Nr kat. IR088

FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Human
Prostein
Clone 10E3
Ready-to-Use
(Link)
Nr kat. IR088
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciała FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Prostein, Clone 10E3 Ready-to-Use (Link) są przeznaczone do
stosowania w immunohistochemii w aparatach Autostainer Link. Przeciwciała te są stosowane do identyfikacji
gruczolakoraków gruczołu krokowego (1). Interpretacja kliniczna wystąpienia barwienia lub jego braku musi być
uzupełniona o badania morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być
przeprowadzana przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań
diagnostycznych.
Synonimy antygenu
P501S (2)
Streszczenie
i informacje ogólne
Monoklonalne mysie przeciwciała przeciwko prosteinie rozpoznają białko złoŜone z 553 aminokwasów
zidentyfikowane z zastosowaniem biblioteki cDNA metodą subtrakcyjną, w połączeniu z masowym badaniem w
kierunku raka gruczołowego gruczołu krokowego przy uŜyciu mikromacierzy (3). Białko prosteina (ang. prostein),
nazywana równieŜ P501S, jest białkiem błon komórkowych typu IIIa wykazującym ekspresję wyłącznie w komórkach
prawidłowych i komórkach nowotworów złośliwych gruczołu krokowego, co potwierdzono z zastosowaniem metod
Northern blot, mikromacierzy cDNA, reakcji PCR w czasie rzeczywistym i metod immunohistochemicznych (1, 3).
Ekspresja prosteiny nie została dotąd wykryta w innych prawidłowych bądź nowotworowych tkankach gruczołowych
poza 2/35 przypadkami raka z komórek nabłonka dróg moczowych, w których odczyn immunologiczny był słaby i
występował jedynie w mniej niŜ 25% komórek guza (1, 3, 4).
Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub instrukcje do
systemu detekcji IHC.
Odczynnik
dostarczony
Immunogen
Swoistość
(123725-001)
Gotowe do uŜycia mysie przeciwciało monoklonalne jest dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym
białko stabilizujące i azydek sodu w stęŜeniu 0,015 mol/L.
Klon: 10E3 (1). Izotyp: IgG2a, kappa.
Rekombinowana skrócona prosteina zawierająca aminokwasy 341-527 (1).
Wykazano, Ŝe monoklonalne mysie przeciwciała przeciwko prosteinie reagują z rekombinowanowanym fragmentem
prosteiny 21 kDa i z dubletem 50 kD obecnym w testach typu Western blot lizatów komórek HEK293
transfekowanych prosteiną. Przeciwciała przeciwko prosteinie wykrywały takŜe dublet 50 kD w testach typu blot
lizatów komórek nowotworowych gruczołu krokowego LNCaP i PC3, nie wykazując natomiast reaktywności w
testach typu Western blot z komórkami Du145 ujemnymi na obecność prosteiny i nietransfekowanymi komórkami
HEK293 (1). Przeprowadzono mapowanie determinanty antygenowej rozpoznawanej przez przeciwciała przeciwko
prosteinie z zastosowaniem nakładających się peptydów, obejmujących sekwencję aminokwasów immunogenu
przeciwciała przeciwko prosteinie. W testach ELISA determinantę antygenową rozpoznawaną przez przeciwciało
przeciwko prosteinie zlokalizowano na aminokwasach 439-459 sekwencji prosteiny (1). Swoistość przeciwciał
przeciw prosteinie badano takŜe metodą cytometrii przepływowej na komórkach B utrwalonych EBV (B-LCL) trwale
transdukowanych retrowirusem wykazującym ekspresję prosteiny lub nieistotną cząsteczką HLA-B8. Wykazano, Ŝe
przeciwciała przeciwko prosteinie dają swoisty odczyn z komórkami B-LCL (po uprzednim spowodowaniu
przepuszczalności błony) transdukowanymi tak, aby wykazywały ekspresję prosteiny. Przeciwciała nie były
reaktywne z komórkami wykazującymi ekspresję HLA-B8 (1). Przeprowadzona metodą cytometrii przepływowej
analiza linii komórkowych LNCaP, PC3 i DU145 z przeciwciałami przeciwko prosteinie wykazała odczyn
skorelowany z danymi ilościowymi uzyskanymi z reakcji odwrotnej transkrypcji PCR. W przypadku komórek
przerzutów raka gruczołowego gruczołu krokowego z linii LNCaP odczyn był silniejszy niŜ w wypadku komórek raka
gruczołowego gruczołu krokowego PC3, zaś w przypadku komórek rakowych DU145 reaktywności nie stwierdzono
(3).
P02768PL_001_IR088/2013.03 str. 1/4
Środki ostroŜności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny w czystej postaci związek chemiczny – azydek sodu (NaN3). Azydek
sodu zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z
elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków
metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydków metalu w kanalizacji.
3.
Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z rozporządzeniami lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi.
Przechowywanie
Skrócona instrukcja
uŜytkownika
Przechowywać w temperaturze 2-8 °C. Nie nale Ŝy uŜywać odczynników po upływie terminu waŜności podanego na
fiolce. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować
takie warunki. Nie ma wyraźnych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem
próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole pozytywne i negatywne. W przypadku uzyskania
nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, i gdy
podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Krok
Comments (Komentarze)
Utrwalanie
Obróbka wstępna
Formalina
EnVision FLEX™, High pH (nr kat. K8004)
ND
20 min HIER, 3 w 1 z uŜyciem PT Link i
PT Link Rinse Station
Rozcieńczenie
Bufor
rozcieńczenia
Kontrola
negatywna
Wizualizacja
Produkt gotowy do uŜycia
Produkt rozcieńczony fabrycznie
Inkubacja 20 min
FLEX Negative Control, Mouse (nr kat. IR750)
Inkubacja 20 min
EnVision™ FLEX, High pH (nr kat.
K8000/K8010)
Inkubacja 20 min, inkubacja w
odczynniku DAB+ 2x5 min
Barwnik
kontrastowy
Tkanka kontrolna
EnVision™ FLEX Hematoxylin (nr kat.
K8008/K8018)
Gruczoł krokowy
Inkubacja 5 min
Szkiełka
FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020)
Zaleca się stosowanie w celu uzyskania
lepszego przylegania skrawków
tkankowych do szkiełek.
Zatapianie
preparatu
Wymagane niewodne, trwałe zatapianie
preparatów
Po przeprowadzeniu barwienia, skrawki
muszą być odwodnione, oczyszczone i
zakryte za pomocą środka do trwałego
zatapiania.
Oprzyrządowanie
Autostainer Link 48 i Autostainer Plus
NaleŜy stosować fiolki dostosowane do
aparatu (nr kat. SK200-SK203 i S3425)
Odczyn cytoplazmatyczny
*UŜytkownik jest zobowiązany przeczytać ulotki dostarczane do opakowań, które zawierają dokładne instrukcje przeprowadzania
procedury barwienia i postępowania z produktem.
Przygotowanie
próbek
Skrawki parafinowe: przeciwciała mogą być wykorzystywane do znakowania skrawków utrwalonych w formalinie i
zatopionych w parafinie. Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o grubości około 4 µm.
Obróbka wstępna: wymagane jest poddanie utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych cieplnemu odmaskowaniu determinanty antygenowej (HIER). Optymalne wyniki uzyskuje się po
przeprowadzeniu na tkankach wstępnej obróbki HIER przy uŜyciu rozcieńczonego roztworu EnVision™ FLEX Target
Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat. K8000/K8004). Odparafinowanie, nawodnienie i cieplne odmaskowanie
determinanty antygenowej (HIER) moŜna przeprowadzić z uŜyciem aparatu Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101).
Szczegółowe informacje zawiera instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link (PT Link User Guide). W aparacie PT Link
naleŜy ustawić następujące parametry pomiarowe: temperatura wstępnego ogrzewania: 65°C; temperatura i czas
odmaskowania determinanty antygenowej: 97°C przez 2 0 minut (±1 min); schłodzenie do 65°C. Usun ąć magazynek
na szkiełka z preparatami ze zbiornika PT i natychmiast zanurzyć szkiełka w naczyniu/zbiorniku (np. PT Link Rinse
Station, nr kat. PT109) zawierającym rozcieńczony bufor o temperaturze pokojowej EnVision™ FLEX Wash Buffer
(20x) (nr kat. K8007). Zostawić szkiełka w buforze Wash Buffer na 1-5 minut.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie
szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). Po przeprowadzeniu barwienia, skrawki muszą być
odwodnione, oczyszczone i zatopione w środku do trwałego zatapiania.
Procedura barwienia
Wizualizacja: zalecanym system wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH (Link) (nr kat. K8000).
Program: w systemie Autostainer Link wstępnie zaprogramowano etapy odczynu i czasy inkubacji. Zalecana
objętość uŜytego odczynnika to 1 x 200 µl lub 2 x 150 µl na szkiełko z preparatem. Szczegółowe informacje
dotyczące wkładania szkiełek mikroskopowych i odczynników przedstawiono w Instrukcji uŜytkownika aparatu
Autostainer Link. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym systemie Autostainer Link, naleŜy skontaktować się z
działem wsparcia technicznego firmy Dako. Instalator oprogramowania Autostainer Link jest dostępny do pobrania
ze strony internetowej www.dako.com\Installer. Uzupełni on oprogramowanie aparatu DakoLink o dane protokołu i
odczynnika dotyczące przeciwciał Anti-Human Prostein, Clone 10E3. Skrócona nazwa protokołu dla tego
przeciwciała to „Prostein”. Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej.
(123725-001)
P02768PL_001_IR088/2013.03 str. 2/4
Barwienie kontrastowe: zalecanym barwnikiem kontrastowym jest EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (nr
kat. K8008). W celu uzyskania optymalnych wyników zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do
zatapiania.
Próby kontrolne: równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i
ujemne próby kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Tkankowa kontrola dodatnia powinna obejmować gruczoł
krokowy, a komórki/struktury powinny wykazywać odczyn taki, jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka
działania”. Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative Control, Mouse (Link) (nr kat. IR750).
Interpretacja
wybarwienia
Charakterystyka
działania
Odczyn komórkowy ma charakter cytoplazmatyczny.
Tkanki prawidłowe: wykazano reaktywność immunologiczną przeciwciał przeciwko prosteinie wobec luminalnych
komórek nabłonkowych prawidłowego gruczołu krokowego, nie stwierdzono natomiast reaktywności w przypadku
wszystkich pozostałych badanych typów tkanek prawidłowych (1, 2, 5).
Rodzaj tkanki
(liczba
badanych
przypadków)
Nadnercza (3)
Szpik kostny (3)
Gruczoły sutkowe (3)
Składniki tkankowe dające
dodatni odczyn
MóŜdŜek (3)
0/3
Rodzaj tkanki
(liczba badanych
przypadków)
Trzustka (3)
Przytarczyce (3)
Przysadka
mózgowa (3)
Gruczoł krokowy (3)
Mózgowie (3)
0/3
Ślinianki (3)
3/3
luminalne
komórki
nabłonkowe (40-90%), odczyn
cytoplazmatyczny
0/3
Szyjka macicy (3)
0/3
Mięśnie szkieletowe
0/3
Jelito grube (3)
0/3
Skóra (3)
0/3
Przełyk (3)
0/3
Jelito cienkie (3)
0/3
Serce (3)
0/3
Śledziona (3)
0/3
0/3
0/3
0/3
Składniki tkankowe dające
dodatni odczyn
0/3
0/3
0/3
Nerki (3)
0/3
śołądek (3)
0/3
Wątroba (3)
0/3
Jądra (3)
0/3
Płuca (3)
0/3
Grasica (3)
0/3
Komórki międzybłonka
(3)
Nerwy obwodowe (3)
0/3
Tarczyca (3)
0/3
0/3
Migdałki (3)
0/3
Jajniki (3)
0/3
Macica (3)
0/3
Tkanki nieprawidłowe: w ramach testów na wielu róŜnych tkankach nowotworowych wykazano brak reaktywności
immunologicznej przeciwciał przeciwko prosteinie wobec większości badanych tkanek nowotworów złośliwych nie
pochodzących z gruczołu krokowego. Wykazano reaktywność immunologiczną na prosteinę wśród większości
tkanek nowotworów pierwotnych i przerzutowych gruczołu krokowego (1, 2, 4-8). Nie stwierdzono korelacji między
ekspresją prosteiny a oceną w skali Gleasona ani statusem przerzutu (1).
Piśmiennictwo
(123725-001)
1.
Kalos M, Askaa J, Hylander BS, Repasky EA, Cai F, Vedvick T, et al. Prostein expression is highly restricted to
normal and malignant prostate tissues. Prostate 2004; 60:246.
2.
Yin M, Dhir R, Parwani AV. Diagnostic utility of p501s (prostein) in comparison to prostate specific antigen
(PSA) for the detection of metastatic prostatic adenocarcinoma. Diagn Pathol 2007; 2:4.1
3.
Xu J, Kalos M, Stolk JA, Zasloff EJ, Zhang X, Houghton RL, et al. Identification and characterization of prostein,
a novel prostate-specific protein. Cancer Res 2001; 61:1563.
4.
Chuang A-Y, DeMarzo AM, Veltri RW, Sharma RB, Bieberich CJ, Epstein JI. Immunohistochemical
differentiation of high-grade prostate carcinoma from urothelial carcinoma. Am J Surg Pathol 2007; 31:1246-55.
5.
Sheridan T, Herawi A, Epstein JI, Illei PB. The role of P501S and PSA in the diagnosis of metastatic
adenocarcinoma of the prostate. Am J Surg Pathol 2007; 31:1351-5.
6.
Owens CL, Epstein JI, Netto GJ. Distinguishing prostatic from colorectal adenocarcinoma on biopsy samples:
the role of morphology and immunohistochemistry. Arch Pathol Lab Med 2007; 131:599-603.
7.
Wang W, Epstein JI. Small cell carcinoma of the prostate: a morphological and immunohistochemical study of
95 cases. Am J Surg Pathol 2008; 32:65-7.1
8.
Osunkoya AO, Netto GJ, Epstein JI. Colorectal adenocarcinoma involving the prostate: report of 9 cases.
Human Pathol 2007; 38:1836-41.
P02768PL_001_IR088/2013.03 str. 3/4
Wydanie 03/13
(123725-001)
P02768PL_001_IR088/2013.03 str. 4/4