Praca doktorska - EWELINA ECKERT

UNIWERSYTET PRZYRODNICZY
WE WROCŁAWIU
WYDZIAŁ NAUK O ŻYWNOŚCI
KATEDRA TECHNOLOGII SUROWCÓW ZWIERZĘCYCH
I ZARZĄDZANIA JAKOŚCIĄ
Ewelina Eckert
Próba pozyskiwania bioaktywnych peptydów
z żółtka jaja metodą hydrolizy enzymatycznej
Promotor: prof. dr hab. Tadeusz Trziszka
Praca wykonana została w ramach projektu pt. „Innowacyjne technologie produkcji
biopreparatów na bazie nowej generacji jaj (OVOCURA)” współfinansowanego przez Unię
Europejską z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Programu
Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka, 2007-2013.
Wrocław 2013
Pragnę wyrazić wdzięczność Promotorowi,
Panu prof. dr hab. Tadeuszowi Trziszce
za skierowanie mojego zainteresowania
na tematykę dotyczącą bioaktywnych peptydów
oraz surowca jajczarskiego
a także wszelką pomoc w realizacji tej pracy
Za wszechstronną pomoc dziękuję również
Pani prof. dr hab. Józefie Chrzanowskiej
oraz Panu prof. dr hab. Antoniemu Polanowskiemu
Dr Aleksandrze Zambrowicz
składam serdeczne podziękowania
za cenne uwagi, opiekę naukową,
oraz życzliwość i wsparcie
SPIS TREŚCI
SPIS TREŚCI
Wykaz używanych skrótów……………………………………………………………..
7
1. Streszczenie..................................................................................................................................
10
2. Wstęp................................................................................................................................................
15
3. Cel pracy........................................................................................................................................
43
4. Materiały i Metody................................................................................................................
44
4.1. Materiały………………………………………………………..…………………..……..…
44
4.1.1. Materiał biologiczny…………………………………................................……..…
44
4.1.2. Enzymy………………………………………….…………………………………….
44
4.2. Metody......................................................................................................................................
44
4.2.1. Izolacja preparatu foswitynowego i immunoglobulinowego z żółtka.......
44
4.2.2. Izolacja i oczyszczanie preparatu proteolitycznego z dyni figolistnej
(Cucurbita ficifolia)…...............................................................................................
45
4.2.3. Otrzymywanie preparatów proteolitycznych z drożdży Yarrowia
lipolytica……………………………………………………………………………....
45
4.2.4. Oznaczanie białka.......................................................................................................
45
2.4.1. Oznaczanie białka metodą kolorymetryczną…………………………...
45
2.4.2. Oznaczanie białka metodą spektrofotometryczną…………………….
46
2.4.3. Elektroforeza SDS-PAGE………………………………………………….
46
4.2.5. Oznaczanie aktywności enzymatycznych……………………………………...
46
4.2.5.1. Oznaczenie aktywności proteolitycznej enzymów aktywnych
w środowisku zasadowym wobec kazeiny…………………………..
46
4.2.5.2. Oznaczenie aktywności proteolitycznej enzymów aktywnych
w środowisku kwaśnym wobec kwasowo-zdenaturowanej
hemoglobiny……………………………………………………………..…
47
2
SPIS TREŚCI
4.2.6. Hydroliza enzymatyczna………………………………………………...
47
4.2.7. Całkowita hydroliza w kwasie solnym………………………………………….
47
4.2.8. Analiza hydrolizatów białkowych……………………………………………….
48
4.2.8.1. Wyznaczanie stopnia hydrolizy (DH) poprzez oznaczenie
stężenia peptydów rozpuszczalnych w 5% kwasie
trichlorooctowym (TCA)………………………………….……...……...
48
4.2.8.2. Oznaczenie stężenia wolnych grup α- aminowych w reakcji
z TNBS……………………………………………………………………...
48
4.2.8.3. Profile peptydowe hydrolizatów techniką wysokosprawnej
chromatografii cieczowej w odwróconych fazach (RP-HPLC)…
48
4.2.9. Oznaczenie aktywności biologicznych hydrolizatów białkowych
i frakcji peptydów...........................................................................................................
49
4.2.9.1. Oznaczenie aktywności przeciwutleniającej………………………...
49
4.2.9.1.1. Zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH………
49
4.2.9.1.2. Zdolność redukcji stopnia utlenienia jonów żelaza
(metoda FRAP)………………………………………………..
49
4.2.9.1.3. Chelatowanie jonów żelaza…………………………………
50
4.2.9.2. Oznaczenie aktywności przeciwdrobnoustrojowej…………………
50
4.2.9.3. Oznaczenie aktywności inhibitorowej wobec
konwertazy angiotensyny I……………………………………...………
50
4.2.9.4. Badanie cytotoksyczności/proliferacji hydrolizatów białkowych
na ludzkich komórkach…………………………………………………..
51
4.2.9.5. Badanie aktywności induktorowej do wydzielania cytokin na
pełnej krwi ludzkiej……………………………………………...
51
4.2.10. Oczyszczanie i rozdział peptydów………………………………………...…...
52
4.2.10.1. Frakcjonowanie hydrolizatów za pomocą ultrafiltracji.................
52
4.2.10.2. Rozdział frakcji peptydowych metodą chromatografii
żelowej………………………………..……………………………………
52
4.2.11. Oznaczanie ciężarów cząsteczkowych metodą chromatografii
żelowej………………………………………………………………………….....…
53
4.2.12. Wyznaczanie mas cząsteczkowych peptydów………………………………
53
3
SPIS TREŚCI
4.2.13. Oznaczanie składu aminokwasowego…………………………………………
53
4.2.14. Oznaczanie sekwencji aminokwasowej peptydów…………………………
54
4.2.15. Synteza chemiczna peptydów…………………………………………………...
54
4.2.16. Analiza peptydów z wykorzystaniem wysokorozdzielczej
spektrometrii mas (HR- ESI-MS)……………………………………………….
55
5. Schemat układu doświadczenia………………………………………………………
56
6. Wyniki……………………………………………………………………………...……………..
57
6.1. Charakterystyka substratów białkowych wykorzystywanych w reakcji
hydrolizy………………………………………………………………………………………
57
6.2. Hydroliza enzymatyczna białek modelowych: foswityny i
immunoglobuliny Y wyizolowanych z żółtka jaja………………………………..
60
6.2.1. Hydroliza enzymatyczna…………………………………………………………..
60
6.2.2. Aktywności biologiczne uzyskanych hydrolizatów………………………….
68
6.2.2.1. Aktywność przeciwutleniająca…………………………………………
68
6.2.2.2. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa…………………………...…….
71
6.3. Hydroliza enzymatyczna białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja…………….
72
6.3.1. Hydroliza enzymatyczna…………………………………………………………..
72
6.3.2. Aktywności biologiczne enzymatycznych hydrolizatów białek
77
poekstrakcyjnych z żółtka jaja……………………………………………………
6.3.2.1. Aktywność przeciwutleniająca…………………………………………
77
6.3.2.2. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa…………………………………
80
6.3.2.3. Aktywność antyhipertensyjna………………………………………….
80
6.3.2.4. Aktywność cytotoksyczna/proliferacyjna……………………………
83
6.3.2.5. Aktywność immunostymulująca………………………………………
85
6.3.3. Izolacja peptydów z hydrolizatów wykazujących najwyższe aktywności
biologiczne……………………………………………………………………………
86
6.3.3.1. Ultrafiltracja wybranych hydrolizatów z udziałem membran
polietylenosulfonowych…………………………………………………
86
6.3.3.2. Rozdział wybranych frakcji peptydowych na kolumnie
4
SPIS TREŚCI
żelowej………………………………………………………………...……..
88
6.3.3.3. Chromatografia hydrofobowa w odwróconych fazach (RPHPLC) wybranych subfrakcji peptydowych o najwyższych
aktywnościach biologicznych i charakterystyka zawartych
w nich peptydów……………………………………………...….……..…
92
6.3.3.3.1. Rozdział subfrakcji 4.2………………………..………………
92
6.3.3.3.1. Rozdział subfrakcji 4.4…………………………..……………
94
6.3.3.3.1. Rozdział subfrakcji 6.3……………………………..…………
98
6.3.3.3.1. Rozdział subfrakcji 7.5……………………………..…………
100
6.3.4. Otrzymywanie syntetycznych peptydów
i ocena ich aktywności biologicznej……………………………………………
103
6.4. Hydroliza białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja w warunkach
przemysłowych przy udziale proteinazy z Bacillus amyloliquefaciens……...
109
6.4.1. Hydroliza enzymatyczna…………………………………………………………..
109
6.4.2. Aktywności biologiczne uzyskanego hydrolizatu………………………….…
112
7. Dyskusja……………………………………………………………………………………….....
114
7.1. Charakterystyka substratów białkowych wykorzystywanych w reakcji
hydrolizy………………………………………….…………………………………………...
114
7.2. Hydroliza enzymatyczna białek modelowych: foswityny i
immunoglobuliny Y wyizolowanych z żółtka jaja…………………….…………..
116
7.2.1. Hydroliza enzymatyczna…………………………………………………………..
116
7.2.2. Aktywności biologiczne uzyskanych hydrolizatów…………………………
120
7.3. Badania na białkach poekstrakcyjnych z żółtka jaja…………………….……...
125
7.3.1. Hydroliza enzymatyczna…………………………………………………………..
125
7.3.2. Aktywności biologiczne enzymatycznych hydrolizatów białek
poekstrakcyjnych z żółtka jaja……………………………………………………
127
7.3.2.1. Aktywność przeciwutleniająca…………………………………………
128
7.3.2.2. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa…………………………………
130
7.3.2.3. Aktywność antyhipertensyjna…………………………………….…….
131
7.3.2.4. Aktywność cytotoksyczna/proliferacyjna…………………………….
132
5
SPIS TREŚCI
7.3.2.5. Aktywność immunostymulująca……………………………………….
133
7.3.3. Izolacja peptydów z hydrolizatów wykazujących najwyższe aktywności
134
biologiczne………………………………………………………………………….....
7.3.3.1. Ultrafiltracja wybranych hydrolizatów z udziałem membran
polietylenosulfonowych…………………………………………………
135
7.3.3.2. Rozdział wybranych frakcji peptydowych na kolumnie żelowej..
136
7.3.3.3. Chromatografia hydrofobowa w odwróconych fazach (RPHPLC) wybranych subfrakcji peptydowych o najwyższych
aktywnościach biologicznych i charakterystyka zawartych
w nich peptydów……………………………………………...….……..…
138
7.3.4. Otrzymywanie syntetycznych peptydów i ocena ich aktywności
biologicznej…………………………………………………………………...……....
141
7.4. Hydroliza białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja w warunkach
przemysłowych przy udziale proteinazy z Bacillus amyloliquefaciens…...…
143
7.4.1. Hydroliza enzymatyczna……………………………………………………..……
144
7.4.2. Aktywności biologiczne uzyskanego hydrolizatu………………….………...
144
8. Podsumowanie i Wnioski………………………………………………………………... 146
Lista tabel i rysunków…………………………………………………………………….. 148
9. Literatura……………………………………………………………………………………….. 152
6
WYKAZ SKRÓTÓW
Wykaz używanych skrótów
ACE
konwertaza angiotensyny (ang. angiotensin converting enzyme)
Balb 3T3
linia komórkowa mysich fibroblastów
BHA
butylohydroksyanizol (E320) (ang. butylated hydroxyanisole)
CPPs
fosfopeptydy kazeinowe (ang. caseinophosphopeptides)
CVD
choroby sercowo-naczyniowe (ang. cardivascullar diseases)
DCM
dichlorometan
DH
stopień hydrolizy (ang. degree of hydrolysis)
DHA
kwas dokozaheksaenowy (ang. docosahexaenoic acid)
DIEA
N,N-diizopropyloetyloamina
DMEM
podłoże-suplement do hodowli komórkowej
(ang. dulbecco's modified eagles medium)
DMF
N,N-dimetyloformamid
DPPH
1,1-difenylo-2-pikrylohydrazyl
EDTA
kwas etylenodiaminotetraoctowy (ang. ethylenediaminetetraacetic acid)
ELISA
test immunoenzymatyczny (ang. enzyme-linked iimmunosorbent assay)
ESI
elektrorozpylanie (ang. electrospray)
FAO
Organizacja Narodów Zjednoczonych do spraw Wyżywienia i Rolnictwa
(ang. Food and Agriculture Organization of the United Nations)
FCS
płodowa surowica cielęca (ang. fetal calf serum)
FRAP
FRAP- zdolność redukcji stopnia utlenienina jonów żelaza
(ang. ferric reducing antioxidant power)
FT-ICR
analizator cyklotronowego rezonansu jonów z fourierowską transformacją
wyników (ang. fourier transform ion cyclotron resonance)
HaCaT
linia komórkowa ludzkich keratynocytów
HDL
lipoproteiny o wysokiej gęstości (ang. high density lipoprotein)
HepG2
linia komórkowa ludzkich hepatocytów
HOBt
hydroksybenzotriazol
HR-MS
spektrometria masowa wysokiej rozdzielczości
(ang. high-resolution mass spektrometry)
IC50
stężenie powodujące zmniejszenie wartości danego parametru o 50%
(ang. inhibitory concentration)
7
WYKAZ SKRÓTÓW
IL
interleukina (ang. interleukin)
IgY
immunoglobulina Y
kDa
kilo dalton
LDL
lipoproteiny o niskiej gęstości (ang. low density lipoprotein)
LPS
lipopolisacharyd, endotoksyna
MALDI-TOF
spektrometr mas, w którym połączono desorpcję laserową z udziałem
matrycy z analizatorem czasu przelotu
(ang. matrix associated laser desorption/ionization time of flight)
m.cz.
masa cząsteczkowa
MeOH
metanol
MTT
3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2-5-difenylo-bromek tetrazoliny
PBS
buforowany roztwór soli fizjologicznej (ang. phosphate buffered saline)
PC
fosfatydylocholina (ang. phosphatidylcholine)
PCR
reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction)
pI
punkt izoelektryczny
RP-HPLC
wysokosprawna chromatografia cieczowa w układzie odwróconym
(ang. reversed phase high performance liquid chromatography)
RPMI
Medium hodowlane dla komórek eukariotycznych
(ang. Roswell Park Memorial Institute medium)
SDS-PAGE
elektroforeza poliakrylamidowa białek w warunkach denaturujących
(ang. sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)
TBHQ
tetr-butylohydroksychinon (E319) (ang. tert-butylhydroquinone)
TCA
kwas trichlorooctowy (ang. trichloroacetic acid)
TCTU
o-(benzotriazol-1-ylo)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy tetrafluoroboran
TFA
kwas trifluoroctowy (ang. trifluoroacetic acid)
TIS
triizopropylosilan
TNBS
kwas trinitrobenzoesosulfonowy (ang. 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid)
TNF-α
czynnik martwicy guza, cytokina związana z procesem zapalnym
(ang. tumor necrosis factor)
TPTZ
2,4,6-tripirydylo-s-triazyna
Tris-HCl
tris (hydroksymetylo) aminometan, chlorowodorek
TSA
agar trypyozowo-sojowy do hodowli mikroorganizmów
(ang. trypticase soy agar)
8
WYKAZ SKRÓTÓW
bulion tryptozowo- sojowy do hodowli mikroorganizmów
TSB
(ang. tryptic soy broth)
WGA
wolne grupy aminowe
WHO
Światowa Organizacja Zdrowia (ang. World Helath Organization)
WNKT
wielonienasycone kwasy tłuszczowe
Skróty nazw aminokwasów
NAZWA
LITEROWA
NAZWA
TRÓJLITEROWA
PEŁNA NAZWA AMINOKWASU
A
Ala
Alanina
B
Anx
Asparagina/Kwas asparaginowy
C
Cys
Cysteina
D
Asp
Kwas asparaginowy
E
Glu
Kwas glutaminowy
F*
Phe
Fenyloalanina
G
Gly
Glicyna
H*
His
Histydyna
I
Ile
Izoleucyna
K*
Lys
Lizyna
L*
Leu
Leucyna
M*
Met
Metionina
N
Asn
Asparagina
P
Pro
Prolina
Q
Gln
Glutamina
R
Arg
Arginina
S
Ser
Seryna
T*
Thr
Treonina
V*
Val
Walina
W*
Trp
Tryptofan
Y*
Tyr
Tyrozyna
Z
Glx
Glutamina/ Kwas glutaminowy
* aminokwas egzogenny
9
STRESZCZENIE
1. STRESZCZENIE
Celem badań prezentowanych w niniejszej pracy była próba zagospodarowania białek
żółtka jaja pozyskanych zarówno na drodze izolacji w warunkach laboratoryjnych (preparat
foswitynowy, IgY), jak również jako zdenaturowany produkt uboczny po ekstrakcji
fosfolipidów w warunkach przemysłowych. W ramach prowadzonych doświadczeń
zaproponowano metodę hydrolizy enzymatycznej jako sposób pozyskiwania bioaktywnych
peptydów z białek żółtka jaja, które następnie izolowano z wybranych hydrolizatów
i identyfikowano.
Pierwszy etap badań z wykorzystaniem preparatu foswitynowego i IgY umożliwił
zoptymailowanie warunków hydrolizy i wybranie enzymów umożliwiających otrzymanie
bioaktywnych produktów. Do degradacji białek wykorzystano niekomercyjne preparaty
enzymów proteolitycznych: serynową i aspartylową proteinazę z drożdży Yarrowia lipolytica
oraz serynową proteinazę z dyni figolistnej (Cucurbita ficifolia), a także enzymy komercyjne
pochodzenia mikrobiologicznego, w tym: proteinazę z Aspergillus melleus, neutrazę
z Bacillus amyloliquefaciens oraz termolizynę z Bacillus thermoproteolyticus rokko. Kolejny
etap
doświadczeń
polegał
na
przeprowadzeniu
hydroliz
enzymatycznych
z udziałem wytypowanych proteinaz niekonwencjonalnych na białkach poekstrakcyjnych
z żółtka jaja. Hydrolizę prowadzono z udziałem poszczególnych enzymów bądź dwóch
wybranych enzymów, wprowadzanych do mieszaniny reakcyjnej jednocześnie lub
sekwencyjnie w odpowiednich odstępach czasowych.
Postęp wszystkich przeprowadzonych hydroliz monitorowano poprzez oznaczenie
stopnia hydrolizy (DH %) i przyrostu wolnych grup aminowych oraz analizę profili
peptydowych uzyskanych metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie
odwróconych faz (RP-HPLC). W hydrolizatach oznaczano aktywność przeciwutleniającą
(poprzez wyznaczenie siły redukującej, chelatującej i zdolności do wymiatania wolnych
rodników DPPH) i przeciwdrobnoustrojową. W wybranych frakcjach hydrolizatów białek
poekstrakcyjnych oznaczono także aktywność antyhipertensyjną (tj. inhibitorową wobec
konwertazy angiotensyny I (ACE Angiotensin Converting Enzyme), immunomodulujacą
i cytotoksyczną. Z hydrolizatów o najbardziej atrakcyjnych pod względem badanych
aktywności biologicznych właściwościach, izolowano bioaktywne peptydy wykorzystując
metody ultrafiltracji, chromatografii żelowej oraz hydrofobowej w systemie RP-HPLC,
a następnie określano ich masy cząsteczkowe i sekwencje aminokwasowe.
10
STRESZCZENIE
Jak wykazano, badane preparaty białek żółtka jaja, w zależności od warunków procesu
hydrolizy, a w szczególności rodzaju zastosowanego enzymu bądź enzymów i ich dawki,
a także czasu trwania procesu, ulegały w różnym stopniu degradacji. Stopień ich hydrolizy
wahał się od kilku do kilkudziesięciu procent. W degradacji preparatu foswitynowego
najbardziej efektywnymi enzymami okazały się zastosowane jedna po drugiej proteinaza
serynowa z Cucurbita ficifolia oraz proteinaza aspartylowa z Yarrowia lipolytica,
w obecności których osiągnięto DH w granicach 53%. Immunoglobulinę Y z najwyższą
wydajnością hydrolizowała proteinaza serynowa z drożdży Yarrowia lipolytica (DH 29,5%),
natomiast preparat białek poekstrakcyjnych – proteinaza z dyni figolistnej zastosowana
w najwyższej dawce (DH 46,3%).
Analiza aktywności biologicznych hydrolizatów wykazała, że spośród wszystkich
zastosowanych enzymów proteolitycznych niekomercyjne preparaty proteaz z drożdży
Yarrowia lipolytica przyczyniały się w największym stopniu do uwalniania z białek żółtka
peptydów wykazujących aktywność przeciwutleniającą. Największą taką aktywność
wykazywały hydrolizaty preparatu foswitynowego oraz immunoglobuliny Y, które
w szczególności charakteryzowały się bardzo silną zdolnością chelatującą jony żelaza Fe2+
oraz zdolnością wymiatania wolnych rodników DPPH. Pozostałe hydrolizaty otrzymywane
z białek żółtka przejawiały również aktywność przeciwutleniającą, jak i antyhipertensyjną.
Badania
cytotoksyczności
wybranych
hydrolizatów
na
liniach
ludzkich
komórek
keratynocytów (HaCaT) i hepatocytów (HepG2) oraz mysich fibroblastów (Balb 3T3)
potwierdziły, że nie są one wobec nich toksyczne.
Zaproponowana
procedura
izolacji
bioaktywnych
peptydów
z
wybranych
hydrolizatów białek poekstrakcyjnych okazała się efektywna i skutkowała bardzo wysokim
wzrostem ich aktywności przeciwutleniającej i inhibitorowej wobec enzymu ACE.
Chromatografia RP-HPLC, która była końcowym etapem izolacji prowadziła do otrzymania
trzech homogennych oraz trzech niehomogennych frakcji peptydowych, z których każda
składała się z dwóch peptydów. Z hydrolizatu białek poekstrakcyjnych otrzymanego
z udziałem serynowej proteazy z drożdży Yarrowia lipolytica wyizolowano dipeptyd: RV
i dekapeptyd: QSLVSVPGMS, charakteryzujący się silną zdolnością do wymiatania wolnych
rodników DPPH (5,08 µM troloxu/mg). Peptyd RV poza posiadaniem cennych aktywności
biologicznych okazał się również zdolny do kształtowania właściwości smakowych
produktów spożywczych (smaku słonego). Proteaza z dyni figolistnej prowadziła natomiast
do uwolnienia z preparatu tych samych białek, peptydów złożonych z 9 - 18 reszt
11
STRESZCZENIE
aminokwasowych, wykazujących zarówno wysoką aktywność inhibitorową wobec enzymu
ACE (0,14- 0,22 µg), jak i zdolność do wymiatania wolnych rodników DPPH.
Synteza
chemiczna
większości
peptydów
zidentyfikowanych
we
frakcjach
niehomogennych umożliwiła jednoznaczne określenie ich aktywności biologicznej.
Pozwoliło to na wytypowanie peptydu posiadającego najlepszą aktywność przeciwutleniającą
i
antyhipertensyjną wśród wszystkich zidentyfikowanych produktów. Był to peptyd
o
sekwencji
aminokwasowej
LAPSLPGKPKPD pochodzący z
hydrolizatu białek
poekstrakcyjnych otrzymanego z udziałem dyni figolistnej.
Preparat białek poekstrakcyjnych uzyskanych jako produkt uboczny po izolacji
fosfolipidów z żółtka jaja poddano też enzymatycznej hydrolizie w warunkach
przemysłowych z udziałem jednego z najtańszych i
najczęściej wykorzystywanych
komercyjnych enzymów proteolitycznych - neutrazy. W wyniku dwugodzinnego procesu
stopień hydrolizy tych białek wyniósł 27,6%. Otrzymane hydrolizaty charakteryzowały się
znaczącą aktywnością przeciwutleniającą i inhibitorową wobec enzymu ACE.
Uzyskane wyniki potwierdziły wysoką bioaktywność produktów uzyskanych
w wyniku enzymatycznej degradacji białek żółtka jaja. Mogą one znaleźć zastosowanie jako
wysoko przyswajalny i bioaktywny składnik rożnego rodzaju żywności funkcjonalnej czy
nutraceutycznej. Natomiast peptydy o wysokiej czystości mogą być potencjalnymi środkami
farmakologicznymi stosowanymi w prewencji i leczeniu chorób np. cywilizacyjnych.
12
ABSTRACT
ABSTRACT
The aim of the research was the hydrolysis of protein preparation obtained as byproduct during isolation of valuable bioactive compounds form hen egg. In the first step, it
was optimized hydrolysis conditions by using egg yolk phosvitin and immunoglobulin Y as
a substrates for the preparation hydrolysates with antioxidant and antimicrobial activity.
Enzymes used for protein degradation were of microbiological and plant origin:
noncommercial proteolytic enzymes such as serine and aspartyl protease from yeast
Yarrowia lipolytica, serine protease isolated from Asian pumpkin (Cucurbita ficifolia), and
commercial proteases from Aspergillus melleus, Bacillus amyloliquefaciens (neutrase),
Bacillus thermoproteolyticus rokko (termolysin).
In the next step, the denatured protein preparation obtained after isolation
of phospholipids from egg yolk was used for enzymatic reaction with the participation
of selected unconventional enzymes. The research was focused on convertion (utilization)
of those protein by-product into value-added products with improved biological activity by
enzymatic hydrolysis. Additionally the purpose of this study was biochemical characterization
of obtained peptides.
The protein hydrolysis was conducted with the use of described above enzymes,
introduced separately or sequentially after certain time periods. The progress of hydrolysis
was monitored by the determination of DH%, increase of free amino groups content and by
RP-HPLC peptide profiles analysis. In obtained hydrolysates the antioxidant activity (Fe3+
reducing activity, DPPH, chelating activity) as well as antimicrobial activity against Bacillus
sp. strains were determined. Furthermore, in selected fractions also the inhibitory activity
against ACE, immunomodulating and cytotoxic activities were analyzed.
The hydrolysates exhibiting the highest biological activity were separated to single
peptides by ultrafiltration, size-exclusion and RP chromatography on HPLC. The
characterization of obtained peptides based on the determination of their molecular masses
(MS), amino acid composition and primary sequences analysis.
As it was showed the protein preparations differ in their susceptibility to the
hydrolysis. Te serine proteases isolated from Asian pumpkin and from Yarrowia lipolytica
yeast caused the most extensive degradation of egg yolk protein preparation. The determined
degrees of hydrolysis (DHs) % of the analyzed hydrolysates reached the level ranged from
34,8 to 46,6 %. The serine protease from yeast Yarrowia lipolytica was also the most effective
for degradation of IgY (DH 29,5%). In opposite, proteases isolated from Bacillus
13
ABSTRACT
amyloliquefaciens, Yarrowia lipolytica and Asian pumpkin caused the most extensive
degradation of phosvitin preparation reached of 29,3; 27,5 and 26,3% , respectively.
The analysis of biological activities showed that among all proteolytic enzymes used
for hydrolysis the Yarrowia lipolytica proteases were the most effective in releasing peptides
with the highest antioxidant activities. Those peptides obtained during degradation of egg
yolk protein preparation were also characterized by the high Fe2+ chelating activity and
antioxidant activity in DPPH test. The determination of hydrolysates cytotoxity, conducted on
human keratinocytes (HaCaT), hepatocytes (HepG2) and on mice fibroblasts (Balb 3T3,
ATCC CCL-163), showed that they were not toxic for those cell lines.
The compiled procedure for isolation of bioactive peptides from selected hydrolysates
of egg yolk protein preparation obtained after extraction of phospholipids was effective and
resulted in obtaining peptides with the strong antioxidant and ACE inhibitory activities. The
RP-HPLC separation, which was the final step in their separation, resulted in isolation the
three homogenic and three heterogenic peptide fractions. In egg yolk preparation hydrolysate
degraded with serine protease of Yarrowia lipolytica the dipeptide RV and decapeptide
QSLVSVPGMS were identified. The latter it was characterized by high scavenging activity in
DPPH test (5,08 µM trolox/mg). The Asian pumpkin serine protease released from egg yolk
preparation seven peptides composed form 9 to 18 amino acid residues. Those peptides
presented high ACE inhibitory activity (0,14-0,22 µg) as well as the antioxidant activity.
In selected peptides the sequence dependent bioactivity was confirmed in test with their
chemically synthesized analogues. One of the synthesized peptides, peptide with the
sequence: LAPSLPGKPKPD showed the highest antioxidant and antihypertensive activity
of all identified peptides.
The hydrolysates of egg yolk protein preparation was also manufactured in the large industrial scale. After two hours degradation of this preparatoin DH reached the level
of 27,6%. The obtained hydrolysates showed the antioxidant and antihypertensive activities.
14
WSTĘP
2. WSTĘP
2.1. Charakterystyka białek jaja.
Białka to wielkocząsteczkowe polimery, zbudowane z reszt aminokwasowych
połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi -CONH-. Występują one we wszystkich
żywych organizmach oraz wirusach spełniając szereg ważnych funkcji w organizmie (np.
kontrola przenikalności błon komórkowych, kataliza enzymatyczna, kontrola wzrostu
i różnicowania, funkcje immunologiczne) [Sikorski i wsp., 2002]. Białka, poza szerokim
zastosowaniem w różnych gałęziach przemysłu, są podstawowymi i integralnymi składnikami
pożywienia spełniając zarówno odżywczą jak i funkcjonalną rolę. Ich rola odżywcza polega
na dostarczaniu energii, składników budulcowych i regulatorowych dla organizmu, natomiast
funkcjonalność polega na modyfikowaniu właściwości fizykochemicznych i sensorycznych
[Sikorski i wsp., 2002]. Białka mogą być więc dodawane do artykułów spożywczych między
innymi w celu poprawy, np. zdolności wiązania wody lub tłuszczów, a także modyfikowania
wyglądu i tekstury produktu [Anantharaman i Finot, 1993]. Trzeba ponadto zaznaczyć, że
wiele białek żywnościowych wykazuje cenne biologiczne aktywności, dzięki czemu zyskały
zainteresowanie zarówno producentów żywności funkcjonalnej i nutraceutyków, jak
i producentów z sektora farmaceutycznego i kosmetycznego.
Jaja kurze są bardzo ważnym komponentem diety, co uwarunkowanie jest między
innymi ich wysoką zawartością białka. Szerokie wykorzystanie jaj kurzych w przemyśle
żywnościowym związanie jest również z ich wielofunkcjonalnością. Całe jajo lub jego
poszczególne komponenty (białko, żółtko) wykorzystywane są między innymi jako
substancja pianotwórcza, żelotwórcza, tworząca emulsje, jak również wpływająca na walory
sensoryczne produktów wytworzonych z jego udziałem, t. j. makaronów, ciast, majonezów,
dressingów. Właściwości te także w wysokim stopniu skorelowane są ze składem
chemicznym jaj, a w szczególności obecnością określonych protein wykazujących
specyficzne właściwości biologiczne i funkcjonalne [Raikos i wsp., 2006]. Już dawno
udowodniono, że jajo jest bardzo wartościowym źródłem białka dla człowieka [Huopalati
i wsp., 2007]. Warto chociażby wspomnieć, iż ze względu na pełnowartościowy skład
aminokwasowy, białka jaja zostały uznane przez organizację FAO/WHO za międzynarodowy
standard do pomiaru wartości odżywczej innych produktów białkowych. Również
przyswajalność protein jaja jest bardzo duża, lepsza niż białek mleka czy mięsa [Trziszka,
2000].
15
WSTĘP
Podjęto już wiele prób zbadania i zidentyfikowania białek jaja, za pomocą technik
chromatograficznych [Awale i Efstathiou, 1999] i elektroforetycznych [Galyean i Cotterill,
1979] oraz innych zaawansowanych metod analiztycznych, które również przyczyniły
się w dużym stopniu do ich izolacji i oczyszczenia. Przykładem są badania przeprowadzone
przez Desert i wsp. [2001], którzy wykorzystując metodę elektroforezy dwukierunkowej (2D)
i techniki immunochemiczne wyizolowali i zidentyfikowali szereg białek jaja kurzego.
Jednakże wiele protein występujących w jaju nadal nie zostało jeszcze poznanych.
Taki stan rzeczy wynika m. in. z tego, że proteiny jaj ptaków występują najczęściej w formie
mieszaniny lipidów powiązanych niekowalencyjnie w duże kompleksy lipoproteinowe
[Burley i Vahedra, 1989], co stwarza wyjątkową trudność w tch analizie. Białka mogą
również istnieć w różnorodnych polimorficznych formach (lub wariantach genetycznych)
różniących się często tylko jednym lub dwoma aminokwasami oraz, co za tym idzie,
nieznacznie strukturą I-rzędową. Struktura białek zależy również w dużym stopniu od
potranslacyjnej modyfikacji (np. glikozylacji, fosforylacji). Takie proteiny części białkowej
jaja jak owoalbumina, owotransferyna czy owomukoid mogą więc przybierać różnorodne
formy (izoformy) [Mine i wsp., 1990; Herbert i wsp., 2001]. Jak wykazali autorzy:
Greenbaum i wsp. [2003], nie ma ścisłej korelacji pomiędzy ilością mRNA w jajach
a jakością białek, dlatego do pełnego określenia ekspresji białek nie może zostać
wykorzystana jedynie analiza genomu w określonych warunkach. Ilość protein w jajach
kurzych zależna jest bowiem od wpływu środowiska, chorób, stosowanych leków i wieku
nioski. Natomiast, potranslacyjne modyfikacje mogą być oceniane jedynie poprzez analizę
białek [Raikos i wsp., 2006].
Pomimo wszelkich trudności w izolacji i identyfikacji białek jaja, już od połowy 1970
roku prowadzono badania [Bengtsson i wsp., 1977; Burley i Valdehra, 1979; Fichtali i wsp.,
1993; Chiou, 2003; Castellani i wsp., 2004; 2006], mające na celu ich wydzielenie
i scharakteryzowanie pod względem fizykochemicznym. Szczególnie ostatnie lata obfitują
w doniesienia literaturowe dotyczące protein występujących zarówno w części białkowej jak
i żółtkowej jaja, wykazujących cenne aktywności biologiczne [Rehault i wsp., 2007; Mine
i D’Silva, 2008; Eckert i wsp., 2013; Zambrowicz i wsp., 2013]. Ich autorzy udowadniają,
że białka jaja mogą mieć działanie m.in. przeciwdrobnoustrojowe, immunostymulujace,
przeciwutleniające czy też przeciwnowotworowe [Chen i wsp., 2012a; Abdou i wsp., 2013;
Eckert i wsp., 2013].
W składzie chemicznym jaj kurzych białko stanowi około 13%, a jego udział
w poszczególnych elementach jest zróżnicowany: w skorupie występuje około 3%, w białku
16
WSTĘP
około 11% a w żółtku 17 % białka. [Trziszka, 2000]. Wyróżnia się wśród nich proteiny
strukturalne, wiążące i transportujące witaminy lub mikroelementy, enzymy proteolityczne,
inhibitory proteaz oraz immunoglobuliny [Stevens, 1996; Saxena i Tayyab, 1997; Trziszka,
2000; Pihlanto i Korhonen, 2003]. Większość białek posiada komponenty węglowodanowe,
głównie: mannozę, galaktozę, glukozaminę lub acetyloglukozaminę [Trziszka, 2000].
2.1.1. Białka części białkowej jaja.
Jednym z najwcześniej wyizolowanych w czystej postaci białek z jaja kurzego była
owoalbumina,
która
jest
główną
proteiną
części
białkowej.
Owoalbumina
jest
fosfoglikoproteiną, stanowiącą 54% wszystkich protein białka jaja kurzego. Ma masę
cząsteczkową równą 44,5 kDa i zbudowana jest z 385 reszt aminokwasowych, z których
połowa posiada charakter hydrofobowy [Nisbet i wsp., 1981; Trziszka, 2000]. Owoalbumina
jest szeroko stosowana jako wzorzec w badaniach krystalograficznych, ze względu na łatwość
krystalizacji. Wyróżnia się dwie polimorficzne odmiany owoalbuminy, A i B, które różnią się
położeniem kwasu asparaginowego w pozycji 311 [Stevens, 1996]. Podczas dłuższego
przechowywania jaj, spontanicznie z owoalbuminy tworzy się S-owoalbumina. Jej powstanie
jest spowodowane deaminacją asparaginy i glutaminy, co prowadzi do niekorzystnej zmiany
wartości odżywczych jaja [Trziszka, 2000]. Zawartość S-albuminy wzrasta od 5%
(w świeżych jajach) do nawet 81% w jajach przechowywanych w warunkach chłodniczych
przez 6 miesięcy [Donovan i Mapes, 1976]. S-owoalbumina charakteryzuje się większą
odpornością termiczną oraz większą podatnością na proteolizę. Owoalbumina białka jaja jest
wykorzystywana
w
badaniach
jako
modelowe
białko
wywołujące
odpowiedź
immunologiczną [Davis i Reeves, 2002].
Drugim co do ilości białkiem zlokalizowanym w części białkowej jaja jest
owotransferyna (12%), glikoproteina zbudowana z 686 reszt aminokwasowych. Dzięki
obecności w jej N-domenie i w C-domenie, odpowiednio 6-ciu i 9-ciu mostków
disiarczkowych jest białkiem o wysokiej stabilności. Poza tym, posiada ona zdolność
wiązania jonów metali takich jak: Fe3+, Cu2+, Al3+. Właściwość wiązania jonów żelaza
sprawia, że jest ona mało podatna na działanie drobnoustrojów, dlatego też proteina ta ma
właściwości przeciwbakteryjne. [Stevens, 1996; Trziszka, 2000].
17
WSTĘP
Tab.2.1. Zestawienie ważniejszych protein jaja (Trziszka, 2000).
BIAŁKO
Owoalbumina
ZAWARTOŚĆ
[%]
54
MASA
CZĄSTECZKOWA
[kDa]
45
pI
WŁAŚCIWOŚCI
4,6-4,8
Występuje w postaci 3 komponentów A1 A2
A3. W czasie przechowywania przekształca
się w S-owoalbuminę.
Konalbumina
(Owotransferyna)
13
76
6,1
Występuje w postaci 2 frakcji (4:1), tworzy
kompleksy z żelazem, czynnik
bakteriostatyczny
Owomukoid
11
28
4,1
Inhibitor proteinaz głównie trypsyny,
Lizozym (G-1)
3,5
14,3
10,5-11,3
Rozkłada polisacharydy, czynnik
bakteriobójczy, tworzy kompleks z
owomucyną
Globulina (G-2)
4
40
5,5
Globulina (G-3)
4
58
4,8
Owoflawoproteid
0,8
32
3,9-4,1
Zawiera kwas sialowy
Owomakroglobulina
0,5
720
4,5-4,7
Zbudowana z 4 identycznych
podjednosteksilne działanie antygeniczne
Dobre właściwości pianotwórcze
Owomucyna
3,4
3
8,3 x10
4,5-5,0
Zbudowana z podjednostek α i β, zawiera
dużo kwasu sialowego, tworzy kompleks z
lizozymem
Lizozym, który został scharakteryzowany po raz pierwszy przez Fleminga w 1922
roku, jest białkiem globularnym o masie cząsteczkowej wynoszącej 14,4 kDa. Proteina ta
występuje powszechnie w komórkach roślin, zwierząt, bakterii i w bakteriofagach. Występuje
także w dużej ilości w białku jaja. Lizozym jest muramidazą [EC 3.2.1.17], która hydrolizuje
wiązania glikozydowe między N-acetyloglukozaminą a kwasem N-acetylomuramidowym
w polisacharydach budujących ściany komórkowe bakterii. Poza tym hydrolizuje również
wiązania glikozydowe w chitynie [Davis i Reeves, 2002]. Lizozym, dzięki zasadowemu
charakterowi, tworzy kompleksy z innymi białkami, np. owomucyną i biopolimerami. Stan
fizykochemiczny kompleksu lizozym-owomucyna jest wskaźnikiem świeżości jaja, gdyż
odpowiada za strukturę żelową białka [Trziszka, 2000]. Lizozym jest bardzo odporny na
ogrzewanie, co uwarunkowane jest w znacznym stopniu obecnością czterech mostków
disiarczkowych w cząsteczce. Przy ogrzewaniu do 100º C w pH nie przekraczającym 8,5 nie
18
WSTĘP
traci aktywności enzymatycznej. Dzięki swym właściwościom lizozym wykorzystywany jest
obecnie jako naturalny konserwant żywności i stale prowadzone są badania nad jego
szerszym wykorzystaniem w przemyśle spożywczym [Trziszka, 2000]. Przykładowo, Froning
[1994] udowodnił, że białko to zapobiega fermentacji twardych serów i redukuje
chorobotwórcze bakterie na powierzchni mięsa.
Owomucyna, jest dużym białkiem o masie rzędu 5,5-8,3 x 106 Da, która stanowi od
1,5 do 3,5% wszystkich protein w białku. Jej stężenie jest około czterokrotnie większe
w białku gęstym niż w rzadkim. Proteina ta odpowiada za utrzymanie prawidłowej struktury
białka jaja i za jego lepkość. Jest również czynnikiem przeciwwirusowej aglutynacji krwinek,
nie tracąc tej właściwości nawet w temperaturze 100º C [Stevens, 1991; Pellegrini i wsp.,
2004]. Owomucyna wpływa także na pienistość i właściwości emulgujące jaja. Ta pierwsza
właściwość zmniejsza się wraz ze spadkiem masy cząsteczkowej proteiny i jej redukcji za
pomocą β-merkaptoetanolu. Natomiast zdolność do emulgacji zwiększa się proporcjonalnie
do ilości powierzchni hydrofobowej w cząsteczce owomucyny [Pellegrini i wsp., 2004].
Owomukoid, glikoproteina o charakterze kwaśnym, jest zbudowana z 185 reszt
aminokwasowych i stanowi od 10 do 11% protein białka. Owomukoid ma masę 28 kDa.
Zawiera w swoim składzie glukozaminy, mannozę i ok. 1% z kwasu sjalowego. Sekwencja
aminokwasowa w cząsteczce owomukoidu tworzy trzy homologiczne podwójne domeny.
Domeny I i II określa się jako typ A, a domenę III jako typ B. Każda z domen posiada trzy
wewnętrzne mostki disiarczkowe, które warunkują termostabilność cząsteczki białka.
Owomukoid odznacza się też właściwościami inhibitorowymi wobec enzymów trawiennych
takich jak trypsyna czy chymotrypsyna. Właściwości te zależą od sekwencji aminokwasowej
w końcowych regionach każdej z domen [Saxena i Tayyab, 1997; Stevens, 1996].
Kolejnym białkiem wykazującym właściwości inhibitorowe wobec proteinaz
serynowych jest owoinhibitor - białko o masie 49 kDa, stanowiące 1,5% protein jaja. Jest ono
inhibitorem wielu enzymów, takich jak: trypsyna, α-chymotrypsyna, subtylizyna, alkaliczna
proteinaza z Aspergillus oryzae oraz szeregu innych proteinaz bakteryjnych i pleśniowych.
[Stevens, 1991; Saxena i Tayyab, 1997; Tardi i wsp., 1997]. Przypuszcza się, że owoinhibitor
odgrywa główną rolę w ochronie przed rozwojem pleśni, które mogą przenikać do treści jaj
podczas inkubacji i przechowywania [Trziszka, 2000].
Cystatyna
jest
najlepiej
poznanym
inhibitorem
papaino-podobnych
proteaz
cysteinowych. Jej stężenie w białku jaja wynosi około 80 mg/l. Ma masę 13,3 kDa
i zbudowana jest z pojedynczego łańcucha polipeptydowego składającego się z 116 reszt
aminokwasowych. Zawiera ona również w swojej strukturze dwa wiązania disiarczkowe.
19
WSTĘP
Cystatyna jest białkiem o dużej stabilności termicznej w szerokim zakresie pH. Nie traci
swojej aktywności nawet podczas 30-minutowej inkubacji w temperaturze 100º C [Saxena
i Tayyab, 1997; Davis i Reeves, 2002]. Proteina ta chroni treść jaja przed bakteryjnymi
i wirusowymi peptydazami cysteinowymi [Korant i wsp., 1986; Liang i wsp., 2003;
Wesierska i wsp., 2005]. Prawdopodobnie pełni również funkcję regulacyjną w czasie
rozwoju jaja [Gołąb i wsp., 2002; Liang i wsp., 2003].
Bardzo interesującym białkiem jest awidyna, stanowiąca jedynie 0,05% zawartości
białka jaja. Awidyna jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej 63,3 kDa. Jest jedynym
białkiem zawierającym w cząsteczce kwasy nukleinowe [Stevens, 1991; Trziszka, 2000].
Proteina ta zbudowana jest z czterech podjednostek. Każda z nich ma jedno miejsce wiążące
biotynę, witaminę niezbędną do wzrostu wielu drobnoustrojów. Powstały kompleks jest
bardzo trwały w szerokim zakresie pH, w obecności różnych czynników denaturujących,
rozpuszczalników organicznych i enzymów proteolitycznych. Dlatego też awidynę traktuje
się jako naturalny czynnik przeciwbakteryjny [Stevens, 1996; Haas i wsp., 2002].
2.1.2. Charakterystyka żółtka jaja.
Żółtko, zwane inaczej deutoplazmą, stanowi substancję zapasową w komórce jajowej
zawierającą materiał budulcowy i składniki odżywcze dla przyszłego zarodka. Żółtko
wykształca się u różnorodnych organizmów, np. owadów, gadów, ptaków a także ssaków.
Embriony ssaków łożyskowych odżywiają się substancjami zawartymi w żółtku do czasu aż
„zagnieżdżą się” w macicy. Żółtka jaj zawieszone są w białku za pomocą jednego lub dwóch
spiralnych i elastycznych struktur zwanych chalazami [Trziszka, 2000].
W żółtku zawarty jest cały tłuszcz obecny w jaju łącznie z cholesterolem, a także
połowa ilości białka. Ściślej ujmując, żółtko zawiera w przybliżeniu 50% suchej substancji
jaja, z czego główną częścią są lipidy (65-70% suchej masy), i białka (30% suchej masy)
[Trziszka, 2000; Laca i wsp., 2010]. Żółtko stanowi 33% wagi całego jaja i ma wartość
energetyczną przybliżeniu 60 kcal, czyli trzy razy więcej niż białko. Stanowi rezerwuar wielu
minerałów, a dzięki temu, że bogate jest w tłuszcze, zawiera witaminy w nim rozpuszczalne,
takie jak: A, K, E, a także witaminę D, która rzadko znajduje się w naturalnych produktach
żywnościowych. Żółtko bogate jest w kwasy tłuszczowe, zarówno nasycone (23% kwas
palmitynowy, 4% kwas stearynowy, 1% kwas mirystynowy) jak i nienasycone (47% kwasu
oleinowego, 16% kwasu linolenowego, 2% kwasu linolowego). Jest także doskonałym
źródłem lecytyny – fosfolipidu niezbędnego do prawidłowego funkcjonowania układu
20
WSTĘP
nerwowego zwierząt i ludzi. Jego żółty kolor wynika z obecności karotenoidów zwanych
ksantofilami, takich jak luteiny i zeaksantyny [Trziszka, 2000; Farinazzo i wsp., 2009].
Żółtko jaja może być łatwo rozdzielone na dwie frakcje poprzez łagodne wirowanie
bez szkód w postaci denaturacji [McBee i Cotterill, 1979]. Otrzymuje się wówczas
supernatant (plazmę) reprezentujący 75-81% suchej substancji żółtka oraz osad granuli, który
stanowi 19-25% suchej substancji żółtka [Causeret i wsp., 1991; Dyer-Hurdon i Nnanna,
1993; Anton i Gandemer, 1997].
Plazma zawiera głównie lipoproteiny o małej gęstości (LDL) stanowiące 65%
wszystkich substancji białkowych oraz rozpuszczalne w wodzie frakcje określane jako
liwetyny, stanowiące 10% masy żółtka. Liwetyny są bardzo heterogenną częścią białek, gdyż
zawierającą proteiny określane jako α, β i γ, w proporcjach 2:5:3 [Schade i Chacana, 2007].
Porównując liwetyny żółtka z białkami surowicy krwi ptaków można stwierdzić,
że α-liwetyna to albumina, β-liwetyna to α2-glikoproteid, a γ-liwetyna to γ-globulina
[Trziszka, 2000]. Z frakcji liwetynowej wyodrębniono również białka transferynę i
immunoglobulinę klasy G określaną IgY, od angielskiej nazwy żółtka – yolk.
Granule zawierają natomiast 42-48% białek i 15% fosfolipidów. Białka granuli to
w 70% lipoproteiny o dużej gęstości (HDL), w 16% foswityna i w 12% lipoproteiny o małej
gęstości LDL [McCully i wsp., 1962]. Frakcję HDL można rozdzielić metodami
chromatograficznymi na lipowitelinę α i β, które wykazują znaczne podobieństwo w składzie
aminokwasowym, ale różnią się zawartością fosforu i reszt węglowodanowych [Kurizaki
i wsp., 1981]. Ponadto, α-lipowitelina zawiera znacznie wyższą zawartość kwasu sialowego
niż β-lipowitelina, co wyjaśnia jej kwaśny charakter [Juneja i Kim, 1997]. W pH 7 obie
lipowiteliny wystepują w posytaci dimerów, a przy wyższych warościach pH w postaci
monomerow. Z frakcji lipowitelinowych można również wydzielić cztery apoproteidowe
polipeptydy o masach: 28, 44, 74 i 109 kDa, które są wrażliwe na ogrzewanie [Trziszka,
2000]. Rozpuszczalność lipowitelin zależy w zancznym stopniu od ich zawartości lipidów.
Stwierdzono
bowiem,
że
proces
delipidacji
powoduje
jednocześnie
utratę
ich
rozpuszczalności [Wang i Wang, 2009].
21
WSTĘP
Tab.2.2. Zestawienie najważniejszych białek żółtka (Zambrowicz, 2009).
BIAŁKO
Liwetyna
MASA
CZĄSTECZKOWA
[kDa]
80
45
150
pI
4,3- 5,7
5,7-7,6
160 (α)
Foswityna
4,0
190 (β)
Lipoproteidy
LDL
Główne
apoproteiny
tworzące frakcje
LDL
Apowiteliny frakcji
HDL
Lipowiteliny
Polipeptydy HDL
(Apoproteiny)
10,3x10
3
3x10
130
15
3
od 55 do 80
9,4-180
9-13
WŁAŚCIWOŚCI
Składa się z 3 frakcji:
α -albumina, allergen
β - α2 -glikoproteid
γ -γ-globulina, wykazuje aktywność immunologiczną jako
immunoglobulina Y
Ma 2 podjednostki: α i β, bogata w fosfor, zawiera ponad
2+
50% seryny, wiąże żelazo, tworzy kompleksy z jonami Ca i
2+
Mg inhibuje utlenianie fosfolipidów
Wydzielono frakcje: LDL1,
LDL2,
VLDL, HDL posiadające właściwości emulgujące.
pI dla
wszystkich
apoprotein
zawiera się
w zakresie:
6,3– 7,5
Frakcje lipoproteidowe stanowią 66% całej masy żółtka
wchodzą w skład VLDL frakcji HDL ( wyodrębniono 2
subfrakcje: α-HDL i β-LDL)
420 (dimery)
28;44;74;109
występują w postaci dwóch frakcji, wykazują wysoką
stabilność cieplną
wrażliwe na ogrzewanie
Lizozym (G-1)
W ostatnich latach nastąpił bardzo duży postęp w badaniach nad proteomem żółtka
jaja. Mann i Mann [2008] przeprowadzili dogłębną jego analizę z wykorzystaniem FT-ICRMS. Odkryli oni 119 unikalnych białek specyficznych dla żółtka jaja, z których 100
wykazano we frakcji rozpuszczalnej – plazmie, a 19 we frakcji nierozpuszczalnej – granulach.
Odkryto również, że 70 białek jest wspólnych dla obu frakcji. Laca i wsp. [2010] wykonali
frakcjonowanie żółtka otrzymując 3 frakcje: granule, składające się w większości z białek
żółtka, frakcję lipidową, zawierającą lipidy żółtka i frakcję wodną, zawierającą głównie
białka (Rys.2.1).
22
WSTĘP
Rys.2.1. Ogólny schemat frakcjonowania żółtka [Laca i wsp., 2010].
Celem ich badań było scharakteryzowanie fizykochemicznych właściwości każdej
z frakcji i określenie ich potencjalnego wykorzystania. Udowodniono między innymi,
że frakcja granul, wykazuje dużą odporność na denaturację cieplną i posiada dobre
właściwości funkcjonalne, w tym zdolność do tworzenia żeli [Laca i wsp., 2010]. Możliwe
jest więc jej szerokie wykorzystanie w przemyśle żywnościowym. Dodatkową korzyścią jest
fakt, że w przeciwieństwie do całego żółtka stosowanego powszechnie do wyrobu wielu
produktów spożywczych, granule mają zredukowany poziom cholesterolu. Frakcja lipidowa
wykazuje cenne właściwości emulgujące i jest przydatna w przemyśle jako bogate źródło
bioaktywnych lipidów. Białka frakcji wodnej, po ich wyizolowaniu przy użyciu
odpowiednich metod, również mogą być wykorzystane w produkcji żywności, kosmetyków
i przemyśle biotechnologicznym [Trziszka, 2000].
Wykonano ponadto elektroforezę otrzymanych frakcji w żelu poliakryloamidowym
SDS, dzięki czemu możliwe było określenie mas cząsteczkowych występujących w danych
frakcjach białek [Laca i wsp., 2010]. Najcięższe białka zidentyfikowano we frakcji nr 2 (>45
kDa), a najlżejsze we frakcji 3 (<97 kDa). Odnotowano, że frakcja 1 zawiera głównie białka
o masie cząsteczkowej pomiędzy 66-200 kDa (Rys.2.1.).
Kilku badaczy porównało właściwości emulgujące żółtka, plazmy i granuli [Aluko
i wsp., 1998; le Denmat i wsp., 2000]. Ich prace badawcze pozwoliły stwierdzić, że zarówno
23
WSTĘP
całe jajo jak i wyizolowana z niego frakcja plazmy charakteryzowały się taką samą zdolnością
do tworzenia emulsji i jej stabilnością, podczas gdy granule wykazywały odmienne
właściwości. To sugeruje, że głównie plazma zawiera substancje odpowiedzialne za
właściwości emulgujące (LDL). Mizutani, i Nakamura [1984] wykazali, że frakcja LDL jest
o wiele lepszym emulgatorem niż albumina z surowicy wołowej. Udowodniono również,
że frakcja LDL jest związkiem bardziej powierzchniowo czynnym niż białka serwatkowe
[Aluko i wsp., 1998] lub kazeina [Mine i Keeratiurai, 2000]. Warto także wspomnieć,
że frakcja plazmy, dzięki dużej zawartości lipoprotein o małej gęstości (LDL) uznaje się za
krioprotektant w żółtku jaja i dzięki temu może być ona wykorzystana na przemysłową skalę.
Znajomość chemicznego składu i właściwości fizykochemicznych żółtka jaja jest
konieczne dla pełnego zrozumienia funkcjonalnych i biologicznych właściwości jakie
przejawiają
poszczególne
jego
komponenty.
Wiele
białek
żółtka
występujących
w biologicznych kompleksach z lipidami nie jest do dzisiaj scharakteryzowanych. Jednakże,
znane obecnie proteiny wykazują niezmiernie cenne właściwości biologiczne i tym samym
stanowią bodziec do dalszych badań nad proteomem żółtka jaja. Białkami żółtka jaja wartymi
szczególnej uwagi są foswityna i immunoglobulina Y, których charakterystykę i możliwości
wykorzystania przedstawiono poniżej.
2.1.2.1. Foswityna.
Foswityna występująca w żółtku jaja kurzego jest fosfoglikoproteiną, która
reprezentuje kolejno 4% i 11% suchej masy żółtka i białek żółtka [Stadelman i Cotterill,
1986; Trziszka, 2000]. Stanowi ona 25% białek frakcji granularnej żółtka gdzie występuje
w połączeniach z lipoproteinami frakcji gęstej (HDL). Powstaje ona z dużej cząsteczki
prekursorowej – witellogeniny typu II, pochodzącej z plazmy krwi. Występuje ona
w naturalnym kompleksie z innym białkiem zwanym lipowiteliną. Stosunek molowy
foswityny do lipowiteliny wynosi 2:1, co odpowiada stosunkowi wagowemu 0,23:1.
Rozdzielenie tego kompleksu może nastąpić przy użyciu roztworów siarczanu magnezu lub
rozpuszczalników organicznych [Davis i Reeves, 2002].
Foswityna występuje w postaci dwóch złożonych polipeptydów: α-foswityny, która
ma masę cząsteczkową 160 kDa i β-foswityny o masie 190 kDa [Gołąb i wsp., 2002].
α-foswityna zawiera trzy lub cztery podjednostki o masie od 35 do 40 kDa i składa się w
około 6%-tach z węglowodanów, w tym: z 2,5% heksoz, 1% z heksozaminy i 2% z kwasu
sjalowego. β-foswityna zawiera cztery lub pięć podjednostek o masie cząsteczkowej 45 kDa
i znajduje się w niej tylko 2% węglowodanów, głównie heksoz [Węsierska i wsp., 2005].
24
WSTĘP
Szczegółowa analiza aminokwasowa wykazała, że β-foswityna zawiera więcej reszt seryny
oraz histydyny niż α-foswityna. Ta druga cząsteczka jest za to szczególnie bogata w glicynę,
alaninę, lizynę, glutaminę, oraz treoninę [Itoh i wsp., 1983].
Cechą charakterystyczną tego białka jest wysoki stopień ufosforylowania. Związane
jest to z wyjątkową kompozycją aminokwasową (w jej skład wchodzi 54% seryny, ale brak
jest metioniny, tryptofanu i tyrozyny). Fosfor występuje jako kwas fosforowy powiązany
z resztami seryny, a jego udział w foswitynie stanowi 80% w stosunku do całego żółtka.
Obecność w około 96% reszt ufosforylowanej seryny w cząsteczce białka determinuje jego
właściwości [Tini i wsp., 2001]. Przykładowo, niewielka objętość właściwa foswityny wynika
z tego, że dochodzi do odpychania elektrostatycznego o dużej sile pomiędzy naładowanymi
grupami fosforanowymi w jej cząsteczce [Belitz i wsp., 2009]. Dodatkowo, duża zawartość
fosforu w cząsteczce jest odpowiedzialna za jej wysoki ujemny ładunek wynoszący około 17
q i zdolność foswityny do wiązania metali, takich jak Ca2+, Mg2+, Mn2+, Co2+, obecnych
w żółtku. Proteina ta wiąże również prawie całe żelazo (Fe2+, Fe3+) obecne w żółtku, nawet po
jego ogrzaniu. Kompleksy żelazowe są silne i stabilne, a żelazawe są słabe i z łatwością
dysocjują [Davis i Reeves, 2002]. Foswityna formuje również w żółtku agregaty wapnia
poprzez fosfowapniowe połączenia z innymi białkami żółtka.
Polipeptydy foswityny występujące w określonych sekwencjach aminokwasowych
stanowią wydłużony rdzeń cząsteczki, z ujemnie naładowanymi fosfoserynami. Natomiast
ich N- i C-termalne końce, zbudowane są z 15 reszt aminokwasowych o charakterze
hydrofobowym. Liczne wewnętrzne oddziaływania w cząsteczce ograniczają fałdowanie
łańcuchów
polipeptydowych.
W
neutralnym
pH
w przypadkowej, spiralnej konformacji, natomiast
cząsteczka
foswityny
istnieje
β-konformacja przeważa głównie
w środowisku kwaśnym [Choi i wsp., 2004]. Wtórna struktura foswityny jest wrażliwa na
czynniki środowiskowe. Cząsteczka tego białka jest np. stabilna podczas pasteryzacji ale
ulega denaturacji podczas gotowania i sterylizacji [Davis i Reeves, 2002].
Podstawowe badania właściwości foswityny dotyczyły głównie jej zdolności wiązania
metali a także zdolności emulgujących i stabilizujących emulsje [Martinet i wsp., 2003;
Castellani i wsp., 2004; 2006]. Chelatowanie metali generuje antyoksydacyjne właściwości
tego białka. Natomiast natura polielektrolitu oraz silne oddziaływania hydrofobowe
umożliwiają foswitynie tworzenie oraz dobre stabilizowanie emulsji [Damodaran i Paraf,
1997; Castellani i wsp., 2005]. Zdumiewające jest jednak to, że foswityna wykazuje słabe
właściwości
adsorpcyjne
i
prawie
wcale
nie
oddziałuje
na
siły
napięcia
międzypowierzchniowego na granicy faz, nawet w wysokich stężeniach (0,1mg/ml).
25
WSTĘP
Natomiast β-kazeina, owoalbumina czy albumina surowicy wołowej obniżają napięcie
międzypowierzchniowe dużo szybciej i w niższych stężeniach. Udowodniono,że słaba
wydajność adsorpcji foswityny na granicy faz olej-woda, w połączeniu ze zdolnością do
tworzenia emulsji i z łatwością tego białka do wiązania żelaza, związana jest z tym,
że cząsteczka kotwiczona jest na granicy faz za pomocą terminalnej części, prezentując resztę
molekuły w fazie wodnej [Castellani i wsp., 2006]. Stwierdzono również, że aktywność
emulgująca i stabilizująca emulsję, wykazywana przez to białko bardzo się zmniejsza przy
częściowym usunięciu fosforanu przez fosfatazę, bądź też, przez inkubację w warunkach
zasadowych. Dodatek jonów wapnia do roztworu foswityny znacznie pogarsza jej
właściwości emulgujące. Optymalne właściwości foswityny w układach dyspersyjnych są
widoczne przy jej stężeniu wynoszącym 0,5% [Davis i Reeves, 2002].
Foswityna, ze względu na silnie ujemny ładunek cząsteczki jest białkiem bardzo
opornym na działanie różnorodnych proteaz. Natomiast alkaliczna defosforylacja zwiększa jej
podatność na aktywność proteolityczną enzymów [Jiang i Mine, 2000].
Charakterystyczny
skład
foswityny
determinuje
nie
tylko
jej
właściwości
fizykochemiczne ale także i biologiczne. Dzięki właściwościom wiązania jonów
dwuwartościowych foswityna jest czynnikem zwiększającym biodostępność jonów metali,
przeciwutleniającym oraz przeciwdrobnoustrojowym. Przykładowo, białko to (w stężeniu
wynoszącym 0,l mg/ml) wykazuje efekt antybakteryjny wobec Echerichia coli [Sattar Khan i
wsp., 2000]. Natomiast, w roztworach o niskiej sile jonowej foswityna tworzy rozpuszczalne
kompleksy z jonami wapnia i żelaza. Dzięki tym właściwościom jest ona rozpatrywana jako
składnik preparatów farmakologicznych stosowanych w leczeniu osteoporozy. Dalsze
badania przeprowadzone na zwierzętach udowodniły, że dieta wzbogacona w foswitynę
znakomicie zwiększa asymilację wapnia przez organizm i wbudowywanie go do kości [Choi
i wsp., 2004]. Doświadczenia przeprowadzone przez Junga i wsp. [2012] wykazały natomiast,
że białko to może być stosowane w prewencji i leczeniu czerniaka gdyż już w stężeniu
5µg/ml hamuje ekspresję tyrozynazy o około 42% i syntezę melaniny o 17% w komórkach
czerniaka B16F1. Wyniki te wskazują, że foswityna może być wykorzystana jako inhibitor
melanogenezy między innymi w produktach kosmetycznych [Jung i wsp., 2012].
Znane są również inne badania potwierdzające przeciwnowotworowe właściwości tej
proteiny. Przykładowo, Ishikawa i wsp. [2009] wykazali, że preparat białkowy z żółtek jaj
skaładający się głównie z foswityny może skutecznie chronić przed kancerogenezą jelita
grubego. Efekt ten przypisuje się silnemu działaniu antyutleniającemu foswityny i powstałych
z niej peptydów, wykazywanemu zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo [Ishikawa
26
WSTĘP
i wsp., 2004; Katayama i wsp., 2006]. Proteiny te regulują bowiem poziom enzymów
odpowiedzialnych za biosyntezę glutationu (GSH), który odgrywa kluczową rolę
w mechanizmie śmierci komórki [Richman i Meister, 1975].
2.1.2.2. Immunoglobulina Y.
IgY jest główną immunoglobuliną występującą w organizmie ptaka i w żółtku jaja,
którą przez długi czas uważano za ekwiwalent IgG, ze względu na podobieństwo funkcji jak
i jej stężenie w surowicy. W wyniku licznych badań porównawczych obu przeciwciał
udowodniono jednak, że jest to niewłaściwe podejście, z powodu znacznych różnic
strukturalnych pomiędzy nimi [Rudolf i wsp., 2009].
IgY ma masę cząsteczkową równą 180 kDa i jest nieco cięższą immunoglobuliną niż
IgG (150 kDa). IgY składa się z dwóch łańcuchów ciężkich – H (65-70 kDa) oraz dwóch
identycznych łańcuchów lekkich – L (19-21 kDa), które połączone są mostkami
disiarczkowymi. Łańcuchy ciężkie mają jeden zmienny (VH) i cztery stałe obszary domen
(CH1, CH3, CH4). U IgG stałe obszary domen są nieco inne (CH1, CH2, CH3) [Rudolf i wsp.,
2009]. Dodatkowo, domeny te są rozdzielone poprzez region zawiasowy, który zapewnia
znaczną elastyczność fragmentu Fab - części wiążącej antygen - w immunoglobulinie G.
W przeciwieństwie do tej immunoglobuliny, łańcuch ciężki IgY nie ma regionu
zawiasowego, co znacznie ogranicza elastyczność w cząsteczce. Łańcuchy lekkie zarówno
w cząsteczce IgY jak i IgG posiadają jedną zmienną (VL) i jedną stałą domenę (CL) [Larsson
i wsp., 1993]. W immunoglobulinie występującej u ssaków obecne jest jednak disiarczkowe
wiązanie w łańcuchach lekkich pomiędzy regionem VL a regionem CV, którego nie
zaobserwowano u IgY. Połączenie to stabilizuje strukturę cząsteczki IgG, dlatego, można
powiedzieć, że siły molekularnego oddziaływania w immunoglobulinie występującej
u ptaków są słabsze. Fragment Fc występujący w cząsteczkach tych przeciwciał pełni funkcję
efektorową, czyli odpowiada za różne zjawiska, zapoczątkowujące związanie antygenu, np.
immunofagocytozę. W cząsteczce IgY region ten zawiera dwa węglowodanowe łańcuchy
boczne, w przeciwieństwie do IgG, gdzie część Fc zawiera tylko jeden łańcuch [Tini i wsp.,
2001; Rudolf i wsp., 2009].
Obie immunoglobuliny można rozróżnić także na podstawie różnorodnych
właściwości fizycznych. Przykładowo punkt izoelektryczny IgY (5,7-7,6) jest niższy niż
w IgG (6,1-8,5). Cząsteczka IgY jest też bardziej hydrofobowa niż IgG [Rudolf i wsp., 2009].
Immunoglobulina Y jest stabilna w szerokim zakresie pH i w wysokich temperaturach. Jej
aktywność prawie całkowicie zanika dopiero w pH 3,5-3,0, co związane jest z uszkodzeniem
27
WSTĘP
części Fab w cząsteczce [Sharma, 1997]. W zasadowych warunkach działanie IgY nie
zmienia się aż do pH osiągającym wartość 11, a maleje dopiero w pH 12 lub wyższym.
Według Shimizu i wsp. [1993b] immunoglobulina Y jest stabilna w temperaturach pomiędzy
60, a 70 ºC. Jej aktywność spada w miarę ogrzewania przez 15 minut w temperaturze 70 ºC,
a cząsteczka ulega denaturacji w temperaturze powyżej 75 ºC. Mrożenie i liofilizacja tego
białka może powodować znaczący spadek aktywności immunostymulujacej, co może być
prawdopodobnie powiązane z gorszą jego rozpuszczalnością. Jednakże badania Fu i wsp.
[2006] wykazały, że liofilizacja nie powoduje niszczących skutków i redukcji aktywności
cząsteczki IgY.
Immunoglobulina Y jest stosunkowo oporna na trawienie trypsyną i chymotrypsyną,
ale wykazuje dużą podatność na trawienie pepsyną. Wykazano, że niemal całe białko ulega
strawieniu przez pepsynę po 8 godzinach inkubacji, podczas gdy hydrolizaty trypsyny
i chymotrypsyny wykazywały po tym samym czasie znacznie mniejszy stopień hydrolizy
[Hatta i wsp., 1993]. Ukierunkowane trawienie trypsyną, podobnie jak i chymotrypsyną tego
białka nie wpływa na zdolność do wiązania antygenu oraz zlepiania komórek, pomimo
odszczepienia polipeptydów podczas hydrolizy [Shimizu i wsp., 1988; Hatta i wsp., 1993].
Żółtko jaja mieści w sobie około 0,7 mg/ml IgA, 0,15 mg/ml IgM, podczas gdy
zawartość IgY jest o wiele wyższa i wynosi od 8 do 25 mg/ml [Kovacs-Nolan i Mine, 2012].
Podstawową rolą immunoglobulin przetransportowanych do żółtka z surowicy krwi ptaka,
jest wywołanie biernej odporności u zarodka aż do momentu, gdy sam będzie w stanie
wytwarzać w pełni funkcjonalne przeciwciała [Tini i wsp., 2001; Kovacs-Nolan i Mine,
2012]. Zidentyfikowano kilka obszarów w cząsteczce immunoglobuliny Y, które umożliwiają
jej transport do żółtka. Niezbędna do tego procesu jest stała cześć Fc oraz połączone z nią
reszty węglowodanowe. Również domena CH2, CH3 bierze udział w transporcie, gdyż jest ona
rozpoznawana przez odpowiedni receptor odpowiedzialny za przeniesienie IgY do jaja
[Kovacs-Nolan i Mine, 2012].
IgY stanowi główne białko frakcji γ-liwetynowej występującej w plazmie żółtka
[Trziszka, 2000]. Separacja immunoglobuliny odbywa się poprzez usunięcie lipoprotein
plazmy i odzyskanie rozpuszczalnej w wodzie frakcji, co umożliwia dalsze oczyszczenie tego
białka z liwetyn [Polson i wsp., 1980].
Obecnie technologia produkcji IgY jest wysoce nowatorską gałęzią biotechnologii,
która oferuje wiele korzyści. Główny pożytek stanowi wytwarzanie przeciwciał poprzez
nieinwazyjne metody, nie powodujące bólu ani śmierci ptaków, ale oparte na prostym
procesie zbierania jaj. Jest to rozwiązanie idealne, zważywszy na regulacje prawne i problemy
28
WSTĘP
etyczne związane z wykorzystaniem zwierząt do badań. Nioski są tańsze w utrzymaniu niż
np. króliki, a produktywność przeciwciał u niosek jest prawie 18-krotnie większa [Schade
i wsp., 1996]. Ponadto, dzięki wysokiej koncentracji przeciwciał w żółtku, z jednego jaja
można otrzymać ponad 100 mg IgY. Uwzględniając to, że nioska znosi w przybliżeniu 20 jaj
na miesiąc, od jednego ptaka można otrzymać około 2 g przeciwciał miesięcznie [Akita
i Nakai, 1992].
Produkcja ptasich przeciwciał z żółtek jaj kurzych w prosty i wydajny sposób
dostarcza więc doskonałego narzędzia wykorzystywanego w wielu dziedzinach immunologii
i nie tylko. IgY są z sukcesem stosowane w immunohistochemii, immunopercypitacji, testach
Western Blot oraz testach ELISA [Dias da Silva i Tambourgi, 2010]. Immunoglobuliny Y
pozwalają także na terapię niektórych chorób bakteryjnych i wirusowych, gdy zawodzi
leczenie konwencjonalne. Z sukcesem są np. wykorzystywane w profilaktyce biegunek u
ludzi i zwierząt. Szczepionki IgY są skuteczne w terapii i zapobieganiu infekcjom
spowodowanym przez Echerichia coli u prosiąt rotawirusy u cieląt i salmonellozy u myszy
[Erhard i wsp., 1996; Jin i wsp., 1998; Guler i wsp., 2005]. Poliklonalne przeciwciała IgY
działają również antagonistyczne na bakterie Streptococcus agalactiae i Streptycoccus aureus
u krów mlecznych [Coleman, 1996]. Białko to może mieć też terapeutyczne zastosowanie
w przypadku zapalenia wymion (mastitis) [Zhen i wsp., 2008]. Antybakteryjne działanie
immunoglobuliny Y na przykład wobec bakterii Escherichia coli polega na wywoływaniu
strukturalnych zmian komórki bakterii, co hamuje jej przyleganie na powierzchnię nabłonka
oraz zwiększa podatność komórek bakteryjnych na fagocytozę [Lee i wsp., 2002]. IgY
wykorzystywana jest również w immunochemii do wykrywania antygenów wirusowych
i bakteryjnych u roślin i zwierząt, oceny częstotliwości występowania pasożytów w jelitach
zwierząt domowych, a także w badaniach zanieczyszczeń pożywienia toksynami lub lekami
[Pichler i wsp, 1998]. W terapii odpornościowej immunoglobulina Y stosowana jest dzięki
niskiej toksyczności wynikającej z tego, że nie wchodzi ona w reakcję krzyżową z IgG
ssaków i tym samym nie aktywuje dopełniacza w szlaku klasycznym oraz mediatorów
zapalenia [Davis i Reeves, 2002]. Dlatego też, immunoglobulina ta znalazła, między innymi,
zastosowanie w prewencji próchnicy u ludzi, gdyż chroni przed działaniem dużej grupy
mikroorganizmów gromadzących się w płytce nazębnej, np. Strepytococcus mutant. IgY
służy także do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej szczególnie u dzieci i niemowląt.
Dodatkowo, próbuje się ją wykorzystać jako nośnik leków w terapii raka [Pichler i wsp, 1998;
Dias da Silva i Tambourgi, 2010]. Ponadto, ostatnio wykazano, że IgY jest nośnikiem
29
WSTĘP
peptydów,
zwanych
Yolkiną,
o
właściwościach
immunostymulacyjnych
będących
fragmentami witellogeniny II [Polanowski i wsp., 2012; 2013].
2.2. Możliwości wykorzystania żółtka jaja.
2.2.1. Procesy ekstrakcji fosfolipidów.
Żółtko
reprezentuje
niezmiernie
bogate
źródło
aktywnych
składników
wykorzystywanych naturalnie przez rozwijający się zarodek. Stanowi również doskonały
surowiec do pozyskiwania (izolowania) tych substancji z możliwością ich dalszego
wykorzystania w różnorodnych gałęziach przemysłu medycznego, farmaceutycznego,
kosmetycznego i biotechnologicznego. Duże zainteresowanie wzbudzają między innymi
fosfolipidy żółtka jaja zawierające w swoim składzie lecytynę, która ze względu na skład
chemiczny jest bardziej wartościowa od lecytyn pochodzenia roślinnego. Zawiera ona
bowiem w swoim składzie do 80 % fosfatydylocholiny, która jest bardzo ważnym elementem
składowym mózgu i tkanki nerwowej, a także reguluje gospodarkę lipidową organizmu
[Siepka i wsp., 2010]. Wykazano, że fosfolipidy żółtka jaja mogą znacznie obniżyć
wchłanianie cholesterolu u szczurów [Jiang i wsp., 2001]. Wykorzystuje się je również do
produkcji liposomów - kulistych pęcherzyków przenoszących substancje lecznicze [Trziszka,
2000]. Lecytyna pochodząca z żółtka jaja posiada również doskonałe właściwości
emulgujące. Ekstrakcja fosfolipidów z żółtka jaj jest zatem pożądana zarówno dla przemysłu
spożywczego, farmaceutycznego jak i kosmetycznego.
Tradycyjna metoda pozyskiwania fosfolipidów z żółtek jaj polega na ich ekstrakcji za
pomocą
rozpuszczalników
organicznych,
takich
jak
heksan,
etanol,
izopropanol
i choloroform. Jednak, wydajność tego procesu jest stosunkowo niewielka (50%), a proteiny
żółtka ulagają prawie całkowitej denaturacji [Warren i wsp., 1988]. Ponad 89%-ową
wydajność izolacji można otrzymać, gdy proces ekstrakcji etanolem poprzedzi się usunięciem
wody z żółtka za pomocą suszenia rozpyłowego [Sim, 1994]. Inna metoda izolowania
i oczyszczania fosfolipidów z żółtek jaj polega na wykorzystaniu w pierwszej kolejności
etanolu i heksanu do ekstrakcji fosfolipidów, a następnie zastosowania układu heksan-aceton
do ich precypitacji [Palacios i Wang, 2005]. Najlepsze rezultaty można natomiast uzyskać
poprzez połączenie tych rożnorodnych technik, czyli ekstrakcję fosfolipidów etanolem ze
zliofilizowanych i odtłuszczonych żółtek jaj, a następnie oczyszczanie surowej frakcji
fosfolipidowej w układzie heksan-aceton [Siepka i wsp., 2010].
30
WSTĘP
Za racjonalny kierunek wykorzystania surowca jajczarskiego, który ukierunkowany
jest głównie na ekstrakcję cennych fosfolipidów, uważa się również odpowiednie
zagospodarowanie powstałych na drodze tego procesu produktów ubocznych, takich jak
częściowo zdenaturowane odtłuszczone białka żółtka. Otrzymana frakcja proteinowa
pomomo, iż stanowi rezerwuar wielu bioaktywnych białek, w wyniku kontaktu z etanolem
czy heksanem posiada ograniczoną wartość i funkcjonalność. Z drugiej strony, białka
żywnościowe postrzegane są coraz częściej, jako prekursory biologicznie aktywnych
i funkcjonalnych peptydów. Prowadzone są obecnie coraz bardziej zaawansowane badania
dotyczące otrzymywania bipeptydów oraz możliwości ich wykorzystania jako preparatów
nutraceutycznych lub biomedycznych. Jedną z najczęstszych metod otrzymywania peptydów
z białek żywnościowych jest hydroliza enzymatyczna. W tym celu poszukuje się również
niekonwencjonalnych enzymów o dużej wydajności i zdolności do generowania peptydów
o pożądanych właściwościach biologicznych. Jednocześnie opracowywane są metody
hydroliz i technologii procesowych zarówno dla białek natywnych żółtka i białka jaja, jak
również dla białek będących produktami ubocznymi izolacji innych bioaktywnych substancji
z treści jaja [Wang i Wang, 2009; Eckert i wsp., 2013; Pokora i wsp., 2013; Zambrowicz
i wsp., 2013].
2.2.2. Pozyskiwanie bioaktywnych peptydów.
Bioaktywne peptydy, są to fragmenty białek, nieaktywne w sekwencji prekursora,
które po uwolnieniu oddziałują z odpowiednimi receptorami organizmu, regulując jego
funkcje [Kołakowski i wsp. 2005]. W wyniku trawienia, biopeptydy są uwalniane z białek
żywnościowych i wchłaniane do jelita. Tam dostają się do krwi wywierając systemowe lub
miejscowe skutki w układzie pokarmowym. Wywołują one też inne efekty zdrowotne,
między innymi w układach: krwionośnym, nerwowym, i immunologicznym [Hartman
i Miesel, 2007]. Wśród bioaktywnych peptydów wyróżniamy proste dipeptydy jak i złożone,
liniowe czy cykliczne
oligo- i
polipeptydy,
które mogą przejawiać
aktywność
przeciwdrobnoustrojową, przeciwutleniającą, immunostymulującą, antywirusową, opiatową,
regulować ciśnienie krwi, hamować agregację płytek krwi lub też stanowić nośniki jonów
metali [Hartman i Miesel, 2007; Mine i Kovacs Nolan, 2006]. Poza tym, niektóre bioaktywne
peptydy wykazują także aktywność antyamnezyjną, chemotaktyczną, embriotoksyczną,
hemolityczną, inhibitorową, powodują skurcze mięśni gładkich oraz stymulują syntezę
czerwonych krwinek. Regulują także czynność błony śluzowej żołądka, przepływ jonów, czy
mechanizm działania fosfoinozytolu [Kołakowski i wsp., 2005]. Wiele peptydów posiada nie
31
WSTĘP
jedną ale kilka biologicznych aktywności [Korhonen i Pihlanto, 2003; Meisel i FitzGerald,
2003; Meisel, 2004]. Możliwości zastosowania biopeptydów w przemyśle farmaceutycznym,
spożywczym czy kosmetycznym stale się zwiększają. Jednak trudności związane z ich
syntezą lub izolowaniem z naturalnych źródeł na dużą skalę pozostają głównymi
przeszkodami ograniczającymi wprowadzanie nowych produktów zawierających te cenne
związki [Dziuba i Fornal, 2009; Agyei i Danquah, 2012].
Bioaktywne peptydy mogą być otrzymywane w wyniku enzymatycznej hydrolizy
białek, przebiegającej w przewodzie pokarmowym podczas trawienia lub podczas procesów
technologicznych wytwarzania żywności [Dziuba i Fornal, 2009]. Ważną metodą
otrzymywania bioaktywnych peptydów jest ich synteza chemiczna oraz projektowana
hydroliza enzymatyczna. Rzadziej wykorzystywanymi metodami wytwarzania bipeptydów są
metody biologii molekularnej [Zambrowicz i wsp., 2013].
2.2.2.1. Pozyskiwanie biopeptydów na drodze hydrolizy enzymatycznej.
Hydroliza enzymatyczna białek polega na rozszczepieniu wiązań peptydowych
w łańcuchach białek, polipeptydów lub oligopeptydów na odpowiednio mniejsze fragmenty,
przy użyciu enzymów proteolitycznych. Szybkość reakcji hydrolizy zależy od wielu
czynników takich jak: specyficzność i stężenie enzymu, stężenie substratu, szybkość
wymiany masy w układzie E/S, stopień denaturowania białka w substracie, pH, temperatura,
siła jonowa w medium reakcji oraz obecność aktywatorów i inhibitorów [Kołakowski i wsp.
2005]. Białka zwierzęce (obecne np. w mleku, mięsie, rybach), jak i roślinne (zawarte np.
w soi, roślinach strączkowych, zbożach) ulegają procesom hydrolizy, w wyniku których
powstaja biopeptydy, między innymi podczas produkcji żywności. Hydroliza może
następować wówczas dwoma dogami – podczas fermentacji produktów żywnościowych,
w wyniku działania enzymów bakteryjnych, grzybowych lub innych proteinaz, albo w skutek
bezpośredniej hydrolizy białka [FitzGerald i O’Cuinn, 2006]. Proteoliza może być również
prowadzona w systemie jedno- lub dwuetapowym. Hydroliza jednoetapowa przebiega
w sposób ciągły, a pH mieszaniny zmienia się samoczynnie w wyniku trwania reakcji lub też
jest utrzymywane na stałym poziomie przez dodatek kwasów albo zasad. Natomiast, podczas
hydrolizy dwuetapowej w kolejnych etapach proteolizy stosowanie są różnorodne enzymy,
najczęściej najpierw endopeptydaza a później egzopeptydaza, lub też zmienia się pH reakcji,
przy zastosowaniu tego samego enzymu [Kołakowski i wsp., 2005].
Najcześciej
hydrolizę
enzymatyczną
białek
żywnościowych
przeprowadza
się z udziałem enzymów trawiennych, głównie trypsyny, alkalazy, chymotrypsyny, pepsyny
32
WSTĘP
lub ich mieszanin, a także enzymów pochodzenia bakteryjnego i grzybowego [Yamamoto
i wsp., 2003]. Możliwość otrzymania biologicznie aktywnych peptydów z białka
zawierającego bioaktywne sekwencje peptydowe zależy od zastosowania enzymów
o odpowiedniej specyficzności, w tym egzopeptydaz hydrolizujących wiązania na N- i Ckońcach peptydów [Dziuba i Fornal, 2009]. Obecnie, projektowanie procesu hydrolizy
ukierunkowanej na otrzymanie peptydów o pożądanej aktywności jest ułatwione dzięki
istnieniu dostępnych w Internecie programów stymulujących hydrolizę białek za pomocą
najczęściej wykorzystywanych proteinaz (baza BIOPEP, czy PeptideCutter) [Dziuba i wsp.,
2003; Gasteiger i wsp., 2005]. Dodatkowo, stale zgłaszane są nowe źródła enzymów
proteolitycznych, jak np., rozwijające się w ekstremalnych warunkach organizmy egzotyczne,
których proteinazy są wyjątkowo stabilne i/lub aktywne w nieprzyjaznych warunkach.
Przykładem może być wysoce termostabilna i alkalofilowa,
proteinaza z wyizolowana
z grzyba Engyodontum album odpornego na wysokie stężenia soli [Chellapan i wsp., 2006].
Problemem pojawiającym się w końcowej fazie hydrolizy enzymatycznej staje
się usunięcie enzymu z mieszaniny reakcyjnej. Poza tym, ważnym warunkiem specyficznej
proteolizy białka jest konieczność stosowania bardzo czystych preparatów enzymatycznych
w
celu
uniknięcia
niespecyficznego
trawienia
i
dodatkowego
zanieczyszczenia
hydrolizowanego białka [Rosenberg, 1996].
Hydroliza enzymatyczna prowadzi do otrzymania wieloskładnikowej mieszaniny
peptydów, w której tylko część składników wykazuje aktywność biologiczną. Może ona
zawierać także niezhydrolizowane białka, polipeptydy, enzymy i inne składniki, a niekiedy
komórki bakterii. Powstałe bioaktywne peptydy wymagają więc oczyszczenia [Graszkiewicz
i wsp., 2007; Gildberg i wsp., 2011; Majumder i Wu, 2011]. Standardowe procedury
obejmują rozdzielanie mieszaniny produktów proteolizy lub wyizolowanej frakcji peptydowej
na subfrakcje z wykorzystaniem różnych technik chromatograficznych lub ultrafiltracji,
a następnie badanie aktywności poszczególnych subfrakcji oraz identyfikację składników
aktywnych [Je i wsp., 2009; Gu i wsp., 2011; Ghassem i wsp., 2012; Pihlanto i Mäkinen,
2013].
Negatywnym aspektem hydrolizy enzymatycznej białek jest wzmaganie goryczy
artykułów żywnościowych poprzez powstawanie gorzkich peptydów, zawierających w swoim
składzie aminokwasy hydrofobowe w pozycji C-końcowej oraz aminokwasy obojętne na
N-końcu [Kroger i wsp., 2006]. Gorzki smak hydrolizatów białkowych można redukować do
poziomu możliwego do zaakceptowania za pomocą ultrafiltracji, obróbki na węglu
aktywowanym lub reakcji plasteinowania [Dziuba i Fornal, 2009]. Udowodniono również,
33
WSTĘP
że używając określonych enzymów do procesu hydrolizy można gorzkie peptydy znacznie
zniwelować [FitzGerald i O’Cuinn, 2006].
Pomimo stosunkowo niskiej wydajności i wysokich kosztów enzymów, procesy
proteolityczne posiadają wciąż wiele zalet w stosunku do syntezy chemicznej peptydów.
Podstawowym atutem, jest ich wysoka stereospecyficzność, łagodne warunki reakcji oraz
duże bezpieczeństwo wynikające z nie stosowania toksycznych dla środowiska odczynników
[Dziuba i Fornal, 2009]. Hydroliza enzymatyczna jest również procesem stosunkowo
szybkim, łatwym w kontroli i nie wymagającym wielu operacji, które są niezbędne podczas
syntezy chemicznej biopeptydów [Guzmán i wsp., 2007]. Dlatego istnieje możliwość
otrzymywania hydrolizatów białkowych o określonym stopniu hydrolizy i składzie peptydów,
charakteryzujących się wysoką aktywnością biologiczną i jakością żywieniową, na większą
skalę [Darewicz i wsp. 2000].
W produkcji bioaktywnych peptydów stosowanie białek żywnosciowych przynosi
wiele zalet. Peptydy uwolnione z tych białek są doskonale tolerowane przez organizm,
a redukcja testów toksykologicznych może znacznie obniżyć koszty ich wdrożenia, np.
w przemyśle farmaceutycznym [Zambrowicz i wsp., 2013]. Niektóre procesy hydrolizy
proteolitycznej prowadzone są w skali przemysłowej w sposób ciągły i obsługiwane są przez
reaktory enzymatyczne zaopatrzone w systemy membranowe [Herrmann i wsp., 1991; Pokora
i wsp., 2013]. Procesy enzymatyczne znacznie usprawnia także immobilizacja enzymów na
odpowiednich niośnikach [Dziuba i Fornal, 2009]. Hydroliza prowadzona na złożu
z immobilizowanym enzymem pozwala na jego wielokrotne wykorzystanie, co przyczynia się
do obniżenia kosztów procesu. Metoda ta jednocześnie ogranicza autolizę enzymu
prowadzącą do powstania wtórnych metabolitów [Agyei i Danquah, 2011]. Technika ta
z powodzeniem została wykorzystana do uzyskania bioaktywnych frakcji peptydowych
między innymi z białek gorczycy (Brassica carinata) [Pedroche i wsp., 2007].
2.2.2.2. Synteza chemiczna biopeptydów.
Synteza chemiczna jest metodą stosowaną do otrzymywania peptydów modelowych
oraz wykorzystywanych w medycynie lub w produkcji żywności, których otrzymanie w inny
sposób nie jest uzasadnione ekonomicznie [Kimmerlin i Seebach, 2005]. Poza tym, tego typu
syntezę
wykorzystuje
się
również
do
potwierdzania
przewidywanych
struktur
pierwszorzędowych, badania bioaktywności analogów biologicznie aktywnych peptydów
oraz sprawdzania zmian aktywności biopeptydow w wyniku modyfikacji chemicznych.
34
WSTĘP
Synteza chemiczna służy także do otrzymywania peptydow o strukturze zaprojektowanej
w celu uzyskania określonej aktywności biologicznej [Dziuba i Fornal, 2009].
Wyróżniamy głównie dwie metody syntezy chemicznej: w fazie stałej oraz w fazie
ciekłej. Synteza w fazie stałej jest najbardziej skutecznym sposobem otrzymywania peptydów
składających się z około 10 do ponad 100 reszt aminokwasowych w skali laboratoryjnej.
Jednak wysoki koszt aparatury i odczynników w znacznym stopniu ogranicza jej
zastosowanie. Z drugiej strony, synteza peptydów w fazie ciekłej jest korzystną metodą
pozyskiwania stosunkowo krótkich bioaktywnych związków na większą skalę [Gill, 1996].
Główną zaletą tej metody jest również to, że produkty pośrednie mogą być
izolowane i oczyszczane na każdym etapie syntezy, by nastepnie zostać połączone w większe
peptydy o żądanej sekwencji [Guzmán i wsp., 2007].
Idealna procedura selektywnej chemicznej syntezy peptydów musi spełniać kryteria
wysokiej specyficzności i wydajności, najlepiej bez uzyskiwania produktów ubocznych.
Niestety wiele z proponowanych metod nie spełnia wyżej wymienionych warunków
w stopniu wystarczającym. Najważniejsze ograniczenia syntezy chemicznej wiążą się
z wykorzystaniem toksycznych odczynników chemicznych używanych do blokowania
funkcjonalnych grup aminokwasowych oraz do reakcji sprzęgania i acylacji. Stanowią one
bowiem bardzo duże obciążenie dla środowiska i są istotną przeszkodą zastosowania tych
technologii do produkcji peptydów wykorzystywanych w przemyśle spożywczym [Gill
i wsp., 1996]. Poza tym, koszty odczynników są zazwyczaj bardzo wysokie, dlatego
stosowanie ich dużych ilości w większej przemysłowej skali jest nieuzasadnione
ekonomicznie. Znaczącą wadą syntezy chemicznej peptydów jest również powstawanie
mieszanin racemicznych i wielu przypadkowych peptydów [Dziuba i Fornal, 2009] .
Synteza chemiczna jest procesem wieloetapowym, gdzie liczba wymaganych operacji
wzrasta proporcjonalnie do liczby reszt aminokwasowych peptydu. Przykładowo synteza
peptydu składającego się z 10 do 20 reszt aminokwasowych, wymaga od 20 do 50 operacji.
To z kolei także wiąże się ze zwiększeniem kosztów procesu [Guzmán i wsp., 2007].
Pomimo tych ograniczeń, synteza chemiczna uważana jest za najbardziej rozwiniętą
dostępną technologię wytwarzania bioaktywnych peptydów. Przy czym, szczególnie nadaje
się ona do syntezy średniej wielkości związków - do stu reszt aminokwasowych, które
obejmują większość peptydów o znaczeniu terapeutycznym [Kimmerlin i Seebach, 2005].
Główną zaletą syntezy chemicznej peptydów jest wysoka czystość otrzymywanych
związków, dlatego metoda ta rozwija się głównie na potrzeby przemysłu farmaceutycznego
[Gill i wsp., 1996]. Duże zainteresowania wzbudza również możliwość otrzymywania
35
WSTĘP
peptydów zmodyfikowanych, poprzez wprowadzanie do sekwencji peptydu określonych grup
funkcyjnych lub zmian w łańcuchach bocznych [Sarabia i wsp., 2004]. Różne inne
modyfikacje końców peptydów, z wykorzystaniem biotyny, fluoresceiny czy rodaminy jako
znaczników, są użyteczne w badaniach kinetycznych in vitro [Chan i White, 2000].
Zastąpienie poszczególnych aminokwasów w sekwencji peptydu może również prowadzić do
wzmocnienia
ich
aktywności.
Przykładowo,
zastąpienie
C-końcowej
fenyloalaniny
tryptofanem w ovokininie (2-7), jednym z najlepiej zcharakteryzowanych biopeptydów białka
jaja, spowodowało znaczną poprawę jego działania przeciwnadciśnieniowego [Yamada i
wsp., 2002]. Atanassov i Tchorbanov [2009] wykazali natomiast, że zamiana określonych
aminokwasów w sekwencji peptydów może zwiększyć ich aktywność przeciwzakrzepową.
Wspołcześnie, ponad 40 zsyntetyzowanych chemicznie peptydów o terapeutycznym
znaczeniu jest obecnych na rynku, co świadczy o dyżym postępie tej technologii, gdyż
w latach 90-tych było ich dostępnych mniej niż 10. Znacznie większa liczba
terapeutycznych peptydów znajduje się obecnie w różnych fazach zatwierdzenia [Guzmán
i wsp., 2007].
2.2.2.3. Pozyskiwanie biopeptydów z użyciem metod biologii molekularnej.
Aktualnie, wiele badań koncentruje się na pozyskiwaniu syntetycznych genów, które
umozliwiają ekspresję bioaktywnych peptydów lub ich prekursorów w komórkach
mikroorganizmów. Jest to obiecująca alternatywa dla hydrolizy bialek żywnościowych, gdzie
ilość uwalnianych bioaktywnych peptydów ograniczona jest stężeniem białka. Przykładowo,
z laktoferyny uwalniana jest podczas hydrolizy enzymatycznej laktoferycyna – peptyd
o silnym działaniu przeciwdrobnoustrojowym. Jednakże ilość tego białka prekursorowego
w mleku krowim jest bardzo niewielka. Uzyskiwanie większych ilości tego biopeptydu jest
możliwe przy użyciu bakterii fermentacji mlekowej [Kim i wsp. 2006;. Renye i Somkuti,
2007]. W wyniku klonowania bakterii Streptococcus thermophilus, udało się otrzymać
2 bioaktywne związki: 11-aminokwasowy peptyd pochodzący z laktoferyny o działaniu
przeciwdrobnoustrojowym
(RRWQWRMKKLG)
oraz
składający
się
z
12
reszt
aminokwasowych peptyd pochodzący z α-S-1 kazeiny, o silnej aktywności antyhipertensyjnej
(FFVAPFPEVFGK). Sekwencje kwasu nukleinowego kodujące te peptydy uzyskano
w wyniku reakcji PCR, a następnie sklonowano je do nowego wektora ekspresyjnego [Renye
i
Somkuti,
2007].
Laktoferycyna
została
również
pomyślnie
ekspresjonowana
i multimeryzowana w komorkach bakterii Escherichia coli BL21 (DE3). Z jednego litra
36
WSTĘP
hodowli komorek otrzymano około 60 mg czystego peptydu o masie cząsteczkowej
odpowiadającej laktoferynie zsyntetyzowanej metodami chemicznymi [Kim i wsp., 2006].
Inna technika wytwarzania peptydów obejmuje ekspresję rekombinowanego białka
w komorce bakterii a następnie hydrolizę tego białka za pomocą określonych proteinaz
obecnych w komórkach. Przykładem takiego procesu jest ekspresja prekursora hormonu
skorupiaka Armadillidium vulgare w komórkach bakterii Escherichia coli, który jest
następnie uwalniany przez hydrolizę endopeptydazą lizynową [Okuno i wsp., 2002].
Chociaż biologiczne systemy ekspresji za pomocą technik genetycznych są bardziej
efektywnym sposobem otrzymywania bioaktywnych peptydów, wymagają one wciąż długich
i kosztownych badań [Dziuba i Fornal, 2009].
2.2.3. Bioaktywne peptydy z żółtka jaja.
Prekursorami biopeptydów mogą być białka żywnościowe, zarówno pochodzenia
zwierzęcego, takie jak: białka mleka (kazeina, białka serwatkowe) czy białka mięśni
(miozyna, kolagen), jak i roślinnego: białka soi (glicynina, β- konglicynina) i białka pszenicy
[Ibrahim i wsp., 1998; Saiga i wsp., 2003; Gibbs i wsp., 2004; Kim i wsp., 2007; Kong i wsp.,
2007, Li i wsp., 2007]. Bogatym źródłem bioaktywnych peptydów, są także białka jaja
kurzego [Tsuge i wsp., 1991; Pellegrini i wsp., 2004; Zambrowicz i wsp., 2009]. Jak dotąd,
liczne badania dotyczące pozyskiwania biopeptydów skupiały się przede wszystkim na
proteinach obecnych w białku jaja, jako ich potencjalnych prekursorów, natomiast
nieproporcjonalnie skąpe są dane literaturowe na temat białek żółtka. Wydaje się jednak, że
sytuacja ta w ostatnich latach się zmienia i badania nad proteinami żółtka jaja jako źródła
bioaktywnych związków zyskują coraz większe zainteresowanie [Pellergini i wsp., 2004;
Abdou i wsp., 2007; Zambrowicz i wsp., 2013].
Największy potencjał do uwalniania bioaktywnych fragmentów ma w szczególności
foswityna, izolowana z frakcji granularnej żółtka, która jest jedną z najbardziej
ufosforylowanych znanych obecnie protein. Już dawno zauważono, na przykładzie produktów
hydrolizy kazeiny mleka, że peptydy ufosforylowane wykazują bardzo cenne aktywności
biologiczne [Sato i wsp., 1986; Park i Allen, 1998]. Zawierają one bowiem skupiska
fosfoseryny, dzięki czemu skuteczne wiążą jony dwuwartościowe takie jak Ca, Mg, Zn, Cu,
Fe, zwiększając tym samym ich biodostępność [Hansen i wsp., 1996; 1997; Kitts, 2005].
Podjednostki kazeiny zawierają jedynie od 1-13 reszt fosfoseryny, natomiast cząsteczka
foswityny posiada ich około 120, dzięki czemu, zarówno natywne białko, jak powstające
37
WSTĘP
z niego peptydy posiadają większą zdolność do kompleksowania jonów metali [Castellani
i wsp., 2004].
Przykładowo, Jiang i Mine [2000, 2001] wykazali w swoich badaniach, że peptydy
pozyskane
z
foswityny
mają
zdolność
wiązania
wapnia
i
hamują
tworzenie
nierozpuszczalnych fosforanów wapnia. W innych badaniach potwierdzono skuteczność
trypsynowych hydrolizatów foswityny w zwiększaniu wchłaniania i akumulacji tego
pierwiastka w kościach u szczurów [Choi i wsp., 2005].
Peptydy foswityny ze względu na silne właściwości chelatujące mogą działać również
przeciwutleniająco. Hydroliza foswityny trypsyną wołową prowadzi do uzyskania frakcji
peptydowych o zdolności hamowania utleniania kwasu linolowego, wymiatania wolnych
rodników DPPH oraz chelatowania jonów żelaza (II) [Xu i wsp., 2007]. Peptydy te
charakteryzują się wysoką zawartością fosforu oraz aminokwasów, takich jak: histydyna,
metionina i tyrozyna [Xu i wsp., 2007]. Wykazano również, że peptydy pozyskane
z foswityny znacząco zmniejszają produkcję prozapalnej IL-8, która stosowana jest jako
biologiczny wskaźnik stresu oksydacyjnego w organizmie [Katayama i wsp., 2006].
Oligopeptydy uwolnione z foswityny posiadają także zdolność zwiększania
wewnątrzkomórkowego poziomu aktywności GSH i regulują ekspresję γ-glutamylocysteiny
w komórkach nabłonka jelit, która katalizuje syntezę GSH [Katayama i wsp., 2006; Katayama
i wsp., 2007]. Z usprawnienia przeciwutleniających systemów ochronnych organizmu wynika
również działanie przeciwnowotworowe foswityny i jej peptydów. Przykładowo, Ishikawa
i wsp. [2009] zauważyli, że spożycie białek żółtka jaja i ich hydrolizatów hamuje proliferację
komórek nowotworowych w jelicie grubym. Natomiast, Azuma i wsp. [2000] udowodnili,
że białka żółtka jaja działają bardziej zapobiegawczo przeciw nowotworowi okrężnicy niż
kazeina mleka.
Inna grupa bipeptydów pochodzących z żółtka jaja, nie będących fragmentami
foswityny wykazała również aktywność przeciwutleniającą. Otrzymano je w wyniku
hydrolizy całego żółtka z udziałem preparatu proteolitycznego Alcalase [Park i wsp., 2001].
Składały się one z 10 i 15 aminokwasów o pierwszorzędowej strukturze, odpowiednio: LeuMet-Ser-Tyr-Met-Trp-Ser-Thr-Ser-Met i Leu-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Arg-Ser-Ser-His-TrpPhe-Ser-Arg-Arg. Taki sam efekt przeciwutleniający wywiera preparat, złożony z frakcji
peptydów o masach cząsteczkowych nie przekraczających 1 kDa, otrzymany w wyniku
proteolitycznego
działania bakteryjnych
enzymów (Bacillus
sp.)
na całe żółtko.
Z powodzeniem został on zastosowany w praktyce, między innymi w wyrobach ciastkarskich
oraz w homogenatach mielonego mięsa wołowego i tuńczyka [Sakanaka i wsp., 2004; 2006].
38
WSTĘP
W wyniku hydrolizy protein żółtka jaja można również uzyskać peptydy o aktywności
antyhipertensyjnej. Degradacja enzymatyczna białek żółtka jaja z udziałem preparatu
proteolitycznego Newlase F otrzymanego z grzybów Rhizopus, prowadzi do uzyskania
oligopeptydów
wykazujących działanie inhibitorowe wobec enzymu ACE. Doustne
podawanie różnych dawek tych oligopeptydów u szczurów wywołało znaczny spadek
skurczowego i rozkurczowego ciśnienia tętniczego krwi [Yoshii i wsp. 2001]. Wysoką
aktywnośc antyhipertensyjną wykazywały także peptydy wyizolowane z hydrolizatów białek
żółtka otrzymanych z udziałem proteinaz pochodzenia bakteryjnego: termolizyny i alkalazy
[You i Wu, 2011].
W badaniach in vivo stwierdzono również stymulujący wpływ preparatu białek żółtka
na wzrost kośćca u szczurów [Leem i wsp., 2004]. W testach in vitro okazało się, że efekt ten
jest wynikiem zwiększania proliferacji komórek osteoblastów MC3T3-E1 przez biopeptydy
uzyskane z białek żółtka [Oi i wsp., 2005].
Tab.2.3. Zestawienie ważniejszych bioaktywnych peptydów wyizolowanych z żółtka jaja (opracowanie własne).
AKTYWNOŚĆ
PEPTYD
(nazwa /sekwencja)
PREKURSOR
BIAŁKOWY
REFERENCJE
frakcja peptydów
m.cz.< 1Kd
preparat z białek
żółtka
Sakanaka i wsp. [2004;
2006]
preparat z białek
żółtka
Park i wsp. [2001]
PPP (Phosvitinophosphopeptides)
foswityna
Xu i wsp. [2007]
oligofosfopeptydy
foswityna
Katayama i wsp., [2006]
oligopeptydy
preparat białek
żółtka
Young i wsp. [2010]
[You i Wu, 2011].
wiązanie jonów metali
PPP (Phosvitinophosphopeptides)
foswityna
Choi i wsp. [2005]
Jiang i Mine [2000, 2001]
antyhipertensyjna
oligopeptydy
preparat z białek
żółtka
Yoshii i wsp. [2005]
immunomodulująca
oligofosfopeptydy
foswityna
Katayama i wsp. [2006]
przeciwnowotworowa
oligopeptydy
preparat z białek
żółtka
Azuma i wsp. (2000)
Ishikawa i wsp. [2009]
proliferacyjna
oligopeptydy
preparat z białek
żółtka
Leem i wsp. [2004].
Oi i wsp. [2005]
Leu-Met-Ser-Tyr-MetTrp-Ser-Thr-Ser-Met
Leu-Glu-Leu-His-LysLeu-Arg-Ser-Ser-HisTrp-Phe-Ser-Arg-Arg
przeciwutleniająca
39
WSTĘP
Peptydy o potencialnej bioaktywności zostały otrzymane również z witeleniny apoproteiny występującej we frakcji lipowitelinowej żółtka. W wyniku jej trawienia pronazą
można otrzymać dwa glikopeptydy, z których jeden charakteryzuje się wysoką zawartością
kwasu sialowego. Kwas sialowy, jest naturalnie występującym w komórkach węglowodanem
o licznych funkcjach biologicznych. Bierze udział między innymi w regulacji adhezji
komórek, neutralizacji różnorodnych toksyn oraz przekazywaniu sygnałów między
komórkami. Sprawdzenie możliwości podobnego działania peptydów wieleniny wymaga
jednak dodatkowych badań [Abdou, 2013].
2.2.4. Możliwości wykorzystania bioaktywnych peptydów oraz ich biodostępność.
Koncepcja produkcji żywności dostarczającej obok składników podstawowych –
potrzebnych do prawidłowego funkcjonowania organizmu, również i dodatkowe –
podnoszące kondycję zdrowotną, warunkujące lepsze samopoczucie oraz zmniejszenie ryzyka
różnorodnych chorób, rozwija się obecnie na szeroką skalę na całym świecie. Inspiracją do
zwiększenia produkcji tzw. żywności funkcjonalnej czy nutraceutyków są między innymi
alarmujące statystyki zapadalności i śmiertelności z powodu chorób cywilizacyjnych,
powstałych w wyniku niewłaściwego stylu życia w tym odżywiania. Szczególne, cenne
właściwości biopeptydów ale również nieoczyszczonych hydrolizatów białkowych sprawiają,
że znalazły zastosowanie między innymi jako składniki zwiększające udział azotu w napojach
specjalnego przeznaczenia, odżywki dla kobiet w ciąży, odżywcze i bakteriobójcze składniki
kosmetyków czy suplementy diety. Można je także już teraz znaleźć w żywności
przeznaczonej dla sportowców lub w produktach hipoalergicznych [Hernell i Lonnerdal,
2003; Schaafsma, 2009). Ponadto, hydrolizaty są również użyteczne jako media wzrostu
różnorodnych pożądanych mikroorganizmów. W wielu badaniach potwierdzony został
pozytywny wpływ frakcji peptydów dodawanych do podłuż w celu poprawy wzrostu
mikroorganizmów lub też produkcji białek rekombinowanych (Duarte de Holanda i Netto,
2006; Quitain i wsp., 2001). Bioaktywne peptydy znajdują również zastosowanie
w przemyśle spożywczym, jako naturalne substancje zapobiegające niepożądanym
mikrobiologicznym i chemicznym przemianom produktów żywnościowych, oraz składniki
nutraceutyków [Sakanaka i wsp., 2004; 2006]. W miarę postępu w nauce i technologii
z pewnością będzie wzrastać zainteresowanie preparatami biopeptydów przez przemysł
farmaceutyczny oraz kosmetyczny.
Jednym z głównych problemów dotyczących efektywności działania biopeptydów jest
ich doustna aplikacja. Aby dostać się do krwiobiegu muszą one bowiem pokonać naturalne
40
WSTĘP
bariery organizmu jakimi są: silnie kwaśne środowisko, pepsyna i enzymy trzustkowe oraz
absorpcja jelita [Gołąb i Warwas, 2005]. Związana jest z tym również biodostępność
biopeptydów, od ktorej zależy ich efekt terapeutyczny in vivo.
Badania kinetyki trawienia peptydów otrzymanych z białek mleka u zwierząt
doświadczalnych wykazało, że niektóre z biopeptydów po spożyciu nie ulegały degradacji
w przewodzie pokarmowym [Scanff i wsp., 1992]. Zazwyczaj wysoka hydrofobowość
peptydów jest przyczyną ich większej odporności na dalszą proteolizę, dlatego mogą być one
w pewnym stopniu przyswajane w całości [Shimizu, 2004]. Inni badacze udowodnili, że po
spożyciu jogurtu lub mleka na skutek enzymatycznego trawienia uwalniane są do krwi takie
wielkocząsteczkowe
peptydy
jak
κ-kazeinoglikopeptyd
oraz
peptyd
pochodzący
z α-S1-kazeiny [Chabance i wsp., 1998].
Masa cząsteczkowa peptydów również wpływa decydująco na ich transport i
biodostępność. Wyniki badań wskazują, że peptydy z 2-6 aminokwasowe są wchłaniane o
wiele łatwiej w porównaniu do białek czy wolnych aminokwasów. Dlatego też, hydrolizaty
białkowe są zalecane w celu dostarczenia łatwo przyswajalnego białka
u pacjentów
cierpiących na skutek niedożywienia czy zaburzeń trawiennych [Gill i wsp., 1996].
Jednocześnie jednak wiadomo, iż w miarę zwiększenia masy czasteczkowej peptydu jego
szanse na pokonanie bariery jelito/krew, maleje. Badania transportu dwóch tripeptydów: IlePro-Pro i Val-Pro-Pro, przy użyciu trzech różnych modeli doświadczalnych wykazały, iż
peptydy te przedostają się w małych ilościach nietknięte przez nabłonek jelitowy [Foltz i
wsp., 2008]. W innych badaniach natomiast, całkowita biodostępność tripeptydów u świń
wynosiła poniżej 0,1%, przez bardzo krótki okres półtrwania w zakresie od 5 do 20 min [van
der Pijl i wsp., 2008]. Oznacza to więc, ze biodostępność biopeptydów może być też zależna
w dużej mierze od cech osobniczych.
Badania nad optymalizacją i poprawą biodostępności bioaktywnych peptydów
przyczyniły się w ostatniej dekadzie do wykrycia różnych sposobów ułatwiających ich
transport.
Odkryto
między
innymi,
że
połączenie
peptydów
z
odpowiednimi
nośnikami powoduje utworzenie nierozpuszczalnego w niskim pH kompleksu, który
po przejściu do jelita rozpuszcza się i ułatwia wchłanianie bioaktywnych związków [Shaji
i Patole, 2008]. Przykładowo, biodostępność bioaktywnych tri peptydów takich jak tri-ValPro-Pro, Ile-Pro-Pro, Leu-Pro-Pro, działających antyhipertensyjnie, można zwiększyć przez
podawanie jednocześnie błonnika pokarmowego wyizolowanego z owoców cytrusowych
[Kies i Van Der Pijl, 2012]. Natomiast, w celu zwiększenia wchłaniania wielu leków
peptydowych stosuje się emulsje [Shaji i Patole, 2008]. Udowodniono również korzyści
41
WSTĘP
płynące
ze
stosowania
innych
strategii
zwiększania
biodostępności,
na
czele
z mikrokapsułkowaniem bioaktywnych peptydów, ich modyfikacją chemiczną zapewniającą
odporność na degradację oraz produkcją wysoce stabilnych analogow peptydowych [Yamada
i wsp., 2002; Pihlanto i Mäkinen, 2013].
42
CEL PRACY
3. CEL PRACY
Jednym z głównych zadań było: opracowanie procedury hydrolizy preparatu
foswitynowego i immunoglobuliny Y otrzymanych z żółtek jaj oraz dobranie najefektywniej
działającego enzymu, umożliwiającego otrzymanie aktywnych biologicznie peptydów.
Podstawowym celem było opracowanie możliwości zagospodarowania preparatu białkowego
pozostałego po procesie ekstrakcji fosfolipidów z żółtka jaja na drodze hydrolizy
enzymatycznej oraz scharakteryzowanie otrzymanych produktów degradacji.
43
MATERIAŁY I METODY
4. MATERIAŁY I METODY
4.1. Materiały
4.1.1. Materiał biologiczny
Materiał biologiczny stanowiły jaja pochodzące od niosek linii Lomann Brown lub
Zielononóżki kuropatwianej dostarczane z Gospodarstwa Specjalistycznego TRONINA.
Substratem w reakcji hydrolizy był preparat foswitynowy wyizolowany z żółtek jaj
zmodyfikowaną metodą według Castellani i wsp., [2006], immunoglobulina Y, otrzymana po
izolacji frakcji foswitynowej oraz preparat białkowy powstały, jako produkt uboczny, po
procesie izolacji fosfolipidów z żółtka jaja w warunkach przemysłowych [Siepka i wsp.,
2010]. Jako standardowe substraty wykorzystano również kazeinę (BDH, Ltd. England) oraz
hemoglobinę wypreparowaną z krwi bydlęcej w Katedrze Technologii Surowców
Zwierzęcych i Zrządzania Jakością.
4.1.2. Enzymy
Do badań wykorzystano niekomercyjne preparaty enzymów proteolitycznych:
proteinazę serynową z dyni figolistnej (Cucurbita ficifolia) oraz proteinazę serynową
i aspartylową z drożdży Yarrowia lipolytica, które otrzymano w Katedrze Technologii
Surowców Zwierzęcych i Zrządzania Jakością. W pracy korzystano również z preparatów
handlowych
enzymów
proteolitycznych,
takich
jak:
termolizyna
z
Bacillus
thermoproteolyticus rokko (Sigma), neutraza z Bacillus amyloliquefaciens (Sigma), oraz
proteinaza z Aspergillus melleus.
4.2. Metody
4.2.1. Izolacja preparatu foswitynowego i immunoglobulinowego z żółtka [Castellani i wsp.,
2006].
Żółtko rozcieńczano 1% NaCl (1:1 w/v) i poddano wirowaniu (1750 x g, t = 10 min).
Supernatant stanowił preparat immunoglobulinowy, który liofilizowano i przechowywano
w temp. 4 °C. Natomiast osad przechowywano w temp. -12 °C przez 7 dni. Następnie granule
rozmrożono i poddano działaniu 1,75 M NaCl (1:1,5 w/v), przez 12 godz. w 4 °C. Po tym
czasie, w procesie wirowania (17000 RCF; 15 min, T= 4 °C), odrzucono górną warstwę
44
MATERIAŁY I METODY
tłuszczową. We frakcji wodno-białkowej obniżono siłę jonową poprzez dodanie H2O
(1:4 v/v) i pozostawiono na 12 godz. w 4 °C. Następnie zawiesinę wirowano (17000 RCF; 15
min, T= 4 °C), osad liofilizowano. W celu oddzielenia fosfolipidów liofilizat rozdrabniano w
moździerzu i poddano trzykrotnej ekstrakcji 96% etanolem (1:3 m/v). Odtłuszczone granule
ponownie poddano liofilizacji. Przed rozpoczęciem hydrolizy preparat foswitynowy poddano
defosforylacji. Naważkę liofilizatu rozpuszczano w 0,4 N NaOH (1:40 w/v) i inkubowano
przez 3 godz. w 37 °C. Następnie roztwór neutralizowano 1 N HCl, dializowano do wody
przez 48 godz. i liofilizowano. Tak przygotowany preparat foswitynowy poddano hydrolizie
enzymatycznej.
4.2.2. Izolacja i oczyszczanie preparatu proteolitycznego z dyni figolistnej (Cucurbita
ficifolia) [Dryjański i wsp., 1990].
Preparat proteolityczny z dyni figolistnej otrzymano przez ekstrakcję miąższu
poddanego homogenizacji. Ekstrakt oddzielono od części stałych poprzez wirowanie (5000g,
20 min, 4 °C). Do otrzymanego supernatantu dodano siarczan amonu in substantia do 50%
nasycenia i pozostawiono przez 24 godz., po czym wirowano (9600 obr./min, 30 min.).
Uzyskany osad będący preparatem enzymatycznym odsalano poprzez dializę przez 12 godz.
do wody destylowanej (temp. 4 °C), a następnie do 0,02 M buforu fosforanowego o pH 6,0.
4.2.3. Otrzymywanie preparatów proteolitycznych z drożdży Yarrowia lipolytica [Szołtysik
i wsp., 2008].
Preparat serynowej i aspartylowej proteinazy z Yarrowia lipolytica otrzymywano
z hodowli wgłębnych drożdży prowadzonych na podłożu mineralno-organicznym o pH
odpowiednio zasadowym i kwaśnym.
4.2.4. Oznaczanie białka.
4.2.4.1. Oznaczanie białka metodą kolorymetryczną [Lowry i wsp., 1951].
Do 1000 µl roztworów białek zawierających od 10-100 µg białka dodawano 5 ml
odczynnika miedziowego i pozostawiono na 10 min w temp. pokojowej. Po tym czasie
dodawano po 500 µl odczynnika Folina i Ciocalteu. Po 60 min mierzono ekstynkcję, wobec
próby odczynnikowej, przy długości fali: λ= 570 nm. Stężenie białka odczytywano wg
krzywej wzorcowej sporządzonej dla albuminy wołowej (BSA), wyrażonej w µg/ml.
45
MATERIAŁY I METODY
4.2.4.2. Oznaczanie białka metodą spektrofotometryczną [Whitaker i Granum, 1980].
Stężenie
białka
w
czystych
roztworach
enzymów
wyznaczano
poprzez
spektrofotometryczny pomiar absorbancji przy długości fali λ = 280 nm pomnożony przez
współczynnik wagowy (np. dla trypsyny: 0,667). Stężenie białka w oczyszczonych frakcjach
peptydów oznaczano poprzez spektrofotometryczny pomiar absorbancji przy długościach fal:
λ= 280 i 235 nm, a następnie wyliczano stężenie białka w mg/ml ze wzoru:
4.2.4.3. Elektroforeza SDS-PAGE [Laemmli, 1970].
Elektroforezę prowadzono w żelu poliakryloamdowym złożonym z: 2 ml buforu
żelowego dolnego (0,4% SDS w 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8), 3,2 ml 30% roztworu akryloamidu
(29,2% akryloamid, 0,8% bisakryloamid), 2,8 ml wody bidestylowanej, 30 µl 10%
nadsiarczanu amonu oraz 5 µl TEMEDU. Przed rozpoczęciem elektroforezy próbkę białka
rozpuszczono (w stężeniu takim aby nanieść na studzienkę od 50 do 150 µg) w buforze do
denaturacji prób (4x stężony: 2,5 ml buforu 1,5 M Tris-HCl, 1g SDS, 2,5 ml
β-merkaptoetanolu, 5 ml glicerolu oraz 4 mg błękitu bromofenolowego) i inkubowano przez 5
min w temp. 100 °C w celu denaturacji próbki. Elektroforezę prowadzono w buforze Trisglicyna pH 8,6 (5x stężony: 7,2 g glicyny, 1,5g Tris, 0,5 g SDS rozpuszczono w 100 ml wody
bidestylowanej), w temp. pokojowej przy natężeniu prądu 40 mA. Po zakończeniu
elektroforezy żel barwiono przez 1 godz. odczynnikiem barwiącym (0,1 % Comassie Brilliant
Blue R- 250 w 40% metanolu w 10% kwasie octowym). Po tym czasie żel przemywano
roztworem 40% metanolu w 10% kwasie octowym aż do momentu odbarwienia tła.
4.2.5. Oznaczanie aktywności enzymatycznych.
4.2.5.1. Oznaczenie aktywności proteolitycznej enzymów aktywnych w środowisku
zasadowym wobec kazeiny [Kunitz, 1945].
Do 900 µl buforu o pH 8,3 (0,1 M Tris; 20 mM CaCl2; 5% DMSO) dodawano po 100
µl enzymu (2-10 µg) i inkubowano przez 2 min w temp. 37 ˚C. Reakcję rozpoczynano
dodając 1000 µl 1% kazeiny (w buforze o pH 8,3). Po 10 min dodawano 3 ml 5% kwasu
TCA. Próby pozostawiono na 10 min, a następnie wirowano (t=15 min, 5,5 tys. obr/min,
T= 20 ºC). Absorbancję mierzono przy długości fali: λ=280 nm. Przyrost absorpcji
46
MATERIAŁY I METODY
odniesiono do kontroli, którą stanowiła próba bez dodatku enzymu. Przyjęto, że 1 jednostka
aktywności enzymu to taka jego ilość, która w powyżej opisanych warunkach, daje przyrost
ekstynkcji ∆ E=0,1.
4.2.5.2. Oznaczenie aktywności proteolitycznej enzymów aktywnych w środowisku kwaśnym
wobec kwasowo-zdenaturowanej hemoglobiny [Chrzanowska i Kołaczkowska, 1998].
Do 750 µl 0,2 M buforu fosforanowo- cytrynianowego o pH 3,0 zawierającego od 2
do 20 µg pepsyny wprowadzono 250 µl 2% kwasowo zdenaturowanej hemoglobiny. Reakcję
prowadzono w 37ºC przez 10 min. Po tym czasie reakcję hamowano poprzez dodanie 1500 µl
5% kwasu TCA. Próby pozostawiono na 10 min, a następnie wirowano (t=15 min, 5,5 tys.
obr/min, T= 20 ºC). Absorbancję mierzono przy długości fali: λ=280 nm. Przyrost absorpcji
odniesiono do kontroli, którą stanowiła próba bez dodatku enzymu. Przyjęto, że 1 jednostka
aktywności enzymu to taka jego ilość, która w powyżej opisanych warunkach, daje przyrost
ekstynkcji ∆ E=0,1.
4.2.6. Hydroliza enzymatyczna.
Reakcję hydrolizy z udziałem proteinaz pozyskiwanych z Cucurbita ficifolia,
Aspergillus melleus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus thermoproteolyticus rokko oraz
proteinazy serynowej z Yarrowia lipolytica prowadzono w 0,1 M buforze Tris-HCl o pH 8,3.
Natomiast w przypadku proteinazy aspartylowej z Yarrowia lipolytica zastosowano 0,05 M
bufor Glicyna-HCl o pH 3,5. Stężenie białka w każdym przypadku wynosiło: 10 mg/ml (1%).
Reakcję hydrolizy rozpoczynano poprzez dodanie określonej ilości enzymów (j/mg
hydrolizowanego białka). Reakcję prowadzono w temperaturze 37 °C przez 0,5; 1; 3; 4; 5 i 24
godz. (badania wstępne z udziałem preparatu foswitynowego i IgY), 0,5; 1; 3 i 5 h (hydrolizy
kombinowane), 0,5; 1; 3; 4; 5; 24; 24,5; 25; 27; 29; 48 godz. (hydrolizy sekwencyjne) lub 0,5;
1; 3 i 4 godz. (badania na białkach poekstrakcyjnych). Po czasie 4, 5, 24 lub 48 godz. proces
hydrolizy hamowano poprzez inkubację prób przez 15 min w temperaturze: 100 °C.
Następnie hydrolizaty wychładzano i wirowano (5500 obr./min, t =15 min, T= pokojowa).
Supernatanty liofilizowano i przechowywano w temp. 4 °C.
4.2.7. Całkowita hydroliza w kwasie solnym.
Do reakcji hydrolizy wykorzystano 4 ml 6 M HCl w którym zawieszono 0,5 g próby
zawierającej 10% r-ór białka. Degradacje prowadzono w 115 °C przez 24 godz. Po tym czasie
47
MATERIAŁY I METODY
próbę wychłodzono i oznaczono zawartość zwolnionych grup aminowych w celu określenia
stopnia hydrolizy.
4.2.8. Analiza hydrolizatów białkowych.
4.2.8.1. Wyznaczanie stopnia hydrolizy (DH) poprzez oznaczenie stężenia peptydów
rozpuszczalnych w 5% kwasie trichlorooctowym (TCA) [Silvestre, 1996].
Do 1ml hydrolizatu dodawano 1ml 10% kwasu trichlorooctowego. Próby
pozostawiono przez 1 godz. (w celu wytrącenia niezhydrolizowanych białek), a następnie
wirowano (1500 obr./min t=15 min, T=5ºC) W otrzymanym supernatancie oznaczono
stężenie białka poprzez pomiar absorbancji przy długościach fali: λ= 280 i 235 nm. Stopień
hydrolizy (DH) wyliczano ze wzoru:
4.2.8.2.Oznaczenie stężenia wolnych grup α- aminowych w reakcji z TNBS [Kuchroo i wsp.,
1983].
Do 2ml odpowiednio rozcieńczonej próby (hydrolizat w 0,1 M boraksie) dodano 50 µl
0,03 M wodnego roztworu TNBS. Próby pozostawiono w zaciemnieniu w temp. pokojowej
przez 2 godz. Po tym czasie dodawano 2 ml roztworu stabilizującego: 0,1 M NaH2PO4
zawierającego 1,5 mM Na2SO3. Następnie mierzono ekstynkcję wobec próby ślepej przy
długości fali λ= 420 nm. Ilość wolnych grup aminowych odczytywano wobec krzywej
wzorcowej sporządzonej dla glicyny (Sigma).
4.2.8.3. Profile peptydowe hydrolizatów techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej
w odwróconych fazach (RP-HPLC) [Ardo i Polychroniadou, 1999].
Rozdział prowadzono na kolumnach chromatograficznych Zorbax XDB C18
o rozmiarach 4,5 x 250, 4,5 x 150 oraz 1,8 x 50, w fazie startowej (A) (0,1% TFA w H2O), w
temp 30 ºC, i gradiencie fazy B (0,1% TFA w ACN). W przypadku hydrolizatów
wyjściowych gradient fazy B wynosił od 0 do 100%, natomiast w przypadku frakcjonowania
hydrolizatów gradienty były zróżnicowane (szczegółowe opisy procesów zamieszczono
w omówieniu wyników). Przed analizą próbę zawieszano w fazie A i odwirowano (15 tys.
48
MATERIAŁY I METODY
obr./min, 15 min). Supernatant w ilości 100 µl nanoszono na kolumnę chromatograficzną.
Eluent monitorowano przy długościach fal: A 230 i A 280 nm.
Analizę RP-HPLC peptydów uzyskanych na drodze syntezy chemicznej prowadzono
na chromatografach cieczowych Thermo Separation Product oraz Varian ProStar. Rozdział
prowadzono na kolumnach YMC-Pack ODS-AQ12S05-2546WT + Guard Column oraz
TSKgel ODS-120T 12TG08eh004 + Guard Column w układzie faz: A (0,1% TFA/H20 i B
(80% CH3CN/H2O + 0,1% TFA).
4.2.9. Oznaczenie aktywności biologicznych hydrolizatów białkowych i frakcji peptydów.
4.2.9.1. Oznaczenie aktywności przeciwutleniającej.
4.2.9.1.1. Zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH [Yen i Chen, 1995].
Do 1 ml rozcieńczonej próbki peptydów zawierającej od 100- 500 µg hydrolizatów
(rozpuszczanych w 0,1 M buforze Tris-HCl o pH 7,0) dodawano 1 ml 96% etanolu, próbę
wymieszano i następnie dodawano 500 µl 0,3 mM etanolowego roztworu rodników DPPH. Po
30 min mierzono absorbancję przy długości fali: λ= 517 nm. Aktywność wyliczano z krzywej
wzorcowej, wyrażonej w ilości µg Troloxu niezbędnych do neutralizacji 0,3 µM roztworu
wolnych rodników DPPH w powyżej opisanych warunkach.
4.2.9.1.2. Zdolność redukcji stopnia utlenienia jonów żelaza (metoda FRAP) [Benzie i Strain,
1996].
Do 3 ml roztworu roboczego (1 A : 1 B : 10 C), A ( 10 mM TPTZ w 40 mM HCl), B
(20 mM FeCl3 x 6 H2O), C (0,3 M buforu octanowy pH 3,6 (3,1 g C2H3NaO2 x 3H2O, 16 ml
kwasu octowego, uzupełniano wodą do 1000 ml) dodawano 1 ml wodnego roztworu badanej
próby (100 – 500 µg). Po 10 min inkubacji w temp. pokojowej mierzono absorbancję
roztworu przy długości fali: λ= 593 nm. Aktywność przeciwutleniającą wyrażano jako
zdolność redukcji stopnia utlenienia jonów żelaza Fe3+do Fe2+. Stężenie jonów Fe2+ w próbie
wyliczano na podstawie krzywej standardowej sporządzonej dla znanych stężeń roztworu
FeSO4. Zdolność redukującą enzymatycznych hydrolizatów i ich frakcji wyliczano na 1 mg
białka.
49
MATERIAŁY I METODY
4.2.9.1.3. Chelatowanie jonów żelaza [Xu i wsp., 2007] – własna modyfikacja metody.
Do 250 µl próby dodawano 1250 µl H2O i 110 µl 1mM FeCl2. Po 2 min dodawano po
1 ml 0,5 mM r-ru ferrozyny. Po 10 min odczytywano absorbancję przy λ= 562 nm. Kontrolą
były odczynniki bez badanej substancji, natomiast w składzie próby ślepej było: 250 µl próby,
2250 µl H2O i 110 µl 1mM FeCl2. Aktywność chelatowania jonów żelaza wyrażano jako ilość
związanego µg FeCl2/mg białka. Krzywa wzorcową sporządzono dla określonych ilości FeCl2
(0-20 µg).
4.2.9.2. Oznaczenie aktywności przeciwdrobnoustrojowej [Węsierska i wsp., 2005] – własna
modyfikacja metody.
Szczepy bakteryjne przechowywano w 4 ºC w postaci hodowli stałej na skosach
agarowych. Inokulum przygotowywano poprzez zmyw bakterii ze skosu do 50 ml podłoża
TSB. Hodowlę prowadzono w temp. 37 ºC do momentu osiągnięcia pożądanej gęstości
komórek wyznaczonej wg skali Mc Farlanda. Zawiesiny bakterii standaryzowano do gęstości
1 x106 jtk/ml. Komórki bakteryjne posiewano na płytkach Petriego ze stałym podłożem TSA
(po 100 µl). Płytki inkubowano przez 2 godz. w temp. 37 ºC. Po tym czasie na powierzchnię
płytek nanoszono krążki z bibuły Wathaman o średnicy 1 cm. Na każdy z nich nanoszono po
100 µg badanych hydrolizatów. Po 24 godz. inkubacji odczytywano strefy zahamowania
wzrostu komórek bakterii w mm.
4.2.9.3. Oznaczenie aktywności inhibitorowej wobec konwertazy angiotensyny I.
Do 100 µl 0,1 M buforu Borax-HCl pH 8,3 zawierającego 0,3M NaCl i 5 mM substrat
Hip-His-Leu (hippuryl-histydyl-leucine) dodawano 40 µl roztworu hydrolizatu. Inkubowano
przez 5 min w temp. 37 °C. Reakcję rozpoczynano poprzez dodanie 20 µl enzymu ACE (2
mU) i prowadzono przez 30 min. Po tym czasie hamowano reakcję poprzez dodanie 150 µl
1 M HCl. Następnie ekstrahowano kwas hippurylowy poprzez dodanie 1000 µl octanu etylu,
próby wirowano (15000 x g, 10 min.). Kolejno pobierano 750 µl organicznej fazy
i odparowano. Pozostałości zawieszano w 800 µl bidestylowanej wody i mierzono
absorbancję przy λ= 228 nm. Próbę ślepą stanowiła próba bez dodatku enzymu. Inhibitorową
aktywność enzymu ACE (IC50) wyrażano jako ilość substancji niezbędnej do połowicznego
zahamowania aktywności enzymu ACE w opisanych powyżej warunkach.
50
MATERIAŁY I METODY
4.2.9.4. Badanie cytotoksyczności/proliferacji hydrolizatów białkowych na ludzkich
komórkach.
Badanie obejmowało przeprowadzenie testu cytotoksyczności i/lub proliferacji na
ludzkich komórkach w obecności hydrolizatów białkowych oraz frakcji peptydowych. Test
określał uszkodzenia lub zwiększony wzrost komórek po zastosowaniu określonych
hydrolizatów. Żywotność komórek została określona za pomocą techniki MTT. Linię
komórkową ludzkich hepatocytów (HepG2) hodowano w medium komórkowym o składzie:
DMEM, 10% FCS, 1xPenicillin/Streptomycin w temperaturze 37 °C i zawartości CO2 – 5%.
Komórki były pasażowane co 2 dni, kiedy konfluencja komórek osiągnęła 85%. Linię
komórkową ludzkich keratynocytów (HaCaT) hodowano w medium komórkowym
o składzie: DMEM, 10% FCS, 1xPenicillin/Streptomycin w temperaturze 37 °C i zawartości
CO2 – 5%. Komórki były pasażowane co 3 dni, kiedy konfluencja komórek osiągnęła 75%.
Linia komórkowa mysich fibroblastów (Balb 3T3) była hodowana w medium komórkowym
o składzie: DMEM, 10% FCS, 1xPenicillin/Streptomycin w temperaturze 37 °C i zawartości
CO2 – 5%. Komórki były pasażowane co 3 dni, kiedy konfluencja komórek osiągmęła 100%.
Komórki
zostały
umieszczone
w
96-cio
studzienkowej
płytce
w
ilości:
5x103/studzienkę dla Balb3T3 i HaCaT oraz 1x104/studzienkę dla HepG2 w 100µl medium
hodowlanym. Przez pierwsze 24 godz. medium hodowlane stanowiło 2% FCS, następnie po
dodaniu hydrolizatów białkowych w ilości 0%, 1%, i 10%, zostało ono zmienione na 0% FCS
+ hydrolizaty białkowe/rozpuszczalnik. Po 48 godz. dodano odczynnik MTT, a po kolejnych
3 godz. przeprowadzono test proliferacji.
Test proliferacji: MTT rozpuszczono w PBS w stężeniu 5 mg/ml i dodawano do
wcześniej potraktowanych mieszaniną białek komórek w ilości 20 µl na dołek i inkubowano
w temperaturze 37 °C przez 3 godz. Po tym czasie medium znad komórek usuwano i do
komórek jest dodawano mieszaninę rozpuszczająca powstałe kryształy soli MTT w ilości 100
µl, o składzie 4 mM HCl, 0.1% Nonidet P-40 w 2-propanolu. Po 30 min inkubacji
w temperaturze pokojowej, mierzono absorpcję przy długości fali 560 nm za pomocą czytnika
spektrofotometrycznego.
Badania cytotoksyczności/proliferacji wykonane zostały w oddziale Polskiej
Akademii Nauk (ul. Rudolfa Weigla 12; 53-114 Wrocław) we Wrocławiu.
4.2.9.5. Badanie aktywności induktorowej do wydzielania cytokin na pełnej krwi ludzkiej.
10 ml próbki krwi obwodowej od zdrowych ochotników pobierano do jałowych
probówek zawierających heparynę (10 U/ml) i w ciągu godziny od pobrania wykorzystywano
51
MATERIAŁY I METODY
do eksperymentów. Krew rozcieńczano 10x przy pomocy medium RPMI 1640
wzbogaconego streptomycyną (100 µg/ml), penicyliną (100 U/ml) i L-glutaminą (3%). Tak
przygotowany materiał użyto do dalszych doświadczeń
Indukcja wydzielania cytokin: Do zawiesiny komórek pełnej krwi ludzkiej (1 ml
próby) dodawano badane induktory w dawkach: 1, 10 i 100 µg. Kontrolę pozytywną
stanowiły komórki krwi traktowane induktorem reakcji zapalnej LPS (lipopolisacharyd E.
coli o stężeniu 4 µg/ml). Kontrolę negatywną stanowiły komórki krwi nietraktowane.
Komórki inkubowano 22 godz. w 37 ºC przy 5% nasyceniu CO2. Poziom wydzielonych
cytokin
oznaczano
w
supernatantach
pohodowlanych
za
pomocą
testów
immunoenzymatycznych ELISA, wg procedury zalecanej przez producenta: IL-1β oraz TNFα (BD OptEIA™ Set Human; Phamingen, USA).
Uzyskane
wyniki
poddano
analizie
statystycznej
przy
użyciu
programu
komputerowego Statistica 6.0. Analiza dotyczyła wyznaczenia średniej arytmetycznej (Śr)
odchylenia standardowego (SD) oraz mediany (M). Istotność statystyczną określono przy
użyciu testu Wilcoxona (p ≤ 0.05) w odniesieniu do próby kontrolnej, którą stanowiły
komórki krwi nietraktowane.
Aktywność immunostymulującą oznaczono w Katedrze Imminochemii, w Instytucie
Immunologii i Terapii Doswiadczalnej im. Ludwika Hirszfelda, Polska Akademia Nauk, ul.
Weigla 12, 53-114 Wrocław, Polska.
4.2.10. Oczyszczanie i rozdział peptydów.
4.2.10.1. Frakcjonowanie hydrolizatów za pomocą ultrafiltracji.
Proces ultrafiltracji przeprowadzono w amikonie o średnicy 60 mm i przy ciśnieniu
1 bar. Hydrolizat frakcjonowano przy wykorzystaniu membran polietylenosulfonowych
przepuszczalności granicznej 30 kDa, w celu oddzielenia enzymu, a następnie 5 kDa, w celu
izolacji bioaktywnej frakcji peptydowej. Frakcje zebrano, zliofilizowano i przechowywano w
temperaturze 4° C. Następnie frakcje o masie molekularnej >5 kDa oraz <5 kDa poddano
dalszym badaniom.
4.2.10.2. Rozdział frakcji peptydowych metodą chromatografii żelowej.
Chromatografię żelową peptydów prowadzono w systemie HPLC, na kolumnie
Zorbax GF-250 Agilent (4,6 x 250 mm). Frakcję eluowano za pomocą buforu 0,02 M Tris-
52
MATERIAŁY I METODY
HCl (pH 6,8) z dodatkiem 0,2 M NaCl, w czasie od 0 do 20 minuty w temp. 30°C i przy
przepływie 0,25 ml/min. Eluent monitorowano przy długościach fal: A230 i A280 nm.
4.2.10.3. Rozdział frakcji peptydowych metodą RP-HPLC [Ardo i Polychroniadou, 1999]
Patrz pkt. 2.8.3.
4.2.11. Oznaczanie ciężarów cząsteczkowych metodą chromatografii żelowej.
Masa molekularna peptydów obecnych w hydrolizacie otrzymanym w Parku
Technologicznym została określona za pomocą chromatografii żelowej w systemie HPLC
z użyciem kolumny Agilent Zorbax GF-250 (4,6 x 250 mm). Roztwór hydrolizatu
nastrzyknięty w ilości 100 µl był eluowany z wykorzystaniem buforu 0,02M Tris-HCl (pH
6,8) + 0,2M NaCl, w gradiencie od 0-100% w czasie od 0 do 12 minuty, przy przepływie
5ml/min i w temperaturze w 30° C. Wykorzystano standardy: albuminę wołową (66 kDa),
owoalbuminę jaja (45 kDa), trypsynogen (24 kDa), β-laktoglobulinę (18,4 kDa), lizozym
białka jaja (14,3 kDa), aprotoninę (6,5 kDa) oraz insulinę wołowa - łańcuch B (3,5 kDa).
Absorbancję monitorowano przy długości fali: λ=230 nm.
4.2.12. Wyznaczanie mas cząsteczkowych peptydów.
Masy
cząsteczkowe
peptydów
oznaczano
poprzez
jonizację
cząsteczek
(elektrorozpylanie ESI) w spektrometrze HCT Esquire (Bruker, Niemcy) połączonym
z detektorem typu: pułapka jonowa. Do liofilizatów frakcji peptydów izolowanych metodą
RP-HPLC dodawano po 1ml mieszaniny: woda/metanol o składzie 70/30 (v/v) z dodatkiem
kwasu mrówkowego (0,1 %). Następnie próby wytrząsano
przez ok. 2 min. Próbki
nastrzykiwano bezpośrednio do spektrometru za pomocą pompy strzykawkowej przy
przepływie analitu 180 µl/min i rejestrowano widma masowe. Przy następujących
parametrach: przepływ: 220 µl/min; optymalizacja czułości 700 m/z; zakres: dla próbek 3002200 m/z 100-1800 m/z. Wyniki przedstawiano
w formie widma masowego próbki,
t.j. zależności intensywności sygnału od stosunku m/z, gdzie m jest masą jonu a z jego
ładunkiem.
4.2.13. Oznaczanie składu aminokwasowego.
Próby zawierające po 10 µg białka poddano hydrolizie w fazie gazowej z użyciem 6M
HCl w obecności fenolu, przez 24 godz. w temperaturze 115 °C. Uwolnione aminokwasy
poddano
derywatyzacji
za
pomocą
karbaminianu
6-aminochinolino-N
53
MATERIAŁY I METODY
hydroksybursztynyloamidu i analizowano w systemie wysokociśnieniowej chromatografii
cieczowej (HPLC) na kolumnie PicoTag 3.9 x150 mm (Waters, Milford, MA, USA).
Kalibracji
dokonano
za
pomocą
trzech
różnych
stężeń
fabrycznych
standardów
aminokwasowych firmy Pierce (USA). Analizy wykonano w laboratorium BioCentrum
w Instytucie Biologii Molekularnej i Biotechnologii Uniwersytetu Jagielońskiego.
4.2.14. Oznaczanie sekwencji aminokwasowej peptydów [Edman, 1950].
Analizę
sekwencji
peptydów
przeprowadzono
w
laboratorium
BioCentrum
w Instytucie Biologii Molekularnej i Biotechnologii Uniwersytetu Jagielońskiego w oparciu
o reakcję Edmana w sekwenatorze białek Procise 491 (Applied Biosystems, USA).
4.2.15. Synteza chemiczna peptydów.
Synteza określonych peptydów prowadzona była w jednorazowym reaktorze
strzykawkowym firmy BRAUN Injekt. Do syntezy użyto 75 mg żywicy Fmoc-L-Asn(Trt)Wang (IrisBiotech GmbH) o obsadzeniu 0,70 mM/g. Grupę ochronną Fmoc- (9fluorenylometyloksykarbonylowa) usuwano za pomocą 25% roztworu piperydyny (SigmaAldrich) w DMF (Carl Roth GmbH + Co. KG). Reakcja sprzęgania aminokwasów
prowadzona
była
przy
użyciu
DMF
jako
rozpuszczalnika
z
wykorzystaniem
3 równoważników TCTU (Iris Biotech GmbH) jako odczynnika sprzęgającego oraz
3 równoważników HOBt (GL Biochem (Shanghai) Ltd) i 6 równoważników DIEA (Iris
Biotech GmbH) jako dodatków. Reakcja prowadzona była w czasie 150 min.
Wykorzystano pochodne aminokwasowe (3 rownoważniki): Fmoc-L-Leu-OH (Iris
Biotech GmbH), 2. Fmoc-L-Ile-OH (Iris Biotech GmbH), 3. Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH (Iris
Biotech GmbH)
Po zakończeniu reakcji syntezy peptydów żywicę przemyto siedmiokrotnie DMF,
jednokrotnie mieszaniną DMF/DCM (CHEMPUR) (1/1; v/v), czterokrotnie DCM,
jednokrotnie mieszaniną DCM/MeOH (CHEMPUR) (1/1; v/v) oraz czterokrotnie MeOH.
Następnie żywicę wysuszono w eksykatorze próżniowym.
Peptydy ściągnięto z żywicy za pomocą mieszaniny TFA (Iris Biotech GmbH) /TIS
(Alfa Aesar)/H2O (95:2,5:2,5; v/v/v). Reakcja prowadzona była w czasie 120 minut.
Następnie
roztwór
przeniesiono
do
zimnego
eteru
dietylowego
(Sigma-Aldrich)
i pozostawiono w lodowce na noc. Nadmiar eteru dietylowego usunięto w strumieniu azotu.
Pozostały osad rozpuszczono w wodzie i zliofilizowano.
54
MATERIAŁY I METODY
Syntezę chemiczną peptydów przeprowadzono na Wydziale Chemii Uniwersytetu
Wrocławskiego (Zespół Chemii i Stereochemii Peptydów i Białek) we Wrocławiu.
4.2.16. Analiza peptydów z wykorzystaniem wysokorozdzielczej spektrometrii mas (HR-ESIMS).
Analiza związków zsyntetyzowanych chemicznie przeprowadzona została metodą
HR-MS na spektrometrze mas FT-ICR Apex-Qe Ultra 7 T instrument (Bruker Daltonics,
Bremen, Germany) ze źródłem jonów ESI w trybie jonów dodatnich. Aparat został
skalibrowany przy użyciu TuneMix (Bruker Daltonics, Bremen, Germany). Zakres wartości
m/z od 100 do 1800. Roztwór użyty do pomiarów: CH3CN/H2O/HCOOH (50:50:0,1; v/v/v).
55
SCHEMAT UKŁADU DOŚWIADCZENIA
5. SCHEMAT UKŁADU DOSWIADCZENIA
BIAŁKA ZÓŁTKA
Analiza
postępu
hydrolizy
Izolacja
substratów
do hydrolizy
z żółtka jaja
i ich
charakterystyka
Hydroliza enzymatyczna
w określonych warunkach
HYDROLIZATY
Ocena
aktywności
biologicznej
Izolacja peptydów
Ultrafiltracja
oraz chromatografia
żelowa i cieczowa
BIOPEPTYDY
Rys.5.1. Ogólny schemat układu doświadczenia.
56
WYNIKI
6. WYNIKI
6.1. Charakterystyka substratów białkowych wykorzystywanych w reakcji hydrolizy.
Substratami wykorzystywanymi w badaniach wstępnych były preparat foswitynowy
i immunoglobulina Y wyizolowane z żółtka jaja. Głównym materiałem badawczym był
precypitat białek frakcji granularnej żółtka otrzymany jako produkt uboczny procesu izolacji
fosfolipidów z żółtka jaja metodą etanolową wg. Siepka i wsp. [2010]. Wykorzystywane
preparaty charakteryzowały się względnie wysoką zawartością białka, na poziomie kolejno
ok. 45%, 65% i 70%. Wszystkie substraty poddano analizie za pomocą chromatografii
cieczowej w odwróconych fazach (RP-HPLC), a także scharakteryzowano pod względem
aktywności biologicznych: przeciwutleniającej i antyhipertensyjnej (Rys.6.1, Tab.6.1).
Ponadto, przeprowadzono ich całkowitą hydrolizę w kwasie solnym w celu oznaczenia
całkowitej zawartości grup aminowych (Tab.6.1).
Rys.6.1. Profile RP-HPLC substratów białkowych: preparatu foswitynowego (A), immunoglobuliny Y (B) oraz białek
żółtka uzyskanych po izolacji fosfolipidów metodą ekstrakcji chemicznej (C). Kolumnę Zorbax XDB C18 (4,5 x250 mm)
równoważono 0,1% TFA, następnie nanoszono po 100µl próby. Rozdział prowadzono przy przepływie v= 1ml/min w temp.
30°C, Zaadsorbowane peptydy zwalniano w gradiencie: 2%/min 0,1% TFA w acetonitrylu. Absorbancję monitorowano przy
długości fali: λ=230 nm.
57
WYNIKI
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (RP-HPLC) białek poekstrakcyjnych
wykazała, że część precypitatu rozpuszczalna w 0,1% TFA dzieliła się na kilka trudnych do
identyfikacji frakcji o tych samych czasach retencji, wśród których znajdowała się frakcja
foswitynowa i immunoglobulinowa (kolejno 20-25 i 27-30 min) (Rys.6.2).
Wykonano również elektroforezę denaturującą w żelu poliakrylamidowym preparatu
białek poekstrakcyjnych. Wykazała ona 2 główne oraz kilka rozproszonych pasm, i tym
samym potwierdziła obecnosć w jego składzie
różnych
protein
żółtka
jaja
(Rys.6.2).
Dominujące
pasmo,
którego
molekularna
wyniosła
ok.
masa
80
kDa
oszacowano jako białka plazmy żółtka, a w
szczególności α-liwetyny. Podobnie, pasmo
polipeptydowe o masie cząsteczkowej ok.
200 kDa przypisano białkom frakcji LDL
plazmy żółtka. Natomiast pasmo o masie
molekularnej
polipeptydom
160
kDa
przypisano
α-foswityny.
Rozproszone
pasmo o masie ok. 60 kDa określono
natomiast
jako
immunoglobuliny
łańcuchy
IgY,
ciężkie
których
masa
molekularna wynosi pomiędzy 60-70 kDa.
Fakt, że żółtko jaja składa się z mieszaniny
lipidów
i
białek
niekowalencyjnie
powiązanych w duże kompleksy lipoprotein,
wyjaśnia trudności w analizie jego struktury.
Rys.6.2. Elektroforeza denaturująca w 12% żelu
poliakrylamidowym białek poekstrakcyjnych żółtka
jaja. Ścieżka 1: marker mas: anhydraza karbonylowa 29
kDa; albumina jaja 45 kDa; albumina wołowa 66 kDa;
fosfohydrolaza 97 kDa, galaktozydaza 116 kDa; miozyna
200 kDa. Ścieżka 2: precypitat 100 µg.
Co więcej, ze względu na częściową
denaturację
białek
precypitacji
etanolem,
żółtka
ich
podczas
właściwości
prawdopodobnie uległy znaczącym zmianom
w porównaniu do ich natywnych form, co mogło istotnie wpłynąć na obraz elektroforetyczny.
58
WYNIKI
Tab.6.1. Przyrost stężenia wolnych grup aminowych po hydrolizie wyczerpującej substratów białkowych
wykorzystywanych do badań oraz ich aktywność przeciwutleniająca i antyhipertensyjna. Reakcje hydrolizy
prowadzono w 6 M HCl przez 24 h w 113 °C. Następnie hydrolizaty wychładzano i przechowywano w temp. 4 °C.
Aktywność przeciwutleniająca wyrażona została jako zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH, zdolność redukcji
stopnia utlenienia jonów żelaza oraz aktywność chelatowania jonów żelaza. Aktywność przeciwutleniającą wyliczano dla 1
mg białka. Aktywność antyhipertensyjną (IC50) wyliczano jako taką ilość hydrolizatu (w µg), która potrzebna jest do
połowicznego zahamowania aktywności enzymu ACE. Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ± SD, n
= 3). Wartości średnie oznaczone różnymi literami w tej samej kolumnie różnią się statystycznie istotnie na poziomie p
≤0,05.
SUBSTRATY
WYKORZYSTYWANE
DO BADAŃ
PRZYROST STĘŻENIA
WOLNYCH GRUP
AMINOWYCH
(po wyczerpującej
hydrolizie)
[μM/g]
ZDOLNOŚĆ
WYMIATANIA
WOLNYCH
RODNIKÓW
DPPH
[μM trolox/mg]
ZDOLNOŚĆ
REDUKCJI STOPNIA
UTLENIENIA
JONOW Fe2+ FRAP
[μg Fe2+/mg]
AKTYWNOŚĆ
CHELATOWANI
A JONÓW Fe2+
[μg Fe2+/mg]
AKTYWNOŚĆ
INHIBITOROWA
WOBEC
ENZYMU ACE
[IC50]
PREPARAT
FOSWITYNOWY
7829.07
b
± 53.28
0.44
a
± 0.04
35.79
b
± 1.71
692.87
a
± 5.48
0
IMMUNOGLOBULINA
IgY
5435.91
c
± 35.10
0
21.38
c
± 1.18
122.59
c
± 2.61
0
BIAŁKA
POEKSTRAKCYJNE
22887.58
a
± 130.50
0.24
b
± 0.03
105.50
a
± 3.01
497.72
b
± 5.43
0
preparat
foswitynowy
Preparat
białek
poekstrakcyjnych,
podobnie
jak
i immunoglobulinowy nie wykazał atrakcyjnych pod względem technologicznym właściwości
biologicznych (Tab.6.1). W porównaniu do standardowych antyutleniaczy wykorzystywanych
w przemyśle spożywczym najwyższe aktywności przeciwutleniające uzyskane przez białka
poekstrakcyjne (aktywność FRAP na poziomie 105,50 µg Fe2+/mg), jak też preparat
foswitynowy (zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH na poziomie 0,44 µM
trolox/mg) były kolejno o 8 lub nawet 50 razy niższe (Tab.6.1, Tab.6.2). Jedynie aktywność
chelatująca jonów żelaza wykazana przez preparat foswitynowy osiągnęła bardziej pożądany
efekt (692,87 µg Fe2+/mg) (Tab.6.1, Tab.6.2).
Tab.6.2. Aktywność przeciwutleniająca standardowych przeciwutleniaczy syntetycznych wykorzystywanych w
technologii żywności wyrażona jako zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH, zdolność redukcji stopnia
utlenienia jonów żelaza oraz aktywność chelatowania jonów żelaza. Stężenie badanych substancji w roztworze wynosiło
1%. Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ± SD, n = 3).
STANDARDOWE
PRZECIWUTLENIACZE
SYNTETYCZNE
BHA
TBHQ
GALUSAN PROPYLU
EDTA
ZDOLNOŚĆ
WYMIATANIA
WOLNYCH
RODNIKÓW
DPPH
[μM trolox/mg]
ZDOLNOŚĆ
REDUKCJI
STOPNIA
UTLENIENIA
JONOW Fe2+ FRAP
[μg Fe2+/mg]
20.60
± 1.29
18.72
± 1.06
25.82
± 1.32
-
810.51
± 2.98
795.69
± 4.60
852.29
± 3.45
-
AKTYWNOŚĆ
CHELATOWANIA
JONÓW Fe2+
[μg Fe2+/mg]
1284.00
± 4.73
59
WYNIKI
6.2. Hydroliza enzymatyczna białek modelowych: foswityny i immunoglobuliny Y
wyizolowanych z żółtka jaja.
6.2.1. Hydroliza enzymatyczna
Wstępny etap badań polegał na określeniu podatności dwóch podstawowych białek
żółtka jaja - preparatu foswitynowego i immunoglobuliny Y na działanie wybranych
enzymów proteolitycznych oraz ich selekcji pod względem zdolności do uwalniania
biologicznie aktywnych peptydów z tych białek. Wcześniejsze wyniki badań potwierdziły
bowiem, że w skład preparatu białek poekstrakcyjnych wchodziły między innymi powyżej
wymienione proteiny (Rys.6.1, Rys.6.2).
Do hydrolizy enzymatycznej preparatu foswitynowego i IgY wykorzystano zarówno
komercyjne, jak i niekomercyjne enzymy proteolityczne. Spośród preparatów komercyjnych
zastosowano
serynowe
i
aspartylowe
proteinazy
pochodzenia
mikrobiologicznego,
charakteryzujące się wysoką aktywnością proteolityczną, w tym neutrazę z Bacillus
amyloliquefaciens, termolizynę z Bacillus thermoproteolyticus rokko oraz proteinazę
z
Aspergillus
melleus.
Wykorzystanymi
enzymami
niekomercyjnymi
były
zewnątrzkomórkowe proteinazy z drożdży Yarrowia lipolytica: serynowa i aspartylowa, oraz
proteinaza serynowa z dyni figolistnej (Cucurbita ficifolia), które otrzymano w Katedrze
Technologii Surowców Zwierzęcych i Zarządzania Jakością. Proteinazy drożdżowe zostały
pozyskane z płynów pohodowlanych, natomiast proteinazę pochodzenia roślinnego
wyizolowano z miąższu dyni (Materiały i metody pkt. 4.2.2 i 4.2.3).
Oba preparaty białek żółtka poddano kontrolowanemu trawieniu z udziałem
pojedynczo zastosowanych enzymów. Wielkość ich dawek, a także czas reakcji
enzymatycznej ustalono po przeprowadzeniu studiów literaturowych oraz przy założeniu
uzyskania możliwie najwyższego poziomu degradacji substratów. Proteinazy niekomercyjne
wykorzystano także do przeprowadzenia hydroliz kombinowanych (gdzie zastosowano
jednocześnie dwa różne enzymy) i sekwencyjnych (podczas których białko hydrolizowano
najpierw jednym, a następnie drugim enzymem). W przypadku drugiego rodzaju degradacji
enzymatycznej przeprowadzono zarówno sekwencję proteinaz serynowych (z Cucurbita
ficifolia oraz Yarrowia lipolytica), jak również proteinaz drożdżowych (serynowej
i aspartylowej). Hydroliza z udziałem obu enzymów pochodzenia drożdżowego wymagała
zmiany pH mieszaniny reakcyjnej przed wprowadzeniem drugiego enzymu - proteinazy
aspartylowej, wykazującej maksimum aktywności w środowisku kwaśnym. Do reakcji
60
WYNIKI
hydrolizy z udziałem tego enzymu wykorzystano 0,05 M bufor Gly-HCl o pH 3,5.
W przypadku pozostałych enzymów stosowano 0,1 M bufor Tris-HCl o pH 8,0.
Postęp reakcji hydrolizy kontrolowano poprzez wyznaczanie stopnia hydrolizy DH
(%) tj. ilości białka rozpuszczalnego w 5 % kwasie TCA, pomiar przyrostu stężenia wolnych
grup α- aminowych a także poprzez analizę profili białkowo-peptydowych (RP-HPLC).
Rys.6.3. Stopień hydrolizy (DH %) preparatu foswitynowego uzyskany w wyniku zastosowania różnych enzymów
proteolitycznych, a także sekwencji lub kombinacji dwóch enzymów. Oznaczenia: D- proteinaza z C.ficifolia, Aproteinaza z A. melleus, N- proteinaza z B. amyloliquefaciens, T- proteinaza z B. thermoproteoliticus rokko, Ys- proteinaza
serynowa z Y. lipolytica, Ya- proteinaza aspartylowa z Y. lipolytica. Wszystkie reakcje prowadzono w 0,1 M buforze TrisHCl pH 8,0, poza hydrolizą z udziałem proteinazy aspartylowej z drozdży Y. lipolytica, którą prowadzono w 0,05 M buforze
Glicyna-HCl pH 3,5. Stężenie preparatu wynosiło: 10 mg/ml. Reakcję hydrolizy rozpoczynano poprzez dodanie enzymów w
ilości: 100, 30, 20, 10 lub 5 j/ mg hydrolizowanego białka. Reakcje prowadzono w temperaturze 37 °C przez 5, 24 lub 48 h.
Po tym czasie proces hydrolizy hamowano poprzez inkubację prób przez 15 min w temperaturze: 100 °C. Następnie
hydrolizaty wychładzano i wirowano (5500 obr./min, t =15 min, T= pokojowa). Supernatanty liofilizowano i
przechowywano w temp. 4 °C. Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ± SD, n = 3). Wartości średnie
oznaczone różnymi literami na tym samym wykresie różnią się statystycznie istotnie na poziomie p ≤0,05.
Zastosowane proteinazy wykazały zróżnicowaną zdolność do hydrolizy preparatu
foswitynowego i IgY, która zależna była od rodzaju enzymu i jego dawki oraz od czasu
reakcji (Rys.6.3, Rys.6.4). Przy czym, zaobserwowano, że preparat foswitynowy prawie we
wszystkich przypadkach ulegał większej degradacji w porównaniu do IgY. Wyjątkiem były
warianty, w których hydrolizę przeprowadzono z udziałem proteinazy z Aspergillus melleus
oraz proteinazy serynowej z Yarrowia lipolytica, gdzie stopień hydrolizy immunoglobuliny Y
był średnio o 2% wyższy. Natomiast hydroliza z udziałem proteinazy aspartylowej
z Yarrowia lipolytica skutkowała wyższym stopniem degradacji IgY o 9%.
61
WYNIKI
Rys.6.4. Stopień hydrolizy (DH %) immunoglobuliny Y uzyskany w wyniku zastosowania różnych enzymów
proteolitycznych, a także sekwencji lub kombinacji dwóch enzymów. Oznaczenia: D- proteinaza z C.ficifolia, Aproteinaza z A. melleus, N- proteinaza z B. amyloliquefaciens, T- proteinaza z B. thermoproteoliticus rokko, Ys- proteinaza
serynowa z Y. lipolytica, Ya- proteinaza aspartylowa z Y. lipolytica. Wszystkie reakcje prowadzono w 0,1 M buforze TrisHCl pH 8,0, poza hydrolizą z udziałem proteinazy aspartylowej z drożdży Y. lipolytica, którą prowadzono w 0,05 M buforze
Glicyna-HCl pH 3,0. Stężenie preparatu wynosiło: 10 mg/ml. Reakcję hydrolizy rozpoczynano poprzez dodanie enzymów w
ilości: 100, 30, 20, 10 lub 5 j/ mg hydrolizowanego białka. Reakcje prowadzono w temperaturze 37 °C przez 5, 24 lub 48 h.
Po tym czasie proces hydrolizy hamowano poprzez inkubację prób przez 15 min w temperaturze: 100 °C. Następnie
hydrolizaty wychładzano i wirowano (5500 obr./min, t =15 min, T= pokojowa). Supernatanty liofilizowano i
przechowywano w temp. 4 °C. Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ± SD, n = 3). Wartości średnie
oznaczone różnymi literami na tym samym wykresie różnią się statystycznie istotnie na poziomie p ≤0,05.
Proteinaza serynowa z drożdży Yarrowia lipolytica charakteryzowała się wysoką
zdolnością do degradacji obu białek. Stopień hydrolizy preparatu foswitynowego w wyniku
działania tego enzymu wyniósł 27,5%, natomiast IgY 29,5% (Rys.6.3, Rys.6.4). W przypadku
preparatu foswitynowego zastosowanie neutrazy w ilości 20 j/mg skutkowało jeszcze wyższą
degradacją białka wynoszącą ponad 29%. Jednakże, najwyższy stopień degradacji tego
preparatu uzyskano podczas hydrolizy, gdzie przez pierwsze 24 godz. białka były
hydrolizowane enzymem z Cucurbita ficifolia, a następnie proteinazą aspartylową z Yarrowia
lipolytica do 48 godz. Końcowe DH wyniosło wówczas 53,0% i było wyższe o niemal 27%
od poziomu hydrolizy przy zastosowaniu pojedynczych enzymów.
Analizując dynamizm procesu hydrolizy można stwierdzić, że prawie wszystkie
preparaty enzymatyczne degradowały substraty znacznie szybciej w pierwszej godzinie
reakcji, a w dalszym etapie proces ten był mniej intensywny (Rys.6.3, Rys.6.4). Wyjątek
stanowi proteinaza serynowa z Yarrowia lipolytica, która hydrolizowała preparat
foswitynowy prawie z taką samą intensywnością przez cały czas trwania reakcji (Rys.6.3).
62
WYNIKI
Rys.6.5. Przyrost stężenia wolnych grup aminowych w hydrolizatach preparatu foswitynowego uzyskany w wyniku
zastosowania różnych enzymów proteolitycznych, a także sekwencji lub kombinacji dwóch enzymów. Oznaczenia: Dproteinaza z C.ficifolia, A- proteinaza z A. melleus, N- proteinaza z B. amyloliquefaciens, T- proteinaza z B.
thermoproteoliticus rokko, Ys- proteinaza serynowa z Y. lipolytica, Ya- proteinaza aspartylowa z Y. lipolytica. Warunki
hydrolizy podano w legendzie do Rys.6.3. Kontrolę stanowił preparat foswitynowy bez dodatku enzymu, dla którego stężenie
wolnych grup aminowych wyniosło 729.29 µM/g. Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ± SD, n =
3). Wartości średnie oznaczone różnymi literami na tym samym wykresie różnią się statystycznie istotnie na poziomie p
≤0,05.
Poziom hydrolizy monitorowano również poprzez pomiar przyrostu wolnych grup
aminowych (WGA), który także potwierdził efektywność zastosowanych enzymów w
hydrolizie białek żółtka (Rys.6.5, Rys.6.6). Jak wykazano, wraz z wydłużeniem czasu reakcji
ich stężenie znacząco przyrastało w hydrolizatach.
Największy wzrost stężenia wolnych grup aminowych miał miejsce podczas hydrolizy
sekwencyjnej preparatu foswitynowego, prowadzonej z udziałem proteinazy serynowej z dyni
figolistnej i proteinazy aspartylowej z Yarrowia lipolytica. Po zakończeniu 48 godzinnej
degradacji ich stężenie w hydrolizacie osiągnęło poziom 5903,8 µmol Gly/g. Skrócenie czasu
hydrolizy do 5h i wprowadzenie jednocześnie dwóch enzymów proteolitycznych skutkowało
mniej zaawansowanym rozkładem białka (3572,6 µM Gly/g). Należy jednak zauważyć, że
przyrost stężenia wolnych grup aminowych był wówczas dużo wyższy niż w toku hydroliz
z udziałem jednego enzymu prowadzonych przez dłuższy czas – 24 godziny (Rys.6.5).
Wyniki
pomiaru
WGA
kształtowały się
inaczej
w
przypadku
degradacji
enzymatycznej IgY. Najefektywniejszym enzymem w uwalnianiu grup aminowych z tego
substratu była proteinaza serynowa z drożdży Yarrowia lipolytica, która działając przez 24
godziny uwolniła 2311,5 µmol Gly/g tych grup (Rys.6.6).
63
WYNIKI
Najniższy poziom WGA uzyskano w trakcie hydrolizy preparatu foswitynowego
prowadzonej z udziałem drożdżowej proteinazy aspartylowej (960,6 µmol Gly/g) natomiast
w przypadku IgY z wykorzystaniem termolizyny (1133,4 µmol Gly/g). Analiza stopnia
degradacji białek oznaczona za pomocą przyrostu stężenia wolnych grup aminowych
potwierdziła wcześniejsze wyniki uzyskane poprzez pomiar białka rozpuszczalnego w 5 %
kwasie TCA (% DH).
Rys.6.6. Przyrost stężenia wolnych grup aminowych w hydrolizatach immunoglobuliny Y uzyskany w wyniku
zastosowania różnych enzymów proteolitycznych, a także sekwencji lub kombinacji dwóch enzymów. Oznaczenia: Dproteinaza z C.ficifolia, A- proteinaza z A. melleus, N- proteinaza z B. amyloliquefaciens, T- proteinaza z B.
thermoproteoliticus rokko, Ys- proteinaza serynowa z Y. lipolytica, Ya- proteinaza aspartylowa z Y. lipolytica. Warunki
hydrolizy podano w legendzie do Rys.6.4. Kontrolę stanowił IgY bez dodatku enzymu, dla której stężenie wolnych grup
aminowych wyniosło 535.91 µM/g. Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ± SD, n = 3). Wartości
średnie oznaczone różnymi literami na tym samym wykresie różnią się statystycznie istotnie na poziomie p ≤0,05.
Przebieg procesu hydrolizy monitorowano także poprzez sporządzenie profili
białkowo-peptydowych techniką RP-HPLC (Rys.6.7, Rys.6.8). Wykazały one obecność
wielu, zróżnicowanych pod względem hydrofobowości produktów degradacji białek,
nieobecnych w próbach kontrolnych, będących pochodnymi specyficzności zastosowanych
enzymów. Peptydy, zawarte w większości hydrolizatów, eluowano acetonitrylem w zakresie
stężenia od 10% do 50%. Wraz z wydłużeniem czasu hydrolizy obu substratów obserwowano
w szczególności znaczny przyrost stężenia peptydów hydrofilowych. Na podstawie
uzyskanych profili peptydowych można także stwierdzić, że produkty degradacji obu białek
charakteryzowały
się
odmiennymi
właściwościami
hydrofobowymi.
W
składzie
64
WYNIKI
hydrolizatów preparatu foswitynowego przeważał udział peptydów bardziej hydrofobowych
niż w składzie hydrolizatów IgY. W tych ostatnich zaobserwowano więcej reszt
hydrofilowych zwalnianych z kolumny przy stężeniu acetonitrylu wynoszącym 5-10%
(Rys.6.8).
65
WYNIKI
Rys.6.7. Profile białkowo-peptydowe RP-HPLC enzymatycznych hydrolizatów preparatu foswitynowego uzyskanych
przy udziale enzymów: z C. ficifolia (A), z A. melleus (B), z B. amyloliquefaciens (C), z B. thermoproteolyticus rokko
(D), proteinazy serynowej z Y. lipolytica (E), proteinazy aspartylowej z Y. lipolytica (F), kombinacji proteinaz
serynowych z C.ficifolia i Y.lipolytica (G), sekwencji proteinaz serynowych z C.ficifolia i Y.lipolytica (H) oraz sekwencji
obu proteinaz z Y.lipolytica (I). Kolumnę Zorbax XDB C18 (4,5 x250 mm) równoważono 0,1% TFA, następnie nanoszono
po 100µl hydrolizatu. Rozdział prowadzono przy przepływie v= 1ml/min w temp. 30°C, Zaadsorbowane peptydy zwalniano
w gradiencie: 2%/min 0,1% TFA w acetonitrylu. Absorbancję monitorowano przy długości fali: λ=230 nm. Warunki
hydrolizy podano w legendzie do Rys. 6.3.
Analiza profili białkowo-peptydowych hydrolizatów preparatu foswitynowego
otrzymanych z zastosowaniem enzymów takich jak: proteinaza serynowa z dyni figolistnej,
neutraza, termolizyna i drożdżowa proteinaza serynowa, prowadziła do uzyskania podobnych
produktów degradacji, na co wskazuje znaczne podobieństwo przedstawionych profili
peptydowych, w szczególności w obszarze obejmującym czas retencji od 15 do 25 minuty
rozdziału (Rys.6.7 A, C, D, E). W profilach peptydowych hydrolizatów IgY otrzymanych
z udziałem enzymów niekonwencjonalnych jak i proteinazy z Aspergillus melleus oraz
z Bacillus thermoproteolyticus rokko również stwierdzono powtarzające się szczyty o czasach
retencji 11 i 16 min (Rys.6.8 A, B, D, E, F). W hydrolizatach obu substratów największą
liczbę i zróżnicowanie uzyskanych frakcji peptydowych zaobserwowano po wprowadzeniu
sekwencji lub kombinacji enzymów ze źródeł niekonwencjonalnych (Rys.6.7 H, I; Rys.6.8 G,
H, I).
66
WYNIKI
Rys.6.8. Profile bialkowo-peptydowe RP-HPLC enzymatycznych hydrolizatów immunoglobuliny Y uzyskanych przy
udziale enzymów: z C. ficifolia (A), z A. melleus (B), z B. amyloliquefaciens (C), z B. thermoproteolyticus rokko (D),
proteinazy serynowej z Y. lipolytica (E), proteinazy aspartylowej z Y. lipolytica (F), kombinacji proteinaz serynowych z
C.ficifolia i Y.lipolytica (G), sekwencji proteinaz serynowych z C.ficifolia i Y.lipolytica (H) oraz sekwencji obu
proteinaz z Y.lipolytica (JI). Kolumnę Zorbax XDB C18 (4,5 x250 mm) równoważono 0,1% TFA, następnie nanoszono po
100µl hydrolizatu. Rozdział prowadzono przy przepływie v= 1ml/min w temp. 30°C, Zaadsorbowane peptydy zwalniano w
gradiencie: 2%/min 0,1% TFA w acetonitrylu. Absorbancję monitorowano przy długości fali: λ=230 nm. Warunki hydrolizy
podano w legendzie do Rys. 6.4.
67
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
6.2.2. Aktywności biologiczne uzyskanych hydrolizatów
Następnym etapem badań była ocena wybranych aktywności biologicznych
(przeciwutleniajacej
i
przeciwdrobnoustrojowej)
otrzymanych
produktów
degradacji
enzymatycznej. Ze względu na to, iż przeciwutleniacze mogą wykazywać różne mechanizmy
działania, aktywność antyoksydacyjną oznaczono za pomocą trzech różnych metod: poprzez
oznaczenie ich zdolności do wymiatania wolnych rodników DPPH, do redukcji stopnia
utlenienia jonów żelaza III (FRAP), oraz zdolności chelatowania jonów żelaza II.
6.2.2.1. Aktywność przeciwutleniająca
Przeprowadzone badania wykazały, że nie tylko rodzaj zastosowanego prekursora
białkowego, ale i typ preparatu proteolitycznego miał decydujący wpływ na poziom
aktywności przeciwutleniającej. Prawie wszystkie oznaczenia potwierdziły również, iż
najdłuższy czas hydrolizy enzymatycznej sprzyjał generowaniu peptydów charakteryzujących
się silniejszym działaniem antyoksydacyjnym. Dodatkowo, można stwierdzić, że spośród
wszystkich zastosowanych enzymów niekonwencjonalne proteazy charakteryzowały się
największą zdolnością do produkcji peptydów wykazujących aktywność przeciwutleniającą
(Tab.6.3).
Najlepszą zdolnością do wymiatania wolnych rodników DPPH wyróżniały się
hydrolizaty immunoglobuliny Y otrzymane z udziałem proteinazy serynowej z drożdży
Yarrowia lipolytica, a nieco niższą – uzyskane z udziałem neutrazy. Otrzymane po 24
godzinach produkty degradacji z udziałem tych enzymów wykazały aktywność równą kolejno
9,7 i 4,3 µM troloxu/mg. Dużo niższe poziomy tej aktywności otrzymano podczas hydrolizy
preparatu foswitynowego. Po zastosowaniu serynowej proteinazy drożdżowej otrzymano
hydrolizaty wykazujące aktywność niemal pięciokrotnie niższą w porównaniu do
hydrolizatów IgY otrzymanych z udziałem tego samego enzymu (Tab.6.3).
Oznaczenie zdolności redukcji stopnia utlenienia jonów Fe2+ potwierdziło, że
najlepszymi właściwościami charakteryzowały się 24 godzinne hydrolizaty IgY otrzymane
z udziałem proteinazy serynowej z drożdży (345,5 µg Fe2+/mg) i neutrazy (403,1 µg Fe2+/mg).
Wysokie aktywności przejawiały również produkty degradacji obu substratów otrzymane w
wyniku zastosowania sekwencji dwóch enzymów, zwłaszcza proteinaz serynowych (preparat
foswitynowy – 158,0 µg Fe2+/mg, IgY – 184,0 µg Fe2+/mg) (Tab.6.3).
68
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
Tab.6.3. Aktywność przeciwutleniająca wyrażona jako zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH, zdolność
redukcji stopnia utlenienia jonów żelaza oraz aktywność chelatowania jonów żelaza, hydrolizatów preparatu
foswitynowego i immunoglobuliny Y. Warunki hydrolizy podano w legendzie do Rys. 6.3. oraz 6.4. Aktywność
przeciwutleniającą wyliczano dla 1 mg białka. Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ± SD, n = 3).
Wartości średnie oznaczone różnymi literami w tej samej kolumnie oraz w tej samej grupie enzymu i jego dawki różnią się
statystycznie istotnie na poziomie p ≤0,05.
ENZYM
CZAS
HYDROLIZY
[h]
0,5
proteinaza z
Cucurbita
ficifolia
3
0.45
e
± 0.01
0.55
c
± 0.02
0.47
d
± 0.003
0.77
b
± 0.01
1.24
a
± 0.03
0.11
c
± 0.001
0.24
b
± 0.01
0
5
0
24
1.46
a
± 0.03
0.17
c
± 0.02
0.17
c
± 0.002
0.24
b
± 0.02
0.16
d
± 0.004
4.28
a
± 0.04
0.20
d
± 0.02
0.24
c
± 0.01
0.24
c
± 0.01
0.29
b
± 0.02
4.20
a
± 0.05
1.59
d
± 0.04
1.74
c
± 0.05
1
3
5
24
0,5
proteinaza z
Aspergillus
melleus
1
0,5
proteinaza z
Bacillus
amyloliquefaciens
1
3
5
24
0,5
proteinaza z
Bacillus
thermoproteolyticus rokko
1
3
5
24
0,5
proteinaza
serynowa z
ZDOLNOŚĆ WYMIATANIA
WOLNYCH RODNOKÓW
DPPH
[μM trolox/mg]
IgY
Preparat
foswitynowy
1
0.27
b
± 0.03
0.28
b
± 0.04
0.46
a
± 0.03
0.13
d
± 0.02
0.16
c
± 0.01
0.36
c
± 0.03
0.43
b
± 0.01
0.35
c
± 0.04
0.35
c
± 0.02
0.81
a
± 0.03
0.03
b
± 0.01
0.02
ab
± 0.01
0.08
a
± 0.01
0.01
ab
± 0.01
0.09
a
± 0.03
0.06
d
± 0.01
0.12
b
± 0.01
0.09
c
± 0.01
0.02
e
± 0.01
0.19
a
± 0.03
1.32
d
± 0.08
1.34
d
± 0.06
ZDOLNOŚĆ REDUKCJI
STOPNIA UTLENIENIA
3+
JONOW Fe FRAP
2+
[μg Fe /mg]
IgY
Preparat
foswitynowy
46.05
bc
± 1.02
50.15
a
± 0.99
46.51
b
± 1.49
39.41
d
± 0.84
48.06
b
± 1.27
66.45
c
± 0.65
68.72
b
± 0.84
66.36
c
± 0.92
64.47
c
± 1.49
93.61
a
± 2.33
25.66
b
± 1.14
26.14
b
± 0.82
25.37
b
± 0.48
26.67
b
± 1.13
403.08
a
± 4.48
31.14
c
± 0.79
30.54
c
± 0.90
30.93
c
± 0.32
35.10
b
± 0.93
209.70
a
± 4.14
47.60
c
± 0.72
47.86
c
± 0.94
35.32
a
± 0.68
31.21
b
± 0.62
34.73
a
± 0.94
30.74
b
± 0.71
32.14
b
± 1.18
32.23
d
± 0.54
35.01
c
± 0.71
39.44
b
± 1.21
35.11
c
± 1.06
52.99
a
± 0.66
100.77
c
± 2.90
106.22
b
± 0.90
100.42
c
± 0.94
107.89
b
± 1.93
112.90
a
± 1.30
102.39
c
± 1.37
101.55
c
± 0.96
99.18
d
± 0.88
105.37
b
± 1.87
120.11
a
± 3.10
47.24
c
± 1.62
58.12
b
± 2.01
AKTYWNOŚĆ
CHELATOWANIA JONÓW
ŻELAZA
2+
[μg Fe /mg]
IgY
Preparat
foswitynowy
224.42
b
± 1.10
191.82
d
± 1.30
208.42
c
± 2.63
172.56
e
± 0.58
246.05
a
± 0.90
194.61
d
± 2.40
209.14
c
± 0.72
227.36
a
± 1.71
169.71
e
± 0.94
212.78
b
± 1.65
142.61
c
± 1.45
148.60
b
± 0.56
139.10
d
± 0.66
144.92
c
± 1.99
209.03
a
± 0.67
110.89
b
± 0.91
88.26
c
± 1.48
89.78
c
± 0.39
88.77
c
± 1.59
422.74
a
± 3.60
208.35
c
± 0.42
215.66
b
± 0.67
414.40
e
± 1.67
509.73
c
± 4.16
523.85
b
± 1.68
467.65
d
± 0.84
617.65
a
± 3.01
432.47
e
± 2.43
430.14
d
± 2.95
477.45
b
± 1.23
438.10
c
± 0.67
495.49
a
± 2.65
221.61
b
± 0.71
229.24
a
± 0.33
200.22
d
± 2.04
202.12
d
± 0.43
215.16
c
± 2.70
230.48
b
± 0.51
230.76
b
± 0.35
227.44
c
± 1.30
242.83
a
± 1.29
231.21
b
± 0.65
189.47
e
± 0.27
193.54
d
± 1.83
69
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
Yarrowia
lipolytica
3
5
24
0,5
proteinaza
aspartylowa z
Yarrowia
lipolytica
1
3
5
24
0,5
1
hydroliza
sekwencyjna
proteinaza
serynowa z
C. ficifolia
/proteinaza
serynowa z
Y.lipolytica
3
5
24
24,5
25
27
29
48
0,5
1
hydroliza
sekwencyjna
proteinaza
serynowa z
C. ficifolia
/proteinaza
aspartylowa z
Y.lipolytica
3
5
24
24,5
25
27
29
48
1.55
d
± 0.01
1.86
b
± 0.03
9.70
a
± 0.23
0.45
c
± 0.03
0.57
b
± 0.02
0.55
b
± 0.02
0.69
a
± 0.01
0.36
d
± 0.02
0.06
g
± 0.002
0.08
f
± 0.01
0.12
d
± 0.01
0.10
de
± 0.01
0.46
a
± 0.03
0.45
a
± 0.01
0.32
c
± 0.01
0.37
b
± 0.01
0.44
a
± 0.01
0.12
d
± 0.01
0.10
f
± 0.01
0.01
i
± 0.01
0.06
g
± 0.01
0.04
h
± 0.004
0.40
e
± 0.02
0.38
e
± 0.01
1.22
a
± 0.01
0.71
c
± 0.02
0.87
b
± 0.01
0.57
d
± 0.002
1.58
c
± 0.07
1.99
a
± 0.09
1.73
b
± 0.08
0.47
c
± 0.03
0.55
b
± 0.03
0.41
d
± 0.01
0.42
d
± 0.02
0.88
a
± 0.05
0.15
b
± 0.03
0.04
e
± 0.01
0.08
d
± 0.004
0.02
g
± 0.002
0.03
f
± 0.003
0.25
a
± 0.05
0
0.18
b
± 0.04
0.12
bc
± 0.01
0.17
b
± 0.01
0.05
g
± 0.002
0
0.06
f
± 0.003
0.05
g
± 0.01
0.29
e
± 0.03
0.91
a
± 0.01
0.84
c
± 0.02
0.76
d
± 0.01
0.87
b
± 0.02
0.69
d
± 0.06
52.65
b
± 1.68
51.34
b
± 0.54
345.53
a
± 2.35
27.14
b
± 0.51
27.14
b
± 0.68
25.63
b
± 1.73
27.55
b
± 0.97
29.71
a
± 0.73
12.43
h
± 0.29
10.12
i
± 0.73
17.01
f
± 0.54
14.03
g
± 0.79
66.20
e
± 0.85
160.11
c
± 3.20
168.06
b
± 0.71
161.51
c
± 1.68
184.01
a
± 2.94
124.53
d
± 1.47
10.04
f
± 0.71
10.09
f
± 0.22
11.15
e
± 0.39
11.00
e
± 0.17
61.29
d
± 1.71
114.03
a
± 1.35
112.99
a
± 1.61
107.54
b
± 0.44
108.23
b
± 0.88
104.42
c
± 0.82
47.67
c
± 1.54
44.99
d
± 0.68
171.09
a
± 2.73
37.83
b
± 0.91
38.44
b
± 0.36
34.82
d
± 1.61
37.57
bc
± 0.59
124.41
a
± 1.72
56.99
g
± 0.96
55.33
h
± 0.50
53.63
i
± 0.79
108.59
f
± 1.31
118.15
e
± 2.18
154.61
b
± 0.87
152.55
c
± 1.13
147.58
d
± 1.01
151.97
c
± 2.06
157.97
a
± 0.60
21.74
e
± 0.48
24.63
d
± 0.59
19.65
f
± 0.62
12.98
g
± 0.87
42.73
a
± 0.79
43.95
a
± 0.72
42.59
a
± 1.55
41.77
a
± 0.27
40.73
b
± 0.72
37.62
c
± 0.56
199.52
d
± 0.88
200.63
d
± 0.97
718.00
a
± 3.18
53.69
d
± 1.55
72.52
b
± 0.55
41.18
e
± 0.48
63.21
c
± 0.95
438.63
a
± 2.98
48.08
h
± 0.72
46.78
h
± 0.83
48.00
h
± 0.63
49.92
g
± 1.11
244.05
f
± 3.99
683.58
c
± 3.33
859.94
a
± 4.01
838.54
b
± 1.58
670.06
d
± 1.05
626.50
e
± 0.35
54.45
f
± 0.72
45.58
i
± 0.60
51.85
g
± 1.09
61.93
e
± 1.33
54.71
f
± 0.89
66.29
d
± 0.55
140.37
a
± 0.59
120.50
b
± 0.90
110.84
c
± 0.95
46.66
h
± 0.24
209.27
b
± 0.45
221.72
a
± 0.94
198.60
c
± 1.18
274.45
e
± 1.22
352.88
d
± 2.19
438.45
c
± 1.86
547.84
b
± 1.94
691.64
a
± 3.44
308.58
h
± 0.73
291.68
i
± 1.99
308.85
h
± 0.95
417.25
g
± 1.81
466.56
f
± 0.73
734.39
b
± 2.44
614.99
e
± 1.08
653.01
d
± 2.53
626.14
c
± 2.63
815.33
a
± 1.83
250.03
c
± 0.46
173.14
h
± 0.44
178.43
g
± 1.75
201.74
e
± 1.05
162.84
i
± 1.27
517.40
a
± 1.71
182.98
f
± 0.63
257.43
b
± 0.54
212.50
d
± 1.26
145.21
j
± 0.47
70
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
hydroliza
kombinowana
proteinaza
serynowa z
C. ficifolia
/proteinaza
serynowa z
Y.lipolytica
0,5
1
3
5
0.02
c
± 0.001
0.04
b
± 0.002
0.08
a
± 0.01
0.07
a
± 0.004
0.10
b
± 0.01
0.22
a
± 0.01
0.06
c
± 0.01
0.13
b
± 0.02
14.49
c
± 0.59
15.65
b
± 0.60
16.09
b
± 0.37
116.70
a
± 0.19
19.86
ab
± 0.96
21.80
a
± 1.19
19.99
ab
± 0.66
20.62
a
± 1.20
87.60
d
± 0.71
94.80
c
± 1.49
100.54
b
± 1.96
615.45
a
± 4.11
139.41
c
± 0.83
148.59
a
± 1.19
146.05
b
± 0.30
139.69
c
± 0.88
najwyższe aktywności
Aktywność przeciwutleniającą otrzymanych hydrolizatów oceniano także poprzez ich
zdolność do chelatownia jonów Fe2+. Najwyższą zdolność chelatującą, w obrębie
jednoenzymowych hydrolizatów preparatu foswitynowego, wykazały 24 godzinne produkty
degradacji proteinazy serynowej z dyni figolistnej jak również proteinazy aspartylowej
z Yarrowa lipolytica, dla których wartości wyniosły kolejno: 617,7 i 691,6 µg Fe2+/mg.
Degradacja enzymatyczna tego substratu na drodze hydrolizy sekwencyjnej z udziałem
proteinaz serynowych przyczyniła się do wzrostu zdolności chelatującej otrzymanych
produktów o ok. 20% (Tab.6.3).
Degradacja immunoglobuliny Y tą samą sekwencją enzymów także prowadziła do
otrzymania hydrolizatów o wysokiej zdolności chelatującej. W tym przypadku najwyższą
aktywnością charakteryzowały się hydrolizaty 25 i 27 godzinne, które chelatowały jony
żelaza na poziomie kolejno 859,9 i 838,5 µg Fe2+/mg. Zastosowanie oddzielnie drożdżowej
proteinazy serynowej w trawieniu IgY prowadziło do otrzymania peptydów wykazujących
jedynie nieco niższą zdolność chelatowania, równą 718,0 µg Fe2+/mg.
Warto zaznaczyć, że zarówno z preparatu foswitynowego jak i IgY udało się otrzymać
hydrolizaty charakteryzujące się wysokimi aktywnościami przeciwutleniajacymi zwłaszcza
chelatującymi, w porówaniu do syntetycznych związków chelatujących standardowo
stosowanych w przetwórstwie żywności (Tab.6.2). Szczególnie przydatne okazały się
proteinazy niekonwencjonalne, które nigdy wcześniej nie zostały zbadanie pod kontem
generowania bioaktywnych peptydów z białek jaja. Hydroliza enzymatyczna z udziałem tych
enzymów może więc stanowić atrakcyjną metodą zagospodarowania wykorzystywanych do
badań preparatów.
6.2.2.2. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa
Enzymatyczne hydrolizaty preparatów: foswityny i IgY poddano analizie pod kątem
ich aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Żaden z hydrolizatów, stosowanych w ilości 100
71
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
µg/ na studzienkę) nie wykazał aktywności przeciwdrobnoustrojowej wobec wybranych
szczepów bakterii z rodzaju Bacillus takich jak: B. subtilis B 172, B subtilis B 3, B. cereus B
512, B. cereus B 3p i B. laterisporum B 6.
6.3. Hydroliza enzymatyczna białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja.
6.3.1. Hydroliza enzymatyczna
Do hydrolizy preparatu białek otrzymanych po ekstrakcji etanolowej fosfolipidów
z żółtka jaja wytypowano trzy z sześciu wcześniej testowanych enzymów: proteinazę
serynową z dyni figolistnej oraz proteinazę serynową i aspartylową z drożdży Yarrowia
lipolytica. Zadecydowała o tym wysoka efektywność w trawieniu wyizolowanych białek
żółtka (Rys.6.3, Rys.6.4), a nade wszystko najwyższa aktywność biologiczna produktów
wygenerowanych w wyniku działania tych enzymów (Tab.6.3). Wszystkie reakcje
prowadzono przy zachowaniu optymalnego dla użytych enzymów pH środowiska
reakcyjnego, stosując odpowiednio bufor Tris-HCl o pH 8,0 dla proteinaz serynowych oraz
Gly-HCl o pH 3,5 dla proteazy aspartylowej. Jednocześnie podjęto próby maksymalnego
skrócenia czasu wszystkich hydroliz do 4 godz. przy zastosowaniu wyższych niż poprzednio
dawek enzymów, mając na uwadze koszty ekonomiczne procesu. Wysoka aktywność
proteinazy pochodzenia roślinnego, umożliwiła dodatkowo przeprowadzenie hydrolizy
wyczerpującej (dawka: 1000 j/mg hydrolizowanego białka). Wykonano również hydrolizy
sekwencyjne z udziałem zarówno dwóch proteinaz serynowych (początkowa hydroliza
enzymem z dyni figolistnej, a po 2 godz. proteinazą serynową z Yarrowia lipolytica) jak i obu
proteinaz drożdżowych (początkowa hydroliza proteinazą serynową, a po 2 godz. proteinazą
aspartylową z Yarrowia lipolytica). Przebieg degradacji białka śledzono poprzez oznaczenie
stopnia hydrolizy (DH) (Rys.6.9), przyrostu stężenia wolnych grup aminowych (Rys.6.10)
oraz profili peptydowych RP-HPLC (Rys.6.11).
Poziom hydrolizy poekstrakcyjnych białek żółtka zależny był zarówno od rodzaju
zastosowanego enzymu i jego dawki, jak również od czasu reakcji. Podobnie jak
w poprzednich badaniach, zaobserwowano, że w pierwszej godzinie reakcji białka były
degradowane znacznie wolniej, a w dalszym etapie proces ten przebiegał szybciej (Rys.6.9).
Duże zróżnicowanie stopnia hydrolizy uzyskano podczas reakcji z udziałem proteinazy z dyni
figolistnej. Zastosowanie najniższej dawki 100 j/mg skutkowało blisko 15% degradacją
substratu. Wynik ten okazał się znacznie niższy, niż w przypadku poziomu hydrolizy
72
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
wyizolowanego preparatu foswitynowego (26%, Rys.6.3), ale był też nieco wyższy
w porównaniu do stopnia degradacji IgY (12%, Rys.6.4). Zwiększanie dawki enzymu do 400
j/mg skutkowało wzrostem stopnia hydrolizy jedynie o 4%, jednakże dodatek proteinazy
w ilości 10 razy wyższej (1000 j/mg) pozwolił już na degradację substratu osiągającą wartość
ponad 46% (Rys.6.9).
Rys.6.9. Stopień hydrolizy (DH %) hydrolizatów białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja uzyskanych po zastosowaniu
różnych enzymów proteolitycznych lub sekwencji dwóch enzymów. Reakcje prowadzono w 0,1 M buforze Tris-HCl pH
8,0, poza hydrolizą z udziałem proteinazy aspartylowej z drożdży Yarrowia lipolytica, którą prowadzono w 0,2 M buforze
Glicyna-HCl pH 3,0 Stężenie białek poekstrakcyjnych wynosiło: 10 mg/ml. Reakcję hydrolizy rozpoczynano poprzez
dodanie enzymów w ilości: 100, 200, 400 lub 1000 j/mg hydrolizowanego białka w przypadku proteinazy z Cucurbita
ficifolia (oznaczenie: D) jak również 20 lub 40 j/mg hydrolizowanego białka w przypadku proteinazy serynowej i
aspartylowej z Yarrowia lipolytica (oznaczenia kolejno: Ys, Ya). Reakcje prowadzono w temperaturze 37 °C przez 4 h. Po
tym czasie proces hydrolizy hamowano poprzez inkubację prób przez 15 min w temperaturze: 100 °C. Następnie hydrolizaty
wychładzano i wirowano (5500 obr./min, t =15 min, T= pokojowa). Supernatanty liofilizowano i przechowywano w temp. 4
°C. Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ± SD, n = 3). Wartości średnie oznaczone różnymi literami
na tym samym wykresie różnią się statystycznie istotnie na poziomie p ≤0,05.
Analizując rezultaty hydrolizy białek poekstrakcyjnych żółtka jaja z udziałem
proteinazy serynowej z Yarrowia lipolytica warto zaznaczyć, że zastosowanie dawki 25 razy
niższej w stosunku od ilości enzymu pochodzenia roślinnego, pozwoliło już na blisko 35%owy rozkład substratu. Białka poekstrakcyjne wykazywały jednak dużą oporność na hydrolizę
73
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
proteinazą aspartylową z drożdży. W wyniku zastosowania dawki tego enzymu równej 20
j/mg, po 4 godz. reakcji uzyskano jedynie nieco ponad 13% degradację, a zwiększenie ilości
enzymu do 40 j/mg poprawiło ten wynik jedynie o 0,43% (Rys.6.9).
Zaaplikowanie dwóch rodzajów proteinaz serynowych: pochodzenia roślinnego
i mikrobiologicznego, w dawkach kolejno 100 i 20 j/mg w modelu hydrolizy sekwencyjnej
prowadziło do degradacji białek poekstrakcyjnych w stopniu 46,0%. Znacznie niższą
degradację uzyskano w wyniku hydrolizy sekwencyjnej z udziałem obu proteaz drożdżowych
(31,3%) (Rys.6.9).
Analiza stężenia wolnych grup aminowych w trakcie prowadzenia procesu hydrolizy
potwierdziła powyższe wyniki. W hydrolizatach otrzymanych z udziałem dyni figolistnej
aplikowanej w dawce 1000 j/mg, po 4 godz. degradacji oznaczono najwyższy poziom WGA
równy 4525,1 µmol Gly/g. Niższą zawartością wolnych grup aminowych charakteryzował
się 4 godzinny hydrolizat otrzymany w wyniku hydrolizy sekwencyjnej proteinazami
serynowymi (3843,8 µmol Gly/g). Z kolei, najniższy poziom WGA zanotowano dla
hydrolizatu otrzymanego w wyniku aktywności proteolitycznej proteinazy aspartylowej
z Yarrowia lipolytica zastosowanej w niższej dawce (1651,1 µmol Gly/g) (Rys.6.10).
74
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
Rys.6.10. Przyrost stężenia wolnych grup aminowych w hydrolizatach białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja
uzyskanych po zastosowaniu różnych enzymów proteolitycznych lub sekwencji dwóch enzymów. Warunki hydrolizy
podano w legendzie do Rys.6.9. Kontrolę stanowił preparat białek poekstrakcyjnych bez dodatku enzymu, dla którego
stężenie wolnych grup aminowych wyniosło 492.97 µM/g. Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ±
SD, n = 3). Wartości średnie oznaczone różnymi literami na tym samym wykresie różnią się statystycznie istotnie na
poziomie p ≤0,05.
Sporządzenie profili białkowo-peptydowych techniką RP-HPLC także pozwoliło na
monitorowanie przebiegu hydrolizy substratu białkowego pochodzącego z żółtka jaja
(Rys.6.11). Ich analiza potwierdziła między innymi zdolność badanych enzymów
proteolitycznych
do
efektywnej
degradacji
niskocząsteczkowych produktów hydrolizy.
białek,
a
także
obecność
nowych
Zaobserwowano występowanie zarówno
produktów o dłuższych czasach retencji (3-7 min.) charakterystycznych dla peptydów
bardziej hydrofobowych, jak i szczyty o krótkich czasach retencji (0,5-1 min.), typowe dla
produktów hydrofilowych. Peptydy o charakterze polarnym pojawiały się szczególnie po
zastosowaniu proteinazy serynowej z Yarrowia lipolytica (Rys.6.11 E, F) lub też sekwencji
enzymów proteolitycznych (Rys.6.11 I, J). Zasadniczo jednak, większość peptydów
zawartych w hydrolizatach eluowano acetonitrylem w zakresie stężenia od 25% do 55%.
Największą liczbę i zróżnicowanie frakcji peptydowych wykazano natomiast w hydrolizatach,
do których wprowadzano kolejno dwie proteinazy serynowe (Rys.6.11 I).
75
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
76
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
Rys.6.11. Profile białkowo-peptydowe RP-HPLC enzymatycznych hydrolizatów białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja
uzyskanych przy udziale enzymów: proteinazy serynowej z dyni figolistnej (oznaczenia: A-100 j/mg; B-200 j/mg; C400 j/mg; D-1000 j/mg), proteinazy serynowej z Yarrowia lipolytica (oznaczenia: E-20 j/mg; F-40 j/mg), proteinazy
aspartylowej z Yarrowia lipolytica (oznaczenia: G-20 j/mg; H-40 j/mg), sekwencji proteinaz serynowych z dyni
figolistnej i Y.lipolytica (oznaczenie: I-100+20 j/mg) oraz sekwencji proteinaz z Y.lipolytica (oznaczenie: J-20+20 j/mg).
Rozdział prowadzono na kolumnie Zorbax XDB C18 (1,8 x50 mm) w układzie faz: A (0,1% TFA/H20 i B (0,1% TFA/ACN),
w gradiencie od 0-100% w czasie od 2 do 12 minuty rozdziału; w temp. 30°C i przy przepływie 1ml/min. Nanoszono po
100µl hydrolizatu. Absorbancję monitorowano przy długości fali: λ=230 nm. Warunki hydrolizy podano w legendzie do Rys.
6.9.
6.3.2. Aktywności biologiczne enzymatycznych hydrolizatów białek poekstrakcyjnych
z żółtka jaja
Przeprowadzone hydrolizy jednoenzymowe jak i sekwencyjne preparatu białek
poekstrakcyjnych przyniosły oczekiwane rezultaty, w postaci zaawansowanych zmian
degradacyjnych, korzystnych w kontekście potencjalnych bioaktywności powstałych
peptydów. W kolejnym etapie przebadano więc otrzymane produkty hydrolizy pod kątem
różnych
aktywności
biologicznych,
między
innymi
pzreciwutleniającej
i przeciwdrobnoustrojowej. Dodatkowo, badania rozszerzono również o aktywności:
antyhipertensyjną, immunostymulującą i cytotoksyczną.
6.3.2.1. Aktywność przeciwutleniająca
Enzymatyczne hydrolizaty poddano ocenie aktywności przeciwutleniającej poprzez
oznaczenie zdolności wymiatania wolnych rodników DPPH, redukcji stopnia utlenienia
jonów żelaza (Fe2+) oraz chelatowania jonów żelaza. Wyniki wykazały, że spośród
wszystkich zastosowanych preparatów proteolitycznych niekonwencjonalna proteinaza
serynowa z drożdży Yarrowia lipolytica generowała peptydy charakteryzujące się najwyższą
aktywnością przeciwutleniajacą (Rys.6.12, Tab.6.4).
W aspekcie zdolności wymiatania wolnych rodników DPPH, niemal w każdym
przedziale czasowym, hydrolizaty otrzymane z udziałem serynowej proteinazy drożdżowej
77
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
w ilości 40 j/mg posiadały najwyższą aktywność. Pół godzinny hydrolizat tego enzymu
wyróżniał się zdolnością wymiatania wolnych rodników DPPH na poziomie 2,3 µM
troloxu/mg, natomiast 4 godzinny – 2,8 µM troloxu/mg (Tab.6.4). Również produkty
otrzymane na drodze hydrolizy sekwencyjnej z udziałem obu proteinaz pochodzenia
drożdżowego posiadały wysoką aktywność przeciwutleniającą. Produkty ograniczonej, 0,5
godzinnej hydrolizy wykazały zdolność do wymiatania wolnych rodników DPPH równą 2,0
µM troloxu/mg. Pozostałe analizowane hydrolizaty charakteryzowały się znacznie niższą
zdolnością wymiatania wolnych rodników DPPH (Rys.6.12).
Najwyższą aktywność redukcji stopnia utlenienia jonów żelaza (Fe2+) oznaczono dla
0,5 godzinnego hydrolizatu otrzymanego z udziałem proteinazy serynowej z drożdży
Yarrowia lipolytica, ale zastosowanej w niższej dawce (209,9 µg Fe2+/mg). Jednakże, w tym
wypadku żadna z zastosowanych hydroliz sekwencyjnych prowadzonych także z udziałem tej
proteinazy nie pozwoliła na wygenerowanie bardziej lub porównywalnie aktywnych
peptydów. Omawiana aktywność pozostałych produktów degradacji kształtowała się
w zakresie od 8,7 do 141,4 µg Fe2+/mg (Tab.6.4). Można również stwierdzić, iż w większości
przypadków
głębsza degradacja białek powodowała spadek rozpatrywanej aktywności.
Wyjątkiem były między innymi hydrolizaty otrzymane z udziałem dyni figolistnej stosowanej
w najwyższej dawce 1000 j/mg, gdzie w miarę postępu hydrolizy aktywność wzrastała
osiągając maksimum po 4 godzinach reakcji (51,5 µg Fe2+/mg) (Rys.6.12, Tab.6.4).
78
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
Rys.6.12. Aktywność przeciwutleniająca wyrażona jako zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH, zdolność
redukcji stopnia utlenienia jonów żelaza (FRAP) oraz aktywność chelatowania jonów żelaza, hydrolizatów białek
poekstrakcyjnych z żółtka jaja uzyskanych po zastosowaniu różnych enzymów proteolitycznych lub sekwencji dwóch
enzymów. Warunki hydrolizy podano w legendzie do Rys. 6.9. Aktywność przeciwutleniającą wyliczano dla 1 mg białka.
Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ± SD, n = 3). Wartości średnie oznaczone różnymi literami na
tym samym wykresie oraz w tej samej grupie enzymu i jego dawki różnią się statystycznie istotnie na poziomie p ≤0,05.
W toku analizy zdolności chelatowania hydrolizatów, jako jednego z mechanizmów
działania przeciwutleniającego, zauważono, że najwyższymi aktywnościami wyróżniały
się również produkty degradacji otrzymane pod wpływem serynowej proteinazy z Yarrowia
lipolytica (Rys.6.12). Przy czym, aktywność chelatowania produktów otrzymanych po 0,5
godzinnej degradacji była niemal 400 jednostek wyższa niż produktów uzyskanych
w końcowym etapie hydrolizy (Tab.6.4). Podobne zróżnicowanie poziomu aktywności
w zależności od czasu reakcji zaobserwowano dla hydrolizatów otrzymanych na drodze
reakcji sekwencyjnych. W przypadku hydrolizy białek poekstrakcyjnych proteinazą
pochodzenia roślinnego, najwyższą zdolność chelatującą wykazały produkty otrzymane po 4
godzinnej degradacji enzymem w dawce 1000 j/mg. Zdolność ta wyniosła wówczas 695,8 µg
Fe2+/mg (Rys.6.12).
W porównaniu do właściwości antyoksydacyjnych badanego substratu białkowego,
aktywności przeciwutleniające uzyskanych hydrolizatów były średnio dwukrotnie wyższe
79
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
w aspekcie zdolności do redukcji oraz do chelatowania jonów żelaza Fe2+, a także niemal
dwunastokrotnie krotnie wyższe w przypadku zdolności wymiatania wolnych rodników
DPPH (Tab.6.1, Tab.6.4).
6.3.2.2. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa
Obok
aktywności
przeciwutleniającej,
hydrolizaty
preparatów
białek
poekstrakcyjnych poddano ocenie pod kątem ich aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Jedne
z podstawowych metod przedłużenia trwałości produktów spożywczych opierają się bowiem
na wykorzystaniu związków aktywnych biologicznie wykazujących te oba synergistyczne
efekty. Przeciwdrobnoustrojowe właściwości enzymatyczne hydrolizatów badano wobec
szczepów bakterii z rodzaju Bacillus takich jak: B. subtilis B 172, B. subtilis B 3, B. cereus
B 512, B. cereus B 3p i B. laterisporum B 6, które często obniżają jakość produktów
spożywczych lub powodują zatrucia pokarmowe. Ponadto, przebadano działanie hydrolizatów
wobec innych bakterii chorobotwórczych jakimi są: S. aureus FRI137, L. monocytogenes
serotyp 4B i E. coli PCM419.
Żaden z
hydrolizatów, stosowanych w ilości 100 µg na studzienkę nie wykazał
aktywności przeciwdrobnoustrojowej wobec wybranych szczepów. Aktualnie w literaturze
nie ma danych na temat hydrolizatów białek żółtka, które wykazywałyby aktywność
przeciwdrobnoustrojową.
6.3.2.3. Aktywność antyhipertensyjna
Właściwości antyhipertensyjne hydrolizatów określono poprzez oznaczenie ich
aktywności inhibitorowej in vitro wobec konwertazy angiotensyny I (ACE). Peptydy
antyhipertensyjne mogą znaleźć wykorzystanie jako naturalne związki farmakologiczne, jak
również substancje podnoszące wartość zdrowotną żywności funkcjonalnej. Wstępne badania
dowiodły, że żaden z wykorzystywanych do badań substratów nie posiadał tej aktywności
(Tab.6.1). Ze względu na wysoki koszt enzymu konwertazy angiotensyny I, nie
przeprowadzono testów na hydrolizatach preparatu foswitynowego i immunoglobuliny Y
podczas badań wstępnych. W przypadku hydrolizatów preparatu białek poekstrakcyjnych,
z tego samego względu, pod kątem działania przeciwnadciśnieniowego przebadano tylko 3 i 4
godzinne produkty degradacji. Z danych literaturowych wynika bowiem, że aktywność tę
wykazują przede wszystkim krótkie peptydy, powstałe na drodze wyczerpującej hydrolizy
białek.
80
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
Rys.6.13. Aktywność inhibitorowa wobec enzymu ACE (IC50) 3 i 4 godzinnych hydrolizatów białek poekstrakcyjnych
z żółtka jaja uzyskanych po zastosowaniu różnych enzymów proteolitycznych lub sekwencji dwóch enzymów. Warunki
hydrolizy podano w legendzie do Rys.6.9. Aktywność antyhipertensyjną wyliczano jako taką ilość hydrolizatu (w µg) , która
potrzebna jest do połowicznego zahamowania aktywności enzymu ACE. Wszystkie dane przedstawiono jako wartości
średnie (średnia ± SD, n = 3). Wartości średnie oznaczone różnymi literami na tym samym wykresie oraz w tej samej grupie
enzymu i jego dawki różnią się statystycznie istotnie na poziomie p ≤0,05.
Wyniki badań aktywności zhydrolizowanych białek poekstrakcyjnych, otrzymanych
po 3 i 4 godzinnej reakcji z udziałem poszczególnych proteinaz niekonwencjonalnych
wykazały ich zróżnicowaną zdolność hamowania enzymu ACE (Rys.6.13). Niemal w każdym
przypadku wyższą aktywność antyhipertensyjną przejawiały hydrolizaty o wyższym stopniu
degradacji. W obrębie hydroliz zarówno jednoenzymowych jak i sekwencyjnych,
przeprowadzonych z udziałem proteinaz serynowych: roślinnej (1000 j/mg) i drożdżowej
z Yarrowia lipolytica (40 j/mg) nie uzyskano znaczących różnic w poziomach aktywności
inhibitorowej wobec enzymu ACE (Rys.6.13). Najwyższą aktywność inhibitorową wobec
tego enzymu wykazały hydrolizaty otrzymane z udziałem proteinazy serynowej z drożdży,
aplikowanej w wyższej dawce (Tab.6.4).
81
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
Tab.6.4. Zestawienie aktywności ptrzeciwutleniającej, antyhipertensyjnej i przeciwdrobnoustrojowej hydrolizatów
białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja uzyskanych po zastosowaniu różnych enzymów proteolitycznych lub sekwencji
dwóch enzymów. Aktywność przeciwutleniająca wyrażona została jako zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH,
zdolność redukcji stopnia utlenienia jonów żelaza oraz aktywność chelatowania jonów żelaza. Aktywność przeciwutleniającą
wyliczano dla 1 mg białka. Aktywność antyhipertensyjną wyliczano jako taką ilość hydrolizatu (w µg), która potrzebna jest
do połowicznego zahamowania aktywności enzymu ACE. Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ±
SD, n = 3). Wartości średnie oznaczone różnymi literami w tej samej kolumnie oraz w tej samej grupie enzymu i jego dawki
różnią się statystycznie istotnie na poziomie p ≤0,05.
ENZYM
CZAS
HYDROLI
ZY
[h]
0,5
proteinaza z
Cucurbita
ficifolia
100 j/mg
1
3
4
proteinaza z
Cucurbita
ficifolia
200 j/mg
1
3
4
0,5
proteinaza z
Cucurbita
ficifolia
400 j/mg
1
3
4
0,5
proteinaza z
Cucurbita
ficifolia
1000 j/mg
1
3
4
0,5
proteinaza
serynowa z
Yarrowia
lipolytica
1
20 j/mg
4
3
0,5
proteinaza
1
ZDOLNOŚĆ
REDUKCJI
STOPNIA
UTLENIENIA
JONOW Fe2+ FRAP
[μg Fe2+/mg]
AKTYWNOŚĆ
CHELATOWANIA
JONÓW Fe2+
[μg Fe2+/mg]
AKTYWNOŚĆ
INHIBITOROWA
WOBEC
ENZYMU ACE
[IC50]
0.89
a
± 0.03
0.32
b
± 0.03
0.18
c
± 0.02
0.28
b
± 0.02
0.63
a
± 0.02
0.20
c
± 0.03
0.08
d
± 0.01
0.27
b
± 0.01
0.20
ab
± 0.03
0.21
a
± 0.03
0.20
a
± 0.04
0.24
a
± 0.02
0
51.46
a
± 1.38
48.78
b
± 1.62
36.44
c
± 1.20
33.26
d
± 0.67
46.14
a
± 1.33
44.68
a
± 1.21
37.11
b
± 0.73
35.53
b
± 1.66
38.91
a
± 1.41
36.77
a
± 1.20
35.44
ab
± 1.30
35.40
ab
± 0.78
21.71
d
± 1.37
27.78
c
± 1.75
43.33
b
± 1.06
56.41
a
± 1.13
209.94
a
± 2.43
52.20
d
± 0.86
73.22
b
± 1.26
62.76
c
± 1.06
141.44
a
± 1.06
123.05
674.38
a
± 13.67
566.26
c
± 3.89
474.25
d
± 4.01
597.10
b
± 8.22
600.72
b
± 1.74
507.59
d
± 2.88
553.75
c
± 13.79
626.16
a
± 6.56
468.70
d
± 12.07
513.73
c
± 3.81
573.56
b
± 3.77
695.86
a
± 7.11
42.32
d
± 2.83
254.79
b
± 5.78
82.49
c
± 1.86
695.76
a
± 14.91
729.46
a
± 16.37
599.49
b
± 17.66
383.59
d
± 3.16
485.68
c
± 12.35
810.70
a
± 16.40
670.46
-
0.11
c
± 0.02
0.23
b
± 0.02
0.42
a
± 0.03
0
0.35
b
± 0.03
0.05
c
± 0.01
0.52
a
± 0.03
2.29
b
± 0.04
1.36
AKTYWNOŚĆ
PRZECIWDROBNOUSTROJO
WA
20.74
b
± 0.69
18.51
a
± 0.61
15.63
b
± 0.45
12.08
a
± 0.57
10.12
b
± 0.41
8.75
a
± 0.18
2.19
a
± 0.31
1.93
a
± 0.24
-
Brak aktywności dla wszystkich frakcji zastosowanych w stężeniu 0,1 mg/ml
0,5
ZDOLNOŚĆ
WYMIATANIA
WOLNYCH
RODNIKÓW
DPPH
[μM trolox/mg]
6.32
b
± 0.41
3.92
a
± 0.26
-
82
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
serynowa z
Yarrowia
lipolytica
d
proteinaza
aspartylowa z
Yarrowia
lipolytica
1
40 j/mg
4
hydroliza
sekwencyjna
proteinaza z
Cucurbita
ficifolia
/proteinaza
serynowa z
Y.lipolytica
0,5
± 0.05
2.10
c
± 0.07
2.75
a
± 0.07
1.47
a
± 0.06
1.34
a
± 0.09
1.12
ab
± 1.00
0.52
c
± 0.05
1.41
a
± 0.06
1.07
b
± 0.04
0.74
c
± 0.03
0.61
d
± 0.03
0
1
0
3
hydroliza
sekwencyjna
proteinaza
serynowa z
Y.lipolytica
/proteinaza
aspartylowa z
Y.lipolytica
0,5
0.61
a
± 0.06
0.37
b
± 0.07
2.03
a
± 0.08
1.76
b
± 0.03
1.09
c
± 0.08
0.93
c
± 0.04
40 j/mg
3
4
0,5
proteinaza
aspartylowa z
Yarrowia
lipolytica
1
20 j/mg
4
3
0,5
3
4
1
3
4
b
± 1.45
100.02
c
± 1.20
88.25
d
± 0.71
24.14
a
± 0.66
20.21
b
± 1.08
11.22
c
± 0.42
8.66
d
± 0.62
23.28
a
± 0.84
18.01
b
± 0.50
12.88
c
± 0.74
10.75
d
± 0.59
32.45
a
± 0.86
27.60
b
± 1.28
25.35
c
± 1.18
18.01
d
± 0.42
60.11
a
± 0.98
53.82
b
± 1.04
14.15
c
± 0.47
12.27
c
± 0.56
b
± 1.84
589.83
c
± 13.84
419.99
d
± 3.47
38.32
a
± 2.94
1.61
c
± 0.12
1.02
d
± 0.09
1.95
b
± 0.08
5.55
c
± 0.19
6.81
a
± 0.39
6.10
b
± 0.26
0.75
d
± 0.03
668.02
a
± 6.85
530.72
b
± 3.99
378.00
c
± 4.30
263.67
d
± 12.24
766.79
a
± 6.82
680.02
b
± 3.56
312.76
c
± 3.66
267.32
d
± 12.33
1.33
a
± 0.21
1.08
a
± 0.12
23.92
b
± 0.86
15.79
a
± 0.42
12.33
b
± 0.46
6.62
a
± 0.39
19.46
a
± 1.12
18.65
a
± 0.92
1.52
a
± 0.23
1.41
a
± 0.35
najwyższe aktywności
6.3.2.4. Aktywność cytotoksyczna/proliferacyjna
Wybrane hydrolizaty uzyskane z udziałem proteinaz serynowych: z dyni figolistnej
(100 j/mg, 200 j/mg i 1000 j/mg) oraz z Yarrowia lipolytica (40 j/mg) otrzymane po 0,5, 3 i 4
godzinach reakcji, które wykazywały atrakcyjne właściwości biologiczne, testowano także
pod kątem cytotoksyczności i/lub proliferacji na ludzkich i zwierzęcych liniach
komórkowych. Oznaczenie to obejmowało określenie uszkodzenia lub zwiększonego wzrostu
komórek po zastosowaniu badanych substancji. Żywotność komórek oszacowano za pomocą
techniki MTT (Rys.6.14).
Uzyskane wyniki dowiodły, że hydrolizaty, użyte w stężeniach 1% i 10% nie wykazują
83
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
cech toksyczności wobec zwierzęcych i ludzkich linii komórkowych (Balb 3T3 – mysich
keratynocytów, HepG2 – ludzkich hepatocytów, HaCaT – ludzkich keratynocytów) podczas
48 godzinnej inkubacji. Co więcej, mogą one wpływać nieznacznie stymulująco na wzrost linii
komórkowych Balb 3T3. Powyższe dane wymagają jednak bardziej szczegółowej weryfikacji.
A
B
C
Rys.6.14. Aktywność cytotoksyczna/proliferacyjna hydrolizatów białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja, uzyskanych po
zastosowaniu proteinaz serynowych z C.ficifolia i Y.lipolytica, badana na liniach komórkowych: A - mysich
fibroblastów Balb 3T3, B - ludzkich hepatocytów HepG2, C - ludzkich keratynocytów HaCaT. Badanie było
prowadzone w 96-cio studzienkowej płytce, gdzie zostały umieszczone komórki w ilości: 5x103/studzienkę dla Balb3T3 i
HaCaT oraz 1x104/studzienkę dla HepG2 w 100µl medium hodowlanym. W pierwszym etapie badania, komórki były
namnażane w 2% FCS medium hodowlanym przez 24 godziny. W drugim etapie po dodaniu hydrolizatów białkowych (0%,
1%, i 10%) medium zostało zmienione na 0% FCS + hydrolizaty białkowe / rozpuszczalnik i pozostawione przez 48 godz. w
celu wzrostu komórek. W trzecim etapie badania do medium dodano odczynnik MTT i po czasie inkubacji; 3 godziny,
przeprowadzono odczyt żywotności komórek spektrofotometrycznie. Rozpuszczalnikiem hydrolizatów białkowych była
woda z założeniem, iż rozpuszczalnik nie ma negatywnych cech na wzrost komórek. Wszystkie dane przedstawiono jako
wartości średnie (średnia ± SD, n = 3).
84
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
6.3.2.5. Aktywność immunostymulująca
Hydrolizaty,
które
wykazały
najwyższe
aktywności
przeciwutleniające
i antyhipertensyjne poddano także ocenie pod kątem ich aktywności immunostymulującej.
Były to: 0,5 i 4 godzinne hydrolizaty uzyskane z udziałem kolejno 100 j/mg oraz 1000 j/mg
proteinazy serynowej z Cucurbita ficifolia, jak również 0,5 i 4 godzinne hydrolizaty
otrzymane z udziałem 40 j/mg proteinazy serynowej z Yarrowia lipolytica. Sprawdzono
immunostymulujące działanie wobec antyzapalnej interleukiny IL-10, biorącej udział
w wygaszaniu odczynu zapalnego w organizmie, oraz wobec najbardziej wielokierunkowo
działającej cytokiny IL-6 w teście (ex vivo) na ludzkiej krwi obwodowej. Ta ostatnia, z jednej
strony działa silnie prozapalnie a z drugiej uczestniczy w zwrotnym hamowaniu syntezy TNF.
W przypadku antyzapalnej interleukiny 10, zaobserwowano istotny statystycznie
wzrost jej poziomu po zastosowaniu obu 0,5 godzinnych hydrolizatów w dawce 50 µg/ml.
Hydrolizaty otrzymane z udziałem 100 oraz 1000 jednostek enzymu dyniowego, zastosowane
w teście w stężeniu wynoszącym 100 µg/ml, przyczyniły się również do wzrostu aktywności
prozapalnej interleukiny 6. Aktywność immunostymulująca hydrolizatów nie kształtowała się
jednak na znacząco wysokim poziomie w porównaniu do kontroli pozytywnej (LPS), dlatego
poprzestano na dalszym poszukiwaniu hydrolizatów/peptydów wykazujących te właściwości.
85
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
6.3.3. Izolacja peptydów z hydrolizatów wykazujących najwyższe aktywności
biologiczne
6.3.3.1. Ultrafiltracja wybranych hydrolizatów z udziałem membran
polietylenosulfonowych
Produkty degradacji enzymatycznej wykazujące najwyższe aktywności biologiczne,
t.j. 0,5 i 4 godzinne hydrolizaty otrzymane z udziałem proteinazy z dyni figolistnej (dawka:
kolejno 100j/mg i 1000 j/mg) oraz 0,5 i 4 godzinne hydrolizaty uzyskane z udziałem
proteinazy serynowej z drożdży Yarrowia lipolytica (dawka: 40 j/mg), poddano wstępnemu
frakcjonowaniu metodą ultrafiltracji. Procedura ta obejmowała wykorzystanie membran
polietylenosulfonowych o przepuszczalności granicznej: 30 kDa (w celu oddzielenia reszty
proteinazy) oraz 5 kDa, i stanowiła pierwszy etap procesu izolacji i oczyszczenia cennych
biologicznie peptydów (Rys.6.15). Z każdego hydrolizatu wyodrębniono i oceniono pod
względem zawartości białka i aktywności biologicznych 2 frakcje. Frakcja I odpowiadała
wielko- i średnio-gabarytowym fragmentom peptydowym (MW >5 kDa), natomiast frakcja II
zawierała w swym składzie małe peptydy o masach cząsteczkowych poniżej 5 kDa.
W otrzymanych frakcjach oznaczano analogicznie jak w wyjściowych hydrolizatach
aktywność przeciwutleniającą, przeciwdrobnoustrojową oraz antyhipertensyjną.
HYDROLIZAT
> 30 kDa
30 kDa
30 kDa > F1 > 5 kDa
5 kDa
F2 < 5 kDa
Rys.6.15. Schemat procesu ultrafiltracji hydrolizatów białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja otrzymanych z udziałem
proteinaz serynowych z C. ficifolia oraz z Y.lipolytica wykazujących najwyższe aktywności biologiczne. Zebrane
frakcje liofilizowano i przechowywano w temperaturze 4° C.
86
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
Otrzymane frakcje peptydów, podobnie jak wyjściowe hydrolizaty enzymatyczne
wykazały znikome hamowanie wzrostu mikroorganizmów. Produkty pozyskane w procesie
ultrafiltracji przejawiały jednak atrakcyjne właściwości antyutleniające (Tab.6.5).
Wszystkie frakcje peptydowe wykazały wyższą zdolność zmiatania rodników DPPH
w porównaniu do ich wyjściowych hydrolizatów. W przypadku zdolności redukującej stopień
utlenienia jonów żelaza, jedynie frakcje pozyskane po 0,5 godzinnej hydrolizie proteinazą
serynową z drożdży przejawiały niższe działanie niż hydrolizaty wyjściowe. Natomiast,
frakcjonowanie hydrolizatów metodą ultrafiltracji przyczyniło się do obniżenia zdolności
chelatujących.
Frakcje oznaczone jako 4, 6 i 7 wykazały najwyższe aktywności przeciwutleniające, a
dwie ostatnie charakteryzowały się dodatkowo wysoką aktywnością inhibitorową wobec
enzymu ACE. Dlatego też, właśnie te produkty wytypowano do dalszej analizy i oczyszczania
na drodze chromatografii żelowej (Tab.6.5).
Tab.6.5. Aktywności biologiczne frakcji hydrolizatów białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja uzyskanych po procesie
ultrafiltracji z wykorzystaniem membran polietylenosulfonowych. Aktywność przeciwutleniajaca wyrażona została jako
zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH, zdolność redukcji stopnia utlenienia jonów żelaza oraz aktywność
chelatowania jonów żelaza (wyliczano dla 1 mg białka). Aktywność antyhipertensyjną wyliczano jako taką ilość hydrolizatu
(w µg), która potrzebna jest do połowicznego zahamowania aktywności enzymu ACE. Wszystkie dane przedstawiono jako
wartości średnie (średnia ± SD, n = 3). Wartości średnie oznaczone różnymi literami w tej samej kolumnie różnią się
statystycznie istotnie na poziomie p ≤0,05.
FRAKCJA
ENZYM
Nr
1
proteinaza
z Cucurbita
ficifolia
1000 j/mg
3
2
4
5
proteinaza
serynowa z
Yarrowia
lipolytica
40 j/mg
6
7
8
0,5 h, >5
kDa
0,5 h, <5
kDa
4 h,
>5 kDa
4 h,
<5 kDa
0,5 h, >5
kDa
0,5 h, <5
kDa
4 h,
>5 kDa
4 h,
<5 kDa
najwyższe aktywności
ZDOLNOŚĆ
REDUKCJI
STOPNIA
UTLENIENIA
JONOW Fe2+ FRAP
[μg Fe2+/mg]
AKTYWNOŚĆ
CHELATOWANIA
JONÓW Fe2+
[μg Fe2+/mg]
AKTYWNOŚĆ
INHIBITOROWA
WOBEC
ENZYMU ACE
[IC50]
AKTYWNOŚĆ
PRZECIWDROBNOUSTROJOWA
3.31*
140.66*
73.66
11.55
ab
c
d
h
± 0.16
± 2.68
± 1.56
± 0.56
2.00*
158.94*
401.73
8.78
c
a
b
g
± 0.19
± 2.29
± 2.81
± 0.23
2.20*
141.59*
0.42
2.16
c
c
h
e
± 0.20
± 2.13
± 0.07
± 0.07
3.63*
149.67*
440.68
1.91*
a
b
a
d
± 0.50
± 1.73
± 2.11
± 0.08
3.58*
76.16
8.37
5.72
ab
f
g
f
± 0.24
± 1.73
± 0.23
± 0.08
3.84*
106.25
34.26
1.57
a
e
f
c
± 0.33
± 0.24
± 0.99
± 0.05
4.13*
141.67*
100.16
0.84*
a
c
c
a
± 0.17
± 0.70
± 1.67
± 0.03
3.30*
119.34*
58.06
0.98*
ab
d
e
b
± 0.26
± 0.91
± 0.94
± 0.02
* wzrost aktywności w porównaniu do hydrolizatu wyjściowego
Brak aktywności dla wszystkich frakcji
zastosowanych w stężeniu 0,1 mg/ml
proteinaza
z Cucurbita
ficifolia
100 j/mg
ZDOLNOŚĆ
WYMIATANIA
WOLNYCH
RODNIKÓW
DPPH
[μM trolox/mg]
87
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
6.3.3.2. Rozdział wybranych frakcji peptydowych na kolumnie żelowej
W następnym etapie oczyszczania najbardziej aktywne frakcje otrzymane po procesie
ultrafiltracji, oznaczone numerami 4, 6 i 7, poddano sączeniu molekularnemu w systemie
HPLC, na kolumnie Zorbax GF-250. W wyniku rozdziału frakcji 4, zawierającej peptydy
o masach poniżej 5 kDa, uzyskano cztery subfrakcje peptydowe zróżnicowane pod względem
ciężaru cząsteczkowego (Rys.6.16). Rozdział frakcji nr 6, w której skład wchodziły także
małocząsteczkowe peptydy, prowadził do uzyskania trzech subfrakcji (Rys.6.17). Natomiast
w toku sączenia molekularnego frakcji 7, zawierającej peptydy o masach powyżej 5 kDa,
otrzymano pięć subfrakcji (Rys.6.18).
Rys.6.16. Chromatografia żelowa frakcji 4, zawierającej peptydy o masach <5 kDa, otrzymanej w procesie
ultrafiltracji 4-godzinnego hydrolizatu proteinazy z C.ficifolia zastosowanej w dawce 1000 j/mg. Rozdział prowadzono
na kolumnie Zorbax GF-250 Agilent (4,6 × 250mm) w systemie HPLC. Frakcję eluowano za pomocą buforu 0,02M Tris-HCl
(pH 6,8) + 0,2M NaCl, w czasie od 0 do 20 minuty rozdziału; w temp. 30°C i przy przepływie 0,25ml/min. Oznaczono
aktywność przeciwutleniajacą, wyrażoną jako zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH, zdolność redukcji stopnia
utlenienia jonów żelaza i aktywność chelatowania jonów żelaza (wyliczano dla 1 mg białka), oraz aktywność
antyhipertensyjną (wyliczano dla 1 µg białka). Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ± SD, n = 3).
Wartości średnie oznaczone różnymi literami na tym samym wykresie różnią się statystycznie istotnie na poziomie p ≤0,05.
Najwyższe aktywności takie jak: zdolność redukujaca, chelatująca i inhibitorowa
wobec ACE, uzyskano dla subfrakcji oznaczonej jako 4.4 zawierającej peptydy o masach <1
kDa, otrzymanej w procesie ultrafiltracji 4-godzinnego hydrolizatu otrzymanego z udziałem
proteinazy z dyni figolistnej zastosowanej w dawce 1000 j/mg (Tab.6.6). Subfrakcja ta
charakteryzowała się niemal 2 – krotnym wzrostem zdolności redukującej (FRAP) oraz
prawie 10 – krotnym wzrostem aktywności antyhipertensyjnej w stosunku do frakcji 4.
Zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH dla tej subtrakcji zmalała o 1,28 jednostki,
88
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
jednakże wciąż była dużo wyższa (ponad 5,5 razy) niż aktywność hydrolizatu wyjściowego.
Nieznacznie zwiększyła się również aktywność chelatowania jonów żelaza, która wyniosła
444,9 µg Fe2+/mg (Rys.6.16, Tab.6.6).
Również subtrakcja 4.2 pochodząca od tej samej frakcji 4 i hydrolizatu uzyskanego
z udziałem enzymu z dyni figolistnej charakteryzowała się wysokimi aktywnościami
biologicznymi, w szczególności zdolnością do redukcji jonów żelaza (o 80 jednostek wyższa)
oraz inhibitorową wobec enzymu ACE (8,5 razy wyższa).
Rys.6.17. Chromatografia żelowa frakcji 6, zawierającej peptydy o masach <5 kDa, otrzymanej w procesie
ultrafiltracji 0,5-godzinnego hydrolizatu proteinazy serynowej z Y. lipolytica zastosowanej w dawce 40 j/mg. Rozdział
prowadzono na kolumnie Zorbax GF-250 Agilent (4,6 × 250mm) w systemie HPLC. Frakcję eluowano za pomocą buforu
0,02M Tris-HCl (pH 6,8) + 0,2M NaCl, w czasie od 0 do 20 minuty rozdziału; w temp. 30°C i przy przepływie 0,25ml/min.
Oznaczono aktywność przeciwutleniajacą, wyrażoną jako zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH, zdolność redukcji
stopnia utlenienia jonów żelaza i aktywność chelatowania jonów żelaza (wyliczano dla 1 mg białka), oraz aktywność
antyhipertensyjną (wyliczano dla 1 µg białka). Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ± SD, n = 3).
Wartości średnie oznaczone różnymi literami na tym samym wykresie różnią się statystycznie istotnie na poziomie p ≤0,05.
Najwyższą aktywność wymiatania wolnych rodników DPPH wykazała subfrakcja 3
otrzymana w procesie chromatografii żelowej frakcji 6, oraz subfrakcja 5 uzyskana po
chromatografii frakcji 7 (Rys.6.17, Rys.6.18; Tab.6.6). Aktywność ta w obu przypadkach była
o 0,8 jednostki wyższa w porównaniu do frakcji wyjściowej oraz około 2 razy wyższa
w stosunku do wyjściowego hydrolizatu (kolejno 0,5 i 4 godzinnego otrzymanego z udziałem
drożdży Yarrowia lipolytica) i wyniosła 4,68 µM trolox/mg dla subfrakcji 6.3 oraz 4,94 µM
trolox/mg dla subfrakcji 7.5 (Tab.6.6).
89
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
Rys.6.18. Chromatografia żelowa frakcji 7, zawierającej peptydy o masach >5 kDa, otrzymanej w procesie
ultrafiltracji 4-godzinnego hydrolizatu proteinazy serynowej z Y. lipolytica zastosowanej w dawce 40 j/mg. Rozdział
prowadzono na kolumnie Zorbax GF-250 Agilent (4,6 × 250mm) w systemie HPLC. Frakcję eluowano za pomocą buforu
0,02M Tris-HCl (pH 6,8) + 0,2M NaCl, w czasie od 0 do 20 minuty rozdziału; w temp. 30°C i przy przepływie 0,25ml/min.
Oznaczono aktywność przeciwutleniajacą, wyrażoną jako zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH, zdolność redukcji
stopnia utlenienia jonów żelaza i aktywność chelatowania jonów żelaza (wyliczano dla 1 mg białka), oraz aktywność
antyhipertensyjną (wyliczano dla 1 µg białka). Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ± SD, n = 3).
Wartości średnie oznaczone różnymi literami na tym samym wykresie różnią się statystycznie istotnie na poziomie p ≤0,05.
Subfrakcje: 4.2, 4.4, 6.3 i 7.5, o najwyższych aktywnościach biologicznych poddano
dalszej charakterystyce, która obejmowała między innymi analizę aminokwasową (Tab.6.7).
W subfrakcjach 4.2, 4.4 oraz 7.5 stwierdzono istotnie wyższe wartości procentowe
pozostałości leucyny (odpowiednio 11,2%, 16,7%, 15,0%) w porównaniu do subfrakcji 6.3
(około 2%). Dodatkowo, subfrakcje 4.2 i 4.4 charakteryzowały się dużym podobieństwem
proporcji w udziale reszt aminokwasowych takich jak: Met, Ser i Ala. W żadnej
z analizowanych subfrakcji nie zaobserwowano znaczącej ilości aminokwasów takich jak Tyr,
Met, Lys, Phe, które mają zasadniczy wpływ na właściwości antyoksydacyjne peptydów
[Pihlanto, 2006]. Stwierdzono natomiast wysokie stężenia takich egzogennych aminokwasów
jak: walina i treonina (w subfrakcji 6.3), oraz arginina (w subfrakcjach: 4.2, 6.3).
90
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
Tab.6.6. Zestawienie hydrolizatów wyjściowych białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja oraz frakcji peptydów
uzyskanych po procesie ultrafiltracji i chromatografii żelowej wykazujących najwyższe aktywności biologiczne.
Aktywność przeciwutleniajaca wyrażona została jako zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH, zdolność redukcji
stopnia utlenienia jonów żelaza oraz aktywność chelatowania jonów żelaza (wyliczano dla 1 mg białka). Aktywność
antyhipertensyjną wyliczano jako taką ilość hydrolizatu (w µg), która potrzebna jest do połowicznego zahamowania
aktywności enzymu ACE. Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ± SD, n = 3). Wartości średnie
oznaczone różnymi literami w tej samej kolumnie oraz w tej samej grupie enzymu i jego dawki różnią się statystycznie
istotnie na poziomie p ≤0,05.
Nr
FRAKCJI
proteinaza
z Cucurbita
ficifolia
1000 j/mg
HYDROLIZAT
WYJŚCIOWY 4h
4
(<5 kDa)
4.2
4.4
proteinaza
serynowa z
Yarrowia
lipolytica
40 j/mg
proteinaza
serynowa z
Yarrowia
lipolytica
40 j/mg
HYDROLIZAT
WYJŚCIOWY 0,5h
6 (<5 kDa)
6.3
HYDROLIZAT
WYJŚCIOWY 4h
7 (>5 kDa)
7.5
najwyższe aktywności
frakcji uzyskanych po
chromatografi żelowej
ZDOLNOŚĆ
WYMIATANIA
WOLNYCH
RODNIKÓW
DPPH
[μM trolox/mg]
ZDOLNOŚĆ
REDUKCJI
STOPNIA
UTLENIENIA
JONOW Fe2+ FRAP
[μg Fe2+/mg]
AKTYWNOŚĆ
CHELATOWANIA
JONÓW Fe2+
[μg Fe2+/mg]
AKTYWNOŚĆ
INHIBITOROWA
WOBEC
ENZYMU ACE
[IC50]
AKTYWNOŚĆ
PRZECIWDROBNOUSTROJO
WA
0.42
d
± 0.03
3.63*
a
± 0.50
2.81
b
± 0.28
2.35
c
± 0.12
2.29
c
± 0.04
3.84*
b
± 0.33
4.68*
a
± 0.10
2.75
c
± 0.07
4.13*
b
± 0.17
4.94*
a
± 0.15
56.41
d
± 1.13
149.67*
c
± 1.73
229.74*
b
± 2.62
269.59*
a
± 3.00
141.44
a
± 1.06
106.25
c
± 0.24
123.54*
b
± 6.40
88.25
c
± 0.71
141.67*
b
± 0.70
163.24*
a
± 11.37
695.76
a
± 14.91
440.68
b
± 2.11
96.92
c
± 1.20
444.88
b
± 11.47
1310.70
a
± 16.40
34.26
c
± 0.99
270.54*
b
± 11.82
419.99
a
± 3.47
100.16
c
± 1.67
269.60*
b
± 9.02
1.93
c
± 0.24
1.91
c
± 0.08
0.22*
b
± 0.02
0.19*
a
± 0.02
-
Brak aktywności dla wszystkich frakcji zastosowanych
w stężeniu 0,1 mg/ml
ENZYM
IZOLACJA
BIOAKTYWNYCH
FRAKCJI
1.57
b
± 0.05
0.41*
a
± 0.01
1.08
b
± 0.12
0.84
b
± 0.03
0.26*
a
± 0.05
* wzrost aktywności w porównaniu do hydrolizatu lub frakcji poprzedniej
Ponadto, subfrakcje 4.2 i 7.5 zawierały w swym składzie dużą ilość reszt Asx (kwasu
asparaginowego/asparaginy) wynoszącą kolejno: 10,1% i 16,1%. Cechą wyróżniającą
subfrakcję 7.5 była również duża ilość seryny (21,3%) i kwasu glutaminowego/glutaminy
(13,3%). Subfrakcja 4.4 zawierała natomiast najwięcej reszt proliny, w ilości 23,3%. Wielu
autorów wskazuje, że aminokwas ten spełnia kluczową role w peptydach posiadających
aktywność inhibitorową wobec enzymu ACE [Smacchi i Gobbetti, 2000; Hartman i Miesel,
2007]. Najmniejszy udział w składzie aminokwasowym badanych subfrakcji miała histydyna.
Stężenie tego aminokwasu mieściło się w zakresie od 0,2 do 1,4% (Tab.6.7).
91
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
Tab.6.7. Wyniki analizy składu aminokwasowego wyizolowanych frakcji peptydów uzyskanych po procesie
ultrafiltracji i chromatografii żelowej oraz białka wzorcowego. Pogrubieniem wyróżniono najwyższe stężenia (w
procentach) aminokwasów w określonej próbie.
NUMER SUBFRAKCJI
AMINOKWAS
[%]
4.4
6.3
7.5
β-lakto
globulina
3.05
5.32
6.63
1.42
0.76
7.67
4.44
7.64
23.33
2.80
3.99
1.73
4.45
16.69
1.69
8.38
1.38
1.78
5.69
2.25
0.61
29.54
10.72
11.56
4.97
8.69
13.60
3.24
1.18
1.97
1.89
0.93
16.08
13.25
21.29
11.45
0.15
0.05
0.30
0.15
7.43
1.13
10.64
2.07
0.06
15.03
0.57
0.36
6.13
17.65
4.44
2.90
1.50
2.64
5.48
10.83
6.43
3.24
7.22
2.73
7.84
17.67
3.20
0.10
4.2
Asx*
10.11
Glx*
3.04
Ser
7.75
Gly
8.39
His
1.38
Arg
10.52
Thr
6.40
Ala
8.23
Pro
6.88
Tyr
4.75
Val
5.48
Met
1.50
Ile
6.05
Leu
11.21
Phe
5.35
Lys
2.96
*Asx=Asp+Asn, Glx=Gln+Glu
6.3.3.3. Chromatografia hydrofobowa w odwróconych fazach (RP-HPLC) wybranych
subfrakcji peptydowych o najwyższych aktywnościach biologicznych i charakterystyka
zawartych w nich peptydów
W celu wyodrębnienia peptydów odpowiedzialnych za wystąpienie biologicznej
aktywności we frakcjach peptydowych, oznaczonych numerami: 4.2, 4.4, 6.3 oraz 7.5
przeprowadzono ich chromatografię na kolumnie Zorbax XDB- C18 w systemie HPLC
(postępowanie opisano pod Rys.6.19, Rys.6.21, Rys.6.23, Rys.6.25). Profil elucyjny każdej
z
prób
ujawnił
obecność
wielu
peptydów
charakteryzujących
się
zróżnicowaną
hydrofobowością. Wszystkie otrzymane sub-subfrakcje przetestowano pod kątem aktywności
antyoksydacyjnej oraz inhibitorowej.
6.3.3.3.1. Rozdział subfrakcji 4.2
Rozdział subfrakcji 4.2 przeprowadzono w gradiencie acetonitrylu 0-60% w 0,1%
TFA. W wyniku chromatografii otrzymano wiele nachodzących na siebie szczytów
peptydowych wśród których udało się wyodrębnić dwie główne sub-subfrakcje (Rys.6.19 A).
Istotnie statystycznie wyższe aktywności przejawiała druga z nich. Jej zdolność wymiatania
wolnych rodników DPPH wynosiła 3,9 µM trolox/mg, a zdolność do redukcji stopnia
92
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
utlenienia jonów żelaza - 252,6 µg Fe2+/mg. Natomiast do połowicznego zahamowania
aktywności enzymu ACE wystarczyło już 0,2 µg tej sub-subfrakcji. W porównaniu do
subfrakcji 4.2 aktywności te były kolejno o 1, niemal 23 i 0,02 jednostki wyższe. Wyjątek
stanowiła aktywność chelatowania jonów żelaza, której poziom był wyższy prawie o 23
jednostki dla sub-subfrakcji pierwszej (Rys.6.19). Warto również zaznaczyć, że w obu
przypadkach aktywność ta znacznie wzrosła, w porównaniu do zdolności chelatowania jaką
wykazała subfrakcja wyjściowa.
1
2
A
4.2.2
Nr
4.2.1
4.2.2
ZDOLNOŚĆ
WYMIATANI
A WOLNYCH
RODNIKÓW
DPPH
[μM
trolox/mg]
ZDOLNOŚĆ
REDUKCJI
STOPNIA
UTLENIENIA
JONOW Fe2+
FRAP
2+
[μg Fe /mg]
AKTYWNOŚĆ
CHELATOWA
-NIA JONÓW
2+
Fe
[μg Fe2+/mg]
AKTYWNOŚĆ
INHIBITOROWA WOBEC
ENZYMU ACE
[IC50]
2.23
b
± 0.05
3.85*
a
± 0.07
237.20*
b
± 2.09
252.61*
a
± 3.59
122.97*
a
± 2.33
100.25
b
± 2.76
0.31
b
± 0.03
0.20
a
± 0.02
B
* wzrost aktywności w porównaniu do frakcji poprzedniej
najwyższe aktywności
Rys.6.19. Rechromatografia subfrakcji 4.2. za pomocą kolumny Zorbax XDB-C18 Agilent o wymiarach 4,5 x 250 mm
(A) oraz 1,8 x 50 mm (B). Próbę nanoszono na zrównoważoną roztworem 0,1% TFA w wodzie kolumnę. Zaadsorbowane
peptydy eluowano 0,1 % TFA w acetonitrylu w temp. 30°C przy przepływie: 3ml/min oraz w gradiencie 0-60%. Oznaczono
aktywność przeciwutleniajacą, wyrażoną jako zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH, zdolność redukcji stopnia
utlenienia jonów żelaza i aktywność chelatowania jonów żelaza (wyliczano dla 1 mg białka), oraz aktywność
antyhipertensyjną (wyliczano dla 1 µg białka). Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ± SD, n = 3).
Wartości średnie oznaczone różnymi literami w tej samej kolumnie różnią się statystycznie istotnie na poziomie p ≤0,05.
Sub-subfrakcję peptydów oznaczoną jako 4.2 rechromatografowano na kolumnie
o wymiarach 4,5 x 50mm (Rys.6.19 B), dzięki czemu udało się wyodrębnić główny szczyt
93
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
peptydowy odpowiedzialny za poszczególne aktywności. Frakcję tę oznaczono numerem
4.2.2 i poddano analizie metodą spektrometrii masowej (MALDI-ToF), w celu identyfikacji
peptydów w niej zawartych (Rys.6.20). Analiza wykazała, że nie jest to frakcja homogenna
i w jej składzie dominowały dwa peptydy złożone z 9 i z 15 reszt aminokwasowych
o następującej sekwencji: VVSGPYIVY i LLGAVASMGALLCAP, będące odpowiednio:
fragmentami białka 1 podobnego do supresora czynnika metastazy raka sutka i białka
czynnika dojrzewania lipazy (Rys.6.20, Tab.6.8).
Rys.6.20. Widmo MS (Maldi Tof) subfrakcji peptydów 4.2.2 uzyskanej po procesie ultrafiltracji, chromatografii
żelowej oraz rechromatografii 4-godzinnego hydrolizatu otrzymanego z udziałem proteinazy z C.ficifolia zastosowanej
w dawce 1000 j/mg.
6.3.3.3.2. Rozdział subfrakcji 4.4
Subtrakcja peptydowa 4.4 okazała się być również bardzo heterogenną. Jej profil
peptydowy ujawnił obecność wielu zróżnicowanych pod względem polarności peptydów.
W wyniku jej chromatografii na kolumnie Zorbax XDB-C18 Agilent o wymiarach 4,5 x 250
mm
uzyskano
cztery
sub-subfrakcje
oznaczone
jako
4.4.1,
4.4.2,
4.4.3,
4.4.4,
charakteryzujące się zróznicowaną aktywnością przeciwutleniającą i inhibitorową, których
poziomy były w niektórych przypadkach wyższe albo niższe w stosunku do subfrakcji
wyjściowej o numerze 4.4 (Rys.6.21 A). W obrębie analizowanych subtrakcji te, oznaczone
numerami 4.4.3 i 4.4.4, wyróżniały się najwyższą aktywnością biologiczną. Zdolność
redukująca subfrakcji 4.4.3 wyniosła: 257,5 µg Fe2+/mg. Natomiast dla subfrakcji 4.4.4
oznaczono najwyższą zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH (3,19 µM trolox/mg),
chelatowania jonów żelaza (387,9 µg Fe2+/mg) i aktywność inhibitorową wobec ACE
(IC50=0,18 µg). Omawiany etap izolacji peptydów przyczynił się do wzrostu jedynie
94
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
aktywności zmiatania wolnych rodników (o 0,84 jednostki w przypadku sub-subfrakcji 4.4.4)
i nieznacznie aktywności antyhipertensyjnej (Rys.6.21).
2
3
1
4
A
4.4.4.1 4.4.4.2
4.4.3.1
B
C
4.4.3.1
D
4.4.4.1
E
4.4.4.2
F
95
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
Nr
4.4.1
4.4.2
4.4.3
4.4.3.1
4.4.3.2
4.4.4
4.4.4.1
4.4.4.2
ZDOLNOŚĆ
WYMIATANIA
WOLNYCH
RODNIKÓW
DPPH
[μM
trolox/mg]
ZDOLNOŚĆ
REDUKCJI
STOPNIA
UTLENIENIA
JONOW Fe2+
FRAP
[μg Fe2+/mg]
AKTYWNOŚĆ
CHELATOWA
-NIA JONÓW
2+
Fe
[μg Fe2+/mg]
AKTYWNOŚĆ
INHIBITOROWA WOBEC
ENZYMU ACE
[IC50]
1.87
e
± 0.10
1.55
f
± 0.03
2.38
c
± 0.05
2.43*
c
± 0.07
2.13
d
± 0.02
3.19*
a
± 0.06
3.24*
a
± 0.05
2.87
b
± 0.06
158.02
g
± 2.06
233.65
f
± 1.93
257.51
c
± 1.84
247.14
d
± 3.51
239.85
e
± 3.69
239.83
e
± 2.80
291.15*
a
± 2.55
281.90*
b
± 2.92
50.32
g
± 2.00
90.77
f
± 1.35
202.78
e
± 1.16
215.58
d
± 2.08
228.40
c
± 1.93
387.93
a
± 4.37
345.04
b
± 6.14
231.43
c
± 3.22
0.27
d
± 0.02
0.36
e
± 0.02
0.22
c
± 0.03
0.22
c
± 0.01
0.27
c
± 0.02
0.18
b
± 0.01
0.15*
a
± 0.01
0.14*
a
± 0.02
* wzrost aktywności w porównaniu do frakcji poprzedniej
Rys.6.21. Rechromatografia frakcji 4.4. za pomocą kolumny Zorbax XDB-C18 Agilent o wymiarach 4,5 x 250 mm (A)
oraz 4,5 x 150 mm (B, C, D, E, F). Próbę nanoszono na zrównoważoną roztworem 0,1% TFA w wodzie kolumnę.
Zaadsorbowane peptydy eluowano 0,1 % TFA w acetonitrylu w temp. 30°C przy przepływie: 3ml/min oraz w gradiencie 0100%. Oznaczono aktywność przeciwutleniajacą, wyrażoną jako zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH, zdolność
redukcji stopnia utlenienia jonów żelaza i aktywność chelatowania jonów żelaza (wyliczano dla 1 mg białka), oraz
aktywność antyhipertensyjną (wyliczano dla 1 µg białka). Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ±
SD, n = 3). Wartości średnie oznaczone różnymi literami w tej samej kolumnie różnią się statystycznie istotnie na poziomie p
≤0,05.
Kolejno sub-subfrakcje 4.4.3 i 4.4.4 poddano dwukrotnej rechromatografii na
kolumnie o wymiarach 4,5 x 150 mm. W wyniku pierwszego procesu, otrzymany profil
peptydowy każdej z nich ujawnił obecność podwójnych szczytów peptydowych (Rys.6.21 B,
C). Dopiero kolejna rechromatografia pozwoliła na uzyskanie homogennych profili (Rys.6.21
D, E, F). Sub-subfrakcja eluowana około 11 minuty rozdziału, oznaczona numerem 4.4.3.1.
charakteryzowała się
lepszymi właściwościami biologicznymi w porównaniu do jej
sąsiedniej sub-subfrakcji 4.4.3.2 (Rys.6.21 B), dlatego przeprowadzono jej dalszą
charakterystykę i poddano ją analizie spektrometrii masowej (Rys.6.22 A).
Wykazano również, iż obie z sasiadujących sub-subfrakcji, eluowanych kolejno w 13 i
po 13 minucie rozdziału (4.4.4.1, 4.4.4.2), posiadały bardzo dobre właściwości
przeciwutleniające i antyhipertensyjne (Rys.6.21 C). Przykładowo, sub-subfrakcja 4.4.4.1
wykazała
o
0,89
jednostki
wyższą
aktywność
zmiatania
rodników
DPPH
w porównaniu do subfrakcji wyjściowej 4.4, uzyskanej na drodze chromatografii żelowej
4-godzinnego hydrolizatu proteinazy z dyni figolistnej. Obie sub-subfrakcje charakteryzowały
96
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
się również znacznie wyższą aktywnością redukującą FRAP (4.4.4.1 – 291,2 µg Fe2+/mg,
4.4.4.2 – 281,9 µg Fe2+/mg). W toku ich oczyszczania wzrosła również aktywność
antyhipertensyjna, kolejno o 21,1% w przypadku sub-subfrakcji 4.4.4.1 oraz o 26,3% dla subsubfrakcji 4.4.4.2.
A
B
C
Rys.6.22. Widma MS (Maldi Tof) subfrakcji peptydów 4.4.3.1 (A), 4.4.4.1 (B) oraz 4.4.4.2 (C) uzyskanych po procesie
ultrafiltracji, chromatografii żelowej oraz rechromatografii 4-godzinnego hydrolizatu otrzymanego z udziałem
proteinazy z C.ficifolia zastosowanej w dawce 1000 j/mg.
97
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
Podobnie jak w poprzednich procesach oczyszczania również i w tym przypadku
zmniejszyła się aktywność chelatowania, która była o niemal 100 (4.4.4.1) i nawet ponad 200
(4.4.4.2) jednostek niższa niż dla subfrakcji 4.4 (Rys.6.21). Wyższą zdolność chelatowania
jonów żelaza wykazaną przez wyjściowe frakcje i nieoczyszczone hydrolizaty można
wyjaśnić między innymi synergistycznym efektem działania obecnych w nich wielu reszt
peptydowych. W miarę procesu ultrafiltracji a potem poszczególnych chromatografii, wiele
peptydów wpływających korzystnie na tą zdolność zostało usuniętych, co przedkładało się na
stopniowe zmniejszenie rozpatrywanej aktywności.
W związku z tym, iż sub-subfrakcje 4.4.4.1 oraz 4.4.4.2 wykazały podobne, wysokie
aktywności zdecydowano na identyfikację peptydów zawartych również w obu z nich metodą
spektrometrii masowej (Rys.6.22 B, C). Sub-subfrakcja 4.4.3.2 okazała się homogenną
i zawierała peptyd będący fragmentem transembranowego kanałowo – podobnego białka 3
o następującej sekwencji: ITMIAPSAF ( Rys.6.22 A, Tab.6.8). Analiza pozostałych subsubfrakcji (4.4.4.1, 4.4.4.2) wykazała, że są one heterogenne i zwierają w swym składzie po
dwa
peptydy:
RASDPLLSV,
RNDDLNYIQ
(Rys.6.22
B)
i
LAPSLPGKPKPD,
AGTTCLFTPLALPYDYSH (Rys.6.22 C). Peptydy: RASDPLLSV i
RNDDLNYIQ
pochodziły od 4-kinazy typu 2 alfa fosfatydyloinozytolo-5-fosforanu i od witellogeniny typu
II. Natomiast prekursorami peptydów: LAPSLPGKPKPD, AGTTCLFTPLALPYDYSH były:
białko uczestniczące w regulacji różnicowania tkanek narządu wzroku i białko trans
membranowe 11 (Tab.6.8).
6.3.3.3.3. Rozdział subfrakcji 6.3
Atrakcyjne parametry aktywności biologicznej subfrakcji 6.3, otrzymanej na drodze
oczyszczania 0,5 godzinnego hydrolizatu otrzymanego z udziałem proteinazy serynowej
z Yarrowia lipolytica, zadecydowały o wytypowaniu jej do dalszego rozdziału metodą
chromatografii cieczowej. Początkowo chromatografię w systemie odwróconej fazy
przeprowadzono podobnie jak w poprzednich przypadkach na kolumnie Zorbax XDB C18
o wymiarach 4,5 x 250 mm (Rys.6.23 A). W wyniku rozdziału uzyskano 4 sub-subfrakcje,
zróżnicowane pod względem hydrofobowości. Najwyższą aktywnością biologiczną
charakteryzowała się sub-subfrakcja wyróżniająca się także największą hydrofobowością,
eluowana między 21 a 23 minutą rozdziału. Jej rechromatografia z wykorzystaniem krótszej
kolumny doprowadziła do wyodrębnienia dominującej sub-subfrakcji peptydów oznaczonej
numerem 6.3.4 (Rys.6.23 B).
98
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
W wyniku przeprowadzonego procesu oczyszczania uzyskano jedynie wzrost poziomu
aktywności inhibitorowej wobec enzymu ACE o prawie 22% w porównaniu do subfrakcji 6.3,
której wartość wyniosła: 0,32 µg (Rys.6.23). Natomiast zdolność do wymiatania wolnych
rodników DPPH sub-subfrakcji 6.3.4 była dwukrotnie niższa (2,33 µmol Trolox/mg). Także
poziom zdolności redukującej i zdolności do chelatowania jonów żelaza nieco się obniżył
i wyniósł kolejno: 100,55 µgFe2+/mg i 220,27 µgFe2+/mg.
1
2
3
4
A
Nr
6.3.1
6.3.2
6.3.3
6.3.4
ZDOLNOŚĆ
WYMIATANIA
WOLNYCH
RODNIKÓW
DPPH
[μM trolox/mg]
ZDOLNOŚĆ
REDUKCJI
STOPNIA
UTLENIENIA
JONOW Fe2+
FRAP
[μg Fe2+/mg]
AKTYWNOŚĆ
CHELATOWA
-NIA JONÓW
Fe2+
[μg Fe2+/mg]
AKTYWNOŚĆ
INHIBITOROWA WOBEC
ENZYMU ACE
[IC50]
0.58
d
± 0.03
1.36
c
± 0.03
2.09
b
± 0.04
2.33
a
± 0.08
128.85*
b
± 2.42
81.02
d
± 1.77
211.58*
a
± 2.87
100.55
c
± 2.08
227.39
a
± 2.32
100.25
c
± 1.89
52.41
d
± 2.56
220.27
b
± 1.92
0.52
d
± 0.03
0.44
c
± 0.02
0.36*
b
± 0.01
0.32*
a
± 0.02
6.3.4
B
* wzrost aktywności w porównaniu do frakcji poprzedniej
Rys.6.23. Rechromatografia frakcji 6.3 za pomocą kolumny Zorbax XDB-C18 Agilent o wymiarach 4,5 x 250 mm (A)
oraz 4,5 x 150 mm (A). Próbę nanoszono na zrównoważoną roztworem 0,1% TFA w wodzie kolumnę. Zaadsorbowane
peptydy eluowano 0,1 % TFA w acetonitrylu w temp. 30°C przy przepływie: 3 ml/min oraz w gradiencie 0-100%.
Oznaczono aktywność przeciwutleniajacą, wyrażoną jako zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH, zdolność redukcji
stopnia utlenienia jonów żelaza i aktywność chelatowania jonów żelaza (wyliczano dla 1 mg białka), oraz aktywność
antyhipertensyjną (wyliczano dla 1 µg białka). Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ± SD, n = 3).
Wartości średnie oznaczone różnymi literami w tej samej kolumnie różnią się statystycznie istotnie na poziomie p ≤0,05.
99
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
W celu identyfikacji sub-subfrakcji 6.3.4 przepowadzono jej sekwencjonowanie o na
automatycznym sekwenatorze białek, metodą Edmana (Rys.6.24). Nie udało się bowiem
określić mas cząsteczkowych techniką spektrometrii masowej. Przeprowadzone analizy
wykazały, iż sub-subfrakcja zawiera jeden dipeptyd odpowiadający prawdopodobnie
fragmentowi foswityny. Chromatogramy pierwszej i drugiej reszty aminokwasowej tego
peptydu ujawniły obecność głównych szczytów odpowiadających takim aminokwasom jak:
arginina (R) i walina (V). Poza dipeptydem RV w składzie tej frakcji zidentyfikowano
obecność w znacznej ilości alaniny, glicyny i tyrozyny (Rys.6.24).
Rys.6.24. Sekwencjonowanie od N-końca subfrakcji peptydów 6.3.4 uzyskanych po procesie ultrafiltracji,
chromatografii żelowej oraz rechromatografii 0,5-godzinnego hydrolizatu proteinazy serynowej z Y. lipolytica
zastosowanej w dawce 40 j/mg.
6.3.3.3.4. Rozdział frakcji 7.5
Izolacja biologiczne aktywnych peptydów z subfrakcji nr 7.5 przebiegała bardzo
podobnie do poprzednich (Rys.6.25). W wyniku jej chromatografii (RP-HPLC) także
uzyskano wiele szczytów peptydowych rozdzielonych na dwie sub-subfrakcje (Rys.6.25 A).
100
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
Ze względu na dużo wyższe aktywności drugiej z nich, następnie przeprowadzono jej
rechromatografię (Rys.6.25 B). Finalny profil peptydowy ujawnił obecność głównego szczytu
peptydowego. Późniejsza jego analiza MS (Maldi Tof) wykazał, że w jego składzie znajdował
się dekapeptyd o następującej sekwencji: QSLVSVPGMS odpowiadający fragmentowi białka
2, podobnego do translokatora jądrowego receptora węglowodoru arylowego (Rys.6.26,
Tab.6.8).
1
2
A
7.5.2
Nr
7.5.1
7.5.2
ZDOLNOŚĆ
WYMIATANIA
WOLNYCH
RODNIKÓW
DPPH
[μM trolox/mg]
ZDOLNOŚĆ
REDUKCJI
STOPNIA
UTLENIENIA
JONOW Fe2+
FRAP
2+
[μg Fe /mg]
AKTYWNOŚĆ
CHELATOWA
-NIA JONÓW
Fe2+
[μg Fe2+/mg]
AKTYWNOŚĆ
INHIBITOROWA WOBEC
ENZYMU ACE
[IC50]
3.29
b
± 0.08
5.08*
a
± 0.26
142.73
b
± 1.85
188.02*
a
± 3.03
255.83
a
± 2.75
251.00
a
± 3.63
0.29
b
± 0.02
0.24*
a
± 0.02
B
* wzrost aktywności w porównaniu do frakcji poprzedniej
Rys.6.25. Rechromatografia frakcji 7.5 za pomocą kolumny Zorbax XDB-C18 Agilent o wymiarach 4,5 x 250 mm (A)
oraz 4,5 x 150 mm (B). Próbę nanoszono na zrównoważoną roztworem 0,1% TFA w wodzie kolumnę. Zaadsorbowane
peptydy eluowano 0,1 % TFA w acetonitrylu w temp. 30°C przy przepływie: 3 ml/min oraz w gradiencie 0-100%.
Oznaczono aktywność przeciwutleniajacą, wyrażoną jako zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH, zdolność redukcji
stopnia utlenienia jonów żelaza i aktywność chelatowania jonów żelaza (wyliczano dla 1 mg białka), oraz aktywność
antyhipertensyjną (wyliczano dla 1 µg białka). Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ± SD, n = 3).
Wartości średnie oznaczone różnymi literami w tej samej kolumnie różnią się statystycznie istotnie na poziomie p ≤0,05.
Poziom aktywność biologicznej tego peptydu, odpowiadający aktywności subsubfrakcji 7.5.2, był znacząco wyższy w porównaniu do subfrakcji wyjściowej o numerze 7.5.
101
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
Peptyd ten wykazał w szczególności bardzo wysoką zdolność do wymiatania wolnych
rodników DPPH, której wartość wyniosła 5,08 µmol trolox/mg (Rys.6.25). Jego aktywność
redukcji stopnia utlenienia żelaza wzrosła średnio o 13 %. Natomiast aktywność inhibitorowa
(IC50), analizowana w teście in vitro, wynosiła w przypadku tego peptydu 0,24 µg i również
była wyższa o niemal 8%.
Rys.6.26. Widmo MS (Maldi Tof) subfrakcji peptydów 7.5.2 uzyskanej po procesie ultrafiltracji, chromatografii
żelowej oraz rechromatografii 4-godzinnego hydrolizatu proteinazy serynowej z Y. lipolytica zastosowanej w dawce 40
j/mg.
Przeprowadzone procedury oczyszczania i izolacji biopeptydów okazały się
skuteczne, czego potwierdzeniem jest uzyskanie czystych związków, scharakteryzowanych
pod względem sekwencji aminokwasowej. Spośród wszystkich frakcji peptydowych, które
otrzymano w prezentowaniej pracy, frakcje wyizolowane z hydrolizatu otrzymanego z
zastosowaniem enzymu z dyni figolistnej wyróżniały się najsilniejszą aktywnością
inhibitorową wobec konwertazy angiotensyny I (ACE), odpowiedzialnej za wzrost ciśnienia
krwi (Rys.6.21). Natomiast peptyd zawarty w sub-subfrakcji 7.5.2, pochodzący z 4
godzinnego
hydrolizatu
otrzymanego
z
udziałem
proteinazy
serynowej
z Yarrowia lipolytica posiadał najwyższą aktywność przeciwutleniającą, ocenioną w aspekcie
zdolności wymiatania wolnych rodników DPPH (Rys.6.25). Warto również zaznaczyć,
że dzięki procesowi oczyszczania uzyskano wzrost wszystkich rozpatrywanych aktywności,
z wyjątkiem zdolności chelatowania jonów żelaza, która we wszystkich przypadkach była
najwyższa w hydrolizatach wyjściowych.
W tabeli 6.8 zestawiono wszystkie peptydy, które udało się wyizolować
z hydrolizatów białek poekstrakcyjnych żółtka jaja, otrzymanych z udziałem dwóch
niekonwencjonalnych enzymów oraz przedstawiono ich identyfikację.
102
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
Tab.6.8. Zestawienie zidentyfikowanych bioaktywnych peptydów wyizolowanych za pomocą technik ultrafiltracji,
chromatografii żelowej oraz rechromatografii hydrolizatów białek poekstrakcyjnych żółtka jaja otrzymanych
z udziałem proteinaz serynowych z C.ficifolia oraz z Y. lipolytica.
HYDROLIZAT
WYJŚCIOWY
UZYSKANY
Z UDZIAŁEM
Nr
SUBSUBFRAKCJI
4.2.2
ILOŚĆ
WYIZOLOWANYCH
PEPTYDÓW
SEKWENCJA
AMINOKWASOWA
VVSGPYIVY
fragment białka 1 podobnego do
supresora czynnika metastazy raka
sutka
LLGAVASMGALLCAP
fragment czynnika dojrzewania lipazy
RASDPLLSV
fragment 4-kinazy typu 2 alfa
fosfatydyloinozytolo-5-fosforanu
RNDDLNYIQ
fragment vitellogeniny typu II
LAPSLPGKPKPD
fragment białka uczestniczącego w
regulacji różnicowania tkanek narządu
wzroku (visual system homeobox 2)
2
proteinazy
z Cucurbita
ficifolia
1000 j/mg
4.4.3.1
2
4.4.4.1
IDENTYFIKACJA PEPTYDÓW
2
AGTTCLFTPLALPYDYSH
fragment białka transmembranowego
11
4.4.4.2
1
ITMIAPSAF
fragment transmembranowego
kanałowo-podobnego białka 3
6.3.2
1
RV
fragment białka foswityny
7.5.2
1
QSLVSVPGMS
fragment białka 2 podobnego do
translokatora jądrowego receptora
węglowodoru arylowego.
proteinazy
serynowej
z Yarrowia
lipolytica
40 j/mg
6.3.4. Otrzymywanie syntetycznych peptydów i ocena ich aktywności biologicznej
W celu jednoznacznego potwierdzenia, który ze związków wyizolowanych z
4 godzinnego hydrolizatu otrzymanego z udziałem dyni figolistnej w postaci mieszaniny
dwóch peptydów, odpowiada za specyficzną aktywność biologiczną danej sub-subfrakcji,
przeprowadzono ich syntezę chemiczną. Na drodze syntezy otrzymano czyste związki
o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej peptydom otrzymanym z sub-subfrakcji 4.4.3.1
(RASDPLLSV
i
RNDDLNYIQ)
oraz
4.4.4.1
(LAPSLPGKPKPD,
AGTTCLFTPLALPYDYSH). Ze względu na koszty procesu oraz zbyt duże komplikacje nie
przeprowadzono syntezy peptydów obecnych w sub-subfrakcji 4.2.2.
103
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
W celu potwierdzenia czystości uzyskanych związków przeprowadzono ich analizę
chromatograficzną metodą RP-HPLC (Rys.6.27).
Rys.6.27. Analiza RP-HPLC peptydów uzyskanych na drodze syntezy chemicznej. Profile peptydowe wykonane zostały
na chromatografach cieczowych Thermo Separation Product oraz Varian ProStar. Rozdział prowadzono na kolumnach
kolejno: YMC-Pack ODS-AQ12S05-2546WT + Guard Column, (detektor UV λ=210 nm, objętość nastrzyku: 100 µl,
przepływ: 1 ml/min) oraz kolumnie TSKgel ODS-120T 12TG08eh004 + Guard Column (detektor UV λ=210 nm oraz 280
nm, objętość nastrzyku: 2 ml, przepływ: 7 ml/min) w układzie faz: A (0,1% TFA/H20 i B (80% CH3CN/H2O + 0,1% TFA),
w gradiencie od 0-80% w czasie 40 minut.
104
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
We wszystkich chromatogramach stwierdzono zdecydowanie dominujący udział
pojedynczych sygnałów przy czasach retencji 19,463; 15,998; 14,712 i 25,929. Pochodziły
one kolejno od peptydów: RASDPLLSV, RNDDLNYIQ, LAPSLPGKPKPD oraz
AGTTCLFTPLALPYDYSH.
Czystość
uzyskanych
związków
była
bardzo
wysoka
i kształtowała się na poziomie od 92% do >99% (Rys.6.27).
Produkty syntezy zanalizowano
również
za pomocą techniki
HR-MS
na
wysokorozdzielczym spektrometrze mas FT-ICR (Rys.6.28).
105
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
Rys.6.28. Analiza HR-ESI-MS peptydów: A – RASDPLLSV, B – RNDDLNYIQ, C – LAPSLPGKPKPD oraz D AGTTCLFTPLALPYDYSH uzyskanych na drodze syntezy chemicznej. Pomiary przeprowadzone zostały na
spektrometrze mas FT-ICR Apex-Qe Ultra 7 T instrument (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) ze źródłem jonów ESI w
trybie jonów dodatnich. Aparat został skalibrowany przy użyciu TuneMix (Bruker Daltonics, Bremen, Germany). Zakres
wartości m/z od 100 do 1800. Roztworem użytym do pomiarów był CH3CN/H2O/HCOOH (50:50:0,1; v/v/v).
Na każdym z widm masowych HR-ESI-MS można było zaobserwować serię pików,
o różnej ilości przyłączonych lub oderwanych protonów. Uzyskane wyniki potwierdziły
również obecność produktów syntezy o wartościach m/z zgodnych z obliczonymi (Tab.6.9).
Tab.6.9. Porównanie wartości m/z z widm masowych peptydów otrzymanych metodą syntezy chemicznej do wartości
obliczonych.
m/z
obliczone
m/z
479.271
479.272 [M+H]
957.531
957.537 [M+2H]
575.777
575.779 [M+H]
1150.543
1150.549 [M+2H]
1219.701
1219.704 [M+H]
610.354
610.356 [M+2H]
407.240
407.240 [M+3H]
985.485
985.472 [M+H]
657.324
657.317 [M+2H]
PEPTYD
RASDPLLSV
RNDDLNYIQ
LAPSLPGKPKPD
AGTTCLFTPLALPYDYSH
+
2+
+
2+
+
2+
3+
+
2+
Zsyntetyzowane chemicznie peptydy oceniono również pod względem wybranych
aktywności
biologicznych.
Sprawdzono
ich
właściwości
przeciwutleniające
i antyhipertensyjne, przy czym porównano także uzyskane wyniki z aktywnościami sub106
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
subfrakcji otrzymanych na drodze oczyszczania 4 godzinnego hydrolizatu dyni figolistnej
(Tab.6.10).
Tab.6.10. Aktywność ptrzeciwutleniająca i antyhipertensyjna peptydów otrzymanych na drodze syntezy chemicznej w
porównaniu do aktywności sub-subfrakcji oczyszczonych z 4-godzinnego hydrolizatu preparatu białek
poekstrakcyjnych z żółtka jaja otrzymanych z udziałem proteinazy z C. ficifolia. Aktywność przeciwutleniająca
wyrażona została jako zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH, zdolność redukcji stopnia utlenienia jonów żelaza
oraz aktywność chelatowania jonów żelaza. Aktywność przeciwutleniającą wyliczano dla 1 mg białka. Aktywność
antyhipertensyjną wyliczano jako taką ilość hydrolizatu (w µg), która potrzebna jest do połowicznego zahamowania
aktywności enzymu ACE. Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ± SD, n = 3). Wartości średnie
oznaczone różnymi literami w tej samej kolumnie różnią się statystycznie istotnie na poziomie p ≤0,05.
PEPTYDY
ZSYNTETYZOWANE
CHEMICZNIE
sub-subfrakcja 4.4.3.1
RASDPLLSV
RNDDLNYIQ
sub-subfrakcja 4.4.4.1
LAPSLPGKPKPD
AGTTCLFTPLALPYDYSH
ZDOLNOŚĆ
WYMIATANIA
WOLNYCH
RODNIKÓW
DPPH
[μM
trolox/mg]
ZDOLNOŚĆ
REDUKCJI
STOPNIA
UTLENIENIA
2+
JONOW Fe
FRAP
[μg Fe2+/mg]
AKTYWNOŚĆ
CHELATOWA
-NIA JONÓW
2+
Fe
2+
[μg Fe /mg]
AKTYWNOŚĆ
INHIBITOROWA WOBEC
ENZYMU ACE
[IC50]
2.43
e
± 0.07
4.71*
b
± 0.09
2.28
f
± 0.07
3.24
c
± 0.05
6.03*
a
± 0.11
2.59
d
± 0.09
247.14
b
± 3.51
140.84
c
± 0.56
99.22
d
± 2.06
291.15
a
± 2.55
296.07
a
± 3.69
28.37
e
± 0.73
215.58
b
± 2.08
196.96
c
± 3.24
26.36
f
± 0.17
345.04
a
± 6.14
179.33
d
± 3.40
27.60
e
± 0.50
0.22
cd
± 0.01
0.19*
c
± 0.02
0.19*
c
± 0.01
0.15
b
± 0.01
0.11*
a
± 0.01
0.72
e
± 0.04
* wzrost aktywności w porównaniu do określonej sub-subfrakcji
Spośród
wszystkich
zsyntetyzowanych
związków,
peptyd
o
sekwencji
LAPSLPGKPKPD charakteryzował się najwyższą aktywnością wymiatania rodników DPPH
(6,03 µM trolox/mg), zdolnością redukującą (296,07 µg Fe2+/mg) oraz aktywnością
inhibitorową (IC50 = 0,11 µg). Drugi peptyd występujący w tej samej sub-subfrakcji 4.4.4.1
posiadał znacznie słabsze właściwości, co wskazuje na to, iż zarówno wysoka aktywność
przeciwutleniająca jak i antyhipertensyjna mieszaniny tych dwóch związków w subsubfrakcji o numerze 4.4.4.1 determinowana jest obecnością peptydu LAPSLPGKPKPD.
Analiza właściwości peptydów pochodzących z drugiej sub-subfrakcji (4.4.3.1)
wykazała, że i w tym przypadku dużo wyższe aktywności przeciwutleniające wykazywał
jeden ze związków. Peptyd o sekwencji RASDPLLSV posiadał 2 razy wyższą aktywność
przeciwrodnikową, niemal 1,5 razy wyższą aktywność FRAP oraz 7,5 razy wyższą zdolność
chelatowania w porównaniu do peptydu RNDDLNYIQ. Odmienna sekwencja aminokwasowa
tych dwóch nonapeptydów nie miała natomiast
istotnego wpływu na właściwości
107
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
inhibitorowe wobec enzymu ACE, gdyż do połowicznego zahamowania jego aktywności
wystarczyło 0,19 µg zarówno jednego jak i drugiego związku.
Peptydy o sekwencjach RASDPLLSV oraz LAPSLPGKPKPD wykazały wyższe
aktywności wymiatania wolnych rodników w stosunku do wyjściowych sub-subfrakcji
w których skład wchodziły (kolejno 4.4.3.1 i 4.4.4.1). Zgodnie z otrzymanymi wynikami
można także stwierdzić, iż wyznaczony poziom aktywności redukującej oraz chelatującej obu
sub-subfrakcji zależny był od występowania w nich dwóch określonych peptydów
w odpowiednim stosunku molowym, bowiem rozpatrywane aktywności poszczególnie
zsyntetyzowanych związków kształtowały się na niższym lub nieistotnym statystycznie
poziomie (Tab.6.10).
108
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
6.4. Hydroliza białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja w warunkach przemysłowych przy
udziale proteinazy z Bacillus amyloliquefaciens.
Zaprezentowane
w
poprzednich
punktach
(6.1-6.3)
wyniki
doświadczeń
przeprowadzone w skali laboratoryjnej zarówno na białkach poekstrakcyjnych jak
i preparacie foswitynowym oraz immunoglobulinie Y pochodzących z żółtka jaja wykazały,
iż hydroliza enzymatyczna prowadzi do znacznej poprawy aktywności biologicznej
uzyskanych produktów. Umożliwia to ich dalsze i niejednokrotnie szersze wykorzystanie, na
przykład, jako bioaktywne składniki białkowe w żywności różnorodnego typu, na czele
z żywnością funkcjonalną czy nutraceutykami.
Specyficzna modyfikacja białek żółtka, kształtowanie ich lepszych właściwości na
drodze proteolitycznej degradacji oraz zwiększenie przyswajalności było również głównym
założeniem procesu przeprowadzonego w większej skali, czyli w warunkach przemysłowych.
Hydrolizę wykonano na pilotażowej linii technologicznej w Parku Technologicznym we
Wrocławiu. Do enzymatycznej degradacji wykorzystano jeden z najtańszych komercyjnych
enzymów proteolitycznych – neutrazę, pochodzącą z Bacillus amyloliquefaciens. Względy
ekonomiczne nie były jednak jedynym kryterium wyboru tej proteinazy, gdyż udowodniono
już w pierwszym etapie badań podczas hydrolizy preparatu foswitynowego i IgY, że neutraza
generuje produkty o wysokich aktywnościach przeciwutleniających (Tab.6.3).
Postęp i kinetykę reakcji enzymatycznej analizowano wyznaczając stopień hydrolizy
(% DH), jak również przyrost wolnych grup aminowych. Określono również profile
białkowo-peptydowe (RP-HPLC) produktów uzyskanych zarówno po 0,5 jak i po
2 godzinach reakcji. Poza tym, końcowy produkt hydrolizy poddano chromatografii żelowej
w celu wyznaczenia mas cząsteczkowych obecnych w nim peptydów, jak również określono
jego skład aminokwasowy.
6.4.1. Hydroliza enzymatyczna
Stopień hydrolizy (% DH) jest ważnym parametrem w ocenie enzymatycznej
modyfikacji białek i może być czynnikiem umożliwiającym kontrolę składu i odpowiednich
właściwości uzyskiwanych hydrolizatów [Ge and Zhang, 1993]. Jak pokazano na Rys.6.29,
stopień hydrolizy produktu ubocznego, uzyskanego po ekstrakcji fosfolipidów z żółtka jaja,
już po 0,5 godzinnej reakcji był niemal 22%-owy, a po 2 godzinach osiągnął wartość 27,6%.
Przyrost wolnych grup aminowych w analizowanym czasie, był nie tylko kolejnym dowodem
109
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
na postęp hydrolizy ale również potwierdzał tą dynamikę degradacji (Rys.6.29). Ilość
wolnych grup aminowych w finalnym produkcie hydrolizy kształtowała się na poziomie
6524,6 µM/g, podczas gdy po 0,5 godzinie wynosiła 5215,8 µM/g.
Rys.6.29. Stopień hydrolizy (DH %) oraz przyrost stężenia wolnych grup aminowych (WGA) w 0,5 i 2-godzinnych
hydrolizatach preparatu białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja otrzymanych z udziałem proteinazy z B.
amyloliquefaciens (N). Reakcję hydrolizy prowadzono w wodzie, w stosunku 1:3 (substrat : woda), w pH 7,0 i temperaturze
45 °C przez 0,5 i 2 h. Po tym czasie proces hydrolizy hamowano poprzez inkubację prób przez 15 min w temperaturze: 100
°C. Następnie hydrolizaty wychładzano i wirowano (5500 obr./min, t =15 min, T= pokojowa). Supernatanty liofilizowano i
przechowywano w temp. 4 °C. Kontrolę stanowił preparat białek poekstrakcyjnych bez dodatku enzymu, dla którego stężenie
wolnych grup aminowych wyniosło 1887.58 µM/g. Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie (średnia ± SD, n =
3). Wartości średnie oznaczone różnymi literami na tym samym wykresie różnią się statystycznie istotnie na poziomie p
≤0,05.
Profile peptydowe RP-HPLC hydrolizatów wykazały różnice w hydrofobowości
peptydów generowanych po czasie 0,5 oraz 2 godzin (Rys.6.30). Na chromatogramie
obrazującym 2 godzinny hydrolizat zaobserwowano również znacznie więcej szczytów
peptydowych
potwierdzających
obecność
większej
ilości
produktów
degradacji
enzymatycznej. Wszystkie peptydy eluowano acetonitrylem w zakresie stężenia od 30% do
50%.
Finalne produkty degradacji różniły się również ciężarem cząsteczkowym, co
potwierdzono za pomocą sączenia molekularnego w systemie HPLC, na kolumnie Zorbax
GF-250 (Rys.6.31). W wyniku enzymatycznej hydrolizy otrzymano peptydy, które
wykazywały masę molekularną od nieco poniżej 4,9 kDa do 41,2 kDa.
110
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
Rys.6.30. Profile białkowo-peptydowe RP-HPLC enzymatycznych hydrolizatów białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja
uzyskanych przy udziale neutrazy - proteinazy z B. amyloliquefaciens. Rozdział prowadzono na kolumnie Zorbax XDB
C18 (1,8 x50 mm) w układzie faz: A (0,1% TFA/H20 i B (0,1% TFA/ACN), w gradiencie od 0-100% w czasie od 2 do 12
minuty rozdziału; w temp. 30°C i przy przepływie 1ml/min. Nanoszono po 100µl hydrolizatu. Absorbancję monitorowano
przy długości fali: λ=230 nm. Warunki hydrolizy podano w legendzie do Rys.6.9.
Rys.6.31. Chromatografia żelowa frakcji 2-godzinnego hydrolizatu preparatu białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja
otrzymanego z udziałem proteinazy z B. amyloliquefaciens. Rozdział prowadzono na kolumnie Zorbax GF-250 Agilent
(4,6 × 250mm) w systemie HPLC. Naniesiono 100µl hydrolizatu. Frakcję eluowano za pomocą buforu 0,02M Tris-HCl (pH
7,2) + 0,2M NaCl, w czasie od 0 do 12 minuty rozdziału; w temp. 30°C i przy przepływie 0,5 ml/min. Absorbancję
monitorowano przy długości fali: λ=230 nm. Standardy: albumina wołowa (66 kDa), owoalbumina jaja (45 kDa),
trypsynogen (24 kDa), β-laktoglobulina (18,4 kDa), lizozym białka jaja (14,3 kDa), aprotonina (6,5 kDa), insulina wołowa łańcuch B (3,5 kDa).
Analizę składu aminokwasowego finalnego produktu przedstawiono w Tab.6.11.
Wyniki wykazały, iż 2 godzinny hydrolizat charakteryzował się największą zawartością
111
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
kwasu asparaginowego i asparaginy (10,2%) oraz kwasu glutaminowego i glutaminy (11,6%).
Ponadto, zawierał stosunkowo wysoką ilość procentową reszt seryny oraz leucyny, które
wynosiły kolejno 9,2 i 8,6%. Natomiast próba ta zawierała, podobnie jak w analizowanych
poprzednio subfrakcjach 4.2, 4.4, 6.3 oraz 7.5, niewiele reszt histydyny (2,2%).
Tab.6.11. Wyniki analizy składu aminokwasowego enzymatycznego hydrolizatu białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja
uzyskanego przy udziale neutrazy - proteinazy z B. amyloliquefaciens oraz z białka wzorcowego. Pogrubieniem
wyróżniono najwyższe stężenia (w procentach) aminokwasów.
AMINOKWAS
[%]
HYDROLIZAT
2h
β-lakto
globulina
Asx*
10.18
Glx*
11.63
Ser
9.21
Gly
5.56
His
2.19
Arg
5.36
Thr
5.92
Ala
8.18
Pro
4.86
Tyr
3.02
Val
6.93
Met
2.29
Ile
5.29
Leu
8.61
Phe
3.91
Lys
6.86
*Asx=Asp+Asn, Glx=Gln+Glu
6.13
17.65
4.44
2.90
1.50
2.64
5.48
10.83
6.43
3.24
7.22
2.73
7.84
17.67
3.20
0.10
6.4.2. Aktywności biologiczne uzyskanego hydrolizatu
W uzyskanym po 2 godzinach hydrolizy produkcie, aktywność antyoksydacyjną
oszacowano na podstawie analizy zdolności wymiatania wolnych rodników DPPH, która
kształtowała się na poziomie 0,33 µM trolox/mg, aktywności redukcji stopnia utlenienia
jonów żelaza, która osiągnęła poziom 176,7 µg Fe2 +/ mg, oraz zdolności chelatowania jonów
żelaza (II), która wyniosła 289,0 µg Fe2+/mg (Tab.6.12). Jednocześnie, przeprowadzone
badania wykazały wyższy poziom aktywności biologicznych hydrolizatu w porównaniu do
natywnego białka, z wyjątkiem zdolności chelatowania. W wyniku degradacji enzymatycznej
zostały bowiem uwolnione aminokwasy czynnie oddziałujące z utleniaczami (Tab.6.11), co
pozwoliło na niemal 28% - owy wzrost aktywności zmiatania rodników DPPH oraz ponad
40% - owe zwiększenie aktywności aktywności redukującej stopień utlenienia jonów żelaza.
112
WYNIKI
___________________________________________________________________________________
Obok aktywności przeciwutleniającej, hydrolizat białek poekstrakcyjnych żółtka jaja
wykazał również aktywność antyhipertensyjną, kształtującą się na poziomie IC50=57,3 µg.
Tab.6.12. Aktywność ptrzeciwutleniająca, antyhipertensyjna i przeciwdrobnoustrojowa 2-godzinnego hydrolizatu
preparatu białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja otrzymanego z udziałem proteinazy z B. amyloliquefaciens. Warunki
hydrolizy podano w legendzie do Rys.6.9. Aktywność przeciwutleniająca wyrażona została jako zdolność wymiatania
wolnych rodników DPPH, zdolność redukcji stopnia utlenienia jonów żelaza oraz aktywnośc chelatowania jonów żelaza.
Aktywność przeciwutleniającą wyliczano dla 1 mg białka. Aktywność antyhipertensyjną wyliczano jako taką ilość
hydrolizatu (w µg) , która potrzebna jest do połowicznego zahamowania aktywności enzymu ACE. Aktywność
przeciwdrobnoustrojową oznaczano dla stężenia hydrolizatu równego 1mg/ml. Wszystkie dane przedstawiono jako wartości
średnie (średnia ± SD, n = 3).
CZAS
HYDROLIZY
[h]
2
ZDOLNOŚĆ
WYMIATANIA
WOLNYCH
RODNIKÓW
DPPH
[μM trolox/mg]
ZDOLNOŚĆ
REDUKCJI STOPNIA
UTLENIENIA
2+
JONOW Fe FRAP
2+
[μg Fe /mg]
AKTYWNOŚĆ
CHELATOWANIA
2+
JONÓW Fe
2+
[μg Fe /mg]
AKTYWNOŚĆ
INHIBITOROWA
WOBEC ENZYMU
ACE [IC50]
AKYUWNOŚĆ
PRZECIWDROBNOUSTROJOWA
0.33*
± 0.03
176.68*
± 2.02
289.00
± 2.39
57.30*
± 2.15
Brak aktywności
* wzrost aktywności w porównaniu do substratu – białek poekstrakcyjnych bez dodatku enzymu
W ramach prowadzonych badań udowodniono więc, iż hydroliza enzymatyczna białek
żółtka jaja pozyskanych po procesie ekstrakcji fosfolipidów może być bardzo dobrą
i konkurencyjną metodą ich zagospodarowania.
113
DYSKUSJA
VII. DYSKUSJA
Produkty przeznaczone do spożycia powinny charakteryzować się wysoką jakością,
odpowiednią wartością odżywczą i całkowitym bezpieczeństwem pod względem zdrowotnym
[Flaczyk, 2005]. Wzrost świadomości konsumenckiej, szczególnie w krajach wysoko
uprzemysłowionych, powoduje zwrócenie uwagi także na zdrowotność spożywanej żywności.
W świetle tego zjawiska konieczne jest promowanie produktów, które nie tylko pełniłyby
funkcję podstawową - odżywczą ale także i terapeutyczną [Świderski, 2003].
W tym kontekście, w niniejszej pracy została podjęta próba otrzymania bioaktywnych
peptydów z możliwością ich zastosowania jako nutraceutyków lub preparatów utrwalających
produkty spożywcze. Priorytetem badawczym w prezentowanym doświadczeniu było
otrzymanie enzymatycznych hydrolizatów z białek żółtka jaja wykazujących aktywność
przeciwutleniającą oraz przeciwdrobnoustrojową. Zakładano, że otrzymane peptydy mogą
być zastosowane m.in. jako biokonserwanty żywności. Równolegle podjęto pracę nad
otrzymywaniem peptydów wykazujących zdolność immunomodulacyjną i obniżania ciśnienia
tętniczego krwi, jako substancji o cechach żywności funkcjonalnej, bądź potencjalnych
substancji farmakologicznych.
7.1.
Charakterystyka
substratów
białkowych
wyizolowanych
z
żółtka
jaja
wykorzystywanych do badań.
Jajo jest naturalnym produktem żywnościowym, które poza wysoką wartością
odżywczą posiada także właściwości terapeutyczne. Związki wyizolowane z treści jaja
wykazują między innymi aktywność: przeciwnowotworową, przeciwdrobnoustrojową,
przeciwwirusową i immunomodulacyjną, dzięki tym właściwościom surowiec jajczarski
może znaleźć także zastosowanie jako źródło substancji przydatnych w przemyśle
farmaceutycznym i kosmetycznym [Trziszka, 2000; Ahn i Ko, 2004].
Spośród aktywnych substancji należy wyróżnić lizozym i cystatynę, które dzięki, m.
in. aktywności antybakteryjnej oraz zdolności inaktywacji proteinaz cysteinowych (cystatyna)
mają największą szansę wykorzystania w klinicystyce [Trziszka, 2000]. Bardzo duże
znaczenie w przemyśle żywnościowym i farmaceutycznym ma frakcja γ-liwetyny żółtka,
która posiada aktywność immunologiczną [Gołąb i Warwas, 2005]. Wyodrębniona z tej
frakcji immunoglobulina Y jest wykorzystywana jako dodatek do żywności zapobiegający
biegunkom i gorączce podróżniczej wywoływanym przez rotawirusy, albo stosowana
114
DYSKUSJA
profilaktycznie w żywności dla dzieci w celu podniesienia ich odporności [Tini i wsp., 2001].
W granulach żółtka zawarta jest natomiast inna interesująca proteina – foswityna - o cennych
właściwościach antyoksydacyjnych [Samaraweera i wsp., 2011].
W ramach charakterystyki tych dwóch białek żółtka jaja (foswityna , IgY), które
zdecydowano się wykorzystać do badań wstępnych, a także białek uzyskanych jako produkt
uboczny po ekstrakcji fosfolipidów, stanowiących główny przedmiot badań, oceniono ich
aktywność przeciwutleniającą oraz antyhipertensyjną.
Ze względu na złożoność procesów oksydacyjnych zachodzących w żywności, jak
również
rozmaitość
antyoksydacyjnych
mechanizmów,
określenie
potencjału
przeciwutleniającego danego związku wymaga zastosowania różnych metod. Niemniej
jednak, procedury takie jak określenie redukcji stopnia utlenienia jonów żelaza czy
wymiatania wolnych rodników DPPH, jak również sprawdzenie zdolności chelatowania
jonów metali, zostały szeroko opisane w literaturze do pomiaru rozpatrywanej aktywności
[Cao i Prior, 1998; Re i wsp., 1999]. Dlatego też zdolności antyoksydacyjne substratów
wykorzystywanych do badań oraz uzyskanych w późniejszym etapie hydrolizatów, oceniono
za pomocą tych trzech metod.
Przeprowadzone testy wykazały niewielki potencjał przeciwutleniający badanych
preparatów w aspekcie zarówno
wymiatania wolnych rodników jak i redukcji stopnia
utlenienia jonów żelaza. W odniesieniu do IgY należy stwierdzić, iż istotnie, nie ma doniesień
literaturowych, które potwierdzałyby jej przeciwutleniające zdolności, a podkreśla się
głównie jej aktywność przeciwdrobnoustrojową i immunomodulującą [Xu i wsp., 2011].
Natomiast, różnorodne wyniki badań ujawniające właściwości antyoksydacyjne foswityny są
na tyle obiecujące, że już teraz rozpatrywana jest ona, jako alternatywa dla antyoksydantów
chemicznych, które mogą wykazywać właściwości toksyczne. Przykładowo, jest ona
wykorzystywana np. jako naturalny antyutleniacz do hamowania procesów oksydacji
w margarynach [Lu i Baker, 1986; Ishikawa i wsp., 2004;] . Mechanizm działania tego białka
polega jednak nie na wychwytywaniu wolnych rodników, tylko na wiązaniu różnorodnych
metali, np. żelaza i miedzi, katalizujących procesy utleniania [Maheswari i wsp., 1997].
Otrzymane wyniki potwierdzają tę tezę, gdyż zdolność wiązania jonów żelaza przez
preparat foswitynowy kształtowała się na najwyższym poziomie, równym niemal 700 µg
Fe2+/mg. Inne badania również wykazały, że zarówno oksydacja kwasu linolowego jak
i degradacja DNA, które to reakcje katalizowane są przez jony Fe2+, są silnie hamowane przez
foswitynę [Maheswari i wsp., 1997; Xu i wsp., 2007].
115
DYSKUSJA
W
toku
przeprowadzonych
eksperymentów
przebadano
także
aktywność
antyhipertensyjną wykorzystywanych białek żółtka. Choroby sercowo-naczyniowe (CVD)
z nadciśnieniem tętniczym na czele są bardzo dużym problemem zdrowotnym w krajach
uprzemysłowionych, i stanowią główną przyczynę śmierci na świecie [Rao i wsp., 2012].
Konwertaza angiotensyny I jest (ACE) jest hydrolazą (EC 3.4.15.1) odgrywającą ważną rolę
w procesie podnoszenia ciśnienia krwi [Lavoie i Sigmund, 2003; Bougatef i wsp., 2010].
Zatem hamowanie działania tego enzymu może wywołać efekt antyhipertensyjny, a związki
działające inhibitorowo wobec ACE mogą znaleźć zastosowanie w profilaktyce a także w
leczeniu chorób nadciśnieniowych [Cao i wsp., 2010].
Liczne badania wykazały, że związki o aktywności antyhipertensyjnej, to zazwyczaj
krótkie sekwencje peptydowe zawierające aminokwasy polarne. Natesh i wsp. [2003]
dowiedli między innymi, że miejsce aktywne enzymu ACE nie może pomieścić ani dużych
cząsteczek peptydów, ani tym bardziej natywnych białek. Wykonane testy na preparacie
foswitynowym, preparacie białek poekstrakcyjnych oraz IgY, wykazały, że żadne z tych
niezhydrolizowanych protein nie posiada zdolności inaktywowania angiotensyny I.
Aktywność przeciwutleniająca i antyhipertensyjna preparatu białek poekstrakcyjnych
kształtowały się na innym poziomie niż wyizolowanych protein żółtka. Preparat ten, jak
wykazały badania chromatograficzne i elektroforetyczne, składa się bowiem nie tylko
z foswityny czy IgY, ale i z różnorodnych innych białek żółtka kształtujących jego
właściwości. Dodatkowo, proces ekstrakcji fosfolipidów z udziałem etanolu mógł
spowodować częściową denaturację protein, zmieniając ich strukturę. Świadczy o tym
chociażby obecność fragmentów zarówno foswityny jak i IgY uwidocznionych na obrazie
elektroforetycznym w postaci kolejno polipeptydowych łańcuchów α-foswityny (160 kDa)
oraz immunoglobulinowych łańcuchów ciężkich (60-70 kDa). Białka żywnościowe są
bowiem podatne na strukturalne i chemiczne modyfikacje w trakcie przetwarzania, co może
wpłynąć również na profil peptydów wytwarzanych podczas późniejszego trawienia [Pokora,
2013].
7.2. Hydroliza enzymatyczna białek modelowych: foswityny i immunoglobuliny IgY
wyizolowanych z żółtka jaja.
7.2.1. Hydroliza enzymatyczna
Hydroliza enzymatyczna białek w produkcji żywności stwarza możliwość poprawy
ich właściwości funkcjonalnych takich jak: wodochłonność, zdolność żelowania czy
116
DYSKUSJA
stabilizowania emulsji, ale także właściwości odżywczych [Clemente 2000, Yujie i wsp.,
2006]. Wiąże się to ze zmianami w III- rzędowej strukturze białek i zmniejszeniem masy
cząsteczkowej [Vinnars i Wilmore, 2003].
Hydrolizaty białek pokarmowych, stanowiące mieszaninę peptydów o zróżnicowanej
masie cząsteczkowej oraz wolnych aminokwasów, są również łatwiej przyswajalne przez
organizm niż natywne białka [Darewicz i wsp., 2000]. Dlatego znajdują szerokie
zastosowanie w produkcji suplementów diety oraz środków spożywczych specjalnego
przeznaczenia żywieniowego. Efektem hydrolizy białek jest także możliwość uwalniania
sekwencji aminokwasów o sprecyzowanej aktywności biologicznej, tzw. biopeptydów
[Clemente, 2000; Korhonen i Pihlanto, 2006; Ketnawa i Rawdkuen, 2013].
Degradacja enzymatyczna in vitro prowadzona jest najczęściej z zastosowaniem
komercyjnych preparatów proteolitycznych, zarówno pochodzenia zwierzęcego (pepsyna,
trypsyna, chymotrypsyna, pankreatyna), roślinnego (papaina, ficyna, bromelaina), jak
i mikrobiologicznego (Alcalase, Neutrase, Protamex™) [Darewicz i wsp., 2000, Tunçtürk
i Zorba, 2006; Zambrowicz, 2009]. Użycie takich proteinaz daje możliwość otrzymywania
hydrolizatów
białkowych
o
określonym
stopniu
hydrolizy i
składzie
peptydów,
charakteryzujących się wysoką aktywnością biologiczną i jakością żywieniową [Darewicz
i wsp. 2000]. Zastosowanie niekonwencjonalnych enzymów, pozyskiwanych z tańszych
źródeł,
może
natomiast
prowadzić
do
otrzymania
hydrolizatów
o
atrakcyjnych
właściwościach, przy jednoczesnej redukcji kosztów hydrolizy.
Celem pierwszego etapu badań był dobór enzymów proteolitycznych umożliwiających
możliwie najwyższy stopień degradacji preparatów: foswitynowego i immunoglobulinowego
oraz otrzymanie produktów o wysokiej aktywności biologicznej. Badania prowadzone przez
różne ośrodki naukowe wykazały, że do uwolnienia bioaktywnych peptydów z białek jaja
szczególnie przydatne są enzymy trawienne, głównie trypsyna chymotrypsyna i pepsyna
a także enzymy pochodzenia mikrobiologicznego [Miesel i Bockelmann, 1999; Park i wsp.,
2001; Kobayashi i wsp., 2004; Pellegrini i wsp., 2004; Sakanaka i wsp., 2004; 2006; Mine
i Kovaks-Nolan, 2005]. Dlatego też w ramach prowadzonych badań na wyizolowanych
białkach żółtka jaja zastosowano dostępne w handlu enzymy takie jak: neutraza, termolizyna
i proteaza z A. melleus. Ponadto, zdecydowano również wykorzystać niekonwencjonalne
proteinazy: serynową i aspartylową z drożdży Yarrowia lipolytica oraz proteinazę serynową
z dyni figolistnej (Cucurbita ficifolia).
Zewnątrzkomórkowa aktywność proteolityczna drożdży Yarrowia lipolytica koreluje
z ich zdolnością do kształtowania specyficznych cech smakowo-zapachowych żywności
117
DYSKUSJA
w której występuje, np. serów dojrzewających z porostem i przerostem pleśniowym (typu
Camembert i Rokpol) [Szołtysik i wsp., 2007]. W zależności od pH środowiska, drożdże
Yarrowia lipolytica wydzielają proteazy kwaśne lub alkaliczne, których synteza zależna jest
również od dostępności węgla, azotu i starki w pożywce oraz obecności białek
zewnątrzkomórkowych [Coelho i wsp., 2010]. Na ekspresje obu proteinaz wpływa
osiemdziesiąt dziewięć mutacji oraz 10 dotychczas zidentyfikowanych genów [GonzalezLopez i wsp., 2002]. Proteinaza aspartylowa, to glikoproteina o wielkości 32 kDa, która
wykazuje maksymalną aktywność w pH od 2,5 do 4,0 oraz w temperaturze 35-45° C.
Proteinaza serynowa ma podobny ciężar molekularny, należy jednak do rodziny subtylizyn
i jest zależna od jonów wapnia. Enzym ten wykazuje maksimum aktywności w zakresie
pH 5-9, oraz w temperaturze 40° C [Beckerich i wsp., 1998].
Owoce dyni są natomiast bogatym źródłem proteinaz serynowych stanowiących około
15% wszystkich protein ekstrahowanych z ich miąższu. Enzym ma masę cząsteczkową równą
około 60 kDa, a jego maksymalną aktywność obserwuje się w pH 8,0 i 11,0. Proteinaza
serynowa z Cucurbita ficifolia jest również dość stabilna w różnych warunkach
temperaturowych [Curotto i wsp., 1988]. Jak dotąd, dane literaturowe na temat generowania
bioaktywnych peptydów w ramach proteolizy białek z udziałem tego enzymu są bardzo
skąpe.
W toku prowadzonych badań, dokonano optymalizacji warunków hydrolizy stosując
różne dawki enzymów oraz skracając lub wydłużając czas reakcji. We wstępnym etapie
degradację prowadzono przez 5, 24 lub 48 godzin przy zachowaniu kontroli parametrów
biochemicznych uzyskiwanych produktów. Na ich podstawie ustalono optymalny czas
hydrolizy, wynoszący maksymalnie do 4 godzin, wystarczający do uzyskania hydrolizatów
o pożądanych właściwościach, przy zastosowaniu odpowiednich dawek enzymów.
Proces hydrolizy monitorowano poprzez wyznaczenie poziomu hydrolizy - DH (%),
przyrostu stężenia wolnych grup aminowych oraz analizę profili peptydowych uzyskanych
w układzie odwróconych faz (RP-HPLC). Stopień hydrolizy jest bardzo istotnym parametrem
opisującym poziom degradacji białka w hydrolizacie, od którego zależny jest charakter
powstałych produktów [Ge i Zhang, 1993, Silvestre, 1996]. Właściwości hydrolizatów
determinowane są bowiem przez długość łańcucha polipeptydowego, hydrofobowość czy też
ilość uwolnionych grup karboksylowych i aminowych, które prowadzą do wzrostu zdolności
jonizacji grup i tworzenia sieci ładunków tych produktów [Aluko i McIntosh, 2005].
Zastosowane preparaty proteolityczne degradowały oba substraty ze zróżnicowaną
wydajnością. Korzystne dla uzyskania głębokiej degradacji preparatu foswitynowego okazało
118
DYSKUSJA
się przeprowadzenie hydrolizy dwuetapowej (sekwencyjnej) z udziałem proteaz pochodzenia
roślinnego i drożdżowego. Uzyskano wówczas najwyższy poziom hydrolizy równy 53%.
Wcześniejsze studia literaturowe również potwierdziły, że głęboki poziom degradacji białek
można osiągnąć poprzez sekwencyjne zastosowanie kilku enzymów. Przykładowo, WhiteCohn i White [1935], w badaniach nad enzymatycznymi hydrolizatami protein białka jaja,
wykazali, że trypsyna w odróżnieniu od pepsyny wykazuje ograniczoną zdolność do
hydrolizy tych białek. Pozytywne wyniki przyniosło jednak zastosowanie kombinacji tych
enzymów. Wstępne trawienie pepsyną natywnego białka jaja, pozwoliło na bardziej
zaawansowaną hydrolizę trypsyną, co potwierdzono w późniejszym czasie także dla protein
serwatkowych.
Degradacja
enzymatyczna
przebiegała
wówczas
z
dużo
większą
intensywnością, w porównaniu z reakcją, w której białka te poddano bezpośredniemu
działaniu trypsyny [White-Cohn i White, 1935; Kananen i wsp., 2000].
Wysoki poziom degradacji enzymatycznej preparatu foswitynowego wykazano
również w produktach uzyskanych przy udziale komercyjnych preparatów proteolitycznych,
przede wszystkim proteinazy z Bacillus amyloliquefaciens. Enzym ten stosowany był już do
otrzymywania hydrolizatów białek żywnościowych przez innych badaczy [Motamedzadegan
i wsp., 2010, Wang i wsp., 2010]. Reakcja enzymatyczna prowadzona przy udziale proteazy
serynowej z drożdży Yarrowia lipolytica pozwoliła natomiast na niemal 30% degradację
zarówno
preparatu
foswitynowego
jak
i
IgY.
Uzdolnienia
proteolityczne
zewnątrzkomórkowych proteaz z drożdży Yarrowia lipolytica były wcześniej oceniane wobec
białek mleka, które również okazały się bardzo podatnymi substratami na ich działanie
[Czajgucka i wsp., 2002; Gdula i wsp., 2002].
Zauważono również, że dużo wyższy stopień hydrolizy w wyniku reakcji z udziałem
proteinazy aspartylowej z Yarrowia lipolytica, działającej w środowisku kwaśnym, uzyskano
w przypadku hydrolizy IgY niż preparatu foswitynowego. Wydaje się, że duże znaczenie
miało pH środowiska reakcji. Okazuje się bowiem, że gdy w innych badaniach poddawano
IgY degradacji enzymami trawiennymi, zachodziła ona bardziej efektywnie w pH 4,5 lub
niższym [Shimizu i wsp., 1988].
Dodatkowo, niektóre badania wykazały, że foswityna jest bardzo odporna na trawienie
proteolityczne in vitro ze względu niezwykłą strukturę jej cząsteczki, która składa się
z długich bloków oligofosfoserynowych nieprzerywanych przez inne grupy [Byrne i wsp.,
1984]. Goulas i wsp. [1996] obserwowali jedynie ograniczoną hydrolizę foswityny
z udziałem pepsyny, trypsyny, i α-chymotrypsyny. Natomiast Jiang i wsp. [2000] wyciągnął
wniosek że defosforylacja foswityny poprzez obróbkę alkaliczną (inkubację w NaOH
119
DYSKUSJA
w 37 °C) zwiększa jej podatność na hydrolizę. Dlatego również w ramach prowadzonych
badań zastosowano tą procedurę przed przeprowadzeniem hydroliz enzymatycznych
preparatu foswitynowego. Zapewne dzięki temu, można było osiągnąć wyższy stopień
hydrolizy tego preparatu w porównaniu do poziomów DH otrzymanych przez kilku innych
badaczy [Goulas i wsp., 1996; Byrne i wsp., 1984].
7.2.2. Aktywności biologiczne uzyskanych hydrolizatów
Na właściwości fizykochemiczne oraz aktywność biologiczną hydrolizatów wpływają
znacznie takie czynniki jak: rodzaj prekursora białkowego, specyficzność enzymu
proteolitycznego, warunki reakcji hydrolizy oraz stopień degradacji białka. Jak dotąd, w
hydrolizatach pochodzących z różnorodnych białek żywnościowych, wykazano istnienie
bioaktywnych peptydów [Ibrahim i wsp., 1998; Kim i wsp., 2007; Kong i wsp., 2007, Li
i wsp., 2007]. Wielu autorów potwierdza, że surowiec jajczarski może być także ich
potencjalnym źródłem [Pellegrini i wsp., 2004; Zambrowicz i wsp., 2009, Eckert i wsp.,
2013; Pokora i wsp., 2013]. Udowodniono na przykład, że podczas spożywania całego jaja,
z owoalbuminy pod wpływem enzymów proteolitycznych (w dużej mierze pepsyny) powstaje
oktapeptyd, tzw. owokinina [Davis i Reeves, 2002]. Peptyd ten ma właściwości obniżania
skurczowego ciśnienia krwi. Dodatkowo, w układzie pokarmowym ulega natychmiastowej
emulsyfikacji i jest dobrze absorbowany przez jelita [Davis i Reeves, 2002]. Zauważono
również, że spożycie białek żółtka jaja i ich hydrolizatów hamuje proliferację komórek
nowotworowych w jelicie grubym [Ishikawa i wsp., 2009].
Szczególnym zainteresowaniem cieszą się obecnie związki pochodzenia naturalnego,
o potencjalnej terapeutycznej roli antyutleniaczy. Niwelują one bowiem niekorzystne
przemiany wynikające z działania wolnych rodników tlenowych. Zmiany te leżą u podstaw
większości stanów patologicznych (choroby układu krążenia, zmiany zwyrodnieniowe),
a także niekorzystnych zmian w produktach żywnościowych (jełczenie, zmiana zapachu
i barwy) [Saga i wsp., 2003]. Syntetyczne przeciwutleniacze, takie jak BHA, TBHQ czy
galusan propylu są wciąż bardzo szeroko stosowane jako dodatki do żywności i kosmetyków.
Ich działanie antyoksydacyjne jest co prawda dużo silniejsze niż naturalnych związków,
takich jak a-tokoferol czy kwas askorbinowy, ale jest równocześnie ściśle regulowane ze
względu na potencjalne zagrożenie dla zdrowia [Lee i wsp., 2010]. Rosną obawy szczególnie
w związku z wykryciem ich potencjału kancerogennego oraz genotoksycznego [Williams
i wsp., 1999; Gharavi i wsp., 2007].
120
DYSKUSJA
Dzięki swym antyoksydacyjnym właściwościom, hydrolizaty białkowe rozpatrywane
są nie tylko jako doskonała alternatywa dla antyoksydantów chemicznych, ale również jako
czynniki zapobiegające chorobom wywołanym stresem oksydacyjnym, jak rak jelita grubego,
choroba
Alzhaimera,
choroba
Parkinsona
[Park
i
wsp.,
2001].
Wykazują
one
wielokierunkowe działanie antyoksydacyjne oparte na mechanizmie przeciwutleniaczy
pierwszorzędowych lub wtórnych. Przeciwutleniacze pierwszorzędowe przerywają reakcję
łańcuchową poprzez zmiatanie wolnych rodników, oddając lub przyjmując atom wodoru.
Wtórne
przeciwutleniacze,
opóźniają
utlenianie
na
skutek
wiązania
kationów
dwuwartościowych, będących katalizatorami tego procesu, czy zmiatania i konwertowania
reaktywnych form tlenu, np.: tlenu singletowego, rodników ponadtlenkowych [Sun i wsp.,
2011]. Ponadto, uczestniczą w przeciwdziałaniu stresowi oksydacyjnemu,poprzez hamowanie
peroksydacji lipidów, kwasów nukleinowych oraz przemian enzymatycznych, będących
induktorami chorób neurodegeneracyjnych, nowotworzenia komórek, procesów starzenia,
miażdżycy, czy cukrzycy [Nazeer i wsp. 2012]. Cechy te podkreślają ich możliwe
prozdrowotne działanie.
Otrzymane produkty degradacji preparatu foswitynowego i immunoglobuliny zostały
scharakteryzowane pod względem ich aktywności przeciwutleniającej, którą wyrażono jako:
zdolność do wymiatania wolnych rodników DPPH, redukcji stopnia utlenienia jonów Fe3+
i do Fe2+ i chelatowania jonów Fe2+.
DPPH
jest
często
stosowany
jako
substrat
w
celu
oceny
aktywności
przeciwutleniającej, gdyż jako wolny rodnik przyjmuje elektron lub jon wodorowy tworząc
stabilną cząsteczkę [Xia i wsp., 2012]. W przeprowadzonych badaniach wykazano,
że najlepszą zdolnością do wymiatania wolnych rodników DPPH, charakteryzowały się
hydrolizaty IgY otrzymane wyniku 24 godzinnej reakcji z termolizyną, neutrazą oraz
proteinazą serynową z drożdży Yarrowia lipolytica. Wartości tej aktywności wyniosły
odpoweidnio: 4,2; 4,3 i 9,7 µmol trolox/mg. Proteinaza serynowa z drożdży generowała
również krótkołańcuchowe peptydy z preparatu foswitynowego o silnej zdolności do
wymiatania wolnych rodników DPPH. Stwierdzono również, że w większości przypadków
krótkotrwała hydroliza preparatu foswitynowego obniżała znacznie aktywność otrzymanych
produktów, natomiast kontynuowanie hydrolizy przez dłuższy czas, warunkujący głębszą
degradacje białka, przyczyniał się do powstawania peptydów charakteryzujących się wyższą
zdolnością wymiatania rodników DPPH niż natywne białko (>0,4). Podobną zależność
zaobserwowali Dávalos i wsp., [2004] którzy wykazali, że w wyniku niemal 57% hydrolizy
121
DYSKUSJA
białek jaja z udziałem pepsyny, można otrzymać peptydy posiadające aktywność wymiatania
wolnych rodników AAPH niemal trzykrotnie wyższą, niż aktywność białka prekursorowego.
Porównując zdolność wymiatania wolnych rodników produktów degradacji preparatu
foswitynowego z tymi samymi właściwościami hydrolizatów IgY, można stwierdzić
iż aktywność ta kształtowała się na dużo wyższym poziomie w tych drugich hydrolizatach.
Jednakże, nie tylko rodzaj zastosowanego prekursora białkowego, ale i rodzaj preparatu
proteolitycznego miał decydujący wpływ na poziom aktywności przeciwutleniającej
w
otrzymanych
proteolitycznych
hydrolizatach.
Spośród
niekonwencjonalne
wszystkich
proteazy
z
zastosowanych
drożdży
Yarrowia
preparatów
lipolytica
charakteryzowały się największą zdolnością do produkcji peptydów wykazujących silną
aktywność antyoksydacyjną.
Również You i Wu [2011], w swoich badaniach porównywali aktywność
przeciwutlenaijacą hydrolizatów białek jaja uzyskanych z udziałem różnorodnych enzymów.
W doświadczeniu wykorzystali preparaty trawienne, tj. pepsynę i pankreatynę, oraz enzymy
pochodzenia mikrobiologicznego takie jak termolizynę i akalazę. Otrzymane przez nich
hydrolizaty wykazały aktywność unieczynnienia rodników AAPH (metoda ORAC-FL),
ABTS i DPPH przy czym, poziomy aktywności hydrolizatów otrzymanych z udziałem
enzymów mikrobiologicznych były wyższe niż poziomy aktywności hydrolizatów
uzyskanych z zastosowaniem enzymów trawiennych. Hydrolizaty białek żółtka otrzymane
z
zastosowaniem
alkalazy,
termolizyny
i
mieszaniny
enzymów
trawiennych
(pepsyny/pankreatyny), wykazały zdolność do wymiatania wolnych rodników DPPH
wynoszącą kolejno: 0,35, 0,19 i 0,19 µM troloxu/mg [You i Wu, 2011] . Podobne wartości
zdolności wymiatania wolnych rodników wykazywane przez hydrolizaty białek jaja uzyskali
inni autorzy, cytowani już powyżej. Dávalos i wsp. [2004] dowiedli, że całe białko jaja jak
i jego hydrolizat (DH 56,9%) uzyskany pod wpływem działania pepsyny, posiadają
aktywność wymiatania wolnych rodników AAPH kształtującą się na poziomie kolejno 0,13
i
0,38
µM
troloxu/mg.
Podsumowując,
hydrolizaty
enzymatyczne
otrzymane
w przedmiotowej pracy wykazały nieporównywalnie wyższe poziomy aktywności
wymiatania wolnych rodników DPPH, w porównaniu z poziomami aktywności jakie
posiadały hydrolizaty protein białek jaja przytoczone w zacytowanej literaturze.
Aktywność przeciwutleniającą oceniano także poprzez określenie siły redukcji stopnia
utlenienia jonów żelaza (III). Badane hydrolizaty charakteryzowały się znaczącą zdolnością
redukującą. Przykładowo, 24 godzinny hydrolizat IgY otrzymany z udziałem neutrazy
wykazał zdolność redukującą równą 403,1 µg Fe2+/mg. Na nieco niższym poziomie
122
DYSKUSJA
kształtowała się natomiast aktywność 24 godzinnych hydrolizatów IgY otrzymanych
z udziałem termolizyny (345,5 µg Fe2+/mg). Otrzymane wyniki podważają teorię Flaczyk
[2005], która w badaniach nad aktywnością przeciwutleniającą enzymatycznych hydrolizatów
otrzymanych z wieprzowych skwarek stwierdziła, że hydrolizaty białek żywnościowych
pochodzenia zwierzęcego wykazują niewielką siłę redukującą w porównaniu z preparatami
roślinnymi.
Z literatury poświęconej temu zagadnieniu wynika, że siła redukująca hydrolizatów
białkowych jest związana z obecnością w łańcuchach białek, peptydów i reszt
aminokwasowych zawierających grupy SH, NH2 oraz fenolowe. Na siłę redukującą mogą
zatem wpływać wzajemne oddziaływania częściowo zhydrolizowanych białek z mostkami
siarczkowymi oraz grupami funkcyjnymi peptydów i aminokwasów [Flaczyk, 2005].
Poza
tym,
podobnie
jak
poprzednio,
wykazano,
iż
hydrolizaty
preparatu
foswitynowego posiadały niższe właściwości antyoksydacyjne, w porównaniu do produktów
degradacji IgY. Należy jednak zaznaczyć że zdolność redukcji stopnia utlenienia jonów
żelaza niemal wszystkich uzyskanych hydrolizatów, kształtowała się na dużo wyższym
poziomie w odniesieniu do aktywności białek prekursorowych.
W przedmiotowej pracy oceniano także zdolność enzymatycznych hydrolizatów
preparatów białek jaja do chelatownia jonów Fe2+. Zarówno produkty degradacji preparatu
foswitynowego jak i immunoglobuliny Y charakteryzowały się bardzo silną zdolnością
chelatujacą. Najwyższy poziom tej aktywności uzyskano dla 24 godzinnych hydrolizatów
preparatu foswitynowego, otrzymanych z zastosowaniem proteazy serynowej z Yarrowia
lipolytica (691,6 µg Fe2+/mg). Podobny poziom tej aktywności wykazały 24 godzinne
hydrolizaty preparatu foswitynowego uzyskane z zastosowaniem proteazy z dyni figolistnej
(617,7 µg Fe2+/mg). Przeprowadzenie hydrolizy sekwencyjnej, w której białko początkowo
degradowano proteinazą z dyni figolistnej a następnie drożdżową proteinazą serynową
przyczyniło się do otrzymania produktów o jeszcze lepszej aktywności chelatowania (815,3
µg Fe2+/mg). Zastosowanie niekonwencjonalnych enzymów, zwłaszcza proteazy serynowej z
Yarrowia lipolytica oraz proteazy z dyni figolistnej na drodze hydrolizy sekwencyjnej IgY
także skutkowało wysoką aktywnością chelatującą uzyskanych produktów (859,9 µg
Fe2+/mg).
Wyniki przedstawione w tej pracy są zgodne z danymi literaturowymi, w których
udowodniono, że zarówno białka obecne w żółtku jaja jak i jego hydrolizaty, wykazują silną
aktywność przeciwutleniającą. Przykładowo, Xu i wsp. [2007] otrzymali z foswityny żółtka
jaja peptydy, o zdolności do zmiatania wolnych rodników DPPH, chelatowania jonów żelaza
123
DYSKUSJA
(II) jak również do hamowania utleniania kwasu linolowego. Bardzo wysoka aktywność
chelatowania jonów żelaza foswitynowych peptydów, wyższa niż natywnego białka, wynika
z tego, że hydroliza prowadzi do otrzymania małych peptydów posiadających fosfoserynowe
ligandy, które znacznie łatwiej i silniej wiążą jony żelaza niż sama niezhydrolizowana
proteina [Xu i wsp., 2007].
Otrzymane hydrolizaty poddano także ocenie aktywności przeciwdrobnoustrojowej
wobec kilku szczepów bakterii z rodzaju Bacillus, znacznie obniżających jakość produktów
spożywczych. Wielu autorów udowodniło bowiem, iż badane substraty białkowe
wyizolowane z żółtka posiadają silny potencjał przeciwdrobnoustrojowego działania.
Przykładowo, wykazano antagonistyczne działanie doustnie podawanych swoistych
przeciwciał IgY wobec rozmaitych jelitowych patogenów, zarówno u zwierząt jak i ludzi,
takich jak: rotawirusy, koronawirusy, bakterie Escherichia coli, Salmonella spp., Yersinia
ruckeri, jak również Staphylococcus aureus i Pseudomonas spp. [Mine i Kovacs-Nolan,
2002]. Dowiedziono także, że silne zdolności chelatujące białka foswityny mogą wywoływać
efekt przeciwdrobnoustrojowy [Khan i wsp., 2000]. Wiadomo także, że niektóre fosfopeptydy
mogą być skuteczne w hamowaniu wzrostu drobnoustrojów. Przykładowo pochodzące od
kazeiny fosfopeptydy o masie cząsteczkowej 3,5 do 4,0 kDa hamują rozwój bakterii
Escherichia coli i Pseudomonas ssp. [Arunachalam i Raja, 2010]. Istnieje jednak bardzo
ograniczona wiedza na temat produktów enzymatycznej degradacji foswityny lub IgY
przejawiających antybakteryjne lub antywirusowe aktywności [Samaraweera i wsp., 2011].
Przeprowadzone testy wykazały, że peptydy otrzymane zarówno z preparatu
foswitynowego jak i IgY nie wykazują pożądanych antagonistycznych właściwości wobec
kilku
Gram+
bakterii
z
rodzaju
Bacillus.
Mechanizm
działania
większości
przeciwdrobnoustrojowych peptydów, szczególnie w stosunku do bakterii G- wynika z ich
zdolności do wiązania się z lipopolisacharydami ściany komórkowej, co prowadzi do
powstania kanałów powodujących destabilizację i śmierć komórki. Brak antybakteryjnego
efektu w przypadku zastosowanych hydrolizatów białek żółtka jaja można wyjaśnić faktem,
iż badane drobnoustroje charakteryzują się odmienną budową ściany komórkowej
w porównaniu do bakterii Gram-. Rzeczywiście, w badaniach in vitro wykazano skuteczne
działanie IgY wobec wielu bakterii Gram-. Natomiast jej aktywność hamowania rozwoju
bakterii Gram+ opisywano tylko sporadycznie [Zhen i wsp., 2008a, 2009; Wang i wsp.,
2011].
124
DYSKUSJA
7.3. Badania na białkach poekstrakcyjnych z żółtka jaja.
7.3.1. Hydroliza enzymatyczna
Doskonałym źródłem hydrolizatów białkowych, o bardzo dobrych właściwościach
funkcjonalnych i żywieniowych, są niewykorzystane produkty uboczne, otrzymane na drodze
różnorodnych procesów technologicznych, które mogą być dalej zagospodarowane jako
pełnowartościowe składniki pasz lub produktów spożywczych [Schwenke, 1994; Vioque
i wsp., 1999; Codova-Murueta i wsp., 2007]. Przykładem tego, są uboczne produkty
przetwórstwa rybnego lub też niewykorzystane produkty przemysłu olejarskiego, takie jak
odtłuszczone białko pozyskiwane z ziaren słonecznika czy rzepaku [Vioque i wsp., 2000].
Hydroliza tego drugiego surowca, pozostałego po procesie produkcyjnym oleju rzepakowego
z zastosowaniem alkalazy prowadzi do znacznego polepszenia jego właściwości
emulgujących i wiązania wody. Następnie zastosowanie endopeptydazy pozwala na
otrzymanie hydrolizatów o bardzo dobrej rozpuszczalności [Schwenke, 1994; Vioque i wsp.,
1999]. Do produkcji wysokobiałkowej żywności mogą być spożytkowane również
odtłuszczone białka żółtka jajka pozostałe po ekstrakcji lecytyny. Wang i Wang [2009]
zaproponowali między innymi ich wykorzystanie na drodze degradacji proteolitycznej
enzymami Protex (Genencor International, Rochester, NY) i Protamax (Novozymes N / A,
Franklinton, NC), dzięki czemu, w wyniku uzyskania stopnia hydrolizy (DH) kolejno 3%
i 6%-owego, znacznie wzrosła ich rozpuszczalność i jednocześnie możliwości zastosowania.
W przedmiotowej pracy zaproponowano natomiast hydrolizę enzymatyczną białek
pozyskanych w wyniku ekstrakcji etanolowej fosfolipidów z żółtka jaja, jako metodę
otrzymywania
biologicznie
aktywnych
peptydów
i
jednocześnie
sposób
ich
zagospodarowania.
Mimo, że istnieje możliwość teoretycznego przewidzenia rodzaju powstających
produktów poprzez m.in., znajomość specyficzności enzymu i struktury pierwszorzędowej
białka istnieje potrzeba prowadzenia badań laboratoryjnych w celu dokładnego opisania
powstających produktów degradacji. Hydroliza enzymatyczna nie zawsze zachodzi bowiem
według ściśle teoretycznie wyznaczonego schematu. Przykładem mogą być badania
prowadzone nad hydrolizatami białek żywnościowych uzyskanych z zastosowaniem trypsyny
[Pellegrini i wsp. 1999; 2001]. Trypsyna wykazuje specyficzność wobec wiązań peptydowych
zlokalizowanych za resztą argininy i lizyny [Żelazko, 2005], mimo to nie uzyskuje się
wyłącznie produktów degradacji zawierających na C-końcach fragmentów peptydowych tych
reszt. Peptyd LGDT2, uwolniony z β-laktoglobuliny pod wpływem działania trypsyny,
125
DYSKUSJA
zawierał na C-końcu łańcucha peptydowego resztę tyrozyny [Pellegrini i wsp., 2001].
Natomiast peptyd LDT2, uzyskany w wyniku działania tego enzymu na α-laktoalbuminę,
zawierał w tej pozycji fenyloalaninę [Pellegrini i wsp., 1999]. Może to również wskazywać na
zanieczyszczenie stosowanego preparatu trypsyny chymotrypsyną, dla której wiązania
utworzone przez tyrozynę i fenyloalaninę są szczególnie wrażliwe.
W wyniku przeprowadzonych badań wstępnych na preparacie foswitynowym oraz
immunoglobulinie Y ustalono optymalny czas hydrolizy, wynoszący 4 godziny,
wystarczający do uzyskania hydrolizatów o pożądanych właściwościach, przy zastosowaniu
odpowiednich dawek enzymów. Dłuższa hydroliza, mimo stosowania mniejszych dawek
proteaz, okazała się nieuzasadniona ekonomicznie. Podobne badania nad optymalizacją
warunków hydrolizy były prowadzone przez innych autorów [Flaczyk, 2005, See i wsp.,
2011, Sun i wsp., 2012].
Analiza uzyskanych na drodze degradacji enzymatycznej produktów z wyizolowanych
białek jaja pod względem ich aktywności przeciwutleniającej pozwoliła również na
wytypowanie enzymów pozwalających na otrzymanie hydrolizatów o tych cennych
właściwościach. Wybór odpowiedniego enzymu proteolitycznego (lub mieszaniny enzymów)
jest najistotniejszym elementem przy prowadzeniu hydrolizy zmierzającej do otrzymywania
produktów o potencjalnej aktywności biologicznej [Clemente, 2000]. Na podstawie
uzyskanych wyników stwierdzono, że proteinazy ze źródeł niekonwencjonalnych, są
kluczowymi enzymami służącym uwalnianiu peptydów zarówno o zdolności wymiatania
wolnych rodników, aktywności redukującej jak i chelatujacej z preparatów białek żółtka.
Dodatkowym atutem jest to, że jeszcze nikt nie testował ich zdolności do generowania
bioaktywnych związków z białek żółtka jaja.
Zastosowane preparaty proteolityczne degradowały białka poekstrakcyjne ze
zróżnicowaną wydajnością. Najwyższy stopień hydrolizy wykazano w próbach, do których
wprowadzono proteinazę z dyni figolistnej w maksymalnej dawce. Poziom degradacji
wynosił wówczas ponad 46%. Wyniki te potwierdziły wysoką aktywność proteolityczną
proteazy z dyni figolistnej, na którą wskazywali w swych badaniach Curotto i wsp. [1989]
oraz Dryjanski i wsp. [1990], testując ten enzym wobec azokolagenu i kazeiny, jako
substratów.
Niekomercyjna
proteinaza
serynowa
z
drożdży
Yarrowia
lipolytica
charakteryzująca się wysoką aktywnością proteolityczną, którą najczęściej wykorzystywano
do tej pory wobec białek mleka [Graszkiewicz, 2005, Wielowiejska, 2009], okazała się także
bardzo efektywna w stosunku do białek żółtka. Hydroliza preparatu białek poekstrakcyjnych
126
DYSKUSJA
prowadzona przy udziale tego enzymu dozowanego w dawce 20 i 40 j/mg, pozwoliła na
degradację substratu na poziomie wynoszącym kolejno ponad 32 i 34%.
W przypadku hydroliz sekwencyjnych, polegających na zastosowaniu dwóch
proteinaz serynowych jedna za drugą w odpowiednich odstępach czasowych uzyskano
stopień hydrolizy porównywalny do tego, po użyciu samego enzymu wyizolowanego z dyni
figolistnej. Istotne znaczenie miała tu dawka stosowanych proteaz, która w przypadku
enzymów zastosowanych do hydrolizy sekwencyjnej była znacznie niższa. Wynik ten
potwierdził, że zastosowanie hydrolizy kombinowanej pozwala na uzyskanie głębokiego
stopnia hydrolizy już przy niskich dawkach enzymów, co w konsekwencji pozwala na
skrócenie czasu trwania procesu. Natomiast, hydroliza przy udziale pojedynczych enzymów
wymaga stosowania wyższych dawek.
Pomimo prawie jednakowego stopnia degradacji białek po przeprowadzeniu obu
hydroliz, uzyskane produkty były znacząco rożne, co zaobserwować można na ich profilach
peptydowych. Hydroliza sekwencyjna skutkowała bowiem powstaniem większej ilości
krótkołańcuchowych peptydów o wyższej hydrofobowości, w porównaniu do degradacji
z udziałem tylko jednego enzymu. Podobną zależność obserwowali w swoich badaniach
Villanueva i wsp. [1999] oraz Gilmartin i Jervis, [2002].
7.3.2. Aktywności biologiczne enzymatycznych hydrolizatów białek poekstrakcyjnych
z żółtka jaja
Kontrolowane uwalnianie bioaktywnych peptydów z białek żywnościowych za
pomocą enzymatycznej hydrolizy jest jedną z najbardziej obiecujących technik wytwarzania
hydrolizatów o potencjalnym zastosowaniu w przemyśle farmaceutycznym i spożywczym.
Stwierdzono bowiem, że hydrolizaty w których stopień hydrolizy wynosi >10%, często
zawierają w swoim składzie bioaktywne peptydy o pozytywnym wpływie na zdrowie
człowieka, podczas gdy te, w których DH wynosi <10%, istotnie poprawiają właściwości
funkcjonalne izolatów białkowych [Pedroche i wsp., 2003].
W przedmiotowej pracy, w wyniku działania niekonwencjonalnych proteinaz,
zarówno pochodzenia mikrobiologicznego jak i roślinnego, na białka poekstrakcyjne z żółtka
jaja, wykazano znacznie wyższy finalny stopień degradacji niż 10%. Dlatego też uzyskane
produkty hydrolizy o potencjalnej bioaktywności przebadano pod względem ich właściwości
przeciwutleniających,
antyhipertensyjnych
przeciwdrobnoustrojowych,
cytotoksycznych/proliferacyjnych oraz immunomodulujących.
127
DYSKUSJA
7.3.2.1. Aktywność przeciwutleniająca
Aktywność
przeciwutleniającą
stwierdzono
w
wielu
hydrolizatach
białek
żywnościowych, tj. białek serwatkowych [Lin i wsp., 2012], hemoglobiny wieprzowej [Sun
i wsp., 2012], białek ryb [Sampath-Kumar i wsp., 2011] czy glutenu [Hasanov i wsp., 2011],
otrzymywanych z udziałem komercyjnych preparatów enzymów proteolitycznych. Równie
skutecznym substratem do otrzymywania antyoksydacyjnych produktów hydrolizy okazała
się frakcja białkowa jaja. Generowanie peptydów o tej cennej aktywności, w wyniku
degradacji enzymatycznej białka jaja z udziałem proteaz z różnych źródeł, wykazali między
innymi Sakanaka i wsp. [2006; 2004], Xu i wsp. [2007], oraz Davalõs i wsp. [2004]. Dane
dotyczące tego zagadnienia w odniesieniu do białek żółtka jaja są nieproporcjonalnie skąpe.
Dlatego założono, że zastosowanie enzymów z nowych źródeł do hydrolizy protein żółtka
może prowadzić do otrzymania nowatorskich produktów atrakcyjnych pod względem
aktywności biologicznej.
W
wyniku
przeprowadzonych
doświadczeń,
prawie
wszystkie
analizowane
hydrolizaty wykazały aktywność wobec rodników DPPH. Jakkolwiek w większości
przypadków wyższą zdolnością zmiatania wolnych rodników charakteryzowały się próby
uzyskane po 0,5 godzinnej reakcji, a zatem próby o niższym DH. Taką zależność wykazywały
jednoenzymowe hydrolizaty otrzymane z udziałem proteinazy aspartylowej z drożdży oraz
produkty hydrolizy proteinazy izolowanej z dyni figolistnej dozowanej w niższych dawkach
(100 i 200 j/mg). Również produkty uzyskane w wyniku przeprowadzenia hydroliz
sekwencyjnych z udziałem dwóch proteinaz serynowych czy dwóch enzymów pochodzenia
mikrobiologicznego, wykazały wyższą zdolność wymiatania rodników DPPH po kolejno 3
lub 0,5 godzinnej reakcji, gdy stopień hydrolizy wyniósł w pierwszym przypadku 34%,
a w drugim 12%.
Podobną zależność zaobserwował Elias i wsp. [2008], w swoich badaniach nad
białkami izolowanymi z szałwii (Salvia hispanica). Stwierdził on między innymi, że głęboka
hydroliza prowadziła do powstania produktów o niższej aktywności przeciwutleniającej.
Wyjaśnił to zjawisko prawdopodobną obecnością w takich hydrolizatach dużej ilości wolnych
aminokwasów, które nie są tak skutecznymi przeciwutleniaczami jak peptydy. Zwiększona
aktywność
antyoksydacyjna
peptydów
wynika
z
ich
unikatowych
właściwości
determinowanych przez określoną sekwencję i własności fizyczne, pozwalających na
ekspozycję odpowiednich reszt aminokwasowych działających jako donory elektronów.
W wyniku tych reakcji peptydy tworzą stabilne rodniki peptydowe, które nie inicjują już
dalszych reakcji utleniania [Elias i wsp., 2008]. Natomiast, Xia i wsp. [2012] zauważyli, że
128
DYSKUSJA
obecność w hydrolizatach peptydów charakteryzujących się większą hydrofobowością
decyduje o silnej aktywności antyoksydacyjnej. Dodatkowo, wykazali oni, że hydrolizaty
białek jęczmienia zawierające długołańcuchowe peptydy posiadały silniejsze działanie wobec
rodników DPPH, a peptydy o małych rozmiarach skuteczniej redukowały poziom utlenienia
jonów żelaza Fe2+.
Warto jednak zaznaczyć, iż niektóre z uzyskanych w przedmiotowej pracy
hydrolizatów, między innymi te, otrzymane z udziałem proteinazy serynowej z Yarrowia
lipolytica, czy w wyniku działania proteinazy z dyni figolistnej, wykazywały najwyższą
aktywność zmiatania rodników DPPH po 4 godzinach reakcji. Świadczy to prawdopodobnie o
obecności w tych hydrolizatach krótkołańcuchowych peptydów zawierających w swoim
składzie albo aminokwasy aromatyczne, albo posiadające grupy SH, które to spełniają
kluczową rolę w interakcji z wolnymi rodnikami [Chen i wsp., 1998, Qian i wsp., 2008].
Dodatnią korelację stopnia hydrolizy i aktywności przeciwutleniającej otrzymywanych
produktów wykazali w swych badaniach między innymi Chen i wsp. [2012] oraz Liu i wsp.
[2010].
Analiza zdolności redukcji stopnia utlenienia jonów Fe+3 do Fe+2 hydrolizatów
preparatu białek poekstrakcyjnych również w większości przypadków wykazała spadek
wartości tego parametru wraz ze wzrostem stopnia hydrolizy. Zaobserwowano, że najwyższą
siłą redukującą cechowały się hydrolizaty, w których głębokość degradacji substratu
określona na podstawie DH, WGA i profili peptydowych, była najniższa. Do produktów tych
zaliczał się: 0,5 godzinny hydrolizat otrzymany z udziałem proteinazy serynowej z Yarrowia
lipolytica zastosowanej w dawce 20 j/mg, którego zdolność redukcji kształtowała się na
najwyższym poziomie i wynosiła 209,9 µg Fe3+/mg, ale także hydrolizaty uzyskane w wyniku
zastosowania proteinazy aspartylowej, enzymu z dyni figolistnej dozowanej w dawce 100,
200 i 400 j/mg, oraz produkty reakcji sekwencyjnych. Wyjątkiem był 4 godzinny hydrolizat
otrzymany z udziałem proteinazy z dyni figolistnej (1000 j/mg), który charakteryzował się
wyższą zdolnością przeciwutleniającą niż inne produkty otrzymane we wcześniejszych
czasach hydrolizy.
Wysoka aktywność uzyskanych produktów jest konsekwencją niespecyficznego
działania zastosowanych proteaz, prowadzącego do otrzymania zróżnicowanej mieszaniny
peptydów. Istnieje jednoznaczny związek pomiędzy wielkością, strukturą i składem
aminokwasowym peptydów, a aktywnością przeciwutleniającą [Chen i wsp., 2012]. Podobną
zależność obserwowali w swych badaniach Moure i wsp. [2006]. Autorzy podkreślali
korelację między stopniem hydrolizy i czasem trwania reakcji, a siłą redukującą hydrolizatów.
129
DYSKUSJA
Jednakże w większości przypadków udowadniali oni wyższą zdolność redukcji Fe+3
w przypadku frakcji drobnocząsteczkowych peptydów, uzyskanych w wyniku głębokiej
hydrolizy białek [Chen i wsp., 2012, Moure i wsp., 2006].
Wpływ dawki enzymu i poziomu degradacji substratu zaobserwowano także
w przypadku aktywności chelatującej hydrolizatów. W wyniku zastosowania proteinazy
serynowej z dyni figolistnej większą zdolnością wiązania jonów Fe2+ charakteryzowały się
hydrolizaty otrzymane z udziałem wyższych dawek enzymów, co może wskazywać na
znamienny wpływ głębokiej degradacji białka. Podobne wyniki uzyskali Torres-Fuentes
i wsp. [2011], którzy analizowali właściwości przeciwutleniające hydrolizatów białek
roślinnych w aspekcie ich zdolności do kompleksowania jonów żelaza.
Zdolność chelatowania kształtowała się inaczej w wyniku użycia proteinaz
drożdżowych. Najwyższą aktywność chelatującą zaobserwowano bowiem w hydrolizatach
uzyskanych, co prawda w wyniku zastosowania wyższej dawki proteinazy serynowej,
jednakże po reakcji trwającej jedynie 0,5 godzinny (1310,7 µg Fe2+/mg).
Zastosowanie
niekonwencjonalnych
enzymów,
zwłaszcza
proteazy
serynowej
z Yarrowia lipolytica skutkowało bardzo wysoką aktywnością chelatującą uzyskanych
produktów. Podobne wyniki przedstawili Xia i wsp. [2012] dla hydrolizatów białka
jęczmienia
trawionego
alkalazą
(z
Bacillus
licheniformis).
Komercyjne
preparaty
enzymatyczne zastosowane w ich badaniach (neutraza, proteaza z A. melleus) pozwoliły na
otrzymanie hydrolizatów o znacznie niższej zdolności wiązania Fe+2. Wyniki te wskazują na
powstawanie produktów bardziej atrakcyjnych pod względem aktywności antyoksydacyjnej,
na skutek działania niekomercyjnymi preparatami enzymatycznymi.
Warto również zaznaczyć, iż otrzymane w przedmiotowych badaniach wartości
chelatowania uzyskanych hydrolizatów zblizone były do zdolności kompleksowania żelaza
związków syntetycznych stosowanych w zywności (EDTA). Otrzymane aktywności
kształtowały się również na dużo wyższym poziomie niż hydrolizatów soi [Zhang i wsp.,
2010], czy kazeiny [Diaz i wsp., 2003].
7.3.2.2. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa
Enzymatyczne hydrolizaty preparatu białek poekstrakcyjnych poddano analizie pod
kątem ich aktywności przeciwdrobnoustrojowej wobec szczepów bakterii z rodzaju Bacillus
takich jak: B. subtilis B 172, B. subtilis B 3, B. cereus B 512, B. cereus B 3p i B. laterisporum
B 6. Ponadto, rozszerzono badania o inne szczepy bakterii chorobotwórczych takich jak: S.
130
DYSKUSJA
aureus FRI137, L. monocytogenes serotyp 4B i E. coli PCM419. Hydrolizaty nie wykazały
jednak aktywności przeciwdrobnoustrojowej wobec wybranych drobnoustrojów.
W literaturze poświęconej przeciwdrobnoustrojowym peptydom, opisano wiele
związków pochodzących z części białkowej jaja. Przykładowo, częściowa hydroliza
natywnego lizozymu pepsyną, prowadzi do uzyskania mieszaniny peptydów wykazującej
aktywność wobec bakterii z rodzaju Bacillus [Abdou i wsp., 2007). Prekursorem
przeciwdrobnoustrojowo aktywnych peptydów jest także owoalbumina, główne białko jaja.
Trypsyna lub chymotrypsyna bydlęca prowadzi do uwolnienia z tego białka m. in. penta-,
heksa- i oktapeptydów wykazujących silną aktywność bakteriobójczą wobec bakterii Bacillus
subtilis [Pellegrini i wsp., 2004]. Efekt bakteriocydny przypisywany jest także 9,9 kDa
fragmentowi (f 109 -200) konalbuminy (OTAP 92), aktywnemu wobec bakterii G+ i G-.
[Chrzanowska, 1998; Ibrahim i wsp., 2000; Gołąb i Warwas, 2005]. Natomiast, aktualnie jest
niewiele danych na temat hydrolizatów białek żółtka, które cechowałby ta aktywność.
7.3.2.3. Aktywność antyhipertensyjna
Pomimo że syntetyczne leki przeciwnadciśnieniowe, ukierunkowane na hamowanie
enzymu ACE, okazały się bardzo skuteczne w leczeniu nadciśnienia tętniczego krwi, ich
stosowanie nierzadko związane jest z występowaniem niekorzystnych skutków ubocznych,
takich jak suchy kaszel, zaburzenia smaku, wysypki skórne, jak również dysfunkcja działania
różnych narządów [Glasser, 2001; Beltrami i Zingale, 2006]. W ciągu ostatnich lat,
wiele uwagi poświęcono naturalnym peptydom pochodzącym z żywności przejawiającym
aktywność inhibitorową wobec ACE, ze względu na ich przewagę nad lekami syntetycznymi
pod względem łagodności, bezpieczeństwa, niezawodności, i braku efektów ubocznych [De
Leo i wsp., 2009; Qu i wsp., 2010; Rao i wsp., 2012].
Do tej pory niejednokrotnie wykazano, że hydroliza protein białka jaja
z zastosowaniem różnych enzymów proteolitycznych prowadzi do uzyskania hydrolizatów
charakteryzujących się wysoką aktywnością inhibitorową wobec konwertazy angiotensyny I
(ACE) [Fujita i wsp., 2000; Miguel i wsp., 2004]. Frakcje wyizolowane przez You i Wu
[2011] z alkalazowych
i termolizynowych
hydrolizatów żółtka wykazały aktywność
inhibitorową wobec enzymu ACE równą kolejno: 52,77 i 86,09 µg/ml. W przedmiotowych
badaniach w wyniku hydrolizy białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja uzyskano hydrolizaty
których aktywność inhibitorowa kształtowała się na poziomie dużo wyższym, między
1,1-23,9
µg/ml.
Aktywność
antyhipertensyjna
pozyskanych
hydrolizatów
białek
poekstrakcyjnych żółtka była również bardziej obiecująca, w porównaniu do zdolności
131
DYSKUSJA
inhibitorowej produktów hydrolizy innych białek żywnościowych, np. roślinnych [Pihlanto
i Mäkinen, 2013]. Przykładowo, różne fermentowane potrawy sojowe wykazują niższe
wartości IC50 wynoszące 0,51; 1,77 i 0,71-17,80 mg/ml dla tempeh, tofu i sosu sojowego
[Kuba i wsp., 2003; Ibe i wsp., 2009]. Natomiast dostępna w handlu chińska pasta sojowa
wykazała podobną aktywność w stosunku do hydrolizatów białek żółtka, gdyż wartość IC50
w jej przypadku wyniosła 12 µg/ml [Li i wsp., 2010].
Na podstawie przeprowadzonych badań zauważono również, że najwyższą
aktywnością antyhipertensyjną charakteryzowały się 4 godzinne hydrolizaty otrzymane
z udziałem proteinazy serynowej z drożdży Yarrowia lipolytica, jak również produkty
głębokiej hydrolizy uzyskane z udziałem proteazy z dyni figolistnej w najwyższej dawce.
Hydrolizaty te, poza wysoką zdolnością inhibitorową wbec enzymu ACE posiadały również
wysoką aktywność przeciwutleniającą, wyrażoną w pierwszym przypadku jako zdolność
wymiatania wolnych rodników a w drugim jako zdolność redukująca i chelatująca. Podobne
wyniki otrzymali Yu i wsp. [2012], w swoich badaniach nad hydrolizatami białek jaja.
Wyizolowane przez nich peptydy wykazały aktywności: antyhipertensyjną i wymiatania
wolnych rodników [Yu i wsp. 2012]. Również z fermentowanych białek rzepaku i lnu
uzyskano hydrolizaty o działaniu inhibitorowym wobec enzymu ACE, jak i o zdolności
hamowania peroksydacji lipidów [Pihlanto i wsp., 2012].
Rozmiar peptydów także odgrywa ważną rolę w kształtowaniu ich aktywności
biologicznej. Udowodniono bowiem, że peptydy przeciwnadciśnieniowe są raczej krótkie
i zawierają tylko od 2 do 9 aminokwasów, natomiast peptydy przeciwutleniające składają się
najczęściej z 3 do 16 reszt aminokwasowych [Kitts i Weiler, 2003]. Uzyskane wyniki
potwierdzają tą tezę, gdyż hydrolizaty o najwyższym stopniu degradacji wykazały
jednocześnie wysokie działanie inhibitorowe, natomiast te, otrzymane po 0,5 godzinnej
reakcji charakteryzowały się najwyższymi aktywnościami przeciwutleniającymi.
7.3.2.4. Aktywność cytotoksyczna/proliferacyjna
Badania cytotoksyczności bioaktywnych peptydów na hodowlach komórkowych in
vitro
stanowią
doskonały wstęp
ogólnie
pojmowanych
badań
toksykologicznych,
niezbędnych do określenia ich prawidłowego działania oraz bezpieczeństwa. Dodatkowo,
testy cytotoksyczności mogą być cenną wskazówką dotyczącą mechanizmu oddziaływania na
komórkę i określić dalszy kierunek badań. Dlatego enzymatyczne hydrolizaty preparatu
białek poekstrakcyjnych podano także ocenie ich cytotoksyczności wobec ludzkich
i zwierzęcych komórek.
132
DYSKUSJA
Na podstawie wykonanych testów nie stwierdzono, aby badane hydrolizaty
wykazywały toksyczny wpływ wobec: – linii komórkowej ludzkich hepatocytów (HepG2),
linii komórkowej ludzkich keratynocytów (HaCaT) oraz linii komórkowej mysich
fibroblastów (Balb 3T3). Świadczy to, o potencjalnej możliwości wykorzystania produktów
hydrolizy
białek
poekstrakcyjnych
żółtka
otrzymanych
z
zastosowaniem
niekonwencjonalnych enzymów, jako dodatków do żywności funkcjonalnej lub kosmetyków.
Liczne badania wykazują, że zarówno białka pochodzenia roślinnego i zwierzęcego
jak i powstające z nich peptydy mogą wykazywać działanie cytotoksyczne [Hartmann i wsp.,
2007]. Opisane w literaturze oddziaływania cytotoksyczne mogą dotyczyć również komórek
nowotworowych [Ishikawa i wsp., 2009; Suarez-Jimenez i wsp., 2012]. Ocena potencjału
uzyskanych hydrolizatów z białek żółtka jako czynników przeciwnowotworowych wymaga
dalszych, szczegółowych badań.
7.3.2.5. Aktywność immunostymulująca
Zarówno immunosupresja jak i immunostymulacja znajdują zastosowanie w różnych
dziedzinach kontroli i leczenia chorób. Leki immunosupresyjne są niezbędne między innymi
w stanach zapalnych wywołanych przez choroby autoimmunologiczne, jak również w celu
zapobiegania odrzuceniu przeszczepów [Agyei i Danquah, 2012]. Niektóre peptydy mogą
działać immunomodulująco i tym samym mają perspektywy wykorzystania jako składniki
leków stosowanych w prewencji lub nawet leczeniu różnorodnych chorób wynikających z
niewłaściwego stylu życia jakimi są, np. nadciśnienie tętnicze lub inne choroby układu
krążenia, cukrzyca, osteoporoza, nowotwory, stres i otyłość [Gill i wsp., 2000; Biziulevičius
i wsp., 2006; Morris i wsp., 2009]. Peptydy immunomodulacyjne mogą być również
włączone do żywności i stanowić bezpieczne zamienniki antybiotyków lub innych środków
farmakologicznych nowej generacji [Agyei i Danquah, 2012].
Interesujące właściwości immunoregulatorowe posiadają peptydy wyizolowane
z hydrolizatów protein białka jaja. Prekursorem jednych z nich jest owomukoid [Mine i
Kovacs -Nolan, 2006]. Wpływają one między innymi na indukcję komórek T, pobudzających
wydzielanie interleukin (IL) 4, 6, 10 oraz 13, ponadto interferonu gamma (IFN).
Immunostymulujące
peptydy
stwierdzono
również
w
hydrolizatach
pepsynowych
(heptapeptyd f 77-84) i chymotrypsynowych owoalbuminy (oktapeptyd f 126-134). Stymulują
one aktywność fagocytarną makrofagów, analogicznie jak peptydy uwolnione z owomucyny
[Mine i Kovacs-Nolan, 2006]. W odróżnieniu do protein białka, niewiele jest danych
dotyczących białek żółtka, jako źródła peptydów o aktywności immunostymulującej. Dopiero
133
DYSKUSJA
ostatnio ukazały się publikacje, w których udowodniono, że białka żółtka mogą być
prekursorami biopeptydów immunostymulujących [Polanowski i wsp., 2012; 2013]. Dlatego
w toku moich badań, otrzymane hydrolizaty poddano również ocenie pod kątem tej
aktywności.
Immunostymulujące działanie wobec antyzapalnej IL-10 oraz prozapalnej IL-6
przeprowadzono na wybranych 0,5 i 4 godzinnych hydrolizatach preparatu białek
poekstrakcyjnych uzyskanych z udziałem enzymów niekonwencjonalnych: proteinazy
z drożdży Yarrowia lipolytica oraz z dyni figolistnej. Jakkolwiek poziom aktywności
induktorowej wobec interleukin 10 i 6 tych hydrolizatów był statystycznie istotny,
w porównaniu do kontroli pozytywnej nie kształtował się na znaczącym poziomie.
Okazuje się, iż działanie immunomodulujące peptydów nie jest do końca specyficzne
jak również nie jest dokładnie poznany ich mechanizm działania [Agyei i Danquah, 2012].
Biziulevičius, i wsp. [2006] wskazują jednak w swoich badaniach, że aktywność
immunostymulująca hydrolizatów białkowych jest często konsekwencją ich aktywności
przeciwdrobnoustrojowej.
Jak
wykazano
w
punkcie
7.3.2.2,
hydrolizaty
białek
poekstrakcyjnych nie hamowały wzrostu komórek bakteryjnych, dlatego w kontekście badań
Biziulevičiusa i wsp., [2006], można wyjaśnić również ich niewielką aktywność
immunostymulującą.
7.3.3. Izolacja peptydów wykazujących najwyższe aktywności biologiczne
Oczyszczanie hydrolizatów białkowych jest pierwszym i podstawowym krokiem
umożliwiającym szczegółowe zbadanie ich właściwości molekularnych a także zrozumienie
ich funkcji biologicznych. Przy czym, do oczyszczenia i izolacji bioaktywnych peptydów
można wykorzystać wiele właściwości protein takich jak ,np. masa cząsteczkowa,
hydrofobowość lub skład aminokwasowy [Ketnawa i Rawdkuen, 2013]. W dalszym etapie
badań podjęto więc próbę izolacji bioaktywnych peptydów z hydrolizatów preparatu białek
poekstrakcyjnych wykazujących najbardziej obiecujące aktywności. Wytypowano do tego
celu 0,5 i 4 godzinne hydrolizaty otrzymane w wyniku działania proteinazy serynowej
z drożdży Yarrowia lipolytica w dawce 40 j/mg oraz 0,5 i 4 godzinne produkty degradacji
enzymu z Cucurbita ficifolia zastosowanego w dawkach kolejno 100 i 1000 j/mg. Procedura
izolacji obejmowała etapy takie jak: ultrafiltracja, sączenie molekularne oraz chromatografia
hydrofobowa w odwróconych fazach w systemie RP-HPLC.
Standardowe procedury izolacji bioaktywnych peptydów z hydrolizatów białek
żywnościowych obejmują etapy takie jak: precypitacja niezhydrolizowanego białka
134
DYSKUSJA
[Graszkiewicz i wsp., 2007], ultrafiltrację [Xu i wsp., 2007], chromatografię cieczową
włączając chromatografię jonowymienną i żelową [Amarowicz i Shahidi, 1997; Xu i wsp.,
2007] oraz końcowo chromatografię hydrofobową (RP-HPLC) [Adebiyi i wsp., 2008].
Jednakże, w zależności od właściwości poszczególnych hydrolizatów, procedury te mogą być
różne. Przykładowo, Saiga i wsp. [2003], w celu wydzielenia przeciwutleniajacych peptydów
z papainowego hydrolizatu mięśni wieprzowych, zastosowali: kationowymienną (złoże AG
50W-X2 resin) i anionowymienną (złoże AG 1-X4) chromatografię, a następnie ultrafiltrację
oraz chromatografię RP-HPLC. Jakkolwiek, Adebiyi i wsp. [2008] wyizolowali czyste
peptydy z hydrolizatów otrąb ryżowych stosując jedynie chromatografię hydrofobową RPHPLC na kolumnie Kaseigel ODS.
7.3.3.1.
Ultrafiltracja
wybranych
hydrolizatów
z
udziałem
membran
polietylenosulfonowych
Ultrafiltracja, to technika powszechnie stosowana zarówno w skali laboratoryjnej jak i
przemysłowej do frakcjonowania, oczyszczania i zatężania białek [Ghosh, 2003].
Frakcjonowanie hydrolizatów za pomocą membran ultrafiltracyjnych umożliwia uzyskanie
bardziej jednorodnego produktu o żądanej masie cząsteczkowej [Guérard, 2007]. Membrany
pozwalające na wyodrębnienie niskocząsteczkowych peptydów są ponadto przydatne do
rozdzielenia niestrawionych protein i pozostałych enzymów [Pihlanto i Mäkinen, 2013].
W większości przypadków, frakcjonowanie hydrolizatów białek poekstrakcyjnych
żółtka jaja na membranach ultrafiltracyjnych prowadziło do wzrostu aktywności
przeciwutleniającej. Łącznie otrzymano osiem frakcji peptydów charakteryzujących się
zróżnicowanymi poziomami aktywności. Ich zdolność do wymiatania wolnych rodników
zawierała się w zakresie od 2,0 do 4,13 µmol trolox/mg, zdolność redukująca w zakresie od
76,2 do 158,9 µg Fe2+/mg, natomiast zdolność do chelatownia jonów żelaza od 0,42 do
440,68 µg Fe2+/mg. Najwyższy wzrost aktywności zaobserwowano w przypadku frakcji 4,
zawierającej peptydy o masie cząsteczkowej <5 kDa, wyodrębnionej z 4 godzinnego
hydrolizatu otrzymanego z udziałem enzymu z dyni figolistnej. W przypadku zdolności
wymiatania wolnych rodników DPPH aktywność wzrosła ponad 3,5-krotnie, natomiast
w przypadku zdolności redukującej FRAP zwiększyła się ponad 2,5-krotnie w stosunku do
hydrolizatu wyjściowego. Podobnie, Park i wsp. [2001] wykazali, że hydrolizaty białek żółtka
jaja o masie cząsteczkowej niższej niż 5 kDa wykazują aktywność przeciwutleniającą i są
najbardziej efektywne w hamowaniu utleniania lipidów. Również Katayama i wsp. [2006]
dowiedli, że drobnocząsteczkowe peptydy o masach cząsteczkowych 1-3 kDa, uzyskane
135
DYSKUSJA
z hydrolizatów foswityny, charakteryzowały się wyższą zdolnością wymiatania wolnych
rodników i okazały się skuteczniejsze w ochronie przed stresem oksydacyjnym ludzkich
komórek nabłonka jelitowego w teście in vitro.
Otrzymane wyniki badań prowadzonych na frakcjach hydrolizatów białek
poekstrakcyjnych wykazały ich znacznie niższą aktywność chelatowania jonów żelaza,
w porównaniu do wyjściowych hydrolizatów. Wyniki te, nie są zgodne z danymi zawartymi
w literaturze. Przykłądowo Feng i wsp. [2006], jak również Jiang i Mine [2001],
z otrzymanych z udziałem trypsyny i poddanych frakcjonowaniu hydrolizatów foswityny,
otrzymali fosfopeptydy o masach cząsteczkowych pomiędzy 1-3 kDa, które wykazywały
wyższą zdolność kompleksowania wybranych metali.
Przeprowadzona procedura ultrafiltracji pozwoliła na zwiększenie aktywności
antyhipertensyjnej w trzech z uzyskanych w przedmiotowej pracy frakcji peptydowych.
Skuteczność tej metody oczyszczania hydrolizatów białkowych w generowaniu frakcji
peptydowych o zdolności inhibitorowej wobec enzymu ACE potwierdzono wieloma
badaniami, które przeprowadzili m.in. Miguel i wsp. [2004] oraz Chiang i wsp. [2008].
Natomiast, Chiang i wsp. [2006] na drodze ultrafiltracji hydrolizatów białek sojowych
otrzymanych z udziałem alkalazy, otrzymali frakcje peptydowe o masie cząsteczkowej
równiej 1 i 10 kDa, dla których wartości IC50 były prawie takie same (kolejno 80 i 78 µg/mg).
Świadczy to tym, że decydujący wpływ na właściwości biologiczne hydrolizatów oraz frakcji
otrzymanych na drodze ultrafiltracji ma nie tylko masa cząsteczkowa obecnych w nich
peptydów, ale także ich sekwencja aminokwasowa [Sarmadi i Ismail, 2010; Ketnawa
i Rawdkuen, 2013].
7.3.3.2. Rozdział wybranych frakcji peptydowych na kolumnie żelowej
Procedura
rozdzielania
peptydów
z
zastosowaniem
chromatografii
żelowej
wykorzystuje również różnicę w masie cząsteczkowej otrzymanych związków i jest
powszechnie stosowana do izolacji bioaktywnych frakcji. Przykładowo sączenie molekularne
na kolumnie Superdex ™ Peptide HR 10/30 z wykorzystaniem 30% acetonitrylu
zawierającego 0,1% TFA do eucji, wykorzystano do uzyskania di-i tri-peptydowych frakcji
białkowych hydrolizatów ziaren gryki o właściwościach antyhipertensyjnych [Li i wsp.,
2002].
Zaproponowana w tej pracy procedura izolacji biopeptydów, obejmująca w pierwszej
kolejności ultrafiltrację, a następnie chromatografię żelową była bardziej efektywna
w porównaniu z procesem frakcjonowania hydrolizatów żółtka opisanym przez You i Wu
136
DYSKUSJA
[2011]. W wyniku chromatografii jonowymiennej, przeprowadzonej na kolumnie
HiPrep16/10 SP FF, otrzymali oni frakcje peptydów, dla których nie uzyskali znaczącego
wzrostu aktywności przeciwutleniającej. Poziom zdolności wymiatania wolnych rodników
DPPH dla tych frakcji pochodzących z hydrolizatu żółtka otrzymanego z udziałem alkalazy
(0,35 µmolTrolox/mg) zawierał się w zakresie od 0,21 do 0,31 µmolTrolox/mg. Podobnie
w przypadku chromatografii otrzymanego przez nich termolizynowego hydrolizatu żółtka
(0,19 µmolTrolox/mg) nie uzyskano wzrostu tej aktywności, a otrzymane frakcje wykazały
zdolność wymiatania wolnych rodników w zakresie od 0,16 do 0,21 µmol trolox/mg.
W przedmiotowej pracy wykazano natomiast znaczny wzrost zdolności redukcji
stopnia utlenienia jonów żelaza Fe+3 oraz aktywności antyhipertensyjnej w większości
subfrakcji pochodzących z hydrolizatu otrzymanego z użyciem enzymu z dyni figolistnej.
Przykładami efektywności podjętej procedury izolacji mogą też być subfrakcje pozyskane
z 0,5 i 4 godzinnych hydrolizatów uzyskanych w wyniku aktywności proteolitycznej proteazy
z drożdży Yarrowia lipolytica. Wykazano dla nich wyższą o około 20% aktywność
wymiatania wolnych rodników DPPH, a także wyższą o ponad 70% aktywność inhibitorową
wobec enzymu ACE, w odniesieniu do frakcji uzyskanych po procesie ultrafiltracji.
Przykładem literaturowym wskazującym wzrost oczekiwanej aktywności biologicznej,
będącej wynikiem procesów oczyszczania, mogą być prace Miguela i wsp. [2004], którzy
wyizolowali trzy frakcje peptydowe z pepsynowego hydrolizatu protein białka jaja
wykazujące wartości IC50 zawarte w zakresie od 10 do 30 µg/ml. Natomiast rezultatem
innych badań prowadzonych przez Fujita i wsp. [2000], było 6 peptydów, których wartości
IC50 były nieporównywalnie wyższe i wyniosły od 0,4 do 15 µmol/l.
Izolacja niektórych subfrakcji peptydowych z białek poekstrakcyjnych żółtka jaja
prowadziła do kilkukrotnego obniżenia poziomu aktywności chelatującej. Przykładem jest
sączenie molekularne hydrolizatu preparatu białek poekstrakcyjnych, otrzymanego z udziałem
proteazy z dyni figolistnej (1000j, 4 godz.). Uzyskane wyniki są potwierdzeniem innych
opracowań naukowych [Amarowicz i wsp., 1997; Li i wsp., 2007], w których wykazano, że
izolacja przeciwutleniajacych peptydów może prowadzić do utraty ich aktywności.
Doświadczenia te były podstawą do stwierdzenia, że korzystnym może być otrzymywanie
frakcji peptydów w mniej oczyszczonej formie, w których prawdopodobnie właściwości
przeciwutleniające wykazuje cały układ zawierający aminokwasy i peptydy o zróżnicowanej
masie cząsteczkowej oraz produkty Maillarda [Flaczyk, 2005].
W toku przeprowadzonych doświadczeń, w najbardziej aktywnych pod względem
przeciwutleniającym i antyhipertensyjnym, subfrakcjach peptydowych, oznaczonych jako:
137
DYSKUSJA
4.2, 4.4., 6.3, 7.5, określono skład aminokwasowy. Właściwości biologiczne hydrolizatów
białkowych i frakcji peptydowych zależą bowiem znacząco od kompozycji jak również
hydrofobowości obecnych w nich aminokwasów [Udenigwe i wsp., 2009; Shahidi i Zhong,
2010; Tang i wsp., 2010; Alemán, i wsp., 2011]. Udowodniono, iż obecność aminokwasów
hydrofobowych, takich jak Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, czy Trp odgrywa ważną rolę
w procesie hamowania peroksydacji lipidów oraz wychwytywania wolnych rodników [Chen
i wsp., 2012]. Niektóre z tych aminokwasów zidentyfikowano w przeważającej ilości we
wszystkich czterech oczyszczonych subfrakcjach, co prawdopodobnie warunkuje ich wysoką
aktywność wymiatania wolnych rodników DPPH (subtrakcja 6.3 i 7.5) lub też wysoką
zdolność redukującą (subtrakcja 4.2 i 4.4). Dodatkowo, najwyższa zdolność zmiatania
wolnych rodników DPPH subtrakcji 7.5, może być tłumaczona jej dużą procentową
zawartością aminokwasów polarnych, takich jak: Asn, Glu, Gln, i Ser, które, zgodnie
z doniesieniami innych autorów także uczestniczą w reakcjach z wolnymi rodnikami
[Pokorny i Korczak, 2001].
Obecność hydrofobowych, aromatycznych lub zawierających rozgałęzione łańcuchy
boczne (Pro) aminokwasów, podobnie jak i duża ilość dodatnio naładowanych
aminokwasów (Lys lub Arg) na C-końcu łańcucha peptydowego generuje silną aktywność
antyhipertensyjną [Forghani i wsp., 2012]. Istotnie, w przedmiotowych badaniach wykazano,
że subfrakcje 4.2 oraz 4.4 charakteryzujące się najwyższą aktywnością inhibitorową wobec
enzymu ACE zawierały w swoim składzie albo wysoką zawartość proliny (4.4), albo też
stosunkowo wiele reszt argininy (4.2).
7.3.3.3.
Rechromatografia
(RP-HPLC)
wybranych
subfrakcji
o
najwyższych
aktywnościach biologicznych i charakterystyka zawartych w nich peptydów
Chromatografia HPLC jest obecnie najczęściej stosowaną techniką oczyszczania
bioaktywnych frakcji oraz najbardziej efektywnym sposobem izolacji peptydów [Gildberg
i wsp., 2011; Gu i wsp., 2011; Ghassem i wsp., 2012]. W celu uzyskania homogennych
biopeptydów warto zastosować kilkustopniowy proces lub kolejno różne kolumny
chromatograficzne [Je i wsp., 2009; Ahn i wsp., 2012]. Przykładowo, Chen i wsp. [2012] po
przeprowadzeniu dwustopniowej chromatografii RP-HPLC wyizolowali z hydrolizatów
białek mięśniowych Amura białego (ryba z rodziny karpiowatych) peptydy, których
aktywność antyhipertensyjna mierzona jako IC50 wzrosła z 55,3 µg/ml do 5,34 µg/ml
w wyniku drugiej rechromatografii, czyli ponad dziesięciokrotnie.
138
DYSKUSJA
Chromatografa i rechromatografia w systemie RP-HPLC były także końcowymi
etapami zaproponowanej procedury oczyszczania i izolacji biopeptydów w przedmiotowej
pracy. Dzięki zastosowanym technikom, udało się wyizolować jednorodne sub-subfrakcje,
które w niektórych przypadkach wykazały kilkukrotny bądź nawet kilkunastokrotny wzrost
biologicznych aktywności, takich jak zdolność wymiatania wolnych rodników, aktywności
redukującej i antyhipertensyjnej.
Najcenniejsze pod względem wybranych aktywności biologicznych sub-subfrakcje
poddano
dalszej
charakterystyce
występujących
w
nich
peptydów,
obejmującej
sekwencjonowanie i analizę mas cząsteczkowych metodą spektrometrii masowej. Wyniki
tych analiz wykazały, że zawierały one peptydy składające się od 9 -ciu do 18 reszt
aminokwasowych. Poza tym, zidentyfikowano jeden dipeptyd. Większość autorów wykazuje,
że wraz ze wzrostem DH zwiększa się liczba krótkich peptydów, które w odróżnieniu od
długołańcuchowych fragmentów białek, posiadają większą zdolność wymiatania wolnych
rodników DPPH [Park i wsp., 2001; Kim i wsp., 2007; Li i wsp., 2007]. W literaturze
opisano wiele antyoksydacyjnych peptydów złożonych jedynie z dwóch lub z trzech reszt
aminokwasowych [Tsuge i wsp., 1991; Yokomizo i wsp., 2002]. Yokomizo i wsp. [2002]
wyizolowali z hydrolizatu białek wytłoczyn sojowych, czyli tzw. okary, poddanych działaniu
Proteinase N, cztery krótkie, antyoksydacyjne peptydy takie jak: Ala-Tyr; Gly-Tyr-Tyr; AlaAsp-Phe i Ser- Asp-Phe. Potwierdzeniem tej teorii jest też otrzymany w tej pracy dipeptyd
RV, uwolniony z hydrolizatu preparatu białek poekstrakcyjnych pod wpływem działania
proteazy serynowej z drożdży Yarrowia lipolytica.
Jednakże, nie tylko krótkołańcuchowym peptydom przypisana jest aktywność
przeciwutleniająca, co także znajduje potwierdzenie w prezentowanych wynikach. Większość
sojowych peptydów złożonych z 3 do 16 reszt aminokwasowych, których wspólną cechą jest
posiadanie w swej strukturze hydrofobowych
aminokwasów, wykazuje silną aktywność
przeciwutleniającą [Pilanto, 2006]. Podobne właściwości posiadają także dwa peptydy
złożone z 13 i 16 reszt aminokwasowych, wyizolowane z hydrolizatu żelatyny
wyekstrahowanej ze skóry ryby „Allasca Pollack” poddanej działaniu Profaze E (Pilanto,
2006). W literaturze opisano też antyoksydacyjne właściwości peptydów o dużo większej
masie cząsteczkowej. Przykładem może być antyoksydacyjny peptyd o masie cząsteczkowej
równej 15 kDa, który został wyizolowany z pepsynowego hydrolizatu mięśni ryby soli
[Pihlanto, 2006].
W ramach przeprowadzonych procedur frakcjonowania hydrolizatów preparatu białek
poekstrakcyjnych uzyskano trzy homogenne peptydy o następującej sekwencji: ITMIAPSAF,
139
DYSKUSJA
RV
i
QSLVSVPGMS.
Peptyd
ITMIAPSAF
został
uwolniony
z
sekwencji
transmembranowego kanałowo-podobnego białka 3, w wyniku działania proteolitycznego
enzymu z dyni figolistnej. Natomiast peptydy QSLVSVPGMS i RV, będące fragmentami
odpowiednio: białka 2 podobnego do translokatora jądrowego receptora węglowodoru
arylowego i
foswityny, zostały uwolnione pod wpływem działania serynowej proteazy
z drożdży Yarrowia lipolytica.
Spośród homogennych peptydów, peptyd ITMIAPSAF charakteryzował się najwyższą
aktywnością inhibitorową, wynoszącą 0,14 µg. Natomiast peptyd QSLVSVPGMS wykazał
aktywność prawie dwukrotnie niższą. Z kolei aktywność inhibitorowa di peptydu RV
osiągnęła wartość równą 0,32 µg. Uzyskane wyniki są potwierdzeniem tego, że zarówno
długołańcuchowe jak i krótkołańcuchowe peptydy pochodzące z białek jaja wykazują
aktywność inhibitorową wobec enzymu ACE. Miguel i wsp. [2004] wyizolowali
z enzymatycznego hydrolizatu białka jaja dwa antyhipertensyjne długołańcuchowe peptydy
o następującej sekwencji: Arg-Ala-Asp-His-Pro-Phe-Leu i Tyr-Ala-Glu-Glu-Arg-Tyr-ProIle-Leu. Aktywność inhibitorową wykazano również w takich długołańcuchowych peptydach
jak Arg-Ala-Asp-His-Pro-Phe [Matoba i wsp., 1999], i Tyr-Gly-Arg-Tyr-Asn-Asp-Leu-GlyHis-Arg [You i wsp., 2010]. Natomiast przykładem krótkołańcuchowych peptydów mogą być
trzy peptydy:
IQW, IRW and LKP wyizolowane z termolizynowego hydrolizatu
ovotransferryny [Majumder i Wu, 2011].
Przede wszystkim peptydy, których komponentami są aminokwasy polarne wykazują
inhibitorową aktywność wobec enzymu ACE. W szczególności obecność reszty proliny
w sekwencji peptydu determinuje jego aktywność [Hartman i Miesel, 2007]. Peptydy:
ITMIAPSAF i QSLVSVPGMS, otrzymane w toku realizacji tej pracy, zawierały w swojej
sekwencji aminokwasowej zarówno prolinę jak i aminokwasy polarne takie jak: treonina
i seryna. Dodatkowo, w kształtowaniu aktywności biologicznej oprócz rodzaju reszt
aminokwasowych duże znaczenie ma także ich położenie w sekwencji peptydu [Forgani
i wsp., 2012]. Najkorzystniej na aktywność inhibitorową wobec enzymu ACE wpływają
reszty tyrozyny i cysteiny zlokalizowane na C-końcu peptydu oraz rozgałęzione alifatyczne
aminokwasy (Val, Ile lub Leu) obecne na N-końcu [Wu i wsp., 2006]. Ariyoshi [1993]
wskazał również, że wysoką aktywność antyhipertensyjną może determinować obecność na
C-końcu peptydu takich aminokwasów jak Tyr, Trp lub Phe. Wynika więc z tego, że wysoka
aktywność antyhipertensyjna peptydu ITMIAPSAF wyizolowanego w przedmiotowej pracy,
związana jest również z występowaniem izoleucyny oraz fenyloalaniny kolejno na jego na
jego N- i C-końcu.
140
DYSKUSJA
Peptyd QSLVSVPGMS, charakteryzował się wysoką zdolnością do wymiatania
wolnych rodników DPPH, która osiągnęła poziom 5,1 µmol trolox/mg. Obecność
w strukturze peptydu hydrofobowych reszt aminokwasowych takich jak Pro, His, Tyr, Trp,
Met, Val oraz Leu ma wpływ na wystąpienie aktywności przeciwutleniającej, a ich
lokalizacja w łańcuchu peptydowym na zwiększenie tej aktywności [Park i wsp., 2001;
Yokomizo i wsp., 2002; Ranathunga i wsp., 2006]. Otrzymany peptyd wewnątrz struktury
posiada dwie reszty waliny a także resztę leucyny i proliny, które są charakterystycznymi
składnikami większości peptydów o silnych właściwościach antyoksydacyjnych [Park i wsp.,
2001; Yokomizoi wsp., 2002; Pihlanto, 2006]. Dodatkowo, reszty Leu i Val umożliwiające
oddziaływania peptydu na granicy faz, mogą ułatwić proces wymiatania wolnych rodników
w fazie lipidowej [Ranathunga i wsp., 2006].
Mimo, że dipeptyd RV wykazał niższe aktywności w porównaniu do dwóch
pozostałych związków wyizolowanych z homogennych sub-subfrakcji, jak wykazały badania
Schindlera i wsp. [2011], który otrzymał taki sam peptyd z hydrolizatów białek ryb, posiada
on dodatkową właściwość kształtowania smaku słonego. Może więc znaleźć zastosowanie
jako składnik bezsodowych przypraw przeznaczonych między innymi dla diabetyków i osób
z nadciśnieniem tętniczym oraz zostać wykorzystany w diecie prewencyjnej w stosunku do
chorób cywilizacyjnych [Dziuba i Fornal, 2009].
7.3.4. Otrzymywanie syntetycznych peptydów i ocena ich aktywności biologicznej
W toku procesów izolacyjnych otrzymano również trzy niehomogenne sub-subfrakcje
z hydrolizatu uzyskanego z udziałem enzymu dyniowego, z których każda składała
się z dwóch peptydów. W sub-subfrakcji o numerze 4.2.2 znajdował się jeden dziewięcioi drugi pietnasto-aminokwasowy peptyd (VVSGPYIVY i LLGAVASMGALLCAP), subsubfrakcja 4.4.3.1 zawierała dwa nona peptydy (RASDPLLSV i RNDDLNYIQ), natomiast w
skład sub-subfrakcji 4.4.4.1 wchodziły peptydy składające się z 12 i 18 reszt
aminokwasowych (LAPSLPGKPKPD i AGTTCLFTPLALPYDYSH). Jednoznacznej oceny
bioaktywności peptydów zawartych w sub-subfrakcjach 4.4.3.1 oraz 4.4.4.1 dokonano po ich
syntezie chemicznej.
Najwyższą aktywność przeciwutleniającą i antyhipertensyjną przejawiał peptyd
o sekwencji LAPSLPGKPKPD. Warto również zaznaczyć, iż jego zdolność wymiatania
wolnych rodników oraz aktywność inhibitorowa wobec ACE, które osiągnęły poziom kolejno
6,03 µM trolox/mg oraz 0,11 µg, były najwyższe wśród wszystkich otrzymanych związków
peptydowych. Wysoką aktywność przeciwrodnikową, równą 4,71 µM trolox/mg wykazał
141
DYSKUSJA
również peptyd RASDPLLSV pochodzący z sub-subfrakcji 4.4.3.1. Wielu autorów
potwierdza, że masa cząsteczkowa większości antyoksydacyjnych peptydów pochodzących
z białek żywnościowych waha się w granicach 500-1800 Da [Jun i wsp., 2004; Je i wsp.,
2005; Ranathunga i wsp., 2006; Park i wsp., 2010]. Co więcej, często hydrofobowe reszty
aminokwasowe, takie jak Val i Leu na N-końcu peptydów oraz obecność proliny w ich
sekwencji determinują silne właściwości przeciwutleniające [Chen i wsp., 1995; Elias i wsp.,
2008, Ren i wsp., 2008]. Oba analizowane peptydy zawierały w swojej sekwencji wiele
hydrofobowych aminokwasów, takich jak Ala, Leu oraz Pro. Dodatkowo, peptyd
LAPSLPGKPKPD posiadał leucynę na N- końcu. Poza tym, najwyższa aktywność
biologiczna tego związku może być determinowana jego specyficzną sekwencją
aminokwasową. Peptyd ten wykazuje bowiem pewne podobieństwo strukturalne do peptydu
RVPSL (fragment PSL) wyizolowanego z białek jaja, który, jak wykazano w badaniach Yu i
wsp. [2012], posiada silny potencjał przeciwrodnikowego i antyhipertensyjnego działania.
Dodatkowo, sekwencja trzech aminokwasów występująca na N- końcu tego związku jest
bardzo podobna do sekwencji tri peptydów: Leu-Gln-Pro i Leu-Leu-Pro wyizolowanych
z glutenu pszenicy i białek jęczmienia, o znanej aktywności inhibitorowej wobec ACE
[Pihlanto i Mäkinen, 2013]. Wcześniej wykazano, że trzy inne silne inhibitory ACE, o
podobnej sekwencji: Leu-Arg-Pro, Leu-Ser-Pro i Leu-Gln-Pro otrzymane z termolizynowych
hydrolizatów białek kukurydzy, po dożylnym podaniu (30 mg/kg masy ciała), pozwoliły na
zmniejszenie ciśnienia tętniczego krwi u szczurów o 15 mm Hg [Miyoshi i wsp., 1991].
Jednakowa
aktywność inhibitorowa wobec ACE wykazana przez dwa peptydy
RASDPLLSV oraz RNDDLNYIQ zidentyfikowane w sub-subfrakcji 4.4.3.1, może być
natomiast
wynikiem
obecności
w
ich
strukturze
dodatnio
naładowanych
reszt
aminokwasowych. Stwierdzono bowiem, że aminokwasy takie jak Arg i Lys, położone
głównie w pozycji środkowej, ułatwiają wiązanie peptydu do centrum aktywnego enzymu
ACE, a zatem wzmagają aktywność antyhipertensyjną [Majumder i Wu, 2010; Wu i wsp.,
2006].
142
DYSKUSJA
7.4. Hydroliza białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja w warunkach przemysłowych przy
udziale proteinazy z Bacillus amyloliquefaciens.
Mimo, że bioaktywne peptydy mają duży potencjał wykorzystania w przemyśle
żywnościowym i kosmetycznym, istnieją pewne ograniczenia w produkcji ich dużych
ilości, w celu zaspokojenia rosnącego wymagania rynku. Brak optymalizacji produkcji
peptydów w skali laboratoryjnej, jak również pewne bariery technologiczno-ekonomiczne
sprawiają, że zbyt mało bioprocesów adaptowanych jest na skalę przemysłową i jednocześnie
niewiele bioaktywnych peptydów trafia na rynek konsumencki [Agyei i Danquah, 2012].
Dlatego też, coraz częściej zwraca się uwagę na nowe technologie pozyskiwania i izolacji
bioaktywnych związków z produktów żywnościowych, które można zastosować na większa
skalę. Pewne postępy już zostały dokonane, poprzez wykorzystanie reaktora ciągłego
i procesów ultrafiltracji do produkcji i rozdziału peptydów w warunkach przemysłowych
[Korhonen i Pihlanto, 2006]. Szacuje się jednak, że procesy oczyszczania i etapy izolacji
w biotechnologicznych procesach przemysłowych mogą stanowić aż do 70% kapitału oraz
znacznie zwiększać koszty eksploatacyjne [Brady i wsp., 2008].
Jak wykazano w poprzednich punktach przedmiotowej pracy, hydroliza enzymatyczna
stanowi doskonałą metodę zagospodarowania bogatych w białko produktów ubocznych
uzyskanych z żółtka jaja po ekstrakcji fosfolipidów metodą etanolową przeprowadzoną
w Parku Technologicznym we Wrocławiu.
Niektóre z hydrolizatów w postaci
nieoczyszczonej wykazywały bardzo wysoką aktywność przeciwutleniającą (chelatującą) czy
antyhipertensyjną, co wskazuje na możliwość ich dalszego wykorzystania w wielu gałęziach
przemysłu. Założono więc, że proces degradacji enzymatycznej kontynuowany w skali
przemysłowej, bez przeprowadzania dodatkowych procesów izolacyjnych, może być
wykorzystany do dalszej modyfikacji powstałego produktu ubocznego i umożliwić uzyskanie
bioaktywnych hydrolizatów. Wcześniejsze procesy doświadczalne wykonane w laboratorium
wykorzystano zatem do optymalizacji warunków i wyboru odpowiedniego enzymu.
Również Young i wsp. [2010] analizowali możliwości wykorzystania szeregu
enzymów lub też kombinacji proteaz bakteryjnych w celu pozyskania fosfopeptydów z białek
żółtka jaja, które posiadałyby właściwości antyoksydacyjne. Ich wyniki wykazały,
że nieoczyszczone hydolizaty białek żółtka, otrzymane na drodze degradacji enzymatycznej
z wykorzystaniem alkalazy i proteazy N (z Bacillus subtilis), posiadały silne działanie
przeciwutleniające. Potwierdza to więc teorię, że odtłuszczone EYP może być traktowane
jako doskonałe źródło nowych antyoksydacyjnych peptydów.
143
DYSKUSJA
7.4.1. Hydroliza enzymatyczna
Hydrolizę preparatu białek żółtka, otrzymanego jako produkt uboczny procesu
ekstrakcji fosfolipidów, przeprowadzono z użyciem neutrazy, pozyskanej z bakterii Bacillus
amyloliquefaciens. Enzym ten wykorzystywany był już do hydrolizy takich białek
żywnościowych jak białka sojowe [Xiangzhen i wsp., 2007], gluten [Siriporn i wsp., 2008]
czy kolagen [May-June i wsp., 2010]. Kinetykę i postęp hydrolizy monitorowano poprzez
oznaczenie stopnia hydrolizy (DH) i przyrostu wolnych grup aminowych oraz analizę RPHPLC. Stopień hydrolizy białek żółtka po 2h reakcji wyniósł 27,6%.
Również Wang i Wang [2009] przeprowadzili kontrolowaną hydrolizę białek żółtka
jaja z udziałem proteaz z Bacillus amyloliquefanciens oraz z Bacillus licheniformis w celu
poprawy właściwości funkcjonalnych. Uzyskali oni jednak znacznie mniejszy stopień
degradacji białek równy kolejno: 3% i 6%. Postęp hydrolizy produktu ubocznego z żółtka
jaja potwierdza również przyrost zawartości wolnych grup aminowych w trakcie trwania
reakcji. Po 0,5 godzinie hydrolizy zawartość wolnych grup aminowych wyniosła 5215,77 µM
Gly/g, podczas gdy końcowe ich stężenie osiągnęło poziom 6524,61 µM Gly / g białka. Profil
białkowo-peptydowy RP-HPLC wykazał różnice w hydrofobowości generowanych
peptydów. Hydrolizat otrzymany po 2 godzinnej degradacji scharakteryzowano także pod
względem mas cząsteczkowych obecnych w nim peptydów. Proces hydrolizy pozwolił na
wygenerowanie peptydów o masach cząsteczkowych równych 41,2; 27,9 oraz 4,9 kDa.
7.4.2. Aktywności biologiczne uzyskanego hydrolizatu
W
przeprowadzonych
badaniach,
aktywność
antyoksydacyjną
uzyskanych
hydrolizatów oszacowano na podstawie analizy zdolności wymiatania wolnych rodników
DPPH, która kształtowała się na poziomie 0,33 µM trolox/mg, aktywności redukcji stopnia
utlenienia jonów żelaza, która osiągnęła poziom 176,68 µg Fe2 +/ mg oraz zdolności
chelatowania jonów żelaza, która wyniosła 289,00 µg Fe2+/mg. Jest to zgodne z wynikami
uzyskanymi przez Sakanaka i Tachibana [2006], który udowodnili, że hydrolizaty uzyskane
podczas hydrolizy żółtek jaja najpierw alkalazą a następnie proteinazą z Bacillus ssp.
wykazały silne działanie antyoksydacyjne. Xu i wsp. [2007] wykazali natomiast silne
działanie przeciwutleniające oligopeptydów pochodzących od foswityny żółtka jaja.
Prowadzone badania wykazały wyższy poziom prawie wszystkich aktywności biologicznych
uzyskanego hydrolizatu białek poekstrakcyjnych, w porównaniu do natywnego białka.
W wyniku hydrolizy zwiększa się bowiem liczba uwolnionych czynnych peptydów
i aminokwasów, co pozwala na ich oddziaływanie z utleniaczami [Kong i Xiong, 2006].
144
DYSKUSJA
Wu i wsp. [2003], w swoich badaniach potwierdzili wzrost aktywności przeciwutleniajacej
w wyniku postępu hydrolizy. Dowiedli między innymi, że głęboka hydroliza białek makreli
prowadzi do uzyskania peptydów wykazujących wyższą aktywność antyoksydacyjną niż
produkty ich częściowej hydrolizy [Wu i wsp., 2003]. .
Hydrolizaty żółtka jaja wykazały również aktywność antyhipertensyjną, kształtującą
się na poziomie IC50=57,30 µg/ml. Według Hartman i Miesel [2007], wysoką aktywność
hamowania enzymu ACE wykazują w szczególności krótkołańcuchowe peptydy zawierające
przynajmniej jedną resztę aminokwasową proliny. Natomiast Kumar i wsp. [2010] wskazuje
dodatkowo na obecność w takich peptydach reszt seryny. Wyniki składu aminokwasowego
otrzymanych 2 godzinnych hydrolizatów żółtka jaja potwierdzają obecność seryny w ilości
9,21% oraz stosunkowo dużej ilości proliny (4,86%). Poza tym, analiza składu
aminokwasowego finalnego hydrolizatu wykazała także duże ilości procentowe takich
aminokwasów jak Asx i Glx. Wielu autorów wskazuje, że aminokwasy o charakterze
kwasowym takie jak Glu, Gln, Asp, Asn mogą inaktywować działania prooksydacyjne
wolnych rodników [Zhang i wsp., 2001, Chen i wsp., 2012].
145
WNIOSKI
8. PODSUMOWANIE I WNIOSKI
1.
Zastosowanie
metody
hydrolizy
enzymatycznej
preparatu
foswitynowego,
immunoglobuliny Y oraz preparatu białek stanowiących produkt uboczny po ekstrakcji
fosfolipidów z żółtka jaja, jest obiecującym sposobem ich zagospodarowania
i waloryzacji.
2.
Spośród wykorzystanych w procesie hydrolizy enzymów proteolitycznych, zarówno
pochodzenia mikrobiologicznego jak i roślinnego, szczególnie efektywna okazała się
proteinaza z owoców dyni figolistnej, w wyniku działania której osiągnięto najwyższy
stopień hydrolizy (DH%) preparatu białek poekstrakcyjnych (46,6%) oraz proteinaza
serynowa z drożdży Yarrowia lipolytica, dzięki której uzyskano wysoki stopień
degradacji preparatu foswitynowego i IgY (kolejno 27,5% i 29,5%).
3.
Otrzymane w wyniku degradacji enzymatycznej hydrolizaty przejawiały aktywność
biologiczną, której spektrum oraz poziom uzależnione były od zastosowanych warunków
procesu.
4.
Otrzymane hydrolizaty nie były toksyczne wobec ludzkich komórek linii: keratynocytów
(HaCaT) oraz hepatocytów (HepG2), a także linii komórkowej mysich fibroblastów
(Balb 3T3).
5.
Najlepszymi aktywnościami przeciwutleniającymi, szczególnie w aspekcie zdolności
wymiatania wolnych rodników DPPH oraz chelatowania jonów żelaza, charakteryzowały
się hydrolizaty immunoglobuliny IgY oraz białek poekstrakcyjnych żółtka.
6.
Niekonwencjonalne
proteazy
z
drożdży
Yarrowia
lipolytica
okazały
się
najefektywniejszymi enzymami w uwalnianiu peptydów z białek żółtka jaja,
wykazujących aktywność przeciwutleniającą.
7.
Uzyskane hydrolizaty białek żółtka jaja nie przejawiały istotnej aktywności
antymikrobiologicznej.
146
WNIOSKI
8.
Dzięki zastosowaniu wielostopniowej procedury izolacji obejmującej proces ultrafiltracji,
chromatografii żelowej oraz RP-HPLC uzyskano znaczny wzrost aktywności
biologicznych peptydów oraz wyodrębniono homogenne frakcje.
9. W wyniku procesu oczyszczania hydrolizatów białkowych zmniejszała się stopniowo
zdolność otrzymanych frakcji do chelatowania jonów żelaza Fe+2.
10. W wyniku oczyszczania hydrolizatów preparatu białek poekstrakcyjnych otrzymano
i zidentyfikowano 9 biologicznie czynnych peptydów, które przejawiały szerokie
spektrum aktywności biologicznych, takich jak: zdolność do wymiatania wolnych
rodników
DPPH,
zdolność
redukcji
stopnia
utleniania
jonów
Fe2+
i przeciwnadiśnieniową, wyrażoną jako aktywność inhibitorowa wobec konwertazy ACE.
11. Najwyższą aktywność inhibitorową wobec konwertazy ACE przejawiały dwa peptydy
wyizolowane z hydrolizatu preparatu białek poekstrakcyjnych otrzymanego z udziałem
proteazy dyniowej. Były to: nonapeptyd stanowiący fragment transmembranowego
kanałowo-podobnego białka 3 o sekwencji: ITMIAPSAF oraz dodekapeptyd o sekwencji
LAPSLPGKPKPD, zidentyfikowany jako fragment białka uczestniczącego w regulacji
różnicowania tkanek narządu wzroku. Oba peptydy wykazywały również aktywność
przeciwutleniającą.
12. Najwyższą aktywność zmiatania wolnych rodników DPPH posiadał dodekapeptyd
LAPSLPGKPKPD oraz dekapeptyd wyizolowany z hydrolizatu preparatu białek
poekstrakcyjnych, który otrzymano z udziałem drożdżowej proteinazy serynowej. Peptyd
ten, o sekwencji: QSLVSVPGMS, stanowił fragment białka 2 podobnego do
translokatora jądrowego receptora węglowodoru arylowego. Wykazywał on również
aktywność antyhipertensyjną.
13. Przeprowadzona w warunkach przemysłowych hydroliza enzymatyczna białkowych
produktów ubocznych z treści jaja pozwala na otrzymanie hydrolizatów o atrakcyjnych
właściwościach biologicznych.
147
LISTA TABEL I RYSUNKÓW
Lista tabel
2.1
Zestawienie ważniejszych protein jaja (Trziszka, 2000)………..…………...………...
18
2.2
Zestawienie najważniejszych białek żółtka (Zambrowicz, 2009)...............................
22
2.3
Zestawienie ważniejszych bioaktywnych peptydów wyizolowanych z żółtka
jaja (opracowanie własne)……………………………………………………………………
39
Przyrost stężenia wolnych grup aminowych po hydrolizie wyczerpującej
substratów białkowych wykorzystywanych do badań oraz ich aktywność
przeciwutleniająca i antyhipertensyjna……………………………………………………
59
Aktywność przeciwutleniająca standardowych przeciwutleniaczy syntetycznych
wykorzystywanych w technologii żywności wyrażona jako zdolność
wymiatania wolnych rodników DPPH, zdolność redukcji stopnia utlenienia
jonów żelaza oraz aktywność chelatowania jonów żelaza…………………………….
59
Aktywność przeciwutleniająca wyrażona jako zdolność wymiatania wolnych
rodników DPPH, zdolność redukcji stopnia utlenienia jonów żelaza oraz
aktywność chelatowania jonów żelaza, hydrolizatów preparatu foswitynowego i
immunoglobuliny IgY………………………………………………………………………...
69
Zestawienie aktywności ptrzeciwutleniającej, antyhipertensyjnej i
przeciwdrobnoustrojowej hydrolizatów białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja
uzyskanych po zastosowaniu różnych enzymów proteolitycznych lub sekwencji
dwóch enzymów……………………………………………………………………………….
82
Aktywności biologiczne frakcji hydrolizatów białek poekstrakcyjnych z żółtka
jaja uzyskanych po procesie ultrafiltracji z wykorzystaniem membran
polietylenosulfonowych………………………………………………………………………
87
Zestawienie hydrolizatów wyjściowych białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja
oraz frakcji peptydów uzyskanych po procesie ultrafiltracji i chromatografii
żelowej wykazujących najwyższe aktywności biologiczne…………………………...
91
Wyniki analizy składu aminokwasowego wyizolowanych frakcji peptydów
uzyskanych po procesie ultrafiltracji i chromatografii żelowej oraz białka
wzorcowego…………………………………………………………………………………….
92
Zestawienie zidentyfikowanych bioaktywnych peptydów wyizolowanych za
pomocą technik ultrafiltracji, chromatografii żelowej oraz rechromatografii
hydrolizatów białek poekstrakcyjnych żółtka jaja otrzymanych z udziałem
proteinaz serynowych z C.ficifolia oraz z Y. lipolytica………………………………...
103
Porównanie wartości m/z z widm masowych peptydów otrzymanych metodą
syntezy chemicznej do wartości obliczonych……………………………………………
106
6.1
6.2
6.3
6.4
6.5
6.6
6.7
6.8
6.9
148
LISTA TABEL I RYSUNKÓW
6.10
6.11
6.12
Aktywność ptrzeciwutleniająca i antyhipertensyjna peptydów otrzymanych na
drodze syntezy chemicznej w porównaniu do aktywności sub-subfrakcji
oczyszczonych z 4-godzinnego hydrolizatu preparatu białek poekstrakcyjnych z
żółtka jaja otrzymanych z udziałem proteinazy z C. ficifolia………………………...
107
Wyniki analizy składu aminokwasowego enzymatycznego hydrolizatu białek
poekstrakcyjnych z żółtka jaja uzyskanego przy udziale neutrazy - proteinazy z
B. amyloliquefaciens oraz z białka wzorcowego………………………………………..
112
Aktywność ptrzeciwutleniająca, antyhipertensyjna i przeciwdrobnoustrojowa 2godzinnego hydrolizatu preparatu białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja
otrzymanego z udziałem proteinazy z B. amyloliquefaciens………………………….
113
Lista rysunków
2.1
Ogólny schemat frakcjonowania żółtka (Laca i wsp., 2010)…………………………
23
5.1
Ogólny schemat układu doświadczenia…………………………………………………...
56
6.1
Profile RP-HPLC substratów białkowych: preparatu foswitynowego,
immunoglobuliny Y oraz białek żółtka uzyskanych po izolacji fosfolipidów
metodą ekstrakcji chemicznej……………………………………………………………….
57
Elektroforeza denaturująca w 12% żelu poliakrylamidowym białek
poekstrakcyjnych żółtka jaja………………………………………………………………...
58
6.2
6.3
6.4
6.5
6.6
6.7
6.8
Stopień hydrolizy (DH %) preparatu foswitynowego uzyskany w wyniku
zastosowania różnych enzymów proteolitycznych, a także sekwencji lub
kombinacji dwóch enzymów..................................................................................................
61
Stopień hydrolizy (DH %) immunoglobuliny Y uzyskany w wyniku
zastosowania różnych enzymów proteolitycznych, a także sekwencji lub
kombinacji dwóch enzymów………………………………………………………………..
62
Przyrost stężenia wolnych grup aminowych w hydrolizatach preparatu
foswitynowego uzyskany w wyniku zastosowania różnych enzymów
proteolitycznych, a także sekwencji lub kombinacji dwóch enzymów…………….
63
Przyrost stężenia wolnych grup aminowych w hydrolizatach immunoglobuliny
IgY uzyskany w wyniku zastosowania różnych enzymów proteolitycznych, a
także sekwencji lub kombinacji dwóch enzymów……………………………………...
64
Profile białkowo-peptydowe RP-HPLC enzymatycznych hydrolizatów
preparatu
foswitynowego…………………………………………………………………………………
65
Profile bialkowo-peptydowe RP-HPLC enzymatycznych hydrolizatów
149
LISTA TABEL I RYSUNKÓW
6.9
6.10
6.11
6.12
6.13
6.14
6.15
6.16
6.17
6.18
6.19
6.20
immunoglobuliny Y…………………………………………………………………………...
66
Stopień hydrolizy (DH %) hydrolizatów białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja
uzyskanych po zastosowaniu różnych enzymów proteolitycznych lub sekwencji
dwóch enzymów……………………………………………………………………………….
73
Przyrost stężenia wolnych grup aminowych w hydrolizatach białek
poekstrakcyjnych z żółtka jaja uzyskanych po zastosowaniu różnych enzymów
proteolitycznych lub sekwencji dwóch enzymów………………………………………
74
Profile białkowo-peptydowe RP-HPLC enzymatycznych hydrolizatów białek
poekstrakcyjnych z żółtka jaja………………………………………………………………
76
Aktywność przeciwutleniająca wyrażona jako zdolność wymiatania wolnych
rodników DPPH, zdolność redukcji stopnia utlenienia jonów żelaza (FRAP)
oraz aktywność chelatowania jonów żelaza, hydrolizatów białek
poekstrakcyjnych z żółtka jaja uzyskanych po zastosowaniu różnych enzymów
proteolitycznych lub sekwencji dwóch enzymów………………………………………
78
Aktywność inhibitorowa wobec enzymu ACE (IC50) 3 i 4 godzinnych
hydrolizatów białek poekstrakcyjnych z żółtka jaja uzyskanych po
zastosowaniu różnych enzymów proteolitycznych lub sekwencji dwóch
enzymów………………………………………………………………………………………...
81
Aktywność cytotoksyczna/proliferacyjna hydrolizatów białek poekstrakcyjnych
z żółtka jaja……………………………………………………………………………………...
84
Schemat procesu ultrafiltracji hydrolizatów białek poekstrakcyjnych z żółtka
jaja………………………………………………………………………………………………...
86
Chromatografia żelowa frakcji 4, zawierającej peptydy o masach <5 kDa,
otrzymanej w procesie ultrafiltracji 4-godzinnego hydrolizatu proteinazy z
C.ficifolia zastosowanej w dawce 1000 j/mg………………………………………….…
88
Chromatografia żelowa frakcji 6, zawierającej peptydy o masach <5 kDa,
otrzymanej w procesie ultrafiltracji 0,5-godzinnego hydrolizatu proteinazy
serynowej z Y. lipolytica zastosowanej w dawce 40 j/mg……………………………..
89
Chromatografia żelowa frakcji 7, zawierającej peptydy o masach >5 kDa,
otrzymanej w procesie ultrafiltracji 4-godzinnego hydrolizatu proteinazy
serynowej z Y. lipolytica zastosowanej w dawce 40 j/mg……………………………..
90
Rechromatografia subfrakcji 4.2. za pomocą kolumny Zorbax XDB-C18 Agilent
o wymiarach 4,5 x 250 mm oraz 1,8 x 50 mm………………………………………….
93
Widmo MS (Maldi Tof) subfrakcji peptydów 4.2.2 uzyskanej po procesie
ultrafiltracji, chromatografii żelowej oraz rechromatografii 4-godzinnego
hydrolizatu otrzymanego z udziałem proteinazy z C.ficifolia zastosowanej w
dawce 1000 j/mg……………………………………………………………………………….
94
150
LISTA TABEL I RYSUNKÓW
Rechromatografia frakcji 4.4. za pomocą kolumny Zorbax XDB-C18 Agilent o
wymiarach 4,5 x 250 mm oraz 4,5 x 150 mm…………………………………………..
95
Widma MS (Maldi Tof) subfrakcji peptydów 4.4.3.1, 4.4.4.1 oraz 4.4.4.2
uzyskanych po procesie ultrafiltracji, chromatografii żelowej oraz
rechromatografii 4-godzinnego hydrolizatu otrzymanego z udziałem proteinazy
z C.ficifolia zastosowanej w dawce 1000 j/mg…………………………………………..
97
Rechromatografia frakcji 6.3 za pomocą kolumny Zorbax XDB-C18 Agilent o
wymiarach 4,5 x 250 mm oraz 4,5 x 150 mm…………………………………………..
99
Sekwencjonowanie od N-końca subfrakcji peptydów 6.3.4 uzyskanych po
procesie ultrafiltracji, chromatografii żelowej oraz rechromatografii 0,5godzinnego hydrolizatu proteinazy serynowej z Y. lipolytica zastosowanej w
dawce 40 j/mg…………………………………………………………………………………..
100
Rechromatografia frakcji 7.5 za pomocą kolumny Zorbax XDB-C18 Agilent o
wymiarach 4,5 x 250 mm oraz 4,5 x 150 mm……………………………...……...……
101
Widmo MS (Maldi Tof) subfrakcji peptydów 7.5.2 uzyskanej po procesie
ultrafiltracji, chromatografii żelowej oraz rechromatografii 4-godzinnego
hydrolizatu proteinazy serynowej z Y. lipolytica zastosowanej w dawce 40 j/mg.
102
6.27
Analiza RP-HPLC peptydów uzyskanych na drodze syntezy chemicznej………...
104
6.28
Analiza HR-ESI-MS peptydów uzyskanych na drodze syntezy chemicznej……...
106
6.29
Stopień hydrolizy (DH %) oraz przyrost stężenia wolnych grup aminowych
(WGA) w 0,5 i 2-godzinnych hydrolizatach preparatu białek poekstrakcyjnych
z żółtka jaja otrzymanych z udziałem proteinazy z B. amyloliquefaciens (N)……
110
6.21
6.22
6.23
6.24
6.25
6.26
6.30
6.31
Profile białkowo-peptydowe RP-HPLC enzymatycznych hydrolizatów białek
poekstrakcyjnych z żółtka jaja uzyskanych przy udziale neutrazy - proteinazy z
B. amyloliquefaciens…………………………………………………………………………..
Chromatografia żelowa frakcji 2-godzinnego hydrolizatu preparatu białek
poekstrakcyjnych z żółtka jaja otrzymanego z udziałem proteinazy z B.
amyloliquefaciens…………………………………………….………………………………..
111
111
.
151
LITERATURA
9. LITERATURA
1.
Abdou, A. M., Higashiguchi, S., Aboueleinin, A. M., Kim, M., Ibrahim, H. R. (2007).
Antimicrobial peptides derived from hen egg lysozyme with inhibitory effect against
Bacillus species. Food Control., 18, 173-178.
2.
Abdou, A. M., Kim, M., Sato, K. (2013) Functional Proteins and Peptides of Hen’s Egg
Origin. Hernandez-Ledesma B. i Hsieh C. C. (red.) Bioactive Food Peptides in Health
and Disease. InTech Janeza Trdine 9, Croatia.
3.
Adebiyi, A. P., Adebiyi, A. O., Yamashita, J., Ogawa, T., Muramoto, K. (2008).
Purification and characterization of antioxidative peptides from unfractionated rice bran
protein hydrolysates. Inter J Food Sci Technol., 43, 35-43.
4.
Agyare, K. K., Xiong, Y. L., Addo, K. (2008). Influence of salt and pH on the solubility
and structural characteristics of transglutaminase-treated wheat gluten hydrolysate. Food
Chem., 107(3), 1131–1137.
5.
Agyei, D., Danquah, M. K. (2012). Rethinking food-derived bioactive peptides for
antimicrobial and immunomodulatory activities. Trends Food Sci Tech., 23, 62-69.
6.
Ahn, C. B., Jeon, Y. J., Kim, Y. T., Je J.Y. (2012). Angiotensin I converting enzyme
(ACE) inhibitory peptides from salmon byproduct protein hydrolysate by Alcalase
hydrolysis. Process Biochem., 47, 2240-2245.
7.
Ahn, D. U., Ko, K. Y. (2004). Economical separation of value-added components from
egg yolk. Proceedings: The 3rd International Symposium on Egg Nutrition for Health
promotion. April 18-21, Banff, Alberta Canada.
8.
Akita, E. M., Nakai, S. (1992). Immunoglobulins from egg yolks: isolation and
purification. J. Food Sci., 57, 629-634.
9.
Alemán, A., Giménez, B., Montero, P., Gómez-Guillén, M. C. (2011). Antioxidant
activity of several marine skin gelatins. LWT Food Sci Tech., 44, 407−413.
10.
Aluko, R. E., Keeratiurai, M., Mine, Y. (1998). Competitive adsorption between egg yolk
lipoproteins and whey proteins on oil-in-water interfaces. Colloids and Surfaces B:
Biointerfaces, 10, 385–393.
11.
Aluko, R. E., McIntosh, T. (2005). Limited enzymatic proteolysis increases the level of
incorporation of canola proteins into mayonnaise. Innovat Food Sci Emerg Tech., 6, 195202.
152
LITERATURA
12.
Amarowicz, R., Shahidi, F. (1997). Antioxidant activity of peptide fractions of capelin
protein hydrolysates. Food Chem., 58, 355-359.
13.
Anantharaman, K., Finot, P. A. (1993). Nutritional Aspects of Food Proteins in Relation
to Technology. Food Rev Int., 9, 629-655.
14.
Anton, M., Gandemer, G. (1997). Composition, solubility and emulsifying properties of
granules and plasma from egg yolk. J Food Sci., 62, 484–487.
15.
Ardo, Y., Polychroniadou, A. (1999). Analysis of free fatty acids, in Laboratory manual
for chemical analysis of cheese. Publication Office of The European Communities,
Luxemburg.
16.
Ariyoshi, Y. (1993) Angiotensin-converting enzyme inhibitors derived from food
proteins. Trends Food Sci Tech., 4, 139-144.
17.
Arunachalam, K. D., Raja, R. B. (2010). Isolation and characterization of CPP (casein
phosphopeptides) from fermented milk. Afr J Food Sci., 4, 167–75.
18.
Atanassov, A., Tchorbanov, B. (2009). Synthetic and natural peptides as antithrombotic
agents—a view on the current development. Biotechnol Biotechnol., 1, 1109–1114.
19.
Awade, A. C., Efstathiou, T. (1999). Comparison of three liquid chromatographic
methods for egg white protein analysis. J Chrom. B., 723, 69–74.
20.
Azuma, N., Suda, H., Iwasaki, H., Yamagata, N., Saeki, T., Kanamoto, R., Iwami, K.
(2000). Antitumorigenic effects of several food proteins in a rat model with colon cancer
and their reverse correlation with plasma bile acid concentration. J Nutr Sci Vitaminol.,
46, 91-96.
21.
Beckerich, J. M., Boisramé-Baudevin, A., Gaillardin, C. (1998). Yarrowia lipolytica: a
model organism for protein secretion studies. Internatl Microbiol., 1, 123–130.
22.
Belitz, H. B., Grosch, W., Schieberle, P. (2009). Food Chem.,. Forth revised and extended
edition, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg. 1070.
23.
Beltrami, L., Zingale, L. C. (2006). Angiotensin-converting enzyme inhibitorrelated
angioedema: How to deal with it. Expert Opin Drug Saf., 5, 643–649.
24.
Bengtsson, G., Marklund, S. E., Olivecrona, T. (1977). Protein components of very low
density lipoproteins from hen’s egg yolk. Eur J Biochem., 79(1), 211–223.
25.
Benzie, I. F. F., Strain, J. J. (1996). The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a
measure of “Antioxidant Power”: the FRAP assay. Anal. Biochem., 293, 70-76.
26.
Biziulevičius, G. A. (2004). How food-borne peptides may give rise to their
immunostimulatory activities: a look through the microbiologist’s window into the
immunologist’s garden (hypothesis). Br J Nutr., 92(06), 1009-1012.
153
LITERATURA
27.
Biziulevičius, G. A., Kislukhina, O. V., Kazlauskaitè, J., Žukaitè, V. (2006). Food-protein
enzymatic hydrolysates possess both antimicrobial and immunostimulatory activities: a
‘cause and effect’ theory of bifunctionality. FEMS Immunol Med Microbiol., 46(1), 131138.
28.
Bougatef, A., Balti, R., Nedjar-Arroume, N., Ravallec, R., Adje, E.Y., Souissi, N.,
Lassoued, I., Guillochon, D., Nasri, M. (2010). Evaluation of angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activities of smooth hound (Mustelus mustelus) muscle protein
hydrolysates generated by gastrointestinal proteases: identification of the most potent
active peptide. Eur Food Res Tech., 231(1), 127-135.
29.
Brady, R., Woonton, B., Gee, M. L., O’Connor, A. J. (2008). Hierarchical mesoporous
silica materials for separation of functional food ingredients e a review. Innovat Food Sci
Emerg Tech., 9(2), 243-248.
30.
Burley, R. W., Vahedra, D. V. (1989). In The avian egg: Chemistry and biology New
York: Wiley, 35-37.
31.
Byrne, B. M., van Het Schip, A. D., van de Klundert, J. A. M., Arnberg, A. C, Gruber, M.,
Geert, A. B. (1984). Amino acid sequence of phosvitin derived from the nucleotide
sequence of part of the chicken vitellogenin gene. Biochem., 23, 4275–42759.
32.
Cao, G., Prior, R. L. (1998). Comparison of different analytical methods for assessing
total antioxidant capacity of human serum. Clin. Chem., 44, 1309–1315.
33.
Cao, W., Zhang, C., Hong, P., Ji, H., Hao, J. (2010). Purification and identification of an
ACE inhibitory peptide from the peptic hydrolysates of Acetes chinensis and its
antihypertensive effects in spontaneously hypertensive rats. Int J Food Sci Tech., 45(1),
959-965.
34.
Castellani, O., Belhomme, C., David-Briand, E., Guérin-Dubiard, C., Anton, M. (2006).
Oil-in-water emulsion properties and interfacial characteristics of hen egg yolk phosvitin.
Food Hydrocoll., 20, 35-43.
35.
Castellani, O., David-Briand, E., Guerin-Dubiard, C., Anton, M. (2005). Effect of
aggregation and sodium salt on emulsifying properties of egg yolk phosvitin. Food
Hydrocoll., 19(4), 769–776.
36.
Castellani, O., Gu´erin-Dubiard, C., David-Briand, E., Anton, M. (2004). Influence of
physicochemical conditions and technological treatments on the iron binding capacity of
egg yolk phosvitin. Food Chem., 85, 569–77.
37.
Causeret, D., Matringe, E., Lorient, D. (1991). Ionic strength and pH effects on
composition and microstructure of yolk granules. J Food Sci., 56, 1532–1536.
154
LITERATURA
38.
Chabance, B., Marteau, P., Rambaud, J. C., Migliore-Samour, D., Boynard, M., Perrotin,
P., Guillet, R., Jolles, P., Fiat, A. M. (1998). Casein peptide release and passage to the
blood in humans during digestion of milk or yogurt. Biochimie., 80(2), 155–65.
39.
Chan, W. C., White, P. D. (2000). Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical
approach. Oxford, Oxford University Press, 341.
40.
Chellapan, S., Jasmin, C., Basheer, S., Elyas, K. K., Bhat, S. G., Chandrasekaran, M.
(2006). Production, purification and partial characterization of a novel protease from
marine Engyodontium album BTMFS 10 under solid state fermentation. Process
Biochem., 41(4), 956-961.
41.
Chen, C., Chi, Y. J., Zhao, M. Y., Lv, L. (2012a). Purification and identification of
antioxidant peptides from egg white protein hydrolysate. Amino Acids., 43(1), 457-66.
42.
Chen, C., Chi, Y. J., Zhao, M. Y., Xu, W. (2012b). Influence of degree of hydrolysis on
functional properties, antioxidant and ACE inhibitory activities of egg white protein
hydrolysate. J Food Sci Biotechnol., 21(1), 27-34.
43.
Chen, H. M., Muramoto, K., Yamauchi, F. (1995). Structural analysis of antioxidative
peptides from soybean b-conglycinin. J Agr Food Chem., 43, 574–578.
44.
Chen, H. M., Muramoto, K., Yamauchi, F., Fujimoto, K., Nokihara, K. (1998)
Antioxidative properties of histidine-containing peptides designed from peptide fragments
found in the digests of a soybean protein. J. Agric Food Chem. 46, 49–53.
45.
Chiang, W. D., Tsou, M. J., Tsai, Z. Y., Tsai, T. C. (2006) Angiotensin I-converting
enzyme inhibitor derived from soy protein hydrolysate and produced by using membrane
reactor. Food Chem. 98, 725–732.
46.
Chiang, W. D., Tsou, M. J., Weng, C. H., Tsai, T. C. (2008). Production of angiotensin Iconverting enzyme inhibitor derived from egg white protein hydrolysates using a
membrane reactor. J Food Drug Anal., 16, 54-60.
47.
Chiou, V. (2003). Isolation of IgY (DFc) Antibodies. US Patent 6608172.
48.
Choi, I., Jung, C., Choi, H., Kim, C., Ha, H. (2005). Effectiveness of phosvitin peptides on
enhancing bioavailability of calcium and its accumulation in bones. Food Chem., 93, 577583.
49.
Choi, I., Jung, C., Seog, H., Choi, H. (2004). Purification of phosvitin from egg yolk and
determination of its physicochemical properties. Food Sci Biotechnol., 13, 434-437.
50.
Chrzanowska, J. (1998). Enzymatyczne modyfikacje białek mleka. Technologia Żywności
XII Zeszyty Naukowe Akademii Rolniczej we Wrocławiu. 328, 23-37.
155
LITERATURA
51.
Chrzanowska, J., Kołaczkowska, M. (1998). Production of extracellular proteolytic
enzymes by Beauveria bassiana. Acta Mycol., 33, 277-285.
52.
Clemente, A. (2000). Enzymatic protein hydrolysates in human nutrition. Trends Food
Sci. Tech., 11, 254 -262.
53.
Coelho, M. A. Z., Amaral, P. F. F., Belo, I. Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse.
Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and
Microbial Biotechnology., 930-944
54.
Coleman, M. A., (1996). Oral administration of chicken yolk immunoglobulins to lower
somatic cell count in the milk of lactating ruminants. US Patent 5, 585-598.
55.
Córdova, M. J. H., Navarrete del Toro, M. A., García Carreño, F. (2007). Concentrates of
fish protein from bycatch species produced by various drying processes. Food Chem.,
100(2), 705-711.
56.
Curotto, E., González, G., O'Reilly, S., Tapia, G., (1989). FEBS Lett., 243, 363–365.
57.
Curotto, E., Gonzfilez, G., O'Reilly, S., Tapia, G. (1988). Isolation and partial
characterization of a protease from Cucurbita ficifolia. FEBS Lett., 243(2), 363-365.
58.
Czajgucka, A., (2002). Charakterystyka uzdolnień hydrolitycznych szczepów drożdży
wydzielonych z serów pleśniowych. Praca doktorska wykonana w Katedrze Technologii
Surowców Zwierzęcych i Zarządzania Jakością, Uniwersytetu Przyrodniczego we
Wrocławiu.
59.
Damodaran, S., Paraf, A., (ed). (1997). Food proteins and their applications. New York:
Marcel-Dekker. 681.
60.
Darewicz, M., Dziuba, J., Caessens, P.W. J. R. (2000). Effect of enzymatic hydrolysis on
the emulsifying and foaming properties of milk proteins - a review. Pol J Food Nutr Sci.,
9(1), 3-8.
61.
Davalõs, A., Migiel, M., Bartolome, B., López–Fandiňo, R. (2004). Antioxidant activity
of peptides derived from egg white proteins by enzymatic hydrolysis. J. Food Prot., 67,
1939-1944.
62.
Davis, C., Reeves, R. (2002). High value opportunities from the chicken egg. A report for
the Rural Industries Research and Development Corporation 02/094.
63.
De Leo, F., Panarese, S., Gallerani, R., & Ceci, L. R. (2009). Angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory peptides: Production and implementation of functional food.
Curr Pharmaceut Des., 15, 3622–3643.
156
LITERATURA
64.
Desert, C., Guerin-Dubiard, C., Nau, F., Jan, G., Val, F., Maillard, J. (2001). Comparison
of different electrophoretic separations of hen egg white proteins. J Agr Food Chem., 49,
4553–4561.
65.
Dias da Silva, W., Tambourgi, D. V. (2010). IgY: a promising antibody for use in
immunodiagnostic and in immunotherapy. Vet Immunol Immunopathol., 135(3-4), 173–
180.
66.
Diaz, M., Dunn, C. M., McClements, D. J., Decker, E. A. (2003). Use of
caseinophosphopeptides as natural antioxidants in oil-in-water emulsions. J. Agric. Food
Chem., 51, 2365–2370.
67.
Donovan, J. W., Mapes, C. J. (1976). A differential scanning calorimetric study of
conversion of ovalbumin to S-ovalbumin in eggs. J. Sci. Food Agric., 27, 197.
68.
Dryjański, M., Otlewski, J., Polanowski, A., Wilusz, T. (1990). Serine proteinase from
Cucurbita ficifolia seed; purification, properties, substrate specificity and action on native
squash trypsin inhibitor (CMTI I). Biol. Chem. Hoppe-Seyler,. 371, 889–895.
69.
Duarte de Holanda, H., Netto, F. M. (2006). Recovery of components from shrimp
(Xiphopenaeus kroyeri) processing waste by enzymatic hydrolysis. J Food Sci., 71(5),
298–303.
70.
Dyer-Hurdon, J. N., Nnanna, I. A. (1993). Cholesterol content and functionality of plasma
and granules fractionated from egg yolk. J Food Sci., 58, 1277–1281.
71.
Dziuba, J., Fornal, Ł. (red.). (2009). Biologicznie aktywne peptydy i białka żywności.
Wyd. Naukowo-Techniczne, Warszawa.
72.
Dziuba, J., Iwaniak, A., Minkiewicz, P. (2003). Computer-aided characteristics of proteins
as potential precursors of bioactive peptides. Polimery., 48(1), 50–53.
73.
Eckert, E., Pokora, M., Zambrowicz, A., Szołtysik, M., Dąbrowska, A., Chrzanowska, J.,
Trziszka, T. (2013). The application of microbial proteases to obtain egg yolk protein
hydrolysates with antioxidant and antimicrobial activity. ŻNTJ. 20(1), 105-118.
74.
Eckert, E., Zambrowicz, A., Pokora, M., Szołtysik, M., Dąbrowska, A. Chrzanowska J.,
Różański, H., Trziszka T. (2013). Biologically active peptides derived from hen eggs and
another animal origin food proteins. World Poultry Sci J., 69(2), 375-386.
75.
Edman, P. (1950). Method for determination of the amino acid sequence in peptides. Acta
Chem., Scand., 4, 283-293.
76.
Elias, R. J., Kellerby, S. S, Decker, E. A. (2008). Antioxidant activity of proteins and
peptides. Crit Rev Food Sci Nutr., 48(5), 430-411.
157
LITERATURA
77.
Erhard, M. H., Bergmann, J., Renner, M., Hofmann, A., Heinritzi, K. (1996) Prophylactic
effect of specific egg yolk antibodies in diarrhea of weaned piglets caused by Escherichia
coli K88 (F4). J Vet Med., A, 43, 217–223.
78.
Farinazzo, A., Restuccia, U., Bachi, A., Guerrier, L., Fortis, F., Boschetti, E., Rasoli, E.,
Citterio, A., Righetti, P. G. (2009). Chicken egg yolk cytoplasmic proteome, mined via
combinatorial peptide ligand libraries. J Chrom., A, 1216, 1241-1252.
79.
Feng, F., Mine, Y. (2006). Phosvitin phosphopeptides increase iron uptake in a Caco-2
cell monolayer model. Int J Food Sci Techn., 41, 455-458.
80.
Fichtali, J., Charter, E. A., Lo, K. V., Nakai, S. (1993). Purification of antibodies from
industrially separated egg yolk. J Food Sci., 58(6), 1282–1290.
81.
Fickers, P., Marty, A., Nicaud, J. M. (2011). The lipases from Yarrowia lipolytica:
Genetics, production, regulation, biochemical characterization and biotechnological
applications. Biotechnol Adv., 29, 632–644
82.
FitzGerald, R. J., G. O'Cuinn. (2006). Enzymatic debittering of food protein hydrolysates.
Biotechnol. Advan., 24, 234-237.
83.
Flaczyk, E. (2005). Właściwości przeciwutleniające enzymatycznych i kwasowych
hydrolizatów białkowych ze szczególnym uwzględnieniem ich aktywności wobec
cholesterolu. Roczniki Akademii Rolniczej w Poznaniu. 361, 1-39
84.
Foltz, M., Cerstiaens, A., van Meensel, A., Mols, R., van der Pijl, P. C., Duchateau, G. S.
M. J. E., Augustijns, P. (2008) The angiotensin converting enzyme inhibitory tripeptides
Ile-Pro-Pro and Val-Pro-Pro show increasing permeabilities with increasing physiological
relevance of absorption models. Peptides., 29, 1312–1320.
85.
Forghan,i B., Ebrahimpour, A., Bakar, J., Hamid, A. A., Hassan, Z., Saari, N. (2012).
Enzyme hydrolysates from Stichopus horrens as a new source for angiotensin-converting
enzyme inhibitory peptides. Corp. Evidence- Based Comp. Alt. Med., 1, 1-9.
86.
Froning, G. W. (1994). New Product Innovations from Eggs. New and Developing
Sources of Food Proteins, 71-94.
87.
Fu, C. Y., Huang, H., Wang, X. M., Liu, Y. G., Wang, Z. G., Cui, S. J., Gao, H. L., Li, Z.,
Li, J. P., Kong, X. G. (2006). Preparation and evaluation of anti-SARS coronavirus IgY
from yolks of immunized SPF chickens. J. Virol. Methods, 133, 112-115.
88.
Fujita, H., Yokoyama, K., Yoshikawa, M. (2000). Classification and antihypertensive
activity of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food
proteins. J. Food Sci., 65, 564-569.
158
LITERATURA
89.
Galyean, R. D., Cotterill, O. J. (1979). Chromatography and electrophoresis of native and
spray-dried egg white. J Food Sci., 44, 1345–1349.
90.
Gasteiger, E., Hoogland, C., Gattiker, A., Duvaud, S., Wilkins, M. R., Appel, R. D.,
Bairoch A. (2005). Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server.
From: “The Proteomics Protocols Handbook.” (Eds.) Walker, J. M., Totowa, N. J., USA
Humana Press Inc., 571-607
91.
Gdula, A., Chrzanowska, J., Szołtysik, M., Kiezel, X., Wojtatowicz, M., (2002). Factors
affecting hydrolytic enzymes production by Yarrowia lipolityca strains. Biotechnol., 1,
81–88.
92.
Ge, S. J., Zhang, L. X. (1993). Control of hydrolysis of a protein modification with
immobilized protease by the pH-Drop method. Acta Biotechnol., 13(2), 151-160.
93.
Gharavi, N., Haggarty, S., El-Kadi, A.O. (2007). Chemoprotective and carcinogenic
effects of tert-butylhydroquinone and its metabolites. Curr. Drug Metab. 8, 1–7.
94.
Ghassem, M., Arihara, K., Babji, A. S. (2012). Isolation, purification and characterisation
of angiotensin Iconverting enzyme-nhibitory peptides derived from catfish (Clarias
batrachus) muscle protein thermolysin hydrolysates. Int. J. Food Sci.Tech., 47(11), 24442451.
95.
Ghosh, R. (2003). Ultrafiltration: An overview. In R. Ghosh (Ed.), Protein bioseparation
using ultrafiltration: Theory, applications and new developments. London: Imperial
College Press., 13-15.
96.
Gibbs, B. F., Zougman, A., Masse, R., Mulligan, C. (2004). Production and
characterization of bioactive peptides from soy hydrolysate and soy–fermented food. Food
Res Int., 37, 123–131.
97.
Gildberg, A., Arnesen, J. A., Suthera, B. S., Rauib, J., Stenberg E. (2011). Angiotensin Iconverting enzyme inhibitory activity in a hydrolysate of proteins from Northern shrimp
(Pandalus borealis) and identification of two novel inhibitory tri-peptides. Process
Biochem., 46, 2205-2209.
98.
Gill, H. S., Doull, F., Rutherfurd, K. J., Cross, M. L. (2000). Immunoregulatory peptides
in bovine milk. Br J Nutr., 84(1), 111-117.
99.
Gill, I., López-Fandino, R. L., Jorba, X., Vulfson, E. N. (1996). Biologically active
peptides and enzymatic approaches to their production. Enzym Microb Tech., 18(3), 162183.
159
LITERATURA
100. Gilmartin, L., Jervis, L. (2002). Production of cod (Gadus morhua) muscle hydrolysates:
influence of combinations of commercial enzyme preparation on hydrolysate peptide size
range. J Agr Food Chem., 50(19), 5417-5423.
101. Glasser, S. P. (2001). Hypertension syndrome and cardiovascular events. High blood
pressure is only one risk factor. Postgrad Med., 110(5), 29–36.
102. Gołąb, K., Gburek, J., Gaweł, A., Warwas, M. (2002). Changes in chicken egg white
cystatin concentration and isoforms during embryogenesis. Br Poultry Sci., 42, 394–398.
103. Gołąb, K., Warwas, M. (2005). Białka jaja kurzego – właściwości biochemiczne i
zastosowania. Adv Clin Exp Med., 5, 1001–1010.
104. Gonzalez-Lopez, C. I., Szabo, R., Blanchin-Roland, S., Gaillardin, C. (2002). Genetic
control of extracellular protease synthesis in the yeast Yarrowia lipolytica. Genetics.,
160(2), 417-427.
105. Goulas, A., Triplett, E. L., Taborsky, G. (1996). Oligophosphopeptides of varied structural
complexity derived from the egg phosphoprotein, phosvitin. J Protein Chem., 15, 1–9.
106. Graszkiewicz, A. (2005) Podatność frakcji kazeinowych na działanie peptydaz drożdży
wyizolowanych z sera. Praca magisterska wykonana w Katedrze Technologii Surowców
Zwierzęcych i Zarządzana Jakością we Wrocławiu.
107. Graszkiewicz, A., Żelazko, M., Trziszka, T., Polanowski, A. (2007). Antioxidative
capacity of hydrolysates of hen egg proteins. Pol. J. Food Nutr. Sci., 57, 195-199.
108. Greenbaum, D., Colangelo, C., Williams, K., Gerstein, M. (2003). Comparing protein
abundance and mRNA expression levels on a genomic scale. Genome Biol., 4(9), 117.
109. Gu, R. Z., Li, C. Y., Liu, W. Y., Yi, W. X., Cai M. Y. (2011). Angiotensin I-converting
enzyme inhibitory activity of low-molecular-weight peptides from Atlantic salmon (Salmo
salar L.) skin. Food Res. Int., 44, 1536-1540.
110. Guérard, F. (2007). Enzymatic methods for marine by-products recovery. In: Shahidi F
editor. Maximizing the value of marine by-products. Campridge: Woodward Publishing
Limited., 107–143.
111. Guler, L., Ok, U., Gunduz, K., Gulcu, Y., Hadimli, H. H. (2005). Antimicrobial
susceptibility and coagulase gene typing of Staphylococcus aureus isolated from bovine
clinical mastitis cases in Turkey. J Dairy Sci., 88, 3149–3154.
112. Guzmán, F., Barberis, S., Illanes, A. (2007). Peptide synthesis: chemical or enzymatic.
Electron J Biotechnol., 10(2), 279-314.
113. Haas, M., Moolenaar, F., Meijer, D. K. F., De Zeeuw, D. (2002). Specific drug delivery to
the kidney. Cardiovasc Drugs Ther., 16, 489–495.
160
LITERATURA
114. Hansen, M., Sandstrӧm, B., Jensen, M., Sorensen, S. S. (1997). Effect of casein
phosphopeptides on zinc and calcium absorption from bread meals. J Trace Elem Med
Biol., 11, 143–149.
115. Hansen, M., Sandstrӧm, B., Lӧnnerdal, B. (1996). The effect of casein phosphopeptides
on zinc and calcium absorption from high phytate infant diets assessed in rat pups and
Caco-2 cells. Pediatr Res., 40, 547–52.
116. Hartman, R., Miesel, H. (2007). Food-deroved peptides with biological activity: from
research to food applications. Curr Opin Biotechnol., 18, 163-169.
117. Hartmann, R., Wal, J. M., Bernard, H., Pentzien, A. K. (2007). Cytotoxic and Allergenic
Potential of Bioactive Proteins and Peptides. Curr Pharmaceut Des., 13(9), 897.
118. Hasanov, H., Boboev, A., Yotova, L., Turabdjanov, S. (2011). Effect of Hydrolysis
Products of Different Proteins of Wheat on Antioxidant Enzymes. Int. J. Bioautomation.,
15(1), 5-12.
119. Hatta, H., Tsuda, K., Akachi, S., Kim, M., Yamamoto, T. (1993). Productivity and some
properties of egg yolk antibody (IgY) against human rotavirus compared with rabbit IgG.
Biosci Biotechnol Biochem., 57(3), 450-454.
120. Herbert, B., Galvani, M., Hamdan, M., Olivieri, E., MacCarthy, J., Pedersen, S., Righetti,
P. G. (2001). Reduction and alkylation of proteins in preparation of two-dimensional map
analysis: why, when and how? Electrophoresis, 22, 2046–2057.
121. Hernell, O., Lonnerdal, B. (2003). Nutritional evaluation of protein hydrolysate formulas
in healthy term infants: Plasma amino acids, hematology, and trace elements. Am J Clin
Nutr., 78, 296–301.
122. Herrmann, G., Schwarz, A., Wandrey, C., Kula, M. R., Knaup, G., Drauz, K. H., Berndt,
H. (1991). Scale up of enzymatic peptide synthesis in an enzyme membrane reactor.
Biotechnol Appl Biochem., 13, 346-353.
123. Huopalati, R. Lopez-Fandino, M. A., Schade, R. (2007). Bioactive egg compounds. Adv
Clini Exp Med., 14(5), 1001–1010.
124. Ibe, S., Yoshida, K., Kumada, K., Tsurushin, S., Furusho, T., Otobe, K. (2009)
Antihypertensive effects of natto, a traditional Japanese fermented food, in spontaneously
hypertensive rats. Food Sci Technol Res., 15, 199-202.
125. Ibrahim, H. R., Iwamori, E., Sugimoto, Y., Aoki, T. (1998). Identification of a distinct
antibacterial domain within the N-lobe of ovotransferrin. Biochim. Biophys. Acta.,
1401(3), 289-303.
161
LITERATURA
126. Ibrahim, H. R., Sugimoto, Y., Aoki, T. (2000). Ovotransferrin antimicrobial peptide
(OTAP-92) kills bacteria through a membrane damage mechanism. BBA., 1523, 196-205.
127. Ishikawa S., Asano T., Takenoshita S., Nozawa Y., Arihara K., Itoh M. (2009). Egg yolk
proteins suppress azoxymethane-induced aberrant crypt foci formation and cell
proliferation in the colon of rats. Nutrition Res., 29, 64–69.
128. Ishikawa, S., Yano, Y., Arihara, K., Itoh, M. (2004). Egg yolk phosvitin inhibits hydroxyl
radical formation from the fenton reaction. Biosci Biotechnol Biochem., 68, 1324-1331.
129. Itoh, T., Abe, Y., Adachi, S. (1983). Comparative studies on the α- and β-phosvitin from
hen’s egg yolk. J Food Sci., 48, 1755-1758.
130. Je, J. Y., Kim, S. Y., Kim, S. K. (2005). Preparation and antioxidative activity of hoki
frame protein hydrolysate using ultrafiltration membranes. Eur Food Res Tech., 221, 157–
162.
131. Je, J. Y., Lee, K. H., Lee, M. H., Ahn C. B. (2009). Antioxidant and antihypertensive
protein hydrolysates produced from tuna liver by enzymatic hydrolysis. Food Res. Int., 42,
1266-1272.
132. Jiang, B., Mine, Y. (2000). Preparation of novel functional oligophosphopeptides from
hen egg yolk phosvitin. J Agric Food Chem., 48, 990–994.
133. Jiang, B., Mine, Y. (2001). Phosphopeptides derived from hen egg yolk phosvitin: effect
of molecular size on the calcium-binding properties. Biosci Biotechnol Biochem., 65,
1187-1190.
134. Jiang, Y., Noh, S.K., Koo, S.I. (2001). Egg phosphatidylcholine decreases the lymphatic
absorption of cholesterol in rats. J Nutr., 131, 2358-2363.
135. Jin, L. Z., Samuel, K. B., Ronald, R. M., Andrew, A. F. (1998). In vitro inhibition of
adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli K88 to piglet intestinal mucus by egg-yolk
antibodies. FEMS Immunol Med Microbiol., 21, 313–321.
136. Jun, S. Y., Park, P. J., Jung, W. K., Kim, S. K. (2004). Purification and characterization of
an antioxidant peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera)
frame protein. Eur Food Res Tech., 219, 20-26.
137. Juneja, L. R., Kim, M. (1997). Egg yolk proteins. In: Hen Eggs: their basic and applied
science. Yamamoto, T., Juneja, L.R., Hatta, H., Kim, M., CRC Press, New York, 57-71.
138. Jung, S., Kim, D. H., Son, J. H., Nam, K., Ahn, D. U., Jo, C. (2012). The functional
property of egg yolk phosvitin as a melanogenesis inhibitor. Food Chem., 1, 135(3), 993998.
162
LITERATURA
139. Kananen, A., Savolainen, J., Mäkinen, J., Perttilä, U., Myllykoski, L., Pihlanto- Leppälä,
A. (2000). Influence of chemical modification oh whey protein conformation on
hydrolysis with pepsin and trypsin. Int. Dairy J., 10, 691-697.
140. Katayama, S., Ishikawa, S., Fan, M. Z., Mine, Y. (2007). Oligophosphopeptides derived
from egg yolk phosvitin up-regulate gamma-glutamylcysteine synthetase and antioxidant
enzymes against oxidative stress in Caco-2 cells. J Agric Food Chem., 55, 28,29-35.
141. Katayama, S., Xu, X., Fan, M.Z., Mine, Y. (2006). Antioxidative stress activity of
oligophosphopeptides derived from egg yolk phosvitin in Caco-2 cells. J Agr Food Chem.,
54, 773-778.
142. Ketnawa, S., Rawdkuen, S. (2013). Purification and characterization of ace inhibitory
peptide from aquatic resources: a review. Int J Plant, Animal Environ Sci., 3(1), 220-233.
143. Khan, M. A. S., Nakamura, S., Ogawa, M., Akita, E., Azakami, H., Kato, A. (2000).
Bactericidal Action of Egg Yolk Phosvitin against Escherichia coli under Thermal Stress.
J. Agric. Food Chem., 48 (5), 1503–1506.
144. Kies, A. K., Van Der Pijl, P. (2012) Peptide availability. USA Patent Application
20120040895.
145. Kim, H. K., Chun, D. S., Kim, J. S. (2006). Expression of the cationic antimicrobial
peptide lactoferricin fused with the anionic peptide in Escherichia coli. App Gen Mol
Biotechnol. 72, 330–338.
146. Kim, S. B., Seo, I. S., Khan, M. A., Ki, K .S, Nam, M. S., Kim, H. S. (2007). Separation
of iron-binding protein from whey trough enzymatic hydrolysis. Int. Dairy J., 17, 625631.
147. Kimmerlin, T., Seebach, D. (2005). ‘100 years of peptide synthesis': ligation methods for
peptide and protein synthesis with applications to b-peptide assemblies. J Pept Res., 65(2),
229-260.
148. Kitts, D. D. (2005). Antioxidant properties of casein-phosphopeptides. Trends Food Sci
Tech., 16, 549–554.
149. Kitts, D. D., Weiler, K. (2003). Bioactive proteins and peptides from food sources.
Applications of bioprocesses used in isolation and recovery. Curr Pharm Des., 9(16),
1309-1323.
150. Kobayashi, K., Hattori, M., Hara-Kudo, Y., Okubo, T., Ymamamoto, S., Takita, T.,
Sugita-Konishi, Y. (2004). Glycopeptide derived from hen egg ovomucin has the ability to
bind enterohemorrhagic Escherichia coli O 157:H7. J. Agric. Food Chem., 52, 5740-5746.
163
LITERATURA
151. Kołakowski, E. (2005). Enzymy i ich wykorzystanie w modyfikacji białek
Żywnościowych: Enzymatyczna modyfikacja składnikow żywności. Red. Kołakowski E.,
Bednarski W., Bielecki S., Wyd. Akad. Roln., Szczecin. 31-99.
152. Kong, B. H., Xiong Y. L. (2006). Antioxidant activity of zein hydrolysates in a liposome
system and the possible mode of action. J. Agric. Food Chem., 54, 6059–6068.
153. Kong, X., Zhou, H., Qian, H. (2007). Enzymatic hydrolysis of wheat gluten by proteases
and properties of the resulting hydrolysates. Food Chem. 102, 759-763.
154. Korant, B., T. Towatari, L. Ivanoff, C. Kettner, A. Cordova, Petteway, S. (1986). Viruses
as Vectors for Cysteine Proteases. In: Cysteine Proteinases and Their Inhibitors, pp. 293305. (V. Turk, Ed.) Walter de Gruyter, Berlin.
155. Korhonen, H., Pihlanto, A. (2003). Food-derived bioactive peptides - opportunities for
designing future foods. Curr Pharmaceut Design., 9, 1297–1308.
156. Korhonen, H., Pihlanto, A. (2006). Bioactive peptides: production and functionality. Int
Dairy J., 16(9), 945-960.
157. Kovacs-Nolan, J., Mine, Y. (2012). Egg Yolk Antibodies for Passive Immunity. Ann Rev
Food Sci Tech., 3, 163-182
158. Kroger, M., Meister, K., Kava, R. (2006). Low-calorie sweeteners and other sugar
substitutes. A review of the safety issues. Compr Rev. Food Sci Food Saf., 5, 35-47.
159. Kuba, M., Tanaka, K., Tawata, S., Takeda, Y., Yasuda, M. (2003). Angiotensin Iconverting enzyme inhibitory peptides isolated from tofuyo fermented soybean food.
Biosci. biotech. biochem., 67, 1278-1283.
160. Kuchroo, C. N., Ramilly, J., Fox, P. F. (1983). Assessment of proteolysis in cheese of
reaction with trinitrobenzene sulphonic-acid. Irish J. Food Sci. Technol., 7, 129-133.
161. Kullman, W. (1979). Enzymatic synthesis of Leu- and Metenkephalin. Biochem Biophys
Res Comm., 91(2), 693-698.
162. Kumar, S., Saravana Kumar, M., Raja, B. (2010). Efficacy of piperine, an alkaloidal
constituent of pepper on nitric oxide, antioxidants and lipid peroxidation markers in LNAME induced hypertensive rats. Int J Res Pharm Sci., 1, 300-307.
163. Kunitz, M. (1945). Crystalline soybean trypsin inhibitor. J Gen Physiol., 30, 291- 310.
164. Kurizaki, J. I., Yamauchi, K., Isshiki, H., Ogiwara, S. (1981). Difference between α- and
β-lipovitellin from hen egg yolk. Agr Biol Chem., 45, 699-704.
165. Laca, A., Pardes, B., Diaz, M. (2010). A method of egg yolk fractionation.
Characterization of fractions. Food Hydrocoll., 24, 434-443
164
LITERATURA
166. Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during assembly of the head of
bacteriophage 4. Nature (London), 227, 680-685.
167. Larsson, A., Bålöw, R. M., Lindahl, T. L., Forsberg, P. O. (1993). Chicken antibodies:
taking advantage of evolution--a review. Poult Sci., 2(10), 1807-1812.
168. Lavoie, J. L., Sigmund, C. D. (2003). Minireview: Overview of the renin-angiotensin
system - An endocrine and paracrine system. Endocrinol., 144, 2179-2189.
169. Le Denmat, M., Anton, M., Beaumal, V. (2000). Characterisation of emulsion properties
and of interface composition in oil-in-water emulsions prepared with hen egg yolk, plasma
and granules. Food Hydrocoll., 14, 539-549.
170. Lee, E. N., Sunwoo, H. H., Menninen, K., Sim, J. S. (2002). In vitro studies of chicken
egg yolk antibody (IgY) against Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium.
Poultry Sci., 81, 632–641.
171. Lee, J. K., Yun, J. H., Jeon, J. K., Kim, S. K., Byun, H. G. (2010). Effect of antioxidant
peptide isolated from Brachionus calciflorus. J Korean Soc Appl Biol Chem., 53(2), 192197.
172. Leem, K. H., Kim, M. G., Kim, H. K., Oi, Y., Kim, M. (2004). Effect of egg yolk proteins
on the longitudinal bone growth in rat, Page 200 in Proc. 16thAnnual meeting Jpn. Soc.
Biosci. Biotechnol. & Agrochem. (in Japanese), Hiroshima, Japan.
173. Li, B., Chen, F., Wang, X., Ji, B., Wu, Y. (2007). Isolation and identification of
antioxidative peptides from porcine collagen hydrolysate by consecutive chromatography
and electrospray ionization-mass spectrometry. Food Chem., 102, 1135-1143.
174. Li, C., Matsui, T., Matsumoto, K., Yamasaki, R., Kawasaki, T. (2002). Latent production
of angiotensin I-converting enzyme inhibitors from buckwheat protein. J Pept Sci., 8(6),
267–274.
175. Li, F. J., Yin, L. J., Cheng, Y. Q., Saito, M., Yamaki, K., Li, L. T. (2010). Angiotensin Iconverting enzyme inhibitory activities of extracts from commercial chinese style
fermented soypaste. JARQ., 44, 167-172.
176. Liang, A. H., Xue, B. Y., Liang, R. X., Wang, J. H., Wang, D. (2003). Inhibitory effect of
egg white lysozyme on ceftizidime−in−duced release of endotoxin from Pseudomonas
aeruginosa. Acta Pharmaceut Sinica, 38, 801–804.
177. Lin, S., Tian, W., Li, H., Cao, J., Jiang, W. (2012). Improving antioxidant activities of
whey protein hydrolysates obtained by thermal preheat treatment of pepsin, trypsin,
alcalase and flavourzyme. Int J Food Sci Tech., 47(10), 2045–2051.
165
LITERATURA
178. Liu, Q., Kong, B., Xiong, Y. L., Xia, X. (2010). Antioxidant activity and functional
properties of porcine plasma protein hydrolysate as influenced by the degree of
hydrolysis. Food Chem., 118(2): 403–410.
179. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randal, R. J. (1951). Protein measurement
with the Folin-phenol reagent. J. Biol. Chem., 193, 265-275.
180. Lu, C. L., Baker, R. C. (1986). Characteristics of egg yolk phosvitin as an antioxidant for
inhibiting metal- catalyzed phospholipid oxidations. Poult Sci., 65, 2065-2070.
181. Maheswari, S. U., Ramadoss, C. S., Krishnaswamy, P. R. (1997). Inhibition of Fe(II)
catalyzed linoleic acid oxidation and DNA damage by phosvitin. Mol Cell Biochem., 177,
47-51.
182. Majumder, K., Wu, J. (2011). Purification and characterization of angiotensin I converting
enzyme (ACE) inhibitory peptides derived from enzymatic hydrolysate of ovotransferrin.
Food Chem., 126, 1614-1619.
183. Majumder, K., Wu, J. P. (2010). A new approach for identification of novel
antihypertensive peptides from egg proteins by QSAR and bioinformatics. Food Res Int.,
43, 1371–1378.
184. Mann, K., Mann, M. (2008). The chicken egg yolk plasma and granule proteomes
Proteomics., 8(1), 178-191.
185. Martinet, V., Saulnier, P., Beaumal, V., Couthaudon, J. L., Anton, M. (2003). Surface
properties of hen egg yolk low-density lipoproteins spread at the air–water interface.
Colloids and surfaces B: Biointerfaces, 31, 185–194.
186. Matoba, N., Usui, H., Fujita, H., Yoshikawa, M. (1999). A novel anti-hypertensive
peptide derived from ovalbumin induces nitric oxide-mediated vasorelaxation in an
isolated SHR mesenteric artery. Febs Letters., 452(3), 181–184.
187. May-June, T., L. Wan-Teng, L. Hsi-Chi, T. Yung-Ling, Wen-Dee C. (2010). The effect of
limited hydrolysis with Neutrase and ultrafiltration on the anti-adipogenic activity of soy
protein. Process Biochem. 45, 217–222.
188. McBee, L., Cotterill, O. (1979). Ion exchange chromatography and electrophoresis of egg
yolk. J Food Sci., 44 (3), 656–660.
189. McCully, K. A., Mok, C. C., Common, R. H. (1962). Paper electrophoretic
characterization of proteins and lipoproteins of hen’s egg yolk. Can J Biochem Physiol.,,
40, 937–952.
190. Meisel, H, FitzGerald, RJ. (2003). Biofunctional peptides from milk proteins: mineral
binding and cytomodulatory effects. Curr Pharmaceut Design., 9, 1289–1295.
166
LITERATURA
191. Meisel, H. (2004). Multifunctional peptides encrypted in milk proteins. Biofactors., 21,
55–61.
192. Miesel, H., Bockehmann, W. (1999). Bioactive peptides encrypted in milk proteins:
proteolytic activation and tropho-functional properties. Antonie Leuvenhoek., 76, 207-215.
193. Miguel, M., Recio, I., Gomez-Ruiz, J. A., Ramos, M., Lopez-Fandino, R., (2004).
Angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity of peptides derived from egg white
proteins by enzymatic hydrolysis. J Food Protect., 67, 1914-1920.
194. Mine, Y, Kovacs-Nolan, J. (2002). Chicken egg yolk antibodies as therapeutics in enteric
infectious disease: a review. J Med Food., 5(3), 159-169.
195. Mine, Y., D’Silva, I. (2008). Bioactive components in egg white. Egg bioscience and
biotechnology, 141–183.
196. Mine, Y., Keeratiurai, M. (2000). Selective displacement of caseinate proteins by hen egg
yolk lipoproteins at oil-in-water interfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 18, 1–
11.
197. Mine, Y., Kovacs-Nolan, J. (2006). New insights in biologically active proteins and
peptides derived from hen egg. World Poult. Sci. J., 62(1), 87-95.
198. Mine, Y., Noutomi, T., Haga, N. (1990). Thermally induced changes in egg white
proteins. J Agr Food Chem., 38(2), 2122–2125.
199. Miyoshi, S., Ishikawa, H., Kaneko, T., Fukui, F., Tanaka, H., Maruyama, S. (1991).
Structures and activity of angiotensin-converting enzyme inhibitors in an alpha-zein
hydrolysate. Agric. biol. chem., 55, 1313-1318.
200. Mizutani, R., Nakamura, R. (1984). Emulsifying properties of egg yolk low density
lipoprotein (LDL): comparison with bovine serum albumin and egg lecithin. Food Sci
Tech, 17, 213–216.
201. Morris, H. J., Carrillo, O. V., Almarales, A, Bermúdez, R. C., Alonso, M. E., Borges, L.,
Quintana M. M., Fontaine R., Llauradó G., Hernández M. (2009). Protein hydrolysates
from the alga Chlorella vulgaris 87/1 with potentialities in immunonutrition.
Biotecnología Aplicada, 26(2), 162-165.
202. Motamedzadegan, A., Davarniam, B., Asadi, G., Abedian, A., Ovissipour, M. (2010).
Optimization of enzymatic hydrolysis of yellowfin tuna Thunnus albacores viscera using
Neutrase. Int Aquat Res., 2, 173-181.
203. Moure, A., Domínguez, H., Parajo, J. C. (2006). Antioxidant properties of ultrafiltrationrecovered soy protein fractions from industrial effluents and their hydrolysates. Process
Biochem., 41, 447–456.
167
LITERATURA
204. Natesh, R., Schwager, S. L. U., Sturrock, E. D., Acharya, K. R. (2003). Crystal structure
of the human angiotensin-converting enzyme lisonopril complex. Nature., 421, 551–554.
205. Nazeer, R. A., Sampath Kumar, N., Jai Ganesh, R. (2012). In vitro and in vivo studies on
the antioxidant activity of fish peptide isolated from the croaker (Otolithes ruber) muscle
protein hydrolys. Peptides., 35(2), 261.
206. Nisbet, A. D., Saundry, R. H., Moir, A. J. G., Fothergill, L. A., Fothergill, J. E. (1981).
The complete amino-acid sequence of hen ovalbumin. Eur J Biochem., 115, 335-345.
207. Oi, Y., Ji, M. Y., Leem, K. H., Cho, S. W., Kim, M. (2005). The effect of hen egg yolk
peptide on bone growth, 17thAnnual meeting Japanese Society of Bioscience
Biotechnology and Agrochemistry (in Japanese), Hokkaido, Japan.
208. Okuno, A., Hasegawa, Y., Nishiyama, M., Ohira, T., Ko, R., Kurihara, M., Matsumoto,
S., Nagasawa, H. (2002). Preparation of an active recombinant peptide of crustacean
androgenic gland hormone. Peptides. 23(3), 567-572.
209. Oyama, K.; Irino, S., Hagi, N. (1987). Production of aspartame by immobilized
thermoase. Meth Enzymol., 136, 503-516.
210. Palacios, L. E., Wang, T. (2005). Egg-Yolk lipid fractionation and lecithin
characterization. J Am Oil Chem Soc., 82, 571-578.
211. Park, O., Allen, J. C. (1998). Preparation of phosphopeptides derived from αS-casein and
β-casein using immobilized glutamic acid-specific endopeptidase and characterization of
their calcium binding. J Dairy Sci., 81, 2858–2865.
212. Park, P. J., Jung, W. K., Nam, K. S., Shahidi, F., Kim, S. K. (2001). Purification and
characterization of antioxidative peptides from protein hydrolysate of lecithin-free egg
yolk. J Am Oil Chem Soc., 78, 651-656.
213. Park, S. Y., Lee, J. S., Baek, H. H., Lee, H. G. (2010). Purification and characterization of
antioxidant peptides from soy protein hydrolysate. J Food Biochem., 34, 120–132.
214. Pedroche, J., Just, M. M., Lqari, H., Megias, C., Giron- Calle, J., Alaiz, M. (2007).
Obtaining of Brassica carinata protein hydrolysates enriched in bioactive peptides using
immobilized digestive proteases. Food Res Int., 40(7), 931-938.
215. Pedroche, J., Yust, M., Girón-Calle, J., Vioque, J., Alaiz, M., Millán, F. (2003). Plant
protein hydrolysates and tailor-made foods. Electronic J Environ Agr Food Chem., 2(1),
233-235.
216. Pellegrini, A., Dettling, C., Thomas, U., & Hunziker, P. (2001). Isolation and
characterization of four bactericidal domains in the bovi Ne b-lactoglobulin. Biochem
Biophys Acta., 1526(2), 131–140.
168
LITERATURA
217. Pellegrini, A., Hűlsmeier, A. J., Hunziker, P., Thomas, U. (2004). Proteolytic fragments of
ovoalbumin display antimicrobial activity. BBA., 1672, 76-85.
218. Pellegrini, A., Thomas, U., Bramaz, N., Hunziker, P., von Fellenberg, R. (1999). Isolation
and identification of three bactericidal domains in the bovine a-lactalbumin molecule.
Biochim Biophys Acta., 1426(3), 439–448.
219. Pichler, H., Krska, R., Szekacs, A., Grasserbauer, M. (1998). An enzyme-immunoassay
for the detection of the mycotoxin zearalenone by use of yolk antibodies. Fresen J Anal
Chem., 362(1), 176–177.
220. Pichler, H., Krska, R., Szekacs, A., Grasserbauer, M. (1998). An enzyme-immunoassay
for the detection of the mycotoxin zearalenone by use of yolk antibodies. Fresenius’ J
Anal Chem., 362(1), 176–177.
221. Pihlanto, A. (2006). Antioxidative peptides derived from milk proteins. Int. Dairy J., 16,
1306–1314.
222. Pihlanto, A., Johansson, T., Mäkinen, S. (2012). Inhibition of angiotensin I-converting
enzyme and lipid peroxidation by fermented rapeseed and flaxseed meal. Eng. Life Sci.,
12(4), 450-456.
223. Pihlanto, A., Korhonen, H. (2003). Bioactive peptides and proteins. Adv Food Nutr Res.,
47, 175–276.
224. Pihlanto, A., Mäkinen, S. (2013). Antihypertensive Properties of Plant Protein Derived
Peptides. Bioactive Food Peptides in Health and Disease., 6.
225. Pokora, M., Eckert, E., Zambrowicz, A., Bobak, Ł., Szołtysik, M., Dąbrowska, A.,
Chrzanowska, J., Polanowski, A., Trziszka, T. (2013), Biological and functional
properties of proteolytic enzyme modified egg protein by-products. Food Sci Nutr., 1(2),
184-195.
226. Pokorny, J., Korczak, J. (2001). Preparation of natural antioxidants. In “Antioxidants in
food” eds. Pokorny J., Yanishlieva N., Gordon M.), Woodhead Publishing, Cambridge,
England: 311-330.
227. Polanowski, A., Sosnowska, A., Zabłocka, A., Janusz, M., Trziszka, T. (2013)
Immunologically active peptides that accompany hen egg yolk IgY- separation and
identification.. Biol. Chem., 394, (7), 879–887.
228. Polanowski, A., Zabłocka, A.., Sosnowska, A.,
Janusz, M., Trziszka, T. (2012)
Immunoregulatory actvity accompanying chicken egg yolk immunoglobulin Y. Poultry
Sci., 91, 3091-3096.
169
LITERATURA
229. Polson, A., Von Wechmar, M. B., Regenmortel, M. H. V. V. (1980). Isolation of viral IgY
antibodies from yolks of immunized hens. Immunol. Commun., 9, 475-493.
230. Qian, Z. J., Jung, W. K., Kim, S. K. (2008). Free radical scavenging activity of a novel
antioxidative peptide purified from hydrolysate of bullfrog skin, Rana catesbeiana Shaw.
Bioresource Technol., 99, 1690–1698.
231. Qu, W. J., Ma, H. L., Pan, Z. L., Luo, L., Wang, Z. B., & He, R. H. (2010). Preparation
and antihypertensive activity of peptides from Porphyra yezoensis. Food Chem., 123(1),
14–20
232. Quitain, A. T., Sato, N., Daimon, H., Fujie, K. (2001). Production of valuable materials by
hydrothermal treatment of shrimp shells. Ind Eng Chem Res., 40(25), 5885–5888
233. Raikos, V., Hansen, R., Campbell, L., Euston, S. R. (2006). Separation and identification
of hen egg protein isoforms using SDS-PAGE and 2D gel electrophoresis with MALDITOF mass spectrometry. Food Chem., 99, 702-710.
234. Ranathunga, S., Rajapakse, N., & Kim, S. K. (2006). Purification and characterization of
antioxidative peptide derived from muscle of conger eel (Conger myriaster). Eur Food
Res Tech., 222, 310–315.
235. Rao, S. Q., Ju, T., Sun, J., Su, Y. J., Xu, R. R., Yang, Y. J. (2012). Purification and
characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides from enzymatic
hydrolysate of hen egg white lysozyme. Food Res Int., 46, 127–134.
236. Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M, Rice-Evans, C. (1999).
Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free
Radical Bio. Med., 26, 1231–1237.
237. Rehault, S., Anton, M., Nau, F., Gautron, J., Nys, Y. (2007). Biological activities of the
egg. Prod Anim., 20(4), 337–347.
238. Ren, J., Zhao, M., Shi, J., Wang, J., Jiang, Y., Cui, C., Kakuda, Y., Xue, S. J. (2008).
Purification and identification of antioxidant peptides from grass carp muscle hydrolysates
by consecutive chromatography and electrospray ionization-mass spectrometry. Food
Chem., 108, 727–736.
239. Renye, J. R., Somkuti, G. A. (2007). Cloning of milk-derived bioactive peptides in
Streptococcus thermophilus. Biotechnol Lett. 30(4), 723–730.
240. Richman, P. G., Meister, A. (1975). Regulation of g-glutamyl-cysteine synthetase by
nonallosteric feedback inhibition by glutathione. J Biol Chem., 250, 1422–1426
241. Rosenberg, I. M. (1996). Protein analysis and Purification. Benchtop techniques.
Birkhauser, Boston-basel-Berlin 1996.
170
LITERATURA
242. Rudolf, J., Führer, M., Galler, B., Ansari, P., Hasenhindl, C., Baumgartner, S. (2009).
Differences in usability of rabbit IgG and chicken IgY after clean-up and impact on gold
labelling properties. J Immunol Methods., 350(1-2), 79-88
243. Saiga, A., Tanabe, S., Nishimura, T. (2003). Antioxidant activity of peptides obtained
from porcine myofibrillar proteins by protease treatment. J. Agric. Food Chem. 51, 36613667.
244. Sakanaka, S., Tachibana, Y. (2006). Active oxygen scavenging activity of egg-yolk
protein hydrolysates and their effects on lipid oxidation in beef and tuna homogenates.
Food Chem., 95, 243-249.
245. Sakanaka, S., Tachibana, Y., Ishihara, N., Juneja, L.R. (2004). Antioxidant activity of
egg-yolk protein hydrolysates in a linoleic acid oxidation system. Food Chem., 86, 99103.
246. Samaraweera, H., Zhang, W., Lee, E. J., Ahn, D.U. (2011). Egg Yolk Phosvitin and
Functional Phosphopeptides - Review. J Food Sci., 76(7), 143-150.
247. Sampath Kumar, N. S., Nazeer, R. A., Jaiganesh, R. (2011). Purification and biochemical
characterization of antioxidant peptide from horse mackerel (Magalaspis cordyla) viscera
protein. Peptides., 32(7), 1496-501.
248. Sarabia, F., Chammaa, S., Sanchez, R. A., Ortiz, L. M., Lopez-Herrera, F. J. (2004).
Chemistry and biology of cyclic depsipeptides of medicinal and biological interest. Curr
Med Chem., 11(10), 1309-1332.
249. Sarmadi, B.H., Ismail, A. (2010). Antioxidative peptides from food proteins: a review.
Peptides., 31, 1949-1956.
250. Sato, R., Noguchi, T., Naito, H. (1986). Casein phosphopeptide (CPP) enhanced calcium
absorption from the ligated segment of rat small intestine. J Nutr Sci Vitaminol., 32, 67–
76.
251. Sattar Khan, M. A., Nakamura, S., Ogawa, M., Akita, E., Azakami, H., Kato, A. (2000).
Bactericidal action of egg yolk phosvitin against Escherichia coli under thermal stress. J.
Agric. Food Chem., 48, 1503-1506.
252. Saxena, I., Tayyab, S. (1997). Protein proteinase inhibitors from avian egg whites. Cell
Mol Life Sci., 53, 13-23.
253. Scanff, P., Yvon, M., Thirouin, S., Pelissier, J. P. (1992). Characterization and kinetics of
gastric emptying of peptides derived from milk proteins in the preruminant calf. J Dairy
Res., 59(4), 437-47.
171
LITERATURA
254. Schaafsma, G. (2009). Safety of protein hydrolysates, fractions thereof and bioactive
peptides in human nutrition. Eur J Clin Nutr., 63, 1161-1168
255. Schade, R., Chacana, P. A. (2007). Livetin fractions (IgY), in Bioactive Egg Compounds.
Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 25-32.
256. Schade, R., Staak, C., Hendriksen, C., Erhard, M., Hugl, H., Koch, G., Larsson, A.,
Pollmann, W., van Regenmortel, M., Rijke, E., Spielmann, H., Steinbusch, H., Straughan,
D. (1996). The production of avian (egg yolk) antibodies:IgY. The report and
recommendations of ECVAM workshop 21. ATLA. 24, 925-934.
257. Schindler, A., Dunkel, A., Stähler, F., Backes, M., Ley, J., Meyerhof, W., Hofmann, T.
(2011). Discovery of salt taste enhancing arginyl dipeptides in protein digests and
fermented fish sauces by means of a sensomics approach. J Agric Food Chem., 59(23),
12578-12588.
258. Schwenke, K. D. (1994). Rapeseed protein. In: Hudson BJF, editor. New and developing
sources of food proteins. London, U.K.: Chapman and Hall. 281-306.
259. See, S. F., Hoo, L. L., Babji, A. S. (2011). Optimization of enzymatic hydrolysis of
Salmon (Salmo salar) skin by Alcalase. Int Food Res J., 18(4), 1359-1365.
260. Shahidi, F., Han, X. Q., Synowiecki, J. (1995). Production and characteristics of protein
hydrolysates from capelin (Mallotus villosus). Food Chem., 53, 285-293.
261. Shahidi, F., Zhong, Y. (2010). Novel antioxidants in food quality preservation and health
promotion. Eur J Lipid Sci Tech., 112, 930-940.
262. Shaji, J., Patole, V. (2008). Protein and peptide drug delivery: Oral approaches. J. Pharm.
Sci., 70, 269-277.
263. Sharma, J. M. (1997). The structure and function of the avian immune system. Acta Vet
Hung., 45, 229-238.
264. Shimizu, M. (2004). Food-derived peptides and intestinal functions. Biofactors., 21, 4347.
265. Shimizu, M., Fitzsimmons, R. C., Nakai, S. (1988). Anti-E. coli immunoglobulin Y
isolated from egg yolk of immunized chickens as a potential food ingredient, J Food Sci.,
53, 1360-1366.
266. Shimizu, M., Nagashima, H., Hshimoto, K. (1993b). Comparative studies on molecular
stability of immunoglobulin G form different species. Comparative Biochem Biophys.,
106B, 255-261.
267. Siepka, E., Bobak, Ł., Trziszka, T. (2010). Frakcjonowanie żółtka w celu pozyskiwania
preparatów wzbogaconych w substancje biologicznie aktywne. ŻNTJ., 6(73), 158-167.
172
LITERATURA
268. Sikorski, Z. E. (red.). (2002). Chemia żywności. Wydawnictwo Naukowo-Techniczne.
269. Silvestre, M. P. C. (1996). Review of methods for the analysis of protein hydrolysates
Food Chem., 60, 263-271.
270. Sim, J. S. (1994). New extraction and fractionation method for lecithin and neutral oil
from egg yolk. In: Egg uses and processing technologies: new developments, Sim, J. S.
and Nakai, S., Cab International: Oxon, U.K., 128-138.
271. Siriporn, D., R. Kongpob, K. Kittinan, and T. Wiwut. (2008). Enzymatic hydrolysis of
rawhide using papain and Neutrase. J. Ind. Eng. Chem. 14, 202–206.
272. Smacchi, E., Gobbetti, M. (2000). Bioactive peptides in dairy products: synthesis and
interaction with proteolytic enzymes. Food Microb.,, 17(2), 129-141.
273. Stadelman, W. J., Cotterill, O. T. (1986). Egg science and technology, 3rd edition.
Westport, CT, AVI.
274. Stevens L. (1991). Egg white proteins. Com Biochem Physiol., Part B, 100, 1-9.
275. Stevens, L. (1996). Egg proteins: what are their functions? Sci Progr., 79, 65-87.
276. Suarez-Jimenez, G. M., Burgos-Hernandez, A., Ezquerra-Brauer J. M. (2012). Bioactive
Peptides and Depsipeptides with Anticancer Potential: Sources from Marine Animals.
Mar Drugs., 10(5), 963-986.
277. Sun, H., Chen, Z., Wen, P., Lei, H., Shi, J., Huang, M., Wang, J. (2012). Optimization of
Enzymatic Hydrolysis Conditions for Preparation of Gingko Peptides from Ginkgo Nuts.
Int J Food Eng., 8(1), 1-15.
278. Sun, Q., Shen, H. X., Luo, Y. K. (2011). Antioxidant activity of hydrolysates and peptide
fractions derived from porcine hemoglobin. J. Food Sci. Technol., 48, 53-60.
279. Świderski, F. (2003). Żywność wygodna i żywność funkcjonalna. Wydawnictwo
Naukowo- Techniczne Warszawa, 2003.
280. Szołtysik, M., Żelazko, M., Połomska, X., Wojtatowicz, M., Chrzanowska, J. (2008).
Wzrost i enzymatyczna aktywność drożdży w mleku różnych gatunków przeżuwaczy.
Acta Sci. Pol., Biotechnologia, 7(2), 27-41.
281. Szołtysik, M., Żelazko, M., Dąbrowska, A., Połomska, X., Wojtatowicz, M.,
Chrzanowska, J. (2007). Porównanie profili lotnych związków zapachowych serów
handlowych i wytwarzanych z udziałem drożdży Yarrowia lipolytica. Acta Sci. Pol.,
Biotechnologia., 6(3), 33-43.
282. Tang, X., He, Z., Dait, Y., Xiong, Y. L., Xie, M., Chen, J. (2010). Peptide fractionation
and free radical scavenging activity of zein. J Agr Food Chem., 58, 587-593.
173
LITERATURA
283. Tardi, P. G., Swartz, E. N., Harasym, T. O., Cullis, P. R., Bally, M. B. (1997). An immune
response to ovoalbumin covalently coupled to liposomes is prevented when the liposomes
used contain doxorubicin. J Immunol Meth., 210, 137-148.
284. Tini, M., Jewell, U. R., Camenisch, G. (2001). Generation and application of chicken
egg−yolk antibodies. Comp Bioch Phys Part A., 131, 569-574.
285. Torres-Fuentes, C., Alaiz, M., Vioque, J. (2011). Affinity purification and characterisation
of chelating peptides from chickpea protein hydrolysates. Food Chem., 129(2), 485-490.
286. Trziszka, T. (red.). (2000). Jajczarstwo, Nauka, Technologia. Wyd. Akademii Rolniczej
we Wrocławiu, Wrocław.
287. Tsuge, N., Eikawa, Y., Nomura, Y., Yamamoto, M., Sugisawa, K. (1991). Antioxidative
activity of peptides prepared by enzymatic hydrolysis of egg white albumin. Nippon
Nogeikagaku Kuishi., 65, 1635-1641.
288. Tunçtürk, Y., Zorba, Ö. (2006). The effects of enzymatic hydrolysis of casein on apparent
yield stress and some emulsion properties. Food Hydrocoll., 20(4), 475-482.
289. Udenigwe, C. C., Lu, Y.-L., Han, C.-H., Hou, W.-C., Aluko, R. E. (2009). Flaxseed
protein-derived
peptide
fractions:
Antioxidant
properties
and
inhibition
of
lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in murine macrophages. Food Chem.,
116, 277-284.
290. van der Pijl, P. C., Kies, A. K., Ten Have, G. A., Duchateau, G. S., Deutz, N. E. (2008).
Pharmacokinetics of proline-rich tripeptides in the pig. Peptides., 29, 2196-2202.
291. Villanueva, A., Vioque, J., Sánchez-Vioque, R., Clemente, A., Bautista, J., Millán, F.
(1999). Production of an extensive sunflower protein hydrolysate by sequential hydrolysis
with endo- and exo-proteases. Grasas y Aceites., 50(6), 472-476.
292. Vinnars, E., Wilmore, D. (2003). History of parenteral nutrition. JPEN., 27, 225–232.
293. Vioque, J., Sa´nchez-Vioque, R., Clemente, A., Pedroche, J., Bautista, J., Millan, F.
(1999). Production and characterization of an extensive rapeseed protein hydrolysate. J
Am Oil Chem Soc., 76, 819-23.
294. Vioque, J., Sa´nchez-Vioque, R., Clemente, A., Pedroche, J., Millan, F. (2000). Partially
hydrolysed rapeseed protein isolates with improved functional properties. J Am Oil Chem
Soc., 77, 447-50.
295. Vioque, J., Sánchez-Vioque, R., Clemente, A., Pedroche, J., Bautista, J., Millan, F.
(1999). Production and characterization of an extensive rapeseed protein hydrolysate. J
Am Oil Chem Soc., 76(7), 819-823.
174
LITERATURA
296. Wang, C., Wang, Q.,
Tian, J. (2010). Optimization of Enzymatic Production of
Oligopeptides from Apricot Almonds Meal with Neutrase and N120P. Int. J. Mol. Sci., 11,
4952-4961.
297. Wang, G., Wang, T. (2009). Egg yolk protein modification by controlled enzymatic
hydrolysis for improved functionalities. Inter. J. Food Sci. Technol., 44, 763-769.
298. Wang, L. H., Li, X. Y., Jin, L. J., You, J. S., Zhou, Y., Li, S. Y., Xu, Y. P. (2011).
Characterization of chicken egg yolk immunoglobulins (IgYs) specific for the most
prevalent capsular serotypes of mastitis-causing Staphylococcus aureus. Vet Microbiol.,
149, 415-21.
299. Warren, M. W., Brown, H. G., Davis, D. R. (1988). Solvent extraction of lipid
components from egg yolk solids. J Am Oil Chem Soc., 65, 1136-1139.
300. Węsierska, E., Saleh, Y., Trziszka, T., Kopeć, W., Siewiński, M., Korzekwa, K. (2005).
Antimicrobial activity of chicken egg white cystatin. World J. Microbiol. Biotechnol., 21,
59-64.
301. Whitaker, J. R., Granum, P. E. (1980). An absolute method for protein determination
based on difference in absorbance at 235 and 280. Anal. Biochem., 109, 156-159.
302. White- Cohn, E., White, A. (1935). The enzymatic hydrolysis of raw and heat-treated eggwhite. J. Biol. Chem., 109, 169-175.
303. Wielowiejska, A. (2009). Ocena bioaktywności produktów hydrolizy białek mleka
prowadzonej z użyciem enzymów drożdży. Praca magisterska wykonana w Katedrze
Technologii Surowców Zwierzęcych Akademii Rolniczej we Wrocławiu.
304. Williams, G. M., Iatropoulos, M. J., Whysner, J. (1999). Safety assessment of butylated
hydroxyanisole and butylated hydroxytoluene as antioxidant food additives. Food Chem
Toxicol., 37, 1027-1038.
305. Wu, H. C., H. M. Chen, Shiau, C. Y. (2003). Free amino acids and peptides as related to
antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus). Food
Res. Int., 36, 949-957.
306. Wu, J. P., Aluko, R. E., Nakai, S. (2006). Structural requirements of angiotensin I
converting enzyme inhibitory peptides: Quantitative structure-activity relationship
modeling of peptides containing 4–10 amino acid residues. Qsar and Combinatorial
Science., 25(10), 873-880.
307. Xia, Y., Bamdad, F., Gänzle, M., Chen, L. (2012). Fractionation and characterization of
antioxidant peptides derived from barley glutelin by enzymatic hydrolysis. Food Chem.
134, 1509-1518.
175
LITERATURA
308. Xiangzhen, K., Z. Huiming, Haifeng, Q. (2007). Enzymatic hydrolysis of wheat gluten by
proteases and properties of the resulting hydrolysates. Food Chem. 102, 759-763.
309. Xu, X., Katayama, S., Mine, Y. (2007). Antioxidant activity of tryptic digest of hen egg
yolk phosvitin. J Sci. Food Agric., 87, 2604-2608.
310. Xu, Y., Li, X., Jin, L., Zhen, Y., Lu, Y., Li, S., You, J., Wang, L. (2011). Application of
chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal
diseases: A review. Biotechnol Adv., 29, 860-868.
311. Yamada, Y., Matoba, N., Usui, H., Onishi, K., Yoshikawa, M. (2002). Design of a highly
potent anti-hypertensive peptide based on ovokinin(2-7). Biosci. biotechn. biochem., 66,
1213-1217.
312. Yamamoto, N., Ejiri, M., Mizuno, S. (2003). Biogenic peptides and their potential use.
Curr Pharm Des., 9(16), 1345–55.
313. Yen, G. C., Chen, H. Y. (1995). Antioxidant activity of various tea extracts in relation to
their antimutagencity. J. Agric. Food Chem., 43, 27-32.
314. Yokomizo, A., Takenaka, Y., Takenaka, T. (2002). Antioxidative activity of peptides
prepared from okara protein. Food Sci Technol. Res., 8(4), 357-359.
315. Yoshii, H., Tachi, N., Ohba, R., Sakamura, O., Takemaya, H., Itani, T. (2001).
Antihypertensive effect of ACE inhibitory oligopeptides from chicken egg yolks. Comp
Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol., 128, 27-33.
316. You, S. J., Udenigwe, C. C., Aluko, R. E., Wu, J. P. (2010). Multifunctional peptides from
egg white lysozyme. Food Res Int., 43(3), 848–855.
317. You, S. J., Wu, J. (2011). Angiotensin - I converting enzyme inhibitory and antioxidant
activities
of
egg
protein
hydrolysates
produced
with
gastrointestinal
and
nongastrointestinal enzymes. J. Food Sci., 76(6), 801-807.
318. Young, D., Fan, M.Z., Mine, Y., (2010). Egg yolk peptides up-regulate glutathione
synthesis and antioxidant enzyme activities in a porcine model of intestinal oxidative
stress. J Agr Food Chem., 58, 7624-7633.
319. Yu, Z., Liu, B., Zhao, W., Yin, Y., Liu, J., Chen, F. (2012). Primary and secondary
structure of novel ACE-inhibitory peptides from egg white protein. Food Chem., 133,
315-322.
320. Yu, Z., Yin, Y., Zhao, W., Wang, F., Yu, Y., Liu, B., Liu, J., Chen, F. (2011).
Characterization
of
ACE-Inhibitory
peptide
associated
with
antioxidant
and
anticoagulation properties. J Food Sci., 76(8), 1149-1155.
176
LITERATURA
321. Yujie, C., Bo, T., Bo, S., Mingruo, G. (2006). Enzymatic hydrolysis conditions for egg
white proteins. Bull. Facul. Agric. Niigata Unive., 58(2), 143-146.
322. Zambrowicz, A. (2009). Wytwarzanie bioaktywnych peptydów z białek jaja na drodze
hydrolizy enzymatycznej. Praca doktorska wykonana w Katedrze Technologii Surowców
Zwierzęcych i Zarządzania Jakością, Wydziału Nauk o Żywności Uniwersytetu
Przyrodniczego we Wrocławiu, Wrocław, 2009.
323. Zambrowicz, A., Pokora, M., Eckert, E., Szołtysik, M., Dąbrowska, A., Chrzanowska, J.,
Trziszka, T. (2013). Antioxidative peptides derived from denaturated egg white protein.
Ital J Food Sci., 2, 2(25), 169-180.
324. Zhang, L., Li, J., Zhou, K. (2010). Chelating and radical scavenging activities of soy
protein hydrolysates prepared from microbial proteases and their effect on meat lipid
peroxidation. Bioresource Tech., 101, 2084-2089.
325. Zhang, Z., Chang, Q., Zhu, M., Huang, Y., Ho, W. K., Chen, Z. (2001). Characterization
of antioxidants presents in hawthorn fruits. J. Nutr. Biochem., 12, 144-152.
326. Zhen, Y. H., Jin, L. J., Guo, J., Li, X. Y., Li, Z., Fang, R., Xu, J. P. (2008).
Characterization of specific egg yolk immunoglobulin (IgY) against mastitis-causing
Staphylococcus aureus. J Appl Microbiol., 105, 1529-35.
327. Zhen, Y. H., Jin, L. J., Li, X. Y., Guo, J., Li, Z., Zhang, B. J., Fang, R., Xu, J. P. (2009).
Efficacy of specific egg yol immunoglobulin (IgY) to bovine mastitis caused by
Staphylococcus aureus. Vet Microbiol., 133, 317-22.
328. Zhu, L., Chen, J., Tang, X., Xiong, Y. L. (2008). Reducing, radical scavenging, and
chelation properties of in vitro digests of alcalase-treated zein hydrolysate. J. agric. food
chem., 56, 2714-2721.
329. Żelazko, M. (2005). Charakterystyka i wykorzystanie proteinaz z trzustek drobiowych.
Praca doktorska wykonana w Katedrze Technologii Surowców Zwierzęcych Akademii
Rolniczej we Wrocławiu, Wrocław.
177