Wyznaczanie parametrów kinetycznych reakcji enzymatycznej

Pracownia specjalizacyjna z chemii organicznej
Instrukcja do ćwiczenia A1
„WYZNACZANIE PARAMETRÓW KINETYCZNYCH REAKCJI ENZYMATYCZNEJ”
1. Wstęp teoretyczny
Reakcje
enzymatyczne
można
scharakteryzować
odpowiednimi
parametrami
kinetycznymi (stałe szybkości reakcji) i termodynamicznymi (stałe równowagi reakcji).
Wśród parametrów kinetycznych można wyróżnić stałe przed osiągnięciem stanu
stacjonarnego (można je wyznaczyć za pomocą tzw. rapid kinetics) i stałe charakteryzujące
stan stacjonarny, czyli szybkość maksymalną Vmax i stałą Michaelisa Km (dla enzymów
zachowujących się według mechanizmu Michaelisa-Menten, w praktyce jest to większość
enzymów katalizujących reakcje pierwszego lub pseudopierwszego rzędu).
Vmax to szybkość reakcji przy hipotetycznym nieskończonym stężeniu substratu, wiąże
się ona ze stężeniem enzymu [E] za pomocą równania:
Vmax = k cat ∗ [ E ]
gdzie kcat to stała katalityczna reakcji.
Km to takie stężenie substratu, przy którym szybkość jest połową szybkości
maksymalnej. W praktyce jednak nie wyznacza się samej wartości Km, lecz Vmax/Km lub
kcat/Km. Szybkość reakcji v dla danego stężenia substratu [S] jest opisana równaniem
Michaelisa-Menten:
v=
k cat ∗ [ S ] ∗ [ E ]
( K m + [ S ])
Wyznaczenie
wartości
parametrów
kinetycznych
charakteryzujących
reakcję
enzymatyczną ma duże znaczenie w badaniach własności biokatalizatorów. Celem ćwiczenia
będzie wyznaczenie parametrów kinetycznych reakcji katalizowanej przez fenololiazę
tyrozynową (β-tyrozynazę, TPL; E.C. 4.1.99.2) - enzym występujący głównie u Gramujemnych Enterobacteriaceae, a także u części stawonogów. Enzym ten katalizuje reakcję
hydrolitycznego rozkładu L-tyrozyny do pirogronianu, fenolu i amoniaku. Kofaktorem TPL
jest fosforan pirydoksalu (PLP).
COOH
HO
NH2
+
TPL
H 2O
PLP HO
+
O
COOH
+
NH3
2. Podstawowe zasady pomiaru parametrów kinetycznych charakteryzujących
stan stacjonarny reakcji enzymatycznej
Pomiary kinetyki stanu stacjonarnego reakcji prowadzi się przygotowując typowo od 6
do 10 próbek zawierających różne stężenia substratu. Podczas przygotowania najlepiej jest
sporządzić mieszaninę zwierającą bufor, kofaktory i enzym, a następnie rozpipetować ją na
próbki. Reakcję inicjuje dodanie różnych ilości substratu. Taka strategia minimalizuje błędy
pipetowania reagentów. Równoległe przeprowadzenie pomiarów dla różnych stężeń
wychodząc ze wspólnej mieszaniny enzymu i kofaktora pozwala uniknąć błędów
spowodowanych różnymi warunkami reakcji, co ma miejsce podczas eksperymentów
nierównoległych.
Do pomiaru kinetyki najczęściej stosuje się spektrofotometrię UV-VIS. Jeśli żaden
z substratów lub produktów reakcji nie posiada znaczącej absorpcji, stosuje się układ
sprzężony, który z dużo większą szybkością (aby szybkość była limitowana tylko
zachodzeniem głównej reakcji) od badanej reakcji
nieodwracalnie przekształca któryś
z produktów dając jednocześnie możliwość detekcji zmian. Mierzy się początkową szybkość
reakcji, gdy cały proces biegnie liniowo, a zużycie substratu jest niewielkie i nie ma wpływu
na tempo procesu.
Stężenia substratu dużo wyższe od Km pozwalają na dość dokładne wyznaczenie kcat,
stężenia niższe sprzyjają bardziej dokładnym pomiarom kcat/Km. Reakcje przeprowadza się
równolegle. Po zmierzeniu szybkości reakcji należy optymalizować dane (szybkości reakcji
dla odpowiadających im stężeń substratów) do równania kinetycznego (tutaj jest to równanie
Michaelisa-Menten). Pomiary
parametrów
kinetycznych
reakcji
enzymatycznych
są
obciążone dużymi błędami eksperymentalnymi, zwykle nie mniejszymi niż 5%.
3. Układ eksperymentalny stosowany w ćwiczeniu
Do mieszaniny reakcyjnej należy dodawać duży nadmiar układu LDH (dehydrogenaza
mleczanowa)/NADH (zredukowany dwunukleotyd nikotynamido-adeninowy). W pomiarach
kinetyki reakcji katalizowanej przez TPL umożliwia to detekcję powstającego pirogronianu,
albowiem w wyniku jego szybkiej, następczej redukcji do
L-mleczanu
NADH ulega
utlenianiu do NAD+. Obydwie formy nukleotydu różnią się znacznie absorpcją przy długości
fali 340nm, gdzie NAD+ ma absorpcję zaniedbywalnie małą, a NADH silnie absorbuje
światło (milimolowy współczynnik ekstynkcji wynosi 6.22).
Ponieważ stosuje się duży nadmiar LDH, o szybkości pojawiania się NAD+
(i wynikającego z tego spadku absorpcji) decyduje tylko i wyłącznie szybkość pojawiania się
pirogronianu – produktu reakcji rozkładu L-tyrozyny.
W celu wykonania pomiarów najpierw należy przygotować mieszaninę zawierającą
wszystkie reagenty bez substratu (tzn. enzym, kofaktor, LDH, NADH), oraz oddzielnie
roztwór substratu o stężeniu 3mM (trudno jest sporządzić roztwory tyrozyny o dobrze
określonym wyższym stężeniu ze względu na niską rozpuszczalność tego aminokwasu
w wodzie; jest to przyczyna zwiększenia błedów eksperymentalnych). Z przygotowanej
mieszaniny bez substratu należy pobrać równe objętości do 6 kwarcowych kuwet, dodać
odpowiednią ilość buforu, a potem substratu tak, aby końcowa objętość roztworu w każdej
kuwecie była równa 1.5ml.
Do pomiarów używa się zakresu stężeń substratu od 0.4mM do 2.5mM. Każda
z sześciu kuwet zawiera inne stężenie substratu. Szybkość reakcji można przeliczyć ze spadku
absorpcji w czasie. Ponieważ NADH ulega w warunkach reakcji powolnemu rozkładowi
(30.4nM/min) należy uwzględnić poprawkę na tę reakcję uboczną.
Uzyskane dane (zależność szybkości reakcji od stężenia substratu) z każdego
równoległego pomiaru (dla sześciu stężeń substratu) wykorzystuje się do optymalizacji
parametrów kinetycznych reakcji (kcat i kcat/Km) do równania Michaelisa-Menten.
Optymalizację wykonuje się za pomocą programu Enzfitter 1.05. Następnie należy uśrednić
parametry otrzymane z wszystkich pomiarów dla danego substratu. Błędy pomiaru wyznacza
się z równania Studenta dla 95% poziomu ufności.
4. Procedura eksperymentalna:
Należy przygotować mieszaninę zawierającą 0.326mM PLP (dodając 0.450ml 1mM
roztworu), 0.652mM NADH (0.450ml 2mM), 88.4U/ml LDH z mięśnia królika (0.450ml
271U/ml), i 14.3nM (4.35U/ml) TPL z Citrobacter freundii. (0.030ml 0.658µM). Do sześciu
kuwet kwarcowych o grubości 1.00cm należy dodać po 0.230ml sporządzonego roztworu,
a następnie różne objętości buforu i 3mM roztworu L-tyrozyny tak, aby objętość roztworu
wynosiła 1.5ml. Stężenie substratu w tak przygotowanych roztworach wynosiło od 0.5 do
2.5mM. Należy mierzyć równolegle początkowy spadek absorpcji we wszystkich 6 kuwetach
przy 340nm za pomocą spektrofotometru UV-VIS 1202 Shimadzu. Uwzględniając
milimolowy współczynnik NADH (6.22) należy wyznaczyć szybkości reakcji dla różnych
stężeń substratu, a następnie fitować do nich kcat i kcat/Km używając równania MichaelisaMenten za pomocą programu Enzfitter 1.05 (Elsevier).