docStreszczenia projektów - Państwowy Instytut Weterynaryjny
download 
Reklamacja Transkrypt
Streszczenia projektów - Państwowy Instytut Weterynaryjny
Ocena występowania mikotoksyn w środkach żywienia zwierząt Kierownik projektu: dr hab. Piotr Jedziniak, prof. nadzw. e-mail: [email protected] Zakład Farmakologii i Toksykologii, Państwowy Instytut Weterynaryjny - Państwowy Instytut Badawczy (PIWet-PIB) w Puławach, 24-100 Puławy, Al. Partyzantów 57 Mikotoksyny, wtórne metabolity wytwarzane przez grzyby konidialne, zwane również strzępkowatymi, nitkowatymi bądź pleśniami, zaliczane są do substancji stanowiących zanieczyszczenia środowiskowe. Stwierdza się je głównie w surowcach roślinnych, w żywności i w paszach. Obecność mikotoksyn w paszach lub żywności niesie duże zagrożenie zdrowotne zarówno dla ludzi jak i dla zwierząt. Po przedostaniu się do organizmu mikotoksyny mogą wywoływać zespół objawów klinicznych i zmian patologicznych, które nazwano mikotoksykozami. Związki te mogą wykazywać działanie kancerogenne, estrogenne, mutagenne, teratogenne i immunotoksyczne. Dodatkowym problemem jest trudność w ich dezaktywacji ze względu na dużą stabilność; są one odporne na czynniki fizyczne, chemiczne, nie ulegają rozkładowi nawet podczas obróbki w procesach technologicznych. Mikotoksyny od lat są uważane za istotny problem w toksykologii weterynaryjnej. Pomimo tego, że rzadko dochodzi do ostrych zatruć mikotoksynami, to ich obecność w paszach ma negatywny wpływ na ich status zdrowotny, co może prowadzić do obniżenia produkcyjności zwierząt, powstania poważnych chorób i z tym związanych strat ekonomicznych. Komisja Europejska w rozporządzeniu No 1881/2006, z późniejszymi zmianami, ustaliła najwyższe dopuszczalne poziomy (ang. maximum residue levels, MRLs) dla 13 mikotoksyn w środkach spożywczych przeznaczonych dla ludzi, a w zaleceniu 576 z sierpnia 2006 roku określiła wartości tolerancyjne w paszach. Poziomy mikotoksyn w paszach są monitorowane w żywności i paszach w wielu krajach (również w Polsce), jednak badania, z uwagi na wysokie koszty nie obejmują zbyt szerokiego zakresu kontrolowanych toksyn. Spośród około 300 wykrytych mikotoksyn, badanych 8 najlepiej poznanych i najbardziej toksycznych (aflatoksyna B1, B2, G1, G2, ochratoksyna A, toksyna T-2, toksyna HT-2, fumonizyna B1 i B2, deoksyniwalenol i zearalenon). W ostatnich latach zwraca się uwagę na fakt, że stwierdzane poziomy mikotoksyn w paszach mogą być niedoszacowane, na skutek obecności tzw. maskowanych mikotoksyn – pochodnych mikotoksyn powstających m.in. w roślinach poprzez sprzęganie toksyn ze związkami hydrofilowymi (np. aminokwasami). Obecność maskowanych mikotoksyn może mieć duże znaczenie toksykologiczne, ponieważ mogą one uwalniać się do mikotoksyn macierzystych w przewodzie pokarmowym zwierząt i ludzi. Przykładem jest deoksyniwalenol -3-beta-D-glukopiranozyd, którego zawartość w środkach żywienia zwierząt nie są wystarczająco poznana. Celem projektu jest ocena występowania mikotoksyn w środkach żywienia zwierząt gospodarskich i towarzyszących. Do badań będzie pobranych około 400 próbek pasz dla drobiu, trzody chlewnej, bydła, ryb wody z systemów pojenia zwierząt jak również karm zwierząt towarzyszących. Pabrane próbki analizowane będą wieloskładnikową metodą pozwalającą na jednoczesne oznaczanie kilkudziesięciu mikotoksyn oraz wybranych maskowanych techniką chromatografii cieczowej z tandemową spektometrią mas. Ocena możliwości wykrycia nielegalnego stosowania błękitu metylenowego w hodowli ryb Kierownik projektu: prof. dr hab. Andrzej Posyniak e-mail: [email protected] Zakład Farmakologii i Toksykologii, Państwowy Instytut Weterynaryjny - Państwowy Instytut Badawczy (PIWet-PIB) w Puławach, 24-100 Puławy, Al. Partyzantów 57 Cel prowadzonych badań/hipoteza badawcza: Poważnym problemem współczesnej ichtioterapii są infekcje bakteryjne oraz choroby wywołane przez grzyby, pierwotniaki lub robaki pasożytnicze. Jedna z metod chemioterapii wykorzystuje barwniki, takie jak zieleń malachitowa, zieleń brylantowa, fiolet krystaliczny czy błękit metylenowy, które nigdy nie były oficjalnie zarejestrowane jako weterynaryjne produkty lecznicze. Ponadto obowiązujące przepisy uznają stosowanie tych substancji za nielegalne i nakazują prowadzenie kontroli pozostałości barwników w rybach przeznaczonych do spożycia przez ludzi. W związku z tym, że w praktyce barwniki mogą być stosowane pojedynczo lub w bliżej nieokreślonej mieszaninie to istnieje poważne podejrzenie, że pochodzące z nielegalnych źródeł preparaty obok dotychczas wykrywanej zieleni malachitowej, fioletu krystalicznego czy zieleni brylantowej w swoim składzie mogą zawierać również błękit metylenowy. Dlatego też celem projektu będzie przeprowadzenie badań zmierzających do opracowania oryginalnej metody oznaczania błękitu metylenowego obok zieleni malachitowej, zieleni brylantowej, fioletu krystalicznego i ich metabolitów w tkankach ryb. Ponadto przewiduje się przeprowadzenie oceny kinetyki zanikania błękitu metylenowego w mięśniach ryb hodowanych z przeznaczeniem do konsumpcji przez ludzi. Zastosowana metoda badawcza/metodyka: Badanie oceny możliwości wykrycia nielegalnego stosowania błękitu metylenowego w hodowli ryb będzie obejmować następujące zadania: Opracowanie metody oznaczania barwników w mięśniach ryb. W celu jednoczesnego ustalenie stężenia błękitu metylenowego obok zieleni malachitowej, zieleni brylantowej, fioletu krystalicznego i ich metabolitów w mięśniach ryb zostanie opracowana nowa metoda z wykorzystaniem techniki chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS/MS). Walidacja metody oznaczenia barwników w mięśniach ryb. Walidacja opracowanej metody oznaczania błękitu metylenowego, zieleni malachitowej, zieleni brylantowej, fioletu krystalicznego i ich metabolitów w mięśniach ryb będzie przeprowadzona zgodnie z wymaganiami Decyzji Komisji 2002/657/WE. Badanie zanikania błękitu metylenowego u ryb. Ryby będą kąpane w roztworze błękitu metylenowego a następnie przeniesione do zbiornika z czysta wodą. W odpowiednio dobranych odstępach czasu ryby będą usypiane, a pobierane od nich próbki mięśni będą analizowane metodą LC-MS/MS. Na podstawie oznaczonych stężeń barwnika określony zostanie czas pozostawania błękitu metylenowego w rybach. Występowanie gamma- i deltakoronawirusów w populacji dzikich ptaków na terenie Polski i ich rola w epidemiologii gammakoronawirusów drobiu (zakaźnego zapalenia oskrzeli kur i koronawirusów indyków) Kierownik projektu: dr hab. Katarzyna Domańska-Blicharz, prof. nadzw. e-mail: [email protected] Zakład Chorób Drobiu, Państwowy Instytut Weterynaryjny - Państwowy Instytut Badawczy (PIWet-PIB) w Puławach, 24-100 Puławy, Al. Partyzantów 57 Zainteresowanie drobiem i produktami drobiowymi ogromnie wzrosło w ciągu ostatnich 20 lat. Jednym z głównych warunków sukcesu i zrównoważonego rozwoju w nowoczesnej produkcji drobiu jest skuteczna kontrola różnych chorób zakaźnych. Wśród czynników zakaźnych, które stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia, produkcji i dobrostanu drobiu w Polsce i krajach Europy, jest wirus zakaźnego zapalenia oskrzeli kur (IBV, ang. infectious bronchitis virus), koronawirus ptasi (AvCoV, ang. avian coronavirus) należący do rodzaju Gammacoronavirus. IBV jest szeroko rozpowszechniony w populacji drobiu w Polsce, u kur występuje jego kilka typów, w tym najczęstsze to Mass, 793B, QX oraz D1466, a główna strategia kontroli tych zakażeń to powszechnie stosowane szczepienia. Z kolei u indyków występuje koronawirus indyczy (TCoV, ang. turkey coronavirus), który może nie jest tak powszechny jak IBV (jego występowanie w populacji indyków w Polce ocenia się na 9-10%) to jednak może negatywnie wpływać na kondycję zdrowotną indyków. Wstępnie przeprowadzone badania 884 próbek dzikich ptaków z różnych regionów w Polsce umożliwiły identyfikację obecności gammakoronawirusów podobnych do IBV u ok. 3,6% ptaków. Badania ostatnich kilku lat wykazały, że niektóre AvCoVs, głównie u dzikich ptaków należą do rodzaju Deltacoronavirus, który pojawił się w oficjalnej taksonomii ICTV dopiero w 2011 r. Przypuszcza się, że te nowoodkryte AvCoVs mogą odgrywać szczególną rolę w adaptacji IBV, a także stanowić swoistą pulę genową wykorzystywaną przez nowopowstające wirusy na drodze rekombinacji i wymiany genów. Jednak wiedza na temat występowania deltakoronawirusów u dzikich ptaków jest ograniczona. Do tej pory przeprowadzono zaledwie kilka badań i wykazały one występowanie tych wirusów w 1,6%, 6,4% i 12,5% badanych dzikich ptaków, odpowiednio w północnej Anglii, między Syberią i Alaską oraz w Hong Kong’u/Kambodży. W Polsce dotychczas nie prowadzono szerszych badań nad deltakoronawirusami. Jednak w maju tego roku u bażantów dostarczonych do ZCHD z klinicznymi objawami choroby wykryto deltakoronawirusa, co może wskazywać, że również te wirusy mogą odrywać pewną rolę w patologii drobiu. Celem projektu jest uzupełnienie tej luki poprzez 1) ocenę występowania deltakoronawirusów w populacji dzikich ptaków i drobiu na terenie Polski, 2) ocenę zmienności genetycznej wykrytych AvCoV poprzez analizę ich pokrewieństwa filogenetycznego, 3) izolację (namnożenie) wykrytych wirusów. Materiał do badań będą stanowiły zarówno dotychczas zgromadzone próbki od dzikich ptaków pozyskane w latach 2009-2014 przez ornitologów do badań monitoringowych wirusa grypy ptaków (AIV, ang. avian influenza virus) jak i pozyskiwane w latach bieżących. Stanowią je wymazy z jamy ustno-gardłowej/kloaki/kałowe pobierane od dzikich ptaków w różnych rejonach Polski (Zadanie 1). Zebrany materiał po odpowiednim przygotowaniu zostanie przebadany na obecność AvCoV za pomocą metod molekularnych wykrywających genom zarówno gamma-, jak i deltakoronawirusów (Zadanie 2). Wykryte AvCoVs będą poddane charakterystyce molekularnej wykorzystując m.in. techniki NGS (Zadanie 3). Wykryte wirusy będą izolowane (namnażane) w hodowlach komórkowych i/lub na zarodkach kurzych (Zadanie 4). Skuteczna strategia zapobiegania wszelkim chorobom zwierząt wymaga ciągłego monitorowania sytuacji epidemiologicznej. Dotyczy to również takiej choroby jak zakaźne zapalenie oskrzeli, wg Banku Światowego drugiej choroby drobiu pod względem wywołanych strat ekonomicznych w latach 2006-2009. Ze względu na fakt dużej zmienności wirusa IB oraz podejrzenie, że źródłem tej zmienności może być rekombinacja/wymiana genów z deltakoronawirusami, istnieje potrzeba wiedzy na temat występowania deltakoronawirusów w populacji dzikich ptaków ale również u drobiu. Wymiernymi efektami badań będzie ocena występowania deltakoronawirusów w populacji dzikich ptaków i drobiu na terytorium Polski, charakterystyka molekularna wykrytych wirusów oraz ocena ich zmienności. Badania te dostarczą informacji o naturze deltakoronawirusów, ich różnorodności, dystrybucji oraz ewolucji. Wyniki badań mogą również pomóc w zrozumieniu epidemiologii IBV. Zastosowanie metody multikryterialnego modelowania decyzji oraz ilościowego modelu stochastycznego do oceny ryzyka wprowadzenia pryszczycy do krajowej populacji przeżuwaczy i świń Kierownik projektu: dr hab. Krzysztof Śmietanka, prof. nadzw. e-mail: [email protected] Zakład Epidemiologii i Oceny Ryzyka, Państwowy Instytut Weterynaryjny - Państwowy Instytut Badawczy (PIWet-PIB) w Puławach, 24-100 Puławy, Al. Partyzantów 57 Celem projektu jest opracowanie modeli matematycznych szacujących ryzyko wprowadzenia pryszczycy do krajowej populacji domowych przeżuwaczy i świń, mapowanie regionów o największym ryzyku wprowadzenia tej choroby oraz określenie krajów i gatunków zwierząt, z którymi wiąże się największe ryzyko. Planowane jest przeprowadzenie analiz w dwóch głównych zadaniach projektu. W zadaniu 1 zostanie zastosowana metoda multikryterialnego modelowania decyzji (MCDA). Polega ona na zidentyfikowaniu czynników środowiskowych, których obecność zwiększa ryzyko wystąpienia pryszczycy. Należą do nich m.in. gęstość i rozmieszczenie populacji bydła, owiec, kóz i świń, bliskość głównych dróg czy gęstość zaludnienia. Przy użyciu procesu hierarchii analitycznej określony zostanie, na podstawie ilości wystąpień w literaturze, względny wpływ każdego z nich na możliwość wystąpienia ogniska FMD, poprzez porównania parami i utworzenie tzw. macierzy ocen umożliwiającej wyznaczenie wag dla poszczególnych czynników ryzyka. Następnie dla każdego z nich utworzone zostaną warstwy rastrowe. W kolejnym etapie będą wyznaczone wartości przystawalności warunków każdej komórki rastrowej o powierzchni 4 km2 do wystąpienia ogniska FMD przy użyciu metody ważonej kombinacji liniowej (WLC), a wyniki zostaną przedstawione za pomocą mapy warstwowej, w której różnymi kolorami będzie zilustrowane ryzyko względne wprowadzenia choroby. Podczas realizacji zadania zastosowane będzie oprogramowanie ArcGIS for Desktop z rozszerzeniem Spatial Analyst (ESRI, Inc.), środowisko programowania PythonWin oraz Statistica (StatSoft). Zadanie 2 polegać będzie na ilościowej ocena ryzyka wprowadzenia FMD za pośrednictwem importu żywych zwierząt za pomocą probabilistycznego modelu stochastycznego. Prawdopodobieństwo wprowadzenia FMD do Polski dla każdego z wrażliwych gatunków (bydło, owce, kozy, świnie) zostanie oszacowane jako suma prawdopodobieństw wprowadzenia choroby do każdego powiatu Polski z każdego kraju eksportującego w/w gatunki do naszego kraju. Opracowanie modelu zostanie przeprowadzone w 6 etapach: 1) zdefiniowanie podstawowej jednostki terytorialnej, dla której będzie przeprowadzona analiza; 2) sformułowanie problemu; 3) zdefiniowanie danych wejściowych modelu i rozkładu prawdopodobieństw; 4) oszacowanie prawdopodobieństwa wystąpienia zagrożenia; 5) analiza wyników. Źródło danych na podstawie których oszacowane zostanie prawdopodobieństwo wystąpienia FMD w kraju eksportującym przeżuwacze i świnie do Polski stanowić będą raporty OIE oraz publikacje naukowe. Liczba zwierząt importowanych do poszczególnych powiatów kraju z podziałem na gatunki zostanie zaczerpnięta z bazy danych TRACES. Prawdopodobieństwa w zakresie możliwości przeżycia FMD przez zakażone zwierzę oraz niewykrycia infekcji zostaną określone na podstawie dostępnych publikacji. Szacowanie prawdopodobieństw, analizy statystyczne i tworzenie map zostaną przeprowadzone w programie @RISK (Palisade, Inc.), Statistica (StatSoft) oraz ArcMap 10.1 (ESRI, Inc.). Zróżnicowanie molekularne oraz antybiotykooporność szczepów Listeria monocytogenes pochodzących z żywności oraz obszarów produkcji żywności Kierownik projektu: dr hab. Kinga Wieczorek, prof. nadzw. e-mail: [email protected] Zakład Higieny Żywności Pochodzenia Zwierzęcego, Państwowy Instytut Weterynaryjny Państwowy Instytut Badawczy (PIWet-PIB) w Puławach, 24-100 Puławy, Al. Partyzantów 57 Listerioza jest zoonoza pokarmową o ciężkim przebiegu szczególnie u kobiet ciężarnych i noworodków. Większość przypadków uogólnionej listeriozy wymaga hospitalizacji, a duży odsetek z nich kończy się śmiercią. Bakterie wywołujące listeriozę, najczęściej jest to L. monocytogenes, są drobnoustrojami odpornymi na niekorzystne warunki środowiskowe oraz charakteryzują się zdolnością wzrostu w niskich temperaturach. Obecność L. monocytogenes stwierdza się w bardzo wielu produktach spożywczych, w tym w żywności gotowej do spożycia, np. rybach wędzonych. Celem obecnego projektu jest charakterystyka szczepów L. monocytogenes pochodzących z żywności i środowiska obrotu żywnością w Polsce. W ramach prowadzonych badań oceniony zostanie potencjał chorobotwórczy izolatów, poprzez określnie ich zróżnicowania molekularnego oraz odporności na wybrane środki przeciwdrobnoustrojowe. Uzyskane podczas realizacji projektu wyniki pozwolą na określenie jakim zróżnicowaniem klonalnym oraz potencjałem chorobotwórczym charakteryzują się badane szczepy L. monocytogenes oraz w jakim stopniu wykazują one odmienność lub podobieństwo genotypowe z izolatami pochodzącymi z innych krajów. W przedstawionym projekcie planowana jest kompleksowa charakterystyka ok. 150 izolatów L. monocytogenes pochodzących z Polski. Zaplanowane cele badawcze zostaną zrealizowane poprzez wykorzystanie różnorodnych metod badawczych. Planowane jest wykonanie identyfikacji serologicznej oraz określenie występowania genów wirulencji przy zastosowaniu techniki PCR. Metoda mikrorozcieńczeń oraz wyznaczenie minimalnego stężenia hamującego (Minimal Inhibitory Concentration, MIC) zostanie wykorzystana do wyznaczenia oporności na wybrane środki przeciwdrobnoustrojowe badanych szczepów L. monocytogenes. Ważnym etapem prowadzonych badań będzie typowanie molekularne izolatów. W tym celu użyte zostaną trzy techniki chrakteryzujące się różnym potencjałem różnicującym. Pierwsza z nich, PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis), opiera się na analizie polimorfizmu miejsc restrykcyjnych, dwie pozostałe na różnicach w sekwencjach genów metabolizmu podstawowego (Multilocus sequence typing, MLST) oraz genów wirulencji (Multilocus virulence sequence typing, MVLST). Uzyskane wyniki pozwolą na wygenerowanie drzew filogenetycznych, a tym samym określenie pokrewieństwa klonalnego szczepów L. monocytogenes. Ponadto przeprowadzone zostaną analizy statystyczne dotyczące m.in. częstości występowania genów wirulencji czy oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, a także potencjału różnicującego oraz wzajemnej zgodności metod użytych do typowania molekularnego badanych izolatów. Charakterystyka molekularna szczepów poliomawirusa i cirkowirusa gęsiego izolowanych od gęsi w Polsce Kierownik projektu: dr hab. Wojciech Kozdruń, prof. nadzw. e-mail: [email protected] Zakład Chorób Wirusowych Drobiu, Państwowy Instytut Weterynaryjny - Państwowy Instytut Badawczy (PIWet-PIB) w Puławach, 24-100 Puławy, Al. Partyzantów 57 Jak dotychczas w Polsce z wyjątkiem parwowirusa gęsiego nie prowadzono badań nad charakterystyką molekularną szczepów wirusowych izolowanych od drobiu wodnego. Oprócz wyżej wymienionego parwowirusa gęsiego najczęściej w stadach gęsi izolowany jest poliomawirus gęsi oraz cirkowirus gęsi. Cirkowirus wykazuje działanie immunosupresyjne, natomiast poliomawirus jest czynnikiem etiologicznym syndromu krwotocznego zapalenia nerek i jelit u gęsi. Oba te wirusy należy uwzględnić w diagnostyce różnicowej choroby Derzsy’ego. Wobec tak dużego znaczenia epidemiologicznego tych wirusów będą podjęte w ramach projektu promotorskiego badania nad molekularną charakterystyką szczepów poliomawirusa i cirkowirusa gęsiego izolowanych ze stad gęsi w Polsce. Do badań będą użyte zarówno szczepy pochodzące z kolekcji własnej Zakładu Chorób Wirusowych Drobiu, a także na bieżąco izolowane z narządów wewnętrznych chorych ptaków w trakcie usługowych badań diagnostycznych oraz izolowane z materiałów pozyskanych od innych partnerów Konsorcjum (SGGW Warszawa oraz UWM Olsztyn). Wszystkie szczepy wirusowe oraz homogenizaty narządów wewnętrznych chorych ptaków posłużą do zakażania odpowiednich hodowli lub linii komórkowych. Zostaną wykonane trzy pasaże. W momencie wystąpienia w hodowli lub linii komórkowej charakterystycznego dla danego wirusa efektu cytopatycznego, zakażone komórki będą zbierane i będzie izolowany całkowity, komórkowy DNA. W reakcji amplifikacji zostaną użyte specyficzne startery dla genu kodującego białko CVP1 cirkowirusa gęsiego oraz kodującego białko VP1 poliomawirusa gęsiego. Po przeprowadzeniu rozdziału elektroforetycznego produktów PCR zostaną one oczyszczone enzymatycznie, a następnie poddane sekwencjonowaniu oraz działaniu specyficznych enzymów restrykcyjnych. Uzyskane sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe będą porównywane z sekwencjami poliomawirusa i cirkowirusa izolowanymi od gęsi i ptaków dzikich i dostępnych w bazach danych. Wszystkie uzyskane wyniki analizy sekwencyjnej oraz analizy restrykcyjnej pozwolą określić podobieństwo pomiędzy szczepami, a także ich pochodzenie. Wyniki uzyskane w trakcie realizacji projektu promotorskiego w znaczący sposób wzbogacą ubogą wiedzę odnośnie zakażeń wirusowych drobiu wodnego. Oprócz tego wyniki te będą bardzo przydatne dla lekarzy weterynarii i hodowców. Powinny być one uwzględnione przy prawidłowym postępowaniu lekarsko – weterynaryjnym w stadach gęsi. Z kolei porównanie szczepów izolowanych od gęsi ze szczepami izolowanymi od dzikich ptaków powinno dać odpowiedź na pytanie o rezerwuar i pochodzenie szczepów cirkowirusa i poliomawirusa. Charakterystyka molekularna szczepów wirusa biegunki bydła i choroby błon śluzowych (BVDV) oraz analiza transkryptomu komórek zakażonych tym wirusem Kierownik projektu: dr hab. Mirosław Polak, prof. nadzw. e-mail: [email protected] Zakład Wirusologii, Państwowy Instytut Weterynaryjny - Państwowy Instytut Badawczy (PIWet-PIB) w Puławach, 24-100 Puławy, Al. Partyzantów 57 Cel prowadzonych badań/hipoteza badawcza: Celem planowanych badań jest ocena patogenności wirusa BVD w oparciu o analizę kinetyki namnażania się różnych szczepów wirusa w hodowli komórkowej oraz zmienności genetycznej wybranych regionów genomu wirusa. Ponadto, ocenione będą zmiany regulacji funkcjonowania genów różnych szlaków przemian komórkowych na poziomie zakażonych komórek. Planowane badania pozwolą lepiej zrozumieć zmienność BVDV poprzez ocenę odpowiedzi organizmu gospodarza na zakażenie szczepami o wysokiej i niskiej zjadliwości należącymi do różnych genotypów wirusa oraz podtypów dominujących w Polsce. Taka charakterystyka wirusa BVD pozwoli w przyszłości wybrać optymalne szczepy do produkcji szczepionek, skutecznie chroniących bydło przed zakażeniem tym patogenem. Zastosowana metoda badawcza/metodyka: Kinetyka namnażania się szczepów wirusa i ich patogenność ocenione będą w systemie in vitro poprzez zmianowanie oraz ocenę ilościową wirusowego RNA w teście RT-qPCR. Wybrane regiony genomu wirusa zostaną poddane sekwencjonowaniu celem klasyfikacji szczepów terenowych. W oparciu o uzyskane wyniku przeprowadzona zostanie selekcja szczepów do dalszych badań genetycznych. Materiałem do badań mikromacierzowych będzie całkowity RNA uzyskany z zakażonych poszczególnymi szczepami komórek MDBK oraz hodowli niezakażonej służącej jako kontrola. Ocena jakościowa/ilościowa RNA zostanie przeprowadzona przy użyciu Bioanalizera. Część materiału zostanie użyta do analizy mikromacierzowej i równolegle część pozostawiona w -70oC będzie wykorzystana do potwierdzenia wyników mikromacierzy metodą RT-qPCR. W badaniu zostaną użyte macierze oligonukleotydowe specyficzne dla bydła (bovine gene expression array, Agilent). Po procesie hybrydyzacji i skanowania, otrzymane wyniki zostaną poddane analizie przy pomocy programów GeneSpring oraz programu Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Qiagen). Pozwoli to na wybór genów o zmienionej ekspresji i określenie ich przynależności do szlaków sygnałowych, co z kolei umożliwi wykazanie różnic i podobieństw pomiędzy poszczególnymi szczepami BVDV na poziomie biologii systemowej. W sumie planuje się wykonanie ok. 30 macierzy do scharakteryzowania ok. 10 szczepów reprezentujących zarówno zjadliwe jak i niezjadliwe szczepy należące do trzech genotypów BVDV. Drugi etap badań będzie polegał na potwierdzeniu wyników otrzymanych z analizy danych mikromacierzowych. Taka weryfikacja będzie możliwa dzięki wykorzystaniu techniki RT-qPCR umożliwiającej ilościową analizę ekspresji wybranych genów. Wpływ spodziewanych rezultatów na rozwój nauki, cywilizacji, społeczeństwa: Uzyskane wyniki badań pozwolą lepiej zrozumieć mechanizmy odpowiedzialne za zwiększoną patogenność określonych szczepów BVDV w stosunku do gospodarza w układzie in vitro. Nowatorska technika badawcza oparta o analizę z wykorzystaniem mikromacierzy pozwoli ocenić wpływ wirusa na organizm gospodarza i określić które geny i jakie szlaki metaboliczne są uruchamiane w trakcie zakażenia i warunkują zwiększoną zjadliwość BVDV. Ocena odpowiedzi serologicznej zwierząt ze stad zakażonych analizowanymi szczepami pozwoli w przyszłości opracować skuteczne szczepionki zapewniające szerokie spektrum odpowiedzi humoralnej przy zakażeniu innymi podtypami wirusa. Stosowanie szczepionek w stadach zakażonych, po usunięciu siewców wirusa, ma istotne znaczenie dla ograniczenia strat ekonomicznych i zachorowań klinicznych osobników serologicznie ujemnych. Uzyskane wyniki pozwolą w przyszłości dobrać odpowiednie szczepy do produkcji skutecznych biopreparatów zabezpieczających stada przed krążeniem w nich BVDV. Wybrane aspekty związane z szerzeniem się, zakaźnością i przeżywalnością wirusa afrykańskiego pomoru świń (ASFV) w środowisku Kierownik projektu: dr hab. Grzegorz Woźniakowski, prof. nadzw. e-mail: [email protected] Zakład Chorób Świń, Państwowy Instytut Weterynaryjny - Państwowy Instytut Badawczy (PIWet-PIB) w Puławach, 24-100 Puławy, Al. Partyzantów 57 Celem projektu jest poznanie aspektów związanych z szerzeniem się, zakaźnością i przeżywalnością wirusa afrykańskiego pomoru świń (ASFV). Planowane jest również zbadanie lokalizacji i poziomu wirusowego DNA w sztucznie kontaminowanych próbkach krwi, wybranych tkankach pochodzących od dzików i świń, ściółce leśnej, glebie oraz wodzie pobranej ze zbiorników wodnych (min. zalew Siemianówka, rzeka Narew, Braszcza i Hwożna) w II i III strefie objętej ograniczeniami ze względu na występowanie ASF. Dotychczas tego typu badania nie były prowadzone w kraju, natomiast badania prowadzone w innych światowych jednostkach badawczych zostały wykonane z użyciem szczepów ASFV występujących w Europie w latach 60-80. Dotychczas przeprowadzone w 2015 roku badania z użyciem szczepu Georgia 2007/1 są cenne dla zrozumienia epidemiologii i szerzenia się ASFV na terenie Rosji oraz transkaukaskim jednak nie w pełni oddają warunki oraz charakterystykę izolatów krążących na terenie Polski. Z tego względu planowane badania mają na celu dostarczenie informacji na temat zakaźności i przeżywalności ASFV w środowisku na podstawie wybranego, reprezentatywnego izolatu tego wirusa z regionu Polski. Duża dostępność różnorodnego materiału klinicznego od świń domowych (3 ogniska) i dzików (83 przypadki) z terenu naszego kraju stwarza szerokie możliwości do wyboru odpowiedniego izolatu ASFV. Rygorystyczne warunki, które spełniają pomieszczenia klasy PCL3+ w Państwowym Instytucie Weterynaryjnym - Państwowym Instytucie Badawczym (PIWet-PIB) o wysokich standardach bioasekuracji stwarzają możliwość prześledzenia zakaźności i przeżywalności wirusa w zależności od tkanki lub zakażonej matrycy w różnych warunkach temperatury i wilgotności. W pierwszym zadaniu badawczym (work package 1 - WP1) planowane jest namnożenie wirusa ASF w hodowlach makrofagów świń oraz analiza wybranych izolatów ASFV techniką sekwencjonowania następnej generacji (NGS). Pozwoli to na wybór reprezentatywnego szczepu z terenu Polski do dalszych badań nad zakaźnością i przeżywalnością ASFV. Wszystkie badania będą realizowane w pomieszczeniach klasy PCL3+, znajdujących się na terenie PIWet-PIB. W drugim zadaniu badawczym (WP2) będzie badana zakaźność i przeżywalność wirusa w sztucznie kontaminowanych próbkach krwi, tkankach (wątroba, śledziona, płuca, nerki i migdałki), ściółce leśnej, glebie oraz wodzie pobranej ze zbiorników wodnych (min. zalew Siemianówka, rzeka Narew, Braszcza i Hwożna) w II i III strefie objętej ograniczeniami ze względu na występowanie ASF. Badania te będą prowadzone w temperaturze od -20°C, do 37°C oraz przy wilgotności 5-80%. Etap ten będzie przeprowadzony przy użyciu linii komórkowej hodowli makrofagów świń zakażanych homogenatami kontaminowanych matryc oraz ilościową techniką real-time PCR z użyciem sond UPL (universal probe library). Wyniki planowanych badań pozwolą na dogłębne prześledzenie zakaźności i przeżywalności w zależności od tkanki lub matrycy. Proponowane badania mają bardzo duże znaczenie poznawcze dla współczesnej epidemiologii i immunologii chorób zakaźnych świń o dużym znaczeniu ekonomicznym. Wyniki badań będą publikowane w renomowanych czasopismach wirusologicznych oraz poświęconych chorobom zakaźnym świń. Wyniki będą też prezentowane podczas konferencji krajowych i międzynarodowych poświęconych chorobom świń. Występowanie zieleni malachitowej i fioletu krystalicznego w wolno żyjących rybach z wybranych polskich jezior i rzek Kierownik projektu: dr hab. Kamila Mitrowska, prof. nadzw. e-mail: [email protected] Zakład Farmakologii i Toksykologii, Państwowy Instytut Weterynaryjny - Państwowy Instytut Badawczy (PIWet-PIB) w Puławach, 24-100 Puławy, Al. Partyzantów 57 Cel prowadzonych badań/hipoteza badawcza: Skażenia chemiczne żywności i środowiska substancjami farmakologicznie aktywnymi są ważnym problemem wymagającym systematycznych badań i bieżącej oceny higienicznotoksykologicznej. W piśmiennictwie naukowym można znaleźć informacje wskazujące na obecność w wodzie i w osadach dennych a także w rybach wolno żyjących takich substancji farmakologicznie aktywnych jak niesteroidowe leki przeciwzapalne, antybiotyki czy środki hormonalne. W przypadku barwników trifenylometanowych, które również są aktywne farmakologicznie, badań takich w Polsce dotychczas nie prowadzono. Barwniki trifenylometanowe takie jak zieleń malachitowa czy fiolet krystaliczny dzięki swoim właściwościom terapeutycznym wykorzystywane są w medycynie ludzkiej i weterynaryjnej. Jako substancje barwiące natomiast są powszechnie używane do barwienia wyrobów papierniczych, farb drukarskich, jedwabiu i wełny. Wśród hodowców ryb cieszą się dużą popularnością, mimo że nigdy nie były oficjalnie zarejestrowane jako weterynaryjne produkty lecznicze i ich stosowanie jest zabronione w hodowlach ryb przeznaczonych do konsumpcji ze względu na potencjalne działanie mutagenne i kancerogenne. W Polsce, o ile w miarę dobrze rozpoznamy jest problem występowania zieleni malachitowej i fioletu krystalicznego w rybach hodowlanych po nielegalnym ich stosowaniu w celach terapeutycznych, to w zasadzie brak jest wiedzy na temat obecności tych barwników w rybach wolno żyjących. Dlatego też celem projektu jest określenie czy w osadach dennych, wodzie i organizmach ryb wolno żyjących z wybranych polskich jezior i rzek narażonych na różne formy oddziaływania człowieka występują barwniki stosowane zarówno w medycynie ludzkiej jak i w praktyce weterynaryjnej oraz różnych gałęziach przemysłu. Proponowane zadania badawcze oparte na modelu ryb wolno żyjących pozwolą zarówno na wnikliwą ocenę lokalnych zanieczyszczeń środowiskowych jak i ocenę produktów żywnościowych uzyskiwanych od tych ryb. Zastosowana metoda badawcza/metodyka: Badanie występowania zieleni malachitowej i fioletu krystalicznego w wolno żyjących rybach z wybranych polskich jezior i rzek obejmować następujące zadania: Wybranie określonych miejsc (rzeki i jeziora) na terenie całego kraju, z których do badań pobrane zostaną próbki wody, osadów i ryb. Określenie, czy w pobranym do badań materiale (ryby, osady i woda) stwierdzana jest obecność barwników z wykorzystaniem chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS/MS). Analiza ryb zostanie przeprowadzona metodą już opracowaną, natomiast do analizy wody i osadów dennych przewiduje się przygotowanie nowej metody. Wyznaczenie zależności pomiędzy barwnikami występującymi w wodzie, osadach i w organizmach ryb oraz ustalenie powiązania uzyskanych wyników z działalnością człowieka (odpady komunalne i przemysłowe, obecność stawów hodowlanych). Dokonanie oceny ryzyka pod kątem zagrożenia środowiska wynikającego z obecności barwników w wodzie i osadach oraz pod kątem zagrożenia zdrowia człowieka wynikające z obecności barwników w rybach.
