pobierz plik - Wydział Biologii UW

Areta Magda Czerwińska
Autoreferat rozprawy doktorskiej zatytułowanej
„Rola czynnika transkrypcyjnego Pax-7 w różnicowaniu mysich zarodkowych
komórek macierzystych”
Pracę wykonano w Zakładzie Cytologii na Wydziale Biologii Uniwersytetu
Warszawskiego
Promotor:
prof. Maria Anna Ciemerych-Litwinienko
Recenzenci: prof. Grażyna Korczak-Kowalska (Zakład Immunologii, Wydział
Biologii Uniwersytetu Warszawskiego)
dr hab. Jarosław Czyż (Zakład Biologii Komórki, Wydział
Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego)
Choroby i urazy mogą prowadzić do zaburzeń naturalnego mechanizmu
odbudowy
mięśni
sytuacjach
są
uszkodzonej
szkieletowych.
przeszczepy
tkanki.
Potencjalnym
komórek,
Szerokie
które
spektrum
sposobem
mogłyby
możliwości
terapii
umożliwić
w
zakresie
w
takich
odtworzenie
medycyny
regeneracyjnej dają komórki pluripotencjalne, czyli zdolne do różnicowania
we wszystkie rodzaje komórek budujących organizm. Takimi komórkami są między
innymi zarodkowe komórki macierzyste, czyli komórki ES (ang. Embryonic Stem).
Co istotne, komórki ES są zdolne do samoodnawiania swojej populacji i zachowania
niezróżnicowanego charakteru w hodowli in vitro. Aby możliwe było zastosowanie
komórek ES w medycynie, mechanizmy regulujące ich różnicowanie muszą zostać
dogłębnie poznane. Należy także opracować wydajne metody uzyskiwania z nich
wybranych rodzajów komórek.
Celem badań, których wyniki zostały opisane w niniejszej rozprawie
doktorskiej było stwierdzenie, czy różnicowanie mysich komórek ES w mioblasty
przebiega tak samo jak różnicowanie mięśniowych komórek prekursorowych
w trakcie rozwoju zarodkowego. Podjęto także próbę odpowiedzi na pytanie o udział
białka Pax-7 w tym procesie. Czynnik transkrypcyjny Pax-7 odgrywa nadrzędną rolę
w czasie zarodkowej miogenezy. Nie wiadomo jednak, czy białko to jest równie
istotne w trakcie różnicowania komórek ES. Aby to zweryfikować, uzyskano 63 linie
mysich komórek ES: 6 pozbawionych genu kodującego funkcjonalny Pax-7
(Pax7-/-), 33 o genotypie Pax7+/- oraz 24 linie kontrolne (Pax7+/+). Następnie
dokonano analizy kariotypu uzyskanych linii komórkowych i na tej podstawie
1
wybrano
do
dalszych
doświadczeń
po
3
linie
Pax7-/-
oraz
Pax7+/+,
charakteryzujące się prawidłową liczbą chromosomów. Techniką immunolokalizacji
antygenów stwierdzono ponadto, że wybrane linie syntetyzują czynniki związane
z utrzymaniem pluripotencji (Oct-4, Nanog).
Analizy fenotypu komórek ES Pax7-/- zostały poprzedzone doświadczeniami
mającymi na celu opracowanie wydajnej metody indukcji ich różnicowania
w
mioblasty.
uzyskiwanych
Zbadano
w
wpływ
wyniku
różnych
cząsteczek
różnicowania
komórek
na
liczbę
ES.
mioblastów
Na
podstawie
przeprowadzonych badań wybrano do dalszych analiz protokół różnicowania
komórek ES z zastosowaniem kwasu retinowego oraz suplementu składającego się
z insuliny, transferyny i selenu. Wybraną metodą posłużono się następnie
w doświadczeniach mających na celu zbadanie fenotypu różnicujących komórek ES
Pax7-/-.
Immunolokalizacja białek charakterystycznych dla komórek prekursorowych
mięśni pozwoliła wykazać, że różnicowanie komórek ES Pax7-/- w mioblasty
zachodzi tak samo, lub nawet bardziej wydajnie niż różnicowanie komórek
kontrolnych, o genotypie Pax7+/+. Dowiedziono także, że brak funkcjonalnego Pax7
nie ogranicza ekspresji genów regulujących miogenezę. Co istotne, poziom ekspresji
tych genów w komórkach ES o genotypie Pax7-/- był wyższy niż w komórkach
kontrolnych. Dzięki globalnej analizie transkryptomu wykazano, że badane komórki
różniły się poziomem ekspresji genów zaangażowanych w transport do jądra
komórkowego,
regulację
transkrypcji,
obróbkę
DNA,
modyfikacje
macierzy
zewnątrzkomórkowej, a także w regulację cyklu komórkowego. Zaobserwowane
różnice sugerują, że różnicujące komórki ES Pax7-/- proliferują intensywniej. Dane
literaturowe wskazują, że Pax-7 może być zaangażowany w regulację proliferacji
i apoptozy komórek. Immunolokalizacja białka Ki-67 (charakterystycznego dla
komórek dzielących się) oraz ufosforylowanej izoformy histonu H2A.X (występującej
wraz
z
dwuniciowymi
pęknięciami
DNA)
pozwoliła
potwierdzić,
że
wśród
różnicujących komórek ES Pax7-/- jest więcej dzielących się i mniej przechodzących
apoptozę.
Podsumowując, analiza fenotypu badanych komórek pozwoliła stwierdzić,
że Pax7 nie jest niezbędny dla różnicowania komórek ES w mioblasty. Udowodniono
ponadto,
że
Pax-7
jest
zaangażowany
w
różnicujących komórek ES.
2
regulację
proliferacji
i
apoptozy