dococena zmian właściwości błon plazmatycznych krwinek czerwonych
download 
Reklamacja Transkrypt
ocena zmian właściwości błon plazmatycznych krwinek czerwonych
Materiały XXXVI Międzyuczelnianej Konferencji Metrologów MKM’04 _________________________________________________________________________________ Izabella ŻAKOWSKA, Dorota CIEPIELEWSKA, Krzysztof JÓŹWIK Politechnika Łódzka, Instytut Maszyn Przepływowych, Zespół Aparatury Medycznej Anna PIENIĄŻEK, Krzysztof GWOŹDZIŃSKI Uniwersytet Łódzki, Instytut Biofizyki Molekularnej Jarosław OLEJNICZAK Zespól Zakładów Opieki Zdrowotnej MSWiA w Łodzi, Oddział Kardiologiczny Ewa SZAJDZIŃSKA–PIĘTEK Politechnika Łódzka, Instytut Techniki Radiacyjnej, Pracownia EPR OCENA ZMIAN WŁAŚCIWOŚCI BŁON PLAZMATYCZNYCH KRWINEK CZERWONYCH U PACJENTÓW ZE SZTUCZNĄ ZASTAWKĄ SERCA W niniejszej pracy opisano zastosowanie spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) w pomiarach dynamiki błon krwinek czerwonych (RBC) człowieka po oddziaływaniu z lipoproteinami małej gęstości (LDL - low density lipoproteins) oraz stanu konformacyjnego białek błonowych RBC. Celem niniejszej pracy było określenie dynamicznych parametrów błon krwinek czerwonych przed i po ich oddziaływaniu z natywnymi i modyfikowanymi lipoproteinami osocza metodą pomiaru płynności lipidów oraz badania stanu fizycznego białek RBC (bez oddziaływania) metodą EPR. W badaniach erytrocyty oraz lipoproteiny LDL zostały wyizolowane od osób ze sztuczną zastawką serca (AHV). Przepływ krwi przez sztuczną zastawkę serca (AHV) jest związany z występowaniem większych wartości gradientów prędkości i ciśnienia na wylocie zastawki. Większe wartości gradientów oraz ich niejednorodność prowadzą do naprężeń ścinających działających na powierzchnie komórek krwi, jak również lipoprotein osocza. Stosowana metoda oparta jest na analizie zmian kształtu linii EPR znaczników spinowych osadzonych w różnych regionach błony plazmatycznej. Na podstawie widm EPR określano parametry charakteryzujące dynamikę znaczników, która zależy od uporządkowania i płynności łańcuchów fosfolipidów w warstwie, a także od konformacji białek błonowych krwinek czerwonych. Jako znaczniki zastosowano trwałe rodniki nitroksydowe: kwas 12-doksylostearynowy (12-DS), związany hydrofobowo z błoną, oraz 4-maleimido-2,2,6,6-tetrametylopiperydyno-1-oksyl (MSL) i 4-jodoacetamido-2,2,6,6tetrametylopiperydyno-1-oksyl (ISL) związane kowalencyjnie z białkami błonowymi. Stwierdzono, w oparciu o widma 12-DS, że inkubacja krwinek czerwonych z LDL prowadzi do wzrostu płynności lipidów błonowych. Ponadto zaobserwowano zmiany konformacji białek błonowych w erytrocytach pochodzących od osób z AHV, na podstawie widm MSL i ISL. EVALUATION OF CHANGES IN THE PROPERTIES OF RED BLOOD CELL PLASMA MEMBRANES OF PATIENTS WITH ARTIFICIAL HEART VALVE This work describes application of electron spin resonance (EPR) spectroscopy to study dynamics of human red blood cells (RBC) after interaction with low density lipoproteins (LDL), and conformations of RBC membrane proteins. The aim of this study was to determine fluidity of RBC lipid membranes before and after their interaction with native and modified plasma lipoproteins, and physical state of RBC proteins (without interaction), using EPR spin label method. The examined erythrocytes and LDL lipoproteins were separated from patients with an artificial heart valve (AHV). The blood flow through AHV is affected by higher values of gradients of velocity and pressure at the valve outlet. Higher values of these gradients and their nonuniformity lead to shear stresses acting on the surface of blood cells as well as on plasma lipoproteins. The applied method Izabela ŻAKOWSKA, Dorota CIEPIELEWSKA, Krzysztof JÓŹWIK, Anna PIENIĄŻEK ... ________________________________________________________________________________ 236 is based on analysis of changes in EPR line shapes of spin labels embedded in different regions of plasma membrane. Parameters characterizing dynamics of spin labels, which depends on ordering and fluidity of phospholipid chains in the layer and on conformations of RBC membrane proteins, were determined from EPR spectra. Stable nitroxide radicals were used as spin probes: 12-doxylstearic acid (12-DS), bound to the membrane due to hydrophobic interactions, and 4-maleimido-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (MSL) and 4-iodoacetamido-2,2,6, 6-tetramethylpiperydine-1-oxyl (ISL) covalently linked to membrane proteins. It has been found that incubation of red blood cells with LDL leads to an increase in lipid membrane fluidity, as indicated by 12-DS spectra. Changes in membrane protein conformations in erythrocytes of patients with AHV have been also observed, based on MSM and ISL spectra. 1. WSTĘP Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) (lub spektroskopia elektronowego rezonansu spinowego - ESR) jest techniką stosowaną często w biotechnologii i również w biofizyce molekularnej [1]. W metodzie sond spinowych znakuje się badane układy diamagnetyczne za pomocą trwałych rodników nitroksydowych. Widma EPR tych rodników wykazują strukturę nadsubtelną typową dla jądra azotu (14N). Parametry rozszczepienia nadsubtelnego oraz kształt widm EPR dostarczają informacji o polarności w mikrootoczeniu znaczników, ich dynamice oraz o upakowaniu i orientacji przestrzennej cząsteczek w układach zorganizowanych, np. cząsteczek białek, lipidów czy cholesterolu w błonie plazmatycznej [2]. 1.1. Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) Technika znaczników spinowych pozwala na uzyskanie wielu nowych, niedostępnych innymi metodami informacji o właściwościach strukturalnych i dynamicznych błon biologicznych. Metoda ta umożliwia określenie stopnia uporządkowania łańcuchów węglowodorowych cząsteczek lipidowych i konformacji białek błonowych (właściwości strukturalne) oraz dynamiki łańcuchów i ich segmentów, a zatem płynności warstwy lipidowej (właściwości dynamiczne) [3]. Powszechnie stosowanymi znacznikami spinowymi są stabilne rodniki nitroksydowe zawierające grupę paramagnetyczną >NO·, w której niesparowany elektron oddziałuje z jądrem azotu. Przez podstawienie odpowiedniej grupy możemy uzyskać znaczniki łączące się kowalencyjnie ze specyficznymi grupami białek (np.: MSL z grupami –SH białek) lub znaczniki wbudowywane do frakcji lipidowej błon (np.: znakowane kwasy tłuszczowe) [3]. Znacznik spinowy po wbudowaniu w badaną błonę plazmatyczną komórki zachowuje się w przybliżeniu tak, jak jej naturalne komponenty np.: lipidy błonowe, które według najnowszych badań tworzą domeny bogate w nienasycone fosfolipidy [4]. Po umieszczeniu próbki paramagnetycznej w stałym polu magnetycznym o indukcji H następuje rozszczepienie poziomów energetycznych niesparowanego elektronu o spinie s=1/2 na podpoziomy zeemanowskie, odpowiadające dwóm wartościom rzutu spinowego momentu pędu na kierunek pola magnetycznego. Próbka umieszczona w zmiennym polu elektromagnetycznym o kierunku prostopadłym do stałego pola magnetycznego, przy ściśle określonej częstotliwości równej częstotliwości rezonansowej (ν), zaabsorbuje część energii. Ocena zmian właściwości błon plazmatycznych krwinek czerwonych u pacjentów ... 237 ________________________________________________________________________________ W wyniku oddziaływania niesparowanego elektronu z jądrem azotu 14N (I=1) w widmie pojawiają się trzy linie struktury nadsubtelnej odpowiadające magnetycznej liczbie spinowej jądra mI = -1, 0, 1. Oddziaływania nadsubtelne są anizotropowe (niesparowany elektron zlokalizowany preferencyjnie na orbitalu 2pz atomu azotu) i ich wielkość określona jest rozkładem gęstości spinowej w grupie >NO·. Położenie i kształt linii EPR zależą od orientacji cząsteczek próbnika względem kierunku pola magnetycznego, a zatem od uporządkowania molekularnego i dynamiki badanego układu. Parametry rozszczepienia nadsubtelnego (składowe podstawowe tensora oddziaływań nadsubtelnych i ich wartość średnia aN) zależą natomiast od własności elektrofilowych mikrootoczenia. Na podstawie widm znaczników spinowych można wyznaczyć parametry, które dają informacje o płynności warstwy lipidowej na różnych głębokościach czy stanie konformacyjnym białek [5, 6]. Podczas przepływu przez mechaniczną zastawkę serca zmiany w strukturze błon komórkowych erytrocytów mogą mieć wpływ na reologię krwi [7]. Nie bez znaczenia pozostaje problem oddziaływań zmodyfikowanych lipoprotein (w tym LDL) z tymi komórkami. Poznanie i określenie zmian w błonach tych komórek może dostarczyć informacji o ich roli w modyfikacji błon elementów morfotycznych u pacjentów ze sztuczną zastawką serca (AHV). Celem artykułu jest przedstawienie zastosowania spektroskopii EPR w badaniach zmian w błonach krwinek czerwonych pochodzących od osób ze sztuczną zastawką serca po oddziaływaniu z lipoproteinami małej gęstości (LDL) oraz opracowania statystycznego uzyskanych wyników pomiarów. 2. MATERIAŁY I METODY Badania prowadzone były na krwinkach czerwonych oraz lipoproteinach LDL pochodzących od osób zdrowych oraz od pacjentów ze sztuczną zastawką serca. 2.1. Preparatyka erytrocytów Krwinki czerwone zostały wyizolowane od pacjentów ze sztuczną zastawką serca. Erytrocyty odwirowywano przy 3000×g przez 15 minut w temperaturze 277 K i po usunięciu osocza i warstwy leukocytów przemywano je trzykrotnie wychłodzonym, zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej (10 mol/m3 PBS) o pH 7,4. W badaniach stosowano zawiesinę erytrocytów o hematokrycie 50%. 2.2. Izolowanie lipoprotein LDL Pełną krew wirowano przy 430×g przez 15 minut w temperaturze 277 K. Uzyskane osocze zbierano, a następnie zagęszczano za pomocą KBr do gęstości d=1,21·103 kg/m3 [8]. Lipoproteiny osocza izolowano w skokowym gradiencie gęstości metodą wirowania w ultrawirówce firmy Beckman SW-60 przy 283000×g w temperaturze 293 K przez 24 godziny. Izabela ŻAKOWSKA, Dorota CIEPIELEWSKA, Krzysztof JÓŹWIK, Anna PIENIĄŻEK ... ________________________________________________________________________________ 238 2.3. Utlenianie lipoprotein LDL Przed utlenianiem lipoproteiny dializowano wobec roztworu PBS o pH 7,4 przez 24 godziny w ciemności, w temperaturze 277 K. Lipoproteiny LDL utleniano jonami miedzi (końcowe stężenie CuSO4 wynosiło 20·10-3 mol/m3). Po utlenieniu nadmiar jonów miedzi usuwano poprzez dializę wobec PBS o pH 7,4 w temperaturze 277 K. Stężenie białka w próbkach zawierających lipoproteiny LDL oznaczano na podstawie krzywej wzorcowej. 2.4. Ocena płynności lipidów błonowych Płynność lipidów błonowych (w całych komórkach) określano przy użyciu kwasu 12-doksylostearynowego. Do zawiesiny erytrocytów dodawano znacznik spinowy rozpuszczony w etanolu o stężeniu 10-1 mol/dm3 i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Z widm znakowanych kwasów tłuszczowych inkorporowanych do lipidów błon krwinek czerwonych obliczano parametr (h+1/h0), tj. stosunek wysokości amplitudy linii niskopolowej (h+1) do linii środkowej widma (h0), którego wartość daje informacje o płynności warstwy lipidowej błony [9]. 2.5. Ocena oddziaływań krwinek czerwonych z lipoproteinami LDL (natywnymi, modyfikowanymi oraz pochodzącymi od osób ze sztuczną zastawką serca) Lipoproteiny LDL lub ox-LDL o stężeniu fizjologicznym były inkubowane ze znakowanymi erytrocytami przez 1 godzinę w temperaturze 310 K. Przed pomiarem widm EPR próbki odwirowywano, przemywano i zawieszano w PBS [10]. 2.6. Izolowanie błon erytrocytów Błony erytrocytarne izolowano zmodyfikowaną metodą Dodge’a [11]. W 20 mol/m3 buforze fosforanowym (pH 7,4) erytrocyty poddawano hemolizie i odwirowywano. Osad błon przemywano buforem fosforanowym o stopniowo malejącej sile jonowej, aż do całkowitego odmycia hemoglobiny. Preparatykę prowadzono w temperaturze 277K. Stężenie białka oceniano metodą Lowry’ego [12]. 2.7. Określanie zmian konformacyjnych białek błonowych Zmiany konformacyjne w strukturze białek błonowych były badane przy użyciu dwóch znaczników spinowych wiążących się kowalencyjnie do grup -SH białek: 4-maleimido-2,2,6,6-tetrametylopiperydyno-1-oksylu (MSL) i 4-jodoacetamido-2,2,6,6tetrametylopiperydyno-1-oksylu (ISL). Błony erytrocytów były inkubowane ze znacznikiem przez 1 godzinę w temperaturze 277K. Nadmiar niezwiązanego znacznika był kilkakrotnie odmywany wychłodzonym PBS-em, aż do wygaśnięcia sygnału EPR w supernatancie. Z widm EPR dla znacznika maleimidowego przyłączonego do błon, obliczano stosunek wysokości amplitudy populacji znacznika słabo unieruchomionego hw do wysokości amplitudy znacznika silnie unieruchomionego hs. Ocena zmian właściwości błon plazmatycznych krwinek czerwonych u pacjentów ... 239 ________________________________________________________________________________ Natomiast, dla znacznika jodoacetamidowego obliczano rotacyjny czas korelacji τc na podstawie równania: h0 τ c = kw0 −1 , h−1 (1) gdzie: τc - czas korelacji dla dyfuzji rotacyjnej, k = 6,5·10-10, w0 - szerokość centralnej linii widma EPR, h0 - wysokość linii środkowej widma EPR, h-1 - wysokość wysokopolowej linii widma EPR. Pomiarów dokonywano na spektrometrze EPR firmy Bruker (ESP-300E). Widma EPR (pasmo X) rejestrowano w temperaturze pokojowej za pomocą spektrometrów EPR firmy Bruker: ER 200D-SRC (badania próbników 12-DS) i ESP-300E (badania próbników MSL oraz ISL). 3. STATYSTYCZNE OPRACOWANIE WYNIKÓW Uzyskane wyniki zostały opracowane statystycznie. Wstępnie zastosowano testy Shapiro Wilka, Fishera-Snedecora oraz test Studenta i Tukey’a. 3.1. Rozkład test-t istotności różnicy dwóch średnich dla prób niezależnych Na podstawie testu t zweryfikowano hipotezę o równości średnich dwóch populacji o jednorodnych (homogennych) wariancjach. W celu sprawdzenia istotności różnicy między obliczonymi średnimi w dwóch próbach (badanej i kontrolnej) wstępnie zastosowano test Shapiro-Wilka (dla sprawdzenia normalności rozkładów) oraz test F-Fishera-Snedecora dla sprawdzenia homogenności wariancji populacji, a następnie przystąpiono do weryfikacji hipotezy zerowej: H 0 : µ1 = µ 2 wartości µ średnich z populacji, z których pobrane próby są równe, wobec hipotezy alternatywnej, H 1 : µ1 ≠ µ 2 wartości µ średnich z populacji, z których pobrane próby nie są równe. Weryfikację hipotez zaczynano od poziomu istotności α = 0,05 (P = 1-α = 0,95) [13]. Wartość doświadczalną obliczano na podstawie wzoru: td = x1 − x 2 (n1 − 1) s12 + (n 2 − 1) s 22 n1 n 2 (n1 + n 2 − 2) n1 + n 2 , gdzie: t d - wartość obliczona na podstawie danych doświadczalnych, s12, s22 - wariancje próby 1 i 2, n1, n2 - liczność próby 1 i 2. (2) Izabela ŻAKOWSKA, Dorota CIEPIELEWSKA, Krzysztof JÓŹWIK, Anna PIENIĄŻEK ... ________________________________________________________________________________ 240 3.2. Test Tukey’a Test Tukey’a jest testem wielokrotnych porównań średnich dla prób równolicznych, przy pomocy którego określano statystycznie istotne różnice. Liczbę możliwych par utworzonych dla k grup określano korzystając ze wzoru na symbol Newtona (kombinacji par jest tyle, ile można utworzyć dwu - elementowych podzbiorów ze zbioru k–elementowego): 2 k k (k − 1) k! = . C = = k 2 2! (k − 2 )! 2 (3) Dla prób równolicznych: SX = s2 , n (4) natomiast dla prób nierównolicznych: SX = s2 2 1 1 + nA nB . (5) Przed przystąpieniem do procedury porównania wielu średnich sprawdzano czy próby pochodzą z populacji o rozkładzie normalnym (test Shapiro-Wilka dla małych prób n ≤ 50) oraz porównywano homogenność wariancji w tych próbach (test Bartletta dla liczności prób n ≥ 6 oraz liczby populacji k ≥ 3) [13]. 3. WYNIKI I DYSKUSJA Dokonano analizy widm EPR znakowanych erytrocytów pochodzących od osób ze sztuczną zastawką serca. Obliczone parametry przedstawiają stan płynności błony plazmatycznej przed i po oddziaływaniach z lipoproteinami LDL. W pierwszej części pracy dokonano oceny stanu fizycznego białek błonowych erytrocytów kontrolnych i pochodzących od osób z AHV. Oba znaczniki tworzą wiązanie kowalencyjne z grupami –SH białek. Z widm znacznika maleimidowego obliczono parametr hw/hs, natomiast dla znacznika jodoacetamidowego obliczono rotacyjny czas korelacji. Użyte znaczniki spinowe: maleimidowy oraz jodoacetamidowy w warunkach fizjologicznych (pH=7,4) wiążą się kowalencyjnie z grupami –SH białek (głównie spektryny i aktyny). Wykazano zmiany konformacyjne białek błonowych (świadczące o uszkodzeniach białek cytoszkieletu, głównie kompleksu spektryna-aktyna) w erytrocytach pochodzących od osób ze sztuczną zastawką serca. Obserwowano wzrost parametru hW hS dla znacznika maleimidowego (MSL) oraz spadek rotacyjnego czasu korelacji dla znacznika jodoacetamidowego (ISL) w erytrocytach pochodzących od osób ze sztuczną zastawką serca. Oba te parametry obliczone dla MSL i ISL wskazują na wzrost ruchliwości przyłączonych znaczników do białek. Zmiany obu tych parametrów mogą być odzwierciedleniem zmian konformacyjnych białek błonowych (białek Ocena zmian właściwości błon plazmatycznych krwinek czerwonych u pacjentów ... 241 ________________________________________________________________________________ cytoszkieletu głównie kompleksu spektryna-aktyna) w erytrocytach od osób chorych. Średnie wartości badanego parametru zostały przedstawione na rysunku 1. hw/hs MSL * 3,7 3,2 kontrola 2,7 2,2 AHV 1,7 1,2 0,7 0,2 Rys. 1. Zależność hw/hs dla krwinek czerwonych (RBC) pochodzących od pacjentów z AHV oraz od grupy kontrolnej (p<0,002) Fig. 1. The hw/hs ratio for red blood cells (RBC) of patients with artificial heart valve and of control group (p<0,002) Na rysunku 2 przedstawiono zmiany rotacyjnego czasu korelacji dla znacznika jodoacetamidowego. τc 10-10(s) ISL 10,2 8,2 6,2 4,2 * kontrola AHV 2,2 0,2 Rys. 2. Zmiany w błonie erytrocytów pochodzących od pacjentów z AHV znakowanych znacznikiem ISL (p<0,002) Fig. 2. Changes in erythrocyte membrane of patients with AHV indicated by ISL (p<0,002) Podobnie jak w przypadku znacznika maleimidowego stwierdzono spadek ruchliwości przyłączonego znacznika. We wcześniej przeprowadzonych badaniach dokonano oceny płynności lipidów błonowych erytrocytów kontrolnych i po ich oddziaływaniu z lipoproteinami LDL stosując dwa znaczniki lipofilowe 5- i 16-DS. Badania te wykazały wzrost płynności lipidów błonowych krwinek czerwonych kontrolnych po oddziaływaniu z lipoproteinami małej gęstości. Otrzymane wyniki były statystycznie istotne [10]. Stosując kwas 12-doksylostearynowy badano płynność lipidów błonowych w erytrocytach po ich oddziaływaniu z natywnymi i modyfikowanymi lipoproteinami LDL. Obserwowano wzrost parametru h+1 h0 , który jest związany ze wzrostem płynności lipidów błonowych w krwinkach czerwonych po oddziaływaniu z lipoproteinami LDL. Średnie wartości badanego parametru h+1 h0 zostały przedstawione na rysunku 3. Obserwowany wzrost płynności lipidów błonowych w erytrocytach po oddziaływaniach z lipoproteinami jest zgodny z wcześniej przeprowadzonymi badaniami [10]. Wzrost płynności lipidów błonowych może być związany z ich utlenianiem, co wykazano stosując Izabela ŻAKOWSKA, Dorota CIEPIELEWSKA, Krzysztof JÓŹWIK, Anna PIENIĄŻEK ... ________________________________________________________________________________ 242 jako utleniacz wodoronadtlenek t-butylowy [14]. Utlenione cząstki LDL (ox-LDL) oddziałując z błonami erytrocytów mogą wpływać na ich parametry, więc również na płynność lipidów błonowych krwinek czerwonych. h+1/h0 Oddziaływanie RBC z lipoproteinami LDL (12-DS) 0,55 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 K K+LDL K+ ox-LDL K+AHV-LDL Rys. 3. Zmiany parametru h+1/h0 kwasu 12-DS w erytrocytach kontrolnych oraz inkubowanych z lipoproteinami LDL natywnymi i modyfikowanymi (NS; n=11) Fig. 3. Changes in h+1/h0 ratio for 12-DS in normal erythrocytes and those incubated with native and modified LDL lipoproteins (NS; n=11) W przypadku stosowania zastawek mechanicznych występują zagrożenia spowodowane przepływem krwi, a związane z procesem kawitacji oraz turbulencjami występującymi podczas przepływu [15, 16], jak również nasileniem reakcji wolnorodnikowych. Procesy te mogą dodatkowo prowadzić do uszkodzeń struktury błon plazmatycznych komórek krwi (krwinek czerwonych i płytek krwi) oraz utlenienia lipoprotein osocza. Rozkład prędkości i ciśnienia ma wpływ na deformację elementów morfotycznych krwi. Jeżeli w polu prędkości i ciśnienia występują miejsca, w których gradienty tych wielkości mają znaczne wartości, to deformacja elementów krwi będzie duża [16]. Stąd oddziaływania pomiędzy sztuczną zastawką serca i elementami morfotycznymi krwi ludzkiej mogą prowadzić do zmian w błonach plazmatycznych tych komórek, włączając erytrocyty. Zmiany w płynności lipidów błonowych krwinek czerwonych (RBC) mogą obniżać ich deformację, zwiększając ich agregację, a w konsekwencji wpływać na właściwości reologiczne krwi [17]. Badania stanu konformacyjnego białek błonowych przy użyciu kowalencyjnie wiążących się znaczników spinowych dostarczyły informacji o ich stanie fizycznym w błonie plazmatycznej oraz oddziaływaniach białkowo-lipidowych w błonie plazmatycznej.. Białka cytoszkieletu błonowego odpowiedzialne są za utrzymanie dwuwklęsłego kształtu krwinek czerwonych. Dla erytrocytów pochodzących od osób ze sztuczną zastawką serca wykazano wzrost parametru hw/hs w stosunku do erytrocytów kontrolnych. Może to wskazywać na zmiany w składzie lub w stanie konformacyjnym białek cytozolowych, a mianowicie na sieciowanie nisko-cząsteczkowych białek, które jest odpowiedzialne za obserwowalny spadek w ruchliwości znacznika. Na właściwości reologiczne erytrocytów mają wpływ: stan błony plazmatycznej, głównie stan białek cytoszkieletu, płynność lipidów oraz lepkość wnętrza. Wszystkie te parametry odpowiedzialne są za utrzymanie kształtu komórki. Obserwowane zmiany w badanych parametrach mogą być związane z obecnością sztucznej zastawki serca lub/i interakcją Ocena zmian właściwości błon plazmatycznych krwinek czerwonych u pacjentów ... 243 ________________________________________________________________________________ stosowanych leków w tej grupie pacjentów. Stan białek błonowych erytrocytów po oddziaływaniu z lipoproteinami LDL zostanie określony w późniejszych badaniach podobnie jak i wpływ leków stosowanych u pacjentów ze sztuczną zastawką. Badania te mogą dostarczyć informacji, w jakim stopniu praca mechanicznej zastawki serca wpływa na strukturę błony erytrocytów, a w jakim stopniu oddziaływania z lipoproteinami natywnymi (LDL), utlenionymi (ox-LDL) oraz pochodzącymi od osób ze sztuczną zastawką serca (AHV-LDL) oraz sposobu opracowania statystycznego otrzymanych wyników pomiarów. Prezentowane badania mogą również pokazać kierunek działań, dzięki którym można zapobiegać procesowi tych uszkodzeń, m.in. powstawaniu stanów zapalnych w organizmie. LITERATURA 1. Płonka P.M., Elas M.: Application of the electron paramagnetic resonance spectroscopy to modern biotechnology; Curr. Top. Biophys. 26(1), 2002, 175-189. 2. Hrynkiewicz A.Z., Rokita E.: Fizyczne metody badań, Wydawnictwo naukowe PWN, Warszawa 1999, Rozdz. 5, 136-159. 3. Gwoździński K., Wolne rodniki oraz spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego w biologii i medycynie [w:] Metody instrumentalne w biofizyce i naukach biomedycznych [D. Ertel, red.], Wydział Fizyki Technicznej i Matematyki Stosowanej Politechniki Łódzkiej, 2000, 86-132. 4. Wiśniewska A., Draus J., Subczyński W.: Is a fluid – mosaic model of biological membranes fully relevant? Studies on lipid organization in model and biological membranes: Cellular and Molecular Biology Letters, 8, 2003, 147-159. 5. Szajdzińska-Piętek E., Struktura i dynamika układów jonomerowych oraz modelowych agregatów amfifilowych; Zeszyty Naukowe, Nr 837, Rozprawy Naukowe, Z. 268, Politechnika Łódzka, 2000, 55-88. 6. Surewicz K.: Metody interpretacji widm EPR znakowanych spinowo błon biologicznych, Zagadnienia Biofizyki Współczesnej, tom 3, 1978, 21-44. 7. Jóźwik K., Nawrat Z.: Eksperymentalne badania przepływu przez dyskową zastawkę serca z warstwą NCD, Cieplne maszyny przepływowe, nr 117, 2000, 317-322. 8. Redgrave T.G., Roberts D.C.K., West C.E.: Separation of plasma lipoproteins by density – gradient ultracentrifugation, Anal. Biochem. 65, 1975, 42-49. 9. Gwoździński K: A spin label study of the action of cupric and mercuric ions on human red blood cells; Toxicology 65, 1991, 315-323. 10. Żakowska I., Szyller-Tracz M., Jóźwik K., Szajdzińska–Piętek E., Gwoździński K., Olejniczak J.,: Wpływ sztucznej zastawki serca na strukturę krwinek czerwonych oraz ich interakcje z natywnymi i modyfikowanymi lipoproteinami osocza małej gęstości, VI Sympozjum Modelowanie i Pomiary w Medycynie, MPM’2004, Krynica, 9-13 maja 2004r. (przyjęto do druku). Izabela ŻAKOWSKA, Dorota CIEPIELEWSKA, Krzysztof JÓŹWIK, Anna PIENIĄŻEK ... ________________________________________________________________________________ 244 11. Dodge J.T., Mitchell C., Hanahan D.J.: The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free ghosts of human erythrocytes;. Arch Biochem. Biophys. 100, 1963, 119130. 12. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randal R.J.: Protein measurements with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 193, 1951, 265-275. 13. Gondko R., Zgirski A., Adamska M.: Biostatystyka w zadaniach; Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego, 1994. 14. Brzeszczyńska J., Gwoździński K: Erythrocyte membrane damage induced by t-buthyl hydroperoxide; Curr. Top. Biophys. 22 (Suppl B), 1998, 238-241. 15. Mirota K., Wpływ postaci konstrukcyjnych sztucznych zastawek aorty na charakterystyki hemodynamiczne przepływu; Wydawnictwo Politechniki Łódzkiej Filii w Bielsku-Białej, 1998. 16. Jóźwik K., Bakteryjne zapalenie wsierdzia a zastawki serca; Nowa Klinika Vol. 7, No 10, 2000, 1052-1056. 17. Gwoździński K., Żakowska I., Olejniczak J., Pawlicki L: Red blood cell membrane alteration in ischaemia heart disease; Curr. Top. Biophys. 22 (Supplement B), 1998, 238241. ABSTRACT W niniejszym artykule podano podstawy teorii opracowania statystycznego wyników pomiarów w przypadku porównywania istotności różnicy między średnimi dla więcej niż dwóch grup. W pierwszym etapie przedstawiono zastosowanie spektroskopii EPR w biofizyce: metody izolowania i znakowania komórek z pełnej krwi ludzkiej pochodzącej od pacjentów ze sztuczną zastawką serca. Inkubacja krwinek czerwonych z cząstkami LDL prowadziła do wzrostu płynności lipidów błonowych monitorowanej przez 12-DS. Z drugiej strony, obserwowano zmianę konformacji białek błonowych w erytrocytach. Zmiany w płynności lipidów błonowych krwinek czerwonych po oddziaływaniu z LDL mogą być związane z wymianą lipidów i cholesterolu między oddziałującymi komponentami, co może prowadzić do zmian w deformacji erytrocytów, wzrostu ich agregacji, a w konsekwencji wpływać na właściwości reologiczne krwi. Następnie przedstawiono sposób statystycznego opracowania uzyskanych wyników pomiaru – test t oraz test Tukey’a. Oddziaływania pomiędzy sztuczną zastawką serca (AHV), krwinkami czerwonymi oraz lipoproteinami LDL mogą wpływać na procesy zachodzące w błonie plazmatycznej. Efektem tego mogą być zmiany w płynności lipidów błonowych krwinek czerwonych (RBC) oraz zmiany w konformacji białek cytoszkieletu prowadzące do zmian odkształcalności RBC, a więc do zmian właściwości reologicznych krwi.
