego tarczycy i u ich zdrowych krewnych. Lokalizacja Zmiana w sekwencji Ekson Kodon DNA Białko 10 609 Cys→Phe TGC→TTG Liczba mutacji Rodziny Chorzy Zdrowi 1 1 2 10 609 TGC→TAC Cys→Tyr 1 1 10 618 TGC→GGC Cys→Gly 1 1 2 10 620 TGC→GGC Cys→Gly 1 3 1 10 620 TGC→CGC Cys→Arg 1 2 - 11 634 TGC→CGC Cys→Arg 6 13 - 11 634 TGC→AGC Cys→Ser 1 1 - 13 791 TAT→TTT Tyr→Phe 4 4 9 14 804 GTG→TTG Val→Leu 2 2 - 16 918 ATG→ACG Suma Met→Thr 1 19 1 29 14 509 MATERIAŁY ZJAZDOWE Celem pracy była: 1. ocena zawartości DNA (ploidalności) w jądrach komórek nowotworowych tarczycy; 2. porównanie wyników ploidalności z występowaniem markerów proliferacji PCNA i Ki67 oraz nadekspresji p53, oraz 3. próba korelacji w/w markerów z typem nowotworu tarczycy oraz stopniem zaawansowania choroby. Badaniem objęto 3 chorych z rakiem anaplastycznym tarczycy, 25 chorych z rakiem zróżnicowanym tarczycy (10 przypadków raka pęcherzykowego, 15 raka brodawkowatego, w tym 3 osoby z typem folikularnym raka brodawkowatego), 25 przypadków gruczolaka pęcherzykowego oraz 30 chorych z wolem guzkowo-koloidowym. Do badań wykorzystano następujące techniki badawcze: cytofluorymetrię przepływową, metodę immunohistochemiczną ABComplex/HRP. Badania wykazały: u wszystkich trzech chorych z rakiem anaplastycznym obecność aneuploidii oraz nadekspresję p53, PCNA i Ki 67; w raku zróżnicowanym obecność aneuploidii w 34%, nadekspresję p53 w 15%, PCNA i Ki67 odpowiednio w 53% i 69.2%. Z kolei u chorych z gruczolakiem pęcherzykowym aneuploidię ujawniono u 2 spośród 25 badanych chorych. U żadnego chorego z wolem koloidowo-guzkowym nie stwierdzono zmian w zawartości DNA ani nadekspresji p53. Chociaż w wolu guzkowo-koloidowym była obecna PCNA i Ki67 (odpowiednio w 13,3 i 12%), to jednak częstość i stopień nasilenia reakcji był znamiennie niższy niż w rakach tarczycy. Stwierdzono korelację pomiędzy obecnością aneuploidii, nadekspresji białka p53 oraz stopniem zaawansowania choroby nowotworowej tarczycy i złym rokowaniem. Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE Wśród 87 chorych na RRT było 19 rodzin. U 29 chorych osób (33,3%) wykryto mutacje w genie RET. Ponadto mutacje znaleziono u 14 krewnych chorych, którzy jeszcze nie mieli klinicznych objawów choroby. Niespodziewanie wykryliśmy bardzo rzadko występującą w Polsce mutację w kodonie 791.Wśród 4 rodzin wykryliśmy ją u 13 osób. Uzyskane wyniki przemawiają za tym, że w polskiej populacji, dla celów diagnostycznych, obok innych miejsc, konieczne jest również analizowanie kodonu 791 jako „gorącego miejsca” dla mutacji odpowiedzialnych za powstawanie RRT. Sromek M, Wiśniewska A, Paszko Z, Jagielska A, Skasko E, Czapczak D, Czetwertyńska M, Kozłowicz–Gudzińska I, Prokurat A, Łyczek M, Kaniewski M, Stachlewska-Nasfeter E Frequency of occurrence of patogenic mutations in gene RET in patients with medulary thyroid cancer MATERIAŁY ZJAZDOWE Centre of Oncology in Warsaw. t Molecular diagnostic of the hereditary medullary thyroid cancer (MTC) was begun in Centre of Oncology in Warsaw in 1998. The aim of this report is the recapitulation of whole investigations performed until now by our team. 87 patient with MTC as well as 54 persons of their relatives were examined. Genomic DNA was isolated from limfocytes of circulating blood. The following exons of the gene RET were amplified by PCR technique: 10, 11, 13, 14 and 16. The products of PCR reaction after purification was subjected to sequencing with add of fluorescent labelled deoxynucleotides. 510 Post sequentional electrophoresis was executed in ABI PRISM 377 apparatus. The results of investigations were presented in the following Table. Character and frequency of occurrence of mutations in gene RET in-patients with medullary thyroid cancer and in their healthy relatives. Location Changes in sequences No of mutations Families Patients Cys→Phe 1 1 - Cys→Tyr 1 1 2 TGC→GGC Cys→Gly 1 1 2 TGC→GGC Cys→Gly 1 3 1 620 TGC→CGC Cys→Arg 1 2 - 11 634 TGC→CGC Cys→Arg 6 13 - 11 634 TGC→AGC Cys→Ser 1 1 - 13 791 TAT→TTT Tyr→Phe 4 4 9 14 804 GTG→TTG Val→Leu 2 2 - 16 918 ATG→ACG Met→Thr 1 1 - 19 29 14 Exon codon DNA Protein 10 609 TGC→TTG 10 609 TGC→TAC 10 618 10 620 10 Total Healthy Within 87 patients with MTC there were 19 families among which 29 patients (33.3%) had patogenic mutations in RET gene. Moreover, mutations were detected also in their 14 relatives who did not have clinical symptoms of the disease yet. Among 4 families in 13 persons unexpectedly we detected for the first time in Poland very rare mutation in codon 791. These informations speak behind this, that in Polish population for diagnostic purposes, beside other places, it is necessary analyse codon 791 as the “hot place” responsible for development of MTC. Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) 12.10.2002, sobota Sesja 5 Ocena ekspresji receptora chemokinowego CCR5 u chorych z cukrzycą typu 2 1 2 Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych i Zaburzeń Metabolicznych AM w Poznaniu, Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej Akademii Medycznej w Poznaniu. t Chemokiny to białka lub peptydy wiążące się ze specyficznymi receptorami na powierzchni komórek układu odpornościowego, powodujące ich aktywację, proliferację i chemotaksję. Istnieją doniesienia sugerujące, iż zwiększona ekspresja receptorów dla chemokin może uczestniczyć w patomechanizmie rozwoju miażdżycy, gdzie przechodzenie monocytów do ściany naczynia jest zjawiskiem kluczowym w inicjacji tego procesu. CCR5 to jeden z receptorów dla chemokin obecny na powierzchni obwodowych limfocytów T, monocytów i makrofagów. Cel. Celem pracy była ocena ekspresji receptora CCR5 u chorych z cukrzycą typu 2. Metody. Badaniu poddano 10 pacjentów z cukrzycą typu 2 (K/M 6/4, w wieku 45 ± 3,4 lat). Kontrolę stanowiło 10 zdrowych ochotników (K/M 5/5, w wieku 42 ± 1,4 lat). U wszystkich pobrano krew w celu uzyskania obwodowych komórek jednojądrzastych peripheral blood mononuclear (PBM). Do bezpośredniej analizy cytometrycznej gęstości receptora CCR5 na powierzchni limfocytów CD4+, monocytów i makrofagów, do badanych próbek dodano przeciwciała anty-CD4, antyCD14 i anty-CCR5. Pomiaru dokonano przy użyciu LSR Cytofluorograf System (Becton Dickinson Co.). Wyniki. U pacjentów z cukrzycą typu 2 obserwowano większą gęstość receptora CCR5 na powierzchni obwodowych komórek jednojądrzastych. Wnioski. Pacjentów z cukrzycą typu 2 cechuje zwiększona ekspresja receptora CCR5. Zwiększona ekspresja CCR5 w tej grupie chorych powinna być rozpatrywana jako jedno ze zjawisk sprzyjających rozwojowi miażdżycy u chorych z cukrzycą typu 2. Bogdański P1, Jagodziński P2, Kujawa A2, Pupek-Musialik D1, Evaluation of chemokine receptor CCR5 expression in patients with diabetes mellitus 1 2 Department of Internal Diseases and Metabolic Disorders, University of Medical Sciences, Poznan, Department of Biochemistry and Molecular Biology University of Medical Sciences, Poznan, t Chemokines are small peptides that are potent activators and chemoattractans for leukocytes. Overexpression of chemokine receptors has been recently analysed in several diseases, including atherosclerosis, where monocyte invasion of the artery wall is a critical event in the initiation of this process. CCR5 is a chemokine receptor expressed on macrophages and peripheral T lymphocytes. Aim. The aim of the study was evaluation of CCR5 receptor expression in patients with diabetes mellitus. Methods. We analyzed 10 patients with diabetes mellitus (F/M 6/4, aged 45 ± 3.4 years). As a control we used 10 healthy volunteers (F/M 5/5, aged 42 ± 1.4 years). The blood samples were collected from patients to obtain peripheral blood mononuclear (PBM) cells. For direct cytometric analysis of the density of CCR5 on the surface of CD4+ lymphocytes or monocytes/ macrophages, cells had been harvested and stained with anti-CD4, anti-CD14 and anti-CCR5 and then analyzed with use of LSR Cytofluorograf System (Becton Dickinson Co.). Results: Higher density of CCR5 on PBM cells was a detected in patient with diabetes mellitus. Conclusions: Patients with diabetes mellitus have increased CCR5 expression. CCR5 overexpression in this group should be considered as one of the changes, which could promote atherosclerosis in patients with diabetes mellitus. Siewko K, Szelachowska M, Krętowski A, Stępień A, Kinalska I, Autoimmunologiczne i metaboliczne markery ryzyka rozwoju cukrzycy u krewnych i stopnia chorych na cukrzycę – badanie retrospektywne Klinika Endokrynologii, Diabetologii i Chorób Wewnętrznych AM w Białymstoku. t Wiadomo, że obecność przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom wysp trzustkowych, uważa się za markery autoimmunologicznego uszkodzenia komórek beta trzustki, szczególnie w grupie podwyższonego ryzyka. Celem obecnej pracy była ocena miana przeciwciał anty-GAD, IAA, IA-2, stężenia C-peptydu w surowicy krwi na czczo, a także pierwszej fazy wydzielania insuliny po dożylnym podaniu glukozy oraz przydatności ich w ocenie ryzyka rozwoju cukrzycy. Materiał: Badanie przeprowadzono w grupie 90 krewnych (44 kobiet, 46 mężczyzn, w tym 30 dzieci do 16 rż), śr. wiek - 27,1±15,48 lat (9-65 lat), śr. BMI24,6±4,95 kg/m2 (13-38 kg/m2), u których w 1993 roku oznaczono przeciwciała ICA oraz anty-GAD. Metody: Przeciwciała anty-GAD, IAA oraz IA-2 oznaczono metodą RIA, stężenie C- peptydu metodą ELISA Wyniki: W 1993 roku u 5 osób (4,5%) stwierdzono podwyższone miano ICA (>20JDF), a powyżej 10 JDF u 13 osób (11,7%). Dodatnie miano przeciwciał antyGAD wykazano u 8 osób (1,6%). W powtórnym badaniu z 2001 roku, obecność jednego z przeciwciał wykazano 511 MATERIAŁY ZJAZDOWE Bogdański P1, Jagodziński P2, Kujawa A2, Pupek-Musialik D1, Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE u 16 krewnych I° chorych na cukrzycę (14,4%). U 10 osób stwierdzono znamienne podwyższenie miana przeciwciał anty- GAD (9%), u 4 podwyższone miana IAA (3,6%), a jedynie u 2 osób obecność IA-2 (1,8%). Po 8 latach, u trzech osób nadal utrzymuje się wysokie miano anty-GAD, u jednej znacznie wzrosło, a u czterech osób obserwowano normalizację miana anty-GAD. U 16 osób (14,4%) wykazano upośledzenie wydzielania pierwszej fazy insuliny po dożylnej stymulacji glukozą, spośród których 12 krewnych miało podwyższone miano jednego z przeciwciał Natomiast u 11 osób (9,9%) zaobserwowano nieznacznie obniżoną sekrecję peptydu c na czczo. Do chwili obecnej u żadnej z badanych osób nie wystąpiły kliniczne objawy cukrzycy. Wnioski: Z naszych badań wynika, że obecność pojedynczych autoprzeciwciał nie musi wiązać się z istotną progresją do wystąpienia klinicznych objawów cukrzycy. Natomiast cukrzycy autoimmunologicznej prawdopodobnie można spodziewać się u osób z podwyższonym mianem kilku przeciwciał oraz upośledzoną pierwszą fazą wydzielania insuliny. Siewko K, Szelachowska M, Krętowski A, Stępień A, Kinalska I, MATERIAŁY ZJAZDOWE Autoimmunological and metabolical markers of the risk of diabetes in the 1st degree relatives of the diabetic patiens. A prospective study Department of Endocrinology, Diabetology and Internal Medicine, Medical Academy, Białystok, t Summary: It’s been widely known that the presence of the antibodies against the islet cells antigens are autoimmunological markers of the extent of damage to the beta cells especially in the group of higher risk. The aim of the present study was to evaluate the titre of the anti-GAD, IAA, IA-2 antibodies, the fasting level of the C-peptide in the serum as well as the first phase of the insulin secretion after the intravenous administration of glucose and their usefulness in the assessment of the risk of development of diabetes. Material: The study was carried out in the group of 90 relatives (44 women, 46 men including 30 children up to 16th year of age) mean age – 27.1 ± 15.48 years (9-65 years), mean BMI – 24.6 ± 4.95 kg/m2 (13-38 kg/m2), in whom the level of ICA and anti-GAD antibodies were measured in 1993. Methods: The anti-GAD antibodies, IAA and IA-2 were measured with the use of the RIA method; the level of the C-peptide was measured by ELISA. Results: In 1993 in 5 persons (4.5%) an elevated titre of ICA was assessed (>20JDF) while in 13 persons the result was over 10 JDF (11.7%). The positive titre of antiGAD antibodies was observed in 8 persons (1.6%). In the consequent study of 2001 the presence of one of the antibodies was proved in 16 of the 1st degree relatives of the diabetic patients (14.4%). In 10 persons we observed a significant increase of the anti-GAD antibodies (9%), in 4 elevated titres of IAA (3.6%) while the presence of IA-2 was observed in only two persons (1.8%). After 8 years in three persons a high level of anti-GAD antibodies was still maintained, in one it significantly increased 512 and in 4 persons a normalisation of the titres of antiGAD antibodies was observed. In 16 persons (14.4%) we observed an impairment of the first phase of the insulin secretion after the intravenous administration of glucose, among which 12 relatives had an elevated titre of one of the antibodies. On the other hand in 11 persons (9.9%) a slight fasting decrease of the C-peptide secretion was assessed. Conclusions: Our studies suggest that the presence of single autoantibodies doesn’t necessarily correlate with significant progression to the clinical symptoms of diabetes. However, the autoimmunological diabetes can be expected in persons with the elevated titre of several antibodies and the impaired first phase of the insulin secretion. Szepietowska B, Szelachowska M, Górska M1, Kinalska I, Ocena markerów humoralnej odpowiedzi immunologicznej oraz parametrów biochemicznych u dorosłych pacjentów ze świeżo rozpoznaną cukrzycą Klinika Endokrynologii, Diabetologii i Chorób Wewnętrznych AM w Białymstoku, 1 Oddział Endokrynologii i Chorób Wewnętrznych Szpitala Wojewódzkiego w Białymstoku t Właściwa klasyfikacja cukrzycy stanowi istotny problem kliniczny. Celem pracy była ocena obecności i współistnienia immunologicznych markerów wystąpienia cukrzycy oraz charakterystyka wybranych parametrów biochemicznych w grupie pacjentów ze świeżo rozpoznaną cukrzycą. Do badania zakwalifikowano 100 pacjentów (śr. BMI<27 kg/m2), z cukrzycą trwającą od 1 do 70 miesięcy, średnio 11,4 ± 21,8 miesięcy, w wieku od 25 do 65 lat – śr. wiek – 43,6 ± 11,4 lat. Zbadano stężenie C-peptydu na czczo i po dożylnej stymulacji glukagonem (ELISA) oraz miana przeciwciał przeciwko dekarboksylazie kwasu glutaminowego (antyGAD65) (RIA), przeciwinsulinowych (IAA) (RIA), oraz przeciwko białkowej fosfatazie tyrozynowej (antyIA2) (RIA). Obecność dodatniego miana przynajmniej jednego z przeciwciał stwierdzono u 45 pacjentów (45%). U 33/ 100 pacjentów stwierdzono dodatnie miano przeciwciał antyGAD, u 20/100 IAA, a u 13/100 antyIA2, u 3 pacjentów współistnienie trzech przeciwciał, u 7 osób dodatnie miano antyGAD i antyIA2, u 7 antyGAD i IAA i u 1 osoby IAA i antyIA2. Wykazano dodatnią istotną statystycznie korelację pomiędzy obecnością antyGAD i antyIA2 (r=0,34; p<0,005). Pacjenci z antyGAD+ i/lub IAA+ i/lub antyIA2+ nie różnili się pod względem wieku oraz BMI (odpowiednio 43,1 ± 11,4 vs. 44,0 ± 11,5 lat; 25,2 ± 4,3 vs. 27,3 ± 5,3 kg/m2). U osób z dodatnimi przeciwciałami zaobserwowano istotnie niższe stężenia peptydu C na czczo (0,6 ± 0,8 vs.1,6 ± 1,5 ng/ml p<0,001) i po stymulacji glukagonem (1,2 ± 1,5 vs. 3,9 ± 2,7 ng/ml, p<0,0001). Zaobserwowano istotne różnice w poziomie glikemii na czczo (173 ± 5,4 vs. 139 ± 40,8 mg%, p<0,05) oraz HBA1c (10,3 ± 2,9 vs. 8,6 ± 2,7 %, p>0,05). Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Szepietowska B, Szelachowska M, Górska M1, Kinalska I, Assessment of antibodies titers: antiGAD, IAA, antiIA2 and bichemical selected parametres in group of newly diagnosed adult patients Department of Endocrinology, Diabetology and Internal Medicine Medical Academy of Bialystok t Classification of diabetes is an important clinical problem. The aim was to evaluate frequency of autoimmune markers and describe clinical and selected biochemical parameters in adult patients with newly diagnosed diabetes. 100 patients with an age of 25-65 years, mean BMI<27 kg/m2 and mean duration of diabetes mellitus of 11.4 ± 21.8 months were included. Fasting and glucagon stimulated C-peptide concentration was measured by ELISA and antiGAD, IAA and antiIA2 titers were assessed by RIA essays. Positive titers of at least one antibody were detected in 45 patients (45%). 33/100 cases were positive to antiGAD antibodies, 20/100 to IAA and 13/10 to antiIAA2. Coexistence of 3 antibodies were detected in 3 patients, in 7 positive titers to antiGAD and antiIA2, in 7 to antiGAD and antiIA2 and in one patient had IAA and antiIA2 positive titers. Positive correlation between antiGAD and antiIA2 antibodies titers was found (r=0.34, p<0.005). There were no differences between age and BMI in groups divided according to positive or negative antibodies titers grade (43.1 ± 11.4 vs. 44.0 ± 11.5 years; 25.2 ± 4.3 vs. 27.3 ± 5.3 kg/m2 respectively). Fasting (0.6 ± 0.8 vs. 1.6 ± 1.5 ng/ml p<0.001) and stimulated C-peptide concentration (1.2 ± 1.5 vs. 3.9 ± 2.7 ng/ml, p<0.0001) was decreased in antibody positive group. Additionally significant differences in fasting glucose (173 ± 5.4 vs. 139 ± 40.8 mg%, p<0.05) and HBA1c levels (10.3 ± 2.9 vs. 8.6 ± 2.7 %, p>0.05) were showed. Nearly 50% of analyzed patients showed positivity to humoral immunological markers of diabetes mellitus development, suggesting high prevalence of autoimmunological diabetes in studied population. These persons have a lower reserve of secretion of endogenous insulin. The evaluation of both B-cell secretory capacity and markers of autoimmunity is recommended to provide a right classification. Bogdański P1, Pupek-Musialik D1, Łącki J2, Łuczak M1, Bryl W1, Jabłecka A3 Ocena stężenia czynnika martwicy guza (TNF) u pacjentów z klinicznymi cechami insulinooporności 1 2 3 Klinika Chorób Wewnętrznych i Zaburzeń Metabolicznych, Zakład Farmakologii Klinicznej, Klinika Reumatologii i Immunologii Klinicznej A.M w Poznaniu. t Insulinooporność (IR) to znana cecha otyłości, wiążąca się ze zwiększoną częstością występowania m.in. nadciśnienia tętniczego i zaburzeń lipidowych. Molekularny mechanizm IR nie jest dostatecznie poznany. Ostatnio w procesie indukcji insulinooporności podkreśla się udział TNF- prozapalnej cytokiny, której zwiększoną ekspresję obserwowano w tkance tłuszczowej. Rozpatrywanych jest kilka molekularnych mechanizmów łączących TNF z insulinoopornością. Cel. Celem pracy była ocena stężenia TNF u pacjentów z klinicznymi cechami insulinooporności oraz poszukiwanie zależności pomiędzy TNF a wskaźnikiem insulinooporności. Metody. Analizie poddano 34 osoby z otyłością brzuszną i nadciśnieniem tętniczym (NT) – (n=34, K/M – 18/16, w wieku 47,3 ± 13,2; BMI=38,6 ± 6,1 kg/m2). Kontrolę stanowiło 16 zdrowych, szczupłych ochotników (K/M 8/8, w wieku 45,1 ± 8,3; BMI=24,2 ± 1,9 kg/m2). Względną (%FAT) i bezwzględną (kgFAT) zawartość tkanki tłuszczowej mierzono metodą bioimpedancji. Stężenie TNF i insuliny oznaczono metodami radioimmunometrycznymi. Wskaźnik insulinooporności obliczono jako stosunek stężenia glukozy na czczo do stężenia insuliny na czczo (IRI/G). Wyniki. 1. W grupie chorych z otyłością i NT stwierdzono znamiennie wyższe stężenia TNF w porównaniu z grupą kontrolną (p<0,05). 2. Grupę tą cechowały znamiennie wyższe stężenia insuliny i IRI/G (p<0,05). 3. Stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy TNF i %FAT (r=0,58; p<0,05) oraz TNF i IRI/G (r=0,69; p<0,05). Wnioski. Chorych z klinicznymi cechami insulinooporności cechują wyższe stężenia TNF. Dodatnia korelacja pomiędzy %FAT i TNF może wskazywać, iż tkanka tłuszczowa to ważne miejsce produkcji tej cytokiny. Dodatnia korelacja pomiędzy TNF i wskaźnikiem IRI/G sugeruje, iż TNF powinien być rozpatrywany w złożonym mechanizmie indukcji insulinooporności. Bogdański P1, Pupek-Musialik D1, Łącki J2, Łuczak M1, Bryl W1, Jabłecka A3, Evaluation of tumor necrosis factor (TNF) in patients with clinical features of insulin resistance syndrome 1 Department of Internal Diseases and Metabolic Disorders, Department of Rheumatology and Immunology, 3 Department of Clinical Pharmacology, University of Medical Sciences, Poznań, 2 t Insulin resistance (IR) is a known feature of obesity and associated with many common diseases. The molecular mechanism of IR is still debated. Recently, 513 MATERIAŁY ZJAZDOWE U 45% pacjentów w badanej grupie wykazano obecność immunologicznej odpowiedzi humoralnej skierowanej przeciwko antygenom trzustkowym. Jednoczesne oznaczanie antyGAD i IAA zwiększa wartość diagnostyczną markerów immunologicznych w badanej grupie, czego nie wykazano w stosunku do przeciwciał antyIA2. Osoby z dodatnim mianem przeciwciał przeciwko antygenom trzustki mają mniejszą rezerwę wydzielania endogennej insuliny. MATERIAŁY ZJAZDOWE Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE some studies have focused on TNF- proinflammatory cytokin constitutively expressed by adipose tissue. Several potential mechanisms that might play a role in TNF-induced insulin resistance are analyzed. Aim. The aim of the study was evaluation of TNF concentration in-patients with clinical features of insulin resistance and investigation of the relationship between TNF and insulin resistance ratio. Methods: We analyzed 34 patients with abdominal obesity and hypertension (n=34, F/Mn – 18/16, aged 47.3 ± 13.2; BMI=38.6 ± 6.1 kg/m2). As a control we used 16 healthy lean volunteers (F/M 8/8, aged 45.1 ± 8.3; BMI=24.2 ± 1.9 kg/m2). Dependent (%FAT) and independent (kgFAT) fat content was measured by bioimpedancy method. TNF and insulin were assessed with use of RIA method. Insulin resistance was calculated as fasting insulin/ glucose ratio (IRI/G) Results. 1. Serum levels of TNF in the obese hypertensives significantly exceeded those observed in normal subjects (p<0.05). 2. Significantly higher values of insulin and IRI/G in this group were observed (p<0.05). 3. Positive correlations between TNF and %FAT (r=0.58; p<0.05) and between TNF and IRI/G ratio (r=0.69; p<0.05) were found. Conclusions: Patients with clinical features of IR have increased level of TNF. Positive correlation between %FAT and TNF can indicate adipose tissue as an important source of this cytokine. Positive correlation between TNF and IRI/G ratio suggests that TNF should be considered as an important player in the state of insulin resistance. Dotychczas nie próbowano ocenić roli PXR w metabolizmie steroidów w jajnikach. Celem pracy była analiza ekspresji genu PXR w jajnikach prawidłowych i policystycznych oraz określenie zdolności receptora do indukowania transkrypcji, na podstawie analizy ekspresji genu CYP3A4. Materiałem do badań były fragmenty jajnika od 13 chorych z zespołem PCO pobrane w trakcie zabiegu resekcji klinowej. Kontrolę stanowiły fragmenty prawidłowych jajników. Z tkanek wyizolowano całkowity RNA, poliA+RNA przepisano odwrotnie i otrzymany cDNA amplifikowano w obecności starterów specyficznych dla genu PXR oraz genu CYP3A4. Obecność transkryptu genu PXR stwierdzono w 6 jajnikach policystycznych. We wszystkich próbach obecny był wariant splicingowy PXR-2, natomiast w jednej obie formy. Ekspresji genu PXR nie stwierdzono w żadnym z jajników prawidłowych. Transkrypty genu CYP3A4 wykryto tylko w próbach, w których stwierdzono ekspresję PXR-1, natomiast w próbach, w których wykryto ekspresję PXR-1, nie obserwowano transkryptu genu CYP3A4. Biorąc pod uwagę udział receptora w regulacji genów związanych z przemianami steroidów, wnioskuje się, że obecność wariantu PXR-2 w jajniku policystycznym może mieć związek z zaburzeniami metabolizmu hormonów steroidowych. Ociepa M1, Warenik-Szymankiewicz A2, Trzeciak WH,1 Splicing variants of pregnane X receptor gene transcript in polycystic ovaries 1 Sesja 6 Ociepa M1, Warenik-Szymankiewicz A2, Trzeciak WH,1 Warianty splicingowe transkryptu genu receptora pregnanowego X w jajnikach policystycznych 1 2 Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej AM w Poznaniu Klinika Endokrynologii Ginekologicznej AM w Poznaniu t Receptor pregnanowy X (PXR, NR1I2) zaliczany jest do rodziny sierocych receptorów jądrowych. W odpowiedzi na ligandy aktywuje on ekspresję genów metabolizujących ksenobiotyki i steroidy. Receptor ulega ekspresji w wątrobie i jelicie cienkim, jak również w komórkach raka piersi. Opisano wariant splicingowy receptora (PXR-2), którego domena wiążąca ligand jest krótsza o 37 aminokwasów i który słabiej aktywuje ekspresję genów, zarówno podstawową, jak i indukowaną. Lokalne zmiany funkcji receptora mogłyby wpływać na metabolizm steroidów w jajniku i oddziaływać pośrednio na gospodarkę hormonalną. Zaburzenia gospodarki hormonalnej pojawiają się m.in. w zespole policystycznych jajników (PCOS), w którym stwierdza się charakterystyczne zmiany w jajnikach, polegające na wzroście komórek theca folliculi. 514 2 Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Medical Sciences, Poznan Department. of Gynecological Endocrynology,University of Medical Sciences, Poznan t The pregnane X receptor (PXR, NR1I2) belongs to the nuclear orphan receptor family. Under the influence of ligands it activates the expression of genes metabolising both xenobiotics and steroids. The receptor is expressed in liver and small intestine, as well as in breast cancer cells. Splicing variant of the receptor (PXR-2) containing 37 amino acids shorter ligand-binding domain and exhibiting weaker both basic and induced gene expression induction was described. Local changes in the receptor function could influence steroid synthesis activation in ovaries and indirectly the hormonal balance of the organism. Disturbances of the hormonal balance are also observed in polycystic ovary syndrome (PCOS) patients, exhibiting characteristic morphologic changes in ovaries. To date, the role of PCR in steroid metabolism has not been evaluated and the expression of PXR has never been found. The investigation has been designed to analyze the expression of PXR gene in normal and polycystic ovaries and to examine the ability of the receptor to induce the transcription of CYP3A4 gene. The fragments of ovaries from 13 patients diagnosed with PCOS, who underwent wedge resection therapy and normal ovaries (control) were used. The total RNA was isolated, poliA+RNA reverse transcribed and the Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) obtained DNA was amplified with the use of specific primers for PXR and CYP3A4. Considering the role of the PXR in the regulation of genes involved in steroid metabolism, it is concluded that the presence of splicing variant PXR-2 in polycystic ovaries could be connected with the disturbances of steroid metabolism. Kocki J1, Wołowiec A1, Putowski L2, KorszeńPilecka I1, Wojcierowski J1 Badania mutacji genu CFTR u pacjentów z niepłodnością 1 2 Zakład Genetyki Medycznej Akademii Medycznej w Lublinie, Klinika Ginekologii Operacyjnej Akademii Medycznej w Lublinie, t Mutacje genu CFTR mogą prowadzić już w życiu płodowym do agenezji lub niedrożności nasieniowodów w wyniku zwłóknienia lub atrofii przewodów najądrza, nasieniowodów i pęcherzyków nasiennych. Zmiany te spowodowane są gęstą wydzieliną powodującą ich niedrożność. W pracy badano mutacje genu CFTR u pacjentów Poradni Genetycznej i Ginekologicznej w Lublinie (w 33 parach małżeńskich), diagnozowanych i leczonych z powodu niepłodności. U wszystkich pacjentów wykonywano badania podmiotowe i przedmiotowe oraz laboratoryjne, w tym: biochemiczne, hormonalne, USG oraz spermiogram u mężczyzn. W DNA limfocytów krwi obwodowej badano następujące mutacje: ∆F508, ∆I507, G542X, 1717-1G→A, R560T, G551D, R553X, Q552X, W1282X, S1251N, 3905insT, N1303K metodą odwrotnej hybrydyzacji z wykorzystaniem zestawu odczynników INNO-LiPATMCFTR12 firmy Innogenetics. Do detekcji alleli 5T, 7T i 9T intronu 8 genu CFTR wykorzystano zestaw odczynników „CF Poly-T” Elucigene firmy AstraZeneca. W grupie 66 pacjentów z niepowodzeniami prokreacji stwierdzono obecność mutacji genu CFTR w 12 przypadkach (18%): w pięciu przypadkach − 5T/5T, w trzech przypadkach – ∆F508, w trzech − 7T/5T, i w jednym − N1303K. U dwóch kobiet stwierdzono genotypy 7T/5T i 5T/5T, co mogło być przyczyną ich niepłodności. Badania mutacji genu CFTR w parach małżeńskich z niepłodnością mają duże znaczenie kliniczne w rozpoznaniu mukowiscydozy jako przyczyny niepłodności jak również w kwalifikacji pacjentów z niepłodnością do współczesnych metod wspomagania rozrodu. Praca finansowana częściowo przez grant Komitetu Badań Naukowych nr 4PO5E 064 16. Wawrzyniak M2, Krysińska I1, Ruchała M1, Wojda A3, Łącka K1 Aberracje chromosomu X a obecność patologii w obrębie tarczycy u chorych z zespołem Turnera 1 Katedra i Klinika Endokrynologii, Przemiany Materii i Chorób Wewnętrznych AM w Poznaniu Przychodnia Medycyny Rodzinnej „Vita” w Osieku nad Notecią 3 Katedra i Zakład Genetyki Medycznej A M w Poznaniu 2 t Pierwsze prace kliniczne dotyczące chorób tarczycy u kobiet z zespołem Turnera pochodzą z początku lat 60. Williams i wsp. postulowali wówczas obecność recesywnego genu zlokalizowanego na ramieniu krótkim chromosomu X odpowiedzialnego za powstawanie zaburzeń czynności tego gruczołu. Elsheikh i wsp. (2001) sugerują możliwość wpływu genu położonego na ramieniu długim chromosomu X na rozwój autoimmunologicznej choroby tarczycy. Trwają prace nad lokalizacją genów w obrębie chromosomu X, mogących odpowiadać za występowanie chorób tarczycy. Trent i wsp. w 1987 odkryli w prążku Xq21-22 gen SERPINA 7, kodujący TBG. Doniesienia z końca 2001 informują o badaniach nad genami LOC 139309 (Xq21.33) oraz LOC 139270, których produkty podobne są odpowiednio do autoantygenu tarczycowego 70 kD oraz cytozolowego białka wiążącego hormony tarczycy. Stąd celem pracy była ocena struktury i czynności tarczycy oraz próba korelacji występowania zaburzeń struktury i czynności tarczycy z kariotypem u dorosłych chorych z zespołem Turnera. Badaniami objęto 45 chorych z zespołem Turnera (45,X w 6 przypadkach (13%), aberracje struktury chromosomu X w 5 (11%) oraz w 34 (76%) kariotyp mozaikowy) w wieku od 19 do 60 lat – średnia 38,0 ± 11,5lat. U każdej chorej w grupie badanej wykonano ultrasonografię tarczycy oraz oznaczono stężenie wolnych i całkowitych hormonów tarczycy, TSH, Tg, TBG oraz przeciwciał anty-Tg i anty-TPO. U 12 badanych kobiet rozpoznano zaburzenia czynności tarczycy (27%). Pierwotną pełnoobjawową niedoczynność tarczycy rozpoznano w 2 przypadkach (4%), subkliniczną niedoczynność tarczycy – w 9 (20%), nadczynność tarczycy w przebiegu choroby Graves-Basedowa u 1 chorej (2 %). Zaburzenia czynności tarczycy najczęściej obserwowano w grupie chorych z monosomią chromosomu X (67%), jednak nie wykazano znamiennych statystycznie różnic w częstości występowania nieprawidłowej czynności tarczycy w podgrupach kariotypowych. Najczęstsze występowanie podwyższonego stężenia przeciwciał przeciwtarczycowych obserwowano w grupach chorych z monosomią chromosomu X (83%) oraz z aberracjami struktury chromosomu X (80%). Analiza statystyczna nie wykazała znamienności statystycznej pomiędzy analizowanymi grupami. Wnioski: 1) U chorych z zespołem Turnera stwierdza się częstsze występowanie chorób tarczycy w porównaniu do populacji zdrowej; szczególnie często obserwuje się obecność autoimmunologicznej choroby tarczycy. 515 MATERIAŁY ZJAZDOWE The transcript specific for PXR gene was detected in 6 samples from polycystic ovaries, whereas no expression was found in samples from normal ovaries. The splicing variant PXR-2 was present in all samples, while the wild type PXR was detected in only one. The CYP3A4 gene transcripts was detected only in the sample, where the wild type of PXR transcript was found, while in the samples containing PXR-2 variant, CYP3A4 gene transcripts were not been observed. Sesja 7 Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE 2) Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w częstości występowania oraz rodzaju zaburzeń struktury i czynności tarczycy u chorych z zespołem Turnera w zależności od kariotypu. Kusz K1, Szarras-Czapnik M2, WarenikSzymankiewicz A3, Latos-Bieleńska A4, Jaruzelska J1 M. Wawrzyniak, I. Krysińska, M. Ruchała, K. Łącka 1 Chromosome X aberrations and thyroid pathology in patients with Turner syndrome MATERIAŁY ZJAZDOWE Department of Endocrinology, Metabolism and Internal Medicine, K. Marcinkowski University of Medical Sciences, Poznan t The first clinical studies of thyroid diseases in women with Turner syndrome come from the beginning of the 60s. Williams et al. postulated the presence of recessive gene located on the short arm of X chromosome responsible for thyroid abnormalities. In turn, Elsheikh et al. (2001) suggest a possibility of influence of the gene located on the long arm of X on the development of autoimmune thyroid diseases (AITD). Studies are under way on localization of genes within X, which might be responsible for thyroid diseases. In 1987 Trent et al. discovered in the Xq21-22 band a SERPINA 7 gene which codes TBG. Communications from the end of 2001 give information on studies of LOC 139309 (Xq21.33) and LOC 139270 genes whose products are similar to thyroid autoantigen 70kD and the cytosol protein binding thyroid hormones, respectively. Hence the aim of our study was evaluation of the structure and function of thyroid and its correlation with the kind of karyotypes in adults with Turner syndrome. Forty five patients with Turner syndrome (45,X in 6 cases (13%), aberrations of the X chromosome structure in 5 (11%) and in 34 (76%) mosaicism) aged 19 to 60 – average age (38.0 ± 11.5 years). In each patient in the study group USG of the thyroid was performed and concentration of free and whole thyroid hormones, TSH, thyroglobulin (Tg) and anti-|Tg and anti-TPO antibodies were determined. In 12 study women thyroid disorders were diagnosed (27%). The primary full-symptomatic hypothyroidism was found in 2 cases (4%), subclinical hypothyroidism in 9 cases (20%), and Graves’ hyperthyroidism in 1 patient (2%). Thyroid disorders were observed most often in a group of patients with monosomy of X chromosome (67%), however, no statistically significant differences were observed in the frequency of occurrence of thyroid dysfunction in karyotype subgroups. The most frequent incidence of increased concentration of anti-thyroid antibodies was noticed in groups of patients with X chromosome monosomy (83%) and with X chromosome structures aberrations (80%). Statistical analysis did not show any statistical significance between the analyzed groups. Conclusions: 1) In Turner syndrome patients more frequent incidence of thyroid diseases is observed than in the healthy group; particularly frequent is the presence of autoimmune thyroid disease. 2) No statistically significant differences in the frequency of occurrence and the kind of thyroid disorders in Turner syndrome patients depending on the karyotype. 516 Poszukiwanie duplikacji regionu DSS powodujących zespół Swyera Zakład Genetyki Człowieka PAN, Instytut „Pomnik-Centrum Zdrowia Dziecka” w Warszawie, Instytut Położnictwa i Ginekologii AM, 4 Katedra i Zakład Genetyki Medycznej AM Poznań 2 3 t Podłoże genetyczne zespołu Swyera jest różnorodne. Jedną z przyczyn jest duplikacja regionu DSS krótkiego ramienia chromosomu X (Xp). Region ten o wielkości 160 kpz zawiera pięć znanych genów: DAX1, MAGEB1, MAGEB2, MAGEB3 oraz MAGEB4. Jednak nie ma dotąd pewności, który z nich powoduje odwrócenie płci, jeśli wystąpi w podwojonej dawce. Nie jest wykluczone, że przyczyną odwrócenia płci jest podwojenie nieznanego jeszcze genu występującego w tym regionie. Celem pracy była analiza regionu DSS w poszukiwaniu duplikacji powodujących zespół Swyera. Badanie tego regionu przeprowadzono u 30 pacjentek z zastosowaniem techniki hybrydyzacji Southerna oraz ilościowego pomiaru sygnałów. U jednej pacjentki wykryto duplikację tylko części regionu DSS. Jest to pierwsza z dotychczas opisanych duplikacji DSS, która nie obejmuje genów MAGEB2 i MAGEB3, co pozwoliło przesunąć dystalną granicę tego regionu o co najmniej 40 kpz w kierunku 3’. Kusz K1, Szarras-Czapnik M2, WarenikSzymankiewicz A3, Latos-Bieleńska A4, Jaruzelska J1 Search for duplications of DSS region causing Swyer syndrome 1 Institute of Human Genetics, Polish Academy of Sciences, The Children Memorial Health Institute, Warsaw, Instytut of Obstetrics and Gynecology, University of Medical Sciences, Poznań, 4 Department of Medical Genetics, University of Medical Sciences, Poznań 2 3 t The genetic background of the Swyer syndrome is variable. Duplications of the DSS region on the short arm of X chromosome (Xp) are one of the causes of sex reversal in the Swyer syndrome patients. DSS region is 160 KB long and encodes five known genes: DAX1, MAGEB1, MAGEB2, MAGEB3 and MAGEB4. However, it is not known so far, which of these genes causes sex reversal when duplicated. Therefore, the aim of this study was molecular analysis of the patients with Swyer syndrome in search of informative duplications of the DSS region that would shed light on that issue. The analysis was performed in 30 Swyer syndrome patients using Southern hybridization and quantitative analysis of the hybridization signal. Duplication was found in only one patient and interestingly, was limited just to a portion of DSS region. This finding enables to move the 5’ border of the DSS region at least 40 KB towards the 3’ end. It is the first duplication of DSS locus, which eliminates MAGEB2 and MAGEB3 genes from the group of candidates causing Swyer syndrome. Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2003; 4 (54) Płodność w zespole Turnera Katedra Endokrynologii, Przemiany Materii i Chorób Wewnętrznych AM w Poznaniu; 1 Poradnia Endokrynologiczna Ars Medica, Piła; 2 Oddział Wewnętrzny, Szpital w Śremie; 3 Zakład Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu t W klasycznym pojęciu zespół Turnera określa się jako dysgenezję gonad uwarunkowaną ilościowymi i/lub jakościowymi aberracjami chromosomu X charakteryzującą się niedoborem wzrostu, pierwotnym brakiem miesiączki, bezpłodnością, wadami kośćca, układu krążenia, układu moczowego i in. Jednak dokładne obserwacje kliniczne oraz analiza kariotypowa przy użyciu nowoczesnych technik cytogenetycznych i biologii molekularnej wykazała możliwość pojawienia się samoistnego miesiączkowania oraz płodności u kobiet z zespołem Turnera. Można to zaobserwować u chorych wz aberracjami strukturalnymi chromosomu X, (region Xq13-q26 zawiera geny odpowiedzialne za kontrolę funkcji jajników) oraz w przypadku kariotypów mozaikowych z obecnością komórek prawidłowych 46,XX (Nielsen i wsp. 1979, Tarani i wsp. 1998, Birkebaek i wsp. 2002). U kobiet z zespołem Turnera wykazano ponadto większą skłonność do samoistnych poronień, zgonów okołoporodowych oraz urodzeń dzieci z aberracjami chromosomalnymi np. zespołem Turnera lub zespołem Downa. Celem naszej pracy była analiza 78 dorosłych chorych z zespołem Turnera, u których przeprowadzono analizę cytogenetyczną oraz badanie kliniczne ze szczególnym uwzględnieniem układu rozrodczego. Znaleziono trzy kobiety z zespołem Turnera, które urodziły żywe dzieci, co stanowiło ok. 3,8%. Wykazano u nich następujące kariotypy: a:46,XX[44]/45,X[2]/47,XXX[1]/46,X,i(X)(q10)[1]/46,xx,t (7;14)(q10;p10)[1]/47,XX,+21[1] b: 46,XX[47]/45,X[3] c: 46,XX[94]/45,X[6]. heart, urinary tract and other. However, deep clinical observation and karyotypes analysis using advanced cytogenetic techniques and molecular biology showed a possibility of presence of spontaneous menstruation in women with Turner syndrome. It can be observed in patients with structural aberrations of X chromosome (Xq13-Xq26 region contains genes responsible for the control of ovarian function) and, in case of mosaicism with presence of 46,XX [Nielsen et al. (1979), Tarani et al. (1998) and Birkebaek et al (2002)]. Moreover, in women with Turner syndrome a more frequent tendency to spontaneous abortions, perinatal deaths, and births with chromosomal aberrations (e.g. Down and Turner syndromes) has been shown.The aim of our study was to analyze 78 adults with Turner syndrome in whom cytogenetic and clinical examination was performed with special consideration of reproductive system. Of these 78 women three gave births to alive children, which was about 3.8%. The following karyotypes were found in them: a.46,XX[44]/45,X[2]/47,XXX[1]/46,Xi(X)(q10)[1]/46,XX,t( 7;14)(q10;p10)[1] /47,XX,+21[1] b. 46,XX[47]/45,X[3] c. 46,XX[94]/45,X[6] From amongst five children born by the studied group, all were female and in three of them stigmata of Turner syndrome were revealed. 1. 46,XX[47]/45,X[3] 2.nuncfishXcen(DXZ1x1)[45]/nucfishXcen(DXZ1x1)[158] 3. 46,XX[46]/45,X[4] In the other two daughters no anomaly in the development was observed. Spośród pięciorga dzieci urodzonych przez opisywane kobiety, wszystkie były płci żeńskiej, a u trzech z nich ujawniono stygmaty zespołu Turnera; 1: 46,XX[47]/45,X[3]; 2: nucfishXcen(DXZ1x1)[45]/nucfishXcen(DXZ1x2)[158]; 3: 46,XX[46]/45,X[4]. U pozostałych dwóch córek nie stwierdzono żadnych anomalii rozwojowych. Łącka K, Rzepka A1, Andrzejewska J2, Wojda A3 Fertility in Turner syndrome Department of Endocrinology, Metabolism and Internal Medicine, K. Marcinkowski University of Medical Sciences, Poznań, Poland; 1. Department of Internal Medicine, Srem Hospital, Poland; 2. Outpatient Endocrinology Unit, Ars Medica Piła, Poland; 3. Department of Human Genetics, Polish Academy of Sciences, Poznań, Poland t Classically Turner syndrome is defined as gonadal dysgenesis caused by quantitative and/or qualitative X chromosome aberrations characterized by short stature, primary amenorrhoea, infertility, abnormalities of bones, 517 MATERIAŁY ZJAZDOWE Łącka K, Rzepka A1, Andrzejewska J2, Wojda A3 Materiały III Konferencji Sekcji Endokrynologii Molekularnej PTE MATERIAŁY ZJAZDOWE INDEX AUTORÓW Ambroziak M ........................ 492, 493 Andrzejewska J ............................. 517 Balcerczak E ................................... 504 Biernacka-Łukanty J ..................... 451 Bogdański P ........................... 511, 513 Bryl W .............................................. 513 Brzeziński J ............................ 491, 497 Celczyńska-Bajew L ...................... 467 Chmielik E .............................. 503, 506 Czapczak D .................................... 509 Czarnocka B .................................... 501 Czekalski S ..................................... 461 Czetwertyńska M .......................... 509 Czyż W ................................... 504, 507 Dedecjus M ............................ 491, 497 Gaj Z ................................................ 507 Gambert Ph ............................ 491, 497 Gembicki M ................................... 508 Gereben B ....................................... 493 Gondek Ł ........................................ 493 Goraj-Zając A.................................. 501 Górska M ........................................ 512 Gubała E ......... 433, 494, 495, 503, 506 Handkiewicz-Junak D .......... 503, 506 Hasse-Lazar K ........................ 494, 495 Hettinger L ..................................... 450 Hilgenfeldt U ................................. 450 Horst-Sikorska W .......................... 467 Idasiak-Piechocka I ....................... 461 Ignacak M........................................ 499 Jabłecka A........................................ 513 Jacques Y Li .................................... 451 Jagielska A ..................................... 509 Jagodziński P ................................. 511 Jakubiak M ..................................... 504 Jakubowski L .................................. 479 Jaruzelska J.............................. 466, 516 Jarząb B........... 433, 494, 502, 503, 506 Jarząb M ................................. 493, 495 Jędrzejczak P .................................. 466 Jurecka-Lubieniecka B . 493, 494, 495 Kaniewski M................................... 506 Kędzia A.......................................... 500 Kinalska I........................ 461, 511, 512 Kocki J.............................................. 515 Kołomecki K .................................. 504 Komorowski J ................................. 507 Korman E ........................................ 500 Korszeń-Pilecka I .......................... 515 Kozłowicz–Gudzińska I ............... 509 Krawczyk A .......... 494, 495, 502, 503 Krętowski A .................................... 511 518 Krysińska I ...................................... 515 Krześlak A....................................... 507 Kujawa A ........................................ 511 Kula D ............................ 493, 494, 495 Kula K ..................................... 472, 505 Kusz K ............................................ 516 Kuzdak K ................................ 504, 507 Kwintkiewicz J .............................. 508 Lagrost L.................................. 491, 497 Lange D ........................................... 501 Latos-Bieleńska A ................. 466, 516 Lecybyl R ........................................ 498 Lehmann T ..................................... 451 Lewicka M ...................................... 450 Lewiński A ............................. 491, 497 Lipińska A....................................... 507 Lisowska K ..................................... 502 Liu X ................................................ 450 Łącka K .................. 440, 508, 515, 517 Łącki J .............................................. 513 Łuczak J .......................................... 493 Łuczak M ........................................ 513 Łyczek M ........................................ 509 Łyczkowska A ............................... 501 Majewski P ..................................... 508 Malisova L ...................................... 450 Masson D ................................ 491, 497 Mirowski M .................................... 504 Nauman A ..................... 453, 492, 493 Nauman J ....................... 453, 492, 493 Niedziela M ................................... 444 Nikiel B ............................................ 501 Obara-Moszyńska M .................... 500 Ociepa M ......................................... 514 Oko A .............................................. 461 Oksza Strzelecki N ........................ 499 Pachucki J ............................... 492, 493 Pasieka Z ................................ 504, 507 Pastuszka D ................................... 501 Paszko Z ......................................... 509 Pawelczyk L ................................... 466 Pawlaczek A ................. 493, 494, 495 Pawlaczyk K .................................. 461 Pomorski L ..................................... 507 Prokurat A ..................................... 509 Pupek-Musialik D ................. 511, 513 Putowski L ...................................... 515 Puzianowska-Kuźnicka M ........... 453 Rabska-Pietrzak B ......................... 500 Rubis B............................................. 498 Ruchała M ...................................... 515 Rudowicz M ................................... 504 Rzepka A ........................................ 517 Siewko K ........................................ 511 Skasko E ......................................... 509 Słowikowska-Hilczer J ......... 472, 505 Spik A .............................................. 466 Sromek M ....................................... 509 Stachlewska-Nasfeter E................. 509 Staszel M ......................................... 493 Stęchły T ................................. 494, 495 Stępień A ........................................ 511 Stępień H ................................ 504, 507 Stępień T ......................................... 504 Szarras-Czapnik M ....................... 516 Szarzyńska J ................................... 508 Szelachowska M .................... 511, 512 Szepietowska B .............................. 512 Szpak S ................................... 494, 495 Trzeciak WH .......... 451, 498, 499, 514 Warenik-Szymankiewicz A ................ ............................................471, 514, 516 Wawrzyniak M............................... 515 Wiench M ...................... 502, 503, 506 Wiktorowicz K .............................. 508 Wiśniewska A ................................ 509 Włoch J ............................................ 501 Wojcierowski J................................ 515 Wojda A ......................... 466, 515, 517 Wołoszańska K ............................... 506 Wołowiec A ................................... 515 Wygoda Z ....................................... 433 Zeman M ........................................ 506 Ziemnicka K ................................... 467