streszczenie (PL)

STRESZCZENIE
Rozprawa doktorska przedstawia badania strukturalne i funkcjonalne białek organizmów
extremofilnych. Chitynaza 60 (MmChi60) z psychrofilnej bakterii Moritella marina i
chitynaza 40 (Chi40) z termofilnej bakterii Streptomyces thermoviolaceus zostały poddane
szczegółowej analizie celem odpowiedzi na pytanie: Jakie cechy strukturalne białek z
organizmów ekstremofilnych wpływają na ich właściwości adaptacyjne?
Rozwiązana struktura krystaliczna MmChi60 pokazała, że cząsteczka białka ma kształt
wydłużony i poza domeną katalityczną składa się dodatkowo z dwóch liniowo ułożonych
domen Ig-like i domeny wiążącej chitynę (ChBD). Jest to pierwsza tak skomplikowana
struktura chitynazy rozwiązana metodami krystalograficznymi, mimo że wiele chitynaz lub
celulaz posiada wielodomenową złożoną budowę. Swoboda konformacyjna poszczególnych
domen w wielu przypadkach jest przyczyną nieudanych prób uzyskania kryształów.
Badania kompleksów białko-ligand pokazały, że enzym w krysztale zachowuje
aktywność. Wynikiem tych badań są kompleksy z produktem pośrednim – jonem
oksazolinowym, i z produktem reakcji NAG2. Charakterystyczny dla chitynaz z rodziny
hydrolaz glikozydowych motyw trzech kwasowych reszt DxDxE jest zachowany w
MmChi60. Analiza porównawcza struktur enzymu niezwiązanego z ligandem i tymi, gdzie
jest on obecny w miejscu wiązania substratu pozwoliła wyjaśnić rolę innych zachowanych
reszt aminokwasów w pobliżu miejsca aktywnego.
Kolejne struktury mutanta reszty aktywnej E153Q nie związanego z ligandem i w
kompleksie z substratem NAG4 i NAG5 ukazały znaczną różnicę w sposobie wiązania
substratu między MmChi60 a innymi chitynazami, których struktury w kompleksie z
substratem są znane. Miejsce wiązania substratu po stronie glikonowej i aglikonowej
charakteryzują się dużą swobodą konformacyjną zmieniając swoje położenie pod wpływem
wiązania ligandu.
Mutanty delecyjne jednej domeny Ig-like (D2), dwóch domen Ig-like (D12) i domen
Ig-like łącznie z ChBD zostały zaprojektowane i poddane krystalizacji celem zaobserwowania
miejsc elastycznych pomiędzy poszczególnymi domenami. W przypadku mutanta D2 w
dwóch cząsteczkach w części asymetrycznej zaobserwowano różne ułożenia ChBD względem
reszty białka. Także domena Ig-like jest przesunięta w porównaniu do białka o pełnej
długości. Struktura krystaliczna mutantów D12 i D123 okazały się być bardzo podobne i
składają się tylko z domeny katalitycznej, dlatego też, mając wysoką rozdzielczość,
posłużyły, jako źródło szczegółów o domenie katalitycznej MmChi60. Zwieńczeniem badań
nad swobodą konformacyjną okazały się badania SAXS, które ukazały, że MmChi60 w
roztworze oprócz wydłużonego kształtu podobnego do tego obserwowanego w krysztale,
może przyjmować inne konformacje, od całkowicie rozwiniętej do bardzo zwartej.
W cząsteczce MmChi60 zostało zidentyfikowanych wiele charakterystycznych cech,
które mogą wpływać na mechanizm reakcji, wiązanie substratu i wydajność enzymatyczną
obserwowaną w niskich temperaturach. Domena wiążąca chitynę łącznie z resztami
tryptofanu liniowo ułożonymi i wyeksponowanymi w stronę rozpuszczalnika, odpowiedzialna
jest za powinowactwo do nierozpuszczalnego substratu; dwie, elastycznie połączone domeny
Ig-like pozwalają ustawić ChBD w odpowiedniej pozycji względem domeny katalitycznej,
której płytkie miejsce wiązania substratu jest przygotowane na przyłączenie substratu.
Mając tylko jeden kryształ udało się rozwiązać strukturę krystaliczną termofilnej
Chi40. Ukazała ona zwartą strukturę, która poza domeną katalityczną składa się z insercyjnej
domeny α+β. Rozpatrując ogólnie, struktura ta jest podobna do innych dostępnych w bazie
PDB jednak głębsze analizy pozwoliły na identyfikowanie cech nietypowych. Sekwencja
aminokwasowa Chi40 wykazuje 34% identyczności z psychrofilną chitynazą z Arthrobacter
TAD20, jednak Chi40 w wielu miejscach jest skrócona, co czyni ją jeszcze bardziej zwartą
niż jej psychrofilna odpowiednik.
Wiele cechy strukturalnych białka Chi40, które mogą wpływać na termofilne
właściwości
tego
białka:
termostabilność
i
prawie
100%
renaturację,
zostało
zidentyfikowanych. Struktura białka jest stabilizowana przez trzy wiązania disiarczkowe, z
czego dwa nie są obserwowane w żadnych sekwencyjnie najbardziej podobnych strukturach.
Trzecie, w Chi40 jest stabilizowane dodatkowe oddziaływaniami z pierścieniami
aromatycznymi reszt fenyloalanin. Dodatkowo zaobserwowano substytucję przez proliny
dodatnio naładowanych aminokwasów biorących udział w oddziaływaniu w postaci mostków
solnych. Taka zamiana stabilizuje strukturę poprzez obniżenie entropi rozfałdowanego białka.
Przedstawione badania chitynaz organizmów ekstremofilnych ukazują cechy tych
białek spotykane we wszystkich chitynazach jak również te, które są charakterystyczne dla
enzymów ekstremofilnych, wskazując na ich rolę w adaptacji do określonych warunków
temperaturowych. Pokazują, że struktury muszą zachować równowagę pomiędzy byciem
sztywnym i elastycznym. Zapewnia to nie tylko stabilizację struktury, ale także swobodę
konformacyjną potrzebną do pełnieni biologicznych funkcji. Szala tego kompromisu
przechyla się w zależności od warunków temperaturowych, w których dany enzym występuje.
Jest to nie tylko interesujące z punktu widzenia nauk podstawowych, ale również ważne z
punktu widzenia projektowania wyspecjalizowanych enzymów wykorzystywanych w
przemyśle.