Skrypt do ćwiczeń - Wydział Biologii UW

Skrypt do ćwiczeń - Wydział Biologii UW

Biotechnologia 2009/2010
BIOTECHNOLOGIA
Zajęcia prowadzone przez
Zakład Biologii Molekularnej i Zakład Regulacji Metabolizmu
Materiały do ćwiczeń dla studentów kierunku Biotechnologia w roku akademickim 2009/2010
opracowane przez pracowników Zakładu Biologii Molekularnej i Zakładu Regulacji Metabolizmu.
Redakcja:
Rafał Derlacz i Joanna Trzcińska-Danielewicz
1
Biotechnologia 2009/2010
Plan ćwiczeń:
Dzień pierwszy
Ekstrakcja inwertazy z drożdży piekarniczych
Immobilizacja inwertazy
Hydroliza roztworu sacharozy
Izolowanie immunoglobulin
Przygotowanie próbek do elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z SDS
Dzień drugi
Elektroforeza białek w żelu poliakryloamidowym z SDS
Sporządzanie krzywej wzorcowej do oznaczania cukrów redukujących
Oznaczanie cukrów redukujących w pobranych próbkach
Dzień trzeci
Określenie wydajności reakcji hydrolizy sacharozy – opracowanie wyników
Analiza stopnia czystości otrzymanego preparatu IgG i wyznaczenie wielkość łańcucha
lekkiego i ciężkiego na podstawie obrazu elektroforetycznego
Kontakt:
Rafał Derlacz
Zakład Regulacji Metabolizmu
Instytut Biochemii UW
Budynek D, II piętro, pokój 209
tel. 0-22-5543209
Jan Fronk
Zakład Biologii Molekularnej
Instytut Biochemii UW
Budynek D, I piętro, pokój 103
tel. 0-22-5543103
http://www.biol.uw.edu.pl/zbm/
2
Biotechnologia 2009/2010
Regulamin pracowni:
1. W pracowni należy zachować ostrożność, porządek i czystość.
2. W pracowni należy nosić bezpieczne obuwie i fartuch laboratoryjny, a przy pracy
z substancjami szkodliwymi rękawiczki gumowe. Okrycia wierzchnie należy pozostawić
w szatni wydziałowej.
3. Opuszczając stanowisko pracy należy sprawdzić czy wszystkie niepotrzebne urządzenia
elektryczne, gaz i woda zostały wyłączone, drobny sprzęt odłożony na miejsce, a użyte
naczynia laboratoryjne umyte i odłożone do suszenia.
4. Studenci nie mogą pracować w pracowni bez opieki pracownika dydaktycznego.
5. W pracowni nie wolno palić tytoniu, spożywać posiłków i napojów, aplikować
kosmetyków. Nie używać do celów spożywczych naczyń laboratoryjnych.
6. Odczynniki należy przechowywać w odpowiednim porządku. Nie wolno trzymać żadnych
substancji w niepodpisanych opakowaniach. Łatwopalne rozpuszczalniki, a także stężone
kwasy i zasady można przechowywać w pracowniach pod wyciągiem tylko w ilościach
zaspokajających bieżące potrzeby.
7. Prace z rozpuszczalnikami organicznymi należy prowadzić przy sprawnie działającej
wentylacji. Podczas pracy nie wolno używać otwartego ognia. Etanol używany
w pracowni jest skażony.
8. Prace z kwasami i zasadami należy prowadzić pod sprawnie działającym wyciągiem
chemicznym.
9. Nigdy nie należy pipetować ustami substancji trujących, żrących lub innych szkodliwych
dla zdrowia.
10. Odpadów substancji, które mogą stanowić zagrożenie dla środowiska naturalnego nie
wolno wylewać do zlewów. Należy je zlewać do szczelnych podpisanych butelek
i przechowywać pod wyciągiem. Będą okresowo zbierane do zniszczenia.
11. Odpady innych stężonych substancji można wylewać do zlewu po ich znacznym
rozcieńczeniu, obficie spłukując wodą z kranu.
12. Okna w pracowni można tylko uchylać w pozycji pionowej. Nie otwierać ich na oścież.
13. W razie zaistnienia nawet najmniejszego wypadku należy niezwłocznie powiadomić
opiekującego się pracownią pracownika dydaktycznego.
W opisie ćwiczeń zastosowano następujące symbole:
 odczynnik gotowy
 uwaga dotycząca czynności niebezpiecznych
3
Biotechnologia 2009/2010
1. Oczyszczanie frakcji immunoglobulin G (IgG) z surowicy
królika
Jedną z metod oczyszczania białek jest chromatografia powinowactwa. Jest to szczególny typ
chromatografii adsorpcyjnej, w której wykorzystuje się wzajemne powinowactwo dwóch
substancji. Pierwsza z nich (tzw. ligand), chemicznie związany z nierozpuszczalnym
nośnikiem, specyficznie adsorbuje drugą substancję (substrat). Specyficzne oddziaływanie
tych dwóch substancji może mieć różny charakter, na przykład taki, jak między:
hormonem a receptorem
enzymem a substratem, czy inhibitorem
przeciwciałem a antygenem
komplementarnymi odcinkami kwasów nukleinowych
kwasami nukleinowymi a białkami.
Swoistość tego oddziaływania jest niekiedy tak duża, że pozwala na otrzymanie
w jednoetapowej procedurze praktycznie czystego preparatu nawet z bardzo złożonych
mieszanin, takich jak homogenaty tkankowe. Poza wykorzystaniem naturalnie występujących
par substrat-ligand, można tak modyfikować niektóre substancje (np. białka otrzymywane
z organizmów transgenicznych), by zyskały one powinowactwo do określonego ligandu.
Jako nośniki w chromatografii powinowactwa stosuje się złoża tradycyjnie wykorzystywane
do filtracji żelowej, przy czym przed użyciem konieczna jest ich odpowiednia aktywacja,
umożliwiająca związanie ligandu. Często ten sam ligand bywa wykorzystywany do
izolowania różnych grup substratów. Na przykład złoże ze związanym białkiem A może
wiązać większość immunoglobulin klasy G, a do złoża z przyłączonym polinukleotydem
poli(U) lub poli(T) mogą wiązać się różne cząsteczki mRNA. Związki izolowane przy użyciu
chromatografii powinowactwa można eluować zarówno w sposób specyficzny (np. przez
użyciu substancji o większym powinowactwie do substancji oczyszczanej niż ligand), jak
i niespecyficzny (np. za pomocą buforów o niskim lub wysokim pH, wysokiej siły jonowej,
czy związków rozrywających wiązania wodorowe).
Całą procedurę chromatografii powinowactwa możemy podzielić na następujące etapy:
chemiczne wiązanie ligandu ze złożem (nie jest konieczne, gdy korzysta się już
z gotowego złoża z dołączonym ligandem)
specyficzne wiązanie substratu do unieruchomionego ligandu
usunięcie substancji niezwiązanych i związanych niespecyficznie
elucja specyficznie związanego substratu.
Poniższe ćwiczenie polega na oczyszczeniu frakcji przeciwciał IgG z surowicy królika
przy pomocy chromatografii powinowactwa.
Przeciwciała (immunoglobuliny) są to białka wydzielane przez limfocyty B, które mają
zdolność do swoistego rozpoznawania i wiązania antygenów (białek, cukrów, lipidów,
kwasów nukleinowych), czyli substancji wywołujących odpowiedź immunologiczną
organizmu. W zależności od struktury i funkcji przeciwciała można podzielić na pięć klas:
IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. W surowicy krwi najobficiej występują przeciwciała IgG, które
zapewniają odporność organizmu na czynniki infekcyjne dostające się przez krew. Są również
jedynymi przeciwciałami zdolnymi do przejścia przez łożysko, zapewniając w ten sposób
ochronę immunologiczną płodu.
Cząsteczka IgG o masie cząsteczkowej około 150 kDa ma kształt litery Y i zbudowana jest
z dwóch identycznych łańcuchów lekkich (m.cz około 25 kDa) i dwóch identycznych
łańcuchów ciężkich (m.cz. około 50 kDa). Łańcuchy lekkie i ciężkie są połączone ze sobą
4
Biotechnologia 2009/2010
wiązaniami (mostkami) dwusiarczkowymi. Funkcjonalnie w cząsteczce IgG można wyróżnić
dwa rejony Fab rozpoznające antygen i rejon Fc oddziaływujący z innymi składnikami układu
odpornościowego (Rys. 1).
łańcuch lekki
SS
S
S-
fragmenty Fab
S-S
S-S
mostki dwusiarczkowe
fragment Fc
łańcuch ciężki
Rys. 1 Schemat budowy przeciwciała
Różnorodność przeciwciał wytwarzanych przez dany organizm jest ogromna (u człowieka
szacuje się ją na ponad 108!), ponieważ mają one rozpoznawać/wiązać teoretycznie wszystkie
antygeny, z którymi może się on zetknąć w swoim otoczeniu. Odkrycie, jak taka wielka
różnorodność przeciwciał zakodowana jest w materiale genetycznym komórki ssaczej zostało
wyróżnione Nagrodą Nobla.
Co więcej, organizm naturalnie wytwarza wiele różniących się między sobą przeciwciał
skierowanych przeciwko temu samemu antygenowi. Dlatego surowice/przeciwciała
przeciwko antygenowi otrzymane z krwi jakiegoś organizmu, np. królika, nazywane są
poliklonalnymi. Przy użyciu specjalnej techniki (również wyróżnionej Nagrodą Nobla)
możliwa jest także produkcja, np. w hodowli komórek mysich, preparatów identycznych
(monoklonalnych) przeciwciał przeciwko danemu antygenowi.
Ze względu na wybiórcze działanie (rozpoznawanie w zasadzie tylko "swojego" antygenu)
przeciwciała są niezastąpionym narzędziem mającym zastosowanie w medycynie – przy
leczeniu, diagnostyce i profilaktyce oraz w badaniach naukowych. Typowe przykłady
zastosowania przeciwciał w leczeniu to podanie surowicy z wysokim mianem odpowiednich
przeciwciał, otrzymanej z innego organizmu, przy infekcji tężcem, błonicą, wścieklizną,
zapaleniu wątroby typu B czy po ukąszeniu przez żmiję lub podanie stosownych przeciwciał
w przypadku ciąży z konfliktem serologicznym (niezgodnością w zakresie czynnika Rh).
W diagnostyce obecność stosownych przeciwciał we krwi jest wykorzystywana do
oznaczania grup krwi oraz kontaktu osoby z niektórymi czynnikami infekcyjnymi,
np. wirusem HIV czy prątkami gruźlicy. Przeciwciałami stwierdza się także obecność
pewnych substancji w próbkach, np. hormonów przy testach ciążowych. W profilaktyce, na
drodze szczepień ochronnych (np. przeciwko odrze, zapaleniu wątroby typu B czy cholerze)
organizm nabywa zdolności wytwarzania odpowiedniej ilości przeciwciał we krwi, których
celem w przyszłości będzie zapobieganie tym infekcjom. W badaniach naukowych
przeciwciała wykorzystuje się w szeregu technik używanych przy izolacji i charakterystyce
białek.
5
Biotechnologia 2009/2010
W poniższym ćwiczeniu do izolowania immunoglobulin G wykorzystuje się kolumnę
napełnioną agarozą związaną z białkiem A, które jest składnikiem ściany komórkowej
bakterii Staphylococcus aureus.
Białko A, choć nie jest fizjologicznym ligandem dla IgG, ma zdolność w neutralnym pH do
tworzenia silnych kompleksów z tymi przeciwciałami (poprzez rejon Fc IgG). Kompleksy te
można rozdysocjować w kwaśnym pH. Siła wiązania się IgG do białka A w znacznym
stopniu zależy od pochodzenia gatunkowego IgG (białko A silnie wiąże się z IgG człowieka,
królika, świnki morskiej, świni, psa; słabiej z IgG krowy, kozy, myszy; bardzo słabo z IgG
konia, owcy, szczura).
Stopień czystości otrzymanego preparatu IgG zostanie oceniony metodą elektroforezy w żelu
poliakryloamidowym z dodatkiem dodecylosiarczanu sodowego (sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis – SDS-PAGE).
Elektroforeza to ruch cząsteczek obdarzonych ładunkiem w polu elektrycznym. Większość
metod elektroforetycznych wykorzystuje specyficzne nośniki – bibułę, żele
poliakryloamidowe lub agarozowe. Elektroforezę białek prowadzi się z żelach
poliakryloamidowych (polyacrylamide gel electrophoresis – PAGE).
Rozdział białek w polu elektrycznym zależy od ich ładunku i wielkości. Im większe białko
tym wolniej porusza się w polu elektrycznym, im bardziej naładowane – tym porusza się
szybciej. Jeżeli białko w danych warunkach ma ładunek ujemny, to migruje do anody; jeżeli
dodatni – do katody.
Najczęściej stosuje się rozdział białek zależny tylko od ich wielkości. Polega on na rozdziale
białek w żelu poliakryloamidowym z SDS (SDS-PAGE). SDS (dodecylosiarczan sodowy)
jest detergentem anionowym denaturującym i opłaszczającym białko, w wyniku czego nadaje
mu ładunek ujemny. W związku z tym, że w obecności SDS wszystkie białka mają ładunek
ujemny, to szybkość migracji w żelu zależy wyłącznie od wielkości białka. Często dodatkowo
przeprowadza się redukcję wiązań dwusiarczkowych, w wyniku czego poszczególne łańcuchy
polipeptydowe białka migrują oddzielnie. W efekcie, wszystkie białka (łańcuchy
polipeptydowe) mają taki sam, liniowy kształt oraz ładunek ujemny, a szybkość ich migracji
w żelu zależy wyłącznie od ich wielkości.
W celu otrzymania jak najlepszego rozdziału białek, oprócz dobrania odpowiedniego
usieciowania żelu (które zależy od stężenia akryloamidu), należy doprowadzić do sytuacji,
w której wszystkie białka w momencie rozpoczęcia rozdziału będą znajdowały się w jednym
miejscu - na początku żelu, a nie rozproszone w całej naniesionej objętości do kieszonki.
W tym celu przygotowuje się żele składające się z dwóch części( żelu „rozdzielającego”
o stężeniu 8 - 20% i żelu „zagęszczającego”, o stężeniu 4% przygotowanych kolejno po
sobie. Wówczas przed rozpoczęciem właściwego rozdziału, białka ulegają koncentracji
w żelu zagęszczającym.
Białka na ogół są bezbarwne. W związku z tym po przeprowadzeniu rozdziału
elektroforetycznego żel trzeba zabarwić, aby uwidocznić obecne w nim białka. W tym celu
stosuje się na przykład barwienie błękitem kumasyny lub związkami srebra.
SDS-PAGE można także wykorzystać do wyznaczania masy cząsteczkowej analizowanych
białek. Droga migracji białka (pojedynczego łańcucha polipeptydowego) w żelu
rozdzielającym jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu dziesiętnego z jego masy
cząsteczkowej (małe białka migrują najdalej). W żelu o prawidłowo dobranym usieciowaniu
ta zależność jest prostoliniowa.
Używając mieszaniny białek o znanych masach cząsteczkowych, tzw. wzorców masy
cząsteczkowej, można, w oparciu o ich drogi migracji w żelu, wykreślić krzywą wzorcową
(krzywą kalibracyjną dla danego żelu) i na jej podstawie, wyznaczyć masę badanego białka
6
Biotechnologia 2009/2010
(pojedynczego łańcucha polipeptydowego), o migracji mieszczącej się w jej prostoliniowym
odcinku (Rys. 2).
Rys.2 Wyznaczanie masy cząsteczkowej białka w oparciu o krzywą kalibracyjną żelu SDS-PAGE
wg Laemmli’ego.
Ze szczegółami dotyczącymi elektroforezy SDS-PAGE zapoznają się Państwo na zajęciach
z Biologii Molekularnej. Dla tych z Państwa, którzy już teraz są zainteresowani tym
zagadnieniem polecamy komentarz do tych zajęć, który można znaleźć na stronie
internetowej Zakładu Biologii Molekularnej (http://biol.uw.edu.pl/zbm).
Na rys.3 przedstawiono obraz elektroforetyczny próbek z kolejnych etapów izolacji IgG
poddanych elektroforezie SDS-PAGE.
1 2 3 4
5 6 7
albumin
Łańcuch
ciężki IgG
Łańcuch
lekki IgG
Rys.3 Obraz elektroforetyczny próbek z kolejnych etapów izolacji IgG poddanych elektroforezie SDS-PAGE.
ścieżka nr 1 – mieszanina białek wzorcowych
ścieżka nr 2 – surowica krwi królika (próbka wyjściowa)
ścieżka nr 3 – wyciek z kolumny
ścieżka nr 4 – ostatni etap płukania przed elucją
ścieżka nr 5 – pierwszy etap elucji
ścieżka nr 6 – drugi etap elucji
ścieżka nr 7 – trzeci etap elucji
ścieżka nr 8 – ostatni etap elucji
7
Biotechnologia 2009/2010
Izolowanie immunoglobulin:
Materiał biologiczny:
zamrożona surowica krwi królika
Odczynniki:
1. Kolumna z białkiem A przyłączonym do agarozy (ok. 0.2 ml złoża).
2.  Bufor kolumnowy: 0.5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
3. Bufor elucyjny: 100 mM glicyna-HCl, pH 2.5
Wszystkie odczynniki przechowywać z temp 4 C (lodówka)!!!
Wykonanie:
UWAGA!!!
Kolumna z białkiem A przyłączonym do agarozy jest do wielokrotnego użytku. Należy
ją przechowywać w temperaturze 4 C i pamiętać, aby zaraz po zakończeniu elucji
wymienić bufor elucyjny na bufor kolumnowy, ponieważ dłuższe działanie niskiego pH
może prowadzić do nieodwracalnego zniszczenia złoża. Doświadczenie można prowadzić
w temperaturze pokojowej używając schłodzonych buforów i przechowując próbki
w lodzie.
Wszystkie próbki uzyskiwane w trakcie preparatyki należy przechowywać w lodzie.
1. Z otrzymanej surowicy królika (200 l) pobrać 10 l i zachować do elektroforezy
(probówka typu Eppendorf oznaczona nr 1).
2. Resztę surowicy nałożyć na kolumnę ze złożem [1] i zacząć zbierać wyciek
do probówki oznaczonej nr 2.
3. Kiedy poziom surowicy zrówna się z górną powierzchnią złoża, nałożyć na kolumnę
10 ml buforu kolumnowego [2] (jednorazowo na kolumnie nie zmieści się taka
objętość buforu, więc należy nakładać go porcjami). Kontynuować zbieranie wycieku
z kolumny do probówki nr 2, aż do zebrania frakcji o objętości 1 ml. Kolejne porcje
wycieku należy odrzucić. Ostatnią porcję wycieku o objętości 1 ml zebrać do
probówki nr 3.
4. Po przepłukaniu złoża buforem kolumnowym, frakcję immunoglobulin wymywać
czterema porcjami po 200 l buforu elucyjnego [3]. Każdą porcję eluatu zebrać
do oddzielnej probówki i zachować do elektroforezy (probówki oznaczone nr 4, 5, 6 i
7).
5. Natychmiast po zakończeniu elucji przemyć złoże buforem kolumnowym [2].
Przemywanie prowadzić do momentu uzyskania wycieku o pH 8.0 (pH kontrolować
papierkiem wskaźnikowym). Złoże pozostawić pod 3-4 cm warstwą buforu
kolumnowego, kolumnę przechowywać zamkniętą w temperaturze 4 C. Uzyskane
podczas preparatyki frakcje (probówki od 1 do 7) zamrozić lub od razu pobrać z nich
odpowiednie ilości preparatów i przygotować próbki do elektroforezy wg poniższego
przepisu.
8
Biotechnologia 2009/2010
Przygotowanie próbek do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z SDS
(SDS-PAGE):
Odczynniki:
1. Bufor Laemmli'ego 5x : 0.325 M Tris-HCl, pH 6.8, 10 % (w/v) SDS, 50 % (w/v)
glycerol, 5 % (v/v) -merkaptoetanol, 0.05 % (w/v) błękit bromofenolowy
Wykonanie:
1. Do probówki nr 1 z surowicą dodać 490 l buforu kolumnowego [2] (czyli rozcieńczyć
50x) i z tak rozcieńczonej próbki do nowej probówki typu Eppendorf oznaczonej literą S
pobrać 16 l.
2. Z probówki nr 2 z wyciekiem pobrać do nowej probówki 10 l i dodać do niej 90 l
buforu kolumnowego [2] (czyli rozcieńczyć 10x). Z tak rozcieńczonej próbki do nowej
probówki oznaczonej literą W pobrać pobrać16 l.
3. Z probówki nr 3 z ostatnią frakcją buforu kolumnowego do nowej probówki oznaczonej
literą P pobrać 16 l.
4. Z probówek 4, 5, 6 i 7 z kolejnymi porcjami eluatu do nowych probówek oznaczonych
odpowiednio E1, E2, E3 i E4 pobrać po 16 l.
5. Do próbek S, W, P, E1, E2, E3 i E4 dodać po 4 l buforu Laemmli'ego 5x [1] (jeśli bufor
był przechowywany w lodówce, należy rozgrzać go przed dodaniem do próbek). Tak
przygotowane próbki można przechowywać w temperaturze –20 C.
6. Przeprowadzić rozdział elektroforetyczny przygotowanych próbek w 12% żelu
poliakrylamidowym zawierającym SDS.
Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym zawierającym SDS
(SDS-PAGE)
Materiał:
12% żel poliakrylamidowy zawierający SDS
Odczynniki:
1. Bufor do elektoforezy (pH 8.3): 0.025 M Tris, 0.192 M glicyna, 0.1 % (w/v) SDS
2.  Mieszanina białek wzorcowych w buforze Laemmli'ego 1x:
miozyna
m.cz. 200 kDa
-galaktozydaza
m.cz. 116,25 kDa
fosforylaza b
m.cz. 97,4 kDa
albumina
m.cz. 66 kDa
owoalbumina
m.cz. 45 kDa
anhydraza
m.cz. 31 kDa
inhibitor trypsyny
m.cz. 21,5 kDa
lizozym
m.cz. 14,4 kDa
aprotynina
m.cz. 6,5 kDa
3. Roztwór do barwienia żelu (do wielokrotnego użycia):
0.2 % (w/v) błękit Coomassie'go R-250 w roztworze woda:metanol:st. kwas octowy 5:5:1
4. 7 % (v/v) kwas octowy
9
Biotechnologia 2009/2010
 Akrylamid przed polimeryzacją jest silnie trujący. Może się zdarzyć, że pod
uszczelką nie akrylamid nie spolimeryzuje całkowicie. W związku z tym pracując
z żelem poliakrylamidowym wszystkie czynności należy wykonywać tylko
w rękawiczkach.

Opary kwasu octowego są trujące. Nigdy nie należy pipetować ustami
stężonego kwasu. Odbarwianie żelu przeprowadzać pod włączonym wyciągiem
chemicznym.
Wykonanie:
1. Z otrzymanego żelu ostrożnie wyciągnąć grzebyk, a następnie trzymając szybki zdjąć
klamry i gumową uszczelkę.
2. Umieścić żel w aparacie (szybką z wcięciem do środka aparatu), szybki umocować
w aparacie małymi białymi klamrami. Wlać bufor do elektroforezy [1] do dolnego
i górnego zbiornika.
3. Kieszonki w żelu przepłukać buforem do elektroforezy [1].
Uwaga!!!
Przepłukanie kieszonek żelu, jak i naniesienie próbek (patrz punkt 5 można także
przeprowadzić przed umieszczeniem żelu w aparacie do elekrtoforezy.
4. Przygotowane wcześniej próbki do elektroforezy S, W, P, E1, E2, E3 i E4 oraz
mieszaninę białek wzorcowych otrzymaną od prowadzących [2] zawierające bufor
Laemmli'ego ogrzewać przez 3 minuty w 100oC.
5. Po zwirowaniu i schłodzeniu do temperatury pokojowej całość próbek nanieść na żel.
Koniecznie zapisać kolejność naniesionych próbek
6. Włączyć chłodzenie aparatu do elektroforezy (lekko odkręcić kran) i podłączyć
aparat do zasilacza (elektroda ujemna od strony kieszonek, elektroda dodatnia
od dolnej krawędzi żelu).
7. Elektroforezę prowadzić przy napięciu około 100 V do czasu przesunięcia się
barwnika do dolnej krawędzi żelu (około 1.5 godz.).
8. Wyjąć szybki z żelem z aparatu, wyciągnąć przekładki i rozłożyć szybki (delikatnie
podważając jedną z nich). Obciąć warstwę żelu zagęszczającego (z kieszonkami).
9. Żel umieścić w naczyniu z roztworem do barwienia żeli [3].
10. Żel barwić przez 20 minut (lub dłużej) w pudełku na plastikowej tacy.
11. Wyjąć żel z roztworu do barwienia [3] i odbarwiać go poprzez kilkukrotne płukanie w 7%
kwasie octowym [4] na gorąco (około 60 - 80 C) pod wyciągiem chemicznym. Żel można
przechowywać w 7% kwasie octowym.
12. Zanalizować otrzymany obraz elektroforetyczny i na jego podstawie wyznaczyć wielkość
łańcucha lekkiego i ciężkiego IgG.
Literatura:
Smith, W.L. i Rollins, T.E. (1982) Meth. Enzymol. 86, 213-222.
Ostrove, S. (1990) Meth. Enzymol. 182, 357-371.
Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685.
Hames, B.D., Hooper, N. M., Houghton, J. D. (2001) Krótkie wykłady. PWN
Warszawa.
10
Biotechnologia 2009/2010
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail/SIGMA/P1406
http://www6.amershambiosciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/Products?Open
Document&parentid=566&moduleid=13422&zone=Labsep#content
Ćwiczenia z biochemii. PWN, Warszawa 2003 (pod redakcją: L. KłyszejkoStefanowicz).
Krótkie wykłady: Biochemia. PWN, Warszawa 2004 (autorzy: D. B. Hames i N. M.
Hooper).
Krótkie wykłady: Immunologia. PWN, Warszawa 2005 (autorzy: P. M. Lydyard, A.
Whelan i M. W. Fanger).
Rola poszczególnych substancji stosowanych podczas ćwiczenia
woda – podstawowy rozpuszczalnik stosowany w biologii molekularnej
Tris (w formie Tris-HCl, Tris-octan, Tris-glicyna) – substancja buforująca,
utrzymuje pH roztworu (7-8)
glicyna (w formie glicyna-HCl) – substancja buforująca, utrzymuje pH roztworu
(2-3)
NaCl – substancja zapewniająca siłę jonową roztworu (także ciśnienie osmotyczne)
BiałkoA-agaroza – złoże do izolacji IgG
SDS – mocny anionowy detergent, upłynniający wszystkie błony komórkowe i
denaturujący białka, nadający im ujemny ładunek wypadkowy
-merkaptoetanol ( -ME) – substancja redukująca, m. in. mostki dwusiarczkowe
w białkach
akryloamid (i N,N'-metylenobisakryloamid) – substancje wytwarzające w
wyniku polimeryzacji ze sobą usieciowany poliakryloamid
nadsiarczan amonowy (APS) – przeciwutleniacz używany przy polimeryzacji
akryloamidu
N,N,N',N'-tetrametylenodiamina (TEMED) – katalizator polimeryzacji
akryloamidu i N,N'-metylenobisakryloamidu
glicerol – substancja obciążająca próbkę do elektroforezy
błękit bromofenolowy – ciemnofioletowy barwnik migrujący do anody w trakcie
SDS PAGE
błękit Coomassie'go R-250 – barwnik tworzący niebieskie kompleksy z białkami
kwas octowy – substancja do usuwania nadmiaru barwnika po barwieniu białka w
żelu akryloamidowym
11
Biotechnologia 2009/2010
2. Immobilizowane enzymy
aktywności inwertazy.
w
biotechnologii.
Oznaczanie
Immobilizacja jest techniką, która znacznie ogranicza swobodną dyfuzję cząstek enzymu lub
komórek. Metody immmoblizacji enzymów mają zastosowanie w biochemii, biotechnologii,
mikrobiologii, inżynierii chemicznej, głównie ze względu na możliwość ich wykorzystania
technologicznego i handlowego. Enzymy można immobilizować metodami chemicznymi,
np. kowalencyjnie wiążąc z nośnikami rozpuszczalnymi lub nierozpuszczalnymi w wodzie,
lub metodami fizycznymi, np. poprzez adsorpcję na nierozpuszczalnych nośnikach, inkluzję
w sieci polimerowej czy mikrokapsułkowanie wewnątrz półprzepuszczalnych membran.
Stosowana procedura nie powinna wpływać na aktywność biologiczną enzymu. Od rodzaju
matrycy i sposobu wiązania zależy ilość, aktywność, stabilność, optimum pH i temperatury
działania immobilizowanego enzymu.
Przykładem immobilizacji jest wykorzystanie jako złoża kwasu alginowego (Rys. 3) do
inkluzji inwertazy, enzymu hydrolizującej sacharozę. Alginian jest to polisacharyd
zbudowany z reszt kwasów D-mannuronowego (M) i L-guluronowego (G) połączonych
wiązaniami 1,4. Występują w nim bloki składające się z M, z G oraz mieszane:
(M–M)x–(G–G)y–(M–G)z
H
H
O
HO COOH OH
COOH
H
O
HO H
OH
H
H
O
H
O
H
H
H
n
Rys. 3 Kwas alginowy
Alginian otrzymuje się z wodorostów lub niektórych szczepów bakteryjnych. Ma masę
cząsteczkową około 250 000, jest nierozgałęziony, długołańuchowy. Rozpuszczony w wodzie
daje lepkie roztwory, które można sterylizować (20 min w temp. 121 C). Cechą
charakterystyczną alginianu jest jego pęcznienie, a z jonami metali dwu- i trójwartościowych
(np. Ca2+, Zn2+, Mn2+, Sr2+, Ba2+, Al3+, Fe3+, lecz nie z Mg2+) tworzenie żeli. Żel alginianowy
jest dość stabilny, obojętny chemicznie i ma strukturę mikroporowatą. W czasie
immobilizacji enzymów w żelu alginianowym nie obserwuje się istotnej denaturacji enzymu,
ponieważ nie towarzyszą temu procesowi zmiany temperatury i pH.
Celem
ćwiczenia
jest
zbadanie
aktywności
immobilizowanej
inwertazy
( -fruktofuranozydazy, EC 3.2.1.26) oraz określenie wydajności reakcji hydrolizy sacharozy.
Materiał biologiczny:
Świeże drożdże piekarnicze
Odczynniki:
1.
66 mM pirofosforan sodu (pH 8,5) (50 ml)
2.
Alginian sodowy (1,5% zawiesina) (20 ml)
12
Biotechnologia 2009/2010
3.
4.
5.
6.
7.
0,1 M CaCl2 (50 ml)
0,6 M roztwór sacharozy (50 ml)
2% kwas 3,5-dinitrosalicylowy (DNS) w 0,4 M NaOH (50 ml)
0,05 M bufor octanowy (pH 4,7) (20 ml)
Roztwór wzorcowy glukozy (2 mg/ml) (10 ml)
Wykonanie:
Ekstrakcja inwertazy z drożdży piekarniczych
30 g świeżych drożdży piekarniczych zawiesić w 30 ml 66 mM pirofosforanu sodu (pH 8,5)
i pozostawić na noc w 20 C (lub termostacie w 37 C). Odwirować przy 5000 x g przez
20 min. Otrzymany supernatant, zawierający m.in. inwertazę, przechowywać zamrożony
w –20 C. Studenci otrzymują przygotowany ekstrakt z drożdży piekarniczych
Immobilizacja inwertazy
Ekstrakt inwertazy (3 ml) miesza się z 20 ml 1,5% zawiesiny alginianu sodu. Następnie
zawiesinę alginian-enzym pipetą dodaje się kroplami do roztworu 0,1 M CaCl2. Powstające
granulki immobilizowanego enzymu o średnicy od 0,1–4 mm pozostawia się na 20 min
w roztworze CaCl2 w celu ich stwardnienia. Następnie zlewa się roztwór CaCl2, a otrzymane
granulki immobilizowanego enzymu przepłukuje wodą destylowaną.
Hydroliza roztworu sacharozy
Szklaną zlewkę o pojemności 100 ml napełnia się 30 ml roztworu sacharozy (0,6 M) i 15 ml
0,05 M buforu octanowego (pH 4,7), a następnie do roztworu zawierającego substrat reakcji
dodaje się około 100 kuleczek alginianu wapniowego z uwięzionym enzymem. Czas 0
doświadczenia liczy się od momentu dodania kulek do roztworu sacharozy. Zawartość zlewki
(roztwór zawierający substrat i kulki alginianowe z immobilizowanym enzymem) miesza się
przez cały czas trwania doświadczenia przy pomocy mieszadła magnetycznego. Kontrolę
przebiegu hydrolizy sacharozy przeprowadzi się przez 80–100 minut, pobierając do
ponumerowanych probówek co 10 minut określone objętości roztworu (1 ml) do oznaczania
powstających cukrów redukujących. Należy pamiętać o pobraniu próby w czasie 0. Wszystkie
pobrane próby należy natychmiast zamrozić w temperaturze - 20 C.
Sporządzanie krzywej wzorcowej do oznaczania cukrów redukujących
Krzywą wzorcową przygotowuje się, dodając do odpowiednio ponumerowanych probówek
0,1 ; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8 ml roztworu wzorcowego glukozy o stężeniu 2 mg/ml. Próby
uzupełnia się wodą do objętości 2 ml i dodaje 0,2 ml odczynnika DNS. Następnie próby po
wymieszaniu umieszcza się na 5 min we wrzącej łaźni wodnej, po czym chłodzi i mierzy ich
absorpcję przy 540 nm. Krzywą wzorcową sporządza się, odkładając na osi 0X ilość glukozy
w poszczególnych próbach, a na osi 0Y odpowiadającą im wartość absorbancji. Na podstawie
pomiarów absorbancji dla wzorcowych roztworów glukozy (C6H12O6, Mcz = 180,16 g mol–1)
wykreślić krzywą wzorcową.
Oznaczanie cukrów redukujących w pobranych próbkach
Pobrane wcześniej próby rozmrozić. Rozmrożone próbki przechowywać w lodzie. Połowę
objętości z każdej pobranej próby należy przenieść do nowej probówki i uzupełnić wodą do
2 ml, dodać 0,2 ml roztworu DNS i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 min. Następnie
schłodzić, wymieszać i zmierzyć absorbancję przy 540 nm. W ten sposób śledzi się przebieg
hydrolizy sacharozy w czasie. Szybkość tej reakcji zależy od aktywności immobilizowanego
enzymu i jego kontaktu z substratem.
13
Biotechnologia 2009/2010
Opracowanie wyników, krzywa hydrolizy sacharozy
Z krzywej wzorcowej wyznaczyć zawartość cukrów redukujących (w
molach)
w poszczególnych próbkach pobranych w czasie trwania reakcji. Z tych wartości wyliczyć
całkowite stężenia (mM) sacharozy (C12H22O11, Mcz = 342,3 g mol–1) w zbiorniku
w kolejnych czasach (St), pamiętając, że z jednej cząsteczki sacharozy powstaje cząsteczka
glukozy i cząsteczka fruktozy. Znając początkowe stężenie sacharozy (S0), wykreślić krzywą,
informującą o wydajności reakcji.
1
(S0 - St)/S0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
10
20
30
40
Czas
50
60
70
[min]
Krzywa konwersji (przykład)
Literatura:
Mosbach, K. (red.) (1976) Immobilized Enzymes, Methods Enzymol. 44.
14
80