przeciwcia£a monoklonalne i poliklonalne i ich zastosowanie w

przeciwcia£a monoklonalne i poliklonalne i ich zastosowanie w

POSTÊPY
BIOLOGII MONOKOMÓRKI
35 2008 SUPLEMENT
NR 24 (17–34)17
PRZECIWCIA£A
I POLIKLONALNE I TOM
ICH ZASTOSOWANIE
W CYTOMETRII...
PRZECIWCIA£A MONOKLONALNE I POLIKLONALNE
I ICH ZASTOSOWANIE W CYTOMETRII PRZEP£YWOWEJ
THE APPLICATION OF MONOCLONAL AND POLICLONAL
ANTIBODIES IN FLOW CYTOMETRY
£ukasz SÊDEK1, Bogdan MAZUR2
Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii Dzieciêcej oraz
Katedra i Zak³ad Mikrobiologii i Immunologii Œl¹skiego Uniwersytetu Medycznego
1
2
Streszczenie: Przeciwcia³a to substancje bia³kowe zdolne do swoistego wi¹zania siê z antygenem. Przeciwcia³a poliklonalne to grupa przeciwcia³, które rozpoznaj¹ ró¿ne epitopy tego samego antygenu.
Przeciwcia³a monoklonalne to przeciwcia³a rozpoznaj¹ce wy³¹cznie jeden epitop. Obydwa typy przeciwcia³ maj¹ zastosowanie diagnostyczne jednak tylko przeciwcia³a monoklonalne maj¹ zastosowanie w
cytometrii przep³ywowej. Dziêki sprzêganiu przeciwcia³ z barwnikami fluorescencyjnymi mo¿liwe jest
wykrywanie antygenów ró¿nych typów komórek. Rozwi¹zania techniczne wspó³czesnych cytometrów
przep³ywowych daj¹ mo¿liwoœæ odczytu do kilkunastu ró¿nych fluorescencji jednoczeœnie, co w praktyce oznacza mo¿liwoœæ jednoczesnej oceny ekspresji do kilkunastu ró¿nych antygenów jednej komórki.
Summary: Antibodies are protein particles capable of specific antigen binding. Policlonal antibodies
comprise of a group of antibodies that recognize different epitopes of the same antigen. Monoclonal
antibodies recognize and bind to only one specific epitope. Both types of antibodies have their applications in diagnostic techniques, however only monoclonal antibodies are used in flow cytometry. Conjugation of monoclonal antibodies with fluorescent dyes enables the detection of antigens of different cell
types. Contemporary flow cytometers can simultaneously detect more than ten different fluorescences,
which gives the possibility of simultaneous assessment of many different antigens of the same cell.
I. PRZECIWCIA£A
Przeciwcia³a, czyli immunoglobuliny, to substancje bia³kowe wytwarzane przez
w pe³ni zró¿nicowane limfocyty B – plazmocyty, zdolne do swoistego ³¹czenia siê
z antygenem. Cz¹steczka przeciwcia³a sk³ada siê z czterech ³añcuchów polipeptydowych: dwóch lekkich i dwóch ciê¿kich po³¹czonych ze sob¹ mostkami
disiarczkowymi (ryc. 1). Wyró¿nia siê 5 typów ³añcuchów ciê¿kich: α, δ, ε, γ, µ
18
£. SÊDEK, B. MAZUR
oraz 2 typy ³añcuchów lekkich: κ
i λ. W zale¿noœci od typu ³añcucha ciê¿kiego wyró¿nia siê 5
klas immunoglobulin,odpowiednio:
IgA, IgD, IgE, IgG oraz IgM.
Zarówno ³añcuchy lekkie, jak
i ciê¿kie zawieraj¹ czêœci sta³e
(C) znajduj¹ce siê w ich
odcinkach C-koñcowych (z
wolnymi grupami karboksylowymi
³añcuchów polipeptydowych) oraz
czêœci zmienne obejmuj¹ce
odcinki N-koñcowe (z wolnymi
grupami aminowymi). Czêœci
sta³e ³añcuchów ciê¿kich i
lekkich s¹ identyczne dla
wszystkich przeciwcia³ danej
RYCINA 1. Schemat budowy przeciwcia³a: VH – czêœæ zmienna
³añcucha ciê¿kiego, VL – czêœæ zmienna ³añcucha lekkiego, CH – klasy. Natomiast czêœci zmienne,
czêœæ sta³a ³añcucha ciê¿kiego, CL – czêœæ sta³a ³añcucha lekkiego, kodowane przez wiele genów o
CDR1-3 – regiony determinuj¹ce dopasowanie (ang. comple- skomplikowanych mechanizmach
mentarity determinig regions) (na podst. [1] zmodyfikowane)
regulacji ekspresji, mog¹ ró¿niæ
siê znacznie nawet w obrêbie
jednej klasy. Czêœæ zmienna ka¿dego ³añcucha sk³ada siê z 3 regionów hiperzmiennych,
zwanych te¿ regionami determinuj¹cymi dopasowanie – CDR (ang. complementarity
determining regions) i 4 przylegaj¹cych do nich regionów zrêbowych – FR (ang. frame
regions). Czêœci zmienne ³añcuchów ciê¿kich i lekkich tworz¹ miejsce wi¹¿¹ce antygen,
a przestrzenna konfiguracja tych czêœci, a zw³aszcza le¿¹cych w ich obrêbie regionów
CDR determinuje swoistoœæ przeciwcia³a, czyli jego selektywne ³¹czenie siê z okreœlonym
antygenem [1, 2]. Miejsce wi¹¿¹ce antygen zwane jest paratopem i jest przestrzennie
dopasowane do determinanty antygenowej (epitopu), czyli okreœlonego fragmentu
przestrzennej struktury antygenu.
Wed³ug obowi¹zuj¹cej nomenklatury przeciwcia³om nadaje siê nazwê wskazuj¹c¹
na antygen, jaki rozpoznaj¹, jednak¿e okreœlenie „przeciwcia³o przeciwko danemu
antygenowi” nie jest do koñca jednoznaczne. I chocia¿ do niektórych celów dalsze
precyzowanie tego pojêcia nie jest konieczne, istniej¹ takie zastosowania, dla których
œcis³e okreœlenie swoistoœci przeciwcia³a jest kluczowe. Jednym z takich zastosowañ
jest cytometria przep³ywowa. Dlatego nale¿y wprowadziæ i zdefiniowaæ pojêcia
przeciwcia³a poliklonalnego i monoklonalnego.
I.1. Przeciwcia³a poliklonalne
Podczas produkcji przeciwcia³ poprzez immunizacjê zwierzêcia okreœlonym antygenem, nawet o bardzo wysokiej czystoœci, ka¿dy klon limfocytów B, który bierze
udzia³ w odpowiedzi immunologicznej wytwarza immunoglobuliny swoiœcie rozpoz-
PRZECIWCIA£A MONO- I POLIKLONALNE I ICH ZASTOSOWANIE W CYTOMETRII... 19
naj¹ce okreœlony epitop tego antygenu [3, 4]. Bior¹c pod uwagê fakt, ¿e w odpowiedzi immunologicznej bierze udzia³ wiele klonów limfocytów B oraz ¿e na jednym
antygenie mo¿e byæ obecnych co najmniej kilka ró¿nych epitopów, mo¿na siê spodziewaæ powstania mieszaniny przeciwcia³ rozpoznaj¹cych ró¿ne determinanty,
ró¿ni¹cych siê równie¿ powinowactwem, czyli stopniem dopasowania i si³¹ wi¹zania
z antygenem. Taka grupa przeciwcia³, rozpoznaj¹ca zasadniczo jeden antygen, ale
reaguj¹ca z ró¿nymi jego epitopami to przeciwcia³a poliklonalne (pochodz¹ce od wielu
klonów limfocytów B).
I.1.1. Zalety i wady stosowania przeciwcia³ poliklonalnych
Jak ju¿ wspomniano, wybór rodzaju przeciwcia³ zale¿y od specyfiki celu, do jakiego
maj¹ byæ u¿yte. Do wielu badañ, obejmuj¹cych równie¿ niektóre zastosowania w
diagnostyce i terapii, przeciwcia³a poliklonalne s¹ w zupe³noœci wystarczaj¹ce. Ich
niew¹tpliwym atutem jest stosunkowo niski w porównaniu z przeciwcia³ami
monoklonalnych koszt uzyskiwania. Zdolnoœæ do rozpoznawania ró¿nych determinant
antygenu sprawia, ¿e przeciwcia³a poliklonalne maj¹ bardzo wysok¹ zach³annoœæ
(awidnoœæ), która wynika z faktu, ¿e ca³kowita si³a oddzia³ywania przeciwcia³
poliklonalnych z wieloma ró¿nymi epitopami antygenu jest znacznie wiêksza ni¿ prosta
suma pojedynczych oddzia³ywañ, poniewa¿ zwi¹zanie jednego przeciwcia³a zwiêksza
prawdopodobieñstwo przy³¹czenia kolejnego przeciwcia³a przez s¹siedni epitop [1–4].
Dziêki tej w³aœciwoœci, za pomoc¹ przeciwcia³ poliklonalnych ³atwo i z wysok¹
czu³oœci¹ mo¿na stwierdziæ obecnoœæ lub brak danego antygenu oraz okreœliæ jego
stê¿enie. Ponadto, przeciwcia³a poliklonalne bardzo dobrze sprawdzaj¹ siê w badaniu
z³o¿onych antygenów, w reakcjach immunoprecypitacji lub aglutynacji. Szczególnym
zastosowaniem przeciwcia³ poliklonalnych s¹ ró¿ne surowice odpornoœciowe, gdy¿
dziêki wysokiej zach³annoœci przeciwcia³a te maj¹ wysok¹ zdolnoœæ neutralizacji
toksyn [3, 5]. Wa¿n¹ zalet¹ przeciwcia³ poliklonalnych jest te¿ fakt, ¿e trwa³oœæ
powsta³ych z antygenem kompleksów w mniejszym stopniu ni¿ w przypadku przeciwcia³ monoklonalnych zale¿y od w³aœciwoœci roztworu (np. pH) [6].
Przeciwcia³a poliklonalne nie sprawdzaj¹ siê jednak w wykrywaniu subtelnych
ró¿nic w budowie antygenów. Je¿eli dwa antygeny ró¿ni¹ siê tylko jednym epitopem,
to przeciwcia³a poliklonalne w reakcji krzy¿owej rozpoznaj¹ obydwa antygeny.
Ponadto próba wykrycia konkretnego antygenu o wielu epitopach w mieszaninie
antygenów za pomoc¹ przeciwcia³ poliklonalnych bêdzie nieœæ ze sob¹ wysokie
ryzyko zajœcia reakcji krzy¿owych i uzyskania fa³szywie pozytywnych wyników.
Problemem jest te¿ zró¿nicowane powinowactwo przeciwcia³ poliklonalnych do antygenu, rzutuj¹ce na wiarygodnoœæ, spójnoœæ i powtarzalnoœæ wyników. Z wymienionych powodów przeciwcia³a poliklonalne nie maj¹ zastosowania w czu³ych i
precyzyjnych technikach, takich jak cytometria przep³ywowa [1, 3].
I.2. Przeciwcia³a monoklonalne
Przeciwcia³a monoklonalne s¹ to przeciwcia³a produkowane przez nieró¿nicuj¹ce
siê, stanowi¹ce jeden klon limfocyty B, rozpoznaj¹ tylko jedn¹, œciœle okreœlon¹
determinantê antygenow¹ [1, 2, 4]. Produkcja przeciwcia³ monoklonalnych jest
20
£. SÊDEK, B. MAZUR
RYCINA 2. Produkcja przeciwcia³ monoklonalnych (opis w tekœcie)
bardziej skomplikowana ni¿ przeciwcia³ poliklonalnych (ryc. 2). Jedn¹ z metod jest metoda
opracowana w 1975 r. przez Köhlera i Milsteina polegaj¹ca na fuzji komórki plazmatycznej
produkuj¹cej przeciwcia³a z komórk¹ szpiczaka (Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny w
1984 r.) [7]. Do fuzji u¿ywane s¹ komórki plazmatyczne wyizolowane z immunizowanej
okreœlonym antygenem myszy oraz komórki szpiczaka z defektem metabolicznym (np.
nieprodukuj¹ce enzymu fosforybozylotransferazy hipoksantyno-guaninowej – HGPRT).
Hodowla mieszaniny komórek poddanych fuzji na specjalnym medium selekcyjnym pozwala
pozbyæ siê niesfuzjowanych plazmocytów oraz komórek szpiczaka, a pozwala jedynie na
prze¿ycie produktów fuzji komórek szpiczaka i plazmocytów (hybrydom). Spoœród
otrzymanych hybrydom izoluje siê i klonuje te, które najbardziej wydajnie produkuj¹
przeciwcia³a. W ten sposób otrzymane hybrydy produkuj¹ce przeciwcia³a o okreœlonej
swoistoœci mo¿na dowolnie d³ugo hodowaæ in vitro [1–3].
PRZECIWCIA£A MONO- I POLIKLONALNE I ICH ZASTOSOWANIE W CYTOMETRII... 21
I.2.1. Zalety i wady stosowania przeciwcia³ monoklonalnych
Przeciwcia³a monoklonalne u¿ywane s¹ wszêdzie tam, gdzie przede wszystkim
wymagana jest wysoka specyficznoœæ i powtarzalnoœæ reakcji z antygenem w ogóle.
W szczególnoœci w³aœnie ten typ przeciwcia³ znalaz³ zastosowanie w cytometrii
przep³ywowej. Za takim wyborem przemówi³y równie¿ inne unikalne w³asnoœci
przeciwcia³ monoklonalnych. Bardzo wa¿n¹ zalet¹ przeciwcia³ monoklonalnych jest
fakt, ¿e dziêki wysokiej specyficznoœci mo¿na u¿ywaæ ich w bardzo ma³ych
stê¿eniach eliminuj¹c przy tym sk³onnoœæ do krzy¿owych reakcji z innymi bia³kami
oraz wi¹zanie niespecyficzne (t³o). Poza tym, przeciwcia³a monoklonalne umo¿liwiaj¹
odró¿nienie od siebie minimalnie ró¿ni¹cych siê antygenów, np. punktow¹ zmian¹
jednego aminokwasu w obrêbie epitopu. Przeciwcia³a monoklonalne pozwalaj¹ te¿
na wykrywanie innych modyfikacji antygenu, takich jak: utlenienie, fosforylacja, czy
proteoliza. Przy pomocy przeciwcia³ monoklonalnych jest ponadto mo¿liwe odró¿nienie
od siebie izoenzymów, proenzymów od enzymów w³aœciwych, bia³ek prawid³owych
od nowotworowych, szczepów bakterii lub mutantów wirusów.
Oprócz swoich niew¹tpliwych zalet, przeciwcia³a monoklonalne maj¹ tak¿e pewne
ograniczenia. Paradoksalnie, niektóre z nich wynikaj¹ równie¿ z ich wysokiej specyficznoœci. Na przyk³ad badanie wieloepitopowego antygenu przy pomocy jed-nego rodzaju
przeciwcia³ monoklonalnych mog¹cego wi¹zaæ siê tylko do jednego epitopu mo¿e daæ
wynik nieadekwatny do rzeczywistoœci. W przypadku skrajnie rzadko wystêpuj¹cych
lub niedostatecznie wyeksponowanych epitopów uzyskany wynik bêdzie mocno zani¿ony.
Ta niska w porównaniu z przeciwcia³ami poliklonalnymi zach³annoœæ, powoduje, ¿e
przeciwcia³a monoklonalne maj¹ tak¿e ograniczone zastosowanie w testach opartych
na reakcjach immuno-precypitacji i aglutynacji. Inna wada przeciwcia³ monoklonalnych
wynika z faktu, ¿e wi¹¿¹ siê specyficznie z okreœlonym epitopem, czyli pewnym tylko
fragmentem przestrzennej struktury bia³ka, a nie z antygenem jako ca³oœci¹. Z tego
powodu dane przeciwcia³o monoklonalne mo¿e rozpoznawaæ dwa ró¿ne antygeny, na
których obecny jest ten sam epitop. Prawdopodobieñstwo takiej krzy¿owej reakcji jest
tym wiêksze, im mniejszy jest epitop rozpoznawany przez dane przeciwcia³o
monoklonalne. Stosowanie przeciwcia³ monoklonalnych w diagnostyce niektórych
rodzajów nowotworów równie¿ mo¿e napotkaæ pewne ograniczenia. Znane s¹ przypadki,
gdy u chorych na szpiczaka mnogiego dochodzi do delecji pewnych fragmentów
produkowanych w ich organizmach immunoglobulin. Je¿eli stosowane do wykrycia tych
patologicznych immunoglobulin przeciwcia³o monoklonalne jest skierowane akurat
przeciwko temu fragmentowi, który uleg³ delecji, to uzyskany wynik jest fa³szywie
negatywny. Dlatego, aby zapobiec takim sytuacjom, prawdopodobne jest, ¿e w przysz³oœci,
przynajmniej do niektórych rodzajów badañ z u¿yciem przeciwcia³, bêd¹ stosowane
mieszaniny przeciwcia³ monoklonalnych lub przeciwcia³a poliklonalne [1–5].
I.3. Nazewnictwo przeciwcia³
Praca z przeciwcia³ami mo¿e w niektórych przypadkach nastrêczyæ pewnych
problemów. Dotyczy to obydwu typów przeciwcia³, jednak nie jest zwi¹zane z ich
22
£. SÊDEK, B. MAZUR
funkcjonalnoœci¹, lecz z ugruntowanym historycznie zamieszaniem w ich nazewnictwie. Pocz¹tkowo, w momencie pierwszego otrzymania, przeciwcia³om nadawano
nazwy bezpoœrednio kojarz¹ce siê z ich funkcjami, jak np. przeciwcia³o CALLA
przeciwko antygenowi powszechnej ostrej bia³aczki limfoblastycznej (ang. common
acute lymphoblastic leukemia antigen). Poniewa¿ ró¿ne firmy zajmuj¹ce siê
produkcj¹ przeciwcia³ nie mog³y u¿ywaæ tych samych nazw, przeciwcia³a rozpoznaj¹ce ten sam antygen (zgodnie z obowi¹zuj¹c¹ nomenklatur¹: CD4) otrzyma³y ró¿ne
nazwy, jak np. Leu3, L3T4, OKT4, W3/25, T4 [3, 8].
W 1982 r. w Pary¿u odby³a siê pierwsza miêdzynarodowa Konferencja poœwiêcona
antygenom ró¿nicowania ludzkich leukocytów – HLDA (ang. Human Leucocyte
Differentiation), której celem by³o ujednolicenie nazewnictwa tych antygenów [9].
Konsekwencj¹ by³o wprowadzenie jednolitego systemu nomenklatury przeciwcia³
zgodnego z nazewnictwem przedzia³ów antygenów ró¿nicowania CD (ang. cluster of
differentiation lub cluster designation) – struktur wystêpuj¹cych na powierzchni
komórek, g³ównie leukocytów. Klasyfikacja antygenów oparta by³a na badaniu ich
rozmieszczenia na ró¿nych typach komórek technikami cytometrii przep³ywowej,
mikroskopii fluorescencyjnej oraz immunohistologii. Okreœlone zosta³y te¿ masy
cz¹steczkowe antygenów metod¹ radioimmunoprecypitacji. Na 1. Konferencji HLDA
wyodrêbniono 15 przedzia³ów CD, w których sklasyfikowano oko³o 150 przeciwcia³.
Do 6. Konferencji HLDA, która odby³a siê w 1996 r. w Kobe w Japonii, sklasyfikowano
ponad 1000 przeciwcia³ w 166 przedzia³ach CD obejmuj¹cych limfocyty T i B, komórki
NK, komórki mieloidalne, monocyty, p³ytki krwi [9–14]. Dla porównania, na ostatniej,
8. Konferencji HLDA, która odby³a siê w 2004 r. w Adelaide w Australii,
wyszczególniono 339 przedzia³ów CD, a w niektórych z nich dodatkowo subprzedzia³y.
Przy okazji ostatniej Konferencji HLDA zmieniono jej nazwê na HCDM (ang. Human
Cell Differentiation Molecules), jednoczeœnie rozszerzaj¹c pole badañ na komórki inne
ni¿ leukocyty, takie jak np. komórki œródb³onka [8, 15–19].
II. ZASADY BARWIENIA KOMÓREK
Rezultaty eksperymentów na komórkach czêsto nie s¹ mierzalne poprzez zwyk³¹
obserwacjê preparatu pod mikroskopem. Aby naprawdê przekonaæ siê o wyniku
eksperymentu, nale¿y najpierw w jakiœ sposób uwidoczniæ jego przedmiot – komórki.
Istnieje kilka sposobów uwidaczniania, czyli barwienia komórek:
A. barwienie poœrednie z u¿yciem przeciwcia³:
♦ sprzê¿onych z barwnikami fluorescencyjnymi,
♦ sprzê¿onych z enzymami,
♦ sprzê¿onych z biotyn¹,
♦ wyznakowanych radioizotopami;
B. barwienie poœrednie z u¿yciem cz¹steczek innych ni¿ przeciwcia³a, sprzê¿onych z barwnikami fluorescencyjnymi,
PRZECIWCIA£A MONO- I POLIKLONALNE I ICH ZASTOSOWANIE W CYTOMETRII... 23
C. barwienie wolnymi barwnikami fluorescencyjnymi,
D. barwienie wolnymi barwnikami niefluorescencyjnymi.
Trzy pierwsze g³ówne typy barwieñ maj¹ zastosowanie w cytometrii przep³ywowej
i zostan¹ omówione szerzej w kolejnych podrozdzia³ach. Wybór okreœlonego sposobu
barwienia komórek zale¿y od celu, w jakim barwienie siê przeprowadza. Warto
dodaæ, ¿e wymienione rodzaje barwieñ mog¹ uwidoczniæ struktury powierzchniowe,
wewn¹trzkomórkowe lub jedne i drugie jednoczeœnie (por. ryc. 4 i 5).
II.1. Barwienie poœrednie z u¿yciem przeciwcia³
Przeciwcia³a s¹ bardzo precyzyjnym narzêdziem, dziêki któremu mo¿na selektywnie wybarwiæ po¿¹dan¹ strukturê komórkow¹ – antygen. W wi¹zaniu przeciwcia³a
z antygenem uczestnicz¹ 4 typy oddzia³ywañ: si³y elektrostatyczne (pomiêdzy grupami
R-NH3+ i R-COO–), wi¹zania wodorowe, oddzia³ywania hydrofobowe oraz si³y van
der Waalsa [1, 3, 4]. Na skutek tych oddzia³ywañ dochodzi do trwa³ego i swoistego
zwi¹zania siê przeciwcia³a z antygenem i utworzenia kompleksu immunologicznego.
Trwa³oœæ kompleksu zale¿y od si³y oddzia³ywania przeciwcia³a z antygenem
(powinowactwa), od iloœci determinant antygenu i od tego czy przeciwcia³o jest
poliklonalne czy monoklonalne. Te dwa ostatnie warunki okreœlaj¹ zach³annoœæ wi¹zania
antygen-przeciwcia³o. Stabilnoœæ kompleksu immunologicznego zale¿y te¿ od proporcji
pomiêdzy przeciwcia³em a antygenem, temperatury oraz pH i si³y jonowej roztworu, w
którym zachodzi reakcja. Przy równowadze lub nadmiarze przeciwcia³ w stosunku do antygenu
tworz¹ siê du¿e kompleksy, które maj¹ sk³onnoœæ do precypitacji [3, 4].
Samo zwi¹zanie przeciwcia³a z antygenem nie wystarczy do uwidocznienia kompleksu.
Wiod¹ce zastosowanie w cytometrii przep³ywowej ma barwienie z u¿yciem przeciwcia³
monoklonalnych sprzê¿onych z barwnikami fluorescencyjnymi.
II.1.1. Barwienie poœrednie z u¿yciem przeciwcia³
sprzê¿onych z barwnikami fluorescencyjnymi
Najszerzej stosowanym w cytometrii przep³ywowej sposobem wykrywania
kompleksów antygen-przeciwcia³o jest u¿ycie przeciwcia³ monoklonalnych sprzê¿onych z barwnikiem fluorescencyjnym, tzw. fluorochromem lub fluoroforem, czyli
cz¹steczk¹ maj¹c¹ zdolnoœæ emisji œwiat³a poprzez fluorescencjê po wzbudzeniu
œwiat³em o okreœlonej d³ugoœci fali. ród³em œwiat³a s¹ lasery gazowe lub oparte
na cia³ach sta³ych (kryszta³ach). W cytometrii przep³ywowej znalaz³o zastosowanie
wiele ró¿nych fluorochromów (tab. I). Ka¿dy fluorochrom ma charakterystyczne
dla siebie widmo absorpcji i emisji, dlatego nie ka¿dy fluorochrom mo¿e byæ
wzbudzany przez ka¿dy laser. Dobór barwników fluorescencyjnych zale¿y od tego,
w jakie lasery wyposa¿ony jest cytometr, od liczby detektorów fluorescencji, a tak¿e
od tego, jakie przeciwcia³a, przeciwko jakim antygenom maj¹ byæ u¿ywane w danym
badaniu. Warto zwróciæ uwagê, ¿e niektóre fluorochromy nie mog¹ byæ stosowane
jednoczeœnie, ze wzglêdu na zbyt podobne widmo emisji, wymagaj¹ce zastosowania
tego samego filtru optycznego (np. PE-Cy5, PerCP, PerCp-Cy5.5).
24
£. SÊDEK, B. MAZUR
Stosowanie wielu fluorochromów jednoczeœnie w
wielokolorowej cytometrii
przep³ywowej, oprócz oczywiœcie
du¿ych mo¿liwoœci analizy i
precyzji w okreœleniu immunoLaser(d³. fali)
Fluorochrom
Charakterystyka
fenotypu populacji komórek, niesie
filtru optycznego
ze sob¹ pewne problemy. MianoFioletowy (407 nm)
Pacific Blue
450/50
wicie stosuj¹c jedynie filtry
Am- Cyan
525/50
optyczne nie da siê unikn¹æ
Cascade Yellow
550/30
konsekwencji faktu, ¿e widma
N iebieski(488 nm)
FITC
530/30
emisji poszczególnych fluorochromów zachodz¹ na siebie (ryc.
PE
575/26
3). Zachodzenie widm emisji
Texas Red
630/30
powoduje, ¿e dany detektor
PE- Cy5
695/40
mierzy nie tylko œwiat³o wyemiPerCP
towane przez przypisany do niego
fluorochrom, lecz tak¿e tê czêœæ
PerCP- Cy5.5
œwiat³a wyemitowan¹ przez inny
PE- Cy7
780/60
fluorochrom, która mieœci siê w
¯ó³ty (594 nm)
Alexa 594
618/25
„oknie” przepuszczalnoœci
Czerwony (635 nm)
APC
670/30
spektralnej filtru optycznego
Alexa 680
712/20
umieszczonego przed danym
detektorem. Efekt ten przynajAlexa 700
730/40
mniej czêœciowo jest niwelowany
APC- Cy7
780/60
poprzez odejmowanie od sygna³u
mierzonego w danym kanale
czêœci sygna³u pochodz¹cego od innych fluorochromów. Operacja ta zwana jest kompensacj¹ i
jest przeprowadzana przez komputer steruj¹cy cytometrem dla ka¿dej pary fluorochromów z
TABELA I. Przyk³ady fluorochromów, z którymi sprzêgane s¹
przeciwcia³a stosowane w cytometrii przep³ywowej. FITC –
izotiocyjanian fluoresceiny, PE – fikoerytryna, PE – C y5
(- C y7)- fikoerytryna- cyjanina 5 (7), PerC P(- C y5.5) –
peridininochlorofil (- cyjanina 5.5), APC (- C y7) – allofikocyjanina (- cyjanina 7) [52, 53]
RYCINA 3. Widma emisji ró¿nych fluorochromów zachodz¹ na siebie. Stosowanie filtrów umo¿liwia
rozdzielenie od siebie sygna³ów pochodz¹cych od ró¿nych fluorochromów i wydzielenie interesuj¹cego
wycinka spektrum [64]
PRZECIWCIA£A MONO- I POLIKLONALNE I ICH ZASTOSOWANIE W CYTOMETRII... 25
osobna. Podstaw¹ obliczenia optymalnej kompensacji jest jednak odpowiednie ustawienie
napiêæ na fotopowielaczach sygna³u mierzonej fluorescencji (PMT), gwarantuj¹ce
umiejscowienie wszystkich komórek, w zakresie mierzalnoœci, w sposób taki, aby
mo¿liwe by³o rozró¿nienie pomiêdzy komórkami negatywnymi, s³abo pozytywnymi
lub silnie pozytywnymi na dany antygen. Zadanie to nie jest ³atwe bior¹c pod uwagê
ró¿ne charakterystyki spektralne stosowanych fluorochromów oraz odmienne
zachowania ró¿nych przeciwcia³ sprzê¿onych z tym samym barwnikiem [20–24].
Maj¹c do dyspozycji odpowiednie przeciwcia³a sprzêgniête z barwnikami fluorescencyjnymi mo¿na okreœliæ sk³ad antygenowy komórek w próbce. Okreœlanie sk³adu
antygenowego z u¿yciem przeciwcia³ nazywa siê immunofenotypowaniem, a same
przeciwcia³a stosowane w cytometrii przep³ywowej powinny byæ przeciwcia³ami
monoklonalnymi. Warunkiem przeprowadzenia pomiaru cytometrycznego jest uzyskanie
zawiesiny komórek (lub ich fragmentów) w odpowiednim buforze. O ile tkanki p³ynne
(krew, szpik kostny, p³yn mózgowo-rdzeniowy) przewa¿nie nie wymagaj¹ ¿adnego
wstêpnego przygotowania przed barwieniem, o tyle w przypadku tkanek sta³ych
(wêz³ów ch³onnych, bioptatów) konieczna jest homogenizacja i filtracja. Niektóre
rodzaje materia³u, jak krew i szpik kostny wymagaj¹ zastosowania antykoagulantów
(takich jak EDTA, heparyna) oraz lizy erytrocytów [20, 25]. Dla niektórych
zastosowañ, takich jak immunofenotypizacja szpiku kostnego w diagnostyce bia³aczek
lub ocena liczebnoœci CD34-pozytywnych komórek macierzystych, kluczowym jest,
by badane komórki by³y ¿ywe przed barwieniem [20]. Podstawowym warunkiem
zapewnienia maksymalnej ¿ywotnoœci komórek i integralnoœci ich b³ony komórkowej
jest badanie przeprowadzone na œwie¿o pobranym materiale. Komórki martwe bowiem
czêsto niespecyficznie wi¹¿¹ przeciwcia³a, co powoduje zafa³szowanie wyników i
znacznie utrudnia póŸniejsz¹ analizê [26–27]. W szczególnoœci do analizy cytometrycznej nie nadaje siê wiêc materia³ rozmra¿any. Cytometria przep³ywowa pozwala
na jednoczesn¹ ocenê ¿ywotnoœci badanych komórek. Osi¹gn¹æ to mo¿na stosuj¹c
równolegle do barwienia przeciwcia³ami, barwienie np. jodkiem propidyny (PI), który
wnika do martwych komórek i wi¹¿e siê z ich DNA (por. ni¿ej).
Przygotowanie próbki do pomiaru cytometrycznego zale¿y od tego, czy badany
antygen znajduje siê na powierzchni komórki, czy wewn¹trz niej (cytoplazma, j¹dro
komórkowe).
II.1.1.1. Barwienie powierzchniowe z u¿yciem przeciwcia³
sprzê¿onych z barwnikami fluorescencyjnymi
Barwienie powierzchniowe przeprowadza siê bezpoœrednio po uzyskaniu zawiesiny
materia³u, poprzez inkubacjê z przeciwcia³em monoklonalnym lub czêœciej z wieloma
przeciwcia³ami sprzê¿onymi z ró¿nymi fluorochromami. Barwienie powinno odbywaæ siê
w ciemnoœci, w temperaturze pokojowej. Nastêpnie, komórki musz¹ zostaæ poddane
dzia³aniu buforu utrwalaj¹cego barwienie, który dodatkowo powoduje lizê erytrocytów
niezbêdn¹ do analizy próbek z krwi i szpiku kostnego. W jednym z wariantów protoko³u
barwienia, po etapie lizy, komórki wymagaj¹ przep³ukania buforem, najczêœciej specjalnie
wzbogaconym roztworem PBS w celu usuniêcia niezwi¹zanych przeciwcia³ oraz resztek
roztworu lizuj¹cego. Wi¹zanie przeciwcia³o-antygen jest na ogó³ silne i kompleksy takie s¹ trwa³e
26
£. SÊDEK, B. MAZUR
przez d³u¿szy czas. Przechowywanie wybarwionych próbek nie jest jednak wskazane ze wzglêdu
na fakt, ¿e zdolnoœæ emisji fluorescencji przez fluorochromy mo¿e znacz¹co obni¿yæ siê [28].
Technik¹ cytometrii przep³ywowej mo¿na badaæ rozmaite antygeny powierzchniowe. Najczêœciej s¹ to ró¿ne antygeny ró¿nicowania – cz¹steczki CD, wystêpuj¹ce g³ównie na leukocytach, antygeny p³ytkowe, erytrocytarne, antygeny komórek
macierzystych i wiele innych (ryc. 4).
II.1.1.2. Barwienie wewn¹trzkomórkowe z u¿yciem przeciwcia³
Barwienie antygenów wewn¹trzkomórkowych, zarówno cytoplazmatycznych, jak i
j¹drowych, wymaga wczeœniejszego utrwalenia komórek, najczêœciej poprzez inkubacjê
w roztworze zawieraj¹cym formaldehyd. Po utrwaleniu, komórki musz¹ zostaæ poddane
permeabilizacji ³agodnym detergentem. Jest to proces, w którym b³ona komórkowa
jest czêœciowo dezintegrowana i staje siê przepuszczalna dla cz¹stek okreœlonych
rozmiarów, przy czym komórka jako ca³oœæ nie traci swej integralnoœci. Równoczeœnie
z dzia³aniem œrodka permeabilizuj¹cego, komórki inkubuje siê z przeciwcia³em
monoklonalnym przeciwko wewn¹trzkomórkowemu antygenowi. Odpowiedni dobór
roztworu permeabilizuj¹cego pozwala na przejœcie do wnêtrza komórki nawet tak
du¿ych cz¹steczek jak pentameryczne przeciwcia³o klasy IgM. Podobnie jak przy
barwieniu powierzchniowym konieczne jest odp³ukanie roztworu utrwalaj¹cego i
permeabilizuj¹cego oraz niezwi¹zanych przeciwcia³ roztworem PBS [28]. Najczêœciej
oznaczanymi za pomoc¹ przeciwcia³ monoklonalnych antygenami cytoplazmatycznymi
s¹ cytoplazmatyczne immunoglobuliny (np. cIgµ [29]), enzymy (np. mieloperoksydaza
– MPO [30]), cytokiny wewn¹trzkomórkowe (np. TNFα [31]) oraz cz¹steczki
przekaŸników sygna³u (np. ZAP-70 [32]). Z antygenów j¹drowych nale¿y wymieniæ
wa¿ny w diagnostyce ostrych bia³aczek limfoblastycznych enzym transferazê nukleotydów terminalnych (TdT [33]) (ryc. 4).
Utrwalanie komórek przed barwieniem wewn¹trzkomórkowym niesie jednak ze sob¹
pewien efekt uboczny, polegaj¹cy na zmianie charakterystyki rozproszenia œwiat³a przez
komórki. Nie stanowi to jednak wiêkszego problemu przy analizie takich próbek. Mo¿na
natomiast wykorzystaæ obraz rozproszenia komórek utrwalonych i nieutrwalonych do
porównania zmian spowodowanych u¿yciem œrodka utrwalaj¹cego [20].
II.1.2. Barwienie poœrednie z u¿yciem przeciwcia³
sprzê¿onych z biotyn¹ lub enzymami
Alternatyw¹ dla przeciwcia³ sprzê¿onych z fluorochromami jest ich sprzêganie z
biotyn¹. Do wykrywania kompleksów z antygenem stosuje siê w takich uk³adach
awidynê lub streptawidynê – bia³ka o wysokim powinowactwie do biotyny, które
sprzêgane s¹ z barwnikiem fluorescencyjnym. Jedna cz¹steczka awidyny lub
streptawidyny mo¿e zwi¹zaæ 4 cz¹steczki biotyny, co zwiêksza czu³oœæ testu [34].
Przeciwcia³a mog¹ byæ równie¿ sprzêgane z enzymami. Takie uk³ady nie maj¹
jednak zastosowania w cytometrii przep³ywowej, lecz w innej grupie technik, zwanych
immunoenzymatycznymi. Do najwa¿niejszych z nich nale¿y technika ELISA (ang.
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), Western Blot oraz techniki PAP i APAAP.
PRZECIWCIA£A MONO- I POLIKLONALNE I ICH ZASTOSOWANIE W CYTOMETRII... 27
RYCINA 4. Ró¿ne rodzaje barwieñ i ró¿ne typy prezentacji wyników pomiaru cytometrycznego: A –
barwienie powierzchniowe antygenu CD3 (histogram), B – barwienie wewn¹trzkomórkowe enzymu
j¹drowego transferazy nukleotydów terminalnych TdT po³¹czone z barwieniem powierzchniowym
antygenu CD10 (wykres kropkowy, prezentacja fluorescencji pochodz¹cej od dwóch ró¿nych fluorochromów), C – barwienie wewn¹trzkomórkowe enzymu cytoplazmatycznego mieloperoksydazy
MPO (wykres kropkowy, po³¹czenie obrazu fluorescencji i rozproszenia bocznego SSC)
W najczêœciej stosowanych odmianach testu ELISA przeciwcia³o jest zwi¹zane
ze sta³ym pod³o¿em. Nastêpnie dodawana jest próbka zawieraj¹ca oznaczany
antygen. Kompleks antygenu z przeciwcia³em wykrywany jest przeciwcia³ami
sprzê¿onymi z enzymem, np. peroksydaz¹ chrzanow¹ (HRP) lub alkaliczn¹ fosfataz¹
(AP). W ostatnim etapie testu dodawany jest substrat dla enzymu sprzê¿onego z
przeciwcia³em (np. dichlorowodorek p-fenylenodiaminy dla peroksydazy chrzanowej
lub np. fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indoksylowy (BCIP) lub b³êkit nitrotetrazolowy
(NBT) dla alkalicznej fosfatazy) [35]. Produkt reakcji jest barwny i oznacza siê go
metod¹ spektrofotometryczn¹. Natê¿enie barwy produktu jest proporcjonalne do iloœci
enzymu, która z kolei jest proporcjonalna do iloœci oznaczanego antygenu [36, 37].
Inna z metod – Western Blot opiera siê o wykrywanie bia³ek przeniesionych po
elektroforezie z ¿elu na specjaln¹ membranê nitrocelulozow¹ lub nylonow¹.
28
£. SÊDEK, B. MAZUR
Przeniesione na zasadzie elektrotransferu bia³ka wykrywane s¹ na membranie
przeciwcia³ami rozpoznaj¹cymi badany antygen. Kompleksy antygen-przeciwcia³o
wykrywane s¹ metod¹ immunoenzymatyczn¹, po inkubacji z przeciwcia³ami
drugorzêdowymi sprzê¿onymi z enzymem, podobnie jak w teœcie ELISA [38].
Techniki PAP (peroksydaza-antyperoksydaza) i APAAP (alkaliczna fosfatazaantyalkaliczna fosfataza) s¹ równie¿ przyk³adami barwieñ komórek z u¿yciem
przeciwcia³ sprzê¿onych z enzymami. Ich g³ównym zastosowaniem jest barwienie
rozmazów krwi lub szpiku kostnego. [35]. Metody te polegaj¹ na trzyetapowym
barwieniu antygenu przeciwcia³ami pierwszo-, drugo- i trzeciorzêdowymi. Przeciwcia³o trzeciorzêdowe jest przeciwcia³em rozpoznaj¹cym w³aœciwy dla siebie enzym
(peroksydazê lub alkaliczn¹ fosfatazê). Wykrywanie kompleksu odbywa siê po
dodaniu roztworów odpowiedniego enzymu, a nastêpnie substratu. Takie wielostopniowe barwienie zapewnia wysok¹ czu³oœæ i stabilnoœæ powsta³ych kompleksów.
Jednak ze wzglêdu na pracoch³onnoœæ tych technik zosta³y one prawie ca³kowicie
zast¹pione prostszymi, lecz równie czu³ymi metodami [34].
II.1.3. Inne barwienia z u¿yciem przeciwcia³
Do barwienia komórek i uwidaczniania kompleksów antygen-przeciwcia³o mog¹ s³u¿yæ
te¿ przeciwcia³a znakowane radioizotopami. Takie przeciwcia³a nie maj¹ jednak zastosowania w cytometrii przep³ywowej. Technikami alternatywnymi do cytometrii przep³ywowej
opartymi na wykrywaniu radioizotopów s¹ metody emisyjnej tomografii pozytonowej – PET
(ang. Positron Emission Tomography) i emisyjnej tomografii pojedynczego fotonu –
SPECT (ang. Single Photon Emission Computed Tomography) [39, 40].
II.2. Barwienie poœrednie z u¿yciem cz¹steczek innych ni¿ przeciwcia³a,
sprzê¿onych z barwnikami fluorescencyjnymi
Z barwnikami fluorescencyjnymi mog¹ byæ równie¿ sprzêgane inne ni¿ przeciwcia³a cz¹steczki. Przyk³adami mog¹ byæ lektyny wi¹¿¹ce wêglowodany [41] oraz
tzw. przeciwcia³a antyfosfolipidowe, których przedstawicielem jest np. aneksyna V.
Ten ostatni zwi¹zek ma zdolnoœæ wi¹zania siê z fosfatydyloseryn¹ – fosfolipidem
b³onowym. W warunkach fizjologicznych fosfolipid ten znajduje siê po wewnêtrznej
(cytoplazmatycznej) stronie b³ony komórkowej. Kiedy jednak komórka wchodzi na
drogê apoptozy, fosfatydyloseryna zostaje przemieszczona na zewnêtrzn¹ stronê
b³ony. Fakt ten zosta³ wykorzystany w jednej z metod wykrywania apoptozy, w której
aneksyna V jest stosowana w parze z jodkiem propidyny (ryc. 5). Test z u¿yciem
aneksyny V i jodku propidyny jest przyk³adem jednoczesnego barwienia powierzchniowego i wewn¹trzkomórkowego [42–44].
II.3. Barwienie wolnymi barwnikami fluorescencyjnymi
W przypadku barwienia z u¿yciem przeciwcia³ sprzê¿onych z fluorochromami,
ka¿dy ze sk³adników odgrywa swoj¹ rolê: przeciwcia³o wi¹¿e siê swoiœcie z
odpowiednim antygenem, natomiast fluorochrom pozwala wykryæ utworzony
PRZECIWCIA£A MONO- I POLIKLONALNE I ICH ZASTOSOWANIE W CYTOMETRII... 29
kompleks. Barwniki fluorescencyjne stosowane samodzielnie mog¹ spe³niaæ
obydwie te funkcje jednoczeœnie: wi¹¿¹ siê
z odpowiedni¹ dla siebie struktur¹ docelow¹
i daj¹ wykrywalny sygna³ utworzenia
kompleksu. Spektrum barwników fluorescencyjnych, które mo¿na stosowaæ w stanie
wolnym, niesprzê¿onym z przeciwcia³ami
jest szerokie, podobnie jak spektrum zastosowañ takich barwieñ. Barwniki fluorescencyjne w stanie wolnym, w wiêkszoœci maj¹ zdolnoœæ wi¹zania siê z DNA,
co zna-az³o zastosowanie m.in. w testach
okreœlaj¹cych zawartoœæ DNA w komórce.
Za pomoc¹ innych wolnych barwników RYCINA 5. Wykrywanie apoptozy: æwiartka Q1 –
mo¿liwe jest badanie procesów oksy- komórki nekrotyczne (wybarwione jedynie jodkiem
propidyny), æwiartka Q2 – komórki w póŸnej fazie
dacyjnych (wybuch tlenowy), badanie apoptozy (wybarwione zarówno aneksyn¹ V, jak i
zmian potencja³u b³onowego, zdolnoœci jodkiem propidyny), æwiartka Q3 – komórki ¿ywe,
fagocytarnej komórek, wewn¹trz- æwiartka Q4 – komórki we wczesnej fazie apoptozy
komórkowego pH, czy aktywnoœci (wybarwione tylko aneksyn¹ V)
enzymatycznej. Najwa¿niejsze barwniki
wraz z zastosowaniami zosta³y zebrane w tabeli II.
II.3.1. Barwniki wi¹¿¹ce siê z DNA
Barwniki fluorescencyjne (jak np. bromek etydyny czy jodek propidyny) wi¹¿¹ siê z DNA
poprzez interkalacjê pomiêdzy komplementarnymi zasadami obydwu jego nici. Jest to wi¹zanie
stechiometryczne, dziêki czemu mo¿liwa jest nie tylko jakoœciowa ocena reakcji tych barwników
z DNA, ale równie¿ i
iloœciowa. Barwienie DNA
danej próbki mo¿e daæ dwa
rodzaje informacji: na temat
ploidii DNA oraz proporcji
pomiêdzy komórkami znajduj¹cymi siê w poszczególnych fazach cyklu
komórkowego (ryc. 6). Ta
grupa barwników znalaz³a
wiêc szczególne zastosowanie
w diagnostyce ró¿nych
chorób przebiegaj¹cych z
zaburzeniem ploidii DNA, RYCINA 6. Profil DNA. Najwy¿szy pik to komórki niedziel¹ce siê,
b¹dŸ cyklu komórkowego bêd¹ce w fazie G0 lub G1 cyklu komórkowego (komórki diploidalne).
Drugi mniejszy pik to komórki w fazie G2 i M (mitozy), o podwojonej
[20, 45]. Poprzez porównanie iloœci DNA (komórki tetraploidalne). Pomiêdzy
pikami znajduj¹ siê
po³o¿enia piku odpowia- komórki w fazie S (syntezy DNA)
30
£. SÊDEK, B. MAZUR
TABELA II. Barwniki fluorescencyjne stosowane w stanie wolnym do barwienia komórek i ich
zastosowanie
Barwnik
Mo¿liwe zastosowanie
PI* (jodek propidyny)
badanie ¿ywotnoœci komórek,wykrywanie [20], [28], [44],
apoptozy, ocena fazy cyklu komórkowego, [54], [55]
ocena ploidii DN A,wykrywanie aneuploidii
EtBr* (bromek etydyny)
DAPI* (4',6- diamidino- 2- fenylindol)
Literatura
Hoechst 33258*, 33342*
FDA** (dwuoctan fluoresceiny)
pomiar wybuchu tlenowego,
badanie ¿ywotnoœci komórek
[55], [56]
HE** (hydroetydyna)
pomiar wybuchu tlenowego
[57, 58]
[57, 59, 60]
DHR** (dihydrorodamina 123)
pomiar wybuchu tlenowego,
badanie aktywnoœci enzymów
[57, 59]
ró¿ne estry fluoresceiny**
badanie aktywnoœci enzymów,
ocena zdolnoœci fagocytarnej komórek
[58, 60, 61]
diacetoksy- 2,3- dicyjanobenzen
badanie wewn¹trzkomórkowego pH
[62]
CFSE**
badanie odpowiedzi limfocytów T na ró¿ne [63]
antygeny
DCFH- DA**
(dwuoctan dichlorofluoresceiny)
* barwniki wi¹¿¹ce siê z DN A; ** barwniki nabywaj¹ce w³aœciwoœci fluorescencyjne po przekszta³ceniu
przez enzym
daj¹cego fazie G0/G1 (faza spoczynku) pomiêdzy próbk¹ badan¹ a diploidaln¹ próbk¹
kontroln¹, mo¿na okreœliæ jej ploidiê. Natomiast okreœlenie proporcji komórek w
poszczególnych fazach cyklu wymaga podzielenia histogramu na trzy regiony
odpowiadaj¹ce fazom G0/G1, S (faza syntezy DNA) i G2/M (faza po zakoñczeniu
replikacji i mitoza) oraz obliczenia powierzchni pod pikami (fazy G0/G1 i G2/M) i
pomiêdzy nimi (faza S).
II.3.2. Barwniki nabywaj¹ce w³aœciwoœci fluorescencyjnych
po przekszta³ceniu przez enzym
Istniej¹ te¿ barwniki, które dopiero po przekszta³ceniu przez enzym nabywaj¹
zdolnoœci do emisji fluorescencji (tab. II). Stosuje siê je do pomiarów aktywnoœci
enzymów, które tê konwersjê przeprowadzaj¹. Najszersze zastosowanie maj¹ zwi¹zki, które nabywaj¹ w³aœciwoœci fluorescencyjnych po utlenieniu przez reaktywne
formy tlenu, takie jak: nadtlenek wodoru (H2O2) – produkt aktywnoœci dysmutazy
ponadtlenkowej (SOD), a tak¿e rodnik hydroksylowy (oOH) oraz tlen singletowy
( 1O 2). Reaktywne formy tlenu s¹ wytwarzane przez aktywowane inicjacj¹
fagocytozy granulocyty w procesie zwanym wybuchem tlenowym, najczêœciej jako
odpowiedŸ na infekcje bakteryjne. W wybuchu tlenowym granulocyty, a tak¿e
PRZECIWCIA£A MONO- I POLIKLONALNE I ICH ZASTOSOWANIE W CYTOMETRII... 31
monocyty, przy udziale enzymu mieloperoksydazy (MPO) mog¹ produkowaæ kwas
podchlorawy (HClO) [46–48].
II.4. Barwienie wolnymi barwnikami niefluorescencyjnymi
Istnieje jeszcze du¿a grupa barwników, które nie wykazuj¹ w³aœciwoœci fluorescencyjnych, jednak s¹ szeroko stosowane do barwienia komórek. Barwienie komórek
z u¿yciem tego typu barwników nie ma jednak zastosowania w cytometrii przep³ywowej. Barwniki te stosuje siê np. do barwienia rozmazów krwi lub szpiku kostnego
(barwienie metodami May-Grünwald-Giemsy, Wrighta, Romanovsky'ego, Pappenheima), a tak¿e w testach ¿ywotnoœci (b³êkit trypanu) [49].
Do tej grupy barwników nale¿¹ te¿ zwi¹zki, które daj¹ barwny produkt w wyniku
reakcji enzymatycznej. Przyk³adem mo¿e byæ b³êkit nitrotetrazolowy (NBT), który
w formie zredukowanej tworzy niebieskie kryszta³y. Wykorzystuje siê go do oceny
aktywnoœci enzymów oksydoredukcyjnych (g³ównie alkalicznej fosfatazy) i zdolnoœci
fagocytarnej komórek [35, 50]. Innym zwi¹zkiem s³u¿¹cym do badania aktywnoœci
enzymów oksydoredukcyjnych (g³ównie peroksydazy) jest diaminobenzydyna (DAB),
daj¹ca po utlenieniu barwny produkt [35, 51].
Inne barwniki z tej grupy maj¹ zastosowanie w diagnostyce bia³aczek i zespo³ów
limfoproliferacyjnych. Nale¿¹ tu np. Sudan czarny B barwi¹cy lipidy obojêtne,
fosfolipidy i cerebrozydy, PAS (periodic-acid-Schiff) wi¹¿¹cy siê z glikogenem, a
tak¿e estry fosforanów – substraty enzymu lizosomalnego kwaœnej fosfatazy oraz
wspomniane wczeœniej fosforany zwi¹zków aromatycznych, bêd¹ce substratem dla
alkalicznej fosfatazy granulocytów (FAG) [35, 51].
LITERATURA
[1] GO£¥B J, JAKÓBISIAK M, LASEK W. Immunologia. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2002.
[2] ROITT I, BROSTOFF J, MALE D. t³um. pod red. J. ¯eromskiego. Immunologia. Wydawnictwo Medyczne
S³otwiñski Verlag, Brema 1996.
[3] KEREN DF. Background on surface marker assays and immunologic reagents. W: Keren DF, McCoy Jr. JP,
Carey JL. [red.] Flow cytometry in clinical diagnosis. ASCP Press, American Society for Clinical Pathology, Chicago 2001: 1–26.
[4] BOENISCH T. Antibodies.W: Boenisch T. [red.] Immunochemical Staining Methods Handbook. Dako
Corporation, Carpinteria, California, 3rd Edition, 2001: 5–11.
[5] PETERS JH, BAUMGARTEN H. [red.] Monoclonal antibodies. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg: 1992.
[6] BOENISCH T. Diluent buffer ions and pH: their influence on the performance of monoclonal antibodies
in immunohistochemistry. Appl Immunohistochem 1999; 7(4): 300–306.
[7] KOHLER G, MILSTEIN C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.
Nature 1975; 256: 445–497.
[8] ZOLA H, SWART B, NICHOLSON I, AASTED B, BENSUSSAN A, BOUMSELL L, BUCKLEY C, CLARK
G, DRBAL K, ENGEL P, HART D, HOREJSI V, ISACKE C, MACARDLE P, MALAVASI F, MASON D,
OLIVE D, SAALMUELLER A, SCHLOSSMAN SF, SCHWARTZ-ALBEIZ R, SIMMONS P, TEDDER
TF, UGUCCIONI M. WARREN H. CD molecules 2005: human cell differentiation molecules. Blood
2005;106(9): 3123–3126.
[9] BERNARD A, BOUMSELL L, DAUSSET J et al. [red.] Leucocyte typing. Springer-Verlag, Berlin: 1984.
[10] RENHERZ EL, HAYNES BF, NADLER LM et al. [red.] Leukocyte typing II. Springer-Verlag, New York,
NY: 1986.
32
£. SÊDEK, B. MAZUR
[11] MCMICHAEL AJ. [red.] Leukocyte typing III. Oxford University Press, Oxford: 1987.
[12] KNAPP W, DORKEN B, GILKS WR et al. [red.] Leucocyte typing IV. Oxford University Press, Oxford:
1990.
[13] SCHLOSSMANN SF, BOUMSELL L, GILKS W et al. [red.] Leukocyte typing V. Oxford University Press,
New York, NY: 1995.
[14] KISHIMOTO T, KIKUTANI H, VON DEM BORNE A et al. [red.] Leukocyte typing VI. Garland
Publishing Inc, New York, NY: 1997.
[15] ABDO M, IRVING B, HUDSON P, ZOLA H. Development of a cluster of differentiation antibody-based
protein microarray. J Immunol Methods 2005; 305(1): 3–9.
[16] ALGANIK MP, HARDIE DL, SWART B, DANDIE GW, ZOLA H, SHAW S, SHAPIRO H, TINCKAM K,
MILFORD EL, WAND MP. Detecting antibodies with similar reactivity patterns in the HLDA8 blind
panel of flow cytometry data. J Immunol Methods 2005; 305(1): 67–74.
[17] VIDAL-LALIENA M, ROMERO X, MARCH S, REQUENA V, PETRIZ J, ENGEL P. Characterization of
antibodies submitted to the B cell section of the 8th Human Leukocyte Differentiation Antigens Workshop by flow cytometry and immunohistochemistry. Cell Immunol 2005 Sep 10 [w druku].
[18] REDDY M, WONG J, DAVIS C, PRABHAKAR U. Co-expression of IL-12 receptors along with CXCR3
and CD25 on activated peripheral blood T lymphocytes. Cell Immunol 2005 Sep 12 [w druku].
[19] HALDER S, HARDIE DL, SCHEEL-TOELLNER D, SALMON M, BUCKLEY CD. Generation and
characterization of novel stromal specific antibodies. Cell Res 2005; 15(9): 739–744.
[20] MCCOY JR. JP. Basic principles in clinical flow cytometry. W: Keren DF, McCoy Jr. JP, Carey JL. [red.] Flow
cytometry in clinical diagnosis. ASCP Press, American Society for Clinical Pathology, Chicago 2001: 45–57.
[21] KANTORSKI J. Podstawy cytometrii przep³ywowej. Centr Eur J Immunol 1996; 21: 87–93.
[22] RADCLIFF G, JAROSZEWSKI MJ. Basics of flow cytometry. Methods Mol Biol 1998; 91: 1–24.
[23] GIVAN AL. Flow cytometry: an introduction. Methods Mol Biol 2004; 263: 1–32.
[24] MAECKER HT, TROTTER J. Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of
Positivity. Cytometry Part A 2006; 69A: 1037–1042.
[25] ¯EROMSKI J, DWORACKI G. Ocena immunofenotypu komórek limfoidalnych przy pomocy cytometrii przep³ywowej – uwagi praktyczne i zastosowanie kliniczne. Centr Eur J Immunol 1996; 21: 99–106.
[26] ORFAO A, SCHMITZ G, BRANDO B, RUIZ ARGUELLES A, BASSO G, BRAYLAN R et al. Clinically
useful information provided by the flow cytometric immunophenotyping of hematological malignancies: current status and future directions. Clin Chem 1999; 45: 1708–1717.
[27] PITUCH-NOWOROLSKA A. Zastosowanie cytometrii przep³ywowej do diagnostyki bia³aczek i ch³oniaków nieziarniaczych. Centr Eur J Immunol 1996; 21: 138–146.
[28] SÊDEK £, MAZUR B. Wieloparametryczna cytometria przep³ywowa jako nowa technika w rêku diagnosty laboratoryjnego – cz. II. Laboratorium. Przegl¹d Ogólnopolski 2007; 4: 42–46.
[29] KONIKOVA E, BABUSIKOVA O, MESAROSOVA A, KUSENDA J, GLASOVA M. Cytoplasmic and surface
membrane phenotypic markers in cells of B cell chronic lymphocytic leukemia. Neoplasma 1994; 41(2): 69–74.
[30] PEFFAULT DE LATOUR R, LEGRAND O, MOREAU D, PERROT JY, BLANC CM, CHAOUI D,
CASADEVALL N, MARIE JP. Comparison of flow cytometry and enzyme cytochemistry for the
detection of myeloperoxydase in acute myeloid leukaemia: interests of a new positivity threshold. Br J
Haematol 2003; 122(2): 211–216.
[31] ROSTAING L, PERES C, TKACZUK J, CHARLET JP, BORIES P, DURAND D, OHAYON E, DE
PREVAL C, ABBAL M. Ex vivo flow cytometry determination of intracytoplasmic expression of IL-2,
IL-6, IFN-gamma, and TNF-alpha in monocytes and T lymphocytes, in chronic hemodialysis patients.
Am J Nephrol 2000; 20(1): 18–26.
[32] WIESTNER A. Flow cytometry for ZAP-70: New colors for chronic lymphocytic leukemia. Cytometry
B Clin Cytom 2006; 70(4): 201–203.
[33] FARAHAT N, LENS D, MORILLA R, MATUTES E, CATOVSKY D. Differential TdT expression in
acute leukemia by flow cytometry: a quantitative study. Leukemia 1995; 9(4): 583–587.
[34] BOENISCH T. Staining methods.W: Boenisch T. [red.] Immunochemical Staining Methods Handbook.
Dako Corporation, Carpinteria, California, 3rd Edition, 2001: 26–31.
[35] BOENISCH T. Basic Enzymology.W: Boenisch T. [red.] Immunochemical Staining Methods Handbook.
Dako Corporation, Carpinteria, California, 3rd Edition, 2001: 14–16.
[36] MADERSBACHER S, WOLF H, GERTH R, BERGER P. Increased ELISA sensitivity using a modified
method for conjugating horseradish peroxidase to monoclonal antibodies. J Immunol Methods 1992;
152(1): 9–13.
PRZECIWCIA£A MONO- I POLIKLONALNE I ICH ZASTOSOWANIE W CYTOMETRII... 33
[37] MARKHAM R, YOUNG L, FRASER IS. An amplified ELISA for human tumour necrosis factor alpha.
Eur Cytokine Netw 1995; 6(1): 49–54.
[38] LAZZAROTTO T, MAINE GT, DAL MONTE P, RIPALTI A, LANDINI MP. A novel Western blot test
containing both viral and recombinant proteins for anticytomegalovirus immunoglobulin M detection. J
Clin Microbiol 1997; 35(2): 393–397.
[39] VEREL I, VISSER GW, VOSJAN MJ, FINN R, BOELLAARD R, VAN DONGEN GA. High-quality 124Ilabelled monoclonal antibodies for use as PET scouting agents prior to 131I-radioimmunotherapy. Eur
J Nucl Med Mol Imaging 2004; 31(12):1645–1652.
[40] BOUCEK JA, TURNER JH. Validation of prospective whole-body bone marrow dosimetry by SPECT/CT
multimodality imaging in 131I-anti-CD20 rituximab radioimmunotherapy of non-Hodgkin's lymphoma. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2005; 32(4): 458–469.
[41] GUASCH RM, GUERRI C, O'CONNOR JE. Study of surface carbohydrates on isolated Golgi subfractions
by fluorescent-lectin binding and flow cytometry. Cytometry 1995; 19(2): 112–118.
[42] WILKINS RC, KUTZNER BC, TRUONG M, SANCHEZ-DARDON J, MCLEAN JR. Analysis of radiation-induced apoptosis in human lymphocytes: flow cytometry using Annexin V and propidium iodide
versus the neutral comet assay. Cytometry 2002; 48(1): 14–19.
[43] DARZYNKIEWICZ Z, HUANG X, OKAFUJI M, KING MA. Cytometric methods to detect apoptosis.
W: Darzynkiewicz Z, Roederer M, Tanke HJ [red.] Cytometry, 4th Edition: New Developments. Methods in Cell Biology. Elsevier Academic Press 2004; 75: 325–327.
[44] HERMES I, HAANEN C, STEFFENS-NAKKEN H, REUTELINGSPERGER C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled annexin V. J Immunol Methods 1995; 184: 39.
[45] TRAGANOS F. Mechanism of antitumor drug action assessed by cytometry. W: Darzynkiewicz Z,
Roederer M, Tanke HJ [red.] Cytometry, 4th Edition: New Developments. Methods in Cell Biology.
Elsevier Academic Press 2004; 75: 265–273.
[46] ZIELIÑSKA M, FENRYCH W, KOSTRZEWA A, WIKTOROWICZ K. Cytometryczny pomiar wybuchu
oddechowego. Diagn Lab 1997; 33: 47–57.
[47] ALVAREZ-LARRAN A, TOLL T, RIVES S, ESTELLA J. Assessment of neutrophil activation in whole
blood by flow cytometry. Clin Lab Hematol 2005; 27(1): 41–46.
[48] MIÊDZOBRODZKI J, ZEMANEK G, BARAN J. Chemiluminescencja – opis zjawiska, mo¿liwoœci jego
detekcji i wykorzystania. Mikrobiologia Medycyna 1999; 1(18).
[49] PAWELSKI S. [red.] Wyposa¿enie i organizacja pracowni hematologicznej – Mariañska B. PZWL, Wyd.
III, Warszawa 1990: 22–24.
[50] PAWELSKI S. [red.] Badania krwinek bia³ych – Mariañska B. PZWL, Wyd. III, Warszawa 1990: 139.
[51] PAWELSKI S. [red.] Diagnostyczne badania cytochemiczne i cytoenzymatyczne – Litwin J. PZWL,
Wyd. III, Warszawa 1990: 148–161.
[52] WOOD B. 9 and 10 color flow cytometry in the clinical laboratory. Arch Pathol Lab Med 2006; 130:
680–690.
[53] www.bdbiosciences.com/spectra
[54] MAZZINI G, FERRARI C, ERBA E. Dual excitation multi-fluorescence flow cytometry for detailed
analyses of viability and apoptotic cell transition. Eur J Histochem 2003; 47(4): 289–298.
[55] JAYPAL V, SHARMILA KM, SELVIBAI G, THYAGARAJAN SP, SHANMUGASUNDRAM N, SUBRAMANIAN S. Fluorescein diacetate and ethidium bromide staining to determine the viability of Mycobacterium smegmatis and Escherichia coli. Lepr Rev 1991; 62(3): 310–314.
[56] CLARKE JM, GILLINGS MR, ALTAVILLA N, BEATTIE AJ. Potential problems with fluorescein
diacetate assays of cell viability when testing natural products for antimicrobial activity. J Microbiol
Methods 2001; 46(3): 261–267.
[57] WALRAND S, VALEIX S, RODRIGUEZ C, LIGOT P, CHASSAGNE J, VASSON MP. Flow cytometry
study of polymorphonuclear neutrophil oxidative burst: a comparison of three fluorescent probes. Clin
Chim Acta 2003; 331(1–2): 103–110.
[58] PERTICARARI S, PRESANI G, MANGIAROTTI MA, BANFI E. Simultaneous flow cytometric method
to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry 1991; 12(7): 687–693.
[59] SMITH JA, WEIDEMANN MJ. Further characterization of the neutrophil oxidative burst by flow
cytometry. J Immunol Methods 1993; 162(2): 261–268.
[60] CASADO JA, MERINO J, CID J, SUBIRA ML, SANCHEZ-IBARROLA A. Simultaneous evaluation of
phagocytosis and Fc R-mediated oxidative burst in human monocytes by a simple flow cytometry
method. J Immunol Methods 1993; 159(1–2): 173–176.
34
£. SÊDEK, B. MAZUR
[61] CONRADS G, HERRLER A, MOONEN I, LAMPERT F, SCHNITZLER N. Flow cytometry to monitor
phagocytosis and oxidative burst of anaerobic periodontopathogenic bacteria by human polymorphonuclear leukocytes. J Periodontal Res 1999; 34(3): 136–144.
[62] COOK JA, FOX MH. Intracellular pH measurements using flow cytometry with 1,4-diacetoxy-2,3dicyanobenzene. Cytometry 1988; 1: 143–151.
[63] LYONS AB, HASBOLD J, HODGKIN PD. Flow cytometric analysis of cell division history using dilution
of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, a stably integrated fluorescent probe. Methods Cell
Biol 2001; 63: 375–398.
[64] BD FACSDiva Software Reference Manual.
Bogdan Mazur
ul. Jordana 19, 41-808 Zabrze
e-mail: [email protected]