Ocena przeciwwirusowej i immunomodulacyjnej
Transkrypt
Ocena przeciwwirusowej i immunomodulacyjnej
MARIA CURIE-SKŁODOWSKA UNIVERSITY INSTITUTE OF MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY Department of Virology and Immunology Akademicka 19, 20-033 Lublin, Poland Fax: 81 537 59 59, tel 81 537 59 40 Ocena przeciwwirusowej i immunomodulacyjnej aktywności trójterpenów izolowanych z kory brzozy (Betula alba) i jemioły (Viscum album) Część I Trójterpeny pentacykliczne są to związki posiadające 30-węglowy szkielet złożony z 4 pierścieni sześciowęglowych i jednego pięciowęglowego. Występują one w wielu roślinach i posiadają aktywność przeciwzapalną, przeciwwirusową i przeciwnowotworową (7,16,17,18,21) Ich przeciwwirusowe działanie skierowane jest w stosunku do wirusów, których genom zbudowany jest z RNA jak i DNA, i które należą do różnych rodzin (systematyka wirusów). Na przykład, hamują one replikację wirusa ospy wietrznej i półpaśca, zapalenia wątroby typu A, opryszki, krowianki, adenowirusa typu 5, reowirusów, wirusa poliomyelitis, wirusa Semliki Forest (2,3,4,5,13,14,15). Szczególnie interesujące jest to, że betulina i kwas betulinowy izolowane z kory brzóz Betula alba oraz ich pochodne są aktywne przeciw wirusowi HIV (ludzkiego niedoboru odporności), rodzina Retroviridae (1,8,9,10,11,20). Bardzo interesujący jest fakt, że pochodne betuliny i kwasu betulinowego hamują wiele etapów replikacji tego wirusa w komórkach ludzkich. Są więc inhibitorami enzymu wirusa - odwrotnej transkryptazy, hamują dojrzewanie cząstek wirusa i jego uwalnianie z zakażonej komórki. Skąpe doniesienia na temat przeciwwirusowej aktywności tych substancji w stosunku do innych patogennych dla człowieka i zwierząt wirusów zostały w naszych badaniach poszerzone o ich działanie na wirusy należące do rodziny Picornaviride (wirus zapalenia mózgu i mięśnia sercowego) i Rhabdoviride (wirus pęcherzykowego zapalenia jamy gębowej bydła). Należy podkreślić, że do tej ostatniej rodziny należy także wirus wścieklizny. Do naszych doświadczeń zostały użyte trójterpeny: betulina i kwas oleanolowy izolowane z kory Betula alba i oczyszczone przez inż. Stanisława Pielę z firmy "Sylveco", Jasionka, oraz kwas betulinowy firmy Sigma. Jak wykazały badania identyfikacyjne i porównawcze laboratorium Chemii Organicznej Politechniki Rzeszowskiej betulina przygotowana przez inż. Pielę jest preparatem bardzo wysokiej czystości. Potwierdziliśmy to porównując preparat betuliny "Sylveco" ze standardem betuliny (Sigma) w chromatografii cienkowarstwowej (TLC) na płytkach Kieselgel 60 (Merck) stosując jako eluent chloroform/octan etylu (10:1). Preparat "Sylveco" i wzorzec wykazywały identyczne Rf (retention factor) i nie stwierdzono plamek żadnych innych substancji po wywołaniu płytek jodem. Natomiast kwas oleanolowy "Sylveco" zawierał pewne zanieczyszczenia betuliną, co stwierdzono w w/w laboratorium Politechniki Rzeszowskiej i co potwierdziły nasze analizy TLC. Jako wirusów testujących użyto: wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej (Versicular stomatitis virus - VSV) i wirus zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (Encephalomyocarditis virus EMCV). Fibroblasty skóry ludzkiej (HSF) były stosowane jako komórki do mierzenia efektów cytotoksyczności wpływu badanych substancji na replikację wirusów. Wirusobójcza aktywność betuliny, kwasu betulinowego i kwasu oleanolowego polegająca na bezpośrednim niszczeniu wirusów była niewielka, np. 26 mg/ml betuliny inaktywowało 50% cząsteczek wirusa VSV. Powodem małej aktywności wirusobójczej badanych substancji była prawdopodobnie ich słaba rozpuszczalność w wodzie, powodująca wytrącanie się trójterpenów w płynie hodowlanym. Natomiast w innym doświadczeniu stwierdzono, że wszystkie trzy badane trójterpeny hamowały replikację obydwu wirusów obniżając ich miano o 50% (EC50) przy stężeniach substancji poniżej 1,3 mg/ml. Ze względu na stosunkowo niską toksyczność (CC50 -stężenie niszczące 50% komórek skóry ludzkiej) i wysoką aktywność przeciwwirusową, indeks terapeutyczny (TI), czyli stosunek CC50/ED50 miał wartość powyżej 18. Stawia to betulinę, kwas betulinowy i kwas oleanolowy w rzędzie potencjalnych substancji o aktywności przeciw wirusom VSV i EMCV. Tabela 1. Wirusobójcza aktywność betuliny (B), kwasu betulinowego (Ba) i oleanolowego (Oa) w stosunku do wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy gębowej bydła (VSV) I wirusa zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (EMCV) EC50 mg/ml Substancja VSV EMCV B 26.8 39.5 Ba 26.8 87.4 Oa 31.7 32.4 Zawiesinę wirusa inkubowano z różnymi stężeniami badanych substancji przez 1 godzinę w 37 oC. Stężenie, które powodowało spadek miana wirusa o 50% uznano za dawkę EC50. Tabela 2. Cytotoksyczne i przeciwwirusowe działanie betuliny (B), kwasu betulinowego (Ba) i kwasu oleanolowego (Oa). Substancja CC50(mg/ml)a VSV EC50 EMCV TIc EC50 (mg/ml) TI (mg/ml)b a B 30 1.2 25 1.26 23.8 Ba 20 1.0 20 1.1 18.1 Oa 25 1.0 25 1.26 19.8 Stężenie toksyczne dla 50% komórek HSF bStężenie c Indeks hamujące replikację wirusa w 50% terapeutyczny CC50/ EC50 Część II Wspomniana powyżej przeciwzapalna aktywność trójterpenów wynika z ich zdolności do wiązania się i hamowania aktywności wielu enzymów komórkowych. Betulina i kwas betulinowy są inhibitorami fosfolipazy A, enzymu, który uwalnia z lipidów błony komórkowej kwas arachidonowy. Kwas arachidonowy jest substratem dla dwu typów enzymów: cyklooksygenaz i lipooksygenaz syntetyzujących prostaglandyny i leukotrieny, uczestniczące w procesie zapalnym. Zarówno oksygenazy jak i lipooksygenazy są hamowane przez kwas ursolowy i oleanolowy. Oba kwasy hamują także aktywność elastazy i serynowych proteaz, które odpowiedzialne są za destrukcję tkanki w procesie zapalnym. Do tych przeciwzapanych aktywności trójterpenów dochodzą jeszcze ich zdolności do hamowania cytokin prozapalnych w tym czynnika martwicy nowotworów (TNF) i interleukiny 1 (IL-1). Jednak doniesienia piśmienictwa są sprzeczne. Niektóre z nich mówią, ze trójterpeny mogą wzmacniać produkcję niektórych cytokin (1,2,4,5,6,7,9,10), czyli mogą działać immunomodulacyjnie. Cytokiny są to białka, które służą komórkom uczestniczącym, np. w procesie zapalnym do "porozumiewania" się między sobą. Ich wytwarzanie może być "markerem" toczącego się stanu zapalnego. Oprócz cytokin prozapanych są cytokiny hamujące, wygaszające stan zapalny, np. interleukina 10 (IL-10) Stosując nowoczesne metody immunoenzymatyczne (ELISA), które pozwalają na ocenę nawet niewielkich zmian w ilości wytworzonych przez komórki cytokin, można wykazać immunomodulacyjną aktywność badanych substancji. W naszych badaniach przeprowadzonych in vitro, zastosowaliśmy model "stanu zapalnego" składający się z komórek krwi człowieka oraz mitogenu fitohemaglutyniny jako induktora cytokin. Stwierdziliśmy, że kwas betulinowy osłabia w komórkach krwi produkcję substancji o charakterze prozapalnym - IFN-g a wzmacnia wytwarzanie IL-10. Ma więc podwójne przeciwzapalne działanie - nie tylko wygasza produkcję prostaglandyn i leukotrienów jak wykazano w innych badaniach (1), ale także wygasza produkcję cytokin prozapalnych takich jak IFN-g, stymulując wytwarzanie przeciwzapalnych cytokin (IL-10). Betulina nie wykazuje takiego działania, gdyż w naszych doświadczeniach stymulowała wytwarzanie TNF-a, czyli cytokiny prozapalnej. Przypuszczamy, że łączne stosowanie betuliny i kwasu betulinowego może dawać najlepszy immunomodulacyjny efekt terapeutyczny . Prace firmy "Sylveco" idące w kierunku izolacji i oczyszczania aktywnych biologicznie substancji naturalnych, zawartych między innymi w korze brzozy, wychodzą naprzeciw potrzebom współczesnej preparatyki farmaceutycznej coraz częściej bazującej na preparatach otrzymywanych z różnych części roślin. Tabela 3. Cytokiny indukowane przez betulinę i kwas betulinowy w hodowli komórek krwi ludzkiej Substancja mg/ml-1 Cytokina TNF-a IFN-g IL-10 1.18ą1.0 1.36ą0.4 0 10 7.56ą5.7* 1.0ą0.4 0 5 5.4ą4.7 1.2ą0.7 0 10 1.42ą0.5 1.4ą0.5 0 5 1.04ą1.0 1.7ą0.8 0 Betulina Kwas betulinowy ˇStatystycznie istotna różnica w porównaniu z kontrolą przy p<0.05 Wykres 1. Wpływ betuliny (B) I kwasu betulinowego (BA) na wytwarzanie cytokin w hodowlach komórek krwi ludzkiej indukowanej PHA+LPS * statystycznie istotna różnica w porównaniu z kontrolą (PHA+LPS) Piśmiennictwo (część I) 1.Akihisa T., Ogihara J., Kato J., Yasukawa K., Ukiya M., Yamanouchi S., Oishi K (2001): Inhibitory effects of triterpenoids and sterols on human immunodeficiency virus-1 reverse transcriptase. Lipids 36, 507-512. 2.Baba M., Shigeta S. (1987): Antiviral activity of glycyrrhizin against varicella-zoster virus in vitro. Antiviral Res. 7, 99-107. 3.Crance J.M., Leveque F., Biziagos E., van Cuyck-Gandre H., Jouan A., deloince R. (1994): Studies on mechanism of action of glycyrrhizin against hepatitis A virus replication in vitro. Antiviral Res. 23, 63-76. 4.Dargan D.J., Galt C.B., Subak-Sharpe J.H. (1992): The effect of cicloxolone sodium on the replication of vesicular stomatitis virus in BSC-1 cells. J. Gen. Virol. 73, 397-406. 5.Dargan D.J., Galt C.B., Subak-Sharpe J.H. (1992): The effect of cicloxolone sodium on the replication in cultured cells of adenovirus type 5, reovirus type 3, poliovirus type 1, two bunyaviruses and Semliki Forest virus. J. Gen. Virol. 73, 407-411. 6.De Clerq E. (2001) :New developments in anti-HIV therapy Curr. Med. Chem. 8, 1543-1572. 7.Fulda S., Debatin K.M. (2000): Betulinic acid induces apoptosis through a direct effect on mitochondria in neuroectodermal tumors. Med. Pediatr. Oncol. 35, 616-618. 8.Hashimoto F., Kashiwada Y., Cosentino L.M., Chen C.H., Garrett P.E., Lee K.H. (1997): AntiAIDS agents-27. Synthesis and anti-HIV activity of betulinic acid and dihydrobetulinic acid derivatives. Bioorg. Med. Chem. 5, 2133-2143. 9.Holz-Smith S.L., Sun IC., Jin L., Matthews T.J., Lee K.H., Chen C.H. (2001):Role of human immunodeficiency virus (HIV) type 1 envelope in the anti-HIV activity of the betulinic acid derivative IC9564. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 60-66. 10. Kanamoto T., Kashiwada Y., Kanbara K., Goth K., Yoshimori M., Goto T., Sano K., Nakashima H. (2001): Anti-human immunodeficiency virus activity of YK-FH312 (a betulinic acid derivative), a novel compound blocking viral maturation. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 1225-1230. 11. Kashiwada Y., Chiyo J., Ikeshiro Y., Nagao T., Okabe H., Cosentino L.M., Fowke K., Lee K.H. (2001): 3,28-di-0-(dimethylsuccinyl)-betulin isomers as anti-HIV agents. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 183-185. 12. Kashiwada Y., Nagao T., Hashimoto A., Ikeshiro Y., Okabe H., Cosentino L.M., Lee K.H. (2000): Anti-AIDS agents. 38. Anti-HIV activity of 3-0-acyl ursolic derivatives. J. Nat. Prod. 63, 1619-1622. 13. Kinjo J., Yokozimo K., Hirakawa T., Shii Y., Nohara T., Uyeda M. (2000): Anti-herpes virus activity of fabaceous triterpenoidal saponins. Biol. Pharm. Bull. 23, 887-889. 14. Kurokawa M., Basnet P., Ohsugi M., Hozumi T., Kadota S., Namba T., Kawana T., Shiraki K. (1999): Anti-herpes simplex virus activity of moronic acid purified from Rhus javanica in vitro and in vivo. J. Pharmacol Exp. Ther. 289, 72-78. 15. Lampis G., Ingianni A., Pompei R. (1997): Synergistic effects of triterpenic compounds with prostaglandin A1 on vaccinia virus infected L929 cells. Antiviral Res. 36, 191-195. 16. Mahato S.B., Sarkar S.K., Poddar G. (1988): Triterpenoid saponins. Phytochemistry 27, 3037-3067. 17. Recio M.C., Giner R.M., Manez S., Gueho J., Julien H.R., Hostettmann K., Rios J.L. (1995): Investigations on the steroidal anti-inflammatory activity of triterpenoids from Diospyros leucomelas. Planta Med. 61, 9-12. 18. Ryu S.Y., Oak M.H., Yoon S.K., Cho D.I., Yoo G.S., Kim T.S., Kim K.M. (2000): Anti-alergic and anti-inflammatory triterpenes from herb of Prunella vulgaris. Planta Med. 66, 358-360. 19. Simoes C.M., Amoros M., Girre L. (1999): Mechanism of antiviral activity of triterpenoid saponins. Phytother. Res. 13, 323-328. 20. Vlietinck A.J., De Bruyne T., Apers S., Pieters L.A. (1998): Plant-derived leading compounds for chemotherapy of human immunodeficiency virus (HIV) infection. Planta Med. 64, 97-109. 21. Zuco V., Supino R., Righetti S.C., Cleris L., Marchesi E., Gambacorti-Paserini C., Formelli F. (2002): Selective cytotoxicity of betulinic acid on tumor cell lines, but not on normal cells. Cancer Lett. 175, 17-25. Piśmiennictwo (część II) 1. Bernard P., Scior T., Didier B., Hibert M., Berthon J.Y.: Ethnopharmacology and bioinformatic combination for leads discovery: application to phospholipase A2 inhibitors. Phytochemistry, 2001,58, 865-874. 2.Choi C.Y., You H.J., Jeong H.G: Nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha production by oleanolic acid via nuclear factor-kappaB activation in macrophages. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001, 288, 49-55. 3.Fernandez M.A., Delas Heras B., Garcia M.D., Saenz M.T., Villar A.: New insights into the mechanism of action of anti-inflammatory triterpene lupeol. J. Pharm. Parmacol., 2001, 53, 1533-1539. 4.Giner-Larza E.M., Manez S., Recio M.C., Giner R.M., Prieto J.M., Cerda-Nicolas M., Rios J.L.: Oleanonic acid, a 3-oxotriterpene from Pistacia, inhibits leukotriene synthesis and has antiinflammatory activity. Eur. J. Pharmacol., 2001, 428, 137-143. 5.Rajic A., Akihisa T., Ukiya M., Yasakawa K., Sandeman R.M., Chandler D.S., Polya G.M.: Inhibition of trypsin and chymotrypsin by anti-inflammatory triterpenoids from Compositae flowers. Planta Med., 2001, 67, 599-604. 6.Suh N., Honda T., Finlay H.J., Barchowsky A., Williams C., Benoit N.E., Xie Q.W., Nathan C., Gribble G.W., Sporn M.B.: Novel triterpenoids suppress inducible nitric oxide synthase (iNOS) and inducible cyclooxygenase (COX-2) in mouse macrophages. Cancer Res., 1998, 58, 717-723. 7.Suh N., Wang Y., Honda T., Gribble G.W., Dmitrovsky E., Hickey W.F., Maue R.A., Place A.E., Porter D.M., Spinella M.J., Williams C.R., Wu G., Dannenberg A.J., Flanders K.C., Letterio J.J., Mangelsdorf D.J., Nathan C.F., Nguyen L., Porter W.W., Ren R.F., Roberts A.B., Roche N.S., Subbaramaiach K., Sporn M.B.: A novel synthetic oleanane triterpenoid, 2,-cyano-3,12dioxoolean-1,9-dien-28-oic acid, with potent differentiating, antiproliferative, and anti- inflammatory activity. Cancer Res., 1999, 59, 336-341. 8.Wang B.H., Polya G.M.: Selective inhibition of cyclic AMP-dependent protein kinase by amphiphilic triterpenoids and related compounds. Phytochemistry, 1996, 41, 55-63. 9.Ying Q.L., Rinerart A.R., Simon S.R., Cheronis J.C.: Inhibition of human leukocyte elastase by ursolic acid. Evidence for a binding site for pentacyclic triterpenoids. Biochem J., 1991, 277, 521526. 10. You H.J., Choi C.Y., Kim J.Y., Park S.J., Hahm K.S., Jeong H.G.: Ursolic acid enhances nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha production via nuclear factor kappaB activation in the resting macrophages. FEBS Lett., 2001, 509, 156-160.