docKrzywe rozkładu objętości płytek krwi
download 
Reklamacja Transkrypt
Krzywe rozkładu objętości płytek krwi
rev.1 2014-01-28 Krzywa rozkładu objętości płytek krwi – interpretacja, i interferencje możliwości komórki są zliczane z najwyższą precyzją. Pozwala to także na zliczanie próbek o bardzo wysokiej i bardzo niskiej liczbie płytek krwi. Automatyczne zliczenie liczby płytek od lat zastępuje metodę zliczania płytek w komorze, znacznie ułatwiając pracę w laboratorium i zwiększając wiarygodność wyniku. Komory zliczeniowe od dawna spoczywają na dnie szuflad pokryte kurzem lub są używane jedynie do sprawdzenia wyników budzących wątpliwości. Jedną z najważniejszych zalet zliczania automatycznego, poza oszczędnością czasu, jest mniejszy błąd statystyczny, ze względu na większą liczbę zliczanych komórek. Jednakże, pomimo automatyzacji, wydanie wyniku liczby płytek wymaga szczegółowego zapoznania się z tematem. Fig. 2 Ogniskowanie hydrodynamiczne – przepływ płynu „opłaszczającego”. Pomimo wszelkich rozwiązań technologicznych zapewniających właściwy wynik, należy wziąć pod uwagę, że w metodzie impedancyjnej elementy morfotyczne różnicowane są jedynie na podstawie objętości. Krwinki czerwone (RBC) i płytki będą oddzielane od siebie tylko na podstawie różnic w objętości. Poza wartością liczbową płytek, analizatory najczęściej dostarczają krzywą rozkładu objętości płytek, co ma bardzo duże znaczenie dla określenia morfologii komórek, a w ten sposób dalszych informacji o płytkach. Krzywa rozkładu objętości płytek (histogram) przedstawia sumę impulsów odpowiedniej populacji komórek o określonej wielkości (Fig. 3). Fig.1 Pomiar objętości w metodzie impedancyjnej Większość analizatorów hematologicznych do zliczania liczby płytek krwi używa metody impedancyjnej. W celu określenia stężenia płytek, komórki przechodzą jedna za drugą przez otwór pomiarowy, tzw. aperturę (Fig. 1). W momencie przejścia komórki przez aperturę zmienia się napięcie elektryczne w przetworniku, dając sygnał elektryczny proporcjonalny do wielkości komórki. Dzięki tym impulsom powstaje krzywa rozkładu objętości dla odpowiedniej populacji komórek. Suma impulsów dla danego rozkładu objętości odpowiada liczbie komórek. Ta metoda pomiarowa została udoskonalona poprzez zastosowanie ogniskowania hydrodynamicznego. Strumień próbki jest „opłaszczany” przez strumień przepływającego rozpuszczalnika, dzięki czemu komórki przepływają dokładnie przez środek otworu pomiarowego w uporządkowany sposób. Pozwala to na wyeliminowanie czynników interferujących, takich jak podwójny przepływ (koincydencja), recyrkulacja itp. W ten sposób Copyright Sysmex Polska Sp. z o.o. Fig. 3 Histogram dla płytek krwi Populacje płytek i erytrocytów są oddzielane przez ruchome dyskryminatory. Dzięki ruchomym dyskryminatorom PL (dolny dyskryminator) i PU (górny dyskryminator) (Fig.3), populacje są optymalnie od siebie oddzielone. Płytki, które fizjologicznie mają wielkość 8-12 fl, są mierzone w przedziale 2-30 fl, przy czym ruchomy dyskryminator PU ustawiany jest tak, by zapewnić optymalne rozdzielenie płytek i erytrocytów. 1 rev.1 2014-01-28 Erytrocyty fizjologicznie mają wielkość 80-100 fl i są zliczane w przedziale od 25 fl do 250 fl. W związku z tymi procedurami, na analizatorach hematologicznych podczas analizy niektórych próbek mogą wystąpić błędy. Płytki o objętości większej niż 30 fl lub krwinki czerwone o objętości mniejszej niż 25 fl mogą fałszować wynik. Również inne, bardzo małe cząsteczki, takie jak fragmenty cytoplazmy mogą być mylnie liczone jako płytki. Czynnikami najczęściej interferującymi są płytki olbrzymie i fragmentocyty, ale mikrocyty i agregaty płytkowe również odpowiadają za błędne wyniki. Immunologiczne znakowanie płytek specyficznymi przeciwciałami monoklonalnymi jest dobrym sposobem ustalenia liczby płytek. Niestety jest to metoda bardzo kosztowna i nie zawsze odpowiednia do rutynowej pracy. Inną alternatywą dla ustalenia liczby płytek jest wybarwienie RNA trombocytów przy użyciu barwnika fluorescencyjnego. RNA płytek wybarwi się i w oparciu o aktywność fluorescencyjną oraz objętość komórki, właściwa liczba płytek, włącznie z płytkami olbrzymimi, zostanie ustalona automatycznie. Większość analizatorów Sysmex jest wyposażonych w metodę barwienia RNA płytek i w przypadku interferencji przełącza się na metodę fluorescencyjną, dzięki zastosowaniu odpowiedniego algorytmu. W takich przypadkach samo różnicowanie na podstawie objętości może nie być wystarczające dla jednoznacznego ustalenia liczby komórek i konieczne jest zweryfikowanie wyniku. Ze względu na objętość powyżej 30 fl płytki olbrzymie liczone są jako erytrocyty. Pod mikroskopem jest widoczna znaczna anizocytoza płytek, z płytkami osiągającymi rozmiary krwinek czerwonych. Większe agregaty płytkowe mogą być nawet mylnie liczone jako erytrocyty, podczas gdy luźne agregaty płytkowe rozpadają się w trakcie przepływu hydrodynamicznego. Odwrotnie natomiast, fragmentocyty i mikrocyty są zliczane jako płytki krwi. Parametry ułatwiające interpretację histogramu: Oprócz oceny histogramu istnieją jeszcze dodatkowe parametry, takie jak P-LCR, MPV, PDW i PCT dostarczające różnych informacji na temat morfologii płytek. P-LCR (wskaźnik obecności dużych płytek) P-LCR wskazuje procent dużych płytek, o objętości powyżej 12 fl. Oprócz dwóch ruchomych dyskryminatorów ograniczających krzywą rozkładu objętości płytek, istnieje jeszcze dodatkowy, stały dyskryminator o wartości 12 fl (Fig. 4). Udział płytek powyżej 12 fl w całkowitej liczbie płytek jest wyrażony procentowo. Przedział wartości referencyjnych dla tego parametru to 15-35%. Wzrost tego parametru może wskazywać na obecność agregatów płytkowych, mikrocytów i płytek olbrzymich. Jednakże we wszystkich tych przypadkach możliwe jest wykrycie błędu pomiaru ze względu na nieprawidłowy rozkład objętości krwinek na krzywej. Krzywa zawsze powinna zaczynać i kończyć się na linii podstawy (ang. baseline). Jeśli zostaną wykryte odchylenia od linii podstawy, ruchomy dyskryminator będzie szukał optymalnego miejsca do rozdzielenia dwóch populacji od siebie. W takich przypadkach analizator wygeneruje ostrzeżenie, by zwrócić uwagę użytkownika, na konieczność sprawdzenia próbki – albo przez dokładniejszą ocenę histogramu, albo przez zliczenie płytek przy użyciu innej metody. Jeśli podejrzewany jest błąd pomiaru, wartość liczbowa komórek może być zweryfikowana za pomocą zliczania w tradycyjnej komorze. Jednakże, należy wziąć pod uwagę, że liczenie komórek w komorze może być źródłem wielu błędów manualnych i wymaga pewnego doświadczenia i wprawy. Fig. 4 Histogram z zaznaczonym dyskryminatorem dla płytek dużych Drugą możliwością jest półilościowe oszacowanie liczby płytek przy użyciu metody Fonio. Metoda ta pozwala na orientacyjną ocenę liczby komórek i dokładności automatycznego zliczenia. Przy 1000-krotnym powiększeniu (okular 10x, obiektyw 100x) jedna płytka krwi w polu widzenia odpowiada 3 20*10 /µl krążącej krwi. W przypadku dysproporcji pomiędzy wynikiem z analizatora, a wartością oszacowaną, należy użyć komory zliczeniowej. Copyright Sysmex Polska Sp. z o.o. PDW (rozpiętość rozkładu objętości płytek) PDW oznacza szerokość rozkładu objętości płytek na poziomie 20% wysokości piku rozkładu traktowanego jako 100% (Fig. 5). Podwyższony PDW jest wskaźnikiem anizocytozy płytek. Przedział wartości referencyjnych dla tego parametru to 9-14 fl. 2 rev.1 2014-01-28 Fig.6 Kształt „krzywej A” „Krzywa B”: W tym przypadku krzywa również nie kończy się na linii podstawy histogramu. Odległość od linii podstawy jest duża i nie ma rozdziału pomiędzy dwoma populacjami. Populacje całkowicie na siebie nachodzą. Możliwą przyczyną takiego rozkładu mogą być fragmentocyty. Fragmentocyty „wślizgują” się do populacji płytek i uniemożliwiają prawidłowy rozdział populacji płytek i krwinek czerwonych. Taki wynik jest wątpliwy i za każdym razem wymaga weryfikacji. Fig. 5 Histogram z zaznaczonym PDW MPV (średnia objętość płytki krwi) Ten parametr dostarcza informacji o średniej objętości płytek pomiędzy dolnym i górnym dyskryminatorem. Przedział wartości referencyjnych dla tego parametru wynosi 8-12 fl. Sposób obliczania MCV PCT (hematokryt płytkowy) Hamatokryt płytkowy jest odpowiednikiem sumy impulsów płytkowych, które pojedynczo są zliczane w pomiarze impedancyjnym i w ten sposób jest odpowiednikiem hematokrytu krwinek czerwonych. Jeśli wysokość krzywej rozkładu objętości w dolnym lub górnym dyskryminatorze odbiega od normy, jeden lub kilka parametrów może być niedostępnych. Będą one oznaczone jako „---". Wartość liczbowa płytek krwi zostanie oflagowana, a analizator wygeneruje ostrzeżenie. W takiej sytuacji należy zweryfikować poprawność wyniku przez sprawdzenie histogramu. W celu dokładniejszej oceny histogramu dla płytek, krzywe możemy podzielić na 3 różne kategorie: nazwane tutaj jako A, B i C. Fig.7 Kształt „krzywej B” „Krzywa A”: Krzywa zaczyna się na linii podstawy, ale się na niej nie kończy, ze względu na interferencje ze strony mikrocytów. W przypadku skrajnie małych erytrocytów nie będzie możliwy prawidłowy rozdział pomiędzy dwoma populacjami komórek. Ponieważ nakładanie się obydwu populacji jest w przybliżeniu takie samo po obu stronach dyskryminatora, uzyskana liczba płytek może być użyta, jeśli MCV mieści się w przedziale wartości prawidłowych. W takim przypadku zliczanie komorowe statystycznie byłoby mniej precyzyjne. Copyright Sysmex Polska Sp. z o.o. Fig.8 Kształt „krzywej C” „Krzywa C” W tym przypadku również wymagana jest weryfikacja liczby płytek. Ruchomy górny dyskryminator (PU) zawsze próbuje ustawić się w miejscu optymalnego rozdziału populacji. Jednakże, w związku z obecnością płytek olbrzymich lub mikroskrzepów, miejsce rozdziału 3 rev.1 2014-01-28 nie może być znalezione, zamiast tego, populacje znacznie na siebie nachodzą. Liczba płytek powinna być sprawdzona np. metodą Fonio. być spowodowany przez cząsteczki o objętości poniżej 2 fl. Przyczyną interferencji może być zwiększona wartość tła, bakterie, grzyby lub cienie komórkowe. W takim przypadku należy sprawdzić wartość tła i jeśli to konieczne wymienić odczynniki. Nieprawidłowy rozkład krwinek w dolnym dyskryminatorze zdarza się raczej rzadko. Może Czynniki, które mogą interferować w zliczaniu płytek metodą impedancyjną Płytki olbrzymie PLT ▼ Fragmentocyty PLT ▲ Mikrocyty PLT ▲ Agregaty płytkowe PLT ▼ ocena histogramu jeśli konieczne, weryfikacja liczby płytek metodą Fonio lub zliczenie w komorze płytki optyczne (lub fluorescencyjne), jeśli dostępne (np. XT-4000i, XE-5000) fragmentocyty i płytki nie mogą być rozdzielone na podstawie objętości ocena histogramu jeśli konieczne, weryfikacja liczby płytek metodą Fonio lub zliczenie w komorze płytki optyczne (lub fluorescencyjne), jeśli dostępne (np. XT-4000i, XE-5000) mikrocyty i płytki nie mogą być rozdzielone na podstawie objętości ocena histogramu jeśli konieczne, weryfikacja liczby płytek metodą Fonio lub zliczenie w komorze płytki optyczne (lub fluorescencyjne), jeśli dostępne (np. XT-4000i, XE-5000) ocena histogramu gdy nie jest prawdopodobna trombocytopenia należy wykluczyć pseudotrombocytopenię EDTAzależną przez zbadanie próbki pobranej na cytrynian Tabela 1. Copyright Sysmex Polska Sp. z o.o. 4
