8. CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA

8. CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA
opracował: Wojciech Zapała
I. WPROWADZENIE
Chromatografia cieczowa naleŜy do najwaŜniejszych metod analizy mieszanin
róŜnorodnych związków chemicznych. Polega ona na zróŜnicowanej szybkości migracji
cząsteczek
poszczególnych
składników
mieszaniny
w
odpowiednio
dobranym
i zoptymalizowanym układzie chromatograficznym. KaŜdy układ chromatograficzny składa
się z trzech elementów:
•
fazy ruchomej (eluent),
•
fazy stacjonarnej (adsorbent),
•
chromatografowana substancja (analit) zawierająca jedną lub wiele związków
chemicznych.
Proces chromatografii najkrócej moŜna zdefiniować jako rozdział poprzez zetknięcie dwu
faz będących we względnym ruchu, przy maksymalnie rozwiniętej powierzchni kontaktu.
Oczywiście jest to definicja bardzo uproszczona, tym nie mniej po jej rozwinięciu moŜna
dokonać klasyfikacji rodzajów i technik chromatograficznych. JeŜeli fazą ruchomą jest gaz, to
mamy do czynienia z chromatografią gazową (ang. Gas Chromatography, GC), jeŜeli fazą
ruchomą jest ciecz – mówimy o chromatografii cieczowej (ang. Liquid Chromatography, LC).
JeŜeli natomiast faza ruchoma będzie płynem w stanie nadkrytycznym – mówimy
o chromatografii nadkrytycznej (ang. Supercritical Liquid Chromatography). Proces
chromatografii moŜna prowadzić metodą kolumnową lub na płaszczyźnie – w tym drugim
rodzaju stosowanym tylko w chromatografii cieczowej, mówimy o chromatografii
cienkowarstwowej (ang. Thin–Layer Chromatography, TLC) lub planarnej (ang. Planar
Chromatography, PLC). Dalszego podziału moŜna dokonać z punktu widzenia mechanizmu
retencji na: chromatografię adsorpcyjną, podziałową, jonowymienną, Ŝelową, wykluczania
itp. Dokładniejszy podział rodzajów i technik chromatograficznych moŜna znaleźć między
innymi w monografii Zygfryda Witkiewicza pt. „Podstawy Chromatografii” [1]. Stosując
polarne adsorbenty (np. Ŝel krzemionkowy), jako fazy ruchome wykorzystuje się
rozpuszczalniki niepolarne lub słabo polarne takie jak np. heksan, heptan, izooktan,
chloroform. W tym przypadku mówimy o chromatografii cieczowej prowadzonej
w normalnym układzie faz (ang. Normal–Phase High Performance Liquid Chromatography,
NP–HPLC). JeŜeli natomiast faza stacjonarna jest niepolarna lub słabo polarna, a stosowane
fazy ruchome stanowią rozpuszczalniki polarne (np. tetrahydrofuran, acetonitryl, metanol lub
woda), mówimy wtedy o chromatografii cieczowej prowadzonej w odwróconym układzie faz
(ang. Reversed–Phase High Performance Liquid Chromatography, RP–HPLC). NaleŜy przy
tym zauwaŜyć, Ŝe chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz jest obecnie
znacznie częściej stosowana niŜ chromatografia w normalnym układzie faz. Fakt ten wynika
ze znacznej hydrofilowości polarnych adsorbentów, które silnie adsorbują wodę występującą
w śladowych ilościach w rozpuszczalnikach, wskutek czego aktywność adsorbentu bardzo
szybko maleje, a tym samym maleje zdolność rozdzielcza kolumny. PowyŜsze zjawisko nie
występuje na niepolarnych, hydrofobowych adsorbentach stosowanych w RP–HPLC, przez
co takie kolumny mogą pracować przez bardzo długi czas. W tabeli 1. przedstawiono
przykłady najczęściej stosowanych faz stacjonarnych i ruchomych wraz z ich zastosowaniami
[1].
Tabela 1. Przykładowe zastosowania chromatografii cieczowej prowadzonej w normalnym i
odwróconym układzie faz.
FAZA STACJONARNA
śel krzemionkowy
Związana faza aminowa,
cyjanowa lub diolowa
Związana faza aminowa,
cyjanowa lub diolowa
Związana faza dimetylowa
RP–2
Związana faza oktylowa
RP–8
Związana faza
oktadecylowa RP–18
Związana faza
triakontylowa RP–30
FAZA RUCHOMA
Normalny układ faz
Heksan, heptan, chloroform,
izopropanol
ROZDZIELANE SUBSTANCJE
Etery, estry, nitrozwiązki, porfiryny,
mykotoksyny, witaminy rozpuszczalne w oleju,
herbicydy, itp
Heksan, heptan, chloroform,
Cukry, steroidy, nitrozwiązki, aminokwasy
izopropanol
Odwrócony układ faz
Związki koronowe, aminy, fenole, steroidy,
witaminy rozpuszczalne w wodzie
Woda, metanol,
tetrahydrofuran, acetonitryl,
izopropanol
Aminy, fenole, steroidy, witaminy rozpuszczalne
w wodzie, flawonoidy
Wielopierścieniowe związki aromatyczne,
karotenoidy, tokoferole, izomery witaminy A,
fulereny, proteiny
Przy właściwie dobranym układzie chromatograficznym, po wprowadzeniu na szczyt
kolumny (albo na linię startu na płytce TLC) roztworu zawierającego mieszaninę związków
chemicznych, następuje ich rozdział. W zaleŜności od siły oddziaływań pomiędzy
składnikami rozdzielanej mieszaniny a fazą stacjonarną (adsorbentem), pojedyncze
(rozdzielone) składniki opuszczają kolumnę w róŜnym czasie. Piki odpowiadające
poszczególnym substancjom są rejestrowane przez odpowiedni detektor w postaci
chromatogramu. Czas przebywania substancji chromatografowanej w kolumnie liczony od
momentu jej wprowadzenia do kolumny do czasu wyjścia maksimum piku nazywamy czasem
retencji. Tak zdefiniowany czas nazywamy całkowitym czasem retencji, tr – patrz rys. 1.
NaleŜy zaznaczyć, Ŝe czas retencji ma sens termodynamiczny, tylko pod warunkiem stałej
wartości natęŜenia przepływu eluentu.
tr2
Sygnał z detektora
2.0
1.5
tr1
1.0
t0
0.5
0.0
pik substancji inertnej
0
2
4
pik składnika 2
pik składnika 1
6
8
10
12
14
16
Czas
Rys. 1. Wielkości retencyjne mieszaniny dwuskładnikowej rozdzielanej za pomocą
chromatografii kolumnowej.
Całkowity czas retencji jest sumą dwóch czasów: czasu w którym substancja
chromatografowana przed opuszczeniem kolumny oddziałuje z adsorbentem i czasu
potrzebnego do opuszczenia kolumny przez substancję nie oddziaływującą z adsorbentem
(składnik inertny układu). Ten drugi czas nazywany jest czasem retencji substancji inertnej
lub czasem martwym retencji, t0 – patrz rys. 1.
Kolejną wielkością charakteryzującą retencję w chromatografii cieczowej jest tak zwany
zredukowany czas retencji, t’r, opisujący czas przebywania substancji w kolumnie tylko
w wyniku jej oddziaływań z adsorbentem (patrz rys. 1.):
(1)
WyraŜanie retencji za pomocą czasu retencji utrudnia porównanie poszczególnych
układów chromatograficznych (róŜne wymiary kolumny, róŜne prędkości przepływu fazy
ruchomej powodują uzyskanie róŜnych wartości czasów retencji). DuŜo bardziej
obiektywnym parametrem pozwalającym na np. porównanie przebiegu retencji w róŜnych
układach chromatograficznych jest bezwymiarowy współczynnik retencji, k, określający ile
razy dłuŜej substancja chromatografowana przebywa w kolumnie w wyniku oddziaływań
z adsorbentem w stosunku do sytuacji, gdyby takie oddziaływania nie miały miejsca:
(2)
gdzie: ki – współczynnik retencji i – tego składnika, tri – czas retencji i– tego składnika,
t0 – czas martwy retencji (czas retencji składnika inertnego układu).
Im większa jest wartość współczynnika retencji, tym silnie substancja chromatografowana
oddziałuje z fazą stacjonarną w kolumnie.
Nieco inaczej proces retencji związków chemicznych wygląda w chromatografii
planarnej. Chromatografia cienkowarstwowa (planarna) jest metodą bardzo szeroko
stosowaną zarówno w laboratoriach analitycznych jak i zakładach przemysłowych. Pozwala
ona na szybkie i stosunkowo tanie przeprowadzenie analizy jakościowej i ilościowej
badanych próbek. W chromatografii cienkowarstwowej przy właściwie dobranym układzie
chromatograficznym, po naniesieniu na płytkę pokrytą warstwą adsorbentu niewielkiej ilości
rozdzielanej mieszaniny, a następnie po rozwinięciu chromatogramu w odpowiedniej
komorze i jego ewentualnej wizualizacji, otrzymamy szereg plamek odpowiadających
poszczególnym, rozdzielonym związkom chemicznym (patrz rys. 2).
Rys. 2. Schematyczny chromatogram TLC.
Podstawową wielkością, jaką wyznacza się z chromatografu TLC jest współczynnik
opóźnienia (ang. retardation factor), Rf. Jak to pokazano na rys. II, współczynnik opóźnienia
definiowany jest jako stosunek drogi migracji substancji chromatografowanej od linii startu
do środka plamki (B), do drogi przebytej przez czoło fazy ruchomej (A):
(3)
Wartości współczynnika opóźnienia, Rf, charakteryzują zachowanie się chromatografowanej
substancji
w
danym
układzie
chromatograficznym.
W
zaleŜności
od
układu
chromatograficznego wartość Rf substancji moŜe przyjmować wartości z przedziału 0≤ Rf ≤1.
Substancja bardzo silnie adsorbująca się w danym układzie osiąga wartość Rf = 0 (zostaje na
linii startu ). Gdy jej adsorpcja jest natomiast minimalna wędruje z czołem fazy ruchomej
i wówczas jej Rf = 1.
Jednym z celów analitycznych, wykorzystujących chromatografie cienkowarstwową, jest
rozdział próbki (mieszaniny) na pojedyncze składniki. Prowadząc analizę nieznanej
mieszaniny moŜemy na podstawie wartości Rf wzorców substancji i wartości Rf substancji
otrzymanych z rozdzielenia mieszaniny określić jej skład jakościowy.
Na wartość Rf analizowanej substancji ma wpływ wiele czynników:
•
rodzaj i jakość adsorbentu (rozkład wielkości ziarna, jednorodność warstwy
adsorbentu, grubość warstwy adsorbentu),
•
rodzaj i skład eluentu,
•
struktura i własności fizykochemiczne analizowanych substancji,
•
temperatura,
•
kształt i wielkość naniesionej na płytkę plamki (dokładność dozowania, ilość
naniesionej substancji),
•
warunki prowadzenia procesu (kształt i wielkość komory chromatograficznej, stopień
wysycenia komory parami fazy ruchomej).
Wszystkie w/w czynniki mogą powodować odstępstwa kształtów plamek od idealnie
symetrycznego. PowyŜsze czynniki wpływają bowiem na liniowość izotermy adsorpcji
testowanej substancji. W niektórych układach moŜe występować tzw. „ogonowanie”
substancji. W takim przypadku wartość Rf substancji określamy na podstawie maksymalnego
stęŜenia w ogonującej próbce, biorąc pod uwagę środek najintensywniej zabarwionego
(świecącego) obszaru plamki. Jednocześnie bardzo silne ogonowanie próbki moŜe
wskazywać na źle dobrany układ chromatograficzny.
PoniewaŜ chromatografia cienkowarstwowa bardzo często wykorzystywana jest do
wstępnego doboru układu chromatograficznego dla chromatografii kolumnowej, bardzo
często
wykorzystuje
się
związek
pomiędzy
współczynnikiem
opóźnienia,
Rf,
a współczynnikiem retencji, k, dany zaleŜnością:
(4)
Proces chromatograficzny moŜna ogólnie zdefiniować jako zespół wzajemnych
„konkurencyjnych” oddziaływań cząsteczek związków chemicznych rozdzielanej mieszaniny
(w przypadku chromatografii cieczowej – dodatkowo składników fazy ruchomej) z fazą
stacjonarną. Oddziaływania te wpływają na róŜne zachowanie się związków chemicznych
w kolumnie i w efekcie prowadzą do rozdzielenia mieszaniny, której składniki opuszczają
układ w róŜnych czasach retencji. Zjawisko wolniejszej migracji składników rozdzielanej
mieszaniny niŜ wynosi prędkość przepływu eluentu nazywamy retencją (opisywaną
współczynnikiem retencji (k)). Gdy kaŜdy składnik mieszaniny wprowadzonej do układu
chromatograficznego wykazuje zróŜnicowaną retencję, układ chromatograficzny jest
selektywny wobec składników rozdzielanej mieszaniny. Dobór odpowiedniego układu
chromatograficznego zapewniającego zadowalającą selektywności i sprawności rozdzielania
zarówno w analityce, jak i w zastosowaniach preparatywnych polega na właściwym wybraniu
odpowiedniej fazy stacjonarnej (wypełnienia kolumny, albo sorbentu w chromatografii
cienkowarstwowej), odpowiedniego składu eluentu (w chromatografii prowadzonej
w warunkach izokratycznych), albo programu elucji (w chromatografii prowadzonej
w warunkach gradientowych) oraz korzystnego dla sprawności rozdzielania stęŜenia
i objętości wprowadzanej do kolumny (lub nanoszonej na płytkę TLC) mieszaniny.
W chromatografii cienkowarstwowej najprostszym sposobem określenia selektywność
rozdziału plamek poszczególnych substancji jest zwykle parametr ∆ , definiowany zgodnie
z oznaczeniami na rys. 2. jako:
∆ (5)
gdzie: Rfa i Rfb są współczynnikami opóźnienia wyznaczonymi odpowiednio dla
substancji a i b.
Im większe wartości przyjmie ∆Rf, tym ujmując problem w uproszczony sposób,
w chromatografii kolumnowej uzyskamy lepszą selektywność rozdziału.
W chromatografii najczęściej stosuje sie dwuskładnikowe fazy ruchome. Skład fazy
ruchomej powinien być tak dobrany, aby zapewnić optymalną zdolność rozdzielczą układu.
Rozpuszczalniki wchodzące w skład fazy ruchomej nie powinny:
•
reagować w sposób nieodwracalny z faza nieruchoma,
•
reagować w sposób nieodwracalny z chromatografowana substancją,
•
zawierać nawet śladowych ilości zanieczyszczeń.
W chromatografii cieczowej składniki faz ruchomych róŜnią się siłą elucji. Mieszając
poszczególne rozpuszczalniki w odpowiednich proporcjach moŜna zatem sterować globalną
siłą elucji fazy ruchomej. Pomocnymi w wyborze odpowiedniego składu fazy ruchomej są
tzw. szeregi eluotropowe. Są to empiryczne zestawienia rozpuszczalników od najmniej
polarnych do silnie polarnych uporządkowane dla danego typu adsorbentu. JeŜeli składniki
fazy ruchomej znacznie róŜnią się siłą elucji, to podczas rozwijania chromatogramu moŜe
wystąpić zjawisko demiksji. Na skutek selektywnej adsorpcji składników mieszanej fazy
ruchomej na płytce tworzą sie strefy o róŜnym składzie, na granicy których tworzy sie front
zwany frontem demiksji. O obecności frontu demiksji moŜemy się przekonać, gdy
chromatografowana substancja znajdzie sie na jego czole. Wówczas jej plamka będzie
spłaszczona i rozmyta w kierunku prostopadłym do poruszania sie fazy ruchomej.
II. CEL ĆWICZENIA
1. Zapoznanie sie z technika chromatografii planarnej,
2. Poznanie
zasad
doboru
optymalnych
warunków
prowadzenia
procesu
chromatograficznego,
3. Poznanie warunków jakościowej analizy mieszaniny dwuskładnikowej.
III. CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA
III.1. Aparatura doświadczalna i odczynniki
•
komory do chromatografii planarnej,
•
kolbki o poj. 25 cm3 zawierające testowe substancje,
•
płytki chromatograficzne RP–18 F254s,
•
lampa UV,
•
lampa kwarcowa,
•
pipetki lub strzykawka analityczna do nanoszenia substancji na płytki,
•
metanol o czystości chromatograficznej,
•
woda demineralizowana,
•
kwercetyna o czystości analitycznej,
•
chryzyna o czystości analitycznej.
III.2. Metodyka badań
Przygotować roztwory metanolu i wody o stęŜeniach objętościowych 50%, 60%, 70%
i 80% objętościowych metanolu w wodzie. Roztwory te zostaną uŜyte jako fazy ruchome.
Przygotowanymi roztworami napełnić odpowiednie komory do TLC tak, aby poziom
zwierciadła cieczy w komorze nie przekraczał wysokości 0,5 cm. Komory następnie szczelnie
zamknąć i pozostawić przez co najmniej jedną godzinę w stałej temperaturze wynoszącej
20oC aŜ do ustalenia się warunków równowagi ciecz – para.
Przygotować roztwory chryzyny, kwercetyny i mieszaniny obu tych związków
w odpowiednich eluentach. StęŜenia poszczególnych roztworów określi prowadzący zajęcia.
Przygotować odpowiednią ilość płytek chromatograficznych o wymiarach 5 x 10 cm.
Na płytkach, miękkim ołówkiem zaznaczyć linię startu (około 0,5 cm od dolnej krawędzi)
i linię mety (około 0,5 cm od górnej krawędzi płytki). Przy pomocy pipetek nanieść na linię
startu poszczególnych płytek przygotowane wcześniej odpowiednie roztwory chryzyny,
kwercetyny i mieszaniny. Płytki wysuszyć pod lampą kwarcową. Umieścić płytki
w komorach. Poczekać na rozwinięcie się chromatografów – za koniec procesu uznajemy
osiągnięcie przez czoło fazy ruchomej linii mety. Po rozwinięciu chromatogramów, wyjąć
płytki z komór i umieścić pod lampą UV. Wizualizację prowadzić przy długości fali 254 nm.
Miękkim ołówkiem obrysować uzyskane plamki. Następnie posługując się odpowiednimi
przyborami wyznaczyć wartości Rf dla pojedynczych substancji i wartość ∆Rf dla mieszaniny
dla kaŜdego analizowanego układu chromatograficznego.
III.3. Opracowanie i dyskusja wyników pomiarów
Wyniki pomiarów zestawić w tabeli:
Lp.
1
2
3
4
Układ
50% MeOH
60% MeOH
70% MeOH
80% MeOH
Rfchryz
Rfkwercet
∆Rf
Przeprowadzić dyskusję wyników wskazując układ chromatograficzny umoŜliwiający
uzyskanie największej selektywność rozdziału mieszaniny. Na podstawie wykonanego
wykresu zaleŜności Rf=f(φ) (φ jest ułamkiem objętościowym metanolu w wodzie) omówić
wpływ składu fazy ruchomej na wartości współczynników opóźnienia pojedynczych
substancji.
IV. LITERATURA
[1] Z. Witkiewicz, „Podstawy Chromatografii”, WNT Warszawa, 2000