Wyróżniona praca w formacie pdf

STRESZCZENIE
Celem doświadczenia było poszukiwanie szczepów bakterii morskich oraz rzecznych
wykazujących zdolność do fluorescencji. Do doświadczenia wykorzystałem próbki wody morskiej
oraz rzecznej pochodzące z ujścia Wisły do Morza Bałtyckiego. Z próbek wody wyizolowałem
izolaty bakteryjne należące do grupy organizmów psychrotrofowych [1]. Spośród uzyskanych
izolatów bakteryjnych wybrałem te, które w prostym teście płytkowym, na podłożu agarowym
z dodatkiem rodaminy B (czynnik selekcyjny) wykazywały zdolność do fluorescencji.
Po uzyskaniu czystych kultur bakteryjnych (uzyskanych po wykonaniu 3 posiewów
redukcyjnych) wybranych izolatów, poddałem je barwieniu Grama[4] w celu potwierdzenia
czystości mikrobiologicznej uzyskanych szczepów bakteryjnych.
W czasie przeprowadzonego doświadczenia uzyskałem 1022 izolaty bakteryjne pochodzące
z wody morskiej oraz 714 izolatów rzecznych. Do czystej postaci doprowadziłem 12 kolonii
rzecznych oraz 9 kolonii morskich.
Wśród 12 izolatów rzecznych wyizolowałem 1 kolonię wykazującą fluorescencję
w obecności rodaminy B oraz promieniowania elektromagnetycznego o długości fali świetlnej
równej 312 nm. Spośród 9 izolatów morskich wyizolowałem także 1 szczep wykazujący
fluorescencję w obecności rodaminy B.
WSTĘP
Celem projektu było zestawienie szczepów bakterii morskich oraz rzecznych pochodzących
z próbek wody z terenu ujścia Wisły do Morza Bałtyckiego. Wśród uzyskanych izolatów
poszukiwałem kolonii bakterii należących do grupy psychrotrofów oraz wykazujące zdolność
do fluorescencji w obecności rodaminy B w podłożu wzrostowym.
Zdolność do fluorescencji w obecności rodaminy B może być związana:
Z produkcją polinienasyconych kwasów tłuszczowych PUFA – wokół kolonii bakterii
obserwujemy niebieską fluorescencję.
Z produkcją enzymów z grupy lipaza/esteraza – żółta fluorescencja wokół kolonii bakterii
w obecności oliwy z oliwek.
Z produkcją enzymów z grupy fosforylaz MTA[2] – różowa fluorescencja kolonii bakterii.
Wykonałem to badanie, ponieważ zainteresowała mnie fluorescencja wśród organizmów
żywych. Podczas zajęć biologii moją uwagę zwróciła zdolność chlorofilu do fluorescencji.
Zafascynowany tym zagadnieniem, postanowiłem przeprowadzić doświadczenie w celu
identyfikacji organizmów wykazujących zdolność do fluorescencji w wodach ujścia Wisły
do Morza Bałtyckiego.
MATERIAŁY I METODY
Informacje teoretyczne
Psychrofile są mikroorganizmami zdolnymi do wzrostu oraz namnażania
w temperaturze 0 ºC. Dzielimy je na dwie grupy: psychrofile właściwe (obligatoryjne), zdolne
do wzrostu w temperaturze 0 ºC, o optymalnej temperaturze 15 ºC, maksymalnej równej 20 ºC.
Kolejną grupą są psychrotrofy (psychrotoleranty), które są organizmami bytującymi
w temperaturze 0 ºC, o optymalnym zakresie temperatur rzędu 20 – 25 ºC. Psychrotrofy dzielimy
natomiast na stenopsychrotrofy o maksymalnej temperaturze wzrostu poniżej 40ºC,
oraz europsychrotrofy zdolne do wzrostu w tej temperaturze[1].
Rodamina B (C28H31ClN2O3) jest związkiem chemicznym używanym w przemyśle jako
barwnik wełny, jedwabiu oraz papieru. W biologii stosowana jest jako barwnik fluorescencyjny
emitujący światło pod wpływem promieniowania elektromagnetycznego o długości fali od 250
do 610 nm[2].
Miejsce pobierania prób
Próbki wody (2x 1000 ml) zostały pobrane przeze mnie 7 lipca 2009 roku
w godzinach od 11.47 do 12.15 na terenie Parku Krajobrazowego „Mewia Łacha” w Świbnie
na Wyspie Sobieszewskiej.
Pierwsza próbka wody pochodzi z „jeziora” na łasze wyznaczającego koryto Wisły
wpływającej do Morza Bałtyckiego. Druga próbka wody jest woda morską pobraną w odległości
100 m od lewego brzegu ujścia Wisły do Morza Bałtyckiego (tab. 1, fot. 1).
Miejsce pobrania prób zostało przeze mnie wybrane świadomie, ponieważ do doświadczenia
potrzebowałem próbek wody morskiej oraz rzecznej. Wykorzystałem 2 próbki wody, ponieważ
celem mojego doświadczenia było określenie miejsca życia bakterii wykazujących zdolność
do fluorescencji.
Tab. 1. Współrzędne geograficzne miejsca pobierania próbek wody
Próba Długość geograficzna [E] Szerokość geograficzna [N]
Pierwsza
18º56’881’’
54º21’685’’
Druga
18º56’831’’
54º21’800’’
Fot. 1. Zdjęcie lotnicze Parku Krajobrazowego „Mewia Łacha” w Świbnie na Wyspie
Sobieszowskiej
Zdjęcie jest własnością serwisu http://www.zumi.pl
© 2009 Onet.pl, Mapy: © Imagis, Zdjęcia: lotnicze © MGGP Aero, satelitarne © Techmex
Właściwości fizyko-chemiczne wody
Właściwości fizyko-chemiczne wody zostały zbadane przeze mnie 7 lipca 2009 roku
w godzinach od 11.47 do 12.15 na terenie Parku Krajobrazowego „Mewia Łacha” w Świbnie
na Wyspie Sobieszewskiej.
Wyniki moich obserwacji zestawiłem z prognozą pogody[3] oraz prognozą
ekohydrodynamiczną[8] w celu dokładnej interpretacji uzyskanych przeze mnie właściwości
fizyko-chemicznych wody (temperatura, klarowność, osad, zawiesina, pH).
Prognoza pogody pozwoliła mi na określenie przybliżonej temperatury wody oraz eliminację
wpływów opadów deszczu na jakość pobranych przeze mnie próbek wody.
Prognoza ekohydrodynamiczna dostarczyła mi informacji na temat prognozowanych wartości
temperatury i zasolenie wody oraz wartości i kierunków prądów morskich dla Zatoki Gdańskiej
z uwzględnieniem Świbna.
Dzięki prognozie ekohydrodynamicznej porównałem uzyskaną przeze mnie wartość
temperatury wody z danymi zamieszczony w tym serwisie. Określiłem także zasolenie oraz wpływ
prądów morskich. Dane te były pomocne przy sporządzaniu podłoża bakteryjnego.
Wartość pH oraz temperaturę w obu przypadkach zmierzyłem dwukrotnie dla uzyskania
dwóch niezależnych wyników.
Aparatura
Sprzęt użyty do badań terenowych
2 termometry rtęciowe – III Liceum Ogólnokształcące w Gdańsku
Przenośny pH-metr Hanna Instruments WOONSOCKET, RI 02895 0,00 – 14,00 pH
± 0,2 pH – III Liceum Ogólnokształcące w Gdańsku
Przenośny odbiornik GPS firmy Garmin
Sprzęt laboratoryjny
Wykorzystałem sprzęt laboratoryjny należący do laboratorium Katedry Mikrobiologii
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej:
Pipety automatyczne HTL o pojemności od 2 µl do 2 ml
Biovortex V1 BIOSAN
Waga cyfrowa AXIS AD3000
Wirówka EPPENDORF 5415d 0-13000 RPM
Autoklaw laboratoryjny SYSTEC 2540EL
Wytrząsarka z chłodzeniem INFORS Unitron (temperatura hodowli 15 ºC – 70 ºC)
Transluminator UV SPECTROLINE MODE TVC-312A o długości promieniowania
elektromagnetycznego 312 nm
Zatężasz wody MILIPORT – „zestaw do zatężania próbek środowiskowych z wody
z wykorzystaniem filtrów nitrocelulozowych 0,22 µm
Przebieg doświadczenia
Próbki wody morskiej oraz rzecznej filtrowałem przy pomocy zestawu do filtracji wody
MILIPORT z użyciem filtrów nitrocelulozowych 0,22 µm. Filtr z zatrzymanymi w osadzie
bakteriami zawiesiłem w 15 ml soli fizjologicznej przy pomocy mechanicznego vortexu. Następnie
z uzyskanej zawiesiny przygotowałem rozcieńczenia seryjne: 10 -1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6.
Posiew powierzchniowy wyżej wymienionych rozcieńczeń wykonałem na podłożu LAS. Płytki
Petriego z przygotowanym posiewem powierzchniowym poddałem inkubacji w temperaturze 15 ºC
przez 72 godziny.
Po inkubacji płytek z posianymi rozcieńczeniami seryjnymi oglądałem szalki w celu oceny
ilości wyrosłych kolonii bakteryjnych. Po konsultacji z opiekunem zmieniłem pożywkę z powodu
słabego wzrostu kolonii bakteryjnych. Zastosowałem pożywkę LAS uboższą w azot , na której
wykonałem posiew powierzchniowych wyżej wymienionych rozcieńczeń seryjnych.
Tak przygotowane płytki poddałem inkubacji w temperaturze 25 ºC przez 72 godziny.
Po inkubacji płytek z posianymi rozcieńczeniami seryjnymi oglądałem szalki w celu oceny
ilości wyrosłych kolonii bakteryjnych. W czasie badanie oceniałem również morfologię: kształt,
wielkość, kolor, średnicę. Do dalszym badań wykorzystano płytki z posiewem redukcyjnych
z rozcieńczeń seryjnych: 10-1, 10-2 oraz 10-3.
Pojedyncze kolonie z płytek przesiałem na „kreskę”, na podłoże z dodatkiem
rodaminy B – LAS-Rod. Płytki po posianiu inkubowałem w temperaturze 25 ºC przez 18 godzin.
Po uzyskaniu wzrostu kolonii bakteryjnych oglądałem płytki na transluminatorze w świetle UV
(312 nm). Bakterie świecące na różowo bądź niebiesko posiałem posiewem redukcyjnym na nowe
płytki LAS-Rod. Otrzymane w ten sposób płytki inkubowałem w temperaturze 25 ºC przez
18 godzin. Posiew redukcyjny oraz inkubacje powtarzałem jeszcze dwa razy w celu
wyprowadzenia „czystej kultury”. Dla wybranych szczepów wykonałem dodatkowo barwienie
Grama w celu oceny cech fenotypowych komórek (bakterie gramdodatnie, bakterie gramujemne,
kształt, wielkość) oraz zapoznania się z tą podstawą metodą mikrobiologiczną. Ostatnim etapem
mojej pracy była analiza uzyskanych kolonii bakteryjnych z 3. posiewu redukcyjnego pod kątem
zdolności do fluorescencji z wykorzystaniem transluminatora oraz światła UV (312 nm)
oraz oznaczenie kolonii bakteryjnych wykazujących fluorescencję.
WYNIKI
Liczba koloni bakteryjnych
Wyk. 1. Ilość kolonii bakteryjnych po inkubacji w temperaturze 25 ºC przez 72 godziny
Ilość kolonii bakteryjnych
1400
1236
1204
Ilość kolonii
1200
1021
1000
800
738
624
690
714
714
600
Rzeczne
Morskie
400
200
0
Płytka 1. 10-1 Płytka 2. 10-2 Płytka 3. 10-3
Wartość
uśredniona
Posiew powierzchniowy
Czyste kultury bakterii wykazujące fluorescencję
Podczas przeprowadzania doświadczenia udało mi się wyizolować dwie czyste kultury
bakteryjne wykazujące fluorescencję w obecności rodaminy B oraz promieniowania
elektromagnetycznego o długości fali świetlnej równej 312 nm (tab. 3). Czyste kultury bakteryjne
udało mi się uzyskać dzięki przeprowadzeniu trzech posiewów redukcyjnych.
Interpretacja fluorescencji czystych szczepów bakteryjnych
Niebieska fluorescencja, którą zaobserwowałem wokół kolonii bakterii pochodzącej z rzeki
(tab. 3) związana jest z produkcją polinienasyconych kwasów tłuszczowych PUFA. Różowa
fluorescencja, którą zaobserwowałem wokół kolonii bakteryjnych pochodzących z próbek wody
morskiej (tab.3) związana jest z produkcją enzymów z grupy fosforylaz MTA[2]. W pierwszym
przypadku zdolność do fluorescencji związana jest z przemianami metabolicznymi w komórce
bakteryjnej, w drugim przypadku natomiast ma ona związek z procesami enzymatycznymi
zachodzącymi we wnętrzu komórki bakteryjnej.
Tab. 3. Liczba czystych szczepów bakteryjnych wykazujących fluorescencję
Cecha
Kolonie rzeczne Kolonie morskie
Fluorescencja
1
1
Kolor fluorescencji
Niebieski
Różowy
Barwienie Grama
Barwienie Grama wykonałem dla określenia typów bakterii wykazujących fluorescencję.
Umożliwiło mi ono porównanie morfologiczne bakterii ze względu na budowę ściany komórkowej
(gram +/gram-).
Tab. 4. Barwienie Grama
Barwienie Grama Typ bakterii Ilość przygotowanych preparatów
Gramdodatnie
Laseczka
Coccus
6
Gramujemne
Pałeczka
DYSKUSJA
Celem mojego doświadczenie było określenie, czy w pobliżu ujścia Wisły do Morza
Bałtyckiego znajdują się bakterie wykazujące zdolność do fluorescencji.
Wynikiem mojej pracy w laboratorium Katedry Mikrobiologii Wydziału Chemicznego
Politechniki Gdańskiej było wyizolowanie, spośród 1021 szczepów kolonii bakteryjnych
pochodzących z próbek wody rzecznej oraz 714 szczepów kolonii bakteryjnych pochodzących
z próbek wody morskiej, 2 czystych kolonii bakteryjnych wykazujących fluorescencję w obecności
rodaminy B oraz promieniowania elektromagnetycznego o długości fali świetlnej równej 312 nm.
Oba szczepy należały do psychrotrofów, ze względu na temperaturę wody, w której bytują
oraz akceptację warunków hodowli (inkubacja w temperaturze 25 °C).
Informacje zebrane przeze mnie podczas badań terenowych (temperatura wody
oraz zasolenie) pozwoliły mi na określenie do której grupy psychrofilii należą mikroorganizmy
żyjące w pobranych próbkach wody morskiej oraz rzecznej. W wyniku porównania temperatury
wody wraz z optymalnymi wartościami temperatury bytowania poszczególnych mikroorganizmów
doszedłem do wniosku, że bakterie żyjące w pobranych przeze mnie próbkach wody należą
psychrotrofów.
Spośród wyizolowanych czystych kultur bakteryjnych kolonia pochodząca z próbek wody
morskiej wykazywała różową fluorescencję, która związania była z produkcją enzymów z grupy
fosforylaz MTA. Czysta kultura bakteryjna wyizolowana z próbek wody rzecznej
charakteryzowała się niebieską fluorescencją. Kolor ten pozwala mi stwierdzić, że bakterie te
produkcją polinienasycone kwasy tłuszczowe PUFA.
Informacja o obecności w wodzie morskiej kolonii bakteryjnych produkujących enzymy
z grupy fosforylaz MTA może być bardzo cenna dla biotechnologów zajmujących się
psychrotrofami. Enzymy z grupy fosforylaz MTA są nową grupą genów reporterowych
(genów kodujących białko, którego obecność lub aktywność biochemiczną można w łatwy sposób
oznaczyć w komórce; łączą się one w fuzje z sekwencjami, które chcemy scharakteryzować
przy zastosowaniu technik inżynierii genetycznej)[5], mających zastosowanie w inżynierii
genetycznej organizmów psychrotrofów, m.in.: w ekspresji genów[1].
Obecność mikroorganizmów produkujących polinienasycone kwasy PUFA, do których należą
m.in.: kwasy OMEGA 3, pozwala wysunąć mi wniosek, że w pobliżu ujścia Wisły do Morza
Bałtyckiego występują siedliska ryb, których głównym źródłem pokarmu jest zooplankton,
czyli mikroorganizmy, wśród których znajdziemy bakterie produkujące polinienasycone kwasy
PUFA.
Informacja ta jest szczególnie ważna dla koncernów farmaceutycznych zajmujących się
pozyskiwaniem kwasów OMEGA 3 z organizmów ryb. Kwasy te wchodzą w skład zróżnicowanej
diety człowieka. Poza tym informacja ta jest bardzo ważna dla osób zajmujących się badaniami
nad polinienasyconymi kwasami PUFA, ponieważ stwarza alternatywne źródło pozyskiwania tych
kwasów poprzez hodowle bakteryjne. Metoda ta może być wykorzystywana w celu ochrony
zagrożonych gatunków ryb. Idealnym przykładem są rekiny, które stanowią największą grupę
na Czerwonej Liście Gatunków Zagrożonych (World Conservation Union’s Red List of Threatened
Species)[7]. Rekiny oraz wieloryby są obecnie głównym źródłem pozyskiwania kwasów OMEGA
3. W tym celu prowadzone są systematyczne połowy tych gatunków. Kolejnym powodem
połowów rekinów jest popyt na ich płetwy, ponieważ sporządzana z nich zupa uchodzi
za przysmak na azjatyckim wybrzeżu Pacyfiku. Działania te prowadzą do stopniowego wymierania
gatunku, dlatego ważne jest opracowania alternatywnego źródła pozyskiwania tak cennych
dla naszego organizmu polinienasyconych kwasów tłuszczowych PUFA.
Alternatywne źródła pozyskiwania polinienasyconych kwasów tłuszczowych PUFA,
do których zaliczamy kwasy OMEGA 3, są bardzo ważne z ekologicznego oraz ekonomicznego
punktu widzenia. W pierwszym przypadku pozwalają na zmniejszenie połowów zagrożonych
gatunków, z których pozyskujemy kwasy OMEGA 3 oraz stopniowy wzrost liczebności
zagrożonego gatunku. Informacja o obecności bakterii produkujących polinienasycone kwasy
PUFA może być również bardzo cenna dla naukowców, którzy przy pomocy technik inżynierii
genetycznej mogliby rozpocząć produkcję kwasów OMEGA 3 na większą skalę,
tak jak w przypadku bakterii produkujących insulinę, czynniki krzepliwości krwi i hormon
wzrostu. W ten sposób oprócz ochrony zagrożonych gatunków zmniejszą koszty pozyskiwania
kwasów OMEGA 3.
PIŚMIENNICTWO
[1] Cieśliński H.: “Cold-adapted Pseudoalteromonas sp. 22b -galactosidase – gene identification,
cloning, expression in E. coli, purification and characterization of a recombinant enzyme.”
tłum. „Adaptowana do zimna beta-galaktozydaza Pseudoalteromonas sp. 22b - identyfikacja genu,
klonowanie, ekspresja w E. coli, oczyszczanie i charakterystka recombinantowego enzymu."
[2] Cieśliński H., Długołęcka A., Kur J. and Turkiewicz M., 2009: “An MTA – phosphorylase gene
discovered in the metagenomic library derived from Antarctic top-soil during screening
for lipolytic active clones confers strong pink fluorescence in the presence of rhodamine B.”
tłum. „Odkrycie genu MTA-fosforylazy odpowiedzialnego za silną różową fluorecencje kolonii
E. coli w obecności rodaminy B podczas badań przesiewowych biblioteki metagenomowego DNA
pochodzącego z antarktyczynej gleby prowadzonych w poszukiwaniu klonów o aktywności
lipolitycznej.” FEMS Letters „In print”
[3] http://www.augustyna.pl/prognozy/sobieszewo.php
[4] http://www.uwm.edu.pl/wnz/v3/fck_files/file/mikrobiologia/MZ-TZrokII-cw2.pdf
[5] http://zguw.ibb.waw.pl/resources/Blok3_skrypt.pdf
[7] http://www.iucnredlist.org/
[8] http://model.ocean.univ.gda.pl/