7PŒYW METIONINY NA TOKSYCZNOu¿ FLUORU W OSOCZU
Transkrypt
7PŒYW METIONINY NA TOKSYCZNOu¿ FLUORU W OSOCZU
&ARM0RZEGL.AUK 7PYWMETIONINYNATOKSYCZNOu¿FLUORU WOSOCZUKRWISZCZURÌW 4HEEFFECTOFMETHIONINEONTOXICITYOFFLUORIDEINBLOODPLASMAOFRATS )WONA"ASZCZYK%WA"IRKNER%WA2OMUK :AKAD"IOCHEMII/GÌLNEJ+ATEDRY"IOCHEMIIW:ABRZUgLSKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH Streszczenie Zbadano wpływ metioniny na system antyoksydacyjny osocza podczas intoksykacji fluorkiem sodu. Badania przeprowadzono na 18 dorosłych szczurach, samicach szczepu Wistar FL, którym podawano wodę destylowaną, NaF lub NaF wraz z metioniną (NaF: 10 mg/kg m.c./dobę, metionina: 10 mg/kg m.c./dobę) przez okres 35 dni. Oznaczono aktywność całkowitą SOD oraz jej izomerów: CuZnSOD i MnSOD, stężenie jonów fluorkowych, a także całkowitą zdolność antyoksydacyjną (FRAP) w osoczu krwi. Stwierdzono niekorzystny wpływ podawanego NaF na układ antyoksydacyjny szczurów (zmniejszenie aktywności SOD, CuZnSOD, MnSOD oraz FRAP). Suplementacja metioniną spowodowała wzrost aktywności CuZnSOD, całkowitej zdolności antyoksydacyjnej osocza i zmniejszenie stężenia jonów fluorkowych. Zatem metionina wykazuje korzystne działanie w czasie zatrucia fluorkiem sodu. Słowa kluczowe: fluor, metionina, dysmutaza ponadtlenkowa, całkowita zdolność antyoksydacyjna, osocze, szczury. Wstęp Skażenie wody pitnej i żywności związkami fluoru oraz powszechne stosowanie ich w stomatologii to główne przyczyny nadmiernego narażenia na fluor. Jony fluorkowe przenikając przez błony komórkowe indukują wiele stanów patologicznych, w tym tworzenie nieprawidłowej struktury kości i zębów [1,2], zaburzenia funkcji nerek [3] i wątroby [4]. W mechanizmie toksycznego działania fluoru istotną rolę odgrywa jego zdolność do wywoływania stresu oksydacyjnego poprzez indukowanie wzmożonych procesów wolnorodnikowych [5]. Wolne rodniki powodują utlenianie lipidów, DNA, białek a nawet wolnych aminokwasów. Jednak utlenianie metioniny (Met) jest reakcją odwracalną. Uważa się nawet, że cykliczne procesy utleniania metioniny do sulfotlenku metioniny (MetO) i redukcji MetO mogą stanowić ważny mechanizm antyoksydacyjny. Przypuszczalnie reszty metioninowe białek pełnią funkcję odtwarzalnych zmiataczy reaktywnych form tlenu i azotu [6]. Celem przeprowadzonych badań było określenie jaki wpływ może mieć podawanie metioniny w czasie intoksy- Abstract The aim of the study has been to determine the influence upon the plasma antioxidative system, exercised by administration of methionine (Met), under exposure to sodium fluoride. The experiment was carried out on Wistar FL rats (adult females) that, for 35 days, were administered distilled water, NaF or NaF with methionine (doses: 10 mg NaF/kg bw/day, 10 mg Met/kg bw/day). The influence of administered NaF and Met was examined by analyzing the activity of superoxide dismutase (SOD- total and both its isoenzymes: CuZnSOD and MnSOD), fluoride concentration and total ability antioxidant (FRAP) in blood plasma. The studies carried out confirmed the disadvantageous effect of NaF upon the antixodative system in rats (decrease activity of SOD, CuZnSOD, MnSOD, FRAP). The administration of methionine increased the activity of CuZnSOD, total ability antioxidant and decreased the concentration of fluoride in blood plasma. Therefore methionine has an ameliorative effect on NaF-exposed rats. Key words: fluoride, methionine, superoxide dismutase, total ability antioxidant, plasma, rats. kacji fluorkiem sodu na całkowitą zdolność antyoksydacyjną osocza, aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) oraz stężenie jonów fluorkowych w osoczu krwi szczurów. Materiał i metody Badania przeprowadzono na 18 dorosłych, 3-miesięcznych szczurach, samicach szczepu Wistar FL, o masie 200g. Zwierzęta pochodziły z Centrum Medycyny Doświadczalnej SUM w Katowicach. Na przeprowadzenie eksperymentu uzyskano zgodę Komisji Etycznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego (zgoda nr 29/2006). W trakcie doświadczenia zapewniono zwierzętom 12-godzinny cykl dzienno-nocny oraz swobodny dostęp do wody i standardowej paszy (Labofeed B). Po dwutygodniowym okresie adaptacyjnym szczury umieszczono pojedynczo w klatkach i podzielono na 3 grupy liczące po 6 osobników. 1. Grupa kontrolna (Kontrola) - szczury, które do picia otrzymywały wyłącznie wodę destylowaną. 2. Grupa fluorkowa (NaF) - zwierzęta otrzymujące NaF (Sodium fluoride, POCH Gliwice) w dawce 10 mg/kg COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. m.c./dobę [7], w postaci roztworu (w ilości 10 ml), a po jego wypiciu miały swobodny dostęp do wody destylowanej. 3. Grupa fluorkowo-metioninowa (NaF+Met) - szczury, które otrzymywały NaF w dawce 10 mg/kg m.c./dobę [7] oraz metioninę (L-Methionine, Sigma) w dawce 10 mg/kg m.c./dobę [7]. Eksperyment prowadzono przez okres 5 tygodni. Po tym czasie zwierzęta usypiano, stosując iniekcję dootrzewnową 1% roztworem heksobarbitalu, w dawce 0,5 ml /100g m.c. Do dalszych badań pobrano krew na heparynę, a w osoczu krwi oznaczono: - stężenie jonów fluorkowych (F - ) przy użyciu jonoselektywnej elektrody fluorkowej Orion 96-09 (USA), - całkowitą aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) [EC 1.15.1.1] oraz jej izoenzymów CuZnSOD i MnSOD metodą Oyanagui [8], - całkowitą zdolność antyoksydacyjną osocza (FRAP) wg metody Benzie i Strain [9]. Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej, wykorzystując test ANOVA Kruskala-Wallisa oraz U MannaWhitney’a. Za znamienne statystycznie przyjęto zmiany przy poziomie istotności p a 0,05. Wyniki Uzyskane wyniki przedstawia tabela I. Stwierdzono zwiększone stężenie jonów fluorkowych w osoczu krwi szczurów grupy NaF i zmiana ta była statystycznie znamienna w porównaniu z kontrolą. U zwierząt, które dodatkowo otrzymywały metioninę stężenie F- było mniejsze zarówno w stosunku do kontroli jak i grupy NaF (znamienność statystyczna). Wykazano niekorzystny wpływ fluorków na aktywność dysmutazy ponadtlenkowej. W grupie NaF wystąpiło zmniejszenie całkowitej aktywności SOD (zmiana statystycznie znamienna) oraz jej obu izoenzymów CuZnSOD i MnSOD w porównaniu z grupą kontrolną. Podawana metionina częściowo ograniczała szkodliwe działanie fluoru, zwiększając aktywność CuZnSOD, ale zmniejszając aktywność SOD i MnSOD (znamienność statystyczna) w stosunku do kontroli. Zdolność antyoksydacyjna osocza zmniejszyła się w osoczu krwi szczurów po ekspozycji na NaF (zmiana statystycznie znamienna w porównaniu z grupa kontrolną), natomiast w grupie NaF+Met uległa zwiększeniu. Dyskusja W Polsce spożycie fluorków wraz z niektórymi produktami spożywczymi może przekraczać zalecaną bezpieczną dawkę, a podstawowym źródłem fluoru w diecie jest woda i napoje z ekstraktem herbaty [10]. Po doustnym przyjęciu F- jest wchłaniany z przewodu pokarmowego, a jego transport z krwią do tkanek i narządów może prowadzić do wielu zmian strukturalnych i funkcjonalnych [1-4]. Toksyczne działanie fluoru wynika m.in. z właściwości generowania wolnych rodników i hamującego wpływu na aktywność enzymatycznego układu antyoksydacyjnego [5,7]. Badania naukowe dowodzą, że związki fluoru mogą indukować powstawanie anionorodnika ponadtlenkowego oraz rodnika hydroksylowego [11]. Narażenie na fluorki skutkuje zwiększeniem ich stężenia w surowicy [2]. Potwierdzają to wyniki prezentowanego eksperymentu. Przyjmowany fluorek sodu wywołał zwiększenie stężenia F- w osoczu krwi szczurów. Podawanie metioniny skutecznie temu wzrostowi przeciwdziałało choć mechanizm tego zjawiska pozostaje nieznany. Poza tkankami miękkimi fluorki są w znacznej części wiązane przez tkankę kostną i zęby [2]. Niestety brak doniesień na temat tego, czy metionina wpływa na tę kumulację, w ten sposób zmieniając stężenie F- w osoczu. Nadmierna podaż jonów fluorkowych jest czynnikiem rozwoju stresu oksydacyjnego. W tym czasie wzmożone lub niekontrolowane powstawanie wolnych rodników prowadzi do nasilonej peroksydacji lipidów [5,7]. Ograniczone przenikanie F- do osocza może wynikać z ochronnej roli podawanej metioniny wobec błon komórkowych. Wiadomo, że metionina uczestniczy w syntezie choliny, składnika lecytyny i sfingomieliny, które budują komórkowe membrany [12]. Poza tym metionina dzięki cyklicznym przemianom utleniania i redukcji może również uczestniczyć w zmiataniu wolnych rodników. Jej utlenianie, jako wolnego aminokwasu lub jako białkowych reszt metioninowych prowadzi do powstania mieszaniny izomerów R i S-sulfotlenku metioniny (MetO). W obecności reduktazy sulfotlenku metioniny (Msr), tioredoksyny, reduktazy tioredoksyny i NADPH następuje redukcja MetO ponownie do metioniny. Met + H2O2 l MetO + H2O MetO + NADPH + H+ l Met + NADP+ + H2O zięki tym procesom metionina może unieszkodliwiać rodnik hydroksylowy, nadtlenek wodoru i tlen singletowy, ograniczając procesy peroksydacji lipidów [6]. Potwierdzają to badania stężenia dialdehydu malonowego, jednego ze Tab. I. Stężenie jonów fluorkowych, aktywność dysmutazy ponadtlenkowej oraz całkowita zdolność antyoksydacyjna osocza krwi szczurów. Grupa Kontrola NaF NaF+Met Stężenie F[μmol/l] 5,59 ±0,57 7,89 ± 0,49a 4,21 ± 0,74a,b Aktywność SOD [NU/ml] 33,60 ± 0,84 31,90 ± 0,75a 31,10 ± 0,60a Aktywność MnSOD [NU/ml] 7,98 ± 1,78 6,50 ± 1,33 4,97 ± 1,83a a – wyniki statystycznie znamienne (p a 0,05) w porównaniu z grupą kontrolną b – wyniki statystycznie znamienne (p a 0,05) w porównaniu z grupą NaF Aktywność CuZnSOD [NU/ml] 25,60 ± 1,47 25,40 ± 1,40 26,20 ± 1,94 FRAP [μmol/l] 226,50 ± 23,87 157,3 ± 26,4a 175,0 ± 43,10 &ARM0RZEGL.AUK wskaźników utleniania lipidów w wątrobie, nerkach, erytrocytach i osoczu krwi [7]. Zatem metionina ochraniając błony plazmatyczne przed destrukcyjnym działaniem wolnych rodników oraz uczestnicząc w regeneracji tych struktur być może zapobiega przenikaniu fluorków do osocza. Fluor wpływa również na aktywność enzymów antyoksydacyjnych [5]. Jednym z nich jest dysmutaza ponadtlenkowa, która katalizuje reakcję dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego, w efekcie której powstaje nadtlenek wodoru i tlen. 2O2u- + 2H+ l H2O2 + O2 Na całkowitą aktywność dysmutazy ponadtlenkowej składa się aktywność jej izoenzymów MnSOD i CuZnSOD. Aktywność MnSOD jest uwarunkowana dostępnością manganu. CuZnSOD jest natomiast enzymem miedzio- i cynko-zależnym, a rola obu pierwiastków wchodzących w jego skład jest różna. Cynk utrzymuje strukturę trzeciorzędową, miedź jest odpowiedzialna za aktywność katalityczną enzymu, będąc jego aktywatorem [13]. Fluor powoduje zmiany aktywności SOD. Zmiany te wynikają m.in. z hamowania biosyntezy enzymu o czym może świadczyć zmniejszenie stężenia mRNA CuZnSOD w wątrobie [14]. Nadmierna lub długotrwała ekspozycja na fluorek sodu przyczynia się do zmniejszenia aktywności CuZnSOD i MnSOD w trzustce [15] oraz nerkach szczurów [5]. Fluorki przyłączają się do centrum katalitycznego CuZnSOD, będąc jego kompetycyjnym inhibitorem. Poza tym fluor wiąże jony magnezu, cynku i manganu [16]. To może tłumaczyć obniżoną aktywność SOD u zwierząt poddanych intoksykacji fluorkiem sodu. W opisywanym doświadczeniu szkodliwe działanie fluorków częściowo znosiła podawana metionina. Wystąpiło bowiem zwiększenie aktywności CuZnSOD, ale zmniejszenie całkowitej aktywności SOD i MnSOD. Metionina jest chelatorem metali ciężkich m.in. Cd, Hg, Pb. Niektórzy autorzy sugerują nawet, że podstawowa ochronna rola reszt metioninowych albumin to wiązanie jonów tych metali, nie zaś bezpośrednie zmiatanie wolnych rodników [17]. Metionina może wpływać na stężenie miedzi [18] i być może uczestniczy również w metabolizmie Zn i Mn, wpływając ostatecznie na aktywność dysmutazy ponadtlenkowej. Wyniki eksperymentu wskazują na niekorzystny wpływ fluorku sodu na całkowitą zdolność antyoksydacyjną osocza. Działanie to wyraźnie znosiła podawana metionina, zapewne dlatego, że oprócz bezpośredniego zmiatania wolnych rodników, uczestniczy w syntezie i działaniu innych antyoksydantów. Jednym z najważniejszych antyoksydantów płynów ustrojowych jest bowiem glutation, który reaguje m.in. z rodnikiem OHu, a powstałe rodniki GSu są neutralizowane w reakcji dysmutacji [19]. Komórkowa homeostaza zredukowanego glutationu jest utrzymywana przez syntezę z metioniny i cysteiny oraz regenerację jego utlenionej formy i absorpcję zewnątrzkomórkowego glutationu. Ponad połowa Met jest zużywana do syntezy glutationu w wątrobie, który jest przekazywany potem do osocza [20]. Peterson i wsp. [21] wykazali, że nawet w przypadku diety ubogiej w Se i witaminę E, która skutkuje m.in. zmniejszeniem zawartości glutationu, suplementacja wyłącznie Met przywraca jego prawidłowe stężenie. Podaż glutationu warunkuje również prawidłową aktywność peroksydazy glutationowej, enzymu antyoksydacyjnego osocza, który katalizuje reakcję rozkładania H2O2 i nadtlenków lipidowych [19]. Podobnie jest w przypadku antyoksydacyjnych właściwości witaminy C, obecnej w osoczu w postaci anionu askorbinianowego, który w czasie zmiatania rodników tlenowych przekształca się w dehydroaskorbinian. Aby zaszła reakcja redukcji dehydroaskorbinianu ponownie do askorbinianu niezbędny jest glutation, a jak wykazano fluorki zmniejszają stężenie glutationu we krwi i wątrobie [22]. Metionina poza uczestnictwem w syntezie glutationu, odgrywa również ważną rolę w wiązaniu, transporcie i bioaktywności selenu w organizmie, zwiększając jego przyswajanie [21]. Selen wchodzi w skład peroksydazy glutationowej [19] oraz reduktazy sulfotlenku metioniny i reduktazy tioredoksyny [6]. Tak więc synteza i funkcja tych enzymów wymaga obecności selenu, podczas gdy zwiększona podaż fluorków powoduje nasilone wydalanie selenu z moczem i niedobory tego pierwiastka w organizmie [23]. Na podstawie wyników przeprowadzonego eksperymentu można stwierdzić, że podawanie metioniny w przypadku zatrucia fluorkiem sodu może być bardzo korzystne z uwagi na fakt wzmocnienia całkowitej zdolności antyoksydacyjnej osocza i redukcji stężenia jonów fluorkowych w osoczu krwi. Wnioski 1. 2. 3. Nadmierna ekspozycja na NaF skutkuje zwiększeniem stężenia jonów fluorkowych w osoczu, czemu skutecznie przeciwdziała podawanie metioniny. Fluor hamuje aktywność dysmutazy ponadtlenkowej, natomiast metionina nieznacznie zwiększa aktywność izoenzymu CuZnSOD. Metionina zwiększa całkowitą zdolność antyoksydacyjną osocza w czasie zatrucia fluorem. Piśmiennictwo 1. 2. 3. 4. 5. Wang J i wsp. Amino acid composition and histopathology of goat teeth in an industrial fluoride polluted area. Fluoride 2003; 36: 177-184. Grucka-Mamczar E i wsp. Wpływ kofeiny i fluorku sodu na stężenie fluorków w surowicy krwi i ich zawartość w zębach i kościach szczurów. Ann Acad Med Stetin 2006; 52: 37-40. Rao MV, Chawla SL, Patel N. Melatonin reduction of fluoride-induced nephrotixicity in mice. Fluoride 2009; 42: 110-116. He LF, Chen JG. DNA damage, apoptosis and cell cycle changes induced by fluoride in rat oral mucosal cells and hapatocytes. World J Gastroenterol 2006; 12: 1144-1148. Błaszczyk I i wsp. Influence of fluoride on rat kidney antioxidant system: efects of methionine and vitamin E. Biol Trace Elem Res 2008; 121: 51-59. COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Moskovitz J. Roles of methionine sulfoxide reductases in antioxidant defense, protein regulation and survival. Curr Pharm Des 2005; 11: 1451-1457. Błaszczyk I i wsp. Influence of methionine upon the concentration of malondialdehyde in the tissues and blood of rats exposed to sodium fluoride. Biol Trace Elem Res 2009; 129: 229-238. Oyanagui Y. Revaluation of assay methods and establishment of kid for superoxide dismutase activity. Anal Biochem 1984; 142: 290-296. Benzie IFF, Strain JJ. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: The FRAP assay. Anal Biochem 1996; 239: 70-76. Dębiński A i wsp. Zawartość fluoru w diecie populacji polskiej – próba oszacowania. Żyw Człow Metab 2006; 4: 300-308. Przybylska D, Długosz A. Wpływ fluorku sodu na procesy wolnorodnikowe. Bromat Chem Toksykol 2007; 1: 9-14. Brosnan JT, Brosnan ME. The sulfur-containing amino acids: an overview. J Nutr 2006; 136: 1636-1640. Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dismutases. Ann Rev Biochem 1995; 64: 97-112. Zhan XA i wsp. Effects of fluoride on hepatic antioxidant system and transcription of Cu/Zn SOD gene in young pings. J Trace Elem Med Biol 2006; 20: 83-87. Chlubek D i wsp. Activity of pancreatic antioxidantive enzymes and malondialdehyde concentations in rats with hyperglycemia caused by fluoride intoxication. J Trace Elem Med Biol 2003; 17: 57-60. 16. Machoy Z. Biochemiczne mechanizmy działania związków fluoru. Folia Med Cracov1987; 1-2: 61-78. 17. Bourdon E i wsp. Differential effects of cysteine and methionine residues in the antioxidant activity of human serum albumin. Free Radic Res 2005; 39: 15-20. 18. Patra RC, Swarup D. Effect of antioxidant ascorbic acid, l-methionine or A tocopherol alone or along with chelator on cardiac tissue of lead-treated rats. Veterinarski Archiv 2004; 74: 235-244. 19. Shoveller AK i wsp. Nutritional and functional importance of intestinal sulfur amino acid metabolism. J Nutr 2005; 135: 1609-1612. 20. Garcia RAG, Stipanuk MH. The splanchnic organs, liver and kidney have unique roles in the metabolism of sulfur amino acids and their metabolites in rats. J Nutr 1992; 122: 1693-1701. 21. Brigelius-Flohe R. Tissue-specific functions of individual glutathione peroxidases. Free Radic Biol Med 1999; 27: 951-965. 22. Kaushik T i wsp. Glutathione metabolism in rats to high-fluoride water and effect of spirulina treatment. Fluoride 2001; 34: 132-138. 23. Wąsowicz W, Gołębiowska M, Chlebna-Sokół D. Increased urinaty excretion of selenium in children- a response to surplus fluoride in drinking water. Trace Elem Med 1988; 5: 43-46. Adres do korenspondencji: dr n.med. Iwona Błaszczyk Zakład Biochemii Ogólnej Katedry Biochemii Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach ul. Jordana 19, 41-808, Zabrze tel./fax +48 32 272 23 18 e-mail: [email protected]