1 Ćwiczenie 3. Metabolizm organizmów Cel ćwiczeń

1 Ćwiczenie 3. Metabolizm organizmów Cel ćwiczeń

wiczenie 3. Metabolizm organizmów
Cel wicze :
Zapoznanie si z przebiegiem podstawowych procesów metabolicznych towarzysz cych
neutralizacji zanieczyszcze i wykorzystywanych w rozwi zaniach technologicznych
in ynierii rodowiska.
Zagadnienia teoretyczne:
1. Typy od ywiania si organizmów – ródła makroelementów i mikroelementów
2. Sposoby zdobywania energii – oddychanie tlenowe, beztlenowe, fermentacja
3. Rodzaje substratów energetycznych wykorzystywanych przez organizmy ywe
4. Asymilacja dwutlenku w gla: fotosynteza bakteryjna i ro linna, chemosynteza
5. Fosforylacja substratowa, oksydatywna, fotooksydacja
Materiały:
podło a stałe, ró nicuj ce: McConkey agar, ENDO agar, agar od ywczy + purpura
bromokrezolowa + ró ne ródła w gla (glukoza, glicerol, mannitol, cytrynian Na, laktoza),
agar od ywczy + skrobia.
podło a płynne: bulion od ywczy + laktoza + purpura bromokrezolowa.
szczepy bakteryjne: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens,
Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis, Sarcina lutea.
zielona masa ro linna (natka pietruszki lub in.), 96% alkohol etylowy, płyn rozwijaj cy:
toluen: eter: aceton (10:2,5:2)
moczarka kanadyjska
ziemia ogrodowa, 50mM KOH, 50mM HCl, glukoza, oran metylowy
Aparatura i szkło:
Probówki (20 i 60cm3), płytki Petriego, zlewki (50 i 500cm3), słoiki 1L Twist, kolby
sto kowe (100 i 500cm3), biureta, mo dzierz porcelanowy, piasek, bibuła filtracyjna, cylindry
miarowe (50 i 100cm3), bagietki z gumk recepturk , linijka z podziałk , termometr
Wykonanie wiczenia:
1.
Identyfikacja szczepów bakteryjnych:
W celu identyfikacji szczepów nale y:
- dokona obserwacji wzrostu, wygl du i barwy wyrosłych kolonii szczepów bakterii na
stałych podło ach ró nicuj cych, zmiany barwy podło a stałego i płynnego w przypadku
zdolno ci poszczególnych szczepów bakterii do rozkładu zawartych w podło u ródeł
w gla,
- rozpozna szczepy bakterii na podstawie wy ej wymienionych cech na płytkach z
numerowanymi posiewami.
2. Wpływ nat enia wiatła i temperatury na proces fotosyntezy
Pomiary intensywno ci fotosyntezy oparte s na oznaczaniu wymiany gazowej ro lin i
polegaj na okre leniu ilo ci pobranego dwutlenku w gla lub wydzielonego tlenu. Do tego
celu słu metody chemiczne b d gazometryczne. Do nich m.in. zalicza si półilo ciow
metod polegaj c na liczeniu p cherzyków tlenu wydzielonego przez fotosyntetyzuj ce
gał zki ro lin wodnych.
Przebieg wiczenia:
1
-
gał zk moczarki kanadyjskiej umie ci w p tli gumki recepturowej przymocowanej do
szklanej bagietki i zanurzy (wierzchołkiem do dołu) w probówce (lub cylindrze) z wod
wodoci gow wzbogacon kilkoma kroplami mineralnej wody gazowanej,
cało umie ci w kolbie sto kowej napełnionej wod ,
ustali 3 punkty w odległo ci 2 i 45 cm mi dzy ródłem wiatła a ro lin ,
w ka dym punkcie kolejno umie ci moczark i okre li ilo wydzielanych p cherzyków
tlenu; pomiary wykonywa w ci gu 2 minut po 4 minutach adaptacji ro lin do warunków
wietlnych, trzykrotnie dla ka dej odległo ci od ródła wiatła,
wyniki bada zestawi w tabeli,
Tabela 1. Wpływ nat enia wiatła na proces fotosyntezy
odległo od
ilo p cherzyków O2 w ci gu 2 minut
ródła wiatła
powtórzenia
(cm)
1
2
3
rednia
2
45
-
do dwu kolb sto kowych napełnionych wod wodoci gow o temperaturze 5oC i 25oC
wstawia kolejno probówk z zanurzon w wodzie gał zk moczarki kanadyjskiej,
po odczekaniu 5 minut, w celu adaptacji moczarki do warunków temperaturowych, liczy
wydzielane p cherzyki tlenu przez 2 minuty,
pomiar w ka dej temperaturze powtórzy trzykrotnie,
wyniki bada zestawi w tabeli,
Tabela 2. Wpływ temperatury na proces fotosyntezy
temperatura
ilo p cherzyków O2 w ci gu 2 minut
o
( C)
powtórzenia
1
2
3
rednia
5
25
3. Wyodr bnianie i rozdzielanie barwników asymilacyjnych
Reakcje fotosyntezy zachodz w specjalnych strukturach komórkowych zawieraj cych
barwniki fotosyntetyczne. U fotosyntetyzuj cych Procaryota odbywaj si one w wypustkach
błon plazmatycznych, za w komórkach Eucaryota w chloroplastach. Barwniki zwi zane z
fotosyntez zalicza si do trzech głównych klas: chlorofili, karotenoidów i fikobilin.
Chlorofile i karotenoidy s zwi zkami dobrze rozpuszczalnymi w rozpuszczalnikach
organicznych, a fikobiliny dobrze rozpuszczaj si w wodzie.
Przebieg wiczenia:
- mas ro linn rozetrze w mo dzierzu z piaskiem; uzyskan miazg wymiesza z 96%
alkoholem etylowym z dodatkiem acetonu; po ponownym utarciu mieszanin przes czy
przez s czek bibułowy; ekstrakt chroni przed wiatłem.
- Przygotowa pasek bibuły filtracyjnej o wymiarach 2x20 cm i bibuły chromatograficznej;
nanie kolejno kroplami w jednym miejscu (3 cm od dolnej kraw dzi bibuły) wyci g
barwników; po ka dym naniesieniu kropli pasek bibuły wysuszy ,
- do cylindra wla płyn rozwijaj cy (warstwa 1-1,5 cm); pasek bibuły z naniesionymi
barwnikami umie ci w cylindrze tak, aby ko cem dotykał płynu rozwijaj cego; cylinder
2
szczelnie przykry ; rozdział barwników prowadzi pod wł czonym dygestorium!; po
30 minutach wyj pasek bibuły, dokładnie wysuszy i rozpozna barwniki.
4. Oznaczanie aktywno ci oddechowej mikroorganizmów glebowych indukowanej
substratem (glukoz )
Wyst puj ce w glebie mikroorganizmy oraz zwierz ta bezkr gowe pobieraj w procesie
oddychania z powietrza glebowego tlen, a wydzielaj dwutlenek w gla, co mo na wykaza
do wiadczalnie. Zazwyczaj ok. 10% mikroorganizmów glebowych zachowuje aktywno .
Pozostałe 90% znajduje si w stanie u pienia lub ycia utajonego. Po wprowadzeniu do gleby
odpowiednich składników pokarmowych, st enie aktywnych komórek ro nie.
Miar aktywno ci oddechowej organizmów jest ilo wydzielonego dwutlenku w gla. W
trakcie wiczenia wydzielany CO2 (produkt oddychania) ulega absorpcji przez roztwór KOH,
stosownie do reakcji:
KOH + CO2
K+ + HCO3Nadmiar KOH jest okre lony ilo ciowo za pomoc miareczkowania HCl.
Przebieg wiczenia:
- do dwóch słojów litrowych wprowadzi po 400g yznej ziemi ogrodowej; do jednego z
nich doda 4g glukozy i wymiesza dokładnie cukier z ziemi ,
- do słojów wstawi małe zlewki zawieraj ce po 20ml KOH (50mM); słoje szczelnie
zakr ci i pozostawi na 24h,
- po inkubacji wyj zlewki, zawarto przela do kolb sto kowych o pojemno ci 100ml;
doda 2-3 krople wska nika pH – oran u metylowego; nadmiar KOH miareczkowa
50mM HCl do zmiany barwy z ółtej na czerwon ,
- ilo wydzielonego CO2 obliczy ze wzoru:
y=
(V0 − V ) ⋅ 50
1000 ⋅ m
gdzie: y - aktywno oddechowa gleby [mM CO2/ g gleby/ doba], V0 - obj to KOH u yta
do absorpcji CO2 [ml], V - obj to KOH nie zoboj tniona przez HCO3- [ml], odpowiadaj ca
obj to ci HCl zu ytego do miareczkowania, m - masa próbki gleby w słoju [g],
-
porówna aktywno
oddechow
indukowan dodatkiem glukozy.
mikroorganizmów glebowych indukowan
i nie
Literatura:
2. Kunicki-Goldfinger W.: ycie bakterii, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1998.
3. Ró alski A.: wiczenia z mikrobiologii ogólnej, cz.1 i cz.2, Wydawnictwo Uniwersytetu
Łódzkiego, Łód 1998.
4. Schlegel H.: Mikrobiologia ogólna, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2001.
5. Zmysłowska I.: Mikrobiologia ogólna i rodowiskowa, Wydawnictwo Uniwersytetu
Warmi sko-Mazurskiego, Olsztyn 2002.
6. Solomon E.P., Berg L.R., Martin D.W., Villee C.A.: Biologia, Oficyna Wydawnicza
Multico, Warszawa 2000.
7. Uziak Z.: Przewodnik do wicze z fizjologii ro lin, Wydawnictwo Akademii Rolniczej,
Lublin 1985.
3