Spektrofotometryczna analiza jakościowa i ilościowa DNA i RNA za

Spektrofotometryczna analiza jakościowa i ilościowa DNA i RNA za

Spektrofotometryczna analiza
jakościowa i ilościowa DNA i RNA
za pomocą urządzenia NanoDrop
— protokół
Wiele laboratoriów ma problem z izolacją RNA. Ten wstępny etap może
zaważyć na powodzeniu lub klęsce całej serii badań, ponieważ RNA
zanieczyszczone odczynnikami używanymi podczas ekstrakcji będzie
nieefektywnie odwrotnie-transkrybowane. Dlatego niezwykle ważna jest
kontrola wyizolowanego RNA przed jakąkolwiek obróbką enzymatyczną.
Idealnym narzędziem do takiej kontroli jakości jest NanoDrop.
Cel: określenie czystości DNA lub RNA po izolacji.
Wprowadzenie: po skończonej izolacji kwasów nukleinowych musimy wiedzieć
jakie jest stężenie i czystość materiału przed wykonaniem jakichkolwiek badań.
Podczas ekstrakcji kwasów nukleinowych używa się rozpuszczalników
organicznych (fenol, chloroform, alkohole) oraz soli (np. chlorek lub izotiocyjanian
guanidyny), które mogą inhibować reakcje enzymatyczne takie jak PCR, RT-PCR,
znakowanie rybonukleotydów i inne. RNA zanieczyszczone solami także szybciej
degraduje (nawet przechowywany w -80 °C!). Dlatego tak ważna jest poprawna
analiza jakościowa i ilościowa każdej próbki. Wygodną formą takiej analizy jest
pomiar absorbancji przy długości fali 230, 260 i 280nm. Obecnie większość
laboratoriów dysponuje systemami typu NanoDrop (Thermo Scientific), które
mierzą te parametry w kropli <1,5ul i automatycznie przeliczają absorbancję na
stężenie i czystość białkową oraz organiczną. Wyznaczają także wykres
absorbancji, bardzo pomocny przy ustalaniu źródła zanieczyszczeń kwasów
nukleinowych.
Wykonanie pomiaru:
*
Próbkę DNA/ RNA przed pomiarem rozmrozić i trzymać na lodzie.
Bezpośrednio przed pomiarem zvortexować lub przepipetować góra-dół aby ją
dobrze wymieszać.
*
W menu urządzenia wybrać odpowiednia opcję (w przypadku NanoDrop’a
1000 jest to “Nucleic Acids”->ds DNA/ ssDNA/ RNA. Opcje różnią się wartością
jednostkowej absorbancji przyjmowaną w przeliczeniu na stężenie, należy o tym
pamiętać!)
*
Przygotować czystą wodę (do inicjalizacji) oraz bufor, w którym
rozpuszczany był kwas nukleinowy (próba “ślepa” używana jako kalibrator).
Inicjalizację i kalibrację wykonać nakrapiając każdorazowo 1,2-1,5µl płynu.Za
każdym razem zetrzeć szmatką okienko spektrofotometru.
*
Nałożyć 1,2-1,5µl próbki na okienko, uważając na ewentualne bąbelki
powietrza, które mogą zafałszować pomiar. Po wykonaniu pomiaru okienko
przemyć wodą i przetrzeć szmatką.
*
Jeżeli musimy zbierać próbkę z powrotem z okienka, dbajmy o jakość wody i
dokładnie przemywajmy okienko pomiędzy pomiarami kolejnych próbek!
Ryc. 1: Czyste RNA w zakresie stężeń od 1000 ng/µl (granatowa krzywa) do 3800
ng/µl (ceglasta). Widzimy, że stężenia powyżej 3000 ng/µl (żółta i ceglasta krzywa)
są zbyt wysokie, by można było poprawnie oszacować A260. Charakterystyczne
jest to, że w przypadku każdej z krzywych absorbancja A230 jest około 2x
mniejsza niż A260 jest to wyznacznik dobrej jakości RNA
Analiza i interpretacja wyniku:
*
Analiza ilościowa: Ilość kwasu nukleinowego jest określana jako stężenie w
1 µl. Zakres stężeń, w którym oznaczenie jest wiarygodne to ok. 10-3000 ng/µl .
Powyżej tej wartości DNA lub RNA jest zbyt stężone, by prawidłowo określić jego
ilość i wyznaczyć krzywą absorbancji (ryc. 1). Poniżej wartości 10ul znacząca
absorbancja tła powoduje przeszacowanie wyniku. Próbkę o zbyt wysokiej
wartości absorbancji rozcieńczamy tym samym buforem, którego używaliśmy
podczas izolacji i którym kalibrowaliśmy urządzenie. Przy zbyt niskiej ilości kwasu
nukleinowego próbkę zagęszczamy lub przyjmujemy że ma ona stężenie niższe niż
wyliczone przez urządzenie.
*
Analiza jakościowa: maksimum absorbancji białek, częstego
zanieczyszczenia DNA przy izolacji manualnej, wynosi 280 nm, zaś
zanieczyszczenia organiczne posiadają najwyższą absorbancję poniżej 240 nm.
Przyjęto więc arbitralnie 230nm jako długość fali dobrze określającą stopień
zanieczyszczeń rozpuszczalnikami.organicznymi.
*
Miarą stopnia czystości kwasów nukleinowych jest stosunek A260/230
oraz A260/280. Przyjmuje się, że czyste DNA lub RNA ma A260/280>1,8 i
A260/230>1,8. Idealnie czyste RNA rozpuszczone w wodzie DEPC może mieć
A260/230 nawet ok. 2,20.Na dokładną wartość tego parametru nieznacznie
wpływa użyty bufor, ale generalnie parametry dobrze wyizolowanego DNA lub
RNA oscylują wokół 1,8 – 2,05.Najprościej rzecz ujmując oznacza to, że
absorbancja przy maksimum dla kwasów nukleinowych (A260) jest 2x większa niż
absorbancja tła i zanieczyszczeń.
*
Krytyczne dla reakcji enzymatycznych są wartości A260/280 i
A260/230<1,4. Niższe wartości mogą spowodować bardzo kiepskie wyniki
amplifikacji np. metodą Real-Time PCR czy też słabe znakowanie sond do
mikromacierzy. Przy A260/230<1 nawet zwykły RT-PCR może okazać się
problemem. Dlatego w przypadku kiepskiej czystości należy powtórzyć ekstrakcję
alkoholem.
Rodzaje zanieczyszczeń
*
Zanieczyszczenie fenolem powodują wzrost absorbancji w zakresie
200-230 nm i rozszerzenie krzywej w zakresie 250-280 nm. Obraz (w przypadku
ryciny 3 dotyczy próbek znaczonych strzałką, oprócz jasnoniebieskiej) jest
podobny jak w przypadku zanieczyszczenia solami chaotropowymi. Takie
DNA/RNA nie nadaje się do zastosowań enzymatycznych. A260/230 i A260/280
mogą przyjmować zaskakujące wartości (>2. lub <1,4 w zależności od stężenia
fenolu i towarzyszących zanieczyszczeń, np. chloroformu i alkoholu
izoamylowego)
Ryc. 2: Zanieczyszczenie fenolem (czerwona strzałka) oraz niepoprawna aplikacja
próbki na okienko (oznaczone czarnymi strzałkami)
*
Zanieczyszczenie izotiocyjanianem lub chlorkiem guanidyny –
widoczne na ryc. 2 (krzywa czarna i jasnozielona). Wydatny pik przy długości fali
230nm i towarzyszące mu przesunięcie absorbancji DNA/RNA w prawo w
kierunku 270nm to cechy charakterystyczne tej kontaminacji. Taka próbka w
żadnym wypadku nie nadaje się do zastosowań enzymatycznych, sole
izotiocyjanianu są silnymi zwiazkami chaotropowymi i unieczynniają eznymy!
Najczęściej oba parametry A260/A280 i A260/A230 <1,4.
Ryc. 3: Zanieczyszczenie solami chaotropowymi. Charakterystyczna „skocznia
mamucia” na wykresie absorbancji.
*
Zanieczyszczenie białkami – powodują wzrost absorbancji w zakresie
200-230 nm i rozszerzenie krzywej w zakresie 250-280 nm. Przy niewielkim
zanieczyszczeniu (<0,1% ) możemy nie obserwować „górki” z prawej strony
wykresu, a jedynie niewielki spadek A260/280.
Ryc 4. Wysokie zanieczyszczenie białkowe DNA we wszystkich próbkach.
*
Zanieczyszczenie etanolem i/lub izopropanolem – nie obserwuje się
znaczącej zmiany absorbancji, szczególnie w roztworach zbuforowanych. W
wodzie parametr A260/230 może być nieznacznie obniżony. Przy niewielkiej
domieszce etanolu reakcje enzymatyczne nie są mocno zakłocóne, warto jednak
przywiązywać wagę do dokłądnego wysuszenia pelletu przd rozpuszczeniem,
ponieważ zanieczyszczenia etanolem i izopropanolem są niewykrywalne
spektrofotometrycznie!
*
Zanieczyszczenie DNA przez RNA (i vice versa)– oba kwasy
nukleinowe są koekstragowane i zazwyczaj występują razem po izolacji. Mają
także bardzo zbliżoną pochłanialność i emisję światła, więc są nirozróżnialne
spektrofotometrycznie. W przypadku konieczności pozbycia się DNA z RNA
musimy wykonać trawienie próbek DNAzą.
Troubleshooting
*
A260/230 jest >2,3
Powodem może być kalibracja urządzenia innym buform niż użyty do
rozpuszczenia próbek (np.woda vs TRIS-HCl). Inna możliwość to nieprawidłowe
nakropienie próbki na okienko i pomiar powietrza zamiast kropli przez
spektrofotometr. Objawia się to poszarpaną krzywą (ryc. 2)
*
Absorbancja A260 jest ujemna.
Powodem może być kalibracja urządzenia innym buform niż użyty do
rozpuszczenia próbek (np.woda vs TRIS-HCl). Inna możliwość to nieprawidłowe
nakropienie próbki na okienko i pomiar powietrza zamiast kropli przez
spektrofotometr. (ryc. 2)
*
Urządzenie nie potrafi wyznaczyć absorbancji
Próbka zawieszona jest w pieniącym się bądź lepkim buforze, nakropiono zbyt
mało próbki bądź poza strefą pomiaru (okienko jest puste).
Z laboratorium do kuchni: o
sprzęcie laboratoryjnym, który
zmienił oblicze gastronomii
Czym jest gastronomia molekularna? Tych, którym kojarzy się ona z
jedzeniem GMO, muszę zmartwić: nie chodzi o zdobycze biotechnologii w
kontekście manipulacji genetycznych, ale o sprzęt laboratoryjny i metody
analityczne, które okazały się być przydatne (a wręcz niezbędne!) podczas
perfekcyjnej obróbki produktów spożywczych.
O zaletach odżywczych wyrobów gastronomii molekularnej pisaliśmy wcześniej,
dziś zajmiemy się aspektem technicznym, czyli sprzętowi, który wyemigrował „z
labów na salony”.
Gotowanie „molekularne” jest traktowane jako ciekawostka właściwie od końca
lat 90-tych, chociaż powinniśmy sobie zdawać sprawę, że korzystały z niego nasze
babki i prababki- takie czynności jak ubijanie piany, wyrabianie ciasta poprzez
mieszanie tylko w jednym kierunku lub zagniatanie chleba zgodnie z odpowiednim
algorytmem, to wszystko służy uzyskaniu odpowiedniej struktury
fizykochemicznej przygotowywanej potrawy i poprawieniu jej smaku. W
dzisiejszych czasach, dzięki zdobyczom techniki i nauk ścisłych można było
udoskonalić procesy obróbki potraw w niespotykanym dotychczas wymiarze.
Łaźnie wodna i cieplarki- slow cooking: by zatrzymać smak mięs
Łaźnie wodne i cieplarki laboratoryjne od dawna służyły utrzymaniu stałych
warunków środowiska, które były niezbędne do wykonywania pewnych reakcji
chemicznych, czy też enzymatycznych. Bez cieplarek nie byłoby możliwe
prowadzenie hodowli komórkowych. Pomysł zastosowanie ich do czynności stricte
kuchennych narodził się w latach 50tych XX wieku.
Chyba od czasu „wynalezienia” ognia wiadomo było, że obróbka termiczna
produktów kulinarnych jest ważna i od sposobu prowadzenia tego procesu zależy
smak i konsystencja dań. Tradycyjne piece i naczynia kuchenne umożliwiały co
prawda utrzymanie stałej temperatury, ale zwykle była ona wysoka, powyżej 100
stopni. Wprowadzenie tzw. „slow cookerów” i metody gotowania „sous-vide”
pozwoliło wydobyć zupełnie nowe smaki ze znanych wszystkim potraw mięsnych i
rybnych.
Idea obu metod jest podobna: stosować tylko tyle ciepła, ile jest potrzebne do
„zmiękczenia” potrawy, zachowując jej teksturę, strukturę tkanek i związki
odżywcze. Gotowanie/pieczenie odbywa się w niskiej (ok 50-60 stopni)
temperaturze przez bardzo długi okres czasu (nawet kilkadziesiąt godzin).
Czasami zastosowane zostaje dodatkowo podciśnienie, by lepiej zachować aromat
potraw.
Ciekły azot w służbie perfekcyjnych deserów lodowych
Ciekły azot służy jako chłodziwo zarówno w przemyśle, w chemii, biologii jak i w
medycynie. Szybkie chłodzenie w bardzo niskiej temperaturze powoduje
natychmiastowe zamarzanie bez tworzenia się dużych kryształów lodu, które
powodują zmianę struktury tkanek. Chłodzienie w ciekłym N2 umożliwia zatem
mrożenie żywotnych komórek do hodowli komórkowych czy przeszczepów.
Skoro wzrost kryształów lodu w mrożonej azotem strukturze jest minimalny, to
dzięki N2 można stworzyć idealnie kremowe lody. Wg znawców kuchni
molekularnej tekstura deserów lodowych zamrażanych azotem jest niesamowita,
lżejsza i bardziej piankowa, niż po zastosowaniu konwencjonalnego mrożenia…
Ciekły azot jest także używany przez eksporterów ryb i owoców morza- głównie
tuńczyka, łososia i miecznika. Polędwica z tuńczyka, zamrożona w azocie, po
umiejętnym rozmrożeniu zachowuje pełnię smaku i świeżości, nadaje się więc do
sporządzenia wybornego sushi lub sashimi w odległej od miejsca połowu
lokalizacji.
Sublimacja: esencja kawowa jak kawa sypana
Skoro już o mrożeniu mowa, to warto wspomnieć o procesie technologicznym,
dzięki któremu kawa rozpuszczalna smakuje jak kawa, a drożdże piekarskie w
proszku są po rehydratacji wciąż żywotne i potrafią spulchniać ciasto.
Sublimacja polega na przejściu ciała stałego w gaz z pominięciem etapu cieczy. By
„odparować” z zamrożonego roztworu, czy też zawiesiny, prawie cały
rozpuszczalnik, korzysta się ze specjalnych komór sublimacyjnych, w których
panuje obniżone ciśnienie i temperatura niższe względem tzw. punktu potrójnego
danego rozpuszczalnika.
Pierwotnie sublimacja była (i dalej jest) wykorzystywana w przemyśle
chemicznym do uzyskiwania czystych związków chemicznych (odparowanie
rozpuszczalnika lub oddzielenie kilku substancji różniących się dostatecznie
parametrami termodynamicznymi punktu potrójnego).
Sublimacyjne odparowanie rozpuszczalnika znalazło swoje miejsce „blisko
kuchni” – służy dziś w produkcji drożdży piekarskich i gorzelniczych, tworzeniu
aromatów i barwników naturalnych oraz w produkcji kawy.
Dobrej jakości kawa rozpuszczalna zachowuje maksimum smaku i nie ma
„palonego” posmaku właśnie dzięki sublimacji. Tańsza technologia suszenia
rozpyłowego polega na wysuszeniu ekstraktu w wysokiej temperaturze po jego
rozpyleniu w postaci aerozolu. Tracona jest w ten sposób część właściwości
organoleptycznych uzyskanego rozpyłowo suchego proszku kawowego.
Sublimacja nie wymaga podgrzewania, chroni więc labilne substancje
aromatyczne zawarte w ekstrakcie.
Wirówki: soki, musy pasty, zupy…
Zastosowanie wirówek w codziennej praktyce kuchennej w zasadzie ogranicza się
do zwirowania liści sałaty w specjalnej plastikowej wirówce, w celu jej
wysuszenia. A szkoda. Wirowanie w przemyśle spożywczym jest świetnie znane i
pozwala np. na oddzielenie drożdży od wytworów gorzelniczych, albo na
zagęszczenie do pożądanej konsystencji musu owocowego. Ponadto można pozbyć
się szybko fusów z napojów owocowych.
Na sieci furorę robią przepisy na przezroczysty sok pomidorowy i bezbarwne
kremy pomidorowe . Żeby zrobić „wywar z białego pomidora” trzeba bardzo
dobrze przygotowany i na gładko roztarty mus zwirować. I voila. Ta sama reguła
obowiązuje przy nowoczesnym przyrządzaniu tradycyjnie klarownego Consommé.
Jeśli chcecie zaskoczyć znajomych na przyjęciu, zaserwujcie im w identycznych
szklankach zwirowany na wysokich obrotach sok pomidorowy, arbuzowy,
jabłkowy i np…. chudy bulion wołowy. Dopiero smak zdradza, co kryje się w
przezroczystym płynie, który wzięli do ręki!
Alginiany i agary: żele nie tylko do analiz
W ekskluzywnych restauracjach nastała moda na kawior. Nie chodzi tu jednak o
rybie jajeczka, ale o kawior o smaku np. arbuzowym, pieczeniowym lub
brokułowym! Jak twierdzą restauratorzy, ekstrakty, soki i musy wyglądają i
smakują lepiej, gdy podaje się je w formie kulek, przypominających wyglądem
kawior. „Kawior” taki powstaje przez enkapsulację dowolnej zawiesiny w
spolimeryzowanym żelu alginianu wapnia.
Z alginianu korzystają także wegetarianie, zastępując nim nieakceptowany
zwierzęcy kolagen. Alginian jest wg nich „produktem ekologicznym,
pozyskiwanym prosto z natury”. Nic bardziej mylnego.
Takie „eko-galaretki” to wynalazek biotechnologii! Tworzone są one poprzez
zestalanie alginianu w roztworze jonów wapnia. Pierwotnie alginiany
(otrzymywane z glonów podobnie jak agary) służyły jako sorbenty i stabilizatory w
reakcjach chemicznych, korzystano z nich również w procesie wytwarzania
biosensorów i immobilizowanych drożdży do bioreaktorów. Dziś są szeroko
stosowane nie tylko w przemyśle i w kuchni, ale także w medycynie do produkcji
kompresów.
Sonikacja: polowanie na smak
Jak najmniejszym kosztem wydobyć maksimum smaku z potrawy? Odpowiedź
brzmi: użyć sonifikacji.
Metoda ta wykorzystuje fale ultradźwiękowe o różnym natężeniu. Energia
niesiona przez takie fale jest całkiem pokaźna, pozwala na zrywanie wiązań
międzycząsteczkowych, aktywację pewnych reakcji chemicznych, porowacenie i
homogenizację materiału biologicznego.
Sonikacja znalazła szereg zastosowań w chemii (mieszanie próbek do NMR,
odgazowanie roztworów, katalizowanie reakcji chemicznych, inicjacja procesu
krystalizacji) i biologii (homogenizacja tkanek, poracja błon biologicznych celem
transformacji komórek egzogennym DNA, enkapsulacja białek i innych związków
bioorganicznych w liposomach). Okazuje się, że teraz wkracza do kuchni z
niesamowitym potencjałem.
Sonikować można np. sos vinegrette, by otrzymać perfekcyjną emulsję do sałatek.
Można sonikować świeże lub suszone zioła w sosach. Można w końcu nadawać
aromat dębowy piwu lub whiskey (!) lub wzbogacać smak tychże napojów
cynamonem, wanilią itd. Zresztą homogenizować można nie tylko sosy i koktajleznawcy twierdzą że metoda ta pozwala uzyskać idealnie kremowe puree,
mięciutkie mięsa (nie trzeba ich długo marynować, wystarczy zsonikować z
dodatkiem marynaty!) czy też buliony, by zintensyfikować ich smak.
Co sądzicie o takim wykorzystaniu technologii laboratoryjnej? Sonikacja i
ultrawirowanie w kuchni to tylko ekscesy, czy może przyszłość
gastronomii?
Źródła:
1. Fun with centrifugation
2. Gastrophysics
3. Molecular recipes
i wiele innych…
Testujemy termocykler Labcycler
od Sensoquest
Przetestowaliśmy termocykler Labcycler, którego producentem jest
Sensoquest Biomedical Electronics, a dystrybutorem Syngen Biotech.
Urządzenie jest niezawodne, wygodne w użytkowaniu, a na dodatek bardzo
szybkie. Jest to urządzenie, które spełniło nasze wymagania. Z czystym
sumieniem możemy polecić je do każdego laboratorium.
Zalety urządzenia:
-Bardzo szybkie grzanie i chłodzenie bloku
-Kolorowy ekran dotykowy
-Złocone termobloki wykonane ze srebra
-Niski pobór mocy
-Możliwosc podziału bloku na 3 niezależne bloki, poprzez specjalne nakladki na
blok
-6 stref kontroli temperatury
-20-letni okres bezawaryjnego użytkowania
-Automatyczny restart po zatrzymaniu
-Możliwość autokalibracji
-Ekspresowa zmiana bloku
– wymaga tylko jednej ręki i trwa 10 sekund.
Wady: – Drobną wadą jest czytelność ekranu sterującego. W naszej opinii mógłby
być nieco wiekszy, przez co nieco wygodniejszy w użytkowaniu.
Broszury,
ulotki
i
protokoły:
http://www.sensoquest.de/download.php?nav=6&seite=
Dane techniczne: Line voltage 85 to 265 without switching, 50 – 60 Hz Power
consumption Maximum 350 Watt, standby 25 Watt Loudness Idle 38 dBA,
typical run 44 dBA, maximum run 48 dBA Interfaces RS232 Heated lid
Electrically moving, temperature and pressure programmable up to 105 °C
Pressure Programmable from 30 to 120 Newton Dimension Length = 444 mm.
Witdh = 251 mm, Height lid close = 201 mm, lid open = 347 mm Weight 11.5
kg Display TFT illuminated colour ¼ VGA, 5,7” diagonal, 320 x 240 = 76800
pixel touchscreen Keyboard Numeric silicon keys Virtual keys on the touchscreen
depending on the context Languages – English, German Programs 680 5-stepprograms, or at least 3000 steps The last 16 program runs can be displayed any
time Password protection Individual for groups, persons, folders and programs
Thermoblock 48, 96, 384 Material Electroformed gold Plated silver Temperature
Minus 5 °C to plus 99.9 °C Uniformity ± 0.25 °C at 55 °C, ± 0.40 °C at 95 °C
Controll accuracy 0.01 °C/s Ramp rate 0.001 °C/s – 5.0 °C/s De(In)crements
Temperature ± 9.99 °C, time ± 99.99 seconds Gradient capable 40 °C, ± 20°C
from the left to the right Heating rate 4.2 °C/s Cooling rate 3.6 °C/s Block format
48-wells, 0.5 ml single tubes96-wells, 0.2 ml single tubes, stripes &
microtiterplates,384-wells, microtiterplates
CE IVD bez tajemnic
Czym jest, na czym bazuje i po co w ogóle to wprowadzono? Niniejszy
artykuł dotyczy dyrektywy 98/79/EC i jej konsekwencji laboratoryjnych
oraz prawno-ekonomicznych.
Idea polityki jakości jest już dość leciwa, wymyślono ją dla celów wielkoskalowego
przemysłu, bo takiego przemysłu nie stać na „brak jakości”. Czym w ogóle jest
jakość? Jakość definiowana po konsumencku to przecież nie to samo, co jakość
zawarta w procedurach i normach. Tak definiowana jakość oznacza wysoką
powtarzalność parametrów produktów danego typu wykonanych w zgodzie z
normą, a także bezpieczeństwo wytwórcy w procesie produkcyjnym i
bezpieczeństwo odbiorcy podczas użytkowania. Taka definicja jakości wcale nie
daje gwarancji, że produkt na przykład będzie stworzony z wysokiej jakości
bawełny. Dlatego sceptycznie podchodzimy do znaczków CE na opakowaniach,
które jednak są potrzebne, bo gwarantują bezpieczeństwo użytkowania i
humanitarne warunki pracy wytwórców.
Jednak skupmy się na diagnostyce in vitro: co ją odróżnia od reszty rynku
konsumenckiego? Mamy wytwórcę, mamy użytkownika — diagnostę. Mamy
jednak kogoś jeszcze. Pacjenta, który jest faktycznym beneficjentem i odbiorcą
testu diagnostycznego, mimo że dzieje się to poza jego świadomością tego faktu.
Po to właśnie, by chronić także chorego, którego przecież nie stać na pomyłki
producenta testu (płaciłby swoim zdrowiem!) powstała dyrektywa UE „o
medycznych przyrządach* do diagnostyki in vitro” (98/79/EC). Dlatego certyfikat
jakości CE nie wystarcza jako gwarancja odpowiedniej jakości w diagnostyce
medycznej.
98/79/EC… Cóż to za dokument i czego dotyczy? Jest to zestaw bardzo
ogólnikowych norm, jakie muszą spełniać odczynniki i urządzenia używane w
laboratoriach diagnostycznych. Jako „medyczne przyrządy* diagnostyczne”
rozumie się wg dyrektywy nie tylko urządzenia, ale także systemy
przechowywania próbek, odczynniki diagnostyczne oraz software do analizy
danych. Wszelka aparatura i chemia, która ma styczność z próbką na
którymkolwiek etapie analizy jest zatem traktowana jako medyczny przyrząd
diagnostyczny i podlega tym wytycznym.
Dyrektywa IVD mówi między innymi, że do diagnostyki in vitromoże by stosowany
sprzęt/odczynnik który spełnia kryteria dla normy CE (działającej w oparciu o
dokument EN ISO 9001) i dodatkowe kryteria, zawarte w aneksach (I- X).
Ponadto pewne odrębne kryteria, inne niż dla odczynników używanych w
laboratoriach, muszą spełnić urządzenia do samokontroli u pacjentów —
glukometry, paski testowe itp.
Z punktu widzenia laboratoriów najważniejszy jest załącznik 2. Zawarta jest w
nim klasyfikacja badań o podwyższonym poziomie wymaganych norm jakości ze
względu na istotność tych badań w kontekście zdrowia i życia pacjenta i
personelu. W aneksie A mamy badania serologiczne grup krwi: systemu ABO, Rh
(C, c, D, E, e) Kell, oraz badania wirusologiczne HIV, HTLV oraz badania wirusów
wątrobowych.
W aneksie B figurują grupy krwi Duffy i Kidd, przeciwciała przeciwkrwinkowe,
typowanie tkankowe HLA (serologia), detekcja toksoplazmozy i różyczki, wirusa
cytomegalii i chlamydiozy (mikrobiologia, wirusologia), testy na fenyloketonurię,
oznaczenie trisomii 21 (genetyczne zaburzenia wrodzone), oznaczenia markeru
nowotworowego PSA oraz glukozy we krwi.
Oznacza to, że oprócz obowiązkowych wymagań z aneksu I i wymogu posiadania
certyfikatu CE dla tych oznaczeń wymagane jest spełnienie
kryteriów załączników IV-VIII, potwierdzone certyfikatami zgodności z drugą
normą, DIN EN ISO 13485 i (najlepiej) oświadczeniem producenta że produkt
może by stosowany w diagnostyce in vitro.
Dla diagnostów ważne jest, co rozumie się przez stosowanie się do wytycznych dla
oznaczeń z aneksów A i B:
— testy używane w diagnostyce MUSZĄ być certyfikowane CE IVD
— wszystkie urządzenia służące do wykonania oznaczeń, a wiec zarówno systemy
do pobierania próbek, jak i pipety, plastiki laboratoryjne i inne urządzenia muszą
spełniać takowe wymagania. O tym wiele laboratoriów zapomina.
Zapomina się także o tym, że zestaw może być certyfikowany np. tylko dla krwi,
bo firmie nie chciało się certyfikować zestawu dla innych typów materiału (to są
koszty a firmy lubią je ciąć!), a my oznaczamy tym zestawem parametry np. w
PMR. To błąd który nie powinien mieć miejsca. Za to powinno się karać i to
surowo (a w Polsce jest z tym różnie).
Dlaczego nie wszystkie laboratoria stosują się do wytycznych aneksów A i B? Bo
jakość kosztuje. Zestawy z IVD są droższe, a konkurencyjność wymaga obniżania
cen. Często kadra jest też nieprzeszkolona i żyje w błogiej niewiedzy. Niestety
nieznajomość prawa nie jest usprawiedliwieniem.
A dlaczego producenci znanych, rewelacyjnych marek sprzętu i odczynników na
przykład do biologii molekularnej często uwzględniają adnotacje „for research use
only”, mimo że ich odczynnikom można ufać bardziej niż KITom z IVD mało
znanych firm? Ma to 2 przyczyny. Po pierwsze certyfikat podraża odczynnik, a
adresatami odczynników do badań molekularnych są głównie jednostki naukowe,
którym IVD nie jest absolutnie do niczego potrzebne. Po drugie zaś, firmy nie chcą
brać na siebie odpowiedzialności prawnej. Wolą swoje enzymy sprzedać
podwykonawcy, który produkuje KITy i sam stara się o certyfikację, sam też
ponosi odpowiedzialność prawną w razie zaistnienia niezgodności. Tak więc np.
bardzo znane polimerazy i odwrotne transkryptazy nie posiadają certyfikacji IVD,
ale wchodzą w skład zestawów z IVD. Czyż to nie ironiczne? Tak
jednak działa prawo, do którego, chcąc nie chcąc, powinniśmy się stosować.
Oczywiście brak certyfikatu IVD przy wykazanym przez producenta fakcie, że
produkt spełnia normę CE i kryteria załącznika I (obligatoryjne) wystarcza, by taki
sprzęt znalazł się w laboratorium, w którym nie wykonuje się analiz z aneksu II. A
więc przyrządy z oznaczeniem zgodności np. z EN ISO 13485 mogą być
automatycznie traktowane jako mogące uczestniczyć w procesie diagnostycznym.
Oczywiście jeśli podlegają przeglądom technicznym i są sprawne.
* Uwaga: Używam określenia „przyrząd”, by nie mylił się on z terminem
„urządzenie” używanym w polskich dokumentach-córkach. Kojarzy się on bowiem
jednoznacznie z aparaturą mechaniczną, a nie chciałam wprowadzać zamętu
podczas objaśnień.
Piśmiennictwo:
Directive 98/79/EC of the European Parliament and of the Council of 27 October
1998 on in vitro diagnostic medical devices.
Test systemu do elektroforezy
kapilarnej Qiaxcel
Systemów do elektroforezy kapilarnej jest obecnie na rynku sporo. Oprócz
sprzężonych z sekwenatorami systemów do analizy fluorescencyjnie
znakowanych kwasów nukleinowych istnieje kilka wielofunkcyjnych
systemów rozdzielających cząsteczki w bardziej „konwencjonalny”,
przypominający klasyczną elektroforezę, sposób. Dwoma największymi
konkurentami na polskim rynku są Bioanalyzer Agilent’u i qiagenowskie
urządzenie Qiaxcel. Miałam przyjemność zetknąć się z oboma systemami,
chciałam jednak szerszej opisać kombajn firmowany przez Qiagen,
ponieważ to na nim obecnie wykonuję rozdziały kapilarne.
Pierwsze wrażenie
Qiaxcel jest duży i kwadratowy. Gabarytowo: jak spora wirówka. W dodatku jak
przystało na produkt Qiagena cechuje się swoistą i nie każdemu przypadającą do
gustu estetyką: srebrna dość łatwo rysująca się farba i granatowe wstawki. Akurat
małego Agilenta, o nowocześniejszej linii, uważam za ładniejszego i
praktyczniejszego, chociaż oczywiście, jak mówi mądrość ludowa, liczy się nie
wygląd lecz wnętrze…
Wnętrze
Idea systemu to rozdział pod wysokim napięciem kwasów nukleinowych w
szklanych kapilarach. Płynny żel o różnym składzie dla różnych typów rozdziału
(DNA/RNA, rozdział dokładny/screening itd.) jest wstrzykiwany pod ciśnieniem
generowanym przez sprężony azot ze zbiornika do kapilar, następnie kwas
nukleinowy wędruje pod ciśnieniem przez kapilary i urządzenie odnotowuje
moment jego detekcji na wyjściu. Przed każdym rozdziałem aparat czyści kapilary
ze starego żelu i przepłukuje je buforem zdalnie. Rezerwuary żelu są integralną
częścią kartridży, które są wymienne i zależnie od typu i zastosowania starczają
na kilkadziesiąt do kilkuset rozdziałów- ilość ta jest predefiniowana na chipie
kartridża i nie można jej zmienić.
Barwnikiem używanym w systemie Qiaxcel jest bromek etydyny, co należy
zaliczyć już na wstępie do wad urządzenia- ogranicza znacząco jego potencjał a
także żywotność kartridża.
Jednorazowo Qiaxcel dokonuje rozdziału 12 próbek (kartridże posiadają 12
kapilar). Przy rozdziale mniejszej liczby próbek trzeba puste miejsca załadować
PCRówkami z czystym buforem. Podraża to analizę pojedynczej próbki, gdyż
maszyna wykorzystuje tą samą ilość żelu i azotu niezależnie od ilości zapełnionych
miejsc w rządku. Maksymalna przepustowość przy jednorazowej analizie to jedna
płytka 96-dołkowa (czyli 8 rozdziałów po 12 prób). Czas trwania pojedynczego
rozdziału waha się od kilku do kilkunastu minut w zależności od użytego kartridża
i doboru warunków. Tutaj akurat Qiaxcel dominuje nad Bioanalyzerem: może
wykonać jednorazowo więcej rozdziałów, aparat robi to szybciej i łatwiej
przygotowuje się próbki.
Obsługa
Po oswojeniu się z Qiaxcelem przygotowanie sprzętu do elektroforezy zajmuje
kilka minut. Wyjątkiem jest pierwsze użycie każdego kartridża, które wiąże się z
kalibracją intensywności sygnału. Przy pomocy dołączonego do zestawu stripa i
buforu do kalibracji wykonuje się poprzedzony symulacją kilkunastominutowy run
wstępny. Raz na jakiś czas, przy pogorszeniu tła elektroforezy należy także
zmieniać bufory płuczące w wanienkach, z których korzystają kartridże podczas
„toalety”. Wielorazowego użytku są też tzw. alignment marker i drabinki
wielkości.
Próbki do elektroforezy z płytki lub stripa po prostu wkłada się w przygotowane
saneczki. Trzeba jedynie sprawdzić czy w żadnej kieszonce nie zalega bańka
powietrza, która skutecznie blokuje kapilary i może je nawet trwale wyłączyć z
użytkowania. Można także korzystać z PCRówek, jednak trzeba im albo poodcinać
łebki, albo umieszczać co 2 rządki, blokując kapselki o otwór z kolejnego rządku.
Jest to jeden z mankamentów. Drugi to wielorazowość używanych buforów.
Produkty PCR do czułych zastosowań downstream typu nested-PCR lub RealTime, a także RNA należy rozpipetować, by nie przenieść z poprzednich analiz
DNA lub rybonukleaz. Z tym wiąże się kolejna wada: Qiaxcel musi mieć co
najmniej 12uL płynu, by nie było ryzyka pobrania powietrza w kapilarę. Samego
materiału analizer pobiera minimalne ilości, ale nakropione musi mieć dużo
więcej niż Bioanalyzer (w nim używany jest 1uL do rozdziału!).
Precyzja rozdziału sprzętu Qiagena jest imponująca jak na tak krótki rozdział na
bromku etydyny. Na kartridżu „high resolution” dla fragmentów DNA poniżej
400nt udaje się uzyskać dobrze widoczne, rozdzielone sygnały dla różnic rzędu
4-6nt. Dla fragmentów ok. 1000nt jest to 10-20nt. Dokładność szacowania
wielkości fragmentów na podstawie dołączonych ladderów przy
wysokorozdzielczych kartridżach to ok. 2nt dla mocnych sygnałów i ok. 5nt dla
sygnałów niewiele wyższych od poziomu tła. Niestety ze względu na właściwości
EtBr czułość nie jest najmocniejszą stroną Qiaxcela: jest ona niewątpliwie wyższa
niż żeli agarozowych, jednakże na agarozę można napipetować maksimum
produktu PCR, tu zaś czas poboru materiału jest ściśle zdefiniowany i wpływa na
rozdzielczość analizy (program „L” powoduje dłuższe pobieranie próbki, ale
wpływa to na pogorszenie jakości rozdziału). Bromek w kartridżu szubko
degraduje, więc z biegiem czasu jego fluorescencja maleje. W zasadzie jednak
„hardware’ową” część obsługi urządzenia można ocenić bardzo pozytywnie. Co
jednak tyczy się software’u…
Software
Tragedia. To słowo najlepiej opisuje parametr przyjazności oprogramowania dla
przeciętnego użytkownika. Początki z obsługą Qiaxcela to sen wariata: przyciski i
paski zadań porozmieszczane zupełnie bez sensu, żeby znaleźć jakąś opcję trzeba
przekllikać w zasadzie wszystko, a i nie zawsze znajdzie się właściwy suwak czy
okienko wyboru opcji. Nawet tak banalna rzecz jak opisanie próbek wymaga
kombinacji alpejskich. Format wprowadzania danych to *csv, w którym nie można
kopiować całych linijek i ogólnie prawie nic nie można. Żeby opisać płytkę 96dołkową trzeba albo zrobić to 100% ręcznie, co zajmuje wprawnym palcom co
najmniej kwadrans, albo przygotować arkusz w Open Office, przekonwertować do
*csv i wgrać do Qiaxcela (ten sam format jest używany także w innych nowych
urządzeniach firmy Q). Co ciekawe urządzenie nie przyjmuje konwersji z MS
Excela! Z innych kwiatków: wgranie opisu makrerów wielkości wymaga często
dopisania dodatkowych wierszy w tabelę, co na początku człowieka przerasta. Nie
istnieje też szybki sposób na wyciągnięcie wynikowych plików graficznych w
cywilizowanym formacie, ja omijam ten problem drukując pdf z grafiką, po czym
wyniki wycinam z pdfów…
Jest jeszcze jedna ułomność obróbki danych: producent dodaje tylko 2 klucze
USB do urządzenia, a to oznacza że nie ma możliwości (legalnego)
przetworzenia i zanalizowania danych przez osobę nie posiadającą klucza. Pod
względem oprogramowania Agilent bije Qiagen na głowę. Ich oprogramowanie
jest dużo bardziej przemyślane, chociaż strasznie zamula system.
Problemy
Problemy z obsługą urządzenia zdarzają się, acz rzadko. Mieliśmy już w karierze
kartridż przeterminowany przed czasem deklarowanym przez producenta
(reklamacja została uwzględniona) i zatkane kapilary (udało się je odratować
dzięki niezwykłemu protokołowi producenta i czajnikowi elektrycznemu x pokoju
socjalnego). Podobno problemem może być pierwsza kalibracja, która jest
wrażliwa na światło i wstrząsy.
Materiały eksploatacyjne
Ile kosztuje użytkowanie? Szacunkowo, przy założeniu że wykorzystany zostaje
cały kartridż cena nie przekracza 3zł za próbkę, wliczając wszystkie materiały
eksploatacyjne.
Podsumowanie
Qiaxcel w porównaniu z tradycyjnymi elektroforezami jest drogi, nie da się tego
ukryć, jednak gdy zachodzi potrzeba precyzyjnego rozdziału większych ilości
próbek: warto zastanowić się nad jego zakupem. Jak wszystkie tego typu
urządzenia, nie jest systemem idealnym, ma sporo ograniczeń. Jednakże do
zastosowań półilościowych oraz jakościowych typu: analiza mutacji insercyjnodelecyjnych, ocena integralności RNA, precyzyjna ocena wielkości produktu
PCR – nadaje się znakomicie. Trzeba jednak bardzo dobrze przemyśleć co i jak
będziemy analizować, żeby nie wylądować w pracowni z niepotrzebnym
meblem. Polecam kontakt z dystrybutorem Qiagena (http://syngen.pl/) w celu
przeprowadzenia demonstracji, bo to najlepszy sposób na zapoznanie się z
urządzeniem.
Ocena:
Wygląd i gabaryty: 3
Wygoda prowadzenia analizy: 6
Oprogramowanie: 2
Róznorodność zastosowań: 4
Ogółem: 4,5
Komentarz autorki (i współpracowników): Aparat podoba mi się.
Wynik multiplex PCR dla typu dzikiego (2 rząd) i podwójnego mutanta
insercyjnego (3 rząd). W pierwszym rzędzie marker wielkości.
Marzena Pieronkiewicz
Zapraszamy na Targi EuroLab
Targi EuroLab – wszystko dla laboratoriów.
Jubileuszowe XV Międzynarodowe Targi
Analityki i Technik Pomiarowych EuroLab, które odbędą się w dniach 10-12 kwietnia 2013 w Centrum TargowoKongresowym MT Polska w Warszawie, to największe tego typu wydarzenie w Polsce. Zostaną tam
zaprezentowane dokonania naukowe i ich zastosowania w najnowocześniejszych rozwiązaniach technologicznych
dostępnych dla rynku w ramach czterech sektorów: analityki chemicznej, Life Science, biotechnologii oraz
metrologii. Podczas EuroLab swoją ofertę przedstawią producenci i dystrybutorzy akcesoriów laboratoryjnych,
drobnego sprzętu, szkła laboratoryjnego, mebli, a także aparatury analitycznej oraz sprzętu optycznego i
kontrolno-pomiarowego. Wśród produktów nie zabraknie substancji chemicznych, odczynników, testów oraz
oprogramowania, jak również profesjonalnych środków czystości, czy odzieży ochronnej.
Szeroka oferta szkoleniowa
Dodatkowo firma MT Targi Polska zadbała o bogaty program naukowy
poświęcony zagadnieniom analitycznym, pomiarowym i biotechnologicznym. Nad
jego najwyższym poziomem merytorycznym czuwa Rada Programowa, składająca
się z wybitnych naukowców i specjalistów, którzy przewodniczą kluczowym
instytucjom naukowo-badawczym w Polsce.
Nowością będzie seminarium pt. „Wstęp do nanotechnologii – perspektywy
rozwoju w Polsce”, którego organizatorem jest Fundacja Wspierania Nanonauk i
Nanotechnologii NANONET. Odbędzie się także spotkanie poświęcone
najnowszym zastosowaniom analityki pt. „Chemik na tropie fałszerstw: leki,
dopalacze i narkotyki” organizowane przez Wydział Chemii Uniwersytetu
Warszawskiego, Narodowy Instytut Leków oraz Komitet Chemii Analitycznej PAN,
jak też seminarium „Jakość w kryzysie”, które zostanie poprowadzone przez
specjalistów z Polskiego Centrum Akredytacji. W programie przewidziano
konferencję tematyczną pt. „Badania molekularne w diagnostyce
laboratoryjnej”, organizowaną przez Krajową Izbę Diagnostów Laboratoryjnych
oraz Polskie Towarzystwo Diagnostyki Laboratoryjnej, podczas której diagności
laboratoryjni będą mogli zdobyć punkty edukacyjne.Odwiedzający będą mogli
także wziąć udział w seminarium „Analizy chemiczne próbek stałych w
mikroobszarze – teraźniejszość i przyszłość badań w Państwowym
Instytucie Geologicznym”. Klub Polskich Laboratoriów Badawczych POLLAB i
Polski Komitet Normalizacyjny poprowadzą cykl wykładów pt. „Problemy
laboratoriów”, a Instytut Biotechnologii Wydziału Chemicznego Politechniki
Warszawskiej wykłady dotyczące biotechnologii „BIOtechnologia zaczyna się
od komórki”. Pełne spektrum zagadnień uzupełni blok seminaryjny Głównego
Urzędu Miar oraz certyfikowane warsztaty na temat metrologii chemicznej
TrainMiC®.
Dodatkowo kryminalistyka
Równolegle odbędą się II Międzynarodowe Targi Techniki Kryminalistycznej
CrimeLab skierowane do branży kryminalistycznej. Spotykają się tam
producenci, dystrybutorzy, użytkownicy oraz naukowcy wykorzystujący sprzęt,
produkty oraz usługi stosowane w technice kryminalistycznej. Patronat Honorowy
nad tym wydarzeniem sprawują Ryszard Kalisz, Przewodniczący Sejmowej
Komisji Sprawiedliwości i Praw Człowieka, Konstanty Miodowicz,
Przewodniczący Sejmowej Komisji do Spraw Służb Specjalnych, Stefan
Niesiołowski, Przewodniczący Sejmowej Komisji Obrony Narodowej oraz
Jarosław Gowin, Minister Sprawiedliwości.
Rejestracja
Wstęp na Targi EuroLab jest bezpłatny po dokonaniu obowiązkowej rejestracji.
Można jej dokonać on-line pod adresem www.targieurolab.pl do 8 kwietnia lub
wypełnić formularz na miejscu. Osoby zarejestrowane na Targi EuroLab mogą
również zwiedzać Targi CrimeLab bez konieczności dokonywana kolejnego
zgłoszenia.
Dogodny dojazd
Organizator zapewnia udogodnienia w zakresie dojazdu do Centrum TargowoKongresowego. Na targi będzie można dostać się bezpłatnym autobusem
targowym z przystanku autobusowego Emilii Plater 01 naprzeciwko Pałacu
Kultury i Nauki oraz pociągiem SKM lub Kolei Mazowieckich z dworca Warszawa
Śródmieście, Warszawa Wschodnia lub Warszawa Zachodnia. Stacja docelowa –
Warszawa Gocławek – znajduje się w odległości około 700 metrów od Centrum
MT Polska. Czas dojazdu pociągiem z centrum Warszawy do stacji docelowej nie
powinien przekroczyć 20 minut.
Więcej informacji na: www.targieurolab.pl.
Applied Biosystems 7500 Fast Real
Time PCR System, czyli Mercedes
wśród termocyklerów do analizy
PCR w czasie rzeczywistym
Rynek aparatury laboratoryjnej pęka w szwach od ilości różnych aparatów
przeznaczonych do amplifikacji w czasie rzeczywistym, dlatego też przed
przystąpieniem do zakupu tego nietaniego urządzenia warto zasięgnąć
opinii użytkowników na temat funkcji i wygody użytkowania.
Przedstawiamy recenzję maszyny 7500 Fast System znanego i cenionego
producenta — Applied Biosystems.
Co warto wiedzieć na początek?
Aparat ten pozwala na detekcję i kwantyfikację kwasów nukleinowych w formacie
96-dołkowym. Wykorzystując PCR pozwala na:
* ilościową detekcję docelowej sekwencji (targetu);
* jakościową detekcję targetu z użyciem analizy post-PCR (tzw. endpoint);
* jakościową analizę produktu PCR – z użyciem analizy krzywej topnienia
(post-PCR).
Urządzenie zbiera surowe dane pomiaru fluorescencji z różnych punktów
czasowych podczas reakcji, w zależności od rodzaju przeprowadzanego pomiaru:
* Real time:
– Krzywa standardowa
– Względna krzywa standardowa
– Porównawcze CT (ΔΔCT)
W powyższych pomiarach aparat zbiera dane po każdym etapie wydłużania w
danym cyklu.
* Post-PCR (endpoint):
– Genotypowanie
– Pomiar typu „obecność/brak”
W tych pomiarach aparat zbiera dane:
– przed reakcją (w przypadku pomiaru typu obecność/brak) – zalecane, lecz
nie obligatoryjne;
– (opcjonalnie) podczas PCR;
– po reakcji.
Aparat posiada 5 filtrów, umożliwiających wykorzystanie w reakcji następujących
barwników:
Filtr 1: FAMTM, SYBR® Green
Filtr 2: JOETM, VIC®
Filtr 3: TAMRATM, NEDTM, Cy3®
Filtr 4: ROXTM, Texas Red®
Filtr 5: Cy5®
Co więcej, system ten pozwala na przeprowadzanie reakcji w dwóch formatach:
* 96- dołkowych płytek (MicroAmp® Optical 96-well reaction plate with
barcode), do których zamknięcia używa się specjalnych taśm optycznych
(MicroAmp® Optical Adhesive film);
* 8- dołkowych pasków z zatyczkami (MicroAmp® Optical 8-tube strip).
Oprogramowanie przyjazne wszystkim
System ten posiada nieskomplikowane oprogramowanie i czytelny interfejs. Opcja
„Design Wizard” pozwala na zaprojektowanie pomiaru krok po kroku, prowadząc
użytkownika poprzez kolejne fazy ustawień. Natomiast, w przypadku braku czasu
na wpisanie danych początkowych, opcja „Quick-start” umożliwia natychmiastowe
rozpoczęcie reakcji, przy możliwości uzupełnienia danych po pomiarze. Program
pomaga także nowicjuszom – podaje przepis przygotowania próbek, wraz z
obliczeniem stężeń reagentów. Podczas reakcji, próbki problematyczne (brak
amplifikacji, szmery, nieczytelny pomiar) zostają oznaczone różnymi symbolami,
dzięki czemu łatwo określić rodzaj błędu. Co więcej, program udostępnia wygodną
opcję sygnalizacji końca reakcji – informacja ta może zostać wysłana do nas
mailem.
Po zakończonej reakcji, wszelkie dane pomiarowe (dane surowe, wyniki po
analizie) mogą zostać eksportowane do jednego pliku excell, jak również zapisane
w postaci obrazka w formacie JPEG (np. krzywe amplifikacji, wykresy ekspresji
genów).
Oszczędność czasu przede wszystkim
7500 Fast PCR System jak sama nazwa wskazuje umożliwia szybki pomiar –
standardowa reakcja PCR z użyciem sondy TaqMan wymaga jedynie około 30
minut, przy jednoczesnym zachowaniu czułości 1 kopii, w objętości zredukowanej
do 5 µl. Jest to możliwe dzięki zwiększeniu prędkości grzania bloku ( z 2,5°C na
5,5°C w jednostce czasu). Z nieco starszą wersją tego aparatu (7500 System)
analogiczna reakcja zachodzi w przeciągu 2 godzin.
Co dostaniemy oprócz urządzenia
Producent oprócz dostarczenia samego aparatu wraz z komputerem i
oprogramowaniem zapewnia nam kilka „drobiazgów”, takich jak początkowy
zestaw 96- dołkowych płytek (lub 8- dołkowych pasków), płytki do kalibracji
urządzenia (z barwnikami, sprawdzające poprawność działania wszystkich pięciu
filtrów), jak również zestaw przedmiotów ułatwiających nam pracę (podkładki pod
płytki, statywy na paski, przyrządy ułatwiające zamknięcie i otwarcie próbówek,
czy umieszczenie taśmy optycznej na płytce). Ponadto, w cenie oferowane jest
jednodniowe szkolenie przez przedstawiciela firmy.
Główne zalety
* Łatwość w obsłudze urządzenia oraz prostota oprogramowania;
* Możliwość pomiaru fluorescencji o różnej długości fali (5 filtrów wzbudzenia i 5
filtrów emisji);
* Różnorodność zastosowań – pomiary typu: krzywa standardowa, względna
krzywa standardowa, porównawcze CT, dyskryminacja alleliczna, obecność/brak;
* Możliwość szybkiej reakcji PCR oraz zredukowania objętości próbki do 5 µl;
* Możliwość przeprowadzania multiplex real time PCR (do 5 różnych targetów w
ramach jednej próbki).
Główne wady
* Przystosowanie urządzenia do innych produktów A. Biosystems (wszelkiego
rodzaju probówki, odczynniki) – jakościowo bardzo dobre, lecz drogie;
* Cena – średni koszt zakupu urządzenia to 100 000 zł, do tego dodać należy
wysoki koszt jego utrzymania;
* Oprogramowanie nie jest kompatybilne ze starszymi wersjami Windows®, jak
również spowalnia pracę niektórych komputerów (opinia stałych użytkowników..).
AM
PLEX-ID uznano za najlepsze
narzędzie
diagnostyczne
w
mikrobiologii
Aparat PLEX-ID zrobił prawdziwą furorę podczas styczniowego zjazdu Society for Applied Microbiology
w Londynie, gdzie zaprezentowano wyniki testów, w których PLEX-ID okazał się szybszy (czas analizy
tylko 8h) i znacznie dokładniejszy niż diagnostyka mikrobiologiczna w wydaniu tradycyjnym. Aparat
PLEX-ID, którego producentem jest firma Abbott uznano za najlepsze dostępne na rynku narzędzie
diagnostyczne w mikrobiologii.
PLEX-ID to platforma, dzięki której możliwa jest detekcja wszystkich znanych
chorobotwórczych bakterii, wirusów i grzybów. Jest to możliwe dzięki unikalnej
technologii łączącej w jednej maszynie automatyczny system izolacji kwasów
nukleinowych z materiału biologicznego, termocyklerów oraz spektrometrii
masowej. Maszyna posiada też dostęp do unikalnych baz wszystkich opisanych do
tej pory grzybów, wirusów i bakterii. Co więcej – maszyna może też wykonywać
detekcję zmutowanych, czy nawet nieznanych jeszcze patogenów. Urządzenie może
wykonać precyzyjną diagnostykę do 250 próbek dziennie.
PLEX-ID jest używany od kilku lat do celów badawczych, jednak jego cena powoduje, że nie jest wykorzystywany
na szeroką skalę. Aparat pierwotnie miał służyć do szybkiej detekcji zakażeń wąglikiem, czy później stosowany
był do identyfikacji SARS, czy nowych wirusów grypy.
Abbott planuje niebawem wprowadzić na rynek mniejsze urządzenie do rutynowej diagnostyki szpitalnej (obecny
model jest wysokosci dużej lodówki i zajmuje bardzo wiele miejsca), mogące wykonać detekcję patogenu
chorobotwórczego w ciągu zaledwie 5h, aby klinicyści mogli wdrożyć jak najszybsze i najskuteczniejsze leczenie
pacjenta.
Jedyną przeszkodą wydaje się być cena, a na urządzenie będą mogły sobie pozwolić prawdopodobnie tylko bardzo
duże i dobrze wyposażone placówki szpitalne.
Cena urządzenia to ok 750 000 $ netto.
Urządzenie nadal nie posiada certyfikacji CE-IVD.
Więcej: http://www.ibisbiosciences.com/products/plex-id-overview.html
Testujemy
spektrofotometr
NanoDrop Lite
Specjalnie dla Was przetestowaliśmy w naszym laboratorium najnowszy
spektrofotometr z serii NanoDrop – NanoDrop Lite. To najmniejsze i
najtańsze urządzenie z serii NanoDrop posiada bardzo wiele zalet i
oceniliśmy je bardzo wysoko. Rekomendujemy je do rutynowej pracy w
Waszych laboratoriach. Poniżej szczegółowe informacje dotyczące
testowanego urządzenia oraz wyniki pomiarów.
Opis urządzenia:
NanoDrop Lite firmy Thermo Scientific jest najnowszym i najkorzystniejszym cenowo produktem z serii
spektrofotometrów NanoDrop.
Jest to niewielkie urządzenie wielkości 16X11,5 cm o wadze 0,8 kg, służące do pomiarów stężeń DNA, RNA i
białek w kropli o objętości 1-1,5ul. Urządzenie wykonuje pomiar absorbancji przy długości fali wyłącznie dla 280 i
260 nm.Urządzenie jest zdecydowanie godne polecenia. Jest ergonomiczne, przyjazne w użytkowaniu. Ekran
urządzenia posiada bardzo czytelne menu, a samo urządzenie jest obsługiwane intuicyjnie – a więc jest bardzo
proste w obsłudze. NanoDrop Lite posiada pokrywę zamykającą powierzchnię roboczą, którą należy odchylić w
celu przeprowadzenia pomiaru. Kroplę roztworu (objętość 1-1,5ul) , którego stężenie będzie mierzone,
umieszcza się za pomocą pipety automatycznej w miejscu dedykowanym do przeprowadzania pomiaru. Następnie
zamyka się pokrywę i dokonuje pomiaru włączając przycisk „Measure”.
Przed przeprowadzeniem pomiarów urządzenie należy skalibrować za pomocą kropli wody. Sam pomiar trwa
kilka sekund (3-4 sekundy), a dane zapisywane są w pamięci urządzenia. Urządzenie praktycznie natychmiast
przelicza stężenia i podaje wynik w ng/ul oraz współczynnik A260/A280 informujący o zanieczyszczeniu
białkami. Pomiary dokonane za pomocą urządzenia NanoDrop Lite są powtarzalne, a wyniki, które nie odbiegają
od siebie (jak to często dzieje się w przypadku podobnie działających urządzeń – ale nie w przypadku
spektrofotometrów z serii NanoDrop).
Wyniki testów:
Do testów wykonaliśmy pomiary stężeń DNA w 28 próbkach. Pomiary wykonywane były w dniach 04.01.2013 (4
powtórzenia każdej próbki) oraz 2 dni później – 07.01.2013 (2 powtórzenia). Wyniki prezentujemy poniżej:
Jak wynika z powyższych danych, wyniki były zwykle powtarzalne, powtórzenie
pomiarów po dwóch dniach dawało porównywalne wyniki, a odchylenie
standardowe było akceptowalne. Z całą pewnością możemy polecić to urządzenie
do rutynowej pracy laboratoryjnej, nie wymagającej pomiarów absorbancji przy
długości fali 230 nm. Jest to urządzenie dedykowane do rutynowej pracy
laboratoryjnej z kwasami nukleinowymi i białkami, szczególnie polecane do
laboratoriów, gdzie wskazana jest oszczędność przestrzeni roboczej.Mimo
niewielkich rozmiarów, zdecydowanie jest to najbardziej wiarygodny i pewny
‘kalkulator’ DNA/RNA/białek na rynku. Oceniamy go bardzo wysoko i
rekomendujemy go jako urządzenie, które polecamy naszym czytelnikom.
Zalety NanoDrop Lite:
-Intuicyjna, bardzo prosta obsługa
-Bezpośrednia obsługa z panelu LCD, nie wymagająca podpięcia do komputera
-Gniazdo usb do transferu danych-Wielkość i waga.-Prosta i intuicyjna obsługa
-Szybkość pomiaru – kilka sekund
-Niewielka strata próbek – wymagany jest zaledwie 1ul próbki do pomiaru
-Pewność pomiaru – wysoce powtarzalne wyniki
-Korzystna cena
-Atrakcyjny design
-Praktycznie zerowe koszty materiałowe po zakupie urządzenia.
Wady:
-Ograniczenie zakresu detekcji (pomiar absorbancji tylko przy długości fali 260 i 280 nm). Dla bardziej
wymagających użytkowników polecamy inne wersje urządzenie NanoDrop.
-Brak jakichkolwiek dodatkowych zastrzeżeń
Ocena: 5/5
Rekomendacje:
-Bardzo wysoka jakość urządzenia. Nie znaleźliśmy jakichkolwiek słabych punktów urządzenia.
Polecamy!
Gdzie można kupić?
Dystrybutorem spektrofotometrów NanoDrop Lite jest TK Biotech z Warszawy.
Kinex – nowy, ciekawy produkt na
rynku
Kinex to nowy, ciekawy produkt na rynku, dedykowany biologii
molekularnej. Jest to gotowa 10x stężona mieszanina enzymatyczna do
szybkiej, 5 minutowej reakcji fosforylacji (kinazowania) oraz stępiania
produktów PCR i fragmentów DNA.
KineX to specjalnie opracowana mieszanina enzymów termostabilnych
pozwalająca w ciągu 5 min na fosforylację oraz stępianie fragmentów
DNA/produktów PCR w celu ich klonowania do popularnych wektorów
plazmidowych lub innych aplikacji. Producentem odczynnika jest polska firma
A&A Biotechnology.