docGenetyka człowieka
download 
Reklamacja Transkrypt
Genetyka człowieka
Polski Kongres Genetyki XV Zjazd Polskiego Towarzystwa Genetycznego IV Zjazd Polskiego Towarzystwa Genetyki Człowieka Warsztaty: Choroby genetyczne Gdańsk, 6-9 września 2004 r. Streszczenia Gdańsk, 2004 r. Druk materiałów związanych z Warsztatami pt. „Choroby genetyczne: diagnostyka, możliwości leczenia, aspekty etyczne” był sponsorowany przez Polską Sieć Biologii Komórkowej i Molekularnej UNESCO/PAN. Druk materiałów zjazdowych był sponsorowany przez Ministerstwo Nauki i Informatyzacji. Patronat honorowy Minister Nauki prof. dr hab. inż. Michał Kleiber Minister Zdrowia Marek Balicki Wojewoda Pomorski Cezary Dąbrowski Prezydent Miasta Gdańska Paweł Adamowicz Prezes Polskiej Akademii Nauk prof. dr hab. Andrzej B. Legocki Rektor Akademii Medycznej w Gdańsku prof. dr hab. med. Wiesław Makarewicz Rektor Uniwersytetu Gdanskiego dr hab. Andrzej Ceynowa, prof. UG Rektor Politechniki Gdańskiej prof. dr hab. inż. Janusz Rachoń Druk sfinansowany przez Polską Sieć Biologii Molekularnej oraz Ministerstwo Nauki i Informatyzacji ISBN 83-920827-2-0 2 Komitet naukowy: Prof. dr hab. Jerzy Bal Instytut Matki i Dziecka, Zakład Genetyki Medycznej, Warszawa Doc. dr hab. Ewa Bocian Instytut Matki i Dziecka, Pracownia Cytogenetyki, Zakład Genetyki Medycznej, Warszawa Prof. dr hab. Kazimierz Jaszczak Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN Prof. dr hab. Magorzata Krajewska-Walasek Instytut „Pomnik-Centrum Zdowia Dziecka”, Zakład Genetyki Medycznej, Warszawa, Prof. dr hab. Józef Kur Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny Prof. dr hab. Janusz Limon Katedra Biologii i Genetyki, Akademia Medyczna w Gdańsku Prof. dr hab. Tadeusz Mazurczak Instytut Matki i Dziecka, Zakład Genetyki Medycznej, Warszawa Prof. dr hab. Jacek Pietrzyk Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii, Wydział Lekarski Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków Doc. dr hab. med. Marek Sanak Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków Prof. dr hab. Zofia Szweykowska-Kulińska Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu, Wydział Biologii, Instytut Biologii Molekularnej Prof. dr hab. Jacek Zaremba Instytut Psychiatrii i Neurologii, Warszawa Dr hab. Ewa Ziętkiewicz Instytut Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu Komitet Naukowy: 3 Komitet Organizacyjny: Pracownicy i doktoranci Katedry Biologii Molekularnej Uniwersytetu Gdańskiego: prof. dr hab. Grzegorz Węgrzyn dr Agata Czyż dr Marcin Łoś dr Agnieszka Szalewska-Pałasz dr Joanna Jakóbkiewicz-Banecka dr Monika Glinkowska dr Sylwia Barańska mgr Ewa Piotrowska mgr Anna Węglewska mgr Katarzyna Ulanowska mgr Anna Szambowska mgr Magdalena Narajczyk 4 Spis treści: Warsztaty ................................................................................................................7 Genetyka człowieka .............................................................................................15 Neurogenetyka................................................................................................................................................15 Genetyka Kliniczna.........................................................................................................................................31 Epidemiologia genetyczna .........................................................................................................................38 Dysmorfologia ................................................................................................................................................59 Choroby wieloczynnikowe..........................................................................................................................79 Onkogenetyka .................................................................................................................................................93 Doniesienia różne ........................................................................................................................................ 118 Genetyka zwierząt ..............................................................................................123 Ekspresja genów, mapy genomowe, .................................................................................................... 123 polimorfizm genetyczny, ewolucja....................................................................................................... 123 Inżynieria genetyczna, biotechnologia ............................................................................................... 143 Mutacje, diagnostyka genetyczna, terapia ........................................................................................ 146 Dziedziczenie wielogenowe .................................................................................................................... 151 Genetyka roślin ..................................................................................................159 Genetyka molekularna .............................................................................................................................. 160 Mapowanie genetyczne ............................................................................................................................ 170 Genetyka rozwoju ....................................................................................................................................... 176 Genetyka populacji ..................................................................................................................................... 178 Mutacje, rekombinacja, replikacja ......................................................................................................... 189 Ekspresja genów .......................................................................................................................................... 193 Genomika i ewolucja molekularna........................................................................................................ 205 Diagnostyka, terapia, ................................................................................................................................ 211 inżynieria genetyczna, biotechnologia ............................................................................................... 211 Doniesienia różne: ....................................................................................................................................... 218 Suplement (streszczenia nadesłane po terminie) ........................................................231 Skorowidz nazwisk .............................................................................................237 5 Warsztaty „Choroby genetyczne: diagnostyka, możliwości leczenia, aspekty etyczne” 6 września 2004 1. Enzyme Replacement Therapy for MPS I. J. E. Wraith Willink Biochemical Genetics Unit, Royal Manchester Children’s Hospital, Manchester The results of a randomized, double-blind, placebo-controlled, global study demonstrated that enzyme replacement therapy with Aldurazyme was effective and safe for patients with MPS I. Functional measures relevant to MPS I morbidity and mortality were chosen as efficacy endpoints to overcome the challenge of showing a treatment effect in a short time period in patients with a chronic disease. Within 26 weeks, Aldurazyme produced clinically important improvements in respiratory function and physical capacity. Of the two primary endpoints of the pivotal study, the change in FVC (forced vital capacity) achieved statistical significance (P = 0.016), while the change in the 6MWT (six minute walk test) approached statistical significance in the main analysis (P = 0.066) and achieved significance by a pre-specified ANCOVA (P = 0.039). In patients with sleep apnea, a statistically significant treatment effect was seen in AHI (-6.6 events/hr, P = 0.037) and in patients whose shoulder flexion fell below the median baseline value, a positive trend was noted (13.4 degrees, P = 0.1). In addition, Aldurazyme rapidly and effectively cleared accumulated substrate as evidenced by significant reductions in hepatomegaly (P = 0.001) and urinary GAG levels (P < 0.001). These improvements occurred despite the fact that most patients had long-standing disease with a mean duration of symptoms of 12.7 years. Earlier treatment, prior to the development of irreversible changes, is expected to lead to better outcomes. These results have been maintained in anopen-label extension to the study which has now gone well past 72 weeks. This data will be presented to the meeting. The initial safety profile and pharmacodynamic response of Aldurazyme in severe patients less than 5 years old is similar to that of older patients with attenuated disease. In both groups the product seems very safe with very few serious infusion associated reactions and drug-related adverse events. The use of Adurazyme as an adjunct to bone marrow transplantation is also under study and preliminary data suggests that this may be a very useful therapy in improving the patient’s condition prior to BMT and in helping to prevent graft rejection. 2. Możliwości leczenia genetycznie uwarunkowanych chorób metabolicznych. A. Tylki-Szymańska Klinika Pediatrii, Oddział Chorób Metabolicznych, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa Choroby lizosomalne możemy zdefiniować jako defekty aparatu lizosomalnego wynikające z deficytu aktywności enzymów lizosomalnych lub białek transportowych/receptorowych błony lizosmalnej. Wspólną cechą wszystkich chorób lizosomalnych jest gromadzenie substratów lub produktów reakcji głównie w lizosomach. Niewydolność aparatu lizosomalnego stymuluje wiele procesów kompensacyjnych, po wyczerpaniu których zaburzeniu ulega złożona funkcja i struktura komórki, prowadząc do jej zniszczenia, a w następstwie do charakterystycznych objawów klinicznych. W miarę jak poznawane były przyczyny i patomechanizm chorób lizosomalnych, krystalizowało się wyzwanie ich leczenia. Do lat osiemdziesiątych możliwe do zaproponowania chorym było jedynie leczenie paliatywne, które do chwili obecnej dla większości chorób jest jedyną formą pomocy pozwalającą zmniejszyć uciążliwość niektórych objawów i poprawić komfort życia. 7 Warsztaty Enzymatyczne leczenie substytucyjne zostało zaproponowane po raz pierwszy przez Bradego w 1965 roku dla chorych z chorobą Gaucher’a. W 1974 roku dowiedziono, że podanie dożylnie oczyszczonego enzymu – glukocerebrozydazy, znacznie obniża poziom glukocerebrozydu w wątrobie i we krwi. Otworzyło to drogę do terapii enzymatycznej w chorobach lizosomalnych. Aktualnie można już leczyć tą metodą chorobę Fabry’ego, Hurler, Pompego (oczekuje się wkrótce preparatów do leczenia chorych z chorobą Huntera, Maroteaux-Lamy i Niemanna-Picka B). Wczesne zastosowanie tego typu leczenia może zapobiec w ogóle wystąpieniu objawów klinicznych. Leczenie enzymatyczne nie pokonuje bariery krew-mózg i stanowi to przeszkodę w zastosowaniu go w tych postaciach chorób lizosomalnych, w których dominuje zajęcie oun. Stało się to powodem do szukania jeszcze innych rozwiązań terapeutycznych; jednym z nich jest metoda hamowania syntezy substratu. N-butyldeoxynojirimycin (OGT 918) hamuje glukozyltransferazę – enzym kluczowy dla syntezy glikosfingolipidów. Stąd preparat może znaleźć zastosowanie w leczeniu wielu sfingolipidoz. Wprowadzenie tej metody leczenia u pacjentów, u których aktywność resztkowa enzymu jest wystarczająca do rozłożenia mniejszej ilości substratu, może sprawić, że skutki choroby staną się nieuchwytne. Leczenie chorób lizosomalnych spowodowanych defektami białek wchodzących w skład błony lizosomalnej (ch. Niemanna-Picka C (II), sialidozy) sprawia największe trudności. Dla większości tego typu chorób pozostaje terapia genowa. Przeprowadzono wiele prób klinicznych z tego typu leczeniem, jednak nie udało się dotychczas wykazać długotrwałego efektu korygującego. W leczeniu chorób lizosomalnych nastąpił wręcz zaskakujący postęp w minionym dwudziestoleciu, dający nadzieję w dalszej przyszłości na leczenie innych chorób spowodowanych wadami metabolizmu. 3. Choroby lizosomalne – rozpoznawanie laboratoryjne i występowanie w Polsce. B. Czartoryska Zakład Genetyki, Instytut Psychiatrii i Neurologii, Warszawa Spichrzeniowe choroby lizosomalne to grupa wrodzonych wad metabolizmu, w których mutacja prowadzi do niewydolności układu lizosomalnego komórek i, w konsekwencji, do wewnątrzlizosomalnego gromadzenia niezdegradowanych substancji czego skutkiem jest cała kaskada zjawisk patologicznych. Do grupy tej zaliczamy ponad 40 chorób, w tym mukopolisacharydozy (9), sfingolipidozy (7) mukolipidozy i glikoproteinozy (oligosacharydozy, 7), ceroidolipofuscynozy (8) itd. Na ogół błąd genetyczny dotyczy jednego enzymu lizosomalnego, niekiedy enzymu modyfikującego, zaś w kilkunastu przypadkach dotyczy integralnego białka błonowego o właściwościach enzymu, transportera lub też o funkcji nieznanej. Są to bardzo rzadkie choroby – w Polsce rozpoznano 1 przypadek na 23 000 dzieci żywo urodzonych w latach 1988–1997 – najwięcej przypadków jednej z mukopolisacharydoz (1 na 42 000), jednej z gangliozydoz (1 na 140 000) lub leukodystrofii metachromatycznej (1 na 152 000). Do rozpoznawania tych chorób wykorzystywane są rozmaite metody, a mianowicie: 1/ Metody histologiczne – stwierdzenie wewnątrzkomórkowego spichrzania nierozłożonego substratu a/ w mikroskopie świetlnym – komórki piankowate, komórki globoidalne, wewnątrzkomórkowe wakuole, metachromazja, złogi PAS dodatnie itp. b/ w mikroskopie elektronowym – ziarnistości, „splątki”, „linie papilarne” itp. 2/ Chemiczna identyfikacja gromadzonego materiału� a/ wydalanego z moczem – np. sulfatydów, mukopolisacharydów, oligosacharydów, wolnego kwasu sjalowego (metodą chromatografii cienkowarstwowej –TLC lub elektroforezy) b/ gromadzonego wewnątrzkomórkowo – TLC lipidów ekstrahowanych z tkanek (np. z bioptatu wątroby lub po splenektomii) – metodą histochemiczną w hodowli komórkowej – np. gromadzenie wolnego cholesterolu 4/ Oznaczanie markerów pośrednich, np. aktywności chitotriozydazy w surowicy 3/ Badanie aktywności enzymatycznej – jest to najczęściej stosowana metoda bezpośrednia a/ in vivo, w hodowli komórkowej b/ in vitro w ekstraktach leukocytów lub hodowanych fibroblastów skóry – stosując znakowany substrat naturalny – stosując substrat syntetyczny, zazwyczaj fluorogenny 3/ Analiza DNA – identyfikacja mutacji. 8 Warsztaty 4. Najnowsze metody diagnozowania i leczenia zespołu Smitha, Lemlego i Opita. M. Krajewska-Walasek (1), E. M. Małunowicz (2), E. Ciara (1), E. Popowska (1), K. Chrzanowska (1), B. Kozakiewicz-Goryluk (1), M. Gajdulewicz (1), A. Jezela-Stanek (1), K. Spodar (1) (1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa (2) Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa Zespół Smitha, Lemlego i Opitza (SLO), zespół mnogich wad rodzonych z współistniejącym opóźnieniem umysłowym, należy do najczęstszych, ale i najrzadziej rozpoznawanych chorób metabolicznych. Choroba uwarunkowana jest mutacjami w genie DHCR7, kodującym reduktazę 7-dehydrocholesterolu (DHCR7), odpowiedzialną za konwersję 7-dehydrocholesterolu (7-DHC) w cholesterol (CH). Wykrycie zaburzeń w biosyntezie cholesterolu spowodowało rewolucyjny przewrót w pre– i postnatalnej diagnostyce tego zespołu. Wczesna diagnostyka pozwala na wdrożenie wczesnego leczenia dietetycznego (dieta bogatocholesterolowa) i udzielenie rodzicom porady genetycznej. Celem pracy jest: (1) przedstawienie wyników stosowania najnowszych procedur biochemiczmych i molekularnych wykorzystywanych w diagnostyce post– i prenatalnej tego zespołu oraz (2) ocena wpływu diety wysokocholesterolowej z/bez podaży kwasów żółciowych na stan kliniczny oraz wybrane parametry laboratoryjne u pacjentów z zespołem SLO. (1) Materiał i metodyka. W IP-CZD weryfikację rozpoznania klinicznego przeprowadza się za pomocą badań biochemicznych i diagnostyki genetycznej. Analiza biochemiczna polega na oznaczaniu 7-, 8-DHC i CH w surowicy krwi oraz stosunku 7 (8)-dehydropregnantriolu do pregnantriolu w jednorazowej porcji moczu metodą GC/MS. W badaniach prenatalnych tzw. inwazyjnych oznaczenia 7-, 8-DHC i CH wykonywane są w wodach płodowych (w 13/ 14 Hbd), natomiast w tzw. nieinwazyjnej diagnostyce prenatalnej markerami choroby u płodu są 7-dehydrometabolity steroidowe pochodzenia płodowego (7-dehydropregnantriol oraz 8-dehydroestriol) stwierdzane (od 12 Hbd) w moczu matki. Uzupełnieniem diagnostyki jest identyfikacja mutacji w genie DHCR7, którą można wykorzystać w badaniach prenatalnych (biopsja kosmówki w 11 Hbd). Wyniki. Za pomocą badań biochemicznych i molekularnych kliniczne rozpoznanie zespołu SLO potwierdziliśmy u 39 pacjentów w wieku od 2 dni do 25. roku życia, ponadto wykonaliśmy 8 badań prenatalnych. Wnioski. Dotychczasowe wyniki naszych badań wykazały pierwszorzędną rolę testów biochemicznych w pre– i postnatalnej diagnostyce zespołu SLO. Identyfikacja mutacji w genie DHCR7 stanowi znakomite uzupełnienie tej diagnostyki. (2) Materiał i metodyka. Badaniem objęto 9 dzieci w wieku od 1m.ż.do 12 l i 3 m., średni czas leczenia wynosił 31 m. Pacjenci zostali podzieleni na 2 grupy: A-dzieci starsze i B-dzieci młodsze. Cholesterol stosowano w dawce 20-40100 mg/kg m.c./dobę, głównie pod postacią żółtek jaj kurzych. 6 pacjentów otrzymywało kwas ursodezoksycholowy w dawce 20 mg/kg m.c./dobę. Ocena badanych obejmowała: stan kliniczny, pomiary antropometryczne (masa oraz wzrost/długość ciała, obwód głowy), badanie neurologiczne i psychologiczne, parametry laboratoryjne – m.in. poziom cholesterolu (CH) oraz 7– i 8– dehydrocholesterolu (7– i 8-DHC) w surowicy metodą GC/MS, gęstość receptorów dla lipoprotein o małej gęstości (LDL) na monocytach. Wyniki. U 9 dzieci stwierdzono poprawę stanu klinicznego: w gr. A głównie zachowania, w gr. B – niektórych parametrów antropometrycznych oraz rozwoju psychomotorycznego. Nie u wszystkich uzyskano wzrost poziomu CH, stwierdzono natomiast wzrost 7– i 8-DHC. Wnioski. Stosowanie u dzieci z zespołem SLO diety bogatocholesterolowej ma wpływ na ich stan kliniczny, przy czym zastosowanie kwasów żółciowych przypuszczalnie nie ma znaczenia. Wydaje się, że najkorzystniejszy efekt można osiągnąć u dzieci najmłodszych. Stosowanie diety nie u wszystkich pacjentów powoduje wzrost poziomu cholesterolu całkowitego w surowicy krwi. Można sądzić, że znaczenie kliniczne ma wzrost poziomu prekursorów cholesterolu: 7-DHC i 8-DHC. Ekspresja receptorów dla LDL u pacjentów z zespołem SLO pozostaje niezmieniona. 9 Warsztaty 5. Wczesna identyfikacja wad metabolizmu w praktyce lekarza pierwszego kontaktu i specjalisty. E. Pronicka Oddział Chorób Metabolicznych, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa Znaczenie wczesnej diagnozy choroby genetycznej, w tym wrodzonej wady metabolizmu (IEM, inborn error of metabolism), nie podlega dyskusji. Poza względami medycznymi, społecznymi i rodzinnymi, za ustaleniem rozpoznania jak najwcześniej przemawiają aspekty organizacyjne i ekonomiczne służby zdrowia. Dotyczy to zarówno przypadków chorób metabolicznych, które poddają się leczeniu jak i tych uznanych dziś za nieuleczane. Problem detekcji choroby w fazie bezobjawowej rozwiązują populacyjne badania przesiewowe noworodków. W Polsce obejmują one tylko kilka (hiperfenyloalaninemie i niedoczynność tarczycy) spośród ponad 500 znanych zaburzeń metabolicznych o uwarunkowaniu genetycznym (Scriver i wsp.: Metabolic and Molecular Bases of Metabolic Disease, 8 wydanie, 2001). W pozostałych przypadkach odpowiedzialność za ustalenie tła genetyczno-metabolicznego choroby spoczywa na lekarzu pierwszego kontaktu i specjaliście wąskich podspecjalności, ich wnikliwości, wiedzy i kompetencji. Pediatra pracujący w poradni i oddziale o ogólnym profilu ma szansę napotkać dotychczas nierozpoznany przypadek wady metabolizmu zaledwie kilka razy w czasie całej praktyki lekarskiej. Samodzielne ustalenie rozpoznania utrudnia nieswoistość obrazu chorobowego, kosztowne i mało dostępne procedury diagnostyczne. Tylko nieliczne IEM z jednoznacznym fenotypem klinicznym uwidoczniają się w badaniu przedmiotowym (mukopolisacharydozy, ch. Zellwegera, ch. Menkesa, inne), rutynowych badaniach biochemicznych (hipoglikemia, kwasica metaboliczna) czy konsultacjach (hepatopatia, kardiopatia, endokrynopatia, zmiany ocze, radiologiczne, inne). Jednak większość IEM przybiera różnorodne maski często występujących chorób nabytych (zakażenie, uraz, zatrucie o nieznanej przyczynie), także w oczach specjalistów wąskich specjalności. W klasycznej diagnostyce różnicowej rzadko występujące przyczyny choroby/objawu rozpatruje się jako ostatnie. Pacjent z wadą metabolizmu jest w takim przypadku przegrany. Z pomocą przychodzi skrining selektywny (inaczej skrining wczasnoobjawowy, „at risk”), program przesiewowy o typie profilaktyki II stopnia. Osobą „przesiewajacą” jest najczęściej lekarz pierwszego kontaktu (ale czasem także rodzina chorego dziecka). On, na podstawie prostych objawów klinicznych i biochemicznych, decyduje o wykonaniu skriningu w kierunku IEM, raczej celem ich wykluczenia niż rozpoznania. Może spodziewać się negatywnego wyniku w 99 na 100 przeprowadzonych badań. Drugim ogniwem skriningu selektywnego jest konsultacyjny ośrodek pediatrii metabolicznej. Tu, na podstawie dostarczonych przez lekarza leczącego: opisu choroby i materiału biologicznego (zwykle tylko mocz i sucha kropla krwi na bibule, ale także surowica, płyn mózgowo-rdzeniowy, materiał biopsyjny) wybiera się indywidualnie i wykonuje zestaw badań skriningowych, dobrany z kilkunastu dostępnych testów, w sposób celowy. Podstawą skriningu selektywnego jest analiza kwasów organicznych w moczu metodą GC-MS (chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią masową) i analiza profilu aminokwasów i acylokarnityn w suchej kropli krwi metodą MS/MS (tandemowa spektrometria mas). Zestaw obowiązujących metod skriningu selektywnego koordynuje i systematycznie kontroluje europejski program jakości (Proficiency test, ERNDIM). Poza prostymi metodami skriningowymi, wykorzystuje się kosztowne i skomplikowane metody biochemiczne, a także enzymatyczne i molekularne. Program skriningu selektywnego w kierunku wad metabolizmu obejmuje w Polsce blisko półtora tysiąca chorych dzieci rocznie i wykrywa około 50 nowych przypadków różnych wad metabolizmu. Liczba ta jest porównywalna z liczbą nowych wykryć fenyloketonurii. Teoretycznie, częstość występowania chorób metabolicznych, które mogą być zidentyfikowane w programie skriningu selektywnego wynosi 1:2700 urodzeń. W praktyce częstość ta wynosi obecnie 1:5700 w wybranych regionach kraju. 6. Molekularna diagnostyka chorób mitochondrialnych. K. Tońska Zakład Genetyki, Uniwersytet Warszawski, Warszawa Badanie chorób mitochondrialnych nastręcza pewnych trudności ze względu na złożony układ jaki stanowią mitochondria z jednej strony posiadające własny DNA i odrębny system transkrypcji i translacji, a z drugiej uzależnione od białek kodowanych i eksprymowanych jądrowo. Podobne objawy mogą więc dawać zarówno mutacje jądrowe jak i mitochondrialne. Dodatkowo obraz komplikuje możliwość istnienia w tkance cząsteczek mtDNA o różnych sekwencjach, ich dystrybucja tkankowa i dziedziczenie. Mutacje w mitochondrialnym DNA prowadzą najczęściej do zaburzeń pracy tkanek i narządów o dużych wymaganiach 10 Warsztaty energetycznych takich jak układ nerwowy czy mięśnie, stąd większość chorób mitochondrialnych należy do schorzeń neurologicznych. Diagnostyka chorób mitochondrialnych wymaga ścisłej współpracy miedzy jednostkami odpowiedzialnymi za przeprowadzenie kolejnych etapów badań: klinicznych, histochemicznych, biochemicznych i molekularnych. Przy diagnostyce molekularnej istotny jest świadomy wybór tkanki do badania (wymóg ten związany jest z różnicami w zawartości zmutowanych cząsteczek mtDNA między tkankami), metod przeprowadzania analiz i wykonania niezbędnych kontroli. Wraz z rozwojem technik sekwencjonowania diagnostyka molekularna chorób mitochondrialnych coraz częściej opiera się na sekwencjonowaniu całego genomu mitochondrialnego lub innych technik pozwalających na przebadanie całej sekwencji mtDNA. Stwierdzenie różnicy między sekwencją pochodzącą od pacjenta, a sekwencją prawidłowa niekoniecznie musi być związane z wykryciem patogennej mutacji (liczne polimorfizmy mtDNA). W takich przypadkach patogenność mutacji należy potwierdzić innymi metodami. 7. Molekularna diagnostyka dystrofii mięśniowej Duchenne’a/Beckera – rodzaj mutacji a przebieg choroby. J. Zimowski Zakład Genetyki, Instytut Psychiatrii i Neurologii, Warszawa Dystrofia mięśniowa Duchenne’a/Beckera (DMD/BMD) polega na stopniowym i nieodwracalnym zaniku mięśni i prowadzi w ostrej postaci (typ Duchenne’a) do utraty zdolności samodzielnego chodzenia (około 10. roku życia) i do śmierci pacjenta przed 20 rokiem życia. W swej łagodnej postaci (typ Beckera) przebieg choroby jest wolniejszy. DMD/BMD występuje z częstością 1: 3500 żywo urodzonych chłopców i dziedziczy się w sposób recesywny sprzężony z płcią – gen dystrofiny położony jest w prążku Xp21. 60% przypadków zachorowań wywołanych jest delecjami, 30% mutacjami punktowymi, pozostałe – duplikacjami części genu. Różny przebieg choroby (typ Duchenne’a versus typ Beckera) tłumaczy teoria uszkodzenia lub zachowania przez mutację ramki odczytu. Całkowity brak dystrofiny na skutek przesunięcia ramki odczytu powoduje pękanie błony włókien mięśniowych, ich degenerację a w konsekwencji przerost mięśni tkanką łączną. Zachowana ramka odczytu pozwala na syntezę białka – dystrofiny. Powstaje wtedy białko o zmienionej wielkości, ale zdolne w ograniczony sposób pełnić swoją funkcję w obrębie kompleksu glikoproteinowego usytuowanego w sarkolemmie, odpowiedzialnego za stabilność błony włókna mięśniowego. W cząsteczce dystrofiny wyodrębniono cztery domeny morfologiczno-funkcjonalne, których uszkodzenie daje nieco inny przebieg choroby. Spotyka się pacjentów, u których delecje zachowujące ramkę odczytu powodują ciężki przebieg choroby ale również takich, u których występują tylko kurcze i bóle mięśniowe. Bardzo rzadko spotyka się DMD/BMD u kobiet. Choroba jest u nich wywołana, poza mutacją w genie dystrofiny, zaburzoną losową inaktywacją chromosomu X lub translokacją chromosomową: X-autosom z pęknięciem w prążku Xp21. W takiej sytuacji dochodzi do unieczynnienia prawidłowego chromosomu X. Dwie trzecie przypadków DMD/BMD jest skutkiem mutacji przekazywanej synowi przez matkę-nosicielkę, pozostałe wywołane są nowopowstałymi mutacjami. Za pomocą śledzenia dziedziczenia polimorficznych sekwencji mikrosatelitarnych możliwe jest ustalanie i wykluczanie nosicielstwa u kobiet z rodzin dotkniętych DMD/BMD. Niekiedy spotyka się kobiety, które urodziły dwóch chorych synów i u których wykluczono nosicielstwo mutacji, są one mozaikami germinalnymi. 8. Nowe strategie terapii genowej. J. Dulak Zakład Biochemii Komórki, Uniwersytet Jagielloński, Kraków Terapia genowa wykorzystuje kwasy nukleinowe w charakterze leków i ma na celu ograniczenie nie tylko objawów, ale przede wszystkim eliminowanie przyczyn chorób. Metoda ta może być teoretycznie stosowana do leczenia wszystkich chorób, bowiem każde schorzenie ma podłoże genetyczne. Ze zrozumiałych względów terapię genową po raz pierwszy zastosowano do leczenia chorób wrodzonych, jednak obecnie jej wykorzystanie dotyczy w znacznie większym stopniu chorób nabytych, w szczególności nowotworów. Pierwszą kontrolowaną próbę kliniczną terapii genowej wykonano w roku 1990 u dzieci chorych na ciężki złożony niedobór odporności (SCID), spowodowany brakiem prawidłowego genu deaminazy adenozynowej. Do chwili obecnej przeprowadzono lub rozpoczęto niemal osiemset prób klinicznych, jednak sukces w postaci trwałego wyleczenia osiągnięto tylko u kilkunastu chłopców chorych na inną odmianę złożonego niedoboru odporności, tzw. X-SCID. Niestety, u dwóch chłopców w dwa lata po udanym transferze brakującego genu pojawiła się białaczka. Chorobę zainicjowało wbudowanie wektora retrowirusowego w obręb onkogenu LMO2. 11 Warsztaty W takiej sytuacji nie dziwi fakt, że ograniczone sukcesy terapii genowej jak i ryzyko efektów ubocznych zachęcają do poszukiwania nowych genów terapeutycznych i strategii ich dostarczania lub hamowania. Obecnie największą uwagę przywiązuje się do opracowania skutecznych sposobów wprowadzania genów przy wykorzystaniu wektorów wirusowych umożliwiających długotrwałą ekspresję transgenu przy znacznym zarazem ograniczeniu procesów zapalnych rozwijających się w odpowiedzi na zastosowany nośnik. Do takiej grupy należą przede wszystkim wektory AAV (adeno-asosciated virsues) oraz wektory adenowirusowe III generacji, tzw. helper-dependent. Dodatkowe możliwości stwarza regulowana ekspresja genów terapeutycznych, przy wykorzystaniu endogennych promotorów tych genów lub sekwencji umożliwiających ekspresję transgenu tylko w określonych warunkach, np. w niedotlenionych tkankach. Modyfikacja kapsydu wektorów wirusowych oraz użycie promotorów tkankowo-specyficznych pozwoli ponadto na ukierunkowaną ekspresję genów tylko w komórkach wybranych narządów. Zastosowanie wymienionych strategii jest brane pod uwagę m.in. w próbach leczenia miażdżycy i jej konsekwencji, np. choroby niedokrwiennej czy zawału serca. Nowe możliwości stwarza także użycie genów, takich jak syntazy tlenku azotu czy oksygenaza hemowa-1. Ich produkty (tlenek azotu oraz tlenek węgla, biliwerdyna i bilirubina) wykazują działanie przeciwzapalne, ograniczają rozwój miażdżycy, uszkodzenie mięśnia sercowego spowodowane niedotlenieniem i reperfuzją oraz stymulują powstawanie nowych naczyń krwionośnych. Zwiększenie skuteczności terapii genowej nowotworów może być z kolei osiągnięte poprzez ukierunkowywane hamowanie ekspresji tych samych genów. Geny przeciwzapalne mogą bowiem zwiększać oporność komórek nowotworowych na działanie chemioterapeutyków, a także nasilać procesy angiogenezy stymulujące wzrost guzów. Badacze zajmujący się ograniczaniem aktywności tych genów duże nadzieje wiążą z niedawno odkrytą specyficzną metodą hamowania ekspresji genów przez małe, dwuniciowe cząsteczki interferującego RNA. Pełne wykorzystanie informacji uzyskanych dzięki poznaniu sekwencji genomu człowieka umożliwi znalezienie nowych celów w terapii genowej chorób wrodzonych i nabytych. Udoskonalenie metod transferu genów i stworzenie skutecznych sposobów ich regulacji przyczynić się może do zwiększenia efektywności prób klinicznych i uzyskania przez terapię genową statusu rzeczywistej metody leczniczej. 12 Wykłady inauguracyjne Wykład inauguracyjny W1. Co wiemy, a czego nie wiemy, o historii Polskiego Towarzystwa Genetycznego? Alicja Kulecka Instytut Historyczny Uniwersytetu Warszawskiego Dzieje Polskiego Towarzystwa Genetycznego są nierozłączną częścią historii i nauki polskiej. Rozwój tej instytucji uwarunkowany był wieloma czynnikami. Do ich grona należał m.in. rozwój badań genetycznych, ich organizacja, powstawanie środowisk uprawiających tą, interdyscyplinarną dziedzinę wiedzy. Dynamiczny rozwój genetyki stanowił jedną z form realizacji ludzkich marzeń o poznaniu tajników istnienia – praw zmienności i dziedziczenia, decydujących o biologicznej jakości życia na Ziemi. Powstanie Towarzystwa w 1966 r. zależne było również od sytuacji politycznej w Polsce. Dopiero wydarzenia Października 1956 r., których konsekwencją była destalinizacja życia naukowego, umożliwiły rozpoczęcie starań o utworzenie tej instytucji. Brak monograficznych badań, dotyczących procesu decyzyjnego w nauce i instytucjach nią kierujących, uniemożliwia wyjaśnienie wszystkich zagadnień związanych z genezą Towarzystwa. Zasadniczy problem zawiera się w pytaniu – co spowodowało, że tak długo zwlekano z wyrażeniem zgody na działalność Polskiego Towarzystwa Genetycznego, czy był to przypadek szczególny, czy też stanowisko typowe wobec wszystkich towarzystw naukowych? Trudno też udzielić odpowiedzi na pytanie – w jaki sposób przebiegały pertraktacje, których celem miało być powołanie do życia towarzystwa skupiającego genetyków? Na podstawie dotychczas wykorzystanych źródeł widoczna jest duża rola środowiska poznańskiego w tych staraniach. Szczególną rolę odgrywał w nich profesor Stefan Barbacki, rolnik, genetyk, twórca pierwszego polskiego czasopisma naukowego poświęconego sprawom genetyki. Efektem jego zabiegów było utworzenie Towarzystwa, uchwalenie statutu, wybór i organizacja władz, rejestracja Towarzystwa. Po nich nastąpił rozwój struktury terytorialnej. Celem działania było upowszechnianie wiedzy genetycznej, popularyzacja badań z zakresu genetyki, edukacja w zakresie genetyki i nauk pokrewnych. Program ten był realizowany poprzez zebrania naukowe, odczyty, wystawy, publikacje, organizację konferencji, sympozjów, seminariów, zjazdów. Władzą najwyższą Towarzystwa był organ kolegialny – Walne Zgromadzenie, od 1976 r. Walny Zjazd. Statut Towarzystwa był dwukrotnie nowelizowany w 1976 i 1995 r. Pierwsza z tych nowelizacji wydłużyła okres kadencyjny z dwóch do trzech lat. Ustanowiła zasadę wyboru przewodniczącego przez Zarząd Towarzystwa, w miejsce obowiązującego poprzednio wyboru przez Walne Zgromadzenie. Nowelizacja z 1995 r. przywróciła zasadę wyboru przewodniczącego przez Walny Zjazd. Zmiany w statucie w 1976 r. umożliwiły przyznawanie nagród Polskiego Towarzystwa Genetycznego. Pierwszym przewodniczącym Towarzystwa został wybrany profesor Wacław Gajewski, biolog, genetyk, związany z Uniwersytetem Warszawskim oraz Instytutem Biochemii i Biofizyki PAN. Pełnił tę funkcję w okresie 1966-1974 i 1983-1986. Był osobą najdłużej sprawującą godność przewodniczącego. Funkcję tą pełnili również profesorowie: Tadeusz Lachowicz (1974-1976), Czesław Tarkowski(1976-1979), Lucjan Wiśniewski (1979-1983), Henryk Hübner (1986-1989), Janusz Limon (1989-1992), Jacek Zaremba(1992-1995), Andrzej Paszewski(1995-1998), Stefan Malepszy(1998-2001), Marek Świtoński(2001-2004). Towarzystwo składało się początkowo z pięciu oddziałów: krakowskiego, lubelskiego, poznańskiego, warszawskiego i wrocławskiego. Najliczniejsze były oddziały warszawski i poznański. W latach 1969-1987 powstały kolejne oddziały w Białymstoku (1969), Gdańsku (1976), Łodzi (1978), Szczecinie (1987) i na Śląsku (1987). W Towarzystwie istnieją także sekcje tematyczne – Cytogentyki Zwierząt Gospodarskich oraz Mutagenezy Środowiskowej. Największą liczbę, 845 członków, Towarzystwo osiągnęło w 1989 r. Podstawę działalności finansowej Towarzystwa stanowią składki członkowskie oraz dotacje państwowe i prywatne. W gronie członków honorowych Towarzystwa znalazła się grupa wybitnych genetyków polskich m.in. Stefan Barbacki, Wacław Gajewski, Antoni Horst, Laura Kaufman, Jerzy Korohoda, Władysław Kunicki Goldfinger, Zbigniew Lorkiewicz, Edmund Malinowski, Tadeusz Ruebenbauer, Maria Skalińska, Andrzej Słaboński, Kazimierz Świeżyński, Maria Ferguson-Smith, Andrzej Paszewski i Jacek Zaremba. Reprezentują różne środowiska prowadzące badania z zakresu genetyki, zarówno terytorialne, jak i instytucjonalne i zawodowe. Towarzystwo wykształciło dwie charakterystyczne dla siebie formy działalności: organizację Zjazdów Genetyków Polskich i nagrody za prace naukowe, podręczniki i popularyzację. Zjazdy stanowią istotne forum wymiany poglądów i doświadczeń pomiędzy różnymi środowiskami prowadzącymi badania z zakresu genetyki. Służą idei interdyscyplinarności Przyczyniają się do rozwoju myśli i metod badań. Wzbogacają refleksję dotyczącą etyki uprawiania nauki, genetyki w szczególności. Nagrody przyczyniają się do promocji badań z zakresu genetyki oraz pośrednio lepszego wyposażenia warsztatów badawczych. Historia Polskiego Towarzystwa Genetycznego inspirować może do dalszych badań dotyczących dziejów genetyki polskiej – dorobku poszczególnych ośrodków prowadzących badania z tego zakresu, kierunków badawczych, szkół 13 Wykłady inauguracyjne badawczych, analizom i ocenom myśli wybitnych genetyków polskich. Służyć one będą pełniejszemu poznaniu dorobku intelektualnego Polski oraz wkładu w dziedzictwo światowe. W2. Genome Architecture, rearrangements, evolution and genomic disorders. J. R. Lupski Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, USA. The term “genomic disorder” refers to a disease that is caused by an alteration of the genome that results in complete loss, gain, or disruption of the structural integrity of a dosage sensitive gene(s). In most of the common chromosome deletion/duplication syndromes, the rearranged genomic segments are flanked by large (usually>10kb), highly homologous low copy repeat (LCR) structures that can act as recombination substrates. Recombination between nonallelic LCR copies, also known as non-allelic homologous recombination (NAHR), can result in deletion or duplication of the intervening segment. Recent findings suggest that other chromosomal rearrangements, including reciprocal, Robertsonian, and jumping translocations, inversions, isochromosomes and small marker chromosomes, may also involve susceptibility to rearrangements related to genome structure or architecture. In several cases, LCRs, AT-rich palindromes and pericentromeric repeats are located at such rearrangement breakpoints. Analysis of the products of recombination at the junctions of the rearrangements reveals both homologous recombination and non-homologous end joining (NHEJ) as causative mechanisms. Thus, a more global concept of genomic disorders emerges in which susceptibility to rearrangements occurs due to underlying complex genomic architecture. Interestingly, this architecture plays a role not only in disease etiology through constitutional rearrangements, but also in somatic rearrangement events associated with cancers and in primate genome evolution. 14 Genetyka człowieka Neurogenetyka Komunikaty ustne: W3. Ustalenie udziału genu MECP2 w patogenezie zespołu Retta i zespołów Retto-podobnych. Ewa Popowska (1), E. Ciara (1), D. Jurkiewicz (1), D. Piekutowska-Abramczuk (1), M. Borucka-Mankiewicz (1), P. Kowalski (1), M. Gajdulewicz (1), K. Spodar (1), K. Chrzanowska (1), A. Tylki-Szymańska (2), M. Krajewska-Walasek (1) (1) Zakład Genetyki Medycznej (2) Klinika Pediatrii, Instytut Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka, al. Dzieci Polskich 20, 04-730 Warszawa Zespół Retta jest postępującą chorobą zaburzającą rozwój neurologiczny, która dziedziczy się w sposób dominujący sprzężony z chromosomem X. Objawy kliniczne obserwowane są prawie wyłącznie u pacjentów płci żeńskiej, gdyż choroba jest w większości przypadków śmiertelna dla płodów płci męskiej. W latach 1998 i 1999 zmapowano gen MECP2 w locus Xq28 i stwierdzono, że koduje białko chromosomalne MeCP2, które pełni funkcję transkrypcyjnego represora, regulującego aktywność genów. W roku 1999 opisano pierwsze mutacje w genie MECP2 u pacjentów z zespołem Retta. Ostatnio stwierdzono, że zmiany w budowie genu MECP2 są też odpowiedzialne za wariant PSV, nietypową formę zespołu Retta, a także niektóre przypadki opóźnienia umysłowego i autyzmu oraz nieliczne przypadki klinicznie rozpoznanego zespołu Angelmana, w których nie wykryto rozległych delecji i zmiany wzoru metylacji w regionie 15q11-13. Celem prezentowanych badań było ustalenie udziału genu MECP2 w patogenezie zespołu Retta i zespołów Retto-podobnych w populacji polskiej. Analizą molekularną objęto 123 pacjentki, u których wstępnie rozpoznano klasyczny zespół Retta (77), zespół Retto-podobny (8) lub zespół Retta/zespół Angelmana (38). Analiza SSCP a następnie sekwencjonowanie wykazało obecność zmian w budowie genu MECP2 u 42 pacjentek, pochodzących z wszystkich analizowanych grup. Ogółem zidentyfikowano 24 różne mutacje, wynikające z substytucji nukleotydowych (12), delecji (9), insercji (2) lub delecjo-insercji (1). Mutacje zlokalizowane są głównie w regionie kodującym domenę supresorową transkrypcji (TRD) a także w regionie kodującym domenę wiążącą metylo-CpG (MBD) lub w końcowej części genu poza domenami. U dwu pacjentek wykryto jednonukletydowe zmiany w konserwowanym regionie 3’UTR. Badania były finansowane z grantu KBN nr 3P05E11222. W4. Mutacje genu ARX częstą przyczyną niepełnosprawności intelektualnej. Magdalena Nawara (1), Karine Poirier (3), Krzysztof Szczałuba (1), Krystyna Chrzanowska (4), Jacek Pilch (5), Jamel Chelly (3), Jerzy Bal (1), Tadeusz Mazurczak (1) (1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Kaspraka 17a, 01-211 Warszawa (2) Studium Medycyny Molekularnej (3) Institut Cochin, Département de Génétique et Pathologie Moléculaire Equipe de Génétique et Physiopathologie des Retards Mentaux 24, rue du Faubourg St Jacques, 75014 PARIS (4) Instytut „Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka”, Zakład Genetyki Medycznej, Al. Dzieci Polskich 20, 04-730 Warszawa (5) Klinika Pediatrii i Neurologii wieku Rozwojowego ŚAM, Medyków 16, 40-752 Katowice Badania nad molekularnym podłożem izolowanych postaci niepełnosprawności intelektualnej (NI) doprowadziły do zidentyfikowania 20 genów odpowiedzialnych za postać choroby sprzężoną z chromosomem X (MRX). Geny 15 Genetyka człowieka te kodują różne białka wpływające m.in. na organizację włókien aktynowych w odpowiedzi na bodźce, uwalnianie neurotransmitterów w synapsach i tworzenie połączeń między neuronami. Mutacje w poszczególnych genach są odpowiedzialne jedynie za 0,5–1% przypadków NI. Wyjątkiem jest gen ARX (Aristaless Related Homeobox gene), którego różne defekty identyfikowano w licznych rodzinach z MRX, zespołem Westa, zespołem Partingtona, XLAG (X-linked lissencephaly with abnormal genitalia), ISSX (X-linked infantile spasms) i dystonią. ARX należy do genów homeoboxu, kodujących czynniki transkrypcyjne kierujące rozwojem podczas embriogenezy. Pacjenci: Do badań genu ARX wybrano 180 osób z niespecyficzną postacią NI, których historia rodziny wskazywała na dziedziczenie choroby jako cechy sprzężonej z chromosomem X. U wszystkich badanych wykluczono zespół FRAXA i FRAXE. Przeprowadzono test w kierunku najczęstszej mutacji (428-451 dup). Jednocześnie u wszystkich pacjentów wykonano screening techniką DHPLC w kierunku mutacji punktowych w genie ARX. Wyniki: Duplikację 24 pz (428-451dup) stwierdzono u 4 pacjentów. Do chwili obecnej w rodzinach 2 probantów przeprowadzono analizę kosegregacji mutacji z fenotypem NI. W obu potwierdzono patogenny charakter mutacji. W jednej z rodzin u matki dwóch chorych chłopców stwierdzono mozaikowatość germinalną pod względem badanej mutacji. Analiza wyników DHPLC jest w trakcie. Wnioski: Mutacja 428-451dup w ARX jest najczestszą znaną przyczyna MRX u chłopców. W przypadkach, gdy w rodzinie jest kilku chorych mężczyzn, a NI jest przenoszona przez kobiety, po wykluczeniu zespołu FRAXA należy wykonać badanie w kierunku duplikacji w genie ARX. W5. Uszkodzenie genu SLC1A2 u chłopca z niepełnosprawnością intelektualną, padaczką i translokacją t(1;11)(p33; p13). Magdalena Mayer (1), M. Wiśniewska (1), J. Kołowska (3), M. Hoeltzenbein M (2), V. M. Kalscheuer (2), H. H. Ropers (2), A. Latos-Bieleńska A (1, 3) (1) Katedra i Zakład Genetyki Medycznej, Poznań; (2) Max Planck Institute for Molecular Genetics, Berlin-Dahlem, Niemcy; (3) Centrum Genetyki Medycznej NZOZ, Poznań Badania pacjentów, u których występowanie choroby związane jest z obecnością zrównoważonych aberracji chromosomowych, umożliwiają identyfikację genów leżących u podstaw choroby oraz badanie korelacji genotyp-fenotyp. W tym kontekście przeprowadzono analizę regionów pęknięć chromosomów u pacjenta z głęboką niepełnosprawnością intelektualną, padaczką i zanikiem kory mózgowej, u którego wykryto zrównoważoną translokacją chromosomową de novo t(1;11)(p33;p13). Za pomocą FISH z użyciem sond BAC i PAC zidentyfikowano klony obejmujące miejsca pęknięć chromosomów pary 1 i 11 zaangażowanych w translokację. Analizy in silico wykazały obecność genu SLC1A2 kodującego transporter glutaminianu, w obrębie klonu zawierającego miejsce pęknięcia na chromosomie pary 11. Dalsze analizy z wykorzystaniem technik mapowania restrykcyjnego i Southern blot wykazały pęknięcie genu SLC1A2 pomiędzy eksonem 9 i 10. Transporter glutaminianu odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu odpowiedniego stężenia zewnątrzkomórkowego neurotransmitera pobudzającego –glutaminianu, jest zatem doskonałym genem kandydatem, którego uszkodzenie może wiązać się z wyżej opisanym fenotypem pacjenta. Na chromosomie pary 1, klon obejmujący miejsce pęknięcia zawiera niewielki fragment nie scharakteryzowanego, nowego genu. Porównanie sekwencji tego genu z ludzkim i mysim mRNA i ESTs pochodzącymi z GenBanku, wskazuje, że koniec 5’ tego genu jest prawdopodobnie niekompletny. Sklonowanie i zsekwencjonowanie fragmentów DNA zawierających punkty pęknięć oraz eksperymenty RT-PCR w celu dokładnego określenia końca 5’ nowego genu wykażą wkrótce, czy gen ten również uległ uszkodzeniu oraz czy w wyniku translokacji chromosomowej doszło do powstania genu fuzyjnego. Praca w ramach działalności statutowej Katedry Genetyki Medycznej w Poznaniu i współpracy z Max Planck Institut f. Molekulare Genetik w Berlinie. 16 Genetyka człowieka W6. Spektrum fenotypowe chorób kręgu Charcot-Marie-Tooth, u chorych, u których stwierdzono mutacje w genie MPZ. Andrzej Kochański (1), Hanna Drac (1, 2), Dagmara Kabzińska (1), Adam Nowakowski (1), Katarzyna Rowińska-Marcińska (1, 2), Barbara Ryniewicz (2), Irena Hausmanowa-Petrusewicz (1) (1) Zespół Badawczo-Leczniczy Chorób Nerwowo-Miesniowych Instytutu Medycyny Doswiadczalnej i Klinicznej Polskiej Akademii Nauk (2) Klinika Neurologiczna Akademii Medycznej w Warszawie Wstęp: Mutacje genu MPZ stwierdza się w różnych odmianach choroby Charcot-Marie-Tooth (CMT). Cel pracy: Badanie genu MPZ w grupie chorych z fenotypem CMT1, CMT2 i wrodzoną neuropatią hipomielinizacyjną (CHN). Wyniki: Mutacje genu MPZ stwierdzono w czterech rodzinach. Mutacja Glu56Lys została stwierdzona u trzech chorych z fenotypem CMT2 (1). Mutacja Asn131Lys (2) oraz Thr65Ala (3) została wykryta u 6 chorych z fenotypem tzw. „ogniskowo pofałdowanej mieliny”. U jednej chorej z wczesnodziecięcą postacią choroby CMT1 stwierdzono mutację Leu190fs (4); natomiast mutacja Thr124Lys została znaleziona u chorego z CHN(5).� Wnioski: 1. Mutacje genu MPZ występują w chorobach CMT1B, CMT2 oraz CHN (6). 2. Typ substytucji aminokwasowej wydaje się określać fenotyp CMT. Piśmiennictwo: 1. An axonal form of Charcot-Marie-Tooth disease with a novel missense mutation in the MPZ gene. Journal of Peripheral Nervous System 2004, Mar; 9(1): 1-2 2. Focally folded myelin in Charcot-Marie-Tooth type 1B disease is associated with Asn131Lys mutation in Myelin Protein Zero gene. European Journal of Neurology 2003; 10: 547-549 3. The novel mutation, Thr65Ala, In the MPZ gene in the patient with Charcot-Marie-Tooth type 1B with focally folded myelin. Neuromuscular Disorders, 2004; 14:229-232 4. Early onset Charcot-Marie-Tooth type 1B disease caused by a novel Leu190fs mutation in the myelin protein zero gene. European Journal of Paediatric Neurology, 2004, w druku 5. A novel MPZ gene mutation in congenital neuropathy with hypomyelination Neurology, w druku 6. Mutations in the Myelin Protein Zero gene result in a spectrum of CMT phenotypes. Acta Myologica, w druku W7. Powtórzenia CAG/CAA w genie SCA17/TBP. Dorota Hoffman-Zacharska (1, 2), Anna Sułek (2), Joanna Empel (3) (1) Pracownia Neurogenetyki, Instytut Matki i Dziecka w Warszawie (2) Zakład Genetyki, Instytut Psychiatrii i Neurologii w Warszawie (3) Zakład Genetyki, Uniwersytet Warszawski Ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typu 17 (SCA17 – spinocerebellar ataxia type 17) należy do grupy ataksji rdzeniowomóżdżkowych o dziedziczeniu autosomalnym dominującym (ADCA – autosomal dominant ataxia). Grupa ta, między innymi, obejmuje 9 jednostek, których podłoże molekularne stanowi niestabilność trójnukleotydowych sekwencji (TNR –trinucleotide repeats) tworzących ciągi powtórzeń w otwartej ramce odczytu genów lub regionach niekodujących. Wszystkie te choroby zaliczane są do „rodziny chorób trójnukleotydowych” (TREDs – triplet repeats disorders) charakteryzujących się wspólnym mechanizmem mutacji (tzw. mutacji dynamicznych) – ekspansją trójnukleotydowych sekwencji mikrosatelitarnych w wyniku tendencji do tworzenia przez te sekwencje nietypowych struktur (np. struktura szpilki do włosów) w trakcie procesu replikacji DNA. SCA 17 opisana została w roku 1999 jako postępująca choroba neurodegeneracyjna o obrazie klinicznym przypominającym chorobę Huntingtona, lecz spowodowana zwielokrotnieniem sekwencji CAG/CAA w otwartej ramce odczytu genu kodującego czynnik transkrypcyjny TBP (TATA-binding protein). Mutacja nie zaburza ekspresji genu, lecz prowadzi do syntezy białka o wydłużonej domenie poliglutaminowej na jego N-końcu. U osób zdrowych liczba glutamin waha się w granicach 25 –42, zakres patogenny wyznaczono jako 45 –66. Obszar DNA kodujący glutaminy w genie TBP można przedstawić jako układ pięciu motywów obejmujących dwa polimorficzne ciągi powtórzeń (CAG)n:: [(CAG)3(CAA)3][(CAG)nI][CAA CAG CAA][(CAG)nII] [CAA CAG].Taki schemat został zaproponowany na podstawie analizy 157 alleli z populacji ogólnej. Analiza sekwencji tego obszaru dla opisanych przypadków SCA17 wskazuje jednak, że nie zawsze taki układ motywów jest zachowany. Stwierdzono, że nie tylko ekspansja powtórzeń CAG w rejonach polimorficznych może prowadzić do wydłużenia sekwencji kodującej glutaminy. Może dochodzić również do zaburzenia podstawowego układu motywów poprzez ich częściowe delecje, co powoduje zwiększoną niestabilność ciągów (CAG)n lub duplikacje. Na podstawie opublikowanych danych dotyczących sekwencji tego 17 Genetyka człowieka obszaru jak i wyników własnych badań proponujemy nowy schemat jego organizacji, jako układ trzech motywów [(CAG)3 (CAA)2][CAA(CAG)6-11CAA CAG][CAA(CAG)9-21CAA CAG]. Podstawowym motywem ulegającym mutacji zgodnie z proponowanych schematem byłaby cała jednostka [CAA (CAG)n CAA CAG] –delecja jednej z takich jednostek prowadziłaby do utraty stabilności i silnej ekspansji powtórzeń (CAG)n w pozostałej jednostce. Innym mechanizmem prowadzącym do wydłużenia całego rejonu mogłaby być duplikacja całego motywu. Przedstawione zostanie porównanie sekwencji DNA zmutowanego obszaru kodującego glutaminy dla opublikowanych przypadków SCA17, których analiza pozwoliła nam na zaproponowanie nowego schematu jego organizacji. W8. The position of the aggregation-causing sequence affects both the rate and the pattern of intracellular protein accumulation. Daniel Bąk (1), Gary Cutting (2), Michał Milewski (1) (1) Medical Genetics Department, Institute of Mother and Child, Kasprzaka 17A, Warsaw (2) Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA Protein aggregation is a common phenomenon accompanying so-called conformational (deposit) disorders e.g. Parkinson’s, Huntington’s and Alzheimer’s diseases. The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a commonly used model for the aggregation process. It has been previously shown that the aggregation of the Cterminal fragment of CFTR (CFTR C-ter) is caused by a 9-aa region, called the ag sequence. Two amino acids within this region, histidine (H) and arginine (R), seem to be crucial for this aggregation. The aim of this study was to test whether changing the position of the ag region or the HR motif within the CFTR C-terminal sequence will affect the aggregation rate and the distribution of protein aggregates. We have found that the peptide’s ability to aggregate was not always retained when the position of the ag sequence was altered. Additionally, the HR motif alone was usually unable to enhance the aggregation rate, when introduced into different positions within the CFTR C-terminus. Interestingly, the morphology of aggregates seemed to depend on the ag/HR position. The most relaxed structures were observed when the ag sequence was located at the very end of the CFTR C-terminus, whereas the same location for the HR motif resulted in the most compact aggregates. We conclude that both the rate of the aggregation process and the intracellular distribution of aggregating protein can be modified by the sequences accompanying the aggregation-causing motifs. Work partially financed from grant PBZ/KBN/042/P05/06. W9. Badania nad genetycznym uwarunkowaniem postaci rodzinnej i sporadycznej choroby Alzheimera Anna Kowalska (1), Wojciech Kozubski (2), Mieczysław Wender (3) (1) Instytut Genetyki Człowieka PAN (2) Katedra i Klinika Neurologii, Akademia Medyczna im. K.Marcinkowskiego, Poznań, (3) Zespół Badawczo-Leczniczy Chorób Neuroimmunologicznych, Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej PAN, Poznań Genetyka choroby Alzheimera (AD: Alzheimer’s disease) jest złożona. Podłoże genetyczne AD jest niejednorodne, a typ dziedziczenia zależy od postaci choroby. W klasyfikacji AD opartej na takich kryteriach jak: wiek chorego w okresie wystąpienia pierwszych objawów choroby oraz liczba osób dotkniętych otępieniem w rodzinie chorego, wyróżnia się: postać wczesną (<65 r.ż., EOAD) i postać późną (> 65 r.ż., LOAD) oraz postać rodzinną, (z co najmniej dwiema osobami chorymi; FAD) i sporadyczną (bez uwarunkowań rodzinnych; SAD). W ok. 5% przypadków, najczęściej w rodzinach z EOAD, choroba dziedziczy się według praw Mendla w sposób autosomalny dominujący (ADFAD). Wykryto dotąd trzy geny odpowiedzialne za ADFAD (geny FAD): gen białka prekursora amyloidu (chromosom 21 q21.2), gen Preseniliny 1 (PS1, chromosom 14 q24.3), oraz gen Preseniliny 2 (chromosom 1 q31-42). Mutacje w genach FAD są odpowiedzialne za rozwój choroby w 50% rodzin z ADFAD. Ponad 85% chorych stanowią przypadki sporadyczne późne, w których AD, podobnie jak w rodzinach z LOAD, jest uwarunkowana wieloczynnikowo z udziałem zarówno czynników genetycznych, jak i środowiskowych. Liczne polimorfizmy DNA w genach związanych z patogenezą AD o stosunkowo niskim stopniu penetracji, ale wysokim rozpowszechnieniu w populacji są rozważane jako ew. czynniki ryzyka genetycznego. Badaniami nad podłożem genetycznym AD objęto grupę 140 chorych z AD (kryteria NINCDS-ADRDA) z regionu woj. poznańskiego. W grupie 55 chorych z EOAD wykonano analizę mutacji w genach FAD. Wykryto 4 mutacje w genie PS1 w rodzinach z ADFAD: A246E, P267L, E3188G i L424R. W grupie przypadków sporadycznych z EOAD i LOAD przeprowadzono analizę asocjacji pomiędzy AD a polimorfizmami DNA w genach m.in.: Alfa-chymotrypsyny, Alfa-2makroglobuliny, Apolipoproteiny E, Interleukiny 1α, Interleukiny 1β, Antagonisty receptorowego (IL-1RA), Inhibitora 18 Genetyka człowieka proteaz, Katepsyny D, Kaweoliny 3, Preseniliny-1, Transferyny. Wyniki analizy statystycznej dotyczącej istotności obserwowanych różnic w grupach osób chorych i kontrolnych oraz ew. interakcji pomiędzy badanymi polimorfizmami DNA zostaną przedyskutowane w kontekście możliwości wykorzystania badań dla celów poradnictwa genetycznego. Komunikaty plakatowe: P1. Algorytm postępowania w diagnostyce molekularnej chorób neurodegeneracyjnych o obrazie klinicznym zbliżonym do choroby Huntingtona Wioletta Krysa (1), Anna Sułek (2), Dorota Hoffman-Zacharska (3), prof. Jacek Zaremba (2) (1) Instytut Psychiatrii i Neurologii, Zakład Genetyki, Pracownia Analizy DNA (2) Instytut Psychiatrii i Neurologii, Zakład Genetyki (3) Instytut Matki i Dziecka w Warszawie, Klinika Neurologii, Epileptologii i Zaburzeń Snu u Dzieci i Młodzieży, Pracownia Neurogenetyki Choroba Huntingtona (HD) należy do postępujących neurodegeneracyjnych chorób i cechuje się monogenowym (IT15), autosomalnym (4p16.3), dominującym wzorem dziedziczenia. Czynnikiem etiologicznym HD jest mutacja dynamiczna –ekspansja trójnukleotydowej sekwencji (CAG)n w I eksonie genu IT15 i powodująca zwiększenie liczby reszt glutaminowych w kodowanym przez niego białku huntingtynie. Ekspresja kliniczna HD obejmuje m.in. ruchy mimowolne tułowia i kończyn, zaburzenia psychiczne i osłabienie funkcji poznawczych. Występowanie powyższych objawów klinicznych i dominującego typu dziedziczenia nie zawsze jest skutkiem mutacji w genie IT15, czego dowodzi dość liczna grupa pacjentów, u których stwierdzono obecność tylko prawidłowych alleli tego genu. Wobec tego do diagnostyki molekularnej chorób podobnie się manifestujących, ale z wykluczoną mutacją w genie IT15, wprowadzono algorytm postępowania polegający na analizie trzech innych genów, w których zwielokrotnienie powtórzeń CAG lub CTG prowadzi do wystąpienia objawów takich jak w chorobie Huntingtona. 1. Mutacja dynamiczna genu TBP (TATA Binding Protein) zaburza lub hamuje funkcje jego białkowego produktu, będącego podstawowym czynnikiem inicjacji transkrypcji oraz wchodzącego w skład podjednostki polimerazy II RNA wiążącej DNA o kluczowym znaczeniu dla ekspresji większości genów. Ekspansja trójek nukleotydowych CAG w tym locus prowadzi do wystąpienia objawów choroby neurodegeneracyjnej zwanej SCA17 (Spinocerebellar Ataxia Type 17). 2. Mutacja w jednym z alleli JPH3 powoduje wystąpienie choroby nazwanej HDL-2 (Huntington Disease Like 2). Produkt białkowy tego genu wchodzi w skład kompleksu odpowiadającego za utrzymanie prawidłowego stanu polaryzacji błony komórkowej. 3. Ekspansja niestabilnej sekwencji trójkowej w obrębie genu CTG-B37 powoduje jednostkę chorobową nazwaną z ang. DRPLA (Dentatorubral – pallidoluysian atrophy) charakteryzującą się autosomalnym dominującym sposobem dziedziczenia. Gen CTG-B37 koduje białko o jeszcze nie poznanej funkcji. W obrazie klinicznym w/w mutacji dynamicznych mieszczą się liczne objawy charakterystyczne dla HD i kilku innych jednostek chorobowych. Dlatego badania genetyczne mają znaczenie rozstrzygające dla rozpoznania, leczenia i prognozowania w poszczególnych przypadkach. P2. The −22 c/t polymorphism in presenilin 1 gene is not connected with late-onset and early-onset familia Alzheimer’s disease. Aleksandra Maruszak (1), Krzysztof Safranow (2), Dorota Religa (3), Magda Gacia (4), Violetta Dziedziejko (2), Małgorzata Kobryś (4), Cezary Zekanowski (1, 4), Dariusz Chlubek (2), Maria Barcikowska (4, 5) (1) Laboratory of Neurodegeneration, International Institute of Molecular and Cell Biology, Warszawa, Poland (2) Department of Biochemistry and Chemistry, Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland. (3) Department of Neurotec, Section of Experimental Geriatrics, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden (4) Department of Neurodegenerative Disorders, Medical Research Centre, Polish Academy of Sciences, Warszawa, Poland (5) Department of Neurology, MSWiA Hospital, Warszawa, Poland The −22 c/t polymorphism in the promoter of the presenilin 1 gene (PSEN1) is associated with increased risk for Alzheimer’s disease (AD) in some populations. It was shown that −22 c allele is connected with two-fold decrease in promoter activity. We analyzed the impact of the polymorphism in groups of Polish late-onset, early-onset AD patients and control subjects. 19 Genetyka człowieka Our results suggest that −22 c/t polymorphism is not connected with AD in Polish population. The −22 t allele showed a high degree of linkage disequillibrium with –2797 insertion of 13 bp. An additional –2897g/t polymorphism is also not connected with −22 c/t one and is not a risk factor for AD. P3. Two novel mutations in presenilin 1 gene connected with familial, early-onset Alzheimer’s disease. Maciej Golan (1), Beata Pepłońska (1), Wanda Lipczyńska-Łojkowska (2), Krystiana Krzyśko (3), Maria Styczyńska (1, 4), Elżbieta Łuczywek (4), Sławomir Filipek (3), Jerzy Kulczycki (2), Maria Barcikowska (1, 4), Cezary Żekanowski (1), Jacek Kuźnicki (5) (1) Department of Neurodegenerative Disorders, Medical Research Center, Polish Academy of Sciences, Warszawa, Poland (2) 1st Department of Neurology, Institute o Psychiatry and Neurology, Warszawa, Poland (3) Laboratory of Biomodelling, International Institute of Molecular and Cell Biology, Warszawa, Poland (4) Department of Neurosurgery, Medical research Center, Polish Academy of Science, Warszawa, Poland (5) Laboratory of Neurodegeneration, International Institute of Molecular and Cell Biology, Warszawa, Poland Alzheimer’s disease (AD) and frontotemporal dementia (FTD) are main causes of neurodegenerative disorders. In a minority of cases early-onset AD (EOAD) shows a pattern of autosomal dominant mode of inheritance with three causative genes identified so far: amyloid precursor protein gene (APP), presenilin 1 gene (PSEN1) and presenilin 2 gene (PSEN2). Familial FTD cases are connected with mutations at the MAPT gene, coding for tau protein. As the main difficulty is to differentiate clinically FTD from EOAD, differential molecular diagnosis could be helpful. We performed a screening for PSEN1 mutations in two patients: one with clinical diagnosis of probable EOAD and the second with a clinical diagnosis of typical FTD, with no mutations in the MAPT gene identified. Two novel mutations in the PSEN1 gene were identified: L424H and L226F, located in transmembrane domains V and VIII respectively. Both mutations were absent in a group of 67 familial AD cases, and in a group of 50 healthy controls. In silico analysis of L424H and L226F suggests influence on PS1 structure. Both mutations affect evolutionary conservative residues, and both substitutions changes their biochemical character. Post-mortem brain examination revealed typical histopathological AD features in the patient with L226F. Collected information strongly suggests that L424H and L226F are disease-causing mutations. P4. Badanie sekwencji kodującej i promotorowej genu Myelin Protein Zero (MPZ) w grupie 50 chorych z dziedziczną neuropatią ruchowo-czuciową Adam Nowakowski, Dagmara Kabzińska, Andrzej Kochański Zespół Badawczo-Leczniczy Chorób Nerwowo-Mięśniowych Instytutu Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej Polskiej Akademii Nauk Wstęp: Jak dotychczas opisano ponad 90 mutacji w genie MPZ u chorych z różnymi formami (HMSN). Cel pracy: 1. Poszukiwanie mutacji w genie MPZ oraz określenie częstości występowania mutacji w genie MPZ u chorych z HMSN. 2. Określenie przydatności metody polimorfizmu konformacji fragmentów jednoniciowych DNA (SSCP) oraz heterodupleksów DNA (HD) w badaniach genetycznych genu MPZ. Materiał i metody: Badanie sekwencji kodującej i promotorowej genu MPZ (SSCP, HD oraz sekwencjonowanie) wykonano u 46 chorych z rozpoznaniem: demielinizacyjnej (15) i aksonalnej formy CMT (23), wrodzonej neuropatii hipomielinizacyjnej (4) oraz choroby CMT o nieznanym podtypie (4) Wyniki: Zidentyfikowano dwie mutacje patogenne tj. E56K (aksonalna forma choroby CMT) i T124K (wrodzona neuropatia hipomielinizacyjna) oraz polimorfizm S228S. Nie stwierdzono mutacji w sekwencji promotorowej genu MPZ . Wnioski: Rozpoznanie wrodzonej neuropatii hipomielinizacyjnej i aksonalnej postaci choroby CMT powinno być wskazaniem do badania genu MPZ. Piśmiennictwo: A. Nowakowski, A. Kochański Screening of the myelin protein zero gene in patients with CharcotMarie-Tooth disease. Acta Biochimica Polonica 2004, 51(1), 273-280. 20 Genetyka człowieka P5. Nowa odmiana choroby Charcot-Marie-Tooth typu 2, charakterystyka kliniczna oraz wykluczenie 7 loci choroby CMT2. Andrzej Kochański (1), Marina Kennerson (2), Marta Kawulak (1), Barbara Ryniewicz (3), Katarzyna Rowińska-Marcińska (1,3), Gina Walizada (2), Adam Nowakowski (1), Irena Hausmanowa-Petrusewicz(1),Garth Nicholson (2) (1) Zespół Badawczo-Leczniczy Chorób Nerwowo-Miesniowych Instytutu Medycyny Doswiadczalnej i Klinicznej Polskiej Akademii Nauk (2) University of Sydney Neurobiology Laboratory, Anazac Research Institute, Concord Hospital NSW 2139, Australia (3) Katedra i Klinika Neurologii Akademii Medycznej w Warszawie Wstęp: Choroba Charcot-Marie-Tooth typu 2 (CMT2) o dziedziczeniu autosomalnym jest heterogenna genetycznie (7 loci, 5 genów). Cel pracy: 1. Określenie sprzężenia genetycznego do jednego z 7 loci choroby CMT 2 w pięciopokoleniowej rodzinie z fenotypem CMT2. 2. Charakterystyka kliniczna i elektrofizjologiczna badanej rodziny. Metody: W pięciopokoleniowej rodzinie CMT2 (9 chorych, 16 zdrowych członków rodziny) przeprowadzono badania neurologiczne i elektromiograficzne (6 chorych) oraz wykonano badanie analizy sprzężeń genetycznych (7 loci).� Wyniki: Wykluczono sprzężenie genetyczne na poziomie lod score <-2 z 7 loci dla CMT2 o dziedziczeniu autosomalnym dominującym. Wnioski: Wyniki przeprowadzonych badań wskazują, że w pięciopokoleniowej rodzinie występuje nowa odmiana CMT2, która cechuje się wczesnym początkiem oraz łagodnym przebiegiem klinicznym. Wyniki badań są kolejnym dowodem na heterogenność genetyczną choroby CMT2. P6. Analiza sekwencji eksonu 2-go genu LITAF/SIMPLE w grupie 35 chorych z dziedziczną neuropatią ruchowo-czuciową. Ewa Sołtysińska (1), G.M. Saifi (2), D. Kabzińska (1), A. Kochański (1), J. R. Lupski (2), � I. Hausmanowa-Petrusewicz (1) (1) Zespół Badawczo-Leczniczy Chorób Nerwowo-Miesniowych Instytutu Medycyny Doswiadczalnej i Klinicznej Polskiej Akademii Nauk (2) Baylor College of Medicine,Department of Molecular and Human Genetics, Houston, USA Wstęp: Jak dotychczas opisano trzy mutacje w eksonie 2-gim genu LITAF/SIMPLE u chorych z demielinizacyjną postacią choroby Charcot-Marie-Tooth typu 1C (CMT1C). Cel pracy: Poszukiwanie mutacji w genie LITAF/SIMPLE w 35 osobowej grupie chorych. Materiał i metoda: Badanie sekwencji eksonu drugiego genu LITAF/SIMPLE metodą polimorfizmu konformacji fragmentów jednoniciowych (SSCP) i heterodupleksów (HD) w grupie 35 chorych z CMT. W przypadku stwierdzenia innego niż dziki wzoru migracji produkt PCR był sekwencjonowany. Wyniki: Wykryto dwie mutacje w genie LITAF/SIMPLE tj.: Ile92Val oraz Leu122Val. Wnioski: 1.Substytucja Ile92Val jest polimorfizmem sekwencji genu LITAF/SIMPLE 2.Substytucja Leu122Val wydaje się być mutacją patogenną 21 Genetyka człowieka P7. Diagnostyka prenatalna w rdzeniowym zaniku mięśni. Wskazania, organiczenia, interpretacja wyników. Maria Jędrzejowska (1), Janusz Zimowski (2), Wojciech Wiszniewski (3), Danuta Sielska (3), Jerzy Bal (3), Tadeusz Mazurczak (3), Irena Hausmanowa-Petrusewicz (1), Jacek Zaremba (2) (1) Zespół Badawczy Chorób Nerwowo-Mięśniowych Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej PAN, Warszawa (2) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Psychiatrii i Neurologii (3) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka Dosiebny dziecięcy i młodzieńczy rdzeniowy zanik mięśni (SMA) jest chorobą genetycznie uwarunkowaną, dziedziczoną jako cecha autosomalna recesywna. Objawy choroby wywołane są mutacjami genu SMN1. Około 96,5% tych mutacji stanowi obualliczna delecja eksonu 7 w genie SMN1. Jednorodność podłoża molekularnego choroby umożliwia objęcie rodzin wysokiego ryzyka programem profilaktyki wtórnej. W pracy przedstawiamy podsumowanie wyników diagnostyki prenatalnej w kierunku SMA, prowadzonej od 1998 roku w dwóch ośrodkach w Polsce. W tym okresie wykonano 55 badań prenatalnych w 50 rodzinach ryzyka SMA. W 38 rodzinach, z 25% ryzykiem wystąpienia SMA u potomstwa, wykonano 43 badania prenatalne. W 8 przypadkach (18,6%) zidentyfikowano genotyp z delecją eksonu 7 w obu allelach genu SMN1. W pozostałych 12 rodzinach, w których prawdopodobieństwo wystąpienia choroby było niższe (różnego stopnia krewni probanta) lub nieznane (brak weryfikacji molekularnej rozpoznania klinicznego probanta) uzyskano 1 wynik potwierdzający chorobę u płodu. Na diagnostykę prenatalną decydowali się głównie rodzice, których dzieci cierpiały na ostrą postać SMA i którzy nie mieli dotąd zdrowego potomstwa (73% rodzin). P8. Badanie sekwencji kodującej genu GDAP-1 w grupie 48 chorych z demielinizacyjną i aksonalną postacią choroby Charcot-Marie-Tooth. Dagmara Kabzińska (1), Andrzej Kochański (1), Hanna Drac (1, 2), Barbara Ryniewicz(2) Irena Hausmanowa-Petrusewicz (1, 2) (1) Zespół Badawczo-Leczniczy Chorób Nerwowo-Mięśniowych Instytutu Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. M. Mossakowskiego Polskiej Akademii Nauk (2) Katedra i Klinika Neurologii Akademii Medycznej w Warszawie Wstęp: Choroba Charcot-Marie-Tooth typu 4A (CMT4A) stanowi najczęstszą odmianę dziedzicznych neuropatii ruchowo-czuciowych dziedziczących się w sposób autosomalny recesywny. Jak dotychczas opisano zaledwie 16 mutacji w genie GDAP-1 kodującym białko Ganglioside-induced differentation-associated protein 1 (Gdap1), o nieznanej jak dotąd funkcji biologicznej. Mutacje w genie GDAP-1 opisano zarówno w demielinizacyjnej jak i aksonalnej odmianie choroby Charcot-Marie-Tooth (CMT1 i CMT2). Cel pracy: Analiza sekwencji kodującej genu GDAP-1 w 48 osobowej grupie chorych z demielinizacyjną i aksonalną postacią choroby CMT. Materiał i metody: Badano sekwencję genu GDAP-1 metodami polimorfizmu fragmentów jednoniciowych (SSCP) oraz heterodupleksów DNA (HTD), u których analiza rodowodu wskazywała na recesywny sposób dziedziczenia choroby. Produkty Reakcji Łańcuchowej Polimerazy (PCR) o innym niż dziki wzorcu migracji w metodach SSCP i HTD sekwencjonowano. Wyniki: Zidentyfikowano trzy nowe mutacje w genie GDAP-1, tj. homozygotyczną mutacje Met116Thr u dwóch chorych braci z trzypokoleniowej rodziny CMT oraz heterozygotyczną mutację Met116Thr u 6 zdrowych nosicieli oraz dwie mutacje 318-1G>A/Ser130Cys u 7-letniego chłopca z CMT2, którego zdrowi rodzice są nosicielami mutacji 3181G>A oraz Ser130Cys. Biopsje nerwu u dwóch chorych braci i 7-letniego chłopca wykazały aksonopatie. Wnioski: 1.Zidentyfikowano trzy nowe mutacje w genie GDAP-1 2.Wyniki badań potwierdzają związek mutacji w genie GDAP-1 z aksonalną formą CMT 3.Badanie sekwencji genu GDAP-1 wskazane jest w przypadkach zarówno sporadycznych, jak i rodzinnych choroby CMT2. 22 Genetyka człowieka P9. Analiza nietypowych wyników diagnostyki molekularnej zespołu łamliwego chromosomu X. Danuta Sielska, Michał Milewski, Jerzy Bal Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Kasprzaka 17a, 01-211 Warszawa Za występowanie zespołu łamliwego chromosomu X, będącego najczęstszą w Polsce dziedziczną postacią niepełnosprawności intelektualnej, odpowiedzialna jest ekspansja (wydłużenie) niestabilnej sekwencji powtórzonej (CGG)n w pierwszym eksonie genu FMR1. Pierwszy etap diagnostyki molekularnej zespołu, obejmujący analizę przy użyciu testu PCR, ma charakter badania przesiewowego. Etap drugi, wykorzystujący hybrydyzację genomową z zastosowaniem techniki Southerna, umożliwia ostateczną weryfikację diagnozy.� Celem retrospektywnej analizy badań diagnostycznych, wykonanych u 1024 osób w ciągu trzech ostatnich lat, było oszacowanie częstości występowania wyników nietypowych, które mogłyby wpłynąć na dokonanie ewentualnej modyfikacji stosowanej procedury diagnostycznej. Analizowane wyniki badań molekularnych obejmowały przykłady nietypowe, zasługujące na szczególną uwagę. Do grupy tej zaliczyć można nietypowy wygląd/układ prążków obserwowanych w etapie badań przesiewowych oraz przypadki mozaikowatości somatycznej u mężczyzn, u których obecności prawidłowego prążka towarzyszy czasami pojawienie się nieco rozmytego sygnału (tzw. smearu), który może zostać łatwo przeoczony w rutynowym badaniu. Analiza doświadczeń własnych wskazuje na konieczność kierowania wszelkich takich przypadków do drugiego etapu badań, umożliwiającego przeprowadzenie ostatecznej weryfikacji wyniku. Drugi istotny problem diagnostyczny stanowią stosunkowo liczne (12 osób w ciągu dwóch lat) przypadki występowania alleli zaliczanych do tzw. “szarej strefy”, których długość odpowiada w przybliżeniu wartości pośredniej między allelem prawidłowym a premutacją. Należy zaznaczyć, że jednoznaczne zaklasyfikowanie takich przypadków do którejkolwiek z tradycyjnych klas alleli (alleli prawidłowych lub premutacyjnych) wiąże się ze znacznym ryzykiem późniejszego błędnego oszacowania prawdopodobieństwa wystąpienia choroby u potomstwa badanych osób. Otrzymane wyniki stanowią podstawę dla wprowadzenia konkretnych modyfikacji w praktycznej procedurze diagnostyki molekularnej zespołu łamliwego chromosomu X. P10. Charakterystyka kliniczna i molekularna pacjentów z dystonią torsyjną typu 1 – wstępne wyniki badań. Krzysztof Szczałuba (1), Jerzy Bal (2), Bartosz Kądziołka (3), Adam Szołna (4), Tadeusz Mazurczak(5) (1) Polskie Towarzystwo Genetyki Człowieka (2) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Warszawa (3) Klinika Neurochirurgii i Urazów Układu Nerwowego, Szpital Bródnowski, Warszawa (4) Klinika Neurochirurgii i Chirurgii Głowy, Wojskowy Szpital Kliniczny, Bydgoszcz (5) Klinika Neurologii AM w Warszawie Dystonie stanowią grupę chorób układu pozapiramidowego charakteryzujących się przetrwałymi i mimowolnymi skurczami mięśni, które powodują skręcające ruchy różnych części ciała (stąd dodatkowe określenie: torsyjne) i/lub przyjmowanie nietypowych póz. Wśród genetycznie uwarunkowanych dystonii wyróżnia się 15 typów, w tym najczęściej występującą, dziedziczącą się autosomalnie dominująco, dystonię torsyjną typu 1 (OMIM: 128100). U podłoża choroby leży defekt w genie DYT1, kodującym torsynę A, polegający na delecji trzech par zasad GAG w piątym eksonie genu. Przedstawiono charakterystykę cech klinicznych oraz wyniki analizy mutacji delGAG w genie DYT1 w grupie 40 pacjentów, w wieku 17-63 lat, z rozpoznaniem klinicznym dystonii pierwotnej. U 4 spośród nich (10%) zidentyfikowano delecję GAG w pozycji 946-948nt genu DYT1 odpowiedzialną za wystąpienie objawów dystonii torsyjnej typu 1. U wszystkich chorych pierwsze objawy dystonii pojawiły się przed ukończeniem 20 roku życia w obrębie kończyny dolnej, a następnie rozszerzyły się na inne części ciała (postaci uogólniające się lub uogólnione). Charakterystyki cech klinicznych wszystkich chorych dokonano na podstawie skali ruchowej dystonii wg Burke-Fahn-Marsden, tzw. Dystonia Movement Scale. W skali uwzględniono m.in. lokalizację objawów i ich ciężkość. Ponadto omówiono wyniki analizy rodowodów oraz badań molekularnych przeprowadzonych wśród krewnych probandów, u których wykazano obecność mutacji w genie DYT1. Badania są kontynuowane i mają na celu opracowanie algorytmu postępowania diagnostycznego w przypadkach pierwotnej dystonii torsyjnej, także w kontekście wskazań do leczenia neurochirurgicznego (wszczepienia stymulatora do prążkowia). 23 Genetyka człowieka P11. Epigenetyczna metoda klasyfikacji nowotworów mózgu Mirosława Z. Barciszewska (1), Ryszard Żukiel (2), Stanisław Nowak (2), Anna-Maria Barciszewska (1, 2, 3), Iwona Gawrońska (1), Jan Barciszewski (1) (1) Instytut Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk, ul. Noskowskiego 12/14, 61-704 Poznań (2) Katedra i Klinika Neurochirurgii i Neurotraumatologii Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego, ul. Przybyszewskiego 49, 60-355 Poznań (3) Wydzial Chemii Uniwersytetu im. Mickiewicza, ul. Grunwaldzka 6, Poznań Nowotworzenie to wieloetapowy proces, który jest wynikiem kumulacji mutacji (modyfikacji i błędów) powstałych zarówno w strukturze pierwszorzędowej genów, jak i w mechanizmach regulacji ich ekspresji. Jednym z nich jest atenuacja transkrypcji informacji genetycznej poprzez metylację cytozyny w DNA. Okazało się, że u wszystkich organizmów eukariotycznych oprócz czterech podstawowych zasad azotowych, adenozyny, guanozyny, tymidyny i cytozyny, występuje również 5-metylocytozyna (m5C) w ilościach od 10 d0 20%. Znaczącej metylacji ulega ok. 80% cytozyn w sekwencjach bogatych w dwunukleotyd CpG, zwanych i „wyspami CpG”. Rozkład metylowanych wysp CpG jest specyficzny dla danego rodzaju komórek i określa swoisty sposób ekspresji genów, zwany epigenetycznym. Z licznych badań wiadomo, że zmiany w metylacji DNA występują w większości nowotworów. Polegają one zarówno na globalnej hipometylacji (zmniejszenie poziomu metylacji), jak również miejscowej hipermetylacji (zwiększonej metylacji). Zmiany te następują najczęściej w obszarze promotorowym genów i mogą skutkować transkrypcyjnym wyłączeniem (wyciszeniem) genów supresorowych albo, przeciwnie, nadekspresją onkogenów. Celem pracy było oznaczenie poziomu metylacji DNA w nowotworach mózgu oraz jej korelacja ze stopniem złośliwości. DNA tkanki nowotworowej poddano hydrolizie enzymatycznej do nukleotydów, które piętnowano radioaktywnym fosforem [32P]. Analizę znakowanych nukleotydów przeprowadzano metodą cienkowarstwowej chromatografii. Wykorzystanie kliniczne oznaczeń poziomu metylacji DNA pozwala na klasyfikację nowotworów oraz różnicowanie stopni złośliwości biologicznej, zwłaszcza w przypadku wznowy nowotworu. (Literatura – R. Żukiel et all. (2004) A simple epigenetic method for the diagnosis and classification of brain tumors, Molecular Cancer Research (USA) 2, 1-7). P12. Genetic study of Alzheimer’s disease: presenilin-1 genes mutations in Polish families. Anna Kowalska (1), Danuta Pruchnik-Wolińska (2), Jolanta Florczak (2), Renata Modestowicz (2), Józef Szczech (2), Wojciech Kozubski (2), Grzegorz Rossa (3), Mieczysław Wender (4) (1) Institute of Human Genetics, Polish Academy of Sciences, 32 Strzeszyńska, 60-479 Poznań (2) Dept. of Neurology, University of Medical Sciences, 49 Przybyszewskiego, 60-355 Poznań, (3) Provincial Hospital for Neurological and Psychiatric Diseases (4) Neuroimmunological Unit, Medical Research Center, Polish Academy of Sciences, 49 Przybyszewskiego, 60-355 Poznań Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder characterized by two major brain lessions, referred to as senile plaques (deposits of amyloid β– peptides; AB) and neurofibrillary tangles (NFT; filaments of a hyperphosphorylated tau protein). According to the “amyloid cascade hypothesis”, the accumulation of Aβ peptides in the brain is a primary event in the pathogenesis of AD. A series of endoproteolytic cleavages of the amyloid precursor protein (APP) controlled by α-, β-, γ-secretases leads to a formation of non-amyloidogenic (the α-secretase pathway) and amyloidogenic (the β-secretase pathway) products which are essential for neurodegenenaration. Other pathological features in AD (neurofibrillary tangles, neuronal damage, and cell death) are regarded as secondary. A small number (15%) of familial AD cases associated mainly with the early-onset form of the disease (EOAD) is transmitted as a genetic autosomal dominant trait with a classical Mendelian pattern of inheritance. To date, three genes responsible for familial EOAD have been identified in the human genome: Amyloid precursor protein (APP) gene, Presenilin 1 (PS1) gene, and Presenilin 2 (PS2) gene. Pathogenic mutations in these genes account for a majority (18-50%) of familial autosomal dominant cases of EOAD. The mutations affect the APP processing causing increased production of a toxic Aβ42 peptide. To contribute to our knowledge on a genetic basis of neurodegeneration in AD, we performed the analysis of mutations in APP, PS1, and PS2 genes in a sample of 20 patients with familial AD from PoznaĂą region. We identified three missense mutations in the PS1 gene: A246E (exon 7), P267L (exon 8), and a novel L424R one (exon 12) in three unrelated families with autosomal dominant EOAD. A frequency of PS1 mutations was estimated at 15% (3/20) in a whole sample of familial AD cases, or 50% (3/6) if the analysis was restricted to the families with a clear autosomal dominant mode 24 Genetyka człowieka of inheritance. A lack of APP and PS2 mutations in the analyzed sample confirms their very rare occurrence among patients. We discussed molecular effects of the mutations on APP metabolism and clinical phenotype upon the mutation nature, its localization in the gene, patient’s Apoliporotein E genotype and other genetic factors. P13. Poszukiwanie nowych genów odpowiedzialnych za niepełnosprawność intelektualną (NI) w rodzinach z X – recesywnym sposobem dziedziczenia. Analiza sprzężeń z zastosowaniem pojedynczo-nukleotydowych polimorfizmów (SNP). Bartłomiej Budny (1, 2), M. Badura (1), W. Chen (2), A. Tzschach (2), M. Wisniewska (1), A. Materna-Kiryluk (1), R. Glazar (1) ,M. Krawczyński (1), M. Hoeltzenbein (2), V. M. Kalscheuer (2), S. Lenzner (2) , H. H. Ropers (2), A. Latos-Bielenska (1) (1) Katedra i Zakład Akademii Medycznej w Poznaniu (2) Max-Planck-Institute for Molecular Genetics, Berlin, Germany Niepełnosprawność intelektualna (definiowana jako IQ<70) jest częstą jednostką chorobową uwarunkowaną zarówno czynnikami środowiskowymi jak i genetycznymi. Szacuje się ze dotyka 2-3% ogólnej populacji. U mężczyzn obserwuje się wyższą częstość niepełnosprawności intelektualnej, co spowodowane jest mutacjami genów zlokalizowanych w chromosomie X. Identyfikacja większości genów biorących udział w patogenezie NI, była możliwa dzięki zastosowaniu metod określanych mianem klonowania pozycyjnego, takich jak badanie translokacji zrównoważonych oraz analiza sprzężeń w dużych rodzinach. W ostatnich latach zmapowano ponad 80 rodzin MRX (ang. Mental Retardation Xlinked) a także zidentyfikowano 17 genów odpowiedzialnych za niespecyficzną, bądź będące częścią określonego zespołu, niepełnosprawność intelektualną. Szacuje się, że w chromosomie X może znajdować się nawet około stu genów, które w wyniku mutacji prowadza do znaczącego obniżenia sprawności intelektualnej. Praca prezentuje 2 nowe rodziny z recesywnym, sprzężonym z chromosomem X sposobem dziedziczenia NI. W obydwu przypadkach wykonano analizę parametryczna (dwu– i wielopunktową) mapując poszczególne rodziny, do regionów na chromosomie X (LodScore > 2). Genotypowanie pacjentów oparto na analizie pojedynczo-nukleotydowych polimorfizmów SNP (ang, Single Nuklotide Polymorphism), które posłużyły jako markery genetyczne. Zastosowanie 68 markerów w odstępach średnio 2-4 cM, pozwoliło uzyskać dokładną mapę chromosomu X i precyzyjne określić granice interwałów sprzężenia dla poszczególnych rodzin. Dysponując danymi pochodzącymi z analizy sprzężeń ustalono strategie wyboru i screeningu genów kandydatów, w celu wykrycia przyczynowych mutacji. W pierwszej kolejności analizowano znane geny odpowiedzialne za NI. Praca realizowana w ramach europejskiego grantu EURO-MRX we współpracy z Max-Planck Institut f. Molekulare Genetik w Berlinie. P14. Bezobjawowa delecja w genie dystrofiny. Janusz Zimowski (1), Elżbieta Fidziańska (1), Elżbieta Zdzienicka (1), Barbara Ryniewicz (2), Jacek Zaremba (1) (1) Pracownia Analizy DNA, Zakład Genetyki, Instytut Psychiatrii i Neurologii, Al. Sobieskiego 9, 02-957 Warszawa (2) Klinika Neurologii, Akademia Medyczna, Warszawa, ul. Banacha 1a Dystrofia mięśniowa Duchenne’a/Beckera (DMD/BMD) polega na stopniowym i nieodwracalnym zaniku mięśni. Średnio w 10 r. życia chory chłopiec przestaje chodzić; umiera średnio w 20 r. życia (typ Duchenne’a). DMD/BMD jest chorobą sprzężoną z płcią i wywoływaną mutacjami w genie dystrofiny zlokalizowanym na krótkim ramieniu chromosomu X (Xp21). Łagodną postać choroby (typ Beckera) charakteryzuje duża rozpiętość nasilenia objawów od nieco lżejszych niż w typie Duchenne’a po bardzo łagodny przebieg choroby, w którym czas życia nie ulega skróceniu, a jedynymi objawami bywają bóle i kurcze mięśniowe. Różny przebieg choroby tłumaczy teoria zachowania lub naruszenia ramki odczytu przez mutację. Przy zachowanej ramce odczytu powstaje skrócone, ale częściowo funkcjonalne białko. Przedstawiamy przypadek trzypokoleniowej rodziny, w której wykryto delecję w obrębie genu dystrofiny obejmującą eksony 3-8 (bez naruszenia ramki). Mutację stwierdzono u trzech braci, ich matki, siostry matki i jej córki. Badanie wykonano ze względu na nieznacznie podwyższony poziom kinazy kreatynowej (CPK). Klinicznie wszyscy mężczyźni z delecją są zdrowi, starsi bracia uprawiają sport. Wcześniejsze badania 1,2 wskazywały, że delecje obejmujące domenę N-końca, nawet przy zachowaniu ramki odczytu, powodują cięższy przebieg choroby nazywany postacią pośrednią. Delecje z zachowaniem ramki występujące w domenie “rod” powodują tylko kurcze i bóle mięśniowe a nawet mogą być bezobjawowe 3. Brak zgody pacjentów na pobranie wycinka mięśniowego uniemożliwia zbadanie białkowego produktu genu –dystrofiny. 25 Genetyka człowieka Nieznany jest mechanizm kompensacji braku części domeny N-końca odpowiedzialnej za wiązanie się dystrofiny z αaktyną, który chroni przed rozwojem choroby. 1 Koenig M, Beggs AH, Moyer M, et al. (1989) The molecular basis for Duchenne versus Becker muscular dystrophy: correlation of severity with type of deletion. Am J Hum Genet 45: 498-506. 2 Beggs AH, Hoffman EP, Snyder JR, et al. (1991) Exploring the molecular basis for variability among patients with Becker muscular dystrophy: dystrophin gene and protein studies. Am J Hum Genet 49: 54-67. 3 Dobosiewicz K, Fidziańska A, Zaremba J, et al. (2000) Bezobiawowa dystrofia mięśniowa typu Beckera. Badanie � genetyczne i immunohistochemiczne. Neurol. Dziec. 9 (18): 191-198. P15. Analiza wariantów polimorficznych genu CHRNA4. Agata Różycka (1), Barbara Steinborn (2), Marek Pietrzak (3), Andrzej Kostyrko (1), Bogumiła Ratajczak (1), Wiesław H. Trzeciak (1) (1) Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej AM w Poznaniu, ul. Święcickiego 6, 60-781 Poznań (2) Katedra i Klinika Neurologii Wieku Rozwojowego, AM w Poznaniu (3) Wielkopolskie Centrum Neurologii Dzieci i Młodzieży w Poznaniu Przeprowadzone w ostatnim czasie badania genetyczne w jednej z form padaczek idiopatycznych, autosomalnej dominującej padaczki czołowej z napadami nocnymi (autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy, ADNFLE), dowodzą, że mutacje genu dla podjednostki 4 (CHRNA4) neuronalnego receptora acetylocholiny warunkują wystąpienie objawów klinicznych tej choroby. W obrębie eksonu 5 genu CHRNA4 zidentyfikowano kilka wariantów polimorficznych, które mogą służyć jako wewnątrzgenowe loci markerowe. Stwierdzono, iż u chorych z ADNFLE częstość występowania dwóch z nich (FokI 651 C/T oraz CfoI 690 C/T) może być zwiększona, podczas gdy inne badania zdają się zaprzeczać tej hipotezie. Wyniki kolejnych badań wskazują na związek polimorfizmu CfoI 690 C/T z wspólną grupą podtypów idiopatycznych padaczek uogólnionych (idiopathic generalised epilepsy, IGE), do których zaliczono młodzieńczą padaczkę miokloniczną (juvenile myoclonic epilepsy, JME). Celem projektu było sprawdzenie czy istnieje związek polimorfizmów FokI 651 C/T i CfoI 690 C/T CHRNA4 z występowaniem obu postaci padaczek idiopatycznych (ADNFLE oraz JME) w populacji polskiej. Ponadto w obrębie eksonu 5 genu CHRNA4 oraz flankujących go sekwencji intronowych zbadano częstość trzech innych, znanych wariantów polimorficznych (CfoI 1641 T/C, CfoI 1671 A/G, StyI 1770+14 A/G) oraz zidentyfikowano nowy, wcześniej nie opisany wariant (SsiI 1770+11 C/T). Badaniami objęto grupę 77 chorych z padaczką idiopatyczną (54 chorych z ADNFLE i 23 chorych z JME) oraz grupę kontrolną składającą się z 100 osób zdrowych. W celu określenia rodzaju wariantu polimorficznego, wybrane sekwencje badanego genu amplifikowano przy użyciu specyficznych starterów i poddawano analizie restrykcyjnej. Produkty analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) rozdzielano na żelu agarozowym lub poliakryloamidowym.� Częstości zmutowanych alleli dla polimorficznych loci wyniosły, odpowiednio w grupie chorych i kontrolnej: 0,08 i 0,07 (FokI 651 C/T); 0,03 i 0,04 (CfoI 690 C/T); 0,44 i 0,43 (CfoI 1641 T/C); 0,54 i 0,52 (CfoI 1671 A/G); 0,12 i 0,06 (SsiI 1770+11 C/T) oraz 0,32 i 0,35 (StyI 1770+14 A/G). Na podstawie uzyskanych częstości alleli dla sześciu analizowanych polimorfizmów nie wykazano istotnych statystycznie różnic pomiędzy grupą chorych z ADNFLE oraz JME a grupą kontrolną. Dlatego analizowane warianty polimorficzne nie wykazują związku zarówno z ADNFLE jak i IGE, nie mogą więc służyć jako wewnątrzgenowe loci markerowe dla badanych padaczek idiopatycznych. Badania finansowane z grantu KBN 3PO5A11525. P16. The severe forms of Stargardt disease (STGD) are frequently caused by a new class of mutations affecting ABCR localization. Wojciech Wiszniewski, C. M. Zaremba, M. Jamrich, J. R. Lupski Department of Human and Molecular Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA Purpose: ABCR (ABCA4) is a photoreceptor-specific member of the ATP-binding cassette (ABC) family, and mutations of ABCR are associated with many retinal phenotypes including Stargardt disease, Fundus Flavimaculatus, combined cone-rod dystrophy and retinitis pigmentosa. Our purpose is to develop an experimental system for investigating mechanisms regulating intracellular trafficking of ABCR and for testing mutations found in domains involved in cellular localization of ABCR. 26 Genetyka człowieka Methods: Our approach is to express a human ABCR transgene in photoreceptors of Xenopus laevis tadpoles. DNA fragments containing both wild type and mutated (L541P, R602W and C1490Y) ABCR coding sequence were cloned into the pXOP vector containing the promoter for the X. laevis rhodopsin gene, and used for transgenesis. The retinas of 2-4 week old tadpoles were studied for the expression and localization of transgenic ABCR by immunofluorescence methods. Results: Expression was restricted to photoreceptor cells and was variable from cell to cell. In some cells very bright staining of the rims of the discs was observed in rod outer segments (ROS). We found that some pathogenic mutations cause mislocalization of ABCR with stacking of misfolded protein in the rod inner segment. Conclusions: Human ABCR can be expressed from a transgene in Xenopus photoreceptors with appropriate localization to the ROS. However, we have identified a new class of ABCR mutations, which lead to improper localization, thus rendering a null effect. Mutations responsible for this effect are found with other null alleles in patients with severe retinal degenerative phenotypes. P17. Choroba Hallervordena-Spatza– opis dwóch przypadków. Iwona Płowaś (2), Zofia Helszer (1, 2), Bogdan Kałużewski (2) (1) Zakład Genetyki Medycznej Katedry Biologii i Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, Al. Kościuszki 3, 90-419 Łódź (2) Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, ul. Sterlinga 3, 91-425 Łódź Choroba Hallervordena-Spatza należy do dziedzicznych chorób układu nerwowego o charakterze metabolicznym. Choroba dziedziczona jest w sposób autosomalny recesywny. W większości przypadków chorobie towarzyszy mutacja w genie PANK2 zlokalizowanym w regionie 20p13-p12.3. Objawy kliniczne choroby ulegają nasileniu w okresie dzieciństwa lub dojrzewania. Najczęściej ostateczne rozpoznanie kliniczne jest stawiane na podstawie badania rezonansu magnetycznego głowy, w którym obserwuje się zmiany o charakterze zwyrodnieniowo-barwnikowym w gałkach bladych określane jako objaw „oka tygrysa”. Pod opieką naszej poradni znajdowało się dwóch pacjentów z rozpoznaniem choroby Hallervordena-Spatza. W obu przypadkach rozpoznanie wstępne potwierdzono badaniem rezonansu magnetycznego. Jednocześnie przeprowadzono diagnostykę molekularną w kierunku wykrycia mutacji w genie PANK2. U pierwszego z pacjentów stwierdzono mutację w genie PANK2, podczas gdy dotychczas przeprowadzone badania molekularne drugiego z pacjentów nie potwierdziły wystąpienia mutacji. Powstaje ważne z klinicznego punktu widzenia pytanie, czy negatywny wynik badania genu PANK2 w drugim przypadku usprawiedliwia postawienie ostatecznej diagnozy. P18. Wysoka liczba powtórzeń sekwencji pol MSRV u chorych na stwardnienie rozsiane Mariola Zawada (1), Monika Pernak (3), Izabela Liwem (1), Danuta Januszkiewicz-Lewandowska (1, 2, 3), Karina Nowicka (1), Jolanta Rembowska (1), Krzysztof Lewandowski (3), Hanna Hertmanowska (4), Mieczysław Wender (5), Jerzy Nowak (1) (1) Instytut Genetyki Człowieka PAN, Poznań (2) Akademia Medyczna, Poznań (3) Zakład Diagnostyki Medycznej, Poznań (4) Oddział Neurologii, Szpital Wojewódzki, Poznań (5) Zespół Neuroimmunologii, IMDiK PAN, Poznań W rozwoju stwardnienia rozsianego istotną rolę odgrywają czynniki genetyczne, immunologiczne oraz infekcje wirusowe. W 1997 Perron zasugerował udział nowoodkrytego wirusa MSRV (multiple sclerosis-related retrovirus) w patogenezie SM. W pracy przedstawiono porównanie liczby kopii sekwencji pol MSRV u 56 chorych na stwardnienie rozsiane w wieku 20–57 lat i 20 osób zdrowych w wieku 20–56 lat. Materiałem badawczym były jądra interfazowe i włókna chromatynowe limfocytów krwi obwodowej pacjentów z SM i osób zdrowych. Analizę liczby kopii sekwencji pol MSRV przeprowadzono metodą FISH z użyciem jako sondy biotynowanego produktu PCR o długości 435 pz. Detekcję związanej sondy MSRV przeprowadzono stosując reakcję: awidyną-FITC i anty-awidyną. Stwierdzono, że liczba kopii sekwencji pol MSRV u chorych na SM była znacząco większa (od 1 do > 50 w jądrze interfazowym) w porównaniu z osobami zdrowymi (od 1 do 20 w jądrze interfazowym). Ponadto, u osób z SM sekwencje pol MSRV występowały na większej liczbie włókien chromatynowych w postaci 27 Genetyka człowieka tandemowych powtórzeń, przy czym liczba powtórzeń była wyższa dwu-, a nawet trzykrotnie w porównaniu z osobami zdrowymi. Uzyskane wyniki bardzo mocno sugerują udział sekwencji pol MSRV w patogenezie stwardnienia rozsianego. P19. Dwie nowe mutacje (Ile 214 Met, Tyr 57 Cys) w genie NEFL u trzech chorych z fenotypem choroby Charcot-Marie-Tooth typu 2E (CMT2E). Dagmara Kabzińska (1), H. Drac (1,2), A. Łusakowska (2), B. Ryniewicz (2), A. Kochański (1) (1) Zespół Badawczo-Leczniczy Chorób Nerwowo-Mięśniowych Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. M. Mossakowskiego PAN (2) Katedra i Klinika Neurologii Akademii Medycznej w Warszawie Wstęp: Gen NEFL koduje białko neurofilamentów o małej masie cząsteczkowej (Neurofilament light chain polypeptide). Mutacje w genie NEFL występują u chorych z fenotypem Charcot-Marie-Tooth typu 2E (CMT 2E), oraz CharcotMarie-Tooth typu 1F (CMT1F). Do tej pory poznano 12 mutacji w genie NEFL. Cel pracy: Identyfikacja mutacji w genie NEFL w grupie 52 chorych z fenotypem CMT1 i CMT2 Materiał i Metody: Badano sekwencje genu NEFL u 52 chorych z fenotypami CMT1 i CMT2. Mutacji w genie NEFL poszukiwano metodami: polimorfizmu fragmentów jednoniciowych (SSCP) oraz heterodupleksów (HD). Produkty PCR o odmiennym względem dzikiego wzorcu migracji, sekwencjonowano. Wyniki: Znaleziono dwie nowe mutacje w genie NEFL: Ile 214 Met u dwóch nie-spokrewnionych chorych. Druga mutacja tj. Tyr 57 Cys została stwierdzonau jednego chorego. P20. CMT caused by EGR2 mutations: a natural history study of 10 patients. Wojciech Wiszniewski, Kinga Szigeti, Gulam Mustafa Saifi and James R. Lupski Department of Human and Molecular Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA We have ascertained 10 consecutive patients with various EGR2 mutations and collected follow-up information regarding disease progression. The mean follow-up was 17.5+/-10 years. Three patients were from an AD, 3 from an AR family and in 4 patients CMT was caused by de novo mutations. Interestingly even the same mutations caused different phenotypes. Respiratory compromise in the form of documented restrictive pulmonary disease was present in 3/7 (43 %) of the patients, in one case it resulted in respiratory failure and death at 6 years of age. Cranial nerve findings were present in 60 %, and involved facial nerve, cranial nerve III, IX and XII. The progression of the disease was rapid, moderate or mild, depending upon the various mutations. Interestingly the toxic gain of function mutations resulted in moderate to severe progression, while the homozygous loss of function mutation in the recessive family with three affected children had minimal if any progression of the neuropathy. We have performed in vitro functional studies, including transcription activity, DNA binding and function in apoptosis in transient transfection experiments utilizing constructs generated by in vitro mutagenesis. We correlated the in vitro data with severity of diseases as measured by age of onset and rate of progression. We did not find a correlation between mutations and outcome, thus it is extremely difficult to prognosticate patients with EGR2 mutations. However our study confirmed that respiratory compromise and cranial nerve dysfunction are commonly associated with EGR2 mutations and can be useful in guiding molecular diagnosis. P21. Encefalomiopatia mitochondrialna u 13-letniego chłopca. Jacek Pilch (1), Katarzyna Wojaczyńska-Stanek (1), Elżbieta Marszał (1), Maciej Kajor (2), Ewa Pronicka (3), Elżbieta Karczmarewicz (4) (1) Klinika Pediatrii i Neurologii Wieku Rozwojowego ŚAM Katowice (2) Katedra Patomorfologii ŚAM Katowice (3) Klinika Chorób Metabolicznych Szpital Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka, Warszawa (4) Zakład Biochemii Klinicznej Szpital Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka, Warszawa Zaburzenia oksydatywnej fosforylacji uwarunkowane mutacjami mitochondrialnego DNA prowadzą do grupy chorób określanych jako miopatie i encefalomiopatie mitochondrialne. Zależność genotypowo-fenotypowa nadal pozostaje niewyjaśniona. Autorzy przedstawiają 13-letniego chłopca z występującymi od 9 roku życia epizodami wymiotów, postępującym osłabieniem siły mięśniowej oraz złą tolerancją wysiłku. Obraz kliniczny – kwasica mleczanowa, 28 Genetyka człowieka zwyrodnienie barwnikowe siatkówki oraz cechy ataksji – najbardziej przypominał zespół Kearns-Sayre’a. Nie występowały natomiast główne objawy, jakimi są postępująca oftalmoplegia i zaburzenia przewodnictwa w obrębie mięśnia sercowego. W obrazie MR głowy uwidoczniono zmiany o podwyższonym sygnale w jądrach podkorowych, płatach czołowych i półkulach móżdżku. Zapis EMG oraz przewodnictwo nerwowo-mięśniowe prawidłowe. W badaniach: histopatologicznym, histoenzymatycznym oraz ultrastrukturalnym mięśnia czworogłowego uda uwidoczniono włókna poszarpane, nieprawidłowe mitochondria oraz brak aktywności COX. Stwierdzono również zaburzenia aktywności enzymów łańcucha oddechowego: obniżenie aktywności kompleksu I, III i IV oraz znamienny wzrost aktywności syntazy cytrynianowej. Przebieg choroby był niekorzystny. Chłopiec zmarł wśród objawów niewydolności wielonarządowej. W toku pozostają badania molekularne. P22. Mutacja genu PLP1 w rodzinnej postaci choroby Pelizaeusa-Merzbachera o zróżnicowanym obrazie klinicznym. Elżbieta Marszał (1), Jacek Pilch (1), Ewa Jamroz (1), Isabelle Creveaux (2), Odile Boespflug-Tanguy (2) (1) Klinika Pediatrii i Neurologii Wieku Rozwojowego ŚAM Katowice, Polska (2) Inserm U384 and Fédération, de Génétique Humaine Auvergne, CHU Clermont-Ferrand, France Gen PLP1 zlokalizowany jest na długim ramieniu chromosomu X (Xq22). Jego mutacje prowadzą do powstania choroby Pelizaeusa-Merzbachera oraz sprzężonej z chromosomem X spastycznej paraplegii. Produktami genu są dwa białka powstające na drodze alternatywnego składania: PLP1 oraz DM20. Są one głównymi białkami strukturalnymi mieliny ośrodkowego układu nerwowego. Gen ulega ekspresji już we wczesnym okresie rozwoju zarodkowego i prawdopodobnie pełni w tym okresie funkcje regulatorowe. Spektrum objawów klinicznych jest ciągłe i przyjmuje obraz od najcięższej postaci wrodzonej po łagodne porażenie kurczowe. Autorzy prezentuja rodzinę, w której chorobą dotkniętych jest pięć osób: troje chłopców z objawami postępującej encefalopatii oraz dwie osoby płci żeńskiej z objawami porażenia kurczowego. Przedstawiono stan neurologiczny oraz neuroobrazowanie. W przeprowadzonych badaniach molekularnych stwierdzono obecność mutacji typu „nonsens” w 5 eksonie genu PLP1 powodującej skrócenie białek PLP/DM20 w pozycji cysteiny 227. Określono w rodzinie nosicielstwo mutacji. P23. Zespół Millera-Diekera u 2,5-letniego chłopca. Jacek Pilch (1), Katarzyna Wojaczyńska-Stanek (1), Ilona Kopyta (1), Elżbieta Marszał (1), Anna Rokicka (2) (1) Klinika Pediatrii i Neurologii Wieku Rozwojowego ŚAM Katowice (2) Katedra i Zakład Biologii Ogólnej i Genetyki ŚAM Katowice Zespół Millera-Diekera jest rzadkim zespołem przyległych genów. Przyczyną jest mikrodelecja okołoterminalna krótkiego ramienia chromosomu 17 (17p13,3). Wśród różnorodnych objawów klinicznych (opóźnienie rozwoju, cechy dysmorfii, wady narządów wewnętrznych) najbardziej stałym są wady z grupy zaburzeń migracji neuronalnej. Najczęściej jest nią gładkomózgowie (lizencefalia). Autorzy przedstawiają 2,5-letniego chłopca z nieobciążonym wywiadem ciążowo-porodowym i rodzinnym, u którego od 5 miesiąca życia występują polimorficzne napady padaczkowe. Rozwój psychoruchowy znacznie opóźniony. W badaniu fizykalnym obecne dyskretne cechy dysmorfii twarzy, niedobór masy a w badaniu neurologicznym hipotonia mięśniowa oraz ruchy mimowolne kończyn górnych. MR głowy wykazało wadę rozwojową OUN pod postacią pachygyrii z zespołem okołosylwialnym. Badanie cytogenetyczne nie wykazało nieprawidłowości, natomiast hybrydyzacja in situ po zastosowaniu sondy molekularnej dla regionu krytycznego MDS, wykazała na krótkim ramieniu jednego z chromosomów pary 17 brak sygnału, co potwierdza obecność mikrodelecji. 29 Genetyka człowieka P24. Genisteina i jej pochodne potencjalnymi inhibitorami syntezy glikozoaminoglikanów w leczeniu chorób lizosomalnych. Ewa Piotrowska (1), Joanna Jakóbkiewicz-Banecka (2), Grzegorz Grynkiewicz (3), Ewa Skorupa (4), Alicja Węgrzyn (5), Anna Tylki-Szymańska (4), Grzegorz Węgrzyn (1) (1) Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, Gdańsk (2) Instytut Oceanologii, Polska Akademia Nauk, Sopot (3) Instytut Farmaceutyczny, Warszawa (4) Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa (5) Instytut Biochemii i Biofizyki, Polska Akademia Nauk, Gdańsk� Mukopolisacharydozy (MPS) i mukolipidozy (ML) to choroby lizosomalne, których bezpośrednią przyczyną jest brak lub obniżona aktywność enzymów zaangażowanych w rozkład glikozaminoglikanów (GAGs), prowadzące do akumulacji tych związków w lizosomach, co powoduje postępującą utratę funkcji tkanek i narządów. W zależności od brakującego enzymu wyróżnia się różne typy MPS i ML, przy czym skuteczne leczenie, w postaci enzymatycznej terapii zastępczej (ERT), obecnie możliwe jest jedynie dla MPS I (dla MPS II i MPS VI trwają próby kliniczne). ERT, bardzo skuteczna w leczeniu większości tkanek i narządów, z powodu istniejącej bariery krwio-mózgowej ma znacznie obniżone działanie przy zmianach chorobowych dotykających ośrodkowy układ nerwowy (CNS). Częściowe przyhamowanie syntezy GAGs mogłoby być alternatywną formą leczenia MPS i ML. Wydaje się, że metoda ta powinna być szczególnie wydajna u pacjentów ze szczątkową aktywnością enzymu. Co więcej, jeśli potencjalny inhibitor syntezy GAGs jest małą cząsteczką, powinien pokonywać barierę krwio-mózgową. Obecnie bada się analogi cukrów wcielanych w czasie syntezy GAGs. Zakłada się, że analogi takie powinny osłabić aktywność specyficznych enzymów jako inhibitory kompetytywne. Innym podejściem może być zatrzymanie ekspresji genów kodujących enzymy uczestniczące w syntezie GAGs. Ekspresja przynajmniej kilku takich genów jest kontrolowana przez szlaki zależne od białka receptorowego estrogenu i kinazy tyrozynowej (PKT). Wykazano, że genisteina, izoflawon sojowy przypominający strukturą estrogen, hamuje aktywność PTK. Zbadaliśmy wpływ genisteiny oraz wybranych jej pochodnych na syntezę GAGs w kulturach fibroblastów znakowanych rodioaktywnym siarczanem. Okazuje się, ze genisteina hamuje syntezę GAGs w hodowlach komórkowych. Warto zatem kontynuować badania nad tym izoflawonem w kontekście rozwoju terapii chorób lizosomalnych. P25. Badania molekularne genu MECP2 u pacjentów z objawami zespołu Retta Zofia Helszer, Płowaś Iwona, Borkowska Edyta, Filipowska Anita, Lach Joanna, Kałużewski Bogdan Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Zespół Retta jest chorobą neurogenetyczną, postępującą, cechującą się ciężkimi objawami klinicznymi. Rozpoznanie jest stawiane na podstawie kryteriów klinicznych, typowych dla zespołu. W 70-80 % przypadków stwierdzono występowanie mutacji w genie MECP2 zlokalizowanym w regionie Xq28, które mogą być odpowiedzialne za występowanie choroby. U dwóch pacjentek z typowymi klinicznymi cechami zespołu Retta przeprowadzono badania molekularne. Za pomocą metody PCR, w oparciu o specyficzne startery, amplifikowano trzy eksony genu MECP2. Do wykrywania mutacji zastosowano metodę MSSCP (Multitemperature Single Strand Conformation Polymorphism). Przeprowadzona analiza nie wykazała zmian mobilności poszczególnych produktów genu w obydwu badanych przypadkach. .Powstaje ważne z klinicznego punktu widzenia pytanie, czy negatywny wynik badania genu MECP2 wskazuje na konieczność dalszej poszerzonej diagnostyki molekularnej, czy też powszechnie przyjęte kryteria kliniczne są wystarczające dla postawienia ostatecznej diagnozy. 30 Genetyka człowieka Genetyka Kliniczna Komunikaty ustne: W10. Mutacje genów LDLR i APOB u 103 pacjentów z hipercholesterolemią rodzinną. M. Chmara (1), J. Kubalska (4), H. Mierzewska (2), A. Wierzbicka (3), E. Pronicka (2), J. Limon (1) (1) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki, Akademia Medyczna w Gdańsku, (2) Klinika Chorób Metabolicznych (3) Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa (4) Zakład Genetyki, Instytut Psychiatrii i Neurologii, Warszawa Hipercholesterolemia rodzinna (FH) i rodzinny defekt apolipoproteiny B-100 (FDB) to choroby jednogenowe o autosomalnym dominującym sposobie dziedziczenia. Częstość występowania heterozygot w obu jednostkach klinicznych w populacji europejskiej wynosi od 1:500 do 1:700 żywych urodzeń. Na podstawie kryteriów klinicznych FH (WHO) została wyłoniona grupa 103 probantów. Od pacjentów, będących pod opieką Kliniki Chorób Metabolicznych, Instytutu „Pomnika – Centrum Zdrowia Dziecka” w Warszawie, została pobrana krew a następnie wyizolowany DNA do badań molekularnych. Do analizy genów LDLR i APOB zastosowano technikę amplifikacji PCR, a następnie bezpośrednie sekwencjonowanie przy użyciu sekwenatora automatycznego ABI 310. W genie LDLR przebadane zostały wszystkie jego eksony wraz z przylegającymi fragmentami intronów oraz sekwencją promotorową. W przypadku genu APOB analizowano fragment eksonu 26, w którym jak dotąd znajdują się wszystkie poznane mutacje APOB prowadzące do FDB. Wśród 103 pacjentów wykryto różne mutacje w genie LDLR w 53 (51%), natomiast w genie APOB wykryto wyłącznie mutację R3500Q w 10 przypadkach. Najczęstszą mutacją w genie LDLR była mutacja punktowa G571E w eksonie 12, która została wykryta u 14 probantów (13.6%). Większość znalezionych mutacji została już opisana w literaturze, natomiast 11 spośród nich wykryto po raz pierwszy (E10K, D36N, E119D, C176W, W422R, S426P, V485M, A699G, ekson 15: 2298 del AC, intron 9: 1359-3 del C, intron 12: 1846-2 A>C). Diagnostyka mutacji w genach LDLR i APOB umożliwia objęcie rodzin z FH i FDB poradnictwem genetycznym oraz wczesną profilaktyką co w wysokim stopniu może je uchronić przed klinicznymi konsekwencjami hipercholesterolemii rodzinnej. W11. The emerging clinical phenotype of the dup(17)(p11.2p11.2) syndrome: the homologous recombination reciprocal of the Smith-Magenis microdeletion Lorraine Potocki (1, 5, 6), Diane Treadwell-Deering (2, 4, 5, 6), Kevin Krull (2, 4, 5,6 ) , Daniel Glaze (3, 4, 5, 6), C. J. Shaw (1, 5), M. Horz (1, 5, 6), P. Stankiewicz (1, 5), James R. Lupski (1, 4, 5 ,6) (1) Department of Molecular and Human Genetics (2) Department of Psychiatry and Behavioral Sciences (3) Department of Neurology (4) Department of Pediatrics (5) Baylor College of Medicine (6) Texas Children’s Hospital, Houston Nonallelic homologous recombination within region-specific low-copy repeats is known to give rise to DNA rearrangements associated with many genetic disorders. Smith-Magenis syndrome (SMS) is a multiple congenital anomalies syndrome due to a heterozygous deletion within 17p11.2. We previously described 7 persons with dup(17)(p11.2p11.2) which is the homologous recombination reciprocal of the SMS deletion, and commented on the relatively mild phenotype as compared to individuals with del(17)(p11.2p11.2). Herein we present the molecular and clinical data on 8 patients with dup(17)(p11.2p11.2) who were evaluated through a multidisciplinary clinical protocol. Each patient harbors a de novo duplication of 17p11.2 of the same size as determined by pulsed-field gel electrophoresis 31 Genetyka człowieka and/or FISH. Clinical features include dysmorphic craniofacial features, hypotonia and failure to thrive, oropharyngeal dysphasia, neurocognitive impairment, and behavioral problems including autistic, aggressive and self-injurious behavior. Structural cardiac anomalies and aortic root enlargement have also been identified. Sleep disturbances are seen in all patients yet the findings are distinct from those of deletion 17p11.2. There is marked variability in the physical features and behavioral profile between patients with dup(17)(p11.2p11.2). This variability cannot be attributed to duplication size, and does not seem to be associated with parent-of-origin effect. It is predicted that the incidence of dup(17)(p11.2p11.2) is equal to that of SMS; however as this duplication is difficult to detect by routine cytogenetic analysis, many of these patients are not ascertained. Systematic clinical evaluation of several more patients will be necessary to determine the features most characteristic of this microduplication syndrome. W12. Clinical molecular analysis of PTPN11 gene mutations in patients with Noonan syndrome. Joanna Wiszniewska, A. James, J. Lescher, K. Hoon, and B. B. Roa Baylor Medical Genetics Laboratories, Department of Human and Molecular Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, USA Noonan syndrome (NS) is a genetically heterogeneous disorder inherited in an autosomal dominant manner. The prevalence of this disease is estimated at approximately 1 in 1,000 – 2,500. Facial dysmorphia, growth retardation, skeletal malformations and congenital heart disease are the most common features associated with Noonan syndrome. Mutations in the PTPN11 gene encoding the non-receptor protein tyrosine phosphatase SHP-2, were identified to cause NS in approximately 50% of both familial and sporadic cases. We studied a cohort of 80 patients referred for Noonan syndrome molecular testing. This included 5 patients with a definite diagnosis (full NS phenotype), and 75 with a possible diagnosis (partial NS phenotype). Analysis of 15 coding exons and exon/intron boundaries of the PTPN11 gene was performed by PCR amplification and bi-directional DNA sequencing. Mutations of PTPN11 gene were found in 1 patient with a definite diagnosis and in 19 patients with a possible diagnosis of NS. Sixteen different mutation alleles were identified, including one novel mutation. The majority (70%) of mutations were found in exons 3 and 13. The study confirms the phenotypic variation among patients with mutations in the PTPN11 gene, and demonstrates the value of PTPN11 mutation analysis in patients for whom a diagnosis of Noonan syndrome is being considered. W13. 10 lat doświadczeń w diagnostyce molekularnej zespołu Pradera-Williego. A. Szpecht-Potocka (1), E. Obersztyn (1), J. Bal (1), E. Bocian(1), E. Kostyk (2), A. Kruczek (2), M. Lassota (3), A. Midro (4), B. Dawydzik (5), I. Jałowiec (6), A. Latos-Bieleńska (7), J. Pilch (8), R. Glazar (9), C. Cybulski (10), T Mazurczak (1) (1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Warszawa (2) Zakład Genetyki Medycznej, Collegium Medicum UJ, Kraków; (3) ZOZ Przychodnia Specjalistyczna Nr 1, Rzeszów; (4) Zakład Genetyki Klinicznej, Białystok; (5) Pediatryczna Poradnia Zaburzeń Metabolicznych, Instytut Zdrowia Matki Polki, Łódź; (6) Wojewódzki Specjalistyczny Szpital Dziecięcy, Kielce; (7) Katedra i Zakład Genetyki Medycznej AM, Poznań; (8) Szpital Kliniczny nr 6 ŚAM, Katowice; (9) PG Centrum Genetyki Medycznej, Poznań; (10) Zakład Genetyki i Patomorfologii PAM, Szczecin The Prader-Willi Syndrome (PWS) is a genetic and neurologic behavioral disorder linked to abnormalities in imprinted domain on chromosome 15q11-q13, characterized inter alia by hypotonia, hyperphagia in early childhood resulting in obesity, hypogonadism, short stature and moderate mental retardation. All of genetic abnormalities in PWS are associated with loss of expression of paternally derived alleles. Using karyotyping, FISH and methylation analysis we have examined 292 patients, diagnosed in different medical centers in Poland, susspected to be PWS and we confirmed PWS diagnosis in 102 cases (35%). We identified 51 cases of paternal deletion (50%), 16 patients with mUPD (16%) and 3 patients with imprinting defect (3%). In 5 cases we could not detect molecular defect because of noninformative microsatellite analysis. All of PWS patients have classical phenotype for deletion, mUPD and ID what we present in 32 Genetyka człowieka details. Four of patients of our 292 cohort have shown PWS-like phenotype but we did not find any abnormalities on chromosome 15. Because of PWS is a multigenic disorder it is possible that gene mutation may occur in these patients. We also conclude that there is significant difference between correct clinical diagnosis of PWS in specialty treatment centers then in others. In specialty treatment Polish medical centers the propotion of confirming PWS and sharing of particular molecular defects are consistent with those observed in tested cohort in other caucasian population. W14. Position effects due to chromosome breakpoints mapping ~ 1 Mb upstream and ~ 1.3 Mb downstream of SOX9 in two cases with campomelic dysplasia. Paweł Stankiewicz (1), Gabriel Bien-Willner (1), James R. Lupski (1, 2 ,3), Jill K. Northup (4), Lillian H. Lockhart (5), Syed M. Jalal (6), Gopalrao V. N. Velagaleti (4, 5) (1) Department of Molecular & Human Genetics Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA (2) Pediatrics, Baylor College of Medicine, Houston, TX (3) Texas Children Hospital, Houston, TX, (4) Depts of Pathology (5) Pediatrics, University of Texas Medical Branch, Galveston, TX (6) Department of Pathology, Mayo Clinic, Rochester, MN. Campomelic dysplasia (CD) is a semilethal skeletal malformation syndrome with or without XY sex reversal. In addition to multiple mutations within the SOX9 gene on 17q24.3, several chromosome translocations and inversions with breakpoints scattered over 1 Mb upstream to SOX9 leading to haploinsufficiency have been described (Pfeifer et al. 1999). Here, we present an apparently balanced translocation t(4;17)(q28.3;q24.3), segregating in a family with a mild acampomelic CD and Robin sequence. Both breakpoints have been identified by FISH within single BAC clones. The 17q breakpoint maps ~ 1 Mb upstream of SOX9, within the same BAC clone as in the previously reported case. A somatic cell hybrid has been generated in our case and the breakpoint is being currently sequenced. DNA sequence analysis revealed a region conserved in human, chimpanzee, and mouse and candidate transcripts have been identified. Interestingly, Jamshidi et al. (2004) reported an isolated Robin sequence in a family segregating with a balanced translocation t(2;17)(q24.1;q24.3). The 17q breakpoint in this family maps very close to our breakpoint. We also report a prenatal identification of acampomelic CD with a male to female sex reversal in a fetus with a de novo apparently balanced complex karyotype 46,XY,t(4;7;8;17)(4qter->4p15.2::17q25->17qter;7qter->7p15::4p15.2->4pter;8pter>8q12.2::7p21.2->7pter;17pter->17q25::8q12.2->8qter). All breakpoints have been mapped within single BAC clones. Surprisingly, the 17q breakpoint maps ~1.3 Mb downstream of SOX9. This is the first report of CD with the chromosome breakpoint mapping distal to SOX9. We discuss the possible molecular mechanisms responsible for the position effect. W15. Nieprawidłowy obraz USG płodu wskazaniem do inwazyjnej diagnostyki prenatalnej. A. Ilnicka (1), B. Pawłowska (1), J. Bogdanowicz (1), A. Tomankiewicz-Zawadzka (1), J. Czyżewska (1), W. Szirkowiec (1), E. Zdzienicka (1), J. Kubalska (1), T. Roszkowski (2), J. Garwoliński (2), R. Dębski (2), R. Szczecina (3), T. Lipiński (3), J. Zaremba (1) (1) Zakład Genetyki Instytutu Psychiatrii i Neurologii, Warszawa (2) Klinika Położnictwa i Ginekologii CMKP, Warszawa (3) Klinika Ginekologii i Położnictwa AM, Warszawa W latach 1999–2003 w Zakładzie Genetyki IPiN przeprowadzono 4032 cytogenetyczne badania prenatalne. Z roku na rok wzrasta liczba pacjentek, u których wykonuje się diagnostykę z powodu stwierdzenia wad płodu w badaniu ultrasonograficznym (USG). W roku 1999 wskazanie to stanowiło 10%, a ostatnio 18% wykonywanych badań. Wśród 575 pacjentek z powyższej grupy wskazań nieprawidłowy wynik badania cytogenetycznego (głównie aneuploidie) stwierdzono w 114 przypadkach (20%). Stanowi to aż 28% nieprawidłowych kariotypów wykrytych łącznie we wszystkich grupach wskazań. W analizowanej grupie stwierdzono 30 przypadków trisomii chromosomu 18 (zespół Edwardsa); w badaniu ultrosonagraficznym u prawie wszystkich płodów z tą aberracją stwierdzono wadę serca, u 17 wentrikulomegalię, a u 5 przepuklinę pępowinową. Wśród 27 płodów z zespołem Downa u 12 w obrazie USG obserwowano zwiększony wymiar przezierności karku (NT), u 9 wadę serca, u 14 skrócenie kości udowych. 33 Genetyka człowieka We wszystkich (24) przypadkach płodów dotkniętych zespołem Turnera badanie ultrasonograficzne ujawniło wodniak karku (często policystyczny), a u 14 płodów dodatkowo występował obrzęk tkanki podskórnej. W 7 przypadkach zespołu Patau’a w obrazie USG najczęściej stwierdzano u płodów holoprozencefalię i wadę serca – po 4 przypadki. U wszystkich 9 płodów z triploidią ultrasonograficznie obserwowano asymetryczną hipotrofię; u niektórych stwierdzono ponadto wadę serca i/lub hiperechogenne jelito. W czterech przypadkach triploidii towarzyszyło małowodzie. U 11 płodów stwierdzono aberracje strukturalne niezrównoważone – w tym 9 de novo. Komunikaty plakatowe: P26. Niepełnosprawność intelektualna w wyniku submikroskopowej delecji towarzyszącej złożonej translokacji t(3;12) – mapowanie punktów złamań metodą FISH z klonami bakteryjnymi. K. Borg (1), E. Bocian (1), P. Stankiewicz (3), A. Kruczek (2), E. Obersztyn (1), T. Mazurczak (1), J. Lupski (3) (1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Warszawa (2) Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński, Kraków; (3) Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, USA. Nieprawidłowy fenotyp w przypadkach zrównoważonych aberracji strukturalnych chromosomów stwierdzany jest w ok. 6% przypadków. Aberracje takie mogą bowiem w różny sposób uszkadzać i inaktywować geny znajdujące się w miejscach złamań. Opublikowane ostatnio wyniki analizy miejsc złamań w przypadkach zrównoważonych cytogenetycznie aberracji stwierdzonych u osób z nieprawidłowym fenotypem wykazały, że w ~10% takich przypadków obecna jest submikroskopowa delecja. Przedstawiono przypadek złożonej translokacji chromosomowej powstałej de novo t(3;12) u osoby z cechami upośledzenia umysłowego. Dokonano analizy molekularnej miejsc złamań z zastosowaniem specyficznych, wyznakowanych fluorescencyjnie, sond molekularnych izolowanych z klonów bakteryjnych (BAC). Stwierdzono bardziej złożony charakter rearanżacji aniżeli w pierwotnej analizie metodą klasyczną. Wykazano, że w wyniku 6 złamań nastąpiła wzajemna translokacja terminalnych fragmentów 3p24.1 –>pter i 12q23.1->qter oraz insercja w pozycji 3q26.31 trzech fragmentów pochodzących z chromosomu 3p i 12q. Translokację określono jako: t(3;12)(3qter→3q26.31::12q23.1→12q22::3p22.3→3p24.1::12q22→12q14.1::3q26.31→3p22.3::12q23.1→ 12qter;12pter→ 12q14.1::3p24.1→3pter). Wykazano także obecność niewidocznej w analizie prążkowej chromosomów mikrodelecji w regionie 3q26.31. Jej wielkość oceniono na ~ 0,5 Mpz. Stwierdzono, że w wyniku translokacji jeden ze zmapowanych ostatnio w 3p25 genów (MEGAP) odpowiedzialnych za upośledzenie umysłowe został przeniesiony na chromosom 12q. Nie można więc wykluczyć wpływu tzw. efektu pozycji tego genu na nieprawidłowy fenotyp probanda. Analiza metodą FISH wykazała również obecność u pacjentki drugiej, zrównoważonej translokacji wzajemnej, t(11;21)(p14.1q;22.11). Nie stwierdzono ubytku materiału genetycznego w punktach złamań tej translokacji. Wyniki przeprowadzonych badań uzasadniają konieczność wykonywania analizy molekularnej w przypadkach cytogenetycznie zrównoważonych translokacji powstałych de novo, którym towarzyszy nieprawidłowy fenotyp. Praca realizowana w ramach Projektu Badawczego Zamawianego Nr PBZ-KBN-042/P05/2001. P27. Rodzinna aneusomia regionów subtelomerowych chromosomu 5 jako skutek inwersji inv(5)(p15.33q35.3) i przyczyna upośledzenia umysłowego. K. Suchenek, E. Bocian, E. Obersztyn, B. Nowakowska, A. Kutkowska-Kaźmierczak, T. Mazurczak Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Warszawa Szacuje się, że submikroskopowe aberracje regionów subtelomerowych chromosomów odpowiedzialne są za około 5 % przypadków upośledzenia umysłowego (UU) o nieznanej etiologii. Wśród 148 opisanych dotychczas aberracji subtelomerowych stwierdzono zaledwie trzy przypadki aneusomii powstałych w wyniku rekombinacji w obrębie rodzicielskiej inwersji. Przedstawiamy pierwszy przypadek rodzinnej inwersji chromosomu 5 z punktami złamań w regionach subtelomerowych obu ramion tego chromosomu. U probanda, sześcioletniej dziewczynki z cechami lekkiego upośledzenia psychoruchowego i prawidłowym kariotypem dzięki zastosowaniu techniki FISH z zestawem sond subtelomerowych (Chromoprobe Multiprobe – T System) wykazano trisomię regionu subtelomerowego 5q. Dalsze badania w rodzinie probanda wykazały, że nieprawidłowy chromosom 5 pary u dziecka jest pochodną rekombinacji dużej inwersji pericentrycznej inv(5)(p15.3q35.3) obecnej u ojca dziecka. Inwersję stwierdzono także u jego brata 34 Genetyka człowieka bliźniaka a częściową trisomię 5q u jego dwóch córek wykazujących cechy upośledzenia umysłowego. Zastosowanie licznych sond specyficznych dla obszarów subtelomerowych krótkiego i długiego ramienia chromosomu 5, pozyskanych z klonów bakteryjnych umożliwiło precyzyjne określenie punktów złamań w obu regionach subtelomerowych oraz wykazanie, że częściowej trisomii regionu subtelomerowego 5q towarzyszy delecja zlokalizowana powyżej subtelomeru 5p. Aberrację stwierdzoną u dzieci określono jako rec(5)dup(5)(q35.3)inv(5)(p15.33q35.3)pat. Wielkość duplikacji 5q oszacowano na ~ 4,6 Mpz a delecji 5p na <1 Mpz. Weryfikacja kariotypu dzieci metodą HR-CGH potwierdziła obecność dup(5q) nie wykazała natomiast obecności towarzyszącej jej del(5p). Obecność zrekombinowanego chromosomu 5 pary u trojga dzieci w rodzinie potwierdza fakt, że w przypadkach dużych inwersji pericentrycznych ryzyko powstania aneusomii u potomstwa jest też duże. Przedstawiony przypadek wskazuje na przydatność i zasadność stosowania w celach diagnostycznych innych sond subtelomerowych niż te, które zawarte są w zestawie komercyjnym. Praca realizowana w ramach projektu badawczego zamawianego Nr PBZ-KBN-042/P05/2001. P28. Analiza abberacji chromosomowych u pacjentów z wadami wrodzonymi w materiale Zakładu Genetyki Akademii Medycznej we Wrocławiu. R. Ślęzak (1), A. Stembalska (1), H. Busza (1), H. Czemarmazowicz (1), J. Kozłowska (1), R. Plewa (1), I. Łaczmańska (1), K. Bartusiak (1), R. Śmigiel (2), M. Sąsiadek (1) (1) Zakład Genetyki Akademii Medycznej we Wrocławiu, Kierownik: Prof. dr hab. Maria Sąsiadek (2) Zakład Patofizjologii Akademii Medycznej we Wrocławiu. Kierownik Prof. dr hab. Józef Jagielski� Wrodzone wady rozwojowe obejmują powstałe w okresie życia płodowego zaburzenia prawidłowego rozwoju, morfogenezy narządu lub histogenezy tkanek. Przyczyny wad wrodzonych są różnorodne etiologicznie. Warunkują je czynniki genetyczne i środowiskowe pochodzenia endogennego i egzogennego. Około 35% wrodzonych wad rozwojowych o znanej etiologii uwarunkowanych jest monogenowo i chromosomowo. Celem pracy była analiza aberracji chromosomów u pacjentów z wadami wrodzonymi, cechami dysmorficznymi oraz upośledzeniem umysłowym. W latach 2000–2003 w Zakładzie Genetyki Akademii Medycznej we Wrocławiu wykonano 1363 badań genetycznych u pacjentów z wadami wrodzonymi i członków ich rodzin. Chromosomy do badań uzyskiwano z limfocytów krwi obwodowej oraz fibroblastów skóry. Chromosomy barwiono technikami prążkowymi GTG, CBG i NOR. W diagnostyce dodatkowej zastosowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z użyciem sond malujących, centromerowych, punktowych oraz zestawów sond telomerowych. W części przypadków stosowano technikę PCR celem identyfikacji sekwencji chromosomowej. Nieprawidłowości kariotypu stwierdzono u 12 % badanych pacjentów. Najczęściej stwierdzano aberracje liczbowe, które zdiagnozowano u 100 pacjentów (łącznie z przypadkami mozaicyzmu). U 56 pacjentów stwierdzono trisomię chromosomu 21, u 7 chromosomu 18, u 2 chromosomu 13, a w jednym przypadku trisomię chromosomu 8. Aberracje liczbowe chromosomów płciowych stwierdzono u 34 pacjentów, w tym monosomię chromosomu X u 19 osób, trisomię chromosomu X u 3, zespół Klinefeltera u 8 pacjentów, dodatkowy chromosom Y u 3 pacjentów, w jednym przypadku zidentyfikowano tetrasomię chromosomu X (49,XXXXY). Aberracje strukturalne stwierdzono u 39 pacjentów, w tym u 14 pacjentów wykazano niezrównoważoną translokację interchromosomową. U 6 pacjentów stwierdzono rzadko występujące aberracje strukturalne. U kolejnych 3 pacjentów stwierdzono niezidentyfikowany naddatek na chromosomach 9, 14 i 15. Zespoły uwarunkowane mikrodelecją zdiagnozowane w badaniu FISH stwierdzono u 14 pacjentów (u 5 – zespół Prader-Willi, u 4 – zespół Angelmana, u kolejnych 4 zespół Williamsa, u jednego pacjenta zespół DiGeorgea). P29. Mutacje genu TCOF1 jako główna przyczyna powstawania zespołu Treacher Collins. Bożena Marszałek (1), Piotr Wójcicki (2), Kazimierz Kobus (2), Wiesław H. Trzeciak (1) (1) Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej Akademii Medycznej, Poznań (2) Szpital Chirurgii Plastycznej, Polanica Zdrój U podłoża zaburzeń rozwoju twarzoczaszki leżą nieprawidłowości różnicowania I i II łuku gardłowego, powodujące zespół Treacher Collins (TCS), zaliczany do twarzowo-żuchwowych wad kostnienia (mandibulofacial dysostosis, MFD1). Zespół ten występujący w populacji ogólnej z częstością około 1/50000 żywych urodzeń, jest autosomalnie dominującym zaburzeniem, spowodowanym mutacjami genu TCOF1, który koduje białko treacle, uczestniczące w transporcie pomiędzy cytoplazmą a jąderkiem. Chorych charakteryzuje m. in. niedorozwój żuchwy i kości jarzmowych, antymongoidalne ustawienie szpar powiekowych oraz niedorozwój małżowiny usznej. Około 70% znanych 35 Genetyka człowieka mutacji TCOF1 stanowią delecje, prowadzące do powstania kodonu terminującego i skrócenia produktu białkowego. Dotychczas opisano 106 mutacji TCOF1 odpowiedzialnych za TCS. Celem projektu była próba ustalenia molekularnego podłoża zaburzeń rozwoju twarzoczaszki poprzez poszukiwanie mutacji w TCOF1 u ok. 60 chorych z zespołem Treacher Collins oraz u 35 ich najbliższych krewnych. Genomowy DNA z limfocytów krwi obwodowej amplifikowano za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Produkty amplifikacji poddano analizie konformacji polimorfizmu pojedynczych nici DNA w gradiencie temperatury (MSSCP), analizie sekwencyjnej oraz analizie restrykcyjnej, a także dokonano pomiaru temperatury topnienia fragmentów zawierających delecje przy pomocy systemu LightCycler. Analiza sekwencyjna fragmentu zawierającego ekson 7 TCOF1 u jednego chorego pozwoliła wykazać występowanie wcześniej opisanej mutacji c.786-787delAG, która powoduje przesunięcie ramki odczytu i wytworzenie kodonu terminującego przy aa 270. Analiza sekwencyjna eksonu 15 u innych chorych wykazała występowanie nowej c.2373-2374delAG, która powoduje wytworzenie kodonu terminującego przy aa 794 oraz nowej tranzycji c.2344C>T, która powoduje zamianę Gln782Ter. Amplifikacja fragmentów zawierających ekson 7 i 15, w których wykryto delecje, wykazała różnicę w temperaturze topnienia fragmentów zawierających allele: prawidłowy i zmutowany z użyciem systemu LightCycler. Natomiast w eksonie 23 zidentyfikowano nową c.3880G>T transwersję powodującą zamianę Glu1294Ter. Ponadto w eksonie 16 został wykryty polimorfizm: c. 2429T>C, powodujący zamianę Ala810Val oraz w intronie 15 c.2428-24delCTCTC. � Wyniki tych badań pozwolą na wdrożenie strategii wykrywania mutacji oraz polimorfizmów TCOF1 u chorych z zespołem Treacher Collins. Badania finansowane z grantu KBN nr 2PO4A 037 26. P30. Wpływ mutacji w regionie przełącznikowym domeny NBD2 na proces dojrzewania białka CFTR. Michał Milewski (1), Krzysztof Dołowy (2), Garry Cutting (3) (1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Warszawa (2) Zakład Biofizyki, Wydział Technologii Drewna SGGW, Warszawa� (3) Institute of Genetic Medicine, JHU, Baltimore, USA Mutacje w genie CFTR są odpowiedzialne za mukowiscydozę – najczęstszą w Polsce nieuleczalną chorobę genetyczną dziedziczoną w sposób autosomalny recesywny. Białko CFTR, tworzące kanał chlorkowy w błonie komórek nabłonkowych, należy do rodziny białek ABC, charakteryzujących się obecnoÂścią domeny wiążącej nukleotydy (NBD). Celem prezentowanego projektu jest zbadanie roli aminokwasów z regionu przełącznikowego domeny NBD2 w procesie dojrzewania białka CFTR i jego funkcjonowania jako kanału chlorkowego. Po wprowadzenia odpowiednich zmian w wybranych pozycjach aminokwasowych białka przy pomocy mutagenezy in vitro, analizowano ekspresję poszczególnych konstruktów stosując transfekcję komórek IB3-1, immunoprecypitację białka CFTR i jego radioaktywne znakowanie przy użyciu [32P]dATP oraz kinazy białkowej A (PKA). Stopień glikozylacji białka CFTR, odpowiadający poszczególnym etapom jego biosyntezy, oceniano na podstawie tempa migracji białka w żelu poliakryloamidowym. Usunięcie całego regionu przełącznikowego skutkowało znacznym zahamowaniem procesu dojrzewania CFTR, co przejawiało się w produkowaniu białka o niepełnej glikozylacji, które nie docierało do błony cytoplazmatycznej komórki. Z kolei wprowadzenie mutacji V1397E, jedynej naturalnie występującej mutacji w tym regionie CFTR, a także podstawień alaninowych w najbardziej konserwowanych pozycji regionu przełącznikowego NBD2 (H1402A, R1403) nie zaburzało procesu dojrzewania białka. Uzyskane wyniki sugerują, że choć region przełącznikowy jest zapewne istotnym dla procesu fałdowania elementem strukturalnym domeny NBD, to pełni on także dodatkową ważną rolę, związaną prawdopodobnie z funkcjonowaniem kanału chlorkowego. Kolejny etap badań obejmować więc będzie analizę elektrofizjologiczną otrzymanych konstruktów.� Badania prowadzano w ramach projektu badawczego KBN 3 P05A 069 23. P31. Inwersja pericentryczna chromosomu 10 a ryzyko genetyczne. Z. Helszer, I. Płowaś, A. Barczyk, B. Kałużewski Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, ul. Sterlinga 3, 91-425 Łódź Częstość występowania inwersji pericentrycznych w populacji ludzkiej szacuje się na ok. 0,12–0,7 ‰. Inwersje pericentryczne chromosomu 10 są stosunkowo częstą aberracją tego chromosomu. Potencjalne znaczenie patogenetyczne, w tym wpływ na rozród człowieka, jest dyskutowane. Przebadano 9 rodzin z inwersją pericentryczną 36 Genetyka człowieka chromosomu 10. Wśród 20 członków rodzin wykryto 14 przypadków tego typu aberracji chromosomowej, w tym w badaniach prenatalnych 4 przypadki. Punkty złamań chromosomowych w badanych przypadkach miały różną lokalizację. Podjęto próbę określenia korelacji pomiędzy wielkością regionu chromosomu zaangażowanego w inwersję a skutkami fenotypowymi oraz oceny ryzyka wystąpienia objawów klinicznych u płodu. P32. Analiza kliniczno-rodowodowa przypadków rodzinnych i sporadycznych zwyrodnienia barwnikowego siatkówki. Maciej R. Krawczyński Katedra i Zakład Genetyki Medycznej AM w Poznaniu Zwyrodnienie barwnikowe siatkówki (RP) stanowi najczęstsze rozpoznanie wśród pacjentów Pracowni Poradnictwa Genetycznego w Chorobach Narządu Wzroku. W okresie 4 lat, rozpoznanie takie postawiono u 117 pacjentów w 39 rodzinach (tj. 18,0% wszystkich przyjętych rodzin i 36,1% rodzin z dystrofiami siatkówki). � W 20 rodzinach ujawniono przypadki sporadyczne choroby, zaś w 19 rodzinach choroba powtarzała się u większej liczby chorych. Analiza rodowodowa pozwoliła na stwierdzenie: dziedziczenia sprzężonego z chromosomem X w 20,5% rodzin, dziedziczenia autosomalnego dominującego w 17,9%, dziedziczenia autosomalnego recesywnego w 15,4% oraz przypadków sporadycznych w 46,2% rodzin. Dziedziczenie sprzężone z chromosomem X związane było z najwyższą powtarzalnością rodzinną (rodziny wielopokoleniowe), najcięższym przebiegiem choroby (pierwsze objawy u chłopców przed 5 rokiem życia, a przed 40 rokiem życia całkowita lub niemal całkowita ślepota), częstym zjawiskiem częściowej dominacji i częstym skojarzeniem RP z zespołem dyskinezji rzęsek. Dziedziczenie autosomalne dominujące związane było z niższą powtarzalnością rodzinną i najłagodniejszym przebiegiem. Pierwsze objawy występowały około 20 roku życia lub później, a bardzo długo utrzymywała się użyteczna lub nawet pełna, centralna ostrość wzroku. Dziedziczenie autosomalne recesywne związane było z pośrednią ciężkością choroby (pierwsze objawy u nastolatków) i długim utrzymywaniem się użytecznej ostrości wzroku. W dwóch przypadkach sporadycznych rozpoznano zespół Ushera. W pozostałych 18 przypadkach sporadycznych RP, dane kliniczne (wiek wystąpienia pierwszych objawów, dynamika przebiegu choroby) pozwoliły sugerować możliwość dziedziczenia autosomalnego dominującego w 7 przypadkach, autosomalnego recesywnego w 9 przypadkach i sprzężonego z X w 1 przypadku. Wobec olbrzymiej heterogenności genetycznej RP i braku dostępnych badań molekularnych (ponad 40 genów), dane kliniczne stanowią jedyną wskazówkę, pozwalająca na sugestie dotyczące rokowania i ryzyka genetycznego. P33. Mutacje genów LPL I APOC2 w hiperlipoproteinemii typu I Magdalena Chmara (1), Kubalska J. (4), Wierzbicka A. (3), Brożek I.(1), Pronicka E.( 2), Limon J. (1) (1) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki, Akademia Medyczna w Gdańsku (2) Klinika Chorób Metabolicznych (3) Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa (4) Zakład Genetyki, Instytut Psychiatrii i Neurologii, Warszawa Hiperlipoproteinemia typu I jest rzadko występującą chorobą jednogenową. Może być efektem zarówno niedoboru lipazy lipoproteinowej (hiperlipoproteinemia IA) jak i apolipoproteiny C-II (hiperlipoproteinemia IB). Charakterystyczna dla chorych z hiperlipoproteinemią jest chylomikronemia wywołana zaburzeniami lipolizy trójglicerydów z powodu obniżonej aktywności lipazy lipoproteinowej (LPL). Obniżenie aktywności LPL może być spowodowane zmniejszoną syntezą tego enzymu lub utratą jego aktywności. Ponadto, może wiązać się z zaburzonym działaniem apolipoproteiny C-II (APOC2) – białka będącego aktywatorem lipazy lipoproteinowej. Obecnie uważa się, że podwyższony poziom trójglicerydów w surowicy jest niezależnym czynnikiem ryzyka miażdżycy. U osób z hiperlipoproteinemią typu I rozwój miażdżycy może prowadzić do choroby niedokrwiennej serca i/lub ostrego zapalenia trzustki. Do analizy genów LPL oraz APOC2 zastosowano technikę amplifikacji PCR, a następnie bezpośrednie sekwencjonowanie przy użyciu sekwenatora automatycznego ABI 310. W celu wykrycia mutacji przebadane zostały sekwencje promotorowe oraz wszystkie eksony tych genów, wraz z przylegającymi fragmentami intronów. Badania zostały przeprowadzone w grupie 10 dzieci z rozpoznaniem klinicznym hiperlipoproteinemii typu I. Mutacje genu LPL zostały wykryte w pięciu przypadkach. Jedna z tych mutacji (S244P, ekson 6) nie została jak dotąd opisana w literaturze. Mutacji w genie APOC2 nie wykryto. Są to pierwsze badania molekularne rodzin z hiperlipoproteinemią typu I w Polsce. Prowadzone są dalsze badania w celu wykrycia spektrum mutacji tych genów w populacji polskiej. 37 Genetyka człowieka Epidemiologia genetyczna Komunikaty ustne: W16. Zespół Smitha, Lemlego i Opitza: ustalenie częstości występowania heterozygotycznego nosicielstwa dwóch najczęstszych mutacji – W151X i V326L. Elżbieta Ciara, E. Popowska, D. Piekutowska-Abramczuk, M. Borucka-Mankiewicz, D. Jurkiewicz, P. Kowalski, M. Krajewska-Walasek Zakład Genetyki Medycznej, „Instytut-Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa Zespół Smitha, Lemlego i Opitza (SLOS) jest monogenową chorobą autosomalną recesywną, charakteryzującą się występowaniem zespołu mnogich wad wrodzonych o szerokim i zmiennym spektrum objawów. Choroba wynika z defektu reduktazy ?7-dehydrocholesterolu (DHCR7), która katalizuje ostatni etap w biosyntezie cholesterolu. Gen DHCR7 kodujący białko enzymatyczne zlokalizowany jest na chromosomie 11 w pozycji q13. Badania molekularne przeprowadzone w populacji polskiej przez Pracownię Genetyki Molekularnej Zakładu Genetyki Medycznej IP-CZD ujawniły obecność 15 różnych mutacji w genie DHCR7, z których dwie, W151X i V326L, wystąpiły na 60% przebadanych alleli genu. Wysoka częstość występowania obu mutacji umożliwia ich wykorzystanie jako markerów nosicielstwa choroby w badaniach przesiewowych. Celem prezentowanych badań było ustalenie frekwencji dwóch najczęstszych mutacji genu DHCR7 w anonimowej grupie noworodków oraz określenie częstości występowania zespołu SLO w populacji polskiej. Przebadano 1650 preparatów DNA na obecność mutacji W151X oraz 1250 preparatów DNA na obecność mutacji V326L. Zidentyfikowano 30 heterozygotycznych nosicieli mutacji W151X oraz 9 heterozygotycznych nosicieli mutacji V326L. Na podstawie uzyskanych wyników oszacowano, że całkowita częstość nosicielstwa choroby wynosi od 5.22% (1 na 19) do 3.32% (1 na 30), a częstość występowania zespołu SLO w populacji polskiej od 1 : 3623 do 1 : 1440 żywo urodzonych dzieci. Rezultaty dotychczasowych badań wskazują, że częstość nosicielstwa zespołu Smitha, Lemlego i Opitza w Polsce jest wyższa niż w innych krajach Europy Środkowej (Czechy i Słowacja, 2%) i znacznie wyższa niż w krajach Europy Zachodniej i Ameryki Północnej (1%-1,4%). Badania były częściowo finansowane z projektu KBN No. PBZ-KBN-042/PO5/2001. W17. Zespół Leigha : Częstość występowania nosicielstwa mutacji genu SURF1 w populacji polskiej. Dorota Piekutowska-Abramczuk (1), E. Popowska (1), E. Ciara (1), D. Jurkiewicz (1), M. Borucka-Mankiewicz (1), P. Kowalski (1), M. Pronicki (2), J. Sykut-Cegielska (3), M. Krajewska-Walasek (1), E. Pronicka (3) (1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa (2) Zakład Patomorfologii, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa (3) Klinika Pediatrii, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa Zespół Leigha, związany z deficytem kompleksu oksydazy cytochromu c (LSCOX-), dziedziczony w sposób autosomalnie recesywny, należy do częściej występujących zaburzeń neurodegeneracyjnych okresu niemowlęcego i dziecięcego. W klasycznej postaci choroby objawy pojawiają się po kilku miesiącach prawidłowego rozwoju i narastają gwałtownie. Dochodzi do zahamowania tempa rozwoju psychomotorycznego, wymiotów i zaburzeń rytmu oddychania. Charakterystyczne jest zaburzenie koordynacji ruchów gałek ocznych, ataksja, dystonia oraz wiotkość mięśni. Obserwuje się podwyższenie poziomu mleczanów w płynie mózgowo-rdzeniowym i surowicy krwi. Choroba prowadzi do zgonu z powodu niewydolności oddechowej zwykle między 2 a 5 rokiem życia. W badaniu autopsyjnym lub CT/MRI identyfikowane są charakterystyczne symetryczne ogniska martwicze w pniu mózgu, okolicy wzgórza wzrokowego, rdzeniu przedłużonym i górnym odcinku rdzenia kręgowego. Prace zmierzające do wyjaśnienia molekularnego podłoża zespołu doprowadziły w roku 1998 do wykrycia zmian w budowie genu SURF1, odpowiedzialnych za większość przypadków tej choroby. Przeprowadzone przez nas uprzednio badania 31 pacjentów z zespołem Leigha, ujawniły obecność pięciu różnych mutacji: M235T, Y274C, 312insATdel10, 758delCA, 845delCT. Najczęściej identyfikowaną 38 Genetyka człowieka mutacją w genie SURF1 jest delecja 845delCT w egzonie 9, występująca u wszystkich badanych (w tym 57% w formie homozygotycznej). Znacząca dominacja 845delCT pozwoliła na wybranie tej mutacji jako markera, służącego do określenia częstości występowania nosicielstwa uszkodzonego genu SURF1 w Polsce. Badania przesiewowe, przeprowadzone na grupie 2000 anonimowych noworodków, doprowadziły do wykrycia sześciu heterozygotycznych nosicieli powszechnej mutacji 845delCT (1:333). Biorąc pod uwagę fakt, iż mutacja ta wykrywana jest na 81% zmutowanych alleli wyliczono, że częstość występowania zespołu Leigha sprzężonego z deficytem kompleksu COX w Polsce wynosi 2,7 : 1000000 żywych urodzeń. Badania były finansowane z projektu KBN nr 3P05E09525. W18. Związek polimorfizmu Trp64Arg genu receptora beta 3-adrenergicznego z występowaniem cukrzycy typu 2 i chorób naczyniowo-sercowych w populacji polskiej. Janusz Błasiak (1), Karolina Przybyłowska (1), Ireneusz Majsterek (1), Katarzyna Bąbol (1), Jacek Kasznicki (2), Józef Drzewoski (2) (1) Katedra Genetyki Molekularnej, Uniwersytet Łódzki, Łódź (2) Zakład Farmakologii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny, Łódź Receptor beta 3-adrenergiczny (beta3-AR ) jest odpowiedzialny za termogenezę i metabolizm lipidów, dlatego polimorfizm Trp64Arg w jego genie może być związany z predyspozycją do otyłości oraz występowaniem chorób z nią związanych takich jak cukrzyca i miażdżyca naczyń wieńcowych. Wykazano zależność między tym polimorfizmem i występowaniem insulinooporności u pacjentów z cukrzycą typu 2 (DM2) w różnych populacjach. Celem pracy było określenie znaczenia polimorfizmu Trp64Arg genu receptora beta 3-AR dla występowania DM2 w populacji kaukaskiej w Polsce. Analizę wariantów polimorficznych przeprowadzono metodą RFLP-PCR z użyciem enzymu MspI. Przebadano 332 pacjentów, wśród których były 154 osoby otyłe (BMI > 27kg/m2), 105 osób z cukrzycą typu 2, 143 osoby z nadciśnieniem, 126 osób z chorobą wieńcową (CHD) oraz 178 osób z prawidłowym metabolizmem glukozy. Częstość allelu Arg była znacząco wyższa w grupie osób z DM2 w porównaniu z grupą, w której DM2 nie stwierdzono (20% vs 12%; OR 1,71, 95% PU 1,01-,2,89) oraz grupie osób z CHD porównywanej z grupą osób bez CHD (19% vs 13%; OR 1,69, 95% PU 1,03-2,78) Otrzymane wyniki wskazują, że allel Arg polimorfizmu Trp64Arg genu beta3-AR może być związany z występowaniem DM2 w populacji w Polsce, jak również może mieć wpływ na rozwój choroby naczyniowosercowej współistniejącej z DM2. Praca finansowana z badań własnych: grant Uniwersytetu Łódzkiego nr 505/450 (JB, KP, IM) oraz grantu Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr 503-123-2 (JK, JD). W19. Wysoka częstość mutacji 313del14 genu GJB2 w populacji polskiej w porównaniu z innymi populacjami rasy białej. Agnieszka Pollak (1), R. Płoski (1,2), M. Mueller-Malesińska (1), J. Waligóra (1, 2), A. Skórka (1, 2), L. Korniszewski (1, 2) , H. Skarżyński (1) (1) Instytut Fizjologii i Patologii Słuchu w Warszawie, ul Pstrowskiego 1, 01-943, Warszawa (2) Klinika Diabetologii Patologii Noworodka i Wad Wrodzonych Akademii Medycznej w Warszawie U podłoża niedosłuchu uwarunkowanego genetycznie najczęściej leżą mutacje w II egzonie genu GJB2, a w szczególności delecja guaniny w pozycji 35 (35 delG). Dane literaturowe wskazują także na występowanie szeregu innych, różnych od 35delG recesywnych, mutacji chorobotwórczych w genie Cx26, rzadziej występujących jako przyczyna niedosłuchu i wykazujących różnice w częstości występowania w różnych populacjach. Nietrudno zauważyć iż mutacje wywołujące niedosłuch mają różne częstości występowania wśród analizowanych populacji, ale zwykle co najmniej dwie poza 35 delG stanowią znakomita większość wywołującą niedosłuch– pozostałe tworzą swojego rodzaju tło będąc w mniejszości. W przedstawianej pracy analizowano mutacje w genie GJB2 wśród polskich pacjentów z niedosłuchem w celu znalezienia innych niż 35delG mutacji o stosunkowo wysokiej częstości, których znajomość może być istotna w diagnostyce genetycznie uwarunkowanego niedosłuchu w naszej populacji. Analiza oparta na sekwencjonowaniu prowadzona wśród heterozygot 35delG wykazała, że drugą co do częstości patogenną mutacją w GJB2 jest 313del14. Wyniki te potwierdzają opublikowane dane (Wiszniewski i wsp. 2001). W celu precyzyjnego określenia częstości występowania tej mutacji wśród pacjentów w Polsce przebadano 421 niespokrewnionych osób z niedosłuchem. Wyniki pozwoliły określić częstość występowania 313del14 u pacjentów z niedosłuchem na 1,54% (95% przedział ufności 0,7%–2,4%). Dane literaturowe wskazują, że 313del14 występuje także 39 Genetyka człowieka w innych populacjach rasy białej ale zdecydowanie rzadziej niż w Polsce. Otrzymane wyniki pozwalają stwierdzić iż mutacja 313del14 stanowi drugą w kolejności po 35delG przyczynę niedosłuchu uwarunkowanego genetycznie w populacji polskiej, a test na jej obecność powinien być wykonywany u każdego pacjenta podejrzanego o niedosłuch uwarunkowany genetycznie równolegle z testem na obecność 35delG. Statystycznie istotna wyższa częstość mutacji 313del14 w Polsce w porównaniu z innymi populacjami rasy białej sugeruje, że mutacja ta mogła powstać w rejonie Europy Środkowej. W20. Częstości alleli niedoborowych alfa-1-antytrypsyny w losowej próbie populacji Krakowa. Marcin Kaczor, Marek Sanak, Andrzej Szczeklik II Katedra Chorób Wewnętrznych, Collegium Medicum, Uniwersytetu Jagiellońskiego, ul. Skawińska 8, 31-066 Kraków Ciężki niedobór alfa-1-antytrypsyny, prowadzący do chorób płuc i wątroby, występuje u homozygot Z i jest jedną z częstszych chorób genetycznych wśród rasy białej. Brak jest wiarygodnych oszacowań częstości najpowszechniejszych alleli niedoborowych Z i S w polskiej populacji. Celem niniejszej pracy jest ocena ich rzeczywistej częstości na podstawie analizy reprezentatywnej próby populacyjnej metodami genetycznymi. Badanie przeprowadzono techniką PCR z użyciem pary sond znakowanych fluorescencyjnie i detekcją „real-time” produktu. Genotypowano losową próbę 550 mieszkańców Krakowa. Częstości alleliczne wyniosły: w przypadku Z – 0,0109 (95% CI: 0,0057-0,0190), natomiast S – 0,0172 (95% CI: 0,0104-0,0268). Nie stwierdzono znamiennych różnic z wcześniej zebraną populacja spośród mieszkańców Kazimierza – jednej z dzielnic Krakowa. Połączono obie grupy, łącznie przebadano 859 osób, znajdując 18 heterozygot MZ, 28 heterozygot MS i jedną homozygotę S. Wykazano zgodność częstości obserwowanych genotypów z oczekiwanymi na podstawie równowagi Hardy’ego-Weinberga. W połączonych grupach częstość allela Z wyniosła 0,0105 (95% CI: 0,0062-0,0165), zaś allela S – 0,0175 (95% CI: 0,0118-0,0248). W Polskiej populacji należy oczekiwać 4 197 (95% CI: 1 470-10 408) homozygot Z. Wczesne wykrycie predyspozycji genetycznej, w połączeniu z prawidłową opieką lekarską i zmianą trybu życia, prowadzić może do uniknięcia lub opóźnienia rozwoju choroby. Należy rozważyć wprowadzenie w Polsce diagnostyki genetycznej niedoborów do powszechnej praktyki klinicznej, zgodnie ze wspólnymi wytycznymi American Thoracic Society i European Respiratory Society. W21. Mutacje genów CFTR, PRSS1 i SPINK1 u pacjentów z zapaleniem trzustki. Agnieszka Sobczyńska-Tomaszewska (1), Daniel Bąk (1, 2), Kamila Czerska (1, 6), Beata Oralewska (3), Grzegorz Oracz (3), Mikołaj Teisseyre (3), Jerzy Socha (3), Marek Zagulski (4), Aleksandra Norek (1, 5), Jerzy Bal (1) (1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka (2) Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski (3) Klinika Gastroenterologii i Hepatologii, Instytut-Centrum Zdrowia Dziecka (4) Pracownia Sekwencjonowania, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawa (5) Politechnika Łódzka, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Łódź (6) Studium Medycyny Molekularnej, Akademia Medyczna, Warszawa Zapalenie trzustki należy do stosunkowo rzadko rozpoznawanych chorób u dzieci (10-15/100 000), ale z uwagi na poważne rokowanie stanowi istotny problem w pediatrii. Jak się sądzi, u podłoża molekularnego zapalenia trzustki leżą mutacje w wielu różnych genach. Badania molekularne genów CFTR, PRSS1 i SPINK1 przeprowadzono w grupie 85 pacjentów w wieku 3-19 lat. Identyfikowano mutacje w następujących genach: CFTR – 30 mutacji (50 pacjentów), dla pozostałej grupy – 2 najczęstsze mutacje (delF508 i dele2,3(21kb)), u wszystkich pacjentów analizowano wariant IVS8-5T, PRSS1 – mutacje R122H, R122C, N29I i A16V, dodatkowo u 30 pacjentów przeprowadzono badanie przesiewowe (poszukiwanie mutacji rzadkich), SPINK1 – mutacja N34S. U 24 pacjentów (28%, P=0,033) zidentyfikowano mutacje w co najmniej jednym badanym genie. W genie PRSS1 mutacje wykryto u 10 pacjentów (12%, P=0,013). U dwóch pacjentów oprócz mutacji w genie PRSS1 zidentyfikowano współistniejące defekty w pozostałych badanych genach: CFTR i SPINK1. W genie CFTR zidentyfikowano mutacje lub wariant 5T u 10 pacjentów (12%, P=1,000): u 7 pacjentów wyłącznie w genie CFTR, u 2 w CFTR i w SPINK1 oraz u 1 pacjenta w genach CFTR i PRSS1. Częstość występowania mutacji w genie CFTR (wyłączając IVS8-5T) u pacjentów z zapaleniem trzustki była 1.5 razy wyższa niż w populacji polskiej (5/85 (6%) vs. 1/25 (4%)). Nie stwierdzono wyższej 40 Genetyka człowieka częstości występowania wariantu IVS8-5T w badanej grupie chorych. Natomiast mutację N34S w genie SPINK1 wykryto u 8 pacjentów (9%, P=0.153), u 3 z nich stwierdzono współistnienie mutacji w innych badanych genach. Mutacje w genie PRSS1 występują nie tylko w przypadkach rodzinnej postaci choroby, ale także u pacjentów bez pozytywnego wywiadu rodzinnego. Ponieważ u pacjentów z mutacjami w genie PRSS1 jest ok. 50 razy wyższe prawdopodobieństwo zachorowania na raka trzustki niż dla populacji ogólnej, istnieje potrzeba włączenia badań molekularnych genu PRSS1 do panelu badań przeprowadzanych u pacjentów z zapaleniem trzustki. Badania molekularne powinny także obejmować analizę najczęstszych mutacji w genach CFTR i SPINK1. Badania wykonywano w ramach realizacji projektu badawczego KBN: 3 P05E 132 23. W22. Serial segmental duplications during primate evolution result in complex human genome architecture. Paweł Stankiewicz (1), Christine J. Shaw (1), Marjorie Withers (1), Ken Inoue (1), James R. Lupski (1, 2, 3) (1) Department of Molecular & Human Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA (2) Pediatrics, Baylor College of Medicine, 3Texas Children Hospital, Houston, Texas 77030, USA (3) Texas Children Hospital, Houston, TX, 4Depts of Pathology and 5Pediatrics, University of Texas Medical Branch, Galveston, TX, 6Department of Pathology, Mayo Clinic, Rochester, MN The human genome is particularly rich in low-copy repeats (LCRs) or segmental duplications (5-10%), and this characteristic distinguishes us from lower mammals such as rodents. How and why the complex human genome architecture consisting of multiple LCRs has evolved, remains an open question. Using molecular and computational analyses of human and progenitor primate genomic regions, we analyzed the structure and evolution of LCRs that resulted in complex architectural features of the human genome in proximal 17p. We found that multiple LCRs of different origins are situated adjacent to one another, whereas each LCR evolved at different time points > 25 to 3-7 million years ago, during primate speciation. Evolutionary studies in primates indicated abundant communication between the LCRs by gene conversion. The DNA transposable element MER1-Charlie3 and retroviral ERVL elements were identified at the breakpoint of the t(4;19) chromosome translocation in Gorilla gorilla, suggesting a potential role for transpositions in evolution of the primate genome. Thus, a series of consecutive segmental duplication events during primate evolution resulted in complex genome architecture in proximal 17p. Some of the more recent events led to the creation of novel genes that in human are expressed primarily in the brain. Our observations support the contention that serial segmental duplication events orchestrated primate speciation both by the generation of novel fusion/fission genes as well as by genomic inversion associated with decreased recombination rates further facilitating gene divergence. W23. Wady wrodzone przedniej ściany brzucha i wybrane czynniki ryzyka ich występowania – dane z Polskiego Rejestru Wrodzonych Wad Rozwojowych (PRWW). Anna Materna-Kiryluk (1), K. Wiśniewska (1, 2) M. Badura (1) J.P. Mejnartowicz (1) M. Czerwionka-Szaflarska (3) E. Gajewska (4) M. Krawczyński (5) J. Limon (6) M. Walczak (7) A. Latos-Bieleńska (1) (1) Katedra i Zakład Genetyki Medycznej AM, Poznań (2) Katedra Profilaktyki Zdrowotnej AM, Poznań� (3) Katedra i Klinika Pediatrii, Alergologii i Gastroenterologii AM, Bydgoszcz (4) Klinika Neonatologii AM, Wrocław (5) Klinika Gastroenterologii Dziecięcej i Chorób Metabolicznych AM, Poznań (6) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki AM, Gdańsk; 7-Katedra Chorób Dzieci PAM, Szczecin Od lat 70-tych w wielu krajach Europy Zachodniej, USA i Australii obserwuje się wzrost częstości występowania wytrzewienia. Obserwowany wzrost nie dotyczy jednak częstości występowania przepukliny pępowinowej. Na podstawie danych z PRWWR określono wskaźnik częstości występowania wytrzewienia i przepukliny pępowinowej wśród dzieci urodzonych w latach 1998-2001 na terenie województw dolnośląskiego, kujawsko-pomorskiego, lubuskiego, opolskiego, pomorskiego, wielkopolskiego i zachodniopomorskiego (43% powierzchni kraju) oraz podjęto próbę identyfikacji wybranych czynników ryzyka występowania tych wad. Na terenie objętym analizą w latach 1998-2001 zarejestrowano 576 509 urodzeń żywych (uż). Do PRWWR zgłoszono 104 żywo urodzone dzieci z wytrzewieniem. Częstość występowania wytrzewienia wynosiła 1,80/1000 uż (71,2% przypadki izolowane, a 28,8% zespoły wad). Stwierdzono zróżnicowanie terytorialne częstości występowania wytrzewienia; najwyższy współczynnik częstości stwierdzono w województwie zachodniopomorskim (2,51/1000 uż). Stwierdzono większą częstość występowania wytrzewienia u dzieci płci męskiej. Wytrzewienie częściej występowało u noworodków z niską masą urodzeniową ciała 41 Genetyka człowieka 1500-1999 g (32,22/1000 uż); a także wśród potomstwa kobiety poniżej 19 roku życia (4,43/1000 uż). Wyższa częstość występowania wytrzewienia wśród dzieci tej grupy kobiet dotyczyła zarówno przypadków izolowanego wytrzewienia jak i zespołów wad (odpowiednio 3,62 i 0,81 na 1000 uż). Najczęstszymi wadami towarzyszącymi wytrzewieniu były wady układu mięśniowo-szkieletowego inne niż wytrzewienie (34%) i wady układu nerwowego (17%). Wśród populacji badanej przepuklinę sznura pępowinowego stwierdzono u 88 dzieci (częstość występowania 1,53/10000 uż), 50% przypadków przepukliny pępowinowej występowało jako wada izolowana, a 50% w zespołach wad. Przepuklinę pępowinową stwierdzano częściej na terenach wiejskich (1,6/1000 uż) niż miejskich (1,35/1000 uż); najczęściej u noworodków z niską masą urodzeniową ciała 1000-1499 g (23,13/1000 uż); u potomstwa kobiet w wieku powyżej 35 lat (2,18/1000 uż). Jednak najwyższy współczynnik częstości występowania izolowanej przepukliny pępowinowej stwierdzono, podobnie jak w przypadku wytrzewienia, wśród dzieci kobiet w wieku poniżej 19 lat (1,01/ 1000 uż). Najczęstszymi wadami towarzyszącymi przepuklinie pępowinowej były wady serca (27,6%) i wady układu mięśniowo-szkieletowego (18,7%). W24. Analiza mechanizmów zdrowego starzenia – badania cytogenetyczne polskich stulatków. Alina Wojda, E. Ziętkiewicz, M. Lubka, M. Witt Instytut Genetyki Człowieka PAN, Poznań, ul. Strzeszyńska 32 Proces starzenia definiowany jest jako zahamowanie zdolności komórki do proliferacji, spowodowane zmianami zachodzącymi z wiekiem komórki (nagromadzenie uszkodzeń DNA, obniżenie zdolności naprawczych DNA, zahamowanie syntezy DNA). Na poziomie cytogenetycznym zmiany te są obserwowane jako aberracje liczby i struktury chromosomów oraz zahamowanie cyklu komórkowego. W celu określenia biomarkera procesu starzenia na poziomie cytogenetycznym przeprowadzono badania limfocytów krwi obwodowej, z zastosowaniem klasycznych i molekularnych (FISH) technik cytogenetycznych. Badania przeprowadzono u 47 kobiet i 7 mężczyzn w wieku od 100 do 107 lat oraz u 60 osób z grupy kontrolnej w przedziałach wiekowych 21–30 lat, 41–50 lat, 61–68 lat, 69–78 lat. W pojedynczych komórkach badanych osób stwierdzono występowanie różnych aberracji chromosomowych, nie znaleziono jednak aberracji charakterystycznych dla danej grupy wiekowej. Tym, co odróżniało poszczególne grupy wiekowe, była częstotliwość występowania komórek, w których obserwowano spontaniczne pęknięcia i złamania chromosomów, najwyższa w grupie wiekowej 61-68 lat. Analiza wyników w grupach podzielonych wg wieku i płci wykazała, że u kobiet częstotliwość aberracji struktury chromosomów początkowo wzrasta z wiekiem, osiągając najwyższe wartości w grupie 61-68 lat, po czym u kobiet starszych i stuletnich stopniowo maleje. U mężczyzn częstotliwość występowania aberracji struktury chromosomów wzrasta systematycznie wraz z wiekiem, jednak wolniej niż u kobiet: w grupie 61-68 lat częstotliwość aberracji struktury jest dużo niższa u mężczyzn, podczas gdy w grupie stulatków odpowiednie wartości dla kobiet i mężczyzn są porównywalne. Częstotliwość występowania aneuploidii chromosomów wzrasta z wiekiem zarówno u kobiet, jak i u mężczyzn; u mężczyzn jednak wzrost ten jest wolniejszy niż u kobiet. Częstotliwość występowania mikrojąder w komórkach dwujądrowych wzrasta z wiekiem zarówno u kobiet i mężczyzn. W ok. 90% przypadków utracie na drodze tworzenia mikrojąder ulegają całe chromosomy, głównie chromosomy płci; chromosomy autosomowe ulegają utracie głównie na drodze nondysjunkcji. W starszych grupach wiekowych dominują osoby charakteryzujące się niską częstotliwością występowania uszkodzeń chromosomowych. Prawdopodobnie wraz z wiekiem następuje eliminacja z populacji osób o podwyższonej skłonności do akumulacji różnych uszkodzeń chromosomów. Można zatem stwierdzić, że stabilność genomu odgrywa fundamentalną rolę w determinacji długości życia. W25. Określenie prawdopodobieństwa wystąpienia patologii u potomstwa nosicieli translokacji robertsonowskich der(13;14) dwu i jednocentromerowych. Anna Jelska (1), Gesa Schwanitz (2), Barbara Panasiuk (1), Anna Latos-Bieleńska (3), Janusz Limon (4), Olga Haus (5), Jacek Pilch (6), Maria Lassota (7), Alina T. Midro (1) (1) Zakład Genetyki Klinicznej AM, Białystok (2) Institut für Humangenetik, Bonn, Germany (3) Katedra i Zakład Genetyki Medycznej AM, Poznań (4) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki AM, Gdańsk (5) Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej AM w Bydgoszczy 42 Genetyka człowieka (6) Pracownia Cytogenetyczna, Klinika Neurologii Wieku Rozwojowego, GCZD i M, Katowice (7) Poradnia Genetyczna Wojewódzkiego Szpitala Dziecięcego, Rzeszów Obecność nosicielstwa translokacji chromosomowej robertsonowskiej der(13;14) kwalifikuje je do grupy niskiego prawdopodobieństwa urodzenia dziecka z niezrównoważonym kariotypem (zespołu Patau) oraz z ojcowską lub matczyną disomią chromosomu 14. Ograniczona możliwość przeżycia in utero płodów w przypadku niektórych form niezrównoważenia kariotypu prowadzi do zwiększonej częstości występowania poronień samoistnych, ciąż obumarłych i wczesnych zgonów noworodków wpływając na wielkość ryzyka genetycznego. Dokładne rozpoznanie cytogenetyczne uwzględnia czy der (13;14) jest jedno czy dwucentromerowa. Celem pracy jest określenie prawdopodobieństwa wystąpienia poszczególnych patologii spowodowanych stanem nosicielstwa der (13;14) w zależności od liczby centromerów obecnych w translokacji der(13;14). Materiał do badań stanowiło 456 ciąż z 151 rodzin nosicieli 85 rodowodów nosicieli der (13;14) identyfikowanych przy użyciu technik prążkowych GTG, CBG i QFQ. Wielkość prawdopodobieństwa wystąpienia poszczególnych patologii oszacowano metodą wg Stengel-Rutkowski i wsp. z uwzględnieniem korekty oszacowania wg Stene. Stwierdzono, że prawdopodobieństwo urodzenia dziecka z trisomią 13 (0/313, tj. poniżej 0,2%), oraz ryzyko ciąż obumarłych i wczesnych zgonów (4/177, tj. poniżej 2,2%), są znacznie niższe niż ryzyko poronień samoistnych (45/313, tj. 14,4%) Wielkość ryzyka poronień samoistnych jest porównywalna do wyniku oszacowania wielkości prawdopodobieństwa niezrównoważenia w diagnostyce prenatalnej (3/23, tj. 13,7%) co potwierdza, że poronienia samoistne mogły wystąpić w wyniku niezrównoważonego kariotypu. Wyższe ryzyko poronień samoistnych u nosicieli translokacji chromosomowych dwucentromerowych tj. 19% (15/79) w porównaniu do jednocentromerowych, tj. 10% (6/57) sugeruje potrzebę dyskryminacji rodzaju translokacji robertsonowskich w ich diagnostyce do celów poradnictwa genetycznego. W26. Wpływ nosicielstwa translokacji zrównoważonych na niepowodzenia ciążowe. Magdalena Pasińska (1), Ewa Duszeńko (2), Barbara Mucha (1), Katarzyna Skonieczka (1), Anna Lauda-Świeciak (1), Olga Haus (1, 2) (1) Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej AM w Bydgoszczy (2) Pracownia Cytogenetyczna Kliniki Hematologii AM we Wrocławiu Uważa się, że za 2,8-13,4% przypadków niepowodzeń ciążowych odpowiada nieprawidłowy kariotyp jednego z partnerów. Najczęściej spotykaną nieprawidłowością jest nosicielstwo aberracji zrównoważonej. Celem badań było przeprowadzenie analizy rodzaju niepowodzeń ciążowych u nosicieli translokacji wzajemnych oraz określenie czy istnieje zależność między rodzajem aberracji a typem niepowodzenia ciążowego, które było wskazaniem do badania kariotypu oraz zależność między rodzajem translokacji a płcią pacjenta. Analizie poddawano chromosomy metafazowe lub prometafazowe, które uzyskiwano z 72 godzinnych hodowli limfocytów krwi obwodowej. U każdego pacjenta analizowano zgodnie z ICSN 1995 co najmniej 20 metafaz udokumentowanych na odbitkach fotograficznych albo wydrukach komputerowych. Dodatkowo w wybranych przypadkach zastosowano technikę FISH z sondami malującymi i specyficznymi. � U par z niepłodnością pierwotną translokacje występowały wyłącznie u mężczyzn, u par z poronieniami nawykowymi, głównie u kobiet a u par z poronieniami i urodzeniem dziecka z wadami z jednakową częstością u obu płci. U 12 badanych; 6 kobiet i 6 mężczyzn znaleziono translokacje wzajemne. W parach z niepłodnością pierwotną translokacje stwierdzono wyłącznie u mężczyzn. Były to: t(1;19)(p35;q13.3), t(15;16)(q13;p13.3), t(14;21)(q10;q10). W parach, w których wystąpiły same poronienia, translokacje znaleziono u 3 kobiet i 1 mężczyzny; 46,XX,t(7;19)(p1 3;p13.1), 46,XX,t(8;16)(q24;q22), 46,XX,t(3;8)(q21;p21), 46,XY,t(13;18)(q14;q21.1). Wśród par, w których wystąpiły poronienia oraz urodzenie dziecka z wadami, translokacje rozpoznano u 6 osób; 3 kobiet i 3 mężczyzn. W 4 przypadkach były to translokacje zrównoważone wzajemne: t(4;13)(q34;q31) – u mężczyzny – ojca trojga dzieci z niezrównoważonym kariotypem, t(1;10)(q21;q22) – u ojca chłopca z zaburzeniami cielesno-płciowymi, t(1;7)(q23;q11.2) – u matki dziecka z niezrównoważonym kariotypem i opóźnieniem rozwoju psycho – ruchowego oraz t(5;13)(p11;q14) – u ojca dziecka z niezrównoważonym kariotypem i klinicznymi objawami zespołu cri du chat. W 2 przypadkach wystąpiły translokacje robertsonowskie; t(14;21)(q10;q10) – u kobiety z 4 poronieniami i dzieckiem z wadami i t(13;14)(q10;q10) – u kobiety, która urodziła dziecko z zespołem Patau. 43 Genetyka człowieka W27. Ocena przydatności pomiarów przezierności karkowej oraz oznaczeń białka ciążowego A i wolnej podjednostki beta gonadotropiny kosmówkowej w badaniach płodu. Lech Dudarewicz (1), Jolanta Lukamowicz (2), Ewa Świątkowska (2), Lucjusz Jakubowski (1) (1) Zakład Genetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki (2) Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki Cel pracy: Określenie zakresu prawidłowej zmienności badanych parametrów i analiza ich rozkładu w grupach płodów zdrowych (dla poszczególnych tygodni ciąży) oraz odniesienie do tak zdefiniowanych przedziałów wyników badań wykonanych w ciążach z rozpoznaną u płodu aberracją chromosomową. Materiał: grupa ciąż pojedynczych, w których wykonano ultrasonograficzne pomiary przezierności karkowej (NT) u płodu zgodnie z protokołem Fundacji Medycyny Płodowej oraz pomiary stężeń surowiczych białka ciążowego A (PAPP-A) i wolnej podjednostki beta gonadotropiny kosmówkowej w surowicy krwi ciężarnych. Analizę danych przeprowadzono przy pomocy dostępnego oprogramowania. Wyniki: Określono zakresy norm dla ocenianych parametrów z uwzględnieniem wieku ciążowego oraz innych danych klinicznych i demograficznych. Opisano zakres ich fizjologicznej zmienności zależnie od stosowanej metody oznaczeń biochemicznych.� Wniosek: Rozkład ryzyka wystąpienia wybranych typów aneuploidii określonego na podstawie pomiaru NT u płodu oraz oceny stężeń surowiczych PAPP-A i f beta-hCG oraz wieku matki jest znamiennie statystycznie różny w grupie płodów zdrowych w porównaniu z grupą płodów z aberracjami chromosomowymi. Pozwala to na wykorzystanie zastosowanego schematu postępowania w badaniach przesiewowych pod kątem wczesnego wykrywania wybranych typów aneuploidii. Badania były częściowo finansowane w oparciu o grant KBN nr 3 PO5E 156 22. Komunikaty plakatowe: P34. Mutacja zmiany sensu w eksonie 12 u chorego z łagodną postacią hemofilii A. Jadwiga Sawecka (1), J. Skulimowska (1), A. Klukowska (2), J. Kościelak (1) (1) Zakład Biochemii, Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie (2) Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii AM w Warszawie Oznaczono mutację u pacjenta z łagodną postacią hemofilii A. W eksonie 12 wykryto mutację typu zmiany sensu, w której 593 kodon genu czynnika VIII, CGC był zastąpiony kodonem TGC, co spowodowało zamianę argininy na cysteinę. W bazie danych znaleziono 33 doniesienia o tego rodzaju mutacji u pacjentów z łagodną bądź umiarkowaną hemofilią A. Tę samą mutację zidentyfikowano również u chorego na łagodną hemofilię A brata bliźniaka pacjenta. � Do oznaczenia mutacji zastosowano cykliczną metodę sekwencjonowania DNA z użyciem polimerazy DNA Ampli Taq, FS i terminatorów znakowanych 4 barwnikami fluorescencyjnymi, pochodnymi dichloroaminy (A-dR6G, C-dROX, GR110, T-dTAMRA). Namnożone eksony metodą PCR poddano sekwencjonowaniu w obu kierunkach i elektroforezie w warunkach denaturujących w temperaturze 51oC na 4% żelu poliakryloamidowym o grubości 0,2 mm i długości 36 cm zawierającym 6M mocznik, przy napięciu 1680 V, natężeniu 50 mA i mocy lasera 40mW na sekwenatorze ABI PRISM 377. P35. Genotyp IL-10 (-1082G/A) w kontekście zachorowalności na gruźlicę. Magdalena Druszczyńska (1) , D. Strapagiel (1), J. Karhukorpi (2), R. Karttunen (2), W. Rudnicka (1) (1) Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Instytut Mikrobiologii i Immunologii, Uniwersytet Łódzki (2) Department of Medical Microbiology, University of Oulu, Finlandia Genetyczne uwarunkowanie podatności na zachorowanie na gruźlicę uważa się za jedną z przyczyn zróżnicowanego przebiegu zakażenia Mycobacterium tuberculosis. Do wystąpienia objawów jawnej klinicznie choroby dochodzi u nie więcej niż 10% zakażonych osób. Pełny rozwój prątków uniemożliwia działanie mechanizmów protekcyjnej 44 Genetyka człowieka odpowiedzi immunologicznej opartej na współdziałaniu makrofagów i limfocytów T oraz wydzielanych przez nie cytokin. Prowadzone na szeroką skalę badania mają na celu wskazanie genu lub zespołu genów odpowiedzialnych za odporność na zachorowanie na tę chorobę. Biorąc pod uwagę, iż poznanie genetycznego podłoża podatności na gruźlicę jest niezbędne dla przygotowania bardziej efektywnej niż BCG szczepionki przeciwgruźliczej oraz opracowania lepszego niż test tuberkulinowy sposobu monitorowania jej skuteczności, celem badań było określenie częstości występowania poszczególnych wariantów allelicznych (A/A, G/G, A/G) genu kodującego IL-10 (pozycja –1082 regionu promotorowego) u 68 pacjentów chorych na gruźlicę płuc oraz 89 zdrowych osób, z których żadna nie chorowała na gruźlicę. Polimorfizm genu kodującego IL-10 określano wykorzystując reakcję łańcuchowej polimerazy (PCR).� Nie stwierdzono różnicy w częstości występowania poszczególnych genotypów IL-10 – A/A, G/G, A/G w grupie pacjentów z gruźlicą i osób zdrowych. Heterozygotami A/G było 36 spośród 68 (53%) pacjentów z gruźlicą oraz 38 spośród 89 (43%) zdrowych ochotników. Genotyp A/A lub G/G stwierdzono odpowiednio u około 30% lub 20% pacjentów chorych na gruźlicę i osób zdrowych. Na podstawie uzyskanych wyników można sugerować, że genotyp IL-10 (-1082G/A) nie ma związku z zachorowalnością na gruźlicę. Badania finansowane z grantu KBN, Nr 3PO5B 091 24. P36. Analiza danych z wywiadu ginekologiczno-położniczego 21 kobiet nosicielek premutacji w genie FMR1. Małgorzata Lisik Katedra i Zakład Biologii Ogólnej, Molekularnej i Genetyki, Śląska Akademia Medyczna, ul. Medyków 18, 40-752 Katowice Nosicielstwo premutacji w genie FMR 1 jest związane z przedwczesnym wygaśnięciem funkcji jajników lub menopauzą przed 40 rokiem życia. Wśród 21 kobiet, nosicielek premutacji w genie FMR1, o liczbie powtórzeń trójki nukleotydów CGG 60–160, przeprowadzono ankietę dotyczącą danych z wywiadu ginekologiczno-położniczego, obejmującej: wiek wystąpienia pierwszej miesiączki, czas trwania cyklu, jego zaburzenia, liczbę ciąż, niepowodzenia rozrodu, datę ostatniej miesiączki. Wiek pacjentek wahał się w granicach 31–49 (średni wiek 41 lat). Pacjentki podzielono na dwie grupy wiekowe, 9-osobową w wieku 31–39 lat oraz 12-osobową w wieku 41–49 lat. Wiek wystąpienia pierwszej miesiączki wahał się w granicach 11–18 lat, (średni 12 lat). Czas trwania cyklu wahał się w granicach 20–30 dni (średnio 26 dni), nieregularne cykle występowały u 3 pacjentek. Liczba ciąż wynosiła 1 do 6 (średnio 2,67), a liczba porodów 1 do 5, (średnio 2,24). Niepowodzenia rozrodu wystąpiły u 6 kobiet, w tym poronienia u 4 pacjentek, urodzenie martwego dziecka u 2, zaśniad groniasty u 1. Ciąża bliźniacza wystąpiła u 2 pacjentek. Wczesna menopauza, około 40 roku życia, wystąpiła u 3 pacjentek, tj. u 14%. Ryzyko wczesnego wygaśnięcia funkcji jajników u nosicielek premutacji ma swoje implikacje kliniczne, które należy uwzględnić przy udzielaniu porady genetycznej. P37. Polimorfizm CD14 a podatność na gruźlicę. Dominik Strapagiel (1), M. Druszczyńska (1), J. Karhukorpi (2), R. Karttunen (2), W. Rudnicka (1) (1) Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Instytut Mikrobiologii i Immunologii, Uniwersytet Łódzki (2) Department of Medical Microbiology, University of Oulu, Finlandia Glikoproteina CD14 jest receptorem sygnałowym wiążącym różnorodne ligandy bakteryjne, w tym lipopolisacharyd bakterii Gram-ujemnych oraz lipoarabinomannan (LAM) ściany komórkowej prątków, uznawany za jeden z głównych czynników chorobotwórczości mykobakterii. Receptory CD14 są zawsze obecne na powierzchni makrofagów i granulocytów oraz w formie rozpuszczalnej w surowicy (sCD14). Interakcja pomiędzy receptorami CD14 i LAM ma kluczowe znaczenie dla przebiegu zakażenia gruźliczego. Reakcja ta może zarówno uruchamiać mechanizmy pochłaniania, zabijania i trawienia prątków w fagocytach, jak również promować wewnątrzkomórkowe przeżywanie i rozwój tych bakterii. Biorąc pod uwagę istotne znaczenie produktów genu CD14 dla przebiegu interakcji prątków z makrofagami, celem badań była ocena polimorfizmu genu CD14 C-159-T oraz surowiczego poziomu sCD14 u 76 pacjentów z gruźlicą płuc i 69 zdrowych osób nigdy nie chorujących na gruźlicę. Polimorfizm genu CD14 określano wykorzystując reakcję łańcuchowej polimerazy (PCR). Produkty PCR o wielkości 227-bp dla allelu C oraz 381-bp dla allelu T uwidaczniano po elektroforezie w 2% żelu agarozowym i barwieniu bromkiem etydyny. Stężenie sCD14 w surowicach oceniano immunoenzymatycznie (QuantikineTM sCD14; R&D). Nie stwierdzono różnicy w częstości występowania poszczególnych genotypów CD14 – C/C, T/T, C/T w grupie 45 Genetyka człowieka pacjentów z gruźlicą i osób zdrowych. Genotyp C/T stwierdzono u ponad połowy pacjentów z gruźlicą oraz zdrowych ochotników. Homozygotami C/C lub T/T było odpowiednio około 30% lub 20% chorych na gruźlicę i osób zdrowych. Zarówno wśród zdrowych ochotników, jak i chorych na gruźlicę nie obserwowano różnicy w średnim poziomie sCD14 w surowicach osób o różnym genotypie CD14, jakkolwiek w surowicach pacjentów z gruźlicą stwierdzono dwukrotnie wyższy średni poziom sCD14 w porównaniu do surowic osób zdrowych. Wyniki pozwalają sugerować, że genotyp CD14 nie odgrywa roli w podatności ludzi na gruźlicę. Obserwowany w surowicach chorych na gruźlicę podwyższony poziom sCD14 nie jest uwarunkowany genetycznie, lecz prawdopodobnie jest konsekwencją trwającego zakażenia M. tuberculosis. Badania finansowane z grantu KBN, Nr 3PO5B 091 24. P38. Mutacje i tło genetyczne w zespole Lebera. Katarzyna Tońska (1), Janusz Piechota (1), Dorota Ratajska (1), Ewa Bartnik (1, 2) (1) Zakład Genetyki, Instytut Botaniki, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski (2) Instytut Biochemii i Biofizyki PAN Zespół Lebera jest najczęstszą chorobą mitochondrialną, dziedziczącą się w linii matczynej, charakteryzującą się utratą wzroku w młodym wieku, której rzadko towarzyszą dodatkowe objawy neurologiczne. 90 % przypadków zespołu Lebera jest powodowanych przez jedną z trzech podstawowych mutacji w mitochondrialnym DNA (nukleotydy 3460, 11778, 14484). Oprócz powyższych, znanych jest kilkanaście rzadko występujących mutacji odpowiedzialnych za tę chorobę. Wciąż trwają dyskusje o roli dodatkowych zmian w mitochondrialnym DNA, zwanych mutacjami drugorzędowymi na obraz choroby. Podjęte badania obejmują zarówno diagnostykę podstawowych mutacji prowadzących do zespołu Lebera jak i określenie mitochondrialnego tła genetycznego (przynależność do haplogrup mitochondrialnego DNA) u pacjentów ze zdiagnozowaną chorobą, a także wyniki poszukiwania nowych mutacji u pacjentów ze wskazaniami klinicznymi. P39. Zespół Allgrove’a u 7-letniego chłopca – rozpoznanie kliniczne choroby i jej molekularne potwierdzenie. Franciszek Iwańczak (1), Śmigiel Robert (1, 2), Blitek Aleksander (1), Heubner Angela (3) (1) II Katedra i Klinika Pediatrii, Gastroenterologii i Żywienia AM we Wrocławiu (2) Katedra Patofizjologii AM we Wrocławiu� (3) Universitaets – Kinderklinik Medizinisch – Theoretisches Zentrum, Dresden, Germany Zespół Allgovea, zwany inaczej zespołem 3A (triple A syndrome) jest rzadkim schorzeniem dziedziczonym w sposób autosomalny recesywny. Charakteryzuje się triadą chorób: achalazją przełyku, niedoczynnością kory nadnerczy oraz zaburzeniem wydzielania łez (alakrimią). U niektórych pacjentów występują dodatkowo zaburzenia neurologiczne oraz dermatologiczne. Ostatnio zidentyfikowano gen na długim ramieniu chromosomu 12 (12q13) nazywanym AAAS (ALADIN lub ADRACALIN), którego mutacje są przyczyną fenotypu zespołu trzech A. Autorzy pracy przedstawiają opis przypadku 7-letniego chłopca z zespołem Allgrove’a. Chłopiec, młodych, zdrowych rodziców spokrewnionych w trzecim pokoleniu, urodzony z CII,PII. W okresie niemowlęcym i pierwszych latach życia chłopiec rozwijał się prawidłowo, nie chorował. Już od pierwszych miesięcy życia rodzice zauważyli u chłopca brak łez, w piątym roku życia rozpoznano niedoczynność kory nadnerczy. W siódmym roku życia na podstawie obrazu klinicznego, badania kontrastowego, scyntygraficznego i manometrycznego przełyku rozpoznano achalazję przełyku. Rozpoznanie zespołu Allgrovea potwierdzono badaniem genetycznym wykonanym w Dziecięcym Szpitalu Uniwersyteckim w Dreźnie, identyfikując mutację zmiany sensu w eksonie 8 genu AAAS (869T>C). Powoduje ona zmianę seryny na prolinę w kodonie 263 (S263P). W literaturze opisano kilkanaście homozygotycznych i heterozygotycznych mutacji w genie AAAS, które powodują powstanie uszkodzonego, skróconego białka, prowadzące do utraty jego funkcji. Leczenie tego zespołu polega na substytucji hormonalnej niewydolności kory nadnerczy, leczeniu operacyjnym achalazji, leczeniu objawów ocznych. 46 Genetyka człowieka P40. Ustalenie molekularnego podłoża zespołu Alagille’a w populacji polskiej. Dorota Jurkiewicz (1), E. Popowska (1), C. Gloser (2), D. Piekutowska-Abramczuk (1), E. Ciara (1), M. Borucka-Mankiewicz (1), P. Kowalski (1), M. Gajdulewicz (1), K. Chrzanowska (1), K. Spodar (1), I. Hansmann (2), M. Krajewska-Walasek (1) (1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa (2) Institut fur Humangenetik und Medizinische Biologie, MLU Halle-Wittenberg, Halle Zespół Alagille’a (AGS, MIM 118450) jest wieloukładowym zespołem zaburzeń rozwojowych, charakteryzującym się występowaniem nieprawidłowości w budowie wątroby, serca, kręgosłupa, narządu wzroku oraz typowym wyglądem twarzy. AGS dziedziczy się w sposób autosomalny dominujący ze zmienną ekspresją objawów i występuje z częstością 1:70000 żywych urodzeń. Zespół Alagille’a wywołany jest mutacjami w genie JAG1, kodującym białko będące ligandem dla receptora Notch, biorącego udział w silnie konserwowanym mechanizmie przekazywania sygnału między komórkami. Celem badań było ustalenie molekularnego podłoża zespołu Alagille’a w populacji polskiej. Badaniami objęto grupę 31 pacjentów z klinicznie rozpoznanym zespołem Alagille’a. Zidentyfikowano 16 różnych mutacji, w tym 12 nie opisywanych dotychczas w literaturze. Wykryto 7 mutacji zmieniających ramkę odczytu, 5 mutacji typu stop kodon, 2 mutacje zaburzające wycinanie intronów i 4 mutacje powodujące zmianę informacji kodonów. Przewiduje się, że większość zidentyfikowanych mutacji prowadzi do syntezy skróconego białka JAG1. Stwierdzono, że czterdzieści procent mutacji występuje w egzonach 2 i 4, kodujących silnie konserwowane regiony białka JAG1. Pozostałe mutacje są rozproszone wzdłuż całej kodującej sekwencji genu. Badania wykazały, że w tylko w trzech z jedenastu przebadanych rodzin specyficzna mutacja została odziedziczona od rodziców, co wskazuje, że w większości przypadków mutacje powstają de novo. Badania były częściowo finansowane z Subsydium FNP nr 6/2000 i projektu KBN nr 3 PO5E12625. P41. Dziedziczna mutacja 657del5 w genie NBS1 w grupie pediatrycznych pacjentów z chłoniakami złośliwymi. Krystyna H. Chrzanowska (1), D. Piekutowska-Abramczuk (1), E. Popowska (1), A. Balcerska (3), W. Balwierz (4), J. Bodalski (5), H. Bubała (6), A. Chybicka (2), A. Gadomski (7), M. Gajdulewicz (1), A. Gaworczyk (8), M. Gładkowska-Dura (9), B. Kazanowska (2), M. Korzon (11), J. Kowalczyk (8), M. Krajewska-Walasek (1), M. Krawczuk-Rybak (12), M. Kuźmicz (12), T. Luszawska-Kutrzeba (4), L. Maciejka-Kapuścińska (3), J. Małdyk (13), M. Matysiak (7), D. Perek (14), R. Rokicka-Milewska (7), D. Sońta-Jakimczyk (6), K. Spodar (1), M. Stolarska (5), K. Stefańska (10), M. Syczewska (15), T. Szczepański (6), K. Sznurkowska (11), J. Wachowiak (10), A. Wakulińska (14), M. Wieczorek (16), E. Wyrobek (4), B. Zapolska (12) (1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Pomnik-Centrum Zdrowia Dziecka, Warszawa (2) Katedra i Klinika Onkologii i Hematologii Dziecięcej, AM, Wrocław (3) Klinika Pediatrii, Hematologii, Onkologii i Endokrynologii, AM, Gdańsk (4) Klinika Onkologii i Hematologii Dziecięcej, PA Instytut Pediatrii, CM UJ, Kraków (5) Klinika Chorób Dzieci, UM, Łódź (6) Katedra i Klinika Hematologii i Chemioterapii, ŚLAM, Zabrze (7) Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii, AM, Warszawa (8) Klinika Hematologii i Onkologii Dziecięcej, AM, Lublin (9) Zakład Patologii, IP-CZD, Warszawa (10) Klinika Hematologii i Onkologii Dziecięcej, AM, Poznań (11) Klinika Pediatrii, Gastroenterologii, i Onkologii, AM, Gdańsk (12) Klinika Onkologii Dziecięcej, SPDSK, AM, Białystok (13) Zakład Patomorfologii, AM, Warszawa (14) Klinika Onkologii Dziecięcej, IP-CZD, Warszawa (15) Klinika Rehabilitacji Pediatrycznej, IP-CZD, Warszawa (16) Oddział Hematologii i Onkologii, ChCPiR, Chorzów Wstęp: Zespół Nijmegen (Nijmegen breakage syndrome; NBS) jest rzadkim schorzeniem, którego podłożem są dziedziczne mutacje w genie NBS1. Produkt białkowy tego genu, nibryna, wchodzi w skład kompleksu N/M/R uczestniczącego w naprawie dwuniciowych uszkodzeń DNA. W Polsce przyczyną wszystkich znanych zachorowań jest homozygotyczna mutacja 657del5. Ponad 50% chorych z NBS zapada w młodym wieku na nowotwory, w szczególności na nieziarnicze chłoniaki złośliwe (NHL) i ostre białaczki limfoblastyczne (ALL). Cel badań: Celem badań było określenie częstości występowania mutacji genu NBS1 (657del5) w grupie pediatrycznych 47 Genetyka człowieka pacjentów z NHL i ALL w Polsce. Materiał i metody: Analizie poddano materiał uzyskany od 456 pacjentów z 12 ośrodków zintegrowanych w Polskiej Pediatrycznej Grupie ds. Leczenia Białaczek i Chłoniaków Złośliwych. Genetyczne badania molekularne przeprowadzono techniką PCR-SSCP. Źródłem genomowego DNA była sucha kropla krwi pobranej na bibułę. Wyniki: W badanej grupie 456 chorych wykryto 5 heterozygotycznych nosicieli mutacji 657del5 (liczba oczekiwana 2,5), odpowiednio u 2/208 pacjentów z NHL i u 3/248 pacjentów z ALL. Przeprowadzone badania umożliwiły także rozpoznanie 6 nowych przypadków zespołu Nijmegen. Wnioski: Mutacja 657del5 występowała w badanej grupie około dwukrotnie częściej (1,1%) niż w populacji ogólnej (0,56%). Wyjaśnienie potencjalnej roli zmutowanego genu NBS1 w patogenezie rozrostów z układu chłonnego u dzieci młodzieży wymaga dalszych badań. Zidentyfikowanie 6 nowych chorych z NBS potwierdza wcześniejsze obserwacje wskazujące, że nadal w znacznym odsetku przypadków rozpoznanie tego zespołu ustalane jest dopiero po wystąpieniu nowotworu. Pracę wykonano w ramach projektów finansowanych przez Komitet Badań Naukowych (nr 3P05A16622 oraz częściowo PBZ-KBN-090/P05/17). P42. Analiza aberracji chromosomowych, częstości wymian chromatyd siostrzanych (SCE) oraz częstości występowania mikrojąder w hodowli limfocytów od osób z boreliozą. Wanda Bratkowska (2), Henryk Stróżyński (1), Dobrosława Łopaczyńska (2), Anna Mordalska (2), Daniela Dworniak (1), Jolanta Stróżyńska (2), Juliusz Kamerys (2), Tomasz Ferenc (2) (1) Katedra i Klinika Chorób Zakaźnych Uniwersytetu Medycznego w Łodzi (2) Zakład Biologii i Genetyki Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Borelioza jest chorobą odzwierzęcą wywołaną przez krętek Borrelia burgdorferi, która rozprzestrzenia się za pośrednictwem kleszczy. Hamowanie odpowiedzi komórkowej i udział limfocytów T w zjawiskach immunologicznych może mieć znaczącą rolę w patogenezie tej choroby, jej ciężkiego i przewlekłego przebiegu. Jak do tej pory, nie wykonywano badań cytogenetycznych i oceny ewentualnego działania genotoksycznego metabolitów w przebiegu zakażenia boreliozą. Materiał i metody: W pracy analizowano częstość aberracji chromosomowych i wymian chromatyd siostrzanych (SCE) w metafazach uzyskanych z hodowli limfocytów krwi obwodowej od 11 osób z boreliozą (3 osoby z ostrą i 8 osób z przewlekłą postacią boreliozy). Test mikrojądrowy z zastosowaniem cytochalazyny B w stężeniu 4,5 mg / ml przeprowadzono w 72-godzinnej hodowli limfocytów krwi obwodowej. Od każdej osoby analizowano 1000 komórek i oceniano częstość występowania komórek dwujądrowych i częstość występowania mikrojąder w tych komórkach. Wyniki: Średni odsetek komórek z aberracjami wynosił 2,39%. Średnia liczba SCE przypadająca na jedną komórkę wynosiła 6,25. Średnie wartości odsetka komórek z aberracjami i średnie wartości SCE nie różniły się istotnie w porównaniu z kontrolą.Wyniki testu mikrojądrowego dla osób z boreliozą nie różniły istotnie w porównaniu z kontrolą. Wstępne wyniki badań nie wykazały działania genotoksycznego metabolitów w przebiegu zakażenia boreliozą. P43. Poziom MMP-1 oraz polimorfizmy regionu promotorowego genu MMP-1 w cukrzycy typu 2 współistniejącej z chorobą naczyniowo-sercową. Karolina Przybyłowska (1), Ireneusz Majsterek (1), Agnieszka Sikora (1), Jacek Kasznicki (2), Józef Drzewoski (2), Janusz Błasiak (1) (1) Katedra Genetyki Molekularnej, Uniwersytet Łódzki, Łódź (2) Zakład Farmakologii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny, Łódź Jednym z głównych powikłań towarzyszących cukrzycy jest choroba naczyniowo-sercowa, która związana jest z aktywnością metaloproteaz macierzowych (MMP) sprzyjających rozwojowi miażdżycy. Celem pracy było określenie związku między poziomem MMP-1 w krwi pacjentów z cukrzycą typu 2 (DM2) i rozwojem CHD, a także określenie wpływu polimorfizmów regionu promotorowego genu MMP-1 na poziom MMP-1 i występowanie CHD. Analizowano dwa polimorfizmy 1G/2G i A/G z wykorzystaniem metody RFLP przy użyciu enzymów restrykcyjnych odpowiednio XmnI i KpnI. Do oceny poziomu MMP-1 wykorzystano test ELISA. Określono genotyp 115 pacjentów z DM2, wśród których 66 miało CHD oraz 150 osób bez DM2 stanowiących grupę kontrolną. Wykazano znacząco wyższy poziom MMP-1 w krwi pacjentów z DM2 w porównaniu z poziomem u osób z prawidłową przemianą glukozy. Wysoki poziom 48 Genetyka człowieka MMP-1 dodatnio korelował z wysoką częstością allelu G polimorfizmu A/G u cukrzyków z CHD w porównaniu z grupą kontrolną (OR 1.64; 95% PU (1.01; 2,65)). Wyniki badań wskazują, że DM2 jest związana z podwyższonym poziomem MMP-1 w krwi, a allel G polimorfizmu A/G może wpływać na występowanie cukrzycy typu 2 współistniejącej z CHD.� Praca finansowana z badań własnych: grant Uniwersytetu Łódzkiego nr 505/450 (KP, IM, JB) oraz z grantu Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr 503-123-2 (JK, JD). P44. Familial acrocentric pericentromeric cryptic translocation 14;22 ascertained by miscarriages. Alina Teresa Midro (1), S. Langer (2, 3), B. Panasiuk (1), R. Leśniewicz (1), M. Speicher (2, 3) (1) Department of Clinical Genetics, Medical University, Białystok, Poland (2) Institut für Humangenetik, Technische Universität München, München, Germany (3) Institut für Humangenetik, GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, Neuherberg, Germany We describe a family in which several family members had recurrent miscarriages. Routine GTG and RBG banding chromosomes in one family member revealed the presence of a de novo supernumerary marker chromosome (SMC). To characterize this marker we used AcroM-FISH [Langer et al (2001) Hum Genet 109:152-158]. As most marker chromosomes are derived from acrocentric chromosomes, AcroM-FISH uses a special probe mix consisting of painting probes for all acrocentric chromosomes, centromere probes for chromosomes 13/21, 14/22, 22, 15, and a probe specific for rDNA, each labeled with a specific combination of fluorochromes. The SMC was stained with the centromere probe for chromosomes 13/21. There was no signal for the rDNA probe or for a painting probe and we described the marker as der(13or21)(pter®q10)(D13/21Z1+). However, we found in addition a rearranged chromosome 14, where the centromeric region was found to be derived from chromosome 22. Acrocentric pericentromeric abnormalities were recently found in high frequencies in couples with three or more miscarriages [Cockwell et al. (2003) Hum Genet 112: 298-302]. These abnormalities may be the underlying cause of recurrent miscarriages as they may result in abnormal pairing configurations at meiosis. Therefore, we analyzed the patient’s mother who also had a history of recurrent miscarriages. Using AcroM-FISH, we found the same t(14;22). Currently, we are analyzing other family members, including the grandmother and siblings who have no history of recurrent miscarriages. If the t(14;22) segregates together with the history of miscarriages, it could represent a further indication that cryptic acrocentric pericentromeric abnormalities may represent a cause for miscarriages. AcroM-FISH appears to be an efficient approach to identify such chromosomal changes and may be included in the work-up of couples after miscarriages. P45. Fenotyp niedosłuchu u pacjentów heterozygot złożonych dla mutacji w genie GJB2. Jarosław Waligóra (1), Agata Skórka (1), Agnieszka Pollak (2), Małgorzata Mueller-Malesińska (2), Rafał Płoski (3), Lech Korniszewski (1), Henryk Skarżyński (2) (1) Klinika Diabetologii, Patologii Noworodka i Wad Wrodzonych Akademii Medycznej w Warszawie (2) Instytut Fizjologii i Patologii Słuchu w Warszawie (3) Katedra i Zakład Medycyny Sądowej Akademii Medycznej w Warszawie Niedosłuch genetycznie uwarunkowany stanowi ok. 60% wszystkich przypadków niedosłuchu. Spośród genów których mutacje powodują niedosłuch izolowany największe kliniczne znaczenie ma gen GJB2 kodujący koneksynę 26. Mutacje w tym genie są odpowiedzialne w zależności od stopnia niedosłuchu za ok. 30 do 60% przypadków niedosłuchu izolowanego. Najczęstszą mutacją powodującą niedosłuch w populacjach europejskich jest mutacja 35delG. Na podstawie wcześniejszych badań ustalono że mutacja 314del14 jest drugą co do częstości mutacją genu GJB2 u osób niesłyszących w populacji polskiej. Do wykrywania między innymi tej mutacji użyto metody polegającej na równoczesnej amplifikacji części 12-72 oraz 306-464 regionu kodującego genu GJB2 przy użyciu znakowanych starterów. Uzyskane produkty są następnie analizowane pod względem długości przy użyciu aparatu ABI 377. Mutacja 314del14 została stwierdzona w 24 przypadkach pacjentów z niedosłuchem będących heterozygotami pod względem mutacji 35delG. U jednego pacjenta mutacja 314del14 wystąpiła w postaci homozygotycznej. Według naszej wiedzy jest to dotychczas pierwszy pacjent opisany pacjent z takim genotypem. Zostały przeanalizowane badania audiologicznej pacjentów heterozygot złożonych 314del14/35delG pod kątem nasilenia niedosłuchu, momentu wystąpienia niedosłuchu. U większości pacjentów niedosłuch był głębokiego i ciężkiego stopnia. W pracy porównano fenetyp niedosłuchu pacjentów heterozygot złożonych 314del14/35delG do homozygot 35delG w genie GJB2 oraz innych heterozygot złożonych. 49 Genetyka człowieka P46. Problemy diagnostyczne w cytogenetycznych badaniach prenatalnych. Joanna Bogdanowicz, A. Ilnicka, B. Pawłowska, A. Tomankiewicz-Zawadzka, J. Czyżewska, J. Purzycka, B. Sobiczewska, J. Zaremba Zakład Genetyki, Instytut Psychiatrii i Neurologii Al. Sobieskiego 9, 02-957 Warszawa Przedstawiamy 5 przypadków cytogenetycznych badań prenatalnych, w których do diagnozy aberracji chromosomowych konieczne było zastosowanie metody FISH z wykorzystaniem sond malujących i subtelomerowych. W pierwszym przypadku metodą prążkową stwierdzono obecność dodatkowego fragmentu na górnych ramionach chromosomu 13. Po zastosowaniu techniki FISH z sondami malującymi okazało się, że pochodzi on z chromosomu 21. Aberracja ta jest pochodzenia ojcowskiego. Stosując sondę 21q22 wykluczono trisomię regionu odpowiedzialnego za zespół Downa. W tym przypadku mimo zastosowania FISH nie udało się ustalić, czy kariotyp płodu był zrównoważony, a także czy ojciec posiadał zrównoważoną translokację. W drugim przypadku stwierdzono translokację 6;12 de novo. Po zastosowaniu sond subtelomerowych okazało się, że punkt pęknięcia na chromosomie 6 znajdował się dystalnie w stosunku do użytej sondy. Nie wiadomo więc, czy kariotyp był zrównoważony. W trzecim przypadku zastosowanie sond subtelomerowych było konieczne do ustalenia, czy stwierdzana u płodu pochodzenia ojcowskiego translokacja 1;17 była zrównoważona. Punkt pęknięcia na chromosomie 17 znajdował się blisko regionu subtelomerowego. W czwartym przypadku badaniem prążkowym stwierdzono u płodu addycję na dolnych ramionach chromosomu 7. Była ona jednak na tyle mała, że do ustalenia pochodzenia tego fragmentu konieczne było zastosowanie FISH. Okazało się, że u płodu obecna jest niezrównoważona translokacja 4;7 pochodzenia matczynego. W piątym przypadku sondy subtelomerowe zastosowano do diagnozy u płodu niezrównoważonej translokacji pochodzenia matczynego. Obecnie technika FISH jest coraz częściej wykorzystywana w prenatalnej diagnostyce cytogenetycznej. Okazuje się jednak, że zastosowanie komercyjnie dostępnych sond molekularnych nie wystarcza do identyfikacji niektórych mikroaberracji chromosomowych. P47. Diagnostyka genetyczna Toxoplasma gondii. Adam Master (1) Karolina Świtaj (2), Magdalena Skrzypczak (1), Piotr Zaborowski (2), Andrzej Płucienniczak (1) (1) Instytut Badań DNA (2) Klinika Chorób Odzwierzęcych i Tropikalnych Instytutu Chorób Zakaźnych i Pasożytniczych Akademii Medycznej w Warszawie Toksoplazmoza jest chorobą wywoływaną przez pierwotniaka Toxoplasma gondii, bezwzględnego pasożyta wewnątrzkomórkowego powszechnie zarażającego wiele ssaków w tym ludzi. W Polsce zarażeni stanowią ponad 59% populacji, a każdego roku odnotowuje się 200-400 przypadków toksoplazmozy wrodzonej. Ustalenie właściwego rozpoznania choroby utrudnia jej skąpo– lub bezobjawowy przebieg i wymaga wykonania wielu badań diagnostycznych, które mają znaczące ograniczenia. Jak dotąd nie ma wystandaryzowanej procedury szybkiego i pewnego wykrywania zarażeń Toxoplasma gondii. Autorzy niniejszego doniesienia prezentują metodę genetycznej diagnostyki zarażeń poprzez wykrywanie i analizę DNA pasożyta izolowanego bezpośrednio z krwi pacjenta. W badaniach zastosowano techniką PCR w połączeniu z elektroforezą kapilarną i laserową detekcją fluorescencji. Identyfikacja pasożyta oparta jest na wykrywaniu sekwencji wielokopijnych genów B1 (35 kopii/genom) oraz 529 bp (200-300 kopii/genom), wysoce specyficznych dla Toxoplasma gondii. Szczegółowa charakterystyka pasożyta bazuje na analizie genetycznej fragmentów genu GRA6, HSP70 oraz wybranych sekwencji STR, wykazujących polimorfizm determinujący przynależność do określonego szczepu. Metodę przetestowano na próbkach kontrolnych: zawiesiny płynu otrzewnowego pobranego od myszy zarażonych szczepem RH Toxoplasma gondii (kontrola pozytywna) oraz wymazu z jamy ustnej niemowlęcia, u którego matki nie stwierdzono obecności przeciwciał przeciwko pasożytowi (kontrola negatywna). W kontroli pozytywnej wykryto produkty specyficzne dla sekwencji B1 oraz 529 bp o oczekiwanej długości, natomiast analiza produktów PCR ze starterami specyficznymi dla GRA6 i HSP70 wykazała obecność fragmentów o długości charakterystycznej dla szczepu RH. W próbce kontroli negatywnej nie wykryto żadnych produktów PCR. Wstępne badania próbek pełnej krwi obwodowej pacjentów, u których toksoplazmozę podejrzewano lub stwierdzono w oparciu o testy immunologiczne wykazały obecność DNA pasożyta. Uzyskane wyniki świadczą o przydatności metody do wczesnej, szybkiej, swoistej, czułej i jednoznacznej diagnostyki zarażeń wywoływanych przez Toxoplasma gondii i jej potencjalnym szerokim zastosowaniu w medycynie i weterynarii nie tylko w zwalczaniu, ale i badaniach przesiewowych. 50 Genetyka człowieka P48. Mutacje w genie AIRE wśród polskich pacjentów z zespołem poliendokrynopatii typu 1 (APS1, APECED). Rafał Płoski (1), L. Korniszewski (2), B. Stolarski (1), E. Rowińska (3) , M. Gremida (3) i E. Pronicka (3) (1) Pracownia Genetyki Molekularnej Człowieka Zakładu Medycyny Sądowej i Klinki Diabetologii i Wad Wrodzonych Akademii Medycznej w Warszawie (2) Klinika Diabetologii, Patologii Noworodka i Wad Wrodzonych Akademii Medycznej w Warszawie (3) Odział Chorób Metabolicznych Kliniki Pediatrii Instytut „Pomnik– Centrum Zdrowia Dziecka” APS1 (APECED) jest rzadkim genetycznie uwarunkowanym zespołem zaburzeń układu odpornościowego (dziedziczony w sposób autosomalny recesywny). Do typowych objawów schorzenia należą uporczywa grzybica, autoimmunologicznie uwarunkowana niewydolność przytarczyc oraz choroba Addisona. Ostatnio wykazano, że APECED jest spowodowany mutacjami w genie AIRE, którego produkt warunkuje ektopową ekspresję antygenów obwodowych w grasicy, co jest istotne dla rozwoju tolerancji immunologicznej. Celem pracy była oparta na bezpośrednim sekwencjonowaniu regionu kodującego analiza mutacji w genie AIRE wśród polskich pacjentów (N=14), u których rozpoznano APECED w oparciu o standardowe kryteria (obecność dwóch spośród ww. typowych zaburzeń). Stwierdzone mutacje pokazano w tabeli poniżej (numeracja zgodna z sekwencją cDNA bazy ENSEMBL – www.ensembl. org). Mutacje [R257>X] + [R257>X] [R257>X] + [M1>L] [R257>X] + [1058delT] [R257>X] + [IVS1+5Gdel] [R257>X] + [S278>R] [1094-1104del13] + [?] [R303>P] + [?] Liczba pacjentów 7 1 1 1 2 1 1 Uwagi mutacja częsta w innych populacjach nowa mutacja nowa mutacja prawdopodobnie zaburza splicing frameshift mutacja częsta w innych populacjach nowa mutacja Przedstawione wyniki wskazują, że w Polsce dominuje częsta w innych populacjach mutacja R257X (68% alleli). Interesujące jest także występowanie w naszej populacji 3 nieopisanych wcześniej mutacji. Obecność tylko jednej patogennej (1094-1104del13) lub potencjalnie patogennej (R303>P) mutacji u 2 pacjentów sugeruje możliwość występowania mutacji w AIRE także poza regionem kodującym. P49. Rodzinna zbalansowana translokacja t(13;14). Rafał Dmowski, Jerzy R. Kowalczyk, Anna Gaworczyk, Bariusz Babicz, Monika Lejman Pracownia Cytogenetyczna Dziecięcego Szpitala Klinicznego w Lublinie, Klinika Hematologii i Onkologii Klinicznej, [email protected] Trisomia chromosomu 13 jest jedną z lepiej poznanych anomalii cytogenetycznych. Częstość jej występowania u noworodków wg różnych autorów zawiera się w przedziale pomiędzy 1:4000 a 1:12000. Narodziny dziecka z trisomią chromosomu 13 są dużym obciążeniem dla rodziców – dzieci te rodzą się z deformacjami ciała, wadami narządów wewnętrznych oraz upośledzeniem umysłowym. Do najczęstszych anomalii fenotypowych w tym zespole należą: wady oczu, nisko osadzone i zdeformowane małżowiny uszne, rozszczep warg i podniebienia, polidaktylia, rzadziej: wąskie paznokcie, przepuklina pępkowa, niedorozwój moszny i wnętrostwo u chłopców. Z wad narządów wewnętrznych do najczęstszych należą: wady serca, dodatkowa śledziona, anomalie układu moczowo-płciowego oraz dwurożna macica u dziewczynek. Długość życia jest krótka – blisko 15% dzieci umiera w okresie pierwszego miesiąca życia a 90% w ciągu pierwszego półrocza. W 80% przypadków trisomia charakteryzuje się obecnością dodatkowego wolnego chromosomu 13, a w 20% obecny jest mozaicyzm lub trisomia związana z translokacją zbalansowaną. Najczęściej jest to translokacja Roberts’onowska t(13;grupa D) i może występować de novo lub być przekazywana przez jednego z rodziców. W pracy przedstawiamy opis rodziny trójpokoleniowej z aberracjami chromosomowymi stwierdzanymi w badaniu cytogenetycznym metodą prążków G: 51 Genetyka człowieka Pokolenie 1: 1. Pacjent 1 – płci męskiej, kariotyp: 45, XY, t(13;14) – zdrowy Pokolenie 2: 2. Pacjentka 2 – płci żeńskiej, córka pacjenta 1, kariotyp: 45, XX, t(13;14) – zdrowa 3. Pacjentka 3 – płci żeńskiej, córka pacjenta 1, kariotyp: 45, XX, t(13;14) – zdrowa Pokolenie 3: 4. Pacjent 4 – płci żeńskiej, córka pacjentki 2, kariotyp: 46, XX – zdrowa 5. Pacjent 5 – płci męskiej, syn pacjentki 2, kariotyp: 45, XY, +13, t(13;14) (q10;q10)/47, XY, +13 – fenotypowe cechy trisomii 13 – dziecko zmarło. 6. Pacjent 6 – płci męskiej, syn pacjentki 3, kariotyp: 46, XY – zdrowy Fenotypowe cechy charakterystyczne dla zespołu trisomii 13 obserwowane są również u pacjentów z innymi aberacjami chromomowymi niż czysta trisomia 13, a nosicielstwo translokacji t(13;14) nie wyklucza możliwości urodzenia dziecka z prawidłowym kariotypem. P50. Oszacowanie wielkości prawdopodobieństwa urodzenia dziecka z niezrównoważonym kariotypem u nosicieli translokacji chromosomowych wzajemnych z udziałem krótkiego ramienia chromosomu 4. Barbara Panasiuk (1), A. Spółczyńska (2), A. Sawicka (1), A. T. Midro (1) (1) Zakład Genetyki Klinicznej AM, Białystok (2) Studenckie Koło Naukowe przy Zakładzie Genetyki Klinicznej AM, Białystok Gromadzenie danych empirycznych z rodowodów nosicieli translokacji chromosomowych wzajemnych (TCW) ma na celu uzyskanie informacji do oszacowania indywidualnego ryzyka genetycznego (urodzenia dziecka z niezrównoważonym kariotypem prowadzącym do wad wrodzonych, ryzyko ciąż obumarłych/ wczesnych zgonów noworodków i ryzyko poronień samoistnych). Celem pracy jest określenie ryzyka u nosicieli translokacji chromosomowych wzajemnych z udziałem krótkiego ramienia. W grupie 150 ciąż z 47 rodzin należących do 25 rodowodów nosicieli TCW, wyselekcjonowanych ze 139 TCW określono wskaźniki ryzyka genetycznego po segregacji 2:2 rozdziale przyległym typu 1 metodą wg Stengel-Rutkowski i wsp. z uwzględnieniem korekty oszacowania wg Stene. Stwierdzono mniejsze wartości prawdopodobieństwa urodzenia dziecka z niezrównoważonym kariotypem u żeńskich nosicieli (3,2±3,3%, 1/ 31) niż u męskich (19,6±5,8%, 11/ 89). Uzyskano większe wartości ryzyka urodzenia dziecka z niezrównoważonym kariotypem (33,3±15,7%, 3/ 9) w przypadku segmentu krótszego: 4p15→pter, natomiast mniejsze (4,8±4,6%, 2/ 21) dla segmentu dłuższego 4p11→pter. Ryzyko poronień samoistnych było mniejsze (<5,4%, 0/ 9) dla segmentu krótszego: 4p15→pter natomiast większe (9,4±6,4%, 2/ 21) dla segmentu dłuższego: 4p11→pter. Stwierdzono mniejsze prawdopodobieństwo (11,1±10,5%, 1/ 9) martwych urodzeń wczesnych zgonów noworodków w przypadku krótszego segmentu: 4p15→pter, większe (42,8±10,8%, 9/ 21) dla segmentu dłuższego 4p11→pter. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że ryzyko zależy od czasu trwania ciąży, płci nosiciela i wielkości segmentu chromosomowego. Uzyskane wskaźniki zastosowano do określenia indywidualnego ryzyka genetycznego u nosicieli TCW z udziałem krótkiego ramienia chromosomu 4. P51. Frequency of occurrence of 3849+10kb C>T mutation in Polish CF patients is significantly higher than in most of other populations. Kamila Czerska, A. Sobczyńska-Tomaszewska, J. Bal Instytut Matki i Dziecka, ul. Kasprzaka 17A, 01-211 Warszawa, Polskie Towarzystwo Genetyki Człowieka The 3849+10kb C>T mutation belongs to the group of splicing CFTR gene defects. It creates a partially active splice site in intron 19 that can lead to the insertion of a new 84-bp cryptic exon containing an in-frame stop codon. This mutation has been found to be associated with a milder form of disease manifestation. Patients carrying this mutation in one allele are characterised by: better nutritional status, older age of onset, normal or slightly elevated chloride values (in comparison to homozygotes for delF508 mutation). Till now there have been 30 CF patients genotyped in our laboratory who have 3849+10kb C>T mutation in at least one allele of CFTR gene. There are 26 patients in this group with genotype: 3849+10kb C>T / delF508. There are also two patients who are homozygotes for 3849+10kb C>T mutation, whose clinical data are being currently collected. They are members of two unrelated families. This genotype is very rare in Poland and in the world. In case of the other patients second mutation has been also identified. 52 Genetyka człowieka 5 patients are carriers of this mutation in one allele and any other mutation in second allele has not been found. Mutation 3849+10kb C>T is found in Polish population with frequency of 3,9% of CF alleles which places this mutation at second position after delF508 (53%). In comparison to the frequency in world population (0,2%) it`s significantly higher score. That is why the identification of this mutation is a part of the routine diagnostics provided by our laboratory. P52. Częstość występowania heterozygotycznych nosicieli mutacji 657del(5) w genie NBS1 w populacji województwa wielkopolskiego. Maria Mosor, Iwona Ziółkowska, Jerzy Nowak Instytut Genetyki Człowieka, Polskiej Akademii Nauk, Strzeszyńska 32, Poznań Homozygoty germinalnej mutacji 657del5 w genie NBS1 rozwijają zespół Nijmegen. Do podstawowych objawów klinicznych zespołu zalicza się małogłowie, zaburzenia wzrostu, niedobór odporności. Zespołowi temu towarzyszy zwiększona predyspozycja do rozwoju nowotworów złośliwych w młodym wieku. Również u heterozygotycznych nosicieli mutacji 657del5 występuje zwiększone ryzyko rozwoju nowotworu. Celem naszych badań było określenie częstości występowania heterozygotycznych nosicieli mutacji 657del5 w genie NBS1 w populacji województwa Wielkopolskiego. Materiałem do badań były próbki DNA wyizolowane z anonimowych, niewykorzystanych bibuł Guthriego. Przeanalizowano 2090 bibuł z całego województwa poprzez zastosownaie analizy fragmentów DNA na automatycznym sekwenatorze ALFExpress. W związku z tak dużą liczbą próbek, zaprojektowano 2 startery reverse dające produkty różniące się wielkością 50 pz. Umożliwiło to równoległą analizę podwojonej liczby prób. Próbki ze zmienionym wzorem zostały zsekwencjonowane. W grupie tej zidentyfikowano 14 nosicieli mutacji 657del5, co daje częstość 1/149. Jest to częstość wyższa aniżeli ustalona wcześniej (1/190) dla populacji zamieszkującej inne obszary Polski. Zaobserwowano również terytorialne zróżnicowanie częstości nosicieli. W 464 próbach z obszarów wschodnich województwa znaleziono 6 heterozygot mutacji 657del5 (1/77). W powiatach południowych nie zidentyfikowano żadnego nosiciela wśród 625 badanych próbek. Uzyskane wyniki wskazują na stosunkowo częste występowanie (1/149) heterozygot mutacji 657del5 w województwie Wielkopolskim, co może być czynnikiem zwiększonego ryzyka rozwoju chorób nowotworowych w tym obszarze. P53. Mutacje i polimorfizmy w genie glukokinazy u ciężarnych z cukrzycą typu MODY. Magdalena Żurawek (1), E. Wender-Ożegowska (2), D. Januszkiewicz- Lewandowska (1, 3), A. Zawiejska (2), J. Nowak (1) (1) Instytut Genetyki Człowieka PAN (2) Klinika Położnictwa i Chorób Kobiecych AM (3) Klinika Onkologii, Hematologii i Transplantologii Pediatrycznej AM Poznań MODY (Maturity–Onset Diabetes of the Young) to klinicznie i genetycznie zróżnicowana postać cukrzycy typu II o autosomalnie dominującym sposobie dziedziczenia charakteryzująca się rozwojem przed 25 rokiem życia oraz możliwością wyrównania glikemii bez użycia insuliny przez okres dłuższy niż dwa lata. Wyróżnia się 6 typów MODY o różnej lokalizacji defektu genetycznego. Najczęściej spotykana jest postać MODY 2, zwłaszcza u kobiet z cukrzycą ciążową i dzieci z łagodną hiperglikemią. Związana jest z mutacjami w genie kodującym glukokinazę (GCK) – enzym szlaku glikolitycznego. Celem badań było określenie częstości mutacji i polimorfizmów w genie GCK w grupie ciężarnych z cukrzycą ciążową, spełniających następujące kryteria: wiek poniżej 35 roku życia, indeks masy ciała poniżej 25, niewielki wzrost glikemii w dwugodzinnym teście obciążenia glukozą (poniżej 3 mmol/l), występowanie cukrzycy u krewnych pierwszego stopnia lub cukrzycy ciążowej w rodzinie. Do wykrywania zmian w genie GCK wykorzystano analizę polimorfizmu konformacji jednoniciowego DNA oraz sekwencjonowanie metodą dideoksy. W grupie 130 pacjentek u 10 (~8%) wykryto trzy nie opisane wcześniej zmiany w regionach kodujących genu GCK: Y215Y, E312Q, GfsinsG, jedną znaną mutację S383L oraz trzy zmiany w sekwencjach intronowych: IVS2-12C>T, IVS3-8G>A, IVS713A>G. Na podstawie uzyskanych wyników należy stwierdzić, że mutacje w genie GCK stosunkowo rzadko występującą u ciężarnych z cukrzycą typu MODY. 53 Genetyka człowieka P54. Mutacje w genach DNAI1 i DNAH5 u polskich chorych z pierwotną dyskinezą rzęsek i/lub zespołem Kartagenera. Maciej Geremek, E. Ziętkiewicz, E. Rutkiewicz, J. Borowski, K. Modrzyńska, J. Pilc, U. Skrzypczak, K. Więckiewicz i M. Witt Zespół Genetyki Molekularnej i Klinicznej, Instytut Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu Pierwotna dyskineza rzęsek (primary ciliary dyskinesia, PCD) jest chorobą, u której podstaw leżą zaburzenia struktury i funkcji aparatu rzęskowego. W około połowie przypadków dodatkowym objawem jest całkowite przełożenie trzewi (wtedy – zespół Kartagenera, KS). PCD/KS cechuje duża heterogenność genetyczna; dziedziczenie w większości autosomalne recesywne. Dwa geny, których rola w patogenezie choroby została potwierdzona, to geny dynein, DNAI1 (9p13-21) oraz DNAH5 (5p15.2). Kodują one łańcuchy dyneiny aksonemalnej (odpowiednio, średni typu 1 i ciężki typu 5) wchodzące w skład ramion dyneinowych, ważnego elementu ultrastruktury rzęsek. W ramach niniejszej pracy poszukiwano mutacji (SSCP, sekwencjonowanie) w tych genach u ponad 80 pacjentów z polskich rodzin z PCD/KS. Przebadano 15 spośród 20 eksonów genu DNAI1; u jednego pacjenta potwierdzono obecność najczęściej opisywanej w literaturze mutacji tego genu, w intronie 1 (w połączeniu z inną, niescharakteryzowaną jeszcze mutacją w eksonie 1); u innego pacjenta wykryto homozygotyczną substytucję w eksonie 17; potwierdzono też dwa opisane wcześniej częste polimorfizmy w eksonach 1 i 11. W genie DNAH5 przebadano 9 spośród 79 eksonów, w których w literaturze opisano mutacje u chorych z PCD/KS. Stwierdzono obecność zarówno rzadkich wariantów (heterozygotyczny wzór migracji u pojedynczych pacjentów) jak i częstych polimorfizmów. Na 11 opisanych w literaturze mutacji, potwierdzono tylko jedną substytucję w eksonie 34, powodującą zmianę ramki odczytu i wprowadzającą przedwczesny kodon stop. Znaleziono dwie nowe mutacje powodujące przedwczesną terminację translacji (w eksonach 32 i 62) oraz dwie nowe substytucje (w eksonach 34 i 53). Spośród siedmiu substytucji nie zmieniających kodowanego białka, cztery są powszechnie występującymi polimorfizmami. Badania dodatkowych 7 eksonów są w toku. Uzyskane wyniki potwierdzają pogląd o heterogenności genetycznej PCD oraz wskazują na dużą heterogenność alleliczną zmian w genie DNAH5. Granty KBN 3P05E 01923 (MW), 3P05E 03824 (EZ). P55. Biometria nosa płodu w drugim trymestrze ciąży. Lech Dudarewicz Zakład Genetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi Cel pracy: Ustalenie optymalnych warunków oceny nosa płodu w drugim trymestrze ciąży oraz określenie zakresu prawidłowej zmienności badanych parametrów. Wstępna ocena przydatności biometrii nosa dla badań przesiewowych w kierunku aneuploidii płodu, przez porównanie płodów z liczbowymi aberracjami chromosomowymi z grupą płodów zdrowych. Materiał: Ultrasonograficzne pomiary długości kości nosowych oraz szerokości nosa u płodów zdrowych oraz płodów z liczbowymi aberracjami chromosomowymi. Wyniki: Określono wpływ wieku ciążowego oraz położenia płodu na badane parametry biometryczne oraz opisano zakres ich fizjologicznej zmienności. Stwierdzono skrócenie kości nosowych oraz poszerzenie nosa w grupie płodów z trisomią 21, lecz mała liczebność grupy badanej nie pozwala na wyciągnięcie statystycznie uzasadnionych wniosków. Wniosek: Biometria nosa płodu wydaje się być wartościowym markerem trisomii 21 w drugim trymestrze ciąży, wymagającym dalszych badań. Badania były finansowane w oparciu o grant KBN nr 3 PO5E 156 22. 54 Genetyka człowieka P56. Analiza wskazań do diagnostyki przedurodzeniowej w przypadkach zespołu Turnera. Grzegorz Nowicki (1), Wojciech Ałaszewski (1), Katarzyna Janiak (2), Maria Respondek-Liberska (2), Dariusz Borowski (3), Magdalena Kozłowska(1), Wanda Hawuła (1), Lucjusz Jakubowski (1) (1) Zakład Genetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki (2) Zakład Diagnostyki i Profilaktyki Wad Wrodzonych I CZMP (3) Zakład Ultrasonografii Ginekologiczno-Położniczej I CZMP� Analiza wyników badań cytogenetycznych wykonanych w ramach inwazyjnej diagnostyki przedurodzeniowej w materiale Zakładu Genetyki ICZMP, pozwoliła na wykazanie zadziwiająco często rozpoznawanego zespołu Turnera (ZT) w postaci monosomii 45,X, mozaikowej czy izochromosomu w stosunku do całkowitej liczby badań i innych typów aberracji chromosowowych. Wśród klasycznych wskazań do wykonania inwazyjnej diagnostyki przedurodzeniowej najczęstszym jest wiek pacjentki. Dynamiczny rozwój ultrasonografii położniczej sprawił, że coraz częściej i stosunkowo wcześnie rozpoznaje się zmiany rozwojowe płodu określane jako ultrasonograficzne markery genetyczne, sugerujące występowanie chorób uwarunkowanych genetycznie. Mogą one być wskazaniem do wykonania inwazyjnej diagnostyki prenatalnej. W prezentowanej pracy przeanalizowano wskazania do diagnostyki przedurodzeniowej, w wyniku której rozpoznano ZT. Analizowano badania płynu owodniowego lub krwi pępowinowej przeprowadzone w Zakładzie Genetyki I CZMP w latach 1992-2004. W okresie tym na wykonanych ogółem 2327 badań rozpoznano przedurodzeniowo 28 przypadków monosomii 45,X (w tym 2 rozpoznane po przeprowadzeniu kordocentezy), 3 przypadki kariotypu mozaikowego 45,X/46,XX oraz 2 przypadki kariotypu 46,X,i(X)(q10). U 24 ciężarnych (86% rozpoznanych przypadków) wskazaniem do diagnostyki przedurodzeniowej był nieprawidłowy obraz ultrasonograficzny płodu, a wiek ciężarnej jedynie w 4 przypadkach (14%).� Najczęściej powtarzającymi się zmianami w obrazie usg były: uogólniony obrzęk płodu, obrzęk w obrębie główki płodu, torbiel szyjna (hygroma colli). Do rzadziej występujących wad towarzyszących należy zaliczyć wady serca, wodobrzusze, płyn w klatce piersiowej, wodonercze. Wynik analizy wskazuje, że obraz usg płodu jest zasadniczym wskazaniem do wykonania inwazyjnej diagnostyki przedurodzeniowej w kierunku ZT. Droga ta pozwala również na postępowanie różnicujące w przypadkach obrzęku płodu pochodzenia immunologicznego czy infekcyjnego P57. Analiza sprzężeń wskazuje na obecność genu zespołu Kartagenera w chromosomie 15. Maciej Geremek (1), E. Ziętkiewicz (1), D. F. Wyszynski (3), M. Khoshnevisan (3), C. Sun (3), S. Wang (3), Y. J. Zhang (3), E. Rutkiewicz (1), J. Pawlik (4), A. Kapellerova (5), S. R. Diehl (3), Michał Witt (1, 2) (1) Zespół Genetyki Molekularnej i Klinicznej, Instytut Genetyki Człowiek PAN, Poznań (2) Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej, Warszawa (3) National Institute of Dental and Craniofacial Research, NIH, Bethesda, USA (4) Instytut Grużlicy i Chorób Płuc, Rabka (5) II Klinika Pediatrii Uniwersytetu w Bratysławie Pierwotna dyskineza rzęsek (ang. primary ciliary dyskinesia, PCD) jest chorobą dziedziczną, u której podstaw leżą zaburzenia struktury i funkcji aparatu rzęskowego. Na obraz kliniczny choroby składają się nawracające infekcje dróg oddechowych, zapalenie zatok, rozstrzenie oskrzeli i często bezpłodność męska. W około połowie przypadków dodatkowym objawem jest całkowite przełożenie trzewi (situs inversus) – tę formę choroby określa się jako zespól Kartagenera (ang. Kartagener syndrome, KS). PCD dziedziczy się w większości przypadków jako choroba autosomalna recesywna. Pierwotna dyskineza rzęsek jest choroba genetycznie heterogenną. Jak dotąd poznano dwa geny odpowiedzialne za pojawienie się choroby. Mutacje w tych genach nie wyjaśniają jednak większości przypadków. Grupa badana obejmująca 70 rodzin, została podzielona na rodziny z zespołem Kartagenera (51 rodzin, 168 genotypowanych członków, 61 chorych) i rodziny z PCD bez przełożenia trzewi (19 rodzin, 52 genotypowanych członków,22 chorych). Przy pomocy zestawu 462 markerów mikrosatelitarnych szukano markerów genomowych sprzężonych z chorobą. Maksymalny wynik LOD równy 3.16 uzyskano w rodzinach z zespołem Kartagenera, dla markera D15S205 zlokalizowanego w chromosomie 15. Badanie pogłębiono używając 65 mikrosatelit rozmieszczonych w ramieniu 55 Genetyka człowieka długim chromosomu 15.Uzyskany wynik LOD = 4.22 dla markera D15S154 oraz wstępna analiza wielopunktowego sprzężenia wskazały na obszar 4.8 cM miedzy markerami D15S1037 i D15S189 jako potencjalnie zawierający locus choroby. Ujemny wynik LOD (podwójny jak i wielopunktowy) w rodzinach bez odwrócenia trzewi wykluczył sprzężenie z chromosomem 15 w tej grupie. Trwa analiza genów znajdujących się w otoczeniu markera D15S154,w celu wyłonienia najbardziej prawdopodobnych kandydatur na geny związane z patogenezą zespołu Kartagenera. Grant KBN 3P05E 01923 (MW). P58. Bakteryjny model w badaniach ludzkich mutacji – badania in vivo na przykładzie polimorfizmu genu MTHFR. Joanna Jakóbkiewicz-Banecka (1), Anna Kloska (1), Magdalena Stepnowska (2), Bogdan Banecki (3), Alicja Węgrzyn (4), Grzegorz Węgrzyn (1) (1) Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański (2) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki, Akademia Medyczna w Gdańsku (3) Katedra Biologii Molekularnej i Komórkowej, Wydział Biotechnologii UG-AMG (4) Instytut Biochemii i Biofizyki, PAN, Gdańsk� Homocysteina jest intermediatem w szlaku biosyntezy takich aminokwasów jak metionina i cysteina. W metabolizm homocysteiny zaangażowane są trzy enzymy – reduktaza metylenotetrahydrofolianowa (MTHFR), syntaza metioninowa (MS) oraz beta-syntaza cystationiny (CBS). Deficyty w aktywności któregoś z enzymów szlaku mogą być przyczyną hiperhomocysteinemii, a ta jest jednym z czynników ryzyka chorób sercowo-naczyniowych, w tym udarów mózgu. Aktywność enzymów tego szlaku zależy od witamin z grupy B (B2, B6, B12, kwas foliowy), które pełnią rolę kofaktorów. Szereg doniesień wskazuje na znaczącą rolę witamin z grupy B w obniżaniu poziomu homocysteiny we krwi. W populacji ludzkiej zidentyfikowano dwa powszechne polimorfizmy genu MTHFR. Jeden z nich to polimorfizm C677T (Ala222Val) powiązany z temperaturowrażliwością reduktazy MTHFR oraz spadkiem aktywności enzymu nawet o 60%. Reduktaza metylenotetrahydrofolianowa z Escherichia coli (MetF) wykazuje wysoki stopień homologii względem ludzkiej reduktazy MTHFR, a mutacja C530T (Ala177Val) w bakteryjnym genie metF jest analogiczna do mutacji C677T ludzkiego genu MTHFR. Dlatego też skonstruowaliśmy bakteryjny system, który umożliwiałby zbadanie efektów fenotypowych tej mutacji oraz opracowanie potencjalnej terapii witaminowej chorych z hiperhomocysteinemią. W celu zbadania funkcji dwóch wariantów reduktazy skonstruowaliśmy szczep z delecją chromosomalnej kopii genu metF (szczep ten jest auksotrofem metioninowym) oraz serię plazmidów niosących gen metF „dzikiego” typu lub gen metF177 (z mutacją punktową C530T) pod kontrolą różnych promotorów (plac, ptet, para). Następnie skonstruowaliśmy szereg merozygotycznych szczepów E. coli, niosących różne kombinacje alleli genu metF na plazmidach. Szczepy te miały symulować różne sytuacje diploidalnej komórki człowieka niosącej dwa allele genu MTHFR. Wyniki przeprowadzonych doświadczeń in vivo potwierdziły, że wariant Ala177Val reduktazy MetF, charakteryzuje się znacznie obniżoną aktywnością oraz temperaturowrażliwością. Wykazaliśmy także, że suplementacja witaminami z grupy B wywiera znaczący wpływ na wzrost aktywności defektywnej reduktazy MetF oraz znosi temperaturowrażliwy fenotyp enzymu. Charakterystyka ludzkiego polimorfizmu C677T genu MTHFR przeprowadzona na modelu bakteryjnym wykazała istotną przydatność tego systemu w badaniu efektów fenotypowych mutacji w ludzkich genach. System ten dodatkowo pozwolił określić wpływ witamin z grupy B na znoszenie skutków fenotypowych badanej mutacji. P59. Analiza molekularna genów związanych z metabolizmem homocysteiny u chorych z niedokrwiennym udarem mózgu. Joanna Jakóbkiewicz-Banecka (1), Leszek Kadziński (1), Zyta Banecka-Majkutewicz (2), Wojciech Sawuła (3), Bogdan Banecki (3), Alicja Węgrzyn (4), Grzegorz Węgrzyn (1), Walenty Nyka (2) (1) Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański (2) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki, Akademia Medyczna w Gdańsku (3) Katedra Biologii Molekularnej i Komórkowej, Wydział Biotechnologii UG-AMG (4) Instytut Biochemii i Biofizyki, PAN, Gdańsk� Udary mózgu są jedną z najczęstszych przyczyn zgonów na świecie. Wyższą zapadalność na udary notuje się m. in. wśród osób starszych oraz wśród mężczyzn. Poza tym istnieje szereg czynników ryzyka, które predysponują do zachorowania na udar. Jednym z niezależnych czynników ryzyka niedokrwiennego udaru mózgu jest hiperhomocysteinemia, czyli podwyższone stężenie we krwi homocysteiny – produktu pośredniego w metabolizmie metioniny. Dwa spośród szeregu enzymów uczestniczących w metabolizmie metioniny, reduktaza metylenotetrahydrofolianu (MTHFR) oraz beta- 56 Genetyka człowieka syntaza cystationiny (CBS) zdają się mieć istotne znaczenie w utrzymaniu prawidłowego stężenia homocysteiny we krwi. Mutacje pojawiające się w genach kodujących powyższe enzymy, mogą powodować wzrost stężenia homocysteiny we krwi i w konsekwencji doprowadzić do wystąpienia udaru. Celem niniejszych badań było określenie częstości występowania dwóch mutacji w genie CBS (D22 w eksonie 4; T833C/ins68 w eksonie 8) i dwóch w genie MTHFR (C677T w eksonie 4; A1298C w eksonie 7) oraz zbadanie zależności pomiędzy tymi mutacjami a zachorowalnością na niedokrwienny udar mózgu. Badania nie wykazały znamiennego statystycznie związku pomiędzy występowaniem mutacji w genach CBS i MTHFR a zachorowalnością na niedokrwienny udar mózgu. Wykazano natomiast powiązanie zachorowalności na niedokrwienny udar mózgu z podniesionym poziomem homocysteiny (p=0,000001) oraz zaobserwowano występowanie korelacji pomiędzy stężeniem homocysteiny we krwi a typem mutacji w pozycji 677 genu MTHFR (p=0,0464). Wykłady plenarne: W28. Future trends in medical genetics. Pier Franco Pignatti Section of Biology and Genetics University of Verona, Italy [email protected] Medical genetics has greatly profited from recent advances in the human genome project with the identification of several disease genes and haplotypes, and with the provision of new methods for rapid molecular genetic analysis. The future holds promise for increased biological knowledge, and for practical health applications in the field of monogenic diseases with the identification of new disease genes, genetic modifiers, and their mechanism of action, and in the field of mutifactorial phenotypes with the identification of susceptibility genes and environmental factors, predictive genetic testing, and the development of new therapeutic approaches (1). Genetic testing will become increasingly important in disease prevention, clinical management, and drug treatment. These advancements will change medical practice and the formation of physicians in order to obtain the potential benefits of genomic-based medicine. The final proof of an effective transfer of this progress from the laboratory to affect people’s lives will be in the verification that the genetic test results will motivate a behavioural change in the persons who have undergone testing (2). The talk will delineate possible trends in medical genetics examining the area of complex diseases at first, then the area of pharmacogenetics, in order to conclude with a perspective on the development of predictive genetic tests. A brief description will be given of cardiovascular disease genetics, with a demonstration of the possible use of testing for genetic polymorphisms in several disease related genes, and the practical measures that could be taken when found to be at increased risk, as for hyperhomocysteinemia in hypofolatemic individuals with the MTHFR 677 C/T or T/T genotype (3) or for miocardial infarction in coronaropathic smoking individuals with the PON2 311 Cys/Cys genotype (4). A pharmacogenetic summary will then be given, with examples of genes for drug metabolism and pharmacodynamics, and their possible interactions to determine the individual’s response to a particular drug, as in the case of beta2ADR 16 Gly/Gly diminished effect of a beta 2 agonist in asthma therapy (5). Finally, the evolution of genetic tests will be discussed, and the difference between a diagnostic and a predictive test will be highlighted, as the latter test will be used for complex diseases, touching on the ethical, legal, and social implications of these tests, and the widely perceived need to inform and educate the public at large on the indications and the limits of genetic testing for mutifactorial phenotypes in the medical and the non-medical setting (6). References 1.Collins FC. The case for a US prospective cohort study of genes and environment. Nature 429:475-7, 2004 2. Collins FS, ED Green, AE Guttmacher, MS Guyer on behalf of the US NHGR. A vision for the future of genomics research. Nature 422: 835-47, 2003 3. Girelli D, N Martinelli, F Pizzolo, S Frigo, O Olivieri, C Stranieri, E Trabetti, G Faccini, E Tinazzi, PF Pignatti, R Corrocher. The interaction between MTHFR 677 C->T genotype and folate status is a determinant of coronary atherosclerosis risk. J Nutr 133:1281-5, 2003 4. Martinelli N, D Girelli, O Olivieri, C Stranieri, E Trabetti, F Pizzolo, S Friso, I Tenuti, S Cheng, MA Grow, PF Pignatti, R Corrocher. Interaction between smoking and PON2 Ser311Cys polymorphism as a determinant of the risk of myocardial infarction. Eur J Clin Invest 34:14-20, 2004 57 Genetyka człowieka 5. PF Pignatti. Trends in pharmacogenomics of drugs used in the treatment of asthma. Pharmacological Res 49:343-9, 2004 6. Hodgson SV & S Popat. Polymorphic sequence variants in medicine: a challenge and an opportunity. Clin Med 3:260-4, 2003 W29. Therapies for LSDs – enzyme augmentation and substrate reduction. J. E. Wraith Willink Biochemical Genetics Unit, Royal Manchester Children’s Hospital Manchester M27 4HA, UK Some 50 different lysosomal disorders are known in humans. They result from the defective function of a specific protein or enzyme which leads ultimately to the progressive accumulation within the lysosome of either undgraded substrate(s) or catabolic products that are unable to escape from this organelle. Most disorders are inherited in an autosomal recessive manner and the disease process is generally progressive and unremitting. The lysosomal disorders, like many other metabolic diseases, show a remarkably varied clinical phenotype. In some patients, the presentation may be in utero or the newborn period, whereas in others, even with the same enzyme deficiency (but probably a different genetic mutation), onset may be in late adulthood. However, for most patients the onset of symptoms may be in the first months or years of life following an often unremarkable and apparently normal early development. The first signs may be some slowing of development and other neurological signs; in other patients some organomegaly or a dysmorphic facial appearance may be noted. Recognition of these clinical signs will assist in the selection of appropriate diagnostic tests. Treatment of LSDs includes haematopoetic stem cell transplant (HSCT), enzyme replacement therapy (ERT) and substrate reduction therapy (SRT), but many disorders remain untreatable. The involvement of the central nervous system is a particular challenge and we have to rethink our therapeutic approach in these LSDs. A combination of enzyme augmentation and substrate reduction is likely to necessary for some disorders. SRT is limited by the single product currently available for use and the side effect profile of the product. Second generation products may be more effective and safer. Cost of therapy remains a challenge whatever approach is selected. W30. The Future of Lysosomal Storage Diseases Therapeutics: Enzymes for New Diseases, Gene Therapy, and The Brain. Dr R. Mościcki Genzyme Co., Combridge, MA, USA It is an exciting era for Lysosomal Storage Disorders. Success was observed first in the treatment of Gaucher disease with enzyme replacement therapy (ERT) which has now provided more than 10 years of experience. These technologies are now also being applied to other lysosomal storage diseases. Successful enzyme replacement therapy for Fabry disease and mucopolysaccharidosis I is now available. Similarly, enzyme therapy is in advanced stages of development for other MPS disorders. Initial clinical results from the US and Europe using ERT for Pompe disease are also suggesting improved survival for infants and other clinical improvements such as reduced cardiomegaly and improved muscle function for some patients. Details of the studies in Pompe disease will be presented. Animal studies in models of Niemann-Pick disease are supportive of clinical trials of ERT for Niemann-Pick B to begin soon. Both animal and human studies have provided encouragement regarding the use of gene therapy for lysosomal storage disorders. The monogenetic pathogenesis and success of ERT have long suggested that many of these diseases would be appropriate targets for such an approach. Initial approaches focused primarily on stem cell transfection. More recentlyanimal models such as those for Fabry disease have been very encouraging that non-stem cell approaches may also have an important role, ie use of the liver as a depot organ to produce enzyme. Experiments in Fabry mouse models have demonstrated long term enzyme expression and substrateclearance after only o ne administration of a viral vector containing the enzyme gene. These findings have now been extended to other lysosomal disorders in animal models. Neurologic disease is a prominent and devastating feature of many lysosomal storage disorders and may not be amenable to systemic administration of enzyme. Gene therapy may also prove useful as one of the approaches being tested in addressing neurologic disease inlysosomal storage disorders. Experiments in animal models demonstratesremarkable spread through the CNS, production of enzyme within the CNS,and clearance of substrate. Small molecules, which pass the blood brain barrier, may also play an important role for lysosomal neurologic disease of some types. Although existing small molecule therapies based onsugar analogs have to date been disappointing with poor efficacy and 58 Genetyka człowieka significant safety issues, newer agents such as ceremide analogs may prove to be an important advance. These agents are more potent and specific and demonstrate entrance into the brain with clearance of substrate within the brain. Early evidence also supports the possibility that neurologic stem cells may also provide an opportunity for regenerative approaches to the brain and function as agents for enzyme production within the CNS in models of lysosomal storage disease. These cells are shown to migrate, produce enzyme, and clear substrate. Most recently the expression of enzyme in the CNS has also been shown to improve CNS function in animals. Dysmorfologia Komunikaty ustne: W31. Aberracje subtelomerowe jako przyczyna upośledzenia umysłowego – badania kliniczne i cytogenetyczno-molekularne w 96 rodzinach. Ewa Obersztyn (1), Z. Helias-Rodzewicz (1), Kamila Suchenek (1), Ewa Bocian(1), Anna Kutkowska-Kaźmnierczak (1), Ewa Kostyk (2), Tadeusz Mazurczak (1) (1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Warszawa (2) Zakład Genetyki Medycznej, Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków Aberracje regionów subtelomerowych chromosomów odpowiedzialne są za około 3-9% przypadków tzw. idiopatycznego upośledzenia umysłowego w stopniu umiarkowanym/głębokim oraz 0,5% przypadków upośledzenia w stopniu lekkim współistniejących z cechami dysmorfiii i / lub wadami wrodzonymi. Celem pracy była ocena częstości występowania aberracji subtelomerowych w grupie 96 chorych z cechami upośledzenia umysłowego, dokonanie szczegółowej charakterystyki cech klinicznych oraz ocena użyteczności techniki FISH w diagnostyce niepełnosprawności intelektualnej. Podstawę kwalifikacji chorych do badań stanowiły następujące kryteria włączenia: upośledzenie umysłowe współistniejące z cechami dysmorfii i/lub wadami wrodzonymi, upośledzenie umysłowe wśród krewnych probanda (nieobligatoryjne), prawidłowy kariotyp oraz wykluczenie mutacji w genie FMR1. Do przeprowadzenia badań techniką FISH (Multiprobe Chromoprobe T system) zakwalifikowano: 41 chorych z głębokim, 28 z umiarkowanym oraz 22 z lekkim stopniem upośledzenia umysłowego. W 54 przypadkach upośledzenie miało charakter rodzinny. Obecność aberracji subtelomerowych wykazano u 9/96 (9,4%) probandów. W większości przypadków, aberracje miały charakter rodzinny (7/9), i były pochodzenia ojcowskiego (6/9). W jednej rodzinie wykazano obecność zrównoważonej translokacji wzajemnej oraz translokacji subtelomerowej. Wśród najczęściej występujących objawów stwierdzono: cechy dyzmorfii twarzy (9/9), głęboki stopień upośledzenia umysłowego (5/9), hipotonię (6/9), małogłowie (6/9) oraz wady wrodzone, w szczególności OUN, serca i narządów płciowych. Przeprowadzono charakterystykę porównawczą cech klinicznych grupy chorych z potwierdzoną oraz wykluczoną obecnością aberracji subtelomerowej w kontekście kryteriów które stanowią wskazania do przeprowadzenia testu subtelomerowego. W32. Oro-facio-digital syndrom typ I – charakterystyka kliniczna i molekularna 2 przypadków. Aleksandra Jezela-Stanek (1), A. Pyrkosz (2), E. GŁłuszkiewicz (2), J. Paprocka (3), M. Krajewska-Walasek (1) (1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut „Pomnik-Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa (2) Katedra i Zakład Biologii Ogólnej, Molekularnej i Genetyki Śląskiej AM, Katowice (3) Klinika Pediatrii i Neurologii Wieku Rozwojowego Śląskiej AM, Katowice Zespół ustno-twarzowo-palcowy typu I (orofaciodigital syndrome type I, OFDS I; [MIM 311200]) należy do heterogennej grupy zaburzeń rozwojowych, dotyczących struktur jamy ustnej, twarzy oraz palców, z którymi bardzo często współistnieją wady ośrodkowego układu nerwowego oraz torbielowatość nerek. Po raz pierwszy został opisany w 1954 roku przez francuskich stomatologów Papillon-Lasage i Psaume. Nazwę wprowadził natomiast Gorlin w roku 59 Genetyka człowieka 1961. Dotychczas scharakteryzowano jego 9 typów (OFD I-IX), różniących się konstelacją wad oraz sposobem dziedziczenia. OFDS typu I dziedziczony jest w sposób dominujący sprzężony z chromosomem X, stąd dla większości płodów męskich jest letalny. Występuje z częstością około 1 na 250 000 żywych urodzeń. Około 75% to przypadki sporadyczne. Jedyny poznany gen, mutacje którego wiążą się z wystąpieniem omawianego zaburzenia – gen OFD I jest zlokalizowany na krótkim ramieniu chromosomu X, w regionie Xp22.2-p22.3. Jest również określony jako gen CXORF5 (Chromosome X Open Reading Frame 5). Kodowane przez niego białko przypuszczalnie odgrywa rolę w interakcjach białko-białko we wczesnych etapach rozwoju, warunkując prawidłowy przebieg organogenezy, aczkolwiek jego rola nie została ostatecznie poznana. Zidentyfikowano dotychczas mutacje zarówno w obrębie eksonów, jak i intronów genu OFD I, przy czym większość z nich warunkuje wystąpienie zaburzeń elongacji. Celem prezentowanej pracy jest przedstawienie 2 przypadków zespołu OFD typu I, gdzie rozpoznanie kliniczne zostało zweryfikowane poprzez analizę genu CXORF5.� W33. Zespół paznokciowo-rzepkowy – przypadek spowodowany nową mutacją w genie LMX1B. Krzysztof Szczałuba (1), Ewa Obersztyn (1), Roberto Ravazzolo (2), Bożena Gołąbek (3), Tadeusz Mazurczak (1) (1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytutu Matki i Dziecka, Warszawa (2) Laboratorio di Genetica Moleculare, Instituto G. Gaslini, Genua, Włochy Zespół paznokciowo-rzepkowy (Nail-patella syndrome) (OMIM: 161200) jest chorobą monogenową o toku dziedziczenia autosomalnym dominującym, charakteryzującą się obecnością licznych malformacji tkanek wywodzących się z ekto– i mezodermy. W obrazie klinicznym choroby dominują symetryczne wady układu kostnego, w tym hipoplazja rzepek, zmiany dystroficzne paznokci oraz zaburzenia funkcji nerek. Za ekspresję kliniczną choroby odpowiedzialne są mutacje w genie LMX1B, zmapowanym w locus 9q34. Przedstawiono charakterystykę cech klinicznych przypadku rodzinnego (u matki i syna) zespołu paznokciowo-rzepkowego oraz wyniki przeprowadzonych badań molekularnych. Wśród cech klinicznych zespołu paznokciowo-rzepkowego, które wystąpiły zarówno u matki jak i jej 4-letniego syna należy wymienić: obustronne „rogi biodrowe”, hipoplastyczne rzepki, zmiany dystroficzne paznokci obu dłoni, przykurcze z ograniczeniem ruchomości w zakresie dużych stawów oraz hipoplazję bliższych odcinków kości promieniowych. W wykonanych badaniach dodatkowych stwierdzono prawidłowe parametry wydolności nerek u obojga, chociaż tylko u matki obserwowano obecność krwinkomoczu i białkomoczu. Wyniki przeprowadzonych badań molekularnych wykazały u obojga pacjentów obecność nowej mutacji typu „missense” (C:G) w kodonie 245 genu LMX1B. Mutacja powoduje zamianę glutaminy w kwas glutaminowy w kodowanym przez gen białku i prawdopodobnie upośledza jego wiązanie z odpowiednimi sekwencjami docelowego DNA. Omówiono znaczenie badań molekularnych dla poradnictwa genetycznego w rodzinie probanda. W34. Zespół MERRF u trzech sióstr z mnogą symetryczną tłuszczakowatością. Magdalena Badura (1), Anna Materna-Kiryluk (1), Katarzyna Tońska (2), Ewa Bartnik (2,3) Anna Latos-Bieleńska (1) (1) Katedra i Zakład Genetyki Medycznej Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu (2) Zakład Genetyki Uniwersytetu Warszawskiego (3) Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawa Prezentujemy opis kliniczny trzech sióstr, u których rozpoznano w 4. dekadzie życia mnogą symetryczną tłuszczakowatość i obustronną zaćmę. Mnoga symetryczna tłuszczakowatość (choroba Madelunga, tłuszczakowatość Launois-Bensaude, MIM 151800) charakteryzuje się nagromadzeniem pod skórą karku, ramion, okolicy nadobojczykowej i nadłopatkowej symetrycznych tłuszczaków. Na świecie opisano jedynie 200 przypadków tej choroby, nie ma zgodności co do etiologii choroby. Ze względu na to, że u brata badanych kobiet rozpoznano na podstawie analizy bioptatu mięśnia szkieletowego miopatię mitochondrialną, wykonano badania molekularne w kierunku znanych mutacji w genomie mitochondrialnym u wszystkich członków rodziny. U chorującego na miopatię brata oraz u jednej z sióstr potwierdzono występowanie w genomie mitochondrialnym mutacji A-G 8344 w genie dla tRNA (Lys). Mutacja konstytucjonalna (A-G 8344) w genomie mitochondrialnym leży u podłoża zespołu MERRF (Myoclonic Epilepsy and Ragged Red Fiber Disease). W klasycznej formie zespół ten charakteryzuje się występowaniem padaczki mioklonicznej, miopatii mitochondrialnej i wolno postępującego otępienia. U pacjentów może występować jednak daleka od klasycznej konfiguracja objawów (mowa skandowana, atrofia nerwu wzrokowego, utrata słuchu, niskorosłość, neuropatia obwodowa). Badanie 60 Genetyka człowieka biopsyjne wycinka mięśnia szkieletowego ujawnia obecność tzw. czerwonych poszarpanych włókien. W literaturze nie było dotąd doniesień o rodzinnie występującej mnogiej symetrycznej tłuszczakowatości z obecnością konkretnej mutacji w genomie mitochondrialnym. Istnieje natomiast wiele doniesień o dysfunkcji mitochondriów w lipodystrofii pojawiającej się w trakcie terapii antyretrowirusowej u pacjentów z AIDS oraz w etiopatogenezie zaćmy. Praca ma na celu zwrócenie uwagi klinicystów na rolę analizy rodowodu i badań molekularnych genomu mitochondrialnego w przypadku pacjentów z mnogą symetryczną tłuszczakowatością. W35. Duplikacja 8p u dwójki dzieci skierowanych z rozpoznaniem mózgowego porażenia dziecięcego. Renata Glazar (1), Marzena Wiśniewska (1), Jolanta Kołowska (2) (1) Katedra i Zakład Genetyki Medycznej AM w Poznaniu (2) Centrum Genetyki Medycznej NZOZ w Poznaniu Mózgowe porażenie dziecięce (mpd) jest częstą przyczyną kierowania pacjentów do poradni genetycznej. Szczegółowa diagnostyka przeprowadzona u tych dzieci wskazuje na to, że tylko w 30% przypadków rozpoznanie to jest prawidłowe, a w 70% kryje się za tym choroba genetycznie uwarunkowana. U dwójki dzieci płci żeńskiej, skierowanych do poradni genetycznej z rozpoznaniem mpd, stwierdzono obecność cech dysmorfii z towarzyszącym opóźnieniem rozwoju psychomotorycznego oraz wrodzoną wadą serca. Dzieci trafiły po raz pierwszy do poradni genetycznej w wieku niemowlęcym: 3 m.ż. i 12 m.ż. Zaobserwowano u nich występowanie podobnych cech dysmorfii: wydłużona i wygładzona rynienka podnosowa, wąska górna warga, micrognathia, wąskie i wysokie podniebienie, w obrębie kończyn górnych pogłębione bruzdy zgięciowe. Badanie echokardiograficzne serca w obydwu przypadkach wykazało obecność ubytku w przegrodzie międzyprzedsionkowej. W przeprowadzonych badaniach cytogenetycznych zidentyfikowano aberrację chromosomową – duplikację w obrębie ramienia krótkiego chromosomu pary 8: dup(8)(p23.1p11.23). Kariotypy rodziców obu dziewczynek były prawidłowe. Omawiany przypadek wskazuje na konieczność wykonywania badania kariotypu w każdej sytuacji, w której u dziecka stwierdza się opóźnienie rozwoju psychomotorycznego oraz cechy dysmorfii, mimo postawionego wcześniej innego rozpoznania. Badanie wykonano w ramach programu rządowego: „Program monitorowania i poprawy pierwotnej profilaktyki wrodzonych wad rozwojowych w Polsce” oraz działalności statutowej KZGM nr 502-1-05-01. W36. Zespół Proteusa i zespół znamienia naskórkowego: nakładanie się cech fenotypowych. Monika Ołdak (1, 2), Dorota Gieruszczak-Białek (1), Agata Skórka (1), Jarosław Waligóra (1), Lech Korniszewski (1) (1) Klinika Diabetologii, Patologii Noworodka i Wad Wrodzonych, Akademia Medyczna w Warszawie, (2) Katedra i Zakład Histologii i Embriologii, Centrum Biostruktury, Akademia Medyczna w Warszawie Hemihipertrofia i hemimegalencefalia mogą występować w różnych zespołach wad wrodzonych takich jak wariant neurologiczny zespółu znamienia naskórkowego, zespół Klippel-Trenaunay-Webera, Proteusa, neurofibromatozie i hipomelanozie Ito. Chociaż kryteria diagnostyczne istnieją dla wielu z tych zespołów, ustalenie rozpoznania jest często trudne ze względu na znaczna zmienność ekspresji i nakładanie się niektórych objawów klinicznych. Przedstawiany przypadek pacjenta z zespołem Proteusa ilustruje ten problem. Obecnie trzyletni chłopiec urodził się w 35 tygodniu pierwszej ciąży bliźniaczej po zapłodnieniu in vitro, rozwiązanej cięciem cesarskim. Siostra bliźniaczka jest zdrowa, jej masa urodzeniowa wynosiła 2190g. Masa urodzeniowa chłopca wynosiła 3180g. Nie było dowodów na transfuzję krwi między bliźniętami. W badaniu przedmiotowym przy urodzeniu zwracały uwagę hemihipertrofia twarzy i lewej połowy ciała, naczyniaki na obu kończynach górnych i na lewej kończynie dolnej oraz znamię naskórkowe po lewej stronie na szyi i lewym przedramieniu wzdłuż linii Blaschko a także liczne tłuszczaki w powłokach brzusznych. Badanie rezonansu magnetycznego głowy wykazało znaczną hemimegalencefalię, asymetrię mózgu i móżdżku z licznymi anomaliami naczyniowymi bardziej zanaczonymi po stronie lewej. U chłopca obserwuje się także ogniskowe zaburzenia pigmentacji owłosionej skóry głowy szczególnie po stronie lewej. Interesujace, że podobne „mozaikowe” różnice w kolorze owłosienia stwierdziliśmy u pacjenta z zespołem znamienia naskórkowego, w którym poza zmianami skórnymi typu nevus stwierdza się hemihipertrofię twarzy z hemimegalencefalią. Może to wskazywać na patogenetyczną rolę mozaikowatości somatycznej w obu zespołach. 61 Genetyka człowieka W37. Zespół Nooan, zespół sercowo-twarzowo-skórny i zespół Costello – trudności diagnostyczne u dziecka z ciężką postacią zespołu Costello. Agata Skórka, L. Korniszewski, D. Gieruszczak-Bialek, J. Waligora Klinika Diabetologii, Patologii Noworodka i Wad Wrodzonych w Warszawie Zespół sercowo-twarzowo-skórny (zespół CFC, cardio-facio-cutaneous syndrome) charakteryzuje się niedoborem wzrostu, typową dysmorfią, wadami serca, zaburzeniami ektodermalnymi oraz upośledzeniem rozwoju umysłowego. W zespole Noonan stwierdza się wiele cech klinicznych podobnych do objawów występujących u pacjentów z zespołem CFC. W literaturze wciąż toczy się debata czy oba te zespoły stanowią dwie odrębne jednostki kliniczne czy też są związane z różną ekspresją tego samego zaburzenia. W 2001 roku zlokalizowano gen odpowiedzialny za występowanie zespołu Noonan (PTPN11, zlokalizowany w locus 22.q24.1). Mutacje tego genu stwierdza się u około 60% pacjentów z zepołem Noonan. Jak do tej pory nie stwierdzono mutacji tego genu u pacjentów z zespołem CFC. Kolejnym zespołem, który sprawia trudności w diagnostyce różnicowej pacjentów z fenotypem CFC/Noonan jest zespół Costello, charakteryzujący się typowymi cechami dysmorfii, opóźnieniem rozwoju psychoruchowego i fizycznego, wadami serca. Zwykle u tych pacjentów z wiekiem pojawia się charakterystyczne pogrubienie rysów twarzy, oraz bardzo charakterystyczny wygląd skóry dłoni i stóp (znaczny nadmiar skóry, skóra aksamitna, miękka z bardzo licznymi bruzdami). Przedstawiamy 7-letniego chłopca, u którego po urodzeniu postawiono rozpoznanie zespołu Noonan ze względu na charakterystyczne cechy twarzoczaszki, krótką płetwiastą szyję, obrzęki dłoni i stóp, złożoną wadę serca (VSD, ASD, PS). Ze względu na znaczne opóźnienie rozwoju psychoruchowego, niedobór wzrost oraz zaburzenia ektodermalne (zaburzenia dotyczące włosów, skóry i zębów) zmieniono rozpoznanie na zespół CFC. Dopiero nasilające się z wiekiem pogrubienie rysów twarzy oraz bardzo charakterystyczne wygląd skóry dłoni i stóp naprowadził na postawienie właściwego rozpoznania zespołu Costello. W38. Porównanie efektywności diagnostyki zespołów CATCH 22 i Williamsa opartej o metodę FISH. Małgorzata Piotrowicz (1), Tatiana Chilarska (1), Wanda Hawuła (1), Anna Ulańska (1), Nina Wieczorek-Cichecka (1), Jadwiga Moll (2), Katarzyna Ostrowska (2), Jolanta Kiełbasiewicz-Binikowska (2), Anna Gutkowska (3), Małgorzata Krajewska-Walasek (3), Lucjusz Jakubowski (1) (1) Zakład Genetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi (2) Klinika Kardiologii Instytutu CZMP w Łodzi (3) Zakład Genetyki Instytutu CZD w Warszawie Zespoły CATCH 22 (Di George/VCF syndrome) oraz Williamsa wiążą się z mnogimi wadami rozwojowymi, wśród których jedną z wiodących nieprawidłowości jest wada układu sercowo-naczyniowego. Najczęstszą przyczyną obu zespołów są mikrodelecje chromosomowe. Analizie poddano pacjentów kwalifikowanych do diagnostyki cytogenetycznej z wykorzystaniem techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ’ (FISH) na podstawie obecności charakterystycznych dla każdego z zespołów cech dysmorfii i/lub typowej wady serca: wady rozwojowej pnia i stożka naczyniowego w zespole CATCH 22; nadzastawkowego zwężenia aorty i/lub łagodnego zwężenia tętnicy płucnej w zespole Williamsa. U pacjentów z podejrzeniem mikrodelecji 22q11.2 potwierdzenie diagnozy uzyskano u 12 chorych (41% badanych). Byli to prawie wyłącznie pacjenci z fenotypowymi cechami zespołu Di George’a lub zespołu podniebienno-sercowo-twarzowego. Wśród 16 pacjentów diagnozowanych w kierunku zespołu Williamsa obecność mikrodelecji 7q11.23 potwierdzono w 9 przypadkach (56%). Byli to także pacjenci z typowymi cechami dysmorfii, którym w ponad 60% towarzyszyła wada zastawkowa dużych naczyń. W obu grupach nie stwierdzano mikrodelecji u pacjentów z charakterystyczną wadą serca lecz cechami dysmorfii odbiegającymi od klasycznych opisów cech obserwowanych w tych jednostkach chorobowych.� Efektywność diagnostyki techniką FISH przy kwalifikacji opartej o pełne kryteria kliniczne jest znacznie wyższa. Biorąc pod uwagę istotne problemy kliniczne związane z zespołami mikrodelecji (m.in. hipercalcemię w zespole Williamsa, hipokalcemię i zaburzenia odporności w zespole CATCH 22) uważamy jednak, że obecność nawet dyskretnie wyrażonych cech fenotypowych oraz typowej wady serca u noworodków i niemowląt stwarza konieczność wykluczenia w/w mikrodelecji także w przypadkach wątpliwych. Poddano dalszej dyskusji kryteria kliniczne kwalifikujące pacjentów do badań w kierunku ww. delecji. 62 Genetyka człowieka W39. Zespół PEHO/”PEHO – like” u dziewczynki. Stanisław Zajączek (1), Zdzisława Rosińska (2), Maria Giżewska (3), Mieczysław Walczak (3), Katarzyna Hnatyszyn (4), Wojciech Lubiński (5) (1) Zakład Genetyki i Patomorfologii Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie (2) Specjalistyczny Zespół Opieki Zdrowotnej nad Matką i Dzieckiem-Szpital „Zdroje” (3) II Klinika Chorób Dzieci PAM (4) Klinika Neonatologii PAM (5) Katedra i Klinika Okulistyki PAM Zespół PEHO (Progressive Encephalopathy,Hipsarrythmia,Optic atrophy,Oedema) jest bardzo rzadkim schorzeniem neurodegeneracyjnym, opisanym u ok. 30 rodzin z Finlandii i w pojedynczych rodzinach z innych krajów. Nie opisano dotąd zespołu w Polsce. Pacjenci „PEHO” i „PEHO-like” różnią się głównie nasileniem i dynamiką zmian obserwowanych w MRI; nasileneim towarzyszących im drgawkom, hipsarytmiom i opóźnieniem PNR, z objawami dotyczącymi zazwyczaj móżdżku i pnia a także nasileniem zmian ocznych przy wspólnym fenotypie dysmorficznym. W skład bardzo charakterystycznych dysmorfii wchodzą: obrzęk dłoni, stóp i policzków, charakterystyczny wygląd dolnego i środkowego piętra twarzy, znaczny przerost dziąsęł i in. Stałym objawem są zwężąjące się szpiczasto zakończone palce z małymi paznokciami. Zespół jest prawdopodobnie uwarunkowany AR a w jego patomechaniźmie znaczącą rolę odgrywa nadmiar w neuronach tlenku azotu, wywołany z kolei niedoborem działającego ochronnie IGF1. Przedstawiamy obserwacje 4 –letniej dziewczynki, prezentującej pełny zespół cech dysmorficznych PEHO z opóźnieniem PNR i drgawkami. O kwalifikacji do grupy PEHO lub PEHO – like zadecyduje w przyszłości ocena dynamiki zmian neuroradiologicznych i ocznych. W40. Współistnienie agenezji i hipoplazji ciała modzelowatego z innymi wadami rozwojowymi. Jolanta Wierzba (1), Małgorzata Lemka (2), Barbara Mańkowska (2), M. Iliszko (3) (1) Klinika Pediatrii, Hematologii, Onkologii i Endokrynologii AM w Gdańsku (Kierownik Kliniki prof. dr hab. med. Anna Balcerska) (2) Klinika Neurologii Rozwojowej AM w Gdańsku ( Kierownik Kliniki prof. dr hab. med. Ewa Dilling– Ostrowska ) (3) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki AM w Gdańsku ( Kierownik Katedry prof. dr hab. med. Janusz Limon) Ciało modzelowate (corpus callosum; CC) jest strukturą mózgowia zespalającą i integrującą jego półkule. Wady rozwojowe CC występują stosunkowo rzadko. Niejednokrotnie opisywano współistnienie niedorozwoju (hipoplazja), lub braku (agenezja) ciała modzelowatego (ACC) z innymi wadami ośrodkowego układu nerwowego (OUN), a także z wadami innych narządów. Celem prezentowanych badań była analiza współistnienia ACC z innymi wadami OUN oraz z wadami innych narządów. Przedstawiono materiał kliniczny dotyczący 24 dzieci w wieku od 4 miesięcy do 15 lat (7 dziewczynek, 17 chłopców), u których stwierdzono całkowitą (N = 14), lub częściową (N = 10) ACC. U większości dzieci wstępne rozpoznanie wady postawiono na podstawie badania ultrasonograficznego i potwierdzono badaniami TK i/ lub NMR mózgowia. U 12 dzieci (50%) ACC była izolowaną wadą, u pozostałych 12 stwierdzono współistnienie innych wad OUN (m. in. holoprosencefalia, poszerzenie komór mózgu, poszerzenie zbiornika wielkiego, torbiele pajęczynówki, zaburzenia migracji neuroblastów, wady móżdżku). U 75% dzieci z ACC występowały wady rozwojowe innych narządów, w tym wady serca (33%), narządu wzroku (25%), układu mięśniowo– szkieletowego (33%) oraz układu moczo– płciowego (16%). U jednej z dziewczynek rozpoznano zespół Aperta, u jednego chłopca zespół Toriello-Carey’a, u innego chłopca obraz kliniczny odpowiadał sekwencji VATER, jedna z dziewczynek obserwowana jest w kierunku zespołu Aicardi. Jedno z dzieci przebyło w okresie prenatalnym zakażenie cytomegalowirusem. U 22 spośród 23 dzieci, u których wykonano badanie cytogenetyczne, nie wykazano aberracji chromosomowych. U jednego chłopca dziecka z małogłowiem, holoprosencefalią, zanikiem nerwu wzrokowego, wadą serca i niedorozwojem narządów płciowych wykryto mozaikowy kariotyp: mos46,XY,r(7)(p22q36)/46,XY,r(7,7) (p22q36,p22q36). Reasumując, ACC najczęściej współistnieje z innymi wadami rozwojowymi i jest sporadycznie uwarunkowana aberracją chromosomalną. Znalezienie patologii struktur ciała modzelowatego jest nie tylko wskazaniem do szczegółowej diagnostyki OUN, ale także do rutynowego wykonania badań pozostałych narządów. Stwierdzenie współistnienia wad towarzyszących, może mieć podstawowe znaczenie dla udzielenia prawidłowej porady genetycznej. 63 Genetyka człowieka W41. Identyfikacja sekwencji specyficznych dla chromosomu Y z wykorzystaniem PCR oraz FISH w przypadkach mozaikowości z udziałem chromosomu markerowego u chorych z cechami zespołu Turnera. Lucjusz Jakubowski (1), Anna Jeziorowska (2), Tatiana Chilarska (1), Iwona Pinkier (1), Agnieszka Potrzebowska (1), Wanda Hawuła (1), Anna Ulańska (1), Anna Krzymińska (3), Hanna Nalewajek (4), Maciej Hilczer (2) (1) Zakład Genetyki, UM w Łodzi (2) Klinika Endokrynologii i Terapii Izotopowej, UM w Łodzi (3) Zakład Patofizjologii Katedry Patofizjologii UM w Łodzi� (4) Poradnia Endokrynologiczna Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi Identyfikacja chromosomów markerowych pochodzących z chromosomu Y przy użyciu klasycznych metod cytogenetycznych przysparza trudności ze względu na jego małe rozmiary i ubogi wzór prążkowy. Tym trudniejsza jest lokalizacja punktów złamań prowadzących do powstania chromosomu markerowego. Zaprezentowano analizę sekwencji specyficznych dla chromosomu Y u dwóch pacjentek z klinicznymi cechami zespołu Turnera i kariotypami mozaikowymi 45,X/46,X,+mar, przy pomocy techniki PCR i w oparciu o mapę delecyjną chromosomu Y. Badano sekwencje dla poszczególnych regionów//interwałów chromosomu Y: Yp11.3//1A– PABY, SRY, Yp11.2//3 – TSPY; Ycen//4A-4B – DYZ3; Yq11.21-11.22//5C– sY83, sY86, //5EwejsY182 (KALY); //5M wejsY116; //5N wejsY122; Yq11.22-11.23//6AwejsY134, sY207; //6B – sY138; //6CwejsY141; //6DwejsY254, sY255 (DAZ); //6E wejsY149, sY150, sY269, sY203, sY152; 6FwejsY156, sY166, sY167, sY158; Yq12//7 – DYZ1(sY160), DYZ2 (sY159). Nie potwierdzono jedynie obecności sekwencji specyficznych dla regionu Yq12, ustalając tym samym punkt złamania poniżej sekwencji sY158. Niezależnie od identyfikacji sekwencji Y-specyficznych w genomowym DNA, pochodzenie chromosomów markerowych z chromosomu Y potwierdzono przy pomocy FISH z wykorzystaniem Chromosome X/Y Cocktail Probe (Qbiogene). Stwierdzono izodicentryczną strukturę obu chromosomów markerowych. U obu pacjentek na podstawie badań hormonalnych podejrzewa się obustronną dysgenezję gonad. Stwierdzenie sekwencji specyficznych dla chromosomu Y było podstawą do ustalenia w obu przypadkach wskazań do obustronnej gonadektomii ze względu na ryzyko pojawienia się w gonadach zmian nowotworowych. Dalsze badania cytogenetyczne i histologiczne gonad mogą pozwolić na wyjaśnienie przyczyn cech niewielkiej maskulinizacji zewnętrznych narządów płciowych u jednej z pacjentek. Omówiono trudności w poszukiwaniu korelacji fenotypowo-genotypowych w przypadkach mozaikowych kariotypów z udziałem monosomii 45,X oraz chromosomu Y pacjentów z cechami somatycznymi zespołu Turnera. Praca finansowana z grantu KBN nr 6 PO5E 135 21 Komunikaty plakatowe: P60. Delecja 18pz w eksonie 5 genu ektodysplazyny-A u chorego z objawami anhydrotycznej dysplazji ektodermalnej. Alicja Kujawa (1), M. Zadurska (2), W. H. Trzeciak (1) (1) Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej Akademii Medycznej w Poznaniu. (2) Zakład Ortodoncji Instytut Stomatologii Akademii Medycznej w Warszawie Dysplazje ektodermalne obejmują około 180 zespołów klinicznych cechujących się nieprawidłowościami rozwojowymi przydatków skóry, w szczególności: zębów, włosów oraz gruczołów potowych. Najczęściej występującą formą dysplazji ektodermalnej jest jej postać anhydrotyczna, spowodowana nieprawidłowym różnicowaniem się przydatków skóry w okresie życia płodowego, które wymaga wzajemnego oddziaływania komórek wywodzących się z ektodermy i mezenchymy. Uważa się, że podstawową przyczyną objawów klinicznych anhydrotycznej dysplazji ektodermalnej u ludzi są mutacje w genach: EDA, EDAR, EDARADD, XEDAR oraz TRAF6, przy czym ok. 95% mutacji odpowiadających za powstanie dysplazji ektodermalnej zlokalizowanych jest w obrębie genu EDA. Gen EDA koduje białko błonowe ektodysplazynę-A (EDA-A) występującą w postaci trimeru. EDA-A w domenie zewnątrzkomórkowej zawiera motyw kolagenopodobny z dwoma ciągami: 4 i 19 powtórzeń Gly-X-Y oraz motyw homologiczny do TNFα i może występować w postaci izoform: A1 i A2 różniących się dwoma aminokwasami: Glu308 i Val309 w sekwencji homologicznej do TNFα. Celem pracy było poszukiwanie i identyfikacja mutacji u chorych z anhydrotyczną dysplazją ektodermalną. 64 Genetyka człowieka Od 4 chorych pobrano krew obwodową i wyizolowano DNA. Następnie wykonano reakcję PCR z zastosowaniem odpowiednich par starterów dla 9 eksonów genu EDA. Obecność mutacji punktowych w amplifikowanych fragmentach wykrywano za pomocą analizy polimorfizmu konformacji pojedynczej nici DNA w gradiencie temperatur (MSSCP). U jednego chorego zaobserwowano zmianę we wzorze prążkowym eksonu 5. Analiza sekwencyjna na sekwenatorze ALFexpress II przy użyciu startera znakowanego Cy5 wykazała EDA 801/814 del 18pz delecję 2 z 19 powtórzeń GlyX-Y. Wykryta mutacja może prowadzić do zaburzenia procesu trimeryzacji ektodysplazyny i blokować przekazywanie sygnału z ektodermy do mezenchymy co uważa się za jedną z przyczyn wystąpienia dysplazji ektodermalnej. P61. Diagnostyka prenatalna zespołu Crouzona w rodzinie wysokiego ryzyka genetycznego. Anna Kutkowska-Kaźmierczak (1), Ewa Obersztyn (1), Renata Jaczyńska (2), Piotr Sucharski (3), Tadeusz Mazurczak (1) (1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Warszawa (2) Klinika Położnictwa i Ginekologii, Instytutu Matki i Dziecka, Warszawa (3) Zakład Genetyki Medycznej, Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków Zespół Crouzona (OMIM 123500) należy do grupy genetycznie uwarunkowanych dyzostoz czaszkowo-twarzowych, o autosomalnym dominującym toku dziedziczenia. Wśród typowych dla choroby objawów wymienia się: przedwczesne zarastanie szwów czaszkowych, hipoplazję środkowej części twarzy, wytrzeszcz gałek ocznych oraz prognatyzm Za wystąpienie objawów choroby odpowiedzialna jest mutacja w genie receptora czynnika wzrostu fibroblastów (FGFR2). Znanych jest ponad 30 mutacji genu FGFR2, z czego 25% stanowią mutacje powstałe de novo. Przedstawiono przypadek rodzinny zespołu Crouzona, w którym chorobę rozpoznano prenatalnie na podstawie oceny ultrasonograficznej płodu oraz wyniku badania molekularnego. W badaniu obrazowym wykonanym w 28 tygodniu ciąży metodą ultrasonografii trójwymiarowej, stwierdzono deformację kości czaszki okolicy skroniowej oraz cechy dysmorficzne twarzoczaszki takie jak: wytrzeszcz gałek ocznych, szeroką, płaską nasadę nosa i prognatyzm, które w kontekście danych rodowodowych uzasadniały podejrzenie zespołu Crouzona u płodu. Uzyskany wynik analizy DNA wyizolowanego z amniocytów potwierdził obecność u płodu tej samej, co u ojca mutacji S267P w eksonie 7 genu FGFR2. Wynik badania MR płodu wykazał jedynie niewielkiego stopnia spłaszczenie kości czaszki w okolicy skroniowo-ciemieniowej. Przedstawiany przypadek należy do nielicznych rozpoznanych prenatalnie dyzostoz twarzowo-czaszkowych typu Crouzona. Dokumentuje znaczenie nowoczesnych technik obrazowania płodu, w tym ultrasonografii trójwymiarowej oraz rezonansu magnetycznego w diagnostyce zespołów dysmorficznych. Diagnostyka molekularna pozostaje nadal metodą z wyboru w rodzinach ryzyka genetycznego, weryfikującą podejrzenie zespołu Crouzona rozpoznanego prenatalnie. P62. Mutacje w genie PTPN11 w grupie 8 pacjentów z zespołem Noonan. Jakub Klapecki, Agnieszka Szpecht-Potocka, Mikołaj Łaniewski-Wołłk, Ewa Obersztyn, Jerzy Bal, Tadeusz Mazurczak Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Warszawa Zespół Noonan (OMIM 163950) jest chorobą genetycznie uwarunkowaną o toku dziedziczenia autosomalnym dominującym o częstości występowania 1 na 2500 wśród żywourodzonych. W obrazie klinicznym choroby wymienia się takie objawy, jak: niedobór wysokości ciała, wady wrodzone serca (najczęściej zwężenie zastawki tętnicy płucnej), deformacje klatki piersiowej, płetwista krótka szyja, szerokie rozstawienie brodawek sutkowych, upośledzenie umysłowe stopnia lekkiego/umiarkowanego, oraz charakterystyczne cechy dysmorfii twarzy: hiperteloryzm, zmarszczki nakątne, pogrubiały obrąbek ucha. U podstaw molekularnych zespołu leży mutacja w genie PTPN11 zlokalizowanym na chromosomie 12 p 24.1. Przedstawiono wstępne wyniki oceny cech klinicznych oraz badań molekularnych w grupie chorych z rozpoznaniem klinicznym zespołu Noonan. Analiza mutacji w genie PTPN11 obejmie sekwencjonowanie kolejnych eksonów genu od 2 do 15. 65 Genetyka człowieka P63. Zespół kociego krzyku (Cri-du Chat) – trudności diagnostyczne – opis przypadku. Izabela Łaczmańska, Justyna Gil, Agnieszka Stembalska, Małgorzata Sąsiadek Zakład Genetyki Akademii Medycznej we Wrocławiu Do Zakładu Genetyki AM we Wrocławiu został skierowany 8-dniowy noworodek płci żeńskiej z podejrzeniem zespołu Cri-du-Chat. Dziecko urodzone z CIPI w stanie ogólnym dobrym, z masą ciała 3200 g, ocenione na 10 punktów w skali Apgar (ciąża rozwiazana w 39 tygodniu cięciem cesarskim z powodu słabej czynności skurczowej macicy). U noworodka w przeprowadzonym badaniu fizykalnym stwierdzono dysmorfizm nie odpowiadający obrazowi charakterystycznemu dla zespołu Cri-du-Chat: dość dużą mózgoczaszkę, trójkatną twarz, trójkatną bródkę, uszy nisko osadzone, zrotowane ku tyłowi oraz nieprawidłowości w zakresie kończyn dolnych (piętowe ustawienie stóp, utrudnione odwodzenie w stawach biodrowych). W wykonanym badaniu USG serca stwierdzono wrodzoną wadę w postaci ASD, VSD. Zwracał uwagę charakterystyczny płacz dziecka, przypominający miauczenie kota. Ze względu na cechy dysmorficzne oraz wady towarzyszące u dziecka wykonano badanie kariotypu metodą barwienia prążkowego chromosomów GTG. Stwierdzono delecję ramienia krótkiego chromosomu 5 w części terminalnej. W celu potwierdzenia rozpoznania zespołu Cri-du-Chat wykonano dodatkowo badanie FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) z zastosowaniem sondy Cri-du-Chat Chromosome Region (CDCR) Probe with 5qter Control Probe o wielkości 140 kpz firmy Qbiogene. Sonda obejmuje regiony 5p15.2 (Cri-du-Chat critical region) i 5p15.3 (cat-like cry critical region). Analiza 50 metafaz i 50 jąder interfazalnych wykazała obecność dwóch prawidłowych sygnałów dla badanego regionu. Ponieważ sonda skierowana jest na obszary 5p15.2 i 5p15.3 wynik badania FISH nie wyklucza delecji tylko jednego z tych obszarów. U dziecka przyjęto jako ostateczny wynik badania delecję w regionie 5p15.3. Dla potwierdzenia wyniku wskazane jest wykonanie badań z zastosowaniem sondy subtelomerowej 5p lub oddzielnych sond na regiony 15p15.2 i 15p15.3. P64. Zespół Wildervanck’a: zaburzenia migracji neuronalnej jako możliwy patomechanizm? Antoni Pyrkosz (1), Beata Klimek (2), Isabelle Alice Dyrek (3), Aleksander L. Sieroń (1), Elżbieta Marszał (2) (1) Katedra i Zakład Biologii Ogólnej, Molekularnej i Genetyki ŚlAM (2) Klinika Neurologii Wieku Rozwojowego ŚlAM (3) Oddział Anestezjologii i Intensywnej Terapii Dzieci ŚlAM Zespół Wildervanck’a (Cervico-Oculo-Acoustic Syndrome, MIM 314600) to uwarunkowany genetycznie zespół zaburzeń, na który składają się: anomalia Klippela Feil`a, Duane`a oraz wrodzona głuchota. Etiologia i patogeneza zespołu jest dotychczas nieznana. Z uwagi na występowanie powyższego zaburzenia prawie wyłącznie u płci żeńskiej, przyjmuje się dziedziczenie dominujące, sprzężone z chromosomem X i letalnością hemizygotycznych płodów męskich. Prezentujemy 3-letniego chłopca z pełną ekspresją zespołu Wildervanck`a. U dziecka stwierdzono – obustronną głuchotę, anomalię Klippel-Feil`a, zez zbieżny oka lewego z anomalią Duane`a, asymetrię twarzy (niedorozwój lewej połowy), wyrośla przeduszne po stronie lewej (usunięte operacyjnie w 12 mż), przymusowe ustawienie głowy, krótka, płetwista szyja z niską linią owłosienia. Badaniem neurologicznym i psychologicznym stwierdzono zaburzenia równowagi i nieznaczne opóźnienie rozwoju umysłowego. Wykonane rutynowe badanie cytogenetyczne chłopca wykazało prawidłowy męski kariotyp. Uwagę zwróciły nie opisywane dotychczas drobne odbarwienia i na lewym udzie pojedyncza zmiana typu kawy z mlekiem. W wywiadzie rodzinnym ze strony ojca stwierdzono heterochromię u dziadka probanta, wiele przypadków choroby Hirschsprunga, po jednym głuchoty oraz cukrzycy typu II. Ze strony matki u babci probanta stwierdzano głuchotę na przypuszczalnym pozapalnym tle. Biorąc pod uwagę całokształt obrazu klinicznego narzuca się spostrzeżenie powiązania powyższych cech z zespołem Waardenburg – Shah, uwarunkowanego defektem w genie endoteliny 3 (*131242) / receptora endoteliny typu 3 DNRB – *131244). 66 Genetyka człowieka P65. Rzadki przypadek częściowej trisomii ramion krótkich chromosomu 12 u dziecka z licznymi cechami dysmorficznymi. Ryszard Ślęzak, Izabela Łaczmańska, Halina Busza, Halina Czemarmazowicz Zakład Genetyki Akademii Medycznej we Wrocławiu, Kierownik: Prof. dr hab. Maria Sąsiadek Izolowana trisomia ramion krótkich chromosomu 12 jest schorzeniem rzadko opisywanym w literaturze medycznej. W obrazie klinicznym zwykle dominują objawy ciężkiego upośledzenia czynności ruchowych z uogólnioną hipotonią, upośledzenie umysłowe i charakterystyczny wygląd twarzy. W pracy przedstawiamy powstały “de novo” przypadek mozaikowej postaci trisomii ramienia krótkiego chromosomu 12, powstałej w wyniku translokacji 12p na ramię krótkie chromosomu 5. W badaniu klinicznym dziecka stwierdzono opóźnienie rozwoju ruchowego z hipotonią mięśniową, cechy dysmorficzne (hiperteloryzm, płaski profil okrągłej twarzy z wystającymi guzami czołowymi, niska nasada nosa, krótki nosek, usta z wydatna wargą dolną, kąciki ust skierowane ku dołowi, niewielki niedorozwój żuchwy, krótka szyja). Badanie cytogenetyczne wykonano z limfocytów krwi obwodowej przy użyciu standardowych metod i barwienia GTG. Badanie wykazało obecność dwóch linii komórkowychwej jednej prawidłowej, drugiej z obecnością naddatku na ramieniu krótkim chromosomu pary 5. Badania cytogenetyczne rodziców nie wykazały żadnych zmian w zakresie składu i budowy chromosomów. Badania metodą FISH wykonano przy użyciu zestawu sond malujących dla wszystkich chromosomów (Multiprobe Octachrome firmy Cytocell) a następnie zestawu sond telomerowych (Chromoprobe Multiprobe-T System firmy Cytocell). Badania te wykazały, że dodatkowy fragment na ramieniu krótkim chromosomu 5 pochodzi z ramienia krótkiego chromosomu 12. Badania sekwencji telomerowych wykazały, że translokacja dystalnej części ramienia krótkiego chromosomu pary 12 na ramię krótkie chromosomu 5 wystąpiła bez utraty materiału chromosomu 5. P66. Kompleksowe przegrupowanie chromosomowe u dziecka z wadą serca, mikrosomią i opóźnionym rozwojem psycho-ruchowym. Magdalena Białecka, A. Gutkowska, K. Spodar, M. Krajewska-Walasek Zakład Genetyki Medycznej, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Al. Dzieci Polskich 20, 04-730 Warszawa 9-miesięczny chłopiec M.U. ze zwężeniem i niedomykalnością zastawki aortalnej, niedoborem masy ciała i wzrostu, opóźnieniem rozwoju psychoruchowego, hipotonią mięśniową i zaburzeniami gospodarki wapniowo-fosforanowej został skierowany do Poradni Genetycznej z podejrzeniem zespołu Williamsa. W badaniu przedmiotowym stwierdzono następujące cechy dysmorfii twarzy: wydatne guzy czołowe, długi nos, małą żuchwę i wysokie podniebienie. � Dziecko z nieobciążonym wywiadem rodzinnym, urodzone z ciąży pierwszej, powikłanej zagrażającym poronieniem i niedoczynnością tarczycy u matki, z rodziców w wieku: matka 31 lat, ojciec 32 lata. Chłopiec urodził się w 42 tygodniu ciąży z cechami infekcji wewnątrzmacicznej, z wagą 4100g i długością 60 cm, oceniony został na 10 pkt Apgar. W pierwszym tygodniu życia stwierdzono fizjologiczny spadek masy ciała. Obecnie mimo dużego apetytu obserwuje się słaby przyrost masy ciała. Pomiary antropometryczne wykazały masę ciała poniżej 3 centyla i wysokość na poziomie 10 centyla. Obserwuje się opóźnienie rozwoju ruchowego. Badanie metodą FISH z zastosowaniem sondy unikalnej ELN wykazało obecność sygnałów w obu chromosomach 7, co wykluczyło postawioną wcześniej diagnozę zespołu Williamsa. Analiza kariotypu u pacjenta M.U. wykazała obecność trzech nieprawidłowych chromosomów tzn. del(4), add(5) i add(9). Przy pomocy metody FISH z zastosowaniem sond malujących (WCP) zlokalizowano przegrupowane fragmenty. Ostatecznie zmiany te oceniono jako przykład CCR (Complex chromosomal rearrangement) – kompleksowego przegrupowania chromosomowego i zapisano jako translokację trzech chromosomów: 46,XY,der(9)t(4;5;9)(4pter->4q28:;5pter-> 5q33::9q22->9qter;9pter->9q22::4q28->4qter::5q28->5qter Kariotypy rodziców są prawidłowe. Pomimo zastosowania metod cytogenetyki klasycznej i molekularnej, trudno stwierdzić jednoznacznie czy mamy do czynienia z translokacją zrównoważoną. Ze względu na obserwowane nieprawidłowości fenotypowe u dziecka, sugerujące niezrównoważony kariotyp, planujemy poszerzenie badań. 67 Genetyka człowieka P67. Wstępna analiza ilościowa cech fenotypu morfologicznego w zespole monosomii 5p. Renata Posmyk (1), B. Panasiuk (1), Latos-Bieleńska (2), Wolnik-Brzozowska (2), M. Piotrowicz (3) , V. Kucinskas (4), O. Haus (5), L. Korniszewski (6), B. Kozak-Klonowska (7), A. Jakubiuk-Tomaszuk (1), A. T. Midro (1) 1. Zakład Genetyki Klinicznej Akademii Medyczne, Białystok 2. Katedra i Zakład Genetyki Medycznej AM, Poznań 3. Zakład Genetyki ICZMP, Łódź 4. Zmogaus Genetikos Centras, Vilnius, Lietuva 5. Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej AM, Bydgoszcz 6. Klinika Diabetologii Dziecięcej i Wad Wrodzonych AM, Warszawa 7. Poradnia Genetyczna, Świętokrzyski Ośrodek Onkologiczny, Kielce Zespół monosomii 5p („krzyku kociego”) (OMIM#123450) należy do klasycznych zespołów wywołanych aberracjami chromosomowymi, który cechuje występowanie charakterystycznych cech dysmorficznych twarzy oraz zaburzenie rozwoju psychoruchowego. Spektrum opisywanych cech dysmorficznych i wad rozwojowych jest szerokie, lecz dotychczas nie podejmowano analizy ilościowej cech fenotypu morfologicznego za pomocą jednorodnego, usystematyzowanego protokółu cech. Celem pracy jest określenie, które z cech fenotypu morfologicznego wykazują powtarzalność niezależnie od wieku i wielkości utraconego materiału chromosomowego. Materiał do badań stanowiła grupa 22 dzieci w wieku od 1 miesiąca do 18 lat z monosomią 5p (prosta delecja terminalna) potwierdzoną klasycznym badaniem cytogenetycznym z zastosowaniem technik prążkowych o rozdzielczości 550 prążków. Do badań wykorzystano katalog 807 cech morfologicznych i klinicznych z bazy danych MDDB opracowanych przez Stengel-Rutkowski. Stwierdzono, że z częstością powyżej 50% cech występują 44 cechy, co stanowi (ok. 5% cech ujętych w katalogu). Do nich należą: 15 cech anamnestycznych oraz 29 cech klinicznych, z których najczęstsze to: niski wzrost, niska masa ciała, małogłowie, szeroko rozstawione i skośnie w górę skierowane szpary powiekowe, zmarszczka nakątna, krótkie philtrum, zgryz otwarty, wysokie, wąskie podniebienie. Wyniki porównano z historią naturalną pacjentki z monosomii 5p pozostającej pod naszą obserwacją przez okres18 lat. Proponowane spektrum cech może być przydatne w klinicznym rozpoznawaniu fenotypu morfologicznego monosomii 5p oraz do tworzenia ekspertowych baz danych do wspomagania diagnozowania tego zespołu przy użyciu oprogramowania komputerowego. P68. Wewnątrzrodzinna zmienność ekspresji cech fenotypu morfologicznego w zespole BOF (Branchio-Oculo-Facial syndrome) (skrzelowo-oczno-twarzowym). Anna Jakubiuk-Tomaszuk (1), E. Hubert (2) , R. Posmyk (1), A. T. Midro (1) (1) Zakład Genetyki Klinicznej AM, Białystok (2) Klinika Chirurgii Szczękowo-Twarzowej AM, Białystok Zespół skrzelowo-oczno-twarzowy (BOF, Branchio-oculo-facial syndrome) (OMIM # 113620) jest rzadkim, wyodrębnionym stosunkowo niedawno (1982r) zespołem z przedwczesnym starzeniem się i z różnorodną ekspresją cech w zakresie oczu, uszu i układu stomatognatycznego. Dotychczas opisano około 50 przypadków, w tym tylko siedem form rodzinnych. Zakres zmienności ekspresji wewnątrzrodzinnej jest więc mało poznany. Celem pracy jest prezentacja fenotypu morfologicznego 6-letniej dziewczynki i jej ojca. U obydwojga stwierdzono: krótki grzbiet nosa z szerokim, skierowanym do dołu wierzchołkiem nosa, krótki odstęp nosowo-wargowy, zgrubiałe kolumny philtrum, rozszczep podniebienia twardego, zdeformowane, nisko osadzone, małe, zrotowane do tyłu małżowiny uszy, klinodaktylię 5 palców dłoni, skórną syndaktylię 2–3 palców stóp. Ponadto u dziewczynki zwracały uwagę: niedobór masy ciała i wzrostu, małogłowie, wydatny szew czołowy, rzadkie, nierównomierne owłosienie głowy (niedobór w okolicy skroniowej), obustronne blizny po przetokach skrzelowych w okolicy szyi poniżej małżowin usznych, szczelina tęczówki, niedrożny kanalik łzowy oka lewego, skórną syndaktylię 2-3 palców stóp. U ojca stwierdzono przedwczesne siwienie. Na tej podstawie rozpoznano zespół BOF ze zmienną ekspresją cech u obydwojga badanych. Dane rodzinne wskazują, że u dziadka wystąpił rozszczep wargi i podniebienia, co łącznie sugeruje autosomalny dominujący sposób dziedziczenia zespołu. 68 Genetyka człowieka P69. Zespół TAR (Thrombocytopenia – absent radius): opis przypadku z agenezją ciała modzelowatego, hipoplazją robaka móżdżku i nerką podkowiastą. Agata Skórka (1), Lech Korniszewski (1), Jolanta Bielicka-Cymermann (2) (1) Klinika Diabetologii, Patologii Noworodka i Wad Wrodzonych Akademii Medycznej w Warszawie (2) Oddział Neurologii i Epileptologii Warszawskiego Szpitala dla Dzieci, Warszawa, ul. Kopernika Zespół TAR, thrombocytopenia – absent radius syndrome (MIM 274000) jest zespołem wad wrodzonych, w którym stwierdza się obustronny brak kości promieniowej z zachowanymi kciukami oraz trombocytopenię ze znacznie zmniejszoną liczbą megakariocytów w szpiku lub ich brakiem. U części pacjentów występują dodatkowo wady serca oraz inne anomalie układu kostnego, ale dopiero w ostatnich latach ukazały się pojedyncze doniesienia o występowaniu wad ośrodkowego układu nerwowego i wad nerek. Częstość upośledzenia umysłowego w zespole TAR ocenia się na 7% i zwykle jest ono skutkiem krwawienia do ośrodkowego układu nerwowego. Okres noworodkowy i niemowlęcy, zwykle powikłany jest epizodami krwawień z powodu małopłytkowości i epizodami ostrych biegunek; objawy te nasilają się w związku z częstą u tych dzieci alergią na białka mleka krowiego. W 1994 roku po raz pierwszy opisano dziewczynkę z zespołem TAR i agenezją robaka móżdżku oraz ciała modzelowatego a w roku 2003 kolejnego pacjenta z dysgenezją (?) móżdżku. W ostatnich latach opisano również występowanie u 3 pacjentów z tym zespołem nerki podkowiastej. Przedstawiamy 3 letnią dziewczynkę z zespołem TAR, ciężkim upośledzeniem rozwoju psychoruchowego, całkowitą agenezją ciała modzelowatego, niedorozwojem robaka móżdżku i nerką podkowiastą. Jest to pierwszy przypadek, w którym stwierdzono występowanie anomalii OUN oraz nerki podkowiastej u jednego pacjenta z zespołem TAR. P70. Aplazja kości strzałkowej z ektrodaktylią Dorota Gieruszczak-Białek, A. Skórka, J. Waligóra, M. Ołdak, L. Korniszewski Klinika Diabetologii, Patologii Noworodka i Wad Wrodzonych Akademia Medyczna w Warszawie Aplazja kości strzałkowej z ektrodaktylią jest rzadko występującym zaburzeniem, o ograniczonej penetracji i zmiennym fenotypie. Dziedziczy się w sposób autosomalny dominujący, często występuje sporadycznie. Do tej pory, w piśmiennictwie zostało opisanych 47 rodzinnych i sporadycznych przypadków. Przedstawiamy nowy przypadek aplazji kości strzałkowej z ektrodaktylią i porównujemy z innymi opisanymi w literaturze. Nasza pacjentka jest pierwszym dzieckiem zdrowych, młodych, niespokrewnionych rodziców. Urodziła się w 34 Hbd z masą ciała 2080g i długością 44 cm. Po urodzeniu stwierdzono skrócenie i łukowate wygięcie prawego przedramienia, skrócenie podudzi, oligodakytlię rąk i stóp, syndaktylię prawej ręki. Rtg prawego przedramienia wykazał skrócenie kości łokciowej, ścienczenie i wygięcie kości promieniowej. W badaniu rtg podudzi stwierdzono brak kości strzałkowej i ścieńczenie kości piszczelowej. Kariotyp prawidłowy 46 XX. Wywiad rodzinny jest negatywny, co ma istotne znaczenia dla różnicowania sporadycznego i rodzinnego wstępowania aplazji kości strzałkowej z ektrodaktylią. P71. Zespół Walker-Warburg u noworodka. Jarosław Waligóra (1), Elżbieta Lipska (1), Dorota Gieruszczak-Białek (1), Monika Ołdak (1), Agata Skórka (1), Lech Korniszewski (1), Anna Kamińska (2) (1) Klinika Diabetologii, Patologii Noworodka i Wad Wrodzonych Akademii Medycznej w Warszawie (2) Klinika Neurologii Akademii Medycznej w Warszawie Zespół Walker-Warburg (MIM 236670) jest rzadką, letalną chorobą genetyczną należącą do wrodzonych dystrofii mięśniowych skojarzonych z wadami OUN. W grupie tej znajdują się również dwa inne genetycznie uwarunkowane zespoły: Wrodzona dystrofia mięśniowa Fukuyamy (FCMD) oraz Muscle-eye-brain disease (MEB). Zespół WalkerWarburg jest chorobą heterogenną pod względem etiologii. Do tej pory zmapowane zostały, co najmniej trzy lokus genowe a jeden z genów został sklonowany. Mutacje w genie POMT1 zlokalizowanym na 9q34.1 są odpowiedzialne za około 20% wszystkich przypadków zespołu. W naszej pracy przedstawiamy przypadek zespołu Walker-Warburg u noworodka. Dziecko ur z C3, P3 w 41 hbd, PSN, 1-2-4-7 Apgar z masą ciała 2780g. W badaniu przedmiotowym stwierdzono: uogólnioną hipotonię mięśniową, przepuklinę oponowo-mózgową w okolicy ciemienia tylnego, gotyckie podniebienie, nakładanie drugiego palca na trzeci u stóp. W badaniu OUN rezonansem magnetycznym wykazano całkowity brak zakrętów i bruzd między zakrętami kory mózgowej o typie agyrii, hipoplastyczne ciało modzelowate, poszerzenie komór bocznych mózgu, wadę rozwojową móżdżku oraz przepuklinę oponowo-mózgową w okolicy potylicznej. Obraz MR odpowiada wadzie rozwojowej typu 69 Genetyka człowieka lisencefalii typ II. W badaniu oczu stwierdzono obustronną jaskrę z anomalią Petersa i zmętnieniem. W badaniach dodatkowych wykazano znaczny wzrost CPK > 20000U/l. Biopsja mięśnia potwierdziła rozpoznanie dystrofii mięśniowej.� Na podstawie powyższych objawów rozpoznano zespół Walker-Warburg. W pracy omówiono objawy kliniczne oraz diagnostykę różnicową. P72. Translokacja pomiędzy chromosomem 7 i 16 u dziecka z zespołem wad. Jarosław Waligóra (1), Zofia Konarska (1), Joanna Brycz-Witkowska (2), Halina Stańczak (3), � Dorota Gieruszczak-Białek (1), Agata Skórka (1), Monika Ołdak (1), Lech Korniszewski (1) (1) Klinika Diabetologii, Patologii Noworodka i Wad Wrodzonych Akakdemii Medycznej w Warszawie (2) Zakładu Anatomii Patologicznej, Pracownia Cytogenetyczna, Akademia Medyczna w Warszawie (3) Zakład Patomorfologii Wieku Rozwojowego, Pracownia Cytogenetyczna, Samodzielny Publiczny Dziecięcy Szpital Kliniczny w Warszawie Przedstawiono przypadek zespołu wad wrodzonych u dziecka z niezrównoważoną translokacją 7;16. Niemowlę płci żeńskiej, CII, PI (I ciąża obumarła w 9 Hbd) ur. w 38 Hbd, PSN, położenie miednicowe płodu, masa ur.1400g/ 41cm, obw. głowy 24 cm, kl.p.26 cm, 3-7-8 pkt w skali Apgar. W badaniu fizykalnym stwierdzono cechy dysmorfii: małogłowie, rozszczep wargi i podniebienia z hiperteloryzmem i fenotypem holoprozencefalii, nakładanie palców dłoni. W badaniu USG ośrodkowego układu nerwowego potwierdzono obecność holoprosencephalii z brakami przegrody międzykomorowej oraz wodogłowie dwukomorowe. W wykonywanym ECHO serca stwierdzono VSD oraz zwężenie zastawki tętnicy płucnej. Kariotyp wykazał aberację chromosomową 46XX, der(7) t(7;16) (q32.3;q22.1). Kariotyp ojca – zrównoważoną translokację wzajemną pomiędzy długimi ramionami chromosomów 7 i 16 pary (46 XY, t(7;16) (q32.3;q22,1)). Wynik badania u dziecka i ojca został potwierdzony FISH z sondami malującymi dla 7 i 16 pary chromosomów. Monosomia części długiego ramienia chromosomu 7 i trisomia części długiego ramienia chromosomu 16 pary są odpowiedzialne za obawy zespołu wad u przedstawianego pacjenta. Holoprosencephalia jest najprawdopodobniej wynikiem utraty jednego allelu genu SHH na 7q36, którego mutacje powodują izolowaną postać tej wady. W pracy przedstawiono porównanie fenotypu opisanego pacjenta z opisanymi w literaturze pacjentami z delecją części długiego ramienia chromosomu 7 i duplikacją części długiego ramienia chromosomu 16 pary. P73. Cytogenetyczno-molekularna oraz kliniczna charakterystyka dwóch nowych przypadków neocentrycznych chromosomów markerowych w NMCs. Maria Constantinou, Iwona Płowaś, Bogdan Kałużewski Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, 91-425 Łódź, ul. Sterlinga 1/3 Chromosomy markerowe, które wykazują obecność centromerów, bez sekwencji alfa-satelitarnego DNA reprezentują interesującą grupę nieprawidłowych strukturalnie chromosomów. W/w markery nie dają pozytywnych sygnałów po hybrydyzacji z odpowiednimi sondami centromerowymi i są w literaturze opisywane jako neocentryczne chromosomy markerowewejNMCs. Uważa się, że stabilność mitotyczna NMCs jest związana z powstaniem neocentromeru w predysponowanych do takich rearanżacji regionach chromosomowych. Prezentujemy kliniczną i molekularną charakterystykę dwóch przypadków NMCs. W obydwu przypadkach technika FISH z sondą pancentromerową nie wykazała obecności sekwencji alfa-satelitarnego DNA w obrębie NMCs. W przypadku 1, diagnozowanym prenatalnie, technika CGH pozwoliła na stwierdzenie, że NMC pochodzi z chromosomu 1 i obejmuje dwa prążki 1q21 i 1q22. W 24 hbd stwierdzono wewnątrzmaciczną atrofię płodu z nieznacznymi cechami opóźnienia rozwoju płodu. Po autopsji potwierdzono atrofię u dziecka. Jednakże wrodzonych wad rozwojowych nie stwierdzono. Przypadek 2 trafił do Poradni Genetyki z wstępnym rozpoznaniem klinicznym zespołu Klinefeltera. Dodatkowo stwierdzono przyspieszony w stosunku do wieku rozwój fizykalny, otyłość oraz nieliczne cechy dysmorfii w obrębie twarzoczaszki. Zastosowanie sond malujących dla chromosomów X i Y wykluczyło gonosomalne pochodzenie NMC. Technika CGH umożliwiła stwierdzenie, że NMC obejmuje jeden prążek – 15q22 z ramienia długiego chromosomu 15. Dodatkowo zastosowanie techniki FISH z sondą specyficzną dla lokus PML (15q22) potwierdziło obecność tego lokus w obrębie NMC. W obydwu przypadkach pochodzenie chromosomowe NMCs potwierdzono przy użyciu techniki M-FISH. Prezentowane chromosomy markerowe są jednymi z najmniejszych NMCs opisanych w literaturze. Dodatkowo przypadek 2 jest pierwszym przypadkiem NMC pochodzącym z chromosomu 15 z takimi puktami złamań chromosomowych. 70 Genetyka człowieka P74. Zespół fenyloketonurii matczynej w diagnostyce małogłowia i upośledzenia umysłowego. Ewa Starostecka (1), Agata Lange (1), Małgorzata Piotrowicz (2), Jarosława Przygocka (3) (1) Poradnia Zaburzeń Metabolicznych, Specjalistyczna Przychodnia Pediatryczna, Instytut „Centrum Zdrowia Matki Polki” w Łodzi 93-338 Łódź, ul.Rzgowska 281/289 (2) Zakład Genetyki Instytutu „Centrum Zdrowia Matki Polki” (3) Samodzielna Pracownia Psychologii Klinicznej Instytutu „Centrum Zdrowia Matki Polki” Fenyloketonuria (PKU) jest jedną z najczęstszych chorób metabolicznych. W Polsce rozpoznawana jest u 1: 8500 nowonarodzonych. Badania przesiewowe wszystkich noworodków, wczesne rozpoznanie i leczenie umożliwiają prawidłowy rozwój umysłowy chorych dzieci. Problemem pozostaje nadal populacja chorych kobiet urodzonych przed wprowadzeniem badań przesiewowych w kierunku PKU. Niektóre z nich mimo braku leczenia, osiągają zbliżony do normy rozwój intelektualny. Dzieci urodzone przez te matki demonstrują objawy zespołu fenyloketonurii matczynej tj. małogłowie, dysmorfię, inne wady wrodzone, opóźnienie rozwoju psychoruchowego będące wynikiem teratogennego działania fenyloalaniny na płód. W pracy przedstawiamy 6 dzieci w wieku od 3–13 lat pochodzących z 3 rodzin. Dzieci te były diagnozowane z powodu małogłowia i upośledzenia rozwoju umysłowego, IQ – średnio 56. Wielokierunkowa diagnostyka tych pacjentów nie pozwoliła na ustalenie przyczyny małogłowia. Ponownie zebrany wywiad rodzinny,a przede wszystkim analiza rozwoju intelektualnego matek nasunęły podejrzenie zespołu fenyloketonurii matczynej, co zostało potwierdzone badaniami biochemicznymi (stężenie fenyloalaniny u matek wynosiło 21,8 – 25,3 mg/dl). Dzieci objęto stałą opieką wielospecjalistyczną (psycholog, kardiolog, nefrolog, neurolog) z uwagi na stwierdzane wady wrodzone. Wdrożona stymulacja rozwoju nie przynosi niestety poprawy w zakresie rozwoju umysłowego. W diagnostyce małogłowia, zwłaszcza współwystępującego rodzinnie należy brać pod uwagę nierozpoznaną fenyloketonurię matczyną. Nie wykrycie tego zespołu u pierwszego dziecka skutkuje urodzeniem przez chorą matkę kolejnych upośledzonych dzieci. O aktualności problemu może świadczyć kolejna, będąca w trakcie diagnostyki rodzina, w której rozpoznanie PKU u matki postawiono diagnozując najmłodsze upośledzone dziecko P75. Submikroskopowa delecja 1qter u chłopca z wybitną dysmorfią twarzoczaszki i opóźnieniem rozwoju psychoruchowego znacznego stopnia. Anna Gutkowska, K. Spodar, A. Marczak, B. Goryluk-Kozakiewicz, M. Krajewska-Walasek Zakład Genetyki Medycznej, Instytut-Pomnik „Centrum Zdrowia Dziecka” Pacjenci z delecją 1q (q42 albo q43-gter) rozpoznaną za pomocą klasycznej analizy chromosomów, mają na tyle charakterystyczny fenotyp, że doświadczony dysmorfolog na podstawie wyglądu dziecka i występujących anomalii może przepowiedzieć tę aberrację przed wykonaniem badania cytogenetycznego. Podczas gdy duże delecje 1q stwierdzane są stosunkowo często (opisano ponad 30 przypadków), opublikowano tylko 2 przypadki mikrodelecji tego regionu. Prezentujemy chłopca z częściową trisomią dystalnego regionu 3p i submikroskopową dystalną delecją 1q. U chłopca z ciąży trzeciej, porodu drugiego o czasie (z CI PI zdrowy syn, ciąża II zakończyła się wczesnym poronieniem samoistnym), zakończonego cięciem cesarskim z powodu wahania tętna płodu, po urodzeniu stwierdzono: hipotrofię (waga 2280 g, długość 48 cm, obwód głowy 32 cm), dysmorfię twarzoczaszki, wnętrostwo, koślawą prawą stopę oraz obustronne zwichnięcie stawów biodrowych. Wykonane badanie cytogenetyczne wykazało prawidłowy kariotyp męski. Dziecko w wieku 3 lat zostało skierowane do Poradni Genetycznej IP-CZD. U dziecka z głębokim niedoborem masy ciała i wzrostu (poniżej – 3 SD) oraz małogłowiem (– 5 SD) stwierdzono: trigonocefalię z wyraźnie zaznaczonym grzebieniem kości czołowej, głęboko i mongoidalnie ustawione szpary powiekowe, zmarszczki nakątne, szeroki i płaski grzbiet nosa, wydatne prolabium oraz cofniętą żuchwę. Ponadto obserwowano bruzdę poprzeczną lewej ręki, zachodzące na siebie palce stóp, obustronne wnętrostwo i hipoplastyczne zewnętrzne narządy płciowe. U pacjenta występowało znaczne opóźnienie rozwoju psychoruchowego, w wieku 3 lat zaczynał samodzielnie siadać. Analiza rodowodu ujawniła występowanie licznych przypadków upośledzenia rozwoju w rodzinie ojca probanda (u dwóch braci ojca oraz 5 osób spośród jego ciotecznego rodzeństwa). Wykonane badanie za pomocą techniki FISH z zestawem sond subtelomerowych wykazało brak sygnału z regionu (jednego) 1qter. Badania rodziców pozwoliły na ustalenie, że zmiana u dziecka jest efektem translokacji zrównoważonej u ojca, w której uczestniczą dystalne regiony 1q i 3p. Kariotyp dziecka: 46,XY,der( 1)t(1;3)(q44;p25)pat, wskazuje na monosomię subtelomerowego regionu 1q oraz trisomię subtelomerowego regionu 3p. Analiza fenotypowa i cytogenetyczna pozostałych członków tej rodziny być może pozwoli nam odpowiedzieć na pytanie, 71 Genetyka człowieka czy istotnie fenotyp delecji 1qter, podobnie jak to obserwuje się w niektórych mikrodelecjach, jest na tyle specyficzny, że może zasugerować ten defekt. P76. Zespół Walcott – Rallison u dziewczynki z mozaikową delecją(15)(q11-12). Stanisław Zajączek (1), Elżbieta Petriczko (2), Mieczysław Walczak (2), Łukasz Kołodziej (3), Krystyna Lisiecka (4) (1) Zakład Genetyki i Patomorfologii Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie (2) II Klinika Chorob Dzieci, (3) Katedra i Klinika Ortopedii Dziecięcej, (4) Zakład Stomatologii DziecięcejPomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie WRS jest bardzo rzadką dysplazją nasadową z towarzyszącym zespołem dysmorficznym, opóźnieniem PNR i cukrzycą typu I; jest on warunkowany AR mutacją genu czynnika inicjacji EIF2AK3 a gen jest zlokalizowany w 2p12. Czynnik ten posiada przynajmniej cztery białka regulacyjne o nieznanej lokalizacji genowej. Przedstawiono 5-letnie obserwacje 19 letniej pacjentki u której rozpoznano ostatnio, na podstawie typowych anomalii kostnych i uzębienia, cech dysmorficznych, zaburzeń gospodarki węglowodanowej i opóźnienia PNR WRS.� U dziewczynki stwierdzono początkowo delecję mos46,XX,del(15)(q11-12)/46,XX –25% vs.75% a diagnostyke prowadzono w kierunku WPS lub bloku sterydów nadnerczowych. Jednakże badania techniką FISH (Doc.Dr Ewa Bocian, Zakład Genetyki IMID) z trzech badanych markerów regionu WP(D15S11,SNRPN i D15S10) potwierdziły delecję jedynie dla sondy SNRPN a zatem delecja znajduje się powyżej rejonu WPS. Opisano dotąd zaledwie jeden przypadek WRS z delecją mozaikową 15q11-12 w 65 % metafaz (Stewart F.J.Clin.Genet, 1996,49,152-153) i o znacznie cięższym przebiegu. Można zatem przypuszczać,że w rejonie tym zlokalizowany jest gen jednego z białek regulacyjnych dla EIF2AK3 – właściwego genu WRS. P77. Terminalna delecja (4)(q32) u dziewczynki z cechami fenotypowymi odpowiadającymi CATCH 22. Tatiana Chilarska (1), Agnieszka Potrzebowska (1), Wanda Hawuła (1), Anna Ulańska (1), Katarzyna Ostrowska (2), Małgorzata Piotrowicz (1), Lucjusz Jakubowski (1) (1) Zakład Genetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi (2) Klinika Kardiologii Instytutu CZMP w Łodzi Delecje terminalne ramion długich chromosomu 4 (4q) od poziomu prążka 4q31 wiążą się ze zmiennym obrazem fenotypowym, obejmującym opóźnienie rozwoju umysłowego, rozszczep podniebienia, wady serca, nieprawidłowości / anomalie w obrębie kończyn oraz charakterystyczne cechy dysmorfii. � Delecje obejmujące odcinki położone dystalnie od prążka 4q32 są rzadsze i wiążące się z nimi cechy fenotypowe są mniej charakterystyczne. Towarzyszy im łagodniejsze także opóźnienie rozwoju umysłowego. Opisano 15-letnią pacjentkę skierowaną do Poradni Genetycznej z wrodzoną wadą serca (PS + RVOTO + VSD), rozszczepem podniebienia (z towarzyszącymi problemami w żywieniu), mową nosową, nieznacznym niedosłuchem, cechami dysmorficznymi w obrębie twarzoczaszki, klinodaktylią V palca obu rąk oraz upośledzeniem umysłowym w stopniu umiarkowanym. W wywiadzie odnotowano także częste infekcje. Podjęto decyzję o badaniu kariotypu, gdyż niektóre cechy mogły odpowiadać zespołowi CATCH22 i konieczne było postępowanie różnicujące w tym kierunku. W rutynowym badaniu cytogenetycznym rozpoznano kariotyp 46,XX,del(4)(q32). Nie potwierdzono współistnienia delecji w obrębie regionu krytycznego dla CATCH 22 po zastosowaniu sondy dla lokus D22S75. Porównano i poddano dyskusji podobieństwa i różnice w obrazie fenotypowym pacjentki w stosunku do innych chorych opisanych w literaturze. 72 Genetyka człowieka P78. Trisomia chromosomu 8 w kariotypie mozaikowym u 7-letniego chłopca. Małgorzata Piotrowicz (1), Tatiana Chilarska (2), Anna Ulańska (1), Tadeusz Biegański (2), Renata Stawerska (3), Barbara Wiśniewska (4), Lucjusz Jakubowski (1) (1) Zakład Genetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi (2) Zakład Diagnostyki Obrazowej (3) Klinika Endokrynologii I CZMP w Łodzi (4) Poradnia Psychologiczna Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi Trisomię chromosomu 8 opisano po raz pierwszy w roku 1971. Większość jej przypadków rozpoznano w kariotypie mozaikowym. Forma niemozaikowa jest zwykle letalna. Częstość występowania trisomii chromosomu 8 ocenia się na 1:25000 do 1:50000 urodzeń z przewagą płci męskiej (5:1). Obserwowano, że w kariotypach mozaikowych linia komórkowa z tą trisomią ma tendencję do zanikania z limfocytów krwi obwodowej wraz z wiekiem. U starszych pacjentów może być widoczna jedynie w kariotypie fibroblastów skóry. Charakterystyczne dla tej aberracji cechy fenotypowe opisał po raz pierwszy Pfeiffer w 1977 roku. Najczęściej obserwuje się długą, wąską twarz, płetwistość szyi, wady układu kostno-stawowego i wady nerek, a rozwój umysłowy jest opóźniony w stopniu lekkim lub umiarkowanym. Przeżywalność pacjentów z formą mozaikową trisomii 8 nie odbiega od przeciętnej dla populacji. Przedstawiono przypadek 7-letniego chłopca urodzonego o czasie, siłami natury, z CIII, PIII, z masą urodzeniową 3350g, w stanie ocenionym w skali Apgar na 9 punktów. Dziecko skierowano do Poradni Genetycznej ze względu na dysproporcje w budowie ciała, nieznacznie opóźniony rozwój psychoruchowy oraz obserwowane przymglenie rogówki oka lewego. Stwierdzano ponadto cechy dysmorfii twarzy, wadę klatki piersiowej, młotkowatość palców stóp oraz wnętrostwo prawostronne. W rentgenogramach kośćca stwierdzono osteopenię, poszerzenie przynasad kości długich ze stosunkowo cienkimi trzonami, hipoplastyczne rzepki, liczne anomalie kości stóp, hipoplazję panewki stawu ramiennego, zmniejszenie wymiaru poprzecznego klatki piersiowej i szerokie żebra. Ogólną sprawność intelektualną chłopca oceniono na pogranicze rozwoju prawidłowego z wyraźnie jednak opóźnionym rozwojem mowy czynnej. W toku diagnostyki cytogenetycznej rozpoznano u pacjenta kariotyp 47,XY,+8[8]/46,XY[42]. Opisywane cechy fenotypu korelują z innymi przypadkami tego typu. P79. Trudności diagnostyczne u 5-letniej dziewczynki z cechami dysmorfii, makrocefalią, zespołem Chiarii I, szczeliną tęczówki, hypotonią i opóźnieniem rozwoju. Małgorzata Piotrowicz (1), Tatiana Chilarska (1), Agata Lange (2), Emilia Nowosławska (3), Danuta Łosowska-Kaniewska (4), Barbara Wiśniewska (5), Lucjusz Jakubowski (1) (1) Zakład Genetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki (2) Poradnia Metaboliczna I CZMP (3) Klinika Neurochirurgii, I CZMP (4) Zakład Diagnostyki Obrazowej I CZMP (5) Poradnia Psychologiczna Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi Zaprezentowano przypadek 5-letniej dziewczynki obserwowanej od okresu noworodkowego ze względu na stwierdzaną makrosomię, makrocefalię, hipotonię, szczelinę tęczówki oka lewego, cechy dysmorfii, nadmierne owłosienie, głębokie bruzdy podeszwowe i dłoniowe, głos o niskim brzmieniu oraz opóźnienie rozwoju psychoruchowego. Pacjentka jest drugim dzieckiem zdrowych, niespokrewnionych rodziców; ma zdrową, starszą siostrę. W pierwszych miesiącach życia obraz fenotypowy sugerował wykluczenie szeregu chorób metabolicznych, wrodzonej niedoczynności tarczycy oraz aberracji chromosomowych. Otrzymano wyniki prawidłowe. W 10 miesiącu życia obraz tomograficzny mózgowia oraz wynik badania RM pozwoliły na zdiagnozowanie obecności wodogłowia nadnamiotowego z radiologicznymi cechami zespołu Chiarii I. Po wszczepieniu zastawki komorowo-otrzewnowej oraz następowej kraniektomii podpotylicznej i laminektomii C1-C2 stan dziewczynki zaczął ulegać stopniowej poprawie. Nadal utrzymywała się jednak niewielka wiotkość, makrosomia i opóźnienie rozwoju psychoruchowego z dominującym opóźnieniem rozwoju mowy czynnej. Około 2 roku życia zaobserwowano niewielką hyperpigmentację skóry z pojedynczymi plamami odbarwieniowymi na skórze brzucha, a w 5 roku życia linijną plamę „cafe au lait” w obrębie skóry tułowia. W diagnostyce różnicowej uwzględniono: zespół Costello (MIM 218040), zespół Noonan (MIM 163950), hypomelanozę Ito (MIM 300337), zespół Weaver (MIM 277590), zespół Teebi (MIM 277590) oraz zespół makrocefalii z wrodzoną marmurkowatością i teleangiektatycznością skóry (macrocephaly-cutis marmorata teleangiectatica congenita syndrome; MIM 602501). 73 Genetyka człowieka P80. Mikrodelecja 22q11.2 [del(22q11.2)] u dzieci z wrodzonymi wadami serca. Bożenna Goryluk-Kozakiewicz, L. Ziółkowska, M. Czerwiecka, E. Sośnierz-Chmielińska, A. Gutkowska, M. Gajdulewicz, K. Chrzanowska, K. Spodar, W. Kawalec, M. Krajewska-Walasek Zakład Genetyki Medycznej, Klinika Kardiologii, Instytut-Pomnik „Centrum Zdrowia Dziecka” Del(22q11.2) występuje z częstością ok. 1 na 2000 w populacji generalnej i charakteryzuje się znaczną zmiennością objawów u poszczególnych pacjentów. Wśród objawów obserwuje się m.in. specyficzną dysmorfię twarzy, aplazję grasicy, hipoplazję przytarczyc, niedobory immunologiczne, nieprawidłowości w zakresie budowy i funkcji podniebienia i gardła, zaburzenia psychiczne oraz wiele innych objawów. Aż u 75% chorych z del(22q11.2) rozpoznaje się wadę/wady serca. Najczęściej są to wady rozwojowe serca i wielkich naczyń dotyczące podziału stożka i pnia naczyniowego. Szacuje się, że u dzieci z izolowaną wadą serca stożka i pnia naczyniowego del(22q11) występuje z częstością od 10-29%. Badaniami objęto grupę 300 dzieci w wieku 18 lat, u których stwierdzono występowanie różnych wrodzonych wad serca, w tym m.in. stożka i pnia naczyniowego, w formie izolowanej oraz współistniejących z dysmorfią twarzy i innymi anomaliami. Badania cytogenetyczne wykonano na limfocytach krwi obwodowej. Analizę kariotypów prowadzono wg metod standardowych, del(22q11.2) identyfikowano przy zastosowaniu techniki FISH. Stwierdzono występowanie del(22q11.2) u 16 dzieci (5,3% całej grupy badanej), w tym u jednego poza del(22q11.2) stwierdzono obecność dodatkowego chromosomu X [47,XXY.ish del(22)(q11.2q11.2)(D22S75-)]. U rodziców dzieci z del(22q11.2) identyczna zmiana została wykryta u 2 matek na 7 badanych dotychczas par rodzicielskich (28%). Ponadto w badanej grupie wykryto trzy aberracje chromosomowe powstałe de novo: 46,XY,t(1;13)(q42;q14); 47,XYY, 46,XX/47,XX,+mar, oraz jedną translokację niezrównoważoną [46,Y,der(X)t(5;X)(q33.2;p22.3)] pochodzenia matczynego. Wstępna analiza wyników wskazuje na istotny udział del(22q11.2) w powstawaniu wad wrodzonych serca. W przypadkach izolowanych wad stożka i pnia naczyniowego występuje rzadko (ok. 3%), natomiast jeśli wady te współistnieją z typową dysmorfią twarzy i/lub bez innych anomalii, delecja ta stwierdzana jest u ponad 40% takich chorych. W ponad 25% przypadków delecja występuje rodzinnie, a rodzic ją posiadający może nie wykazywać żadnych objawów klinicznych. Praca wykonana w ramach projektu KBN nr 0553/P05/2002/22 P81. Częściowa trisomia 4q i monosomia 9p u dziecka – opis przypadku. Anna Lauda-Świeciak (1), Danuta Kurylak (2), Ewa Duszeńko (3), Krystyna Soszyńska (1,3) (1) Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej AM w Bydgoszczy (2) Wojewódzki Szpital Dziecięcy w Bydgoszczy (3) Pracownia Cytogenetyczna, Katedra i Klinika Hematologii AM we Wrocławiu Nieprawidłowości chromosomowe stanowią znaczny odsetek chorób genetycznie uwarunkowanych. Niezrównoważone aberracje autosomalne są jedną z głównych przyczyn wad wrodzonych i upośledzenia umysłowego. Celem pracy była analiza korelacji zmian cytogenetycznych z fenotypem 5-miesięcznego niemowlęcia płci żeńskiej, skierowanego do Poradni Genetycznej z powodu cech dysmorficznych i zespołu wad wrodzonych. Dziewczynka ze środowiska wiejskiego, rodziców młodych, zdrowych, niespokrewnionych, urodzona w 40 Hbd z mc 2880g . W wywiadzie rodzinnym: rodzice dziecka przez 2 lata mieli trudności z poczęciem, u siostry ojca dziecka dwukrotnie nastąpiła utrata ciąży. W pierwszych godzinach po urodzeniu stwierdzono u dziecka cechy dysmorfii (mała, guzowata czaszka z wystającymi szwami, wąskie, krótkie szpary powiekowe, hipoplastyczny nos z niewykształconymi skrzydełkami, obustronnie przed małżowinami usznymi pozostałości łuków skrzelowych w postaci otworów, hipoplastyczne paznokcie, “małpia bruzda” na prawej dłoni, klinodaktylia dystalnych policzków V palców dłoni, czoło, boczne powierzchnie twarzy, ramiona, uda, pokryte krótkimi, czarnymi włoskami), obrzęki, wadę serca (koarktacja aorty, ubytek przegrody międzyprzedsionkowej typu ASD II, przetrwały przewód tętniczy) oraz drgawki, prawdopodobnie hipoglikemiczne. W trakcie dalszej diagnostyki rozpoznano niedoczynność tarczycy oraz obustronny refluks pęcherzowo-moczowodowy; napady hipoglikemii utrzymują się. Występujące cechy dysmorfii oraz zaobserwowane zaburzenia endokrynologiczne i neurologiczne są podobne do opisywanych w literaturze przypadków częściowej trisomii 4q. Badanie cytogenetyczne limfocytów krwi obwodowej wykonane techniką GTG oraz FISH z sondami WCP4 i WCP9 wykazało u dziecka obecność nieprawidłowego kariotypu 46,XX,der(9)t(4;9)(q21;p22), inv(9)(p12q12) z częściową trisomią ramienia długiego chromosomu4 i częściową monosomią ramienia krótkiego chromosomu 9. U matki dziecka stwierdzono kariotyp prawidłowy żeński z inwersją inv(9)(p12q12). Ojciec dziecka nie zgłosił się do Poradni Genetycznej 74 Genetyka człowieka P82. Trisomia translokacyjna ramion krótkich chromosomu 9 u dziewczynki z 46,XX,15, +t(9;15)(q10;q10). Anetta Juraszek (1), Krystyna Soszyńska (1), Sylwia Cettler (2), Ewa Duszeńko(3), Olga Haus (1,3) (1) Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej AM w Bydgoszczy (2) Wojewódzki Szpital Zespolony w Toruniu (3) Pracownia Cytogenetyczna, Katedra i Klinika Hematologii AM we Wrocławiu Aberracje chromosomu 9 są jedną z przyczyn występowania zespołów wad rozwojowych u noworodków. Najczęściej opisywana jest całkowita trisomia ramion krótkich, rzadziej inne niezrównoważone aberracje oraz bardzo rzadko trisomia ramion długich. U noworodków z trisomią 9p opisywano zmniejszenie masy i długości ciała, hipotonię mięśniową, objawy dysmorfii czaszkowo-twarzowej (mikrocefalia, wąskie, mongoloidalnie ustawione szpary powiekowe, głęboko osadzone gałki oczne, hiperteloryzm, wydatny nos, zniekształcenie małżowin usznych, gotyckie podniebienie lub jego rozszczep), zmiany kostne oraz wady serca i układu moczowo-płciowego. Celem pracy była analiza korelacji kariotypowo-fenotypowych u 2-miesięcznej dziewczynki skierowanej do Poradni Genetycznej z powodu podejrzenia zespołu Downa. Dziewczynka ze środowiska miejskiego, rodziców młodych, zdrowych, nie spokrewnionych, urodzona siłami natury w 39 Hbd, z ciąży pierwszej, w stanie ogólnym dobrym (8 pkt wg skali Apgar), z masą urodzeniową 2400 g. W trakcie ciąży matka była trzykrotnie hospitalizowana z powodu wielowodzia i hipotrofii płodu. Po porodzie u matki stwierdzono wysokie miana przeciwciał TOXO-IgM i IgG. U dziecka od urodzenia obserwowano zaburzenia oddychania i policytemię. W badaniu przedmiotowym stwierdzono drobną budowę ciała, duże ciemię tylne, trójkątną twarz, fałd nakątny, zez zbieżny oka prawego, nisko osadzone, asymetryczne małżowiny uszne, trójkątne usta, wysokie podniebienie, obustronną “małpią bruzdę”, klinodaktylię V palców rąk, hipoplazję paznokci kończyn górnych i dolnych, prężenia kończyn dolnych, objaw Raynauda w obrębie kończyn górnych. Badanie cytogenetyczne limfocytów krwi obwodowej wykonane techniką GTG oraz FISH z sondami WCP9 i WCP15 wykazało u dziecka obecność nieprawidłowego kariotypu 46,XX,-15,+t(9;15)(q10;q10). Wyniki badania kariotypu rodziców były prawidłowe. Konstelacja objawów fenotypowych u dziewczynki wydaje się być wynikiem obecności nieprawidłowego kariotypu oraz współistnienia wrodzonego zakażenia Toxoplasma gondii. P83. Częściowa trisomia 7p w dwóch kolejnych ciążach z rozpoznanymi wadami rozwojowymi u płodów, jako efekt matczynej zrównoważonej translokacji między chromosomami 7 i 22 [t(7;22)]. Grzegorz Nowicki (1), Wojciech Ałaszewski (1), Maria Respondek-Liberska (2), Marek Kozarzewski (3), Magdalena Kozłowska (1), Wanda Hawuła (1), Iwona Pinkier (1), Anna Jelska (4), Alina Midro (4), Lucjusz Jakubowski (1) (1) Zakład Genetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi (2) Zakład Diagnostyki i Profilaktyki Wad Wrodzonych I CZMP (3) Zakład Ultrasonografii Ginekologiczno-Położniczej I CZMP� (4) Zakład Genetyki Klinicznej AM w Białymstoku Przedstawiono przypadek dwukrotnego niepowodzenia w donoszeniu ciąży u pacjentki z nosicielstwem translokacji zrównoważonej t(7;22)(p11.2?;p11.2?) lub t(7;22)(q11.2?;q11.2?). W ciąży I ze względu na opisywaną w badaniu usg hipotrofię płodu, nieprawidłowy obraz główki oraz przerost mięśnia sercowego wykonano kordocentezę genetyczną w 33/37 tygodniu ciąży i stwierdzono częściową trisomię ramion krótkich chromosomu 7, w wyniku ich translokacji na chromosom 22. Badania kariotypu rodziców pozwoliły na rozpoznanie translokacji zrównoważonej t(7;22) u matki. Opis sekcyjny noworodka wykazał dodatkowo torbielowatą prawą nerkę oraz cechy dysmorfii twarzowej, a także zmiany w budowie mózgu o typie DandywejWalkera.� W ciąży II ze względu na stwierdzoną u matki translokację w 15 tygodniu ciąży wykonano diagnostyke przedurodzeniową. Podobnie jak w ciąży I rozpoznano częściową trisomię 7p. Wykonane szczegółowe badanie usg wskazywało na hipotrofię płodu, wadę serca, wodonercze, nieprawidłową budowę mózgu z cechami pozwalającymi podobnie jak w ciąży pierwszej podejrzewać zespół DandywejWalkera. Ocena morfotyczna płodu była trudniejsza ze względu na mniejsze zaawansowanie ciąży (17/20 tydzień) w stosunku do ciąży pierwszej (37 tydzień). Analiza punktów złamań, wskazuje że mogły wystąpić dwa warianty: t(7;22)(p11.2;p11.2) lub t(7;22)(q11.2;q11.2). 75 Genetyka człowieka Dla pierwszego ryzyko niezrównoważenia kariotypu u dziecka wynosi 4,35 +– 3,01% (2/46) zarówno w przypadku nosicielstwa translokacji przez matkę jak i przez ojca. Dla drugiej opcji jest zerowe. W kolejnej, trzeciej ciąży, diagnozowanej przedurodzeniowo stwierdzono prawidłowy, męski kariotyp płodu. Pacjentka urodziła zdrowego, donoszonego chłopca. P84. Dysplazja czołowo-przynasadowa w rodzinie ze zmienną ekspresywnością cech fenotypowych. Izabela Brożek (1), K. Ochman (1), J. Wierzba (2), J. Limon (1) (1) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Akademia Medyczna w Gdańsku (2) Klinika Pediatrii, Hematologii, Onkologii i Endokrynologii Akademii Medycznej w Gdańsku Dysplazja czołowo-przynasadowa (FMD) jest niezwykle rzadką genetycznie uwarunkowaną chorobą zajmującą układ kostno-stawowy oraz tkankę łączną. W około 50% przypadków stwierdza się mutację genu filaminy A zlokalizowanego w chromosomie X. Najbardziej charakterystyczną cechą choroby jest charakterystyczny wygląd twarzy, w którym zwraca uwagę nadoczodołowe zgrubienie kostne oraz inne cechy dysplazji kostnej. Choroba wykazuje znaczną zmienność kliniczną i przebiega zwykle ciężej u mężczyzn. Przedstawiamy rodzinę, w której występuje FMD zarówno u kobiet, jak i u mężczyzn, wśród których są przypadki o bardzo skąpej symptomatyce. Probantka, 14-letnia dziewczynka prezentuje typowe cechy choroby: małogłowie, wydatne zgrubienia nadoczodołowe, krótka rynienka podnosowa, mała broda, mikro- i retrognacja, drobne zęby, nisko schodząca na czoło linia włosów, krzaczaste brwi, arachnodaktylia, boczne skrzywienie kręgosłupa. Sylwetka dziewczynki jest marfanoidalna, mięśnie szkieletowe słabo rozwinięte. Badanie TK3D uwidoczniło nadmierne kostnienie w okolicy oczodołów, brak prawidłowego modelowania przynasad kości długich. U 22-letniej siostry probantki obserwuje się dyskretne objawy dysplazji kostnej. Pozostali członkowie rodziny wykazujący cechy choroby to brat ojca matki i jego syn. Matka i dziadek probantki nie wykazują cech choroby mimo, że ze względu na miejsce w rodowodzie są oni potencjalnymi nosicielami mutacji. Badania molekularne (mutacje genu filaminy A) zarówno u probantki, jak i jej siostry są w trakcie. Zmienność ekspresywności objawów fenotypowych w obrębie rodziny może wskazywać na udział innych genów w rozwoju choroby. Wykłady plenarne: W42. Genetic Services in Europe: the way forward Jean-Jacques Cassiman Center for Human Genetics, KU Leuven, Belgium Genetic services in Europe, while based on high quality scientific know-how, suffer from an intolerably high level of technical errors and poor reporting, caused by a lack of structuring and complementarity at the European level and the absence of a common European objective to provide quality services to all its consumers now and in the future. Diverse and heterogeneous quality schemes, lack of reference systems and differing Member State (MS) regulations, have added to the overall disorganization and fragmentation of services. Nevertheless, genetic services face an ever-increasing number of requests for testing, while widespread susceptibility testing and pharmacogenetic tests are lurking on the horizon. With the active participation of stakeholders, an EU funded network of excellence has been set up that twill stat its activities in 2005. The EUROGENTEST NoE intends to structure, harmonize and improve the overall quality of these services, while paying substantial attention to issues resulting from testing including legal, health policies and health economic impact, IPR (Intellectual Property Rights), ethical and social questions: confidentiality, informed consent, employment and insurance. The EUROGENTEST NoE will attempt to improve the organization and harmonization of external quality assessment/ assurance schemes, facilitate the development of guidelines and support the accreditation/certification of the genetic services. In addition, collaboration between academic centers and the private sector on technology development and the validation of genetic tests, should generate more rapid translation and accurate, more economical and overall better testing technologies. A quality website, with all relevant information will be developed and made accessible to experts and customers. With the help of Parent and Patient Support Groups, the EUROGENTEST NoE will collect quality tools for education 76 Genetyka człowieka of different categories of stakeholders. Training for personnel both from within and from outside the EU will be provided. The already substantial number of female scientists involved in the EUROGENTEST NoE, will be further increased and a female scientist will assume responsibility of supervising gender issues. Finally, the EUROGENTEST NoE aims at becoming a model for similar initiatives in developing countries and will provide appropriate support for their development. The EUROGENTEST network aims at developing the necessary infrastructure, tools, resources, guidelines and procedures leading to the establishment of harmonized, quality genetic testing services in Europe, which can interact with, stand as a model for, or help to achieve similar services on other continents. This will be achieved by bringing together, in a real long-term partnership, experts and expert centers available in Europe engaged on different aspects of testing, including researchers, small and medium enterprises (SMEs), testing laboratories, quality management and public health experts, ethicists, lawyers, sociologists, educational authorities and consumers. The tools used to achieve the goals of the network will be (1) the promotion of research, proper utilization, quality assurance and control, and adequate management of genetic tests, (2) the creation of quality information resources that can be readily accessed, ultimately facilitating the emergence of new tests (e.g. for rare diseases for which tests are not available) and the improvement of existing ones (higher accessibility and improvement of genotyping techniques in terms of lower costs, higher efficiency and specificity), (3) agreement on best practice guidelines and protocols, strengthening, unification and organization of quality assessment schemes and accreditation of laboratories to achieve harmonization and high quality of the services offered across the EU, (4) establishing a knowledge and technology platform to facilitate impact assessment and information flow, and (5) joining resources in the area of rare disease services, where uniform patient access and quality standards are even more limited by the low number of affected individuals. The EUROGENTEST NoE will focus on the quality of genetic services, measured against existing European and international or developing quality norms for laboratory bench tests in the cytogenetics, molecular and biochemical genetics sectors (accreditation and certification as appropriate through ISO 17025, ISO15189, Good Laboratory Practice (GLP). In addition the network will consider the quality of informatic systems, which are or will be available to stakeholders including researchers, medical and non-medical clinical and laboratory personnel, consumers, authorities and legislators. In addition, ethical, legal, intellectual property and societal issues related to these services will be evaluated and recommendations for their appropriate management will be formulated. A network of Health Technology Assessment units, from a number of different member states (MS) will evaluate the impact of genetic testing services on public health policies and economics. Recommendations to address potential problems will be drafted. An audit of quality educational material relevant to genetic services will be performed and disseminated and new educational materials will be developed and made available to key member state representatives. Through interactions with SMEs a network will be created which should allow the appropriate, quality controlled and focused development of new technologies for testing. W43. Complex traits – a new challenge for clinical genetics Jacek J. Pietrzyk Department of Medical Genetics, Chair of Pediatrics, Medical Faculty, Jagiellonian University The term “complex traits” refers to the diseases, whose inheritance does not follow the simple Mendelian pattern. They are usually defined as disorders where one or more genes acting in the concert together with or without environmental factors increase or diminish the risk of trait occurrence. Therefore, in broad sense, complex traits comprise disorders with oligogenic, poligenic and multifactorial etiology. In contrast to the rare Mendelian diseases, complex traits represent relatively common disorders responsible for significant population burden. In addition to the “big three” represented by cancer, psychiatric diseases and cardiovascular diseases, this group comprises also a vast majority of congenital malformations, diabetes, asthma and rheumatoid arthritis, just to mention the most common entities. These traits are characterized by significant phenotype variation and in many instances reveal a quantitative phenotype. Therefore, loci carrying the determinants of these traits are termed “quantitative trait loci” (QTL). In comparison to Mendelian disorders, where many responsible genes have been cloned, the number of identified genes, which contribute to the etiology of complex trait is really low. The major causes, which make gene identification so difficult, are represented by: locus heterogeneity, epistasis, different penetrance and expressivity, pleiotropy and limited statistical power of genetic analyses. Since in many complex traits there is a significant influence of environmental factors, one would like to measure the contribution of genetic, heritable factors to the etiology and phenotype of complex diseases. The most commonly used parameter is heritability expressing the proportion of phenotype variation of a trait in a given population, which is due to genetic determinants. Heritability can be estimated from twins concordance or parent sib correlations. Assuming 77 Genetyka człowieka a significant impact of complex traits on the population well-being in general, a search for genes, which underlie complex disorders is highly warranted. This very complicated and tedious task needs a bunch of analytical procedures applied in a stepwise approach. The first step is to establish a significant linkage or association between the locus or allele and the trait in question. Linkage analysis based on the co-segregation of the genetic marker and the trait within a family may provide the first information about the chromosomal fragment carrying disease gene(s). As an initial procedure, a genome-wide screen applying several hundreds of highly polymorphic genetic markers evenly distributed over the genome may be used. With the access to large, multigeneration pedigrees, or with a proper selection of a substantial number of nuclear families with at least two affected siblings, linkage analysis is a powerful method for localizing the locus with a disease gene. Another approach is based on association analysis, which compares the frequency of specific markers between the group of unrelated cases and healthy controls. This method is population-based and has two major requirements: unbiased selection and precisely defined phenotypes eliminating heterogeneity. An alternative to association is linkage disequilibrium representing nonrandom association of two alleles. Linkage and association analyses represent low resolution methods, which permit to focus on the 10-30 cM chromosomal fragment possibly containing disease genes. The next step is a fine mapping reducing the critical region to the minimal interval of 1 cM with the modest number of potential candidate genes, which makes sequence analysis and functional studies feasible. When the information about the potential involvement of particular gene in disease patomechanism is available, then gene candidate approach based on specific linkage and/or association analysis is used. This can be performed as casecontrol, simplex and multiplex families studies. The most conclusive evidence on the candidate gene being involved in the patomechanism of the disease is functional test based on knock-in or knock-out technology in model animals with human diseases. There are many thresholds in the identification of genes responsible for complex traits. Firstly, due to the fact that these traits are in majority polygenic. Secondly, very little is known about the interaction and modifying effects of these genes and it is supposed that complex traits may result from polymorphic variants in non-coding regulatory sequences. Thirdly, dissecting the interaction between the environment and the genes is extremely difficult, because of the lifelong cumulative outcome. Fourthly, a highly efficient and powerful statistical test should be available in an attempt to avoid bias and spurious linkage/association results. Therefore, what is the best approach to the elusive matter of complex diseases? There is general consent that such a strategy should be based on large epidemiological studies of many different populations, including isolates. Collaborative multicenter studies including data banking and sharing for pooled analyses are needed for identification of genes of major effects, but especially for identification of many genes of small cumulative effects which contribute to the etiology of complex diseases. A special emphasis should be placed on the outcome of combined effect of genotypeenvironmental interaction. References: 1. Cooper R.S. Gene-environment interactions and the etiology of common complex disease. Ann. Intern. Med. 2003; 139; 437–440 2. Darvasi A., Pisanté-Shalom A. Complexities in the genetic dissection of quantitative trait loci. Trends Genet. 2002; 18; 489-491 3. Glazier A.M., Nadeau J.N., Aitman T.J. Finding genes that underlie complex traits. Science. 2002; 298; 2345–2349 4. Kraft P., Horvath S. The genetics of gene expression and gene mapping. Trends Biotechnol. 2003; 21; 377–378 5. Peltonen L., McKusick V.A. Genomics and medicine. Dissecting human disease in the postgenomic era. Science. 2001; 291; 1224–1229 6. Rees J. Complex disease and the new clinical sciences. Science. 2002; 296; 698–701 7. Thomson G., Esposito M.S. The genetics of complex diseases. Trends Cell Biol. 1999; 9; M17–20 78 Genetyka człowieka Choroby wieloczynnikowe Komunikaty ustne: W44. Polimorfizmy genu MTHFR u osób z chorobą niedokrwienną serca o różnym stopniu zaawansowania zmian miażdżycowych w tętnicach wieńcowych. Joanna Sokołowska, Włodzimierz Skorupski, Andrzej Cieśliński, Wiesław H. Trzeciak Instytut Kardiologii AM w Poznaniu Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej AM w Poznaniu Choroba niedokrwienna serca (CNS) jest schorzeniem o etiologii wieloczynnikowej, rozwijającym się na podłożu genetycznym. Jednym z intensywnie badanych czynników ryzyka CNS jest endogenny aminokwas homocysteina (Hcy) oraz zaburzenia jego przemiany, spowodowane występowaniem mutacji i polimorfizmów w genach kodujących enzymy metabolizmu Hcy, zwłaszcza reduktazy metylenotetrahydrofolianowej. Celem pracy było oszacowanie korelacji polimorfizmów C677T, A1298C, G1793A genu MTHFR z występowaniem CNS, zaawansowaniem zmian miażdżycowych w tętnicach wieńcowych oraz stężeniem Hcy u 260 chorych z populacji polskiej. Ponadto podjęto próbę korelacji stężenia Hcy z wiekiem, płcią, zaawansowaniem zmian miażdżycowych oraz stężeniem metioniny w osoczu. Potwierdzono, że stężenie homocysteiny rośnie z wiekiem i jest wyższe u mężczyzn oraz u osób z CNS oraz najwyższe u chorych z trzema zaatakowanymi naczyniami. Nie stwierdzono różnego rozkładu genotypów polimorfizmu C677T pomiędzy grupą chorych i kontrolną. Potwierdzono też, że nie ma korelacji pomiędzy A1298C, a wystąpieniem choroby, a częstość genotypów tego polimorfizmu u osób z CNS oznaczono w Polsce po raz pierwszy. Podjęto też po raz pierwszy na świecie, próbę korelacji pomiędzy polimorfizmem G1793A, a wystąpieniem choroby, która jednak nie wykazała takiego związku. Nie wykazano też zależności zaawansowania miażdżycy od genotypu wszystkich trzech polimorfizmów. Stwierdzono, że poziom Hcy jest wyższy u nosicieli allelu T polimorfizmu C677T, a polimorfizmy A1298C oraz G1793A nie wpływają na jej stężenie. Równocześnie wykazano, że stężenie metioniny nie różni się istotnie pomiędzy grupą chorych i grupą kontrolna, a jej poziom nie zależy od żadnego z badanych polimorfizmów. Wnioskuje się, że występowanie polimorfizmów C677T, A1298C, G1793A genu MTHFR nie jest czynnikiem ryzyka CNS w populacji polskiej. W45. Próba wyjaśnienia molekularnego podłoża wrodzonego zespołu wydłużonego QT w populacji polskiej. M. Borucka-Mankiewicz, E. Popowska, P. Kowalski, E. Ciara, D. Piekutowska-Abramczuk, D. Jurkiewicz, K. Bieganowska, M. Krajewska-Walasek Zakład Genetyki Medycznej, Zakład Kardiologii IPCZD. Wrodzony zespół wydłużonego QT (LQTS) charakteryzuje się stałym lub okresowym nieprawidłowym wydłużeniem odstępu QT w zapisie elektrokardiograficznym. Choroba może występować jako zespół Jervella i Lange-Nielsena (odmiana 1, JLN1 i odmiana 2, JNL2), dziedziczonym w trybie autosomalnym recesywnym lub jako zespół Romano i Warda (odmiany 1-6, LQT1-6), dziedziczonym w trybie autosomalnym dominującym. Celem prezentowanej pracy jest próba ustalenia genetycznego podłoża wrodzonego zespołu wydłużonego QT w populacji polskiej z uwzględnieniem trybu dziedziczenia i odmiany choroby. Badania polegały na określeniu uszkodzonego regionu i identyfikacja mutacji w genach KVLQT1, HERG i KCNE1, kodujących białka kanałów potasowych IKs i IKr, biorących udział w repolaryzacji komórek mięśnia sercowego. Badaniami objęto 30 pacjentów, pochodzących z 26 nie spokrewnionych rodzin. Przeprowadzone sekwencjonowanie ujawniło obecność kilku różnych substytucji nukleotydowych, z których jedne wprowadzały zmianę informacji kodonu i są prawdziwymi mutacjami (gen KVLQT1 – R243H, V254M, A341V, C445X; gen HERG – P1122L) lub są uznawane za polimorfizmy (gen KCNE1 – G38S, D85N) a drugie nie prowadziły do zmiany informacji kodonu (gen KVLQT1 – F485F, S546S; gen HERG – I489I, L564L) i miały charakter typowych zmian polimorficznych. Stwierdzono, że w jednej rodzinie mutacja wystąpiła na jednym allelu genu KVLQT1 i jest przyczyną dominującego zespołu LQT1, natomiast w dwu innych rodzinach mutacje wystąpiły na obu allelach genu 79 Genetyka człowieka KVLQT1 i spowodowały wystąpienie recesywnego zespołu JLN1 (z głuchotą) i nietypowej recesywnej odmiany LQT1. W jednej rodzinie wystąpiła dominująca odmiana LQT2, która była wynikiem mutacji w genie HERG. W 11 rodzinach wykryto jedynie zmiany polimorficzne, a w następnych 11 rodzinach nie wykryto ani mutacji ani polimorfizmów w analizowanych genach KVLQT1, HERG i KCNE1. Badania były finansowane z projektu KBN nr 6P05E15021. W46. Równoczesne nosicielstwo allelu 5G genu PAI-1 i allelu C genu PPARα ma związek z wczesną chorobą niedokrwienną serca – wyniki badań pilotażowych. Beata Sarecka (1), Anna Balcerzyk (1), Paweł Niemiec (1), Iwona Żak (1), Jolanta Krauze(2), Maria Trusz-Gluza(1) (1) Katedra i Zakład Biochemii i Genetyki Medycznej Śląskiej Akademi Medycznej ul. Medyków, 18, 40– 752 Katowice (2) I Katedra i Klinika Kardiologi Ślaskiej Akademi Medycznej ul. Ziołowa 45/47, 40-635 Katowice Wstęp Inhibitor aktywatora plazminogenu-1 (PAI-1) jest głównym inhibitorem fibrynolizy. Polimorfizm 4G/5G promotora genu PAI-1, w pozycji –675 ma związek z poziomem stężenia PAI-1 i w ten sposób wpływa na fibrynolizę. Receptor aktywowany przez proliferatory peroksysomów α (PPARα) należy do rodziny jądrowych receptorów hormonów i jest czynnikiem transkrypcyjnym aktywowanym przez ligandy, takie jak kwasy tłuszczowe lub związki z grupy fibratów. Reguluje on ekspresję genów kodujących białka, które związane są z metabolizmem lipidów i odpowiedzią na stany zapalne. Cel Określenie związku polimorfizmu 4G/5G genu PAI-1 i polimorfizmu G→C w intronie 7 genu PPARα z wczesną chorobą niedokrwienną serca (ChNS). Materiały i Metody Badaniami objęto 171 osób rasy kaukaskiej, grupa 1 – pacjenci z wczesną chorobą niedokrwienną serca potwierdzoną koronarograficznie (n=85, wiek 46±6.5), grupa 2 – dobrowolni dawcy krwi bez obciążeń chorobami sercowonaczyniowymi w wywiadzie (n=86, wiek 35±9.7). Polimorfizmy analizowano techniką PCR-RFLP. Produkty amplifikacji trawiono odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi: BseLI dla PAI-1,TaqI dla PPARα a następnie rozdzielano elektroforetycznie na 8% żelu poliakrylamidowym i uwidaczniano przez barwienie AgNO3. Wyniki Częstości alleli wśród pacjentów z ChNS w porównaniu z kontrolą dla polimorfizmu PAI-1 4G/5G wynoszą odpowiednio: 4G 0.55 vs. 0.59, 5G 0.45 vs. 0.41, dla polimorfizmu PPARα G→C w intronie 7: G 0.82 vs. 0.88, C 0.18 vs. 0.12. Częstości genotypów wśród chorych w porównaniu z kontrolą dla polimorfizmu PAI-1 4G/5G wynoszą odpowiednio: 4G/4G 0.31 vs. 0.37, 4G/5G 0.48 vs. 0.44, 5G/5G 0.21 vs. 0.19, dla polimorfizmu PPARα G→C w intronie 7: GG 0.66 vs. 0.77, GC 0.33 vs. 0.22, CC 0.01 vs. 0.01. Brak znamiennych różnic w częstościach poszczególnych alleli i genotypów między badanymi grupami. Podwójne heterozygoty (4G/5G + GC) występują znamiennie częściej w grupie z ChNS (0.16) w porównaniu z kontrolą (0.05) (p=0.0118, OR=4.04, 95%CI 1.26-12.94). Równoczesne nosicielstwo allelu PAI-1 5G i PPARα C [(4G/5G + GC) + (4G/5G + CC) + (5G/5G + GC) + (5G/5G + CC)] jest znamiennie wyższe wśród pacjentów z ChNS (0.25) niż u krwiodawców (0.10) (p=0.0144, OR=2.807, 95%CI 1.19-6.597). Wnioski Równoczesne nosicielstwo allelu 5G polimorfizmu 4G/5G genu PAI-1 i allelu C polimorfizmu G→C genu PPARα ma związek z wczesną chorobą niedokrwienną serca. W47. Efekt funkcjonalny polimorfizmu G-765C genu dla cyklooksygenazy-2 w astmie oskrzelowej. Wojciech Szczeklik, Marek Sanak, Sylwia Dziedzina, Anna Gielicz, Grażyna Pulka, Andrzej Szczeklik II Katedra Chorób Wewnętrznych Collegium Medicum UJ. Wprowadzenie: Polimorfizm G-765C, znajduje się w regionie promotorowym genu dla cyklooksygenazy-2 (COX-2), kluczowego enzymu dla syntezy prostaglandyn w chorobach zapalnych. Zmiana ekspresji COX-2 może mieć wpływ na produkcję prostaglandyn oraz przebieg astmy oskrzelowej. 80 Genetyka człowieka Cele pracy: Celem pracy była ocena częstości polimorfizmu G-765C w zdrowej populacji polskiej, oraz w grupie chorych na astmę. Efekt czynnościowy polimorfizmu sprawdzono przez pomiar produkcji prostaglandyn w monocytach. Metody: Genotypowano losową próbę populacji (n=547), oraz chorych na astmę oskrzelową (n=310); uwzględniono chorych dobrze tolerujących niesteroidowe leki przeciwzapalne (ATA ; n=198) oraz chorych na astmę aspirynową (AIA;n=112). Monocty z krwi obwodowej izolowano od chorych ATA o przeciwstawnych genotypach: CC (n=8) i GG (n=9), poziom prostaglandyn oznaczono techniką GC/MS w warunkach podstawowych oraz po pobudzeniu LPS. Pomiary standaryzowano na transkrypt b;-aktyny. Wyniki: Częstości alleliczne w grupach chorych były podobne (AIA=0,18; ATA=0,19) i nie różniły się od kontroli (0,17). Homozygoty CC były częstsze wśród kobiet chorych na astmę niż u kontroli (OR= 3,08; 95%CI 1,35-6,63; p=0,01). W grupie AIA, pacjenci z genotypem CC wykazywali cięższy przebieg choroby, co wyrażało się większym zapotrzebowaniem na glikokortykosteroidy doustne (p=0,002). Produkcja prostaglandyn przez monocyty była ponad 10-krotnie wyższa u homozygot CC niż u homozygot GG, zarówno w warunkach podstawowych jak i po stymulacji LPS. Wnioski: Asocjacja polimorfizmu G-765C z astmą obserwowana jest tylko u kobiet, charakteryzuje ją cięższy przebieg choroby w grupie AIA. U homozygot CC polimorfizm manifestuje się o rząd wielkości zwiększoną produkcją prostaglandyn przez monocyty. W48. Brak asocjacji pomiędzy polimorfizmem C-270T genu BDNF a schizofrenią. Maria Skibińska (1, 2), Aleksandra Szczepankiewicz (1), Agnieszka Słopień (3), Anna Leszczyńska-Rodziewicz (2), Piotr Czerski (1), Paweł Kapelski (2), Monika Dmitrzak-Węglarz (1,3 ), Joanna Hauser (1, 2) (1) Pracownia Genetyki Psychiatrycznej Akademii Medycznej w Poznaniu (2) Klinika Psychiatrii Dorosłych Akademii Medycznej w Poznaniu (3) Klinika Psychiatrii Dzieci i Młodzieży Akademii Medycznej w Poznaniu Cel badania: Brain Derived Neurotrophic Factor należy do rodziny neurotrofin. BDNF odgrywa istotną rolę w neuroprotekcji i plastyczności synaptycznej w centralnym układzie nerwowym. W nawiązaniu do neurorozwojowej koncepcji etiologii schizofrenii wskazuje się na udział BDNF w patofizjologii tej choroby (Takahashi i wsp., 2000). Opisano także związek BDNF z wczesnym wiekiem początku choroby (Krebs i wsp., 2000). Gen kodujący BDNF jest więc genem kandydującym w schizofrenii. Wyniki badań Szekeres i wsp. (2003) wskazują na asocjację polimorfizmu C-270T BDNF ze schizofrenią. Metoda: Grupę badaną stanowiło 409 pacjentów z rozpoznaniem schizofrenii i 173 osoby z grupy kontrolnej (dawcy krwi oraz studenci). Badany polimorfizm genu BDNF polega na substytucji C/T w pozycji –270 w sekwencji niekodującej. Analizę polimorfizmu przeprowadzono z zastosowaniem metody PCR-RFLP przy użyciu enzymu restrykcyjnego HinfI. Badana grupa była w równowadze prawa Hardy’ego-Weinberga. Wyniki: Nie stwierdzono istotnej statystycznie różnicy w częstości występowania genotypów jak i alleli C-270T genu BDNF pomiędzy grupą chorych na schizofrenię a grupą kontrolną (p=0,262 dla genotypów, p=0,359 dla alleli). Prowadząc analogiczną analizę w podgrupach uwzględniających podział ze względu na wiek początku choroby nie stwierdzono różnic istotnych statystycznie zarówno w częstości genotypów (p=0,399) jak i alleli (p=0,177). Wnioski: Nie stwierdziliśmy związku pomiędzy badanym polimorfizmem genu BDNF i ryzykiem zachorowania na schizofrenię.� 81 Genetyka człowieka W49. Dominujące mutacje genu NANOS1 są przyczyną niepłodności męskiej. Kamila Kusz (1), Anna Spik (1), Anna Latos-Bieleńska (2), Maciej Kotecki (1), Joanna Bierła (3), Piotr Jędrzejczak (4), Leszek Pawelczyk (4), Jadwiga Jaruzelska (1) (1) Instytut Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu (2) Zakład i Katedra Genetyki Medycznej, Akademii Medycznej w Poznaniu (3) Zakład Histologii, Akademii Medycznej w Poznaniu (4) Klinika Niepłodności i Endokrynologii Rozrodu Akademii Medycznej w Poznaniu Białko Nanos jest represorem translacji specyficznych mRNA w morfogenezie i rozwoju komórek germinalnych D. melanogaster. W procesach tych Nanos działa w kompleksie z Pumilio. Niedawno wykryto ludzkie homologi obu białek – NANOS1 i PUMILIO2. Ulegają one specyficznej ekspresji w komórkach germinalnych dorosłych mężczyzn. Silnie zakonserwowana interakcja tych białek sugeruje, że mogą one odgrywać ważną rolę w spermatogenezie człowieka. W niniejszych badaniach wykryto trzy typy mutacji punktowych genu NANOS1 powodujących fenotyp czystej niepłodności mężczyzn. Wszystkie mutacje były związane z całkowitym brakiem komórek linii germinalnej w kanalikach plemnikotwórczych pacjentów. Wyniki te sugerują, że NANOS1 może brać udział w powstawaniu i/lub samoodnawianiu macierzystych komórek germinalnych spermatogoniów. Analiza rodowodów wskazuje, że dziedziczenie genu NANOS1 jest dominujące, a penetracja mutacji ograniczona do płci męskiej. Jest to pierwsze doniesienie o mutacji autosomalnego genu komórek germinalnych, która powoduje fenotyp czystej niepłodności męskiej. Komunikaty plakatowe: P85. Udział ludzkich białek Hsp 40 w wywoływaniu reumatoidalnego zapalenia stawów. Agnieszka Kotlarz, Konrad Krzewski, Barbara Lipińska Katedra Biochemii, Uniwersytet Gdański, Kładki 24, 80-822 Gdańsk Prezentowana praca jest częścią projektu obejmującego badania nad rolą ludzkich homologów bakteryjnego białka szoku termicznego DnaJ (Hsp40), w wywoływaniu reumatoidalnego zapalenia stawów (RA). Celem projektu jest zweryfikowanie hipotezy dotyczącej udziału białka DnaJ E. coli w indukcji odpowiedzi autoimmunologicznej, w przypadku chorób reumatycznych. Kontynuacją badań było sprawdzenie czy ludzkie białka HDJ-2 i HDJ-3, homologi białka DnaJ, mogą być celem odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez antygen bakteryjny. Uprzednio wykazaliśmy, że w surowicach osób chorych na RA poziom przeciwciał przeciwko białku DnaJ oraz ludzkiemu Hsp40, HDJ-1, jest w sposób znaczący podwyższony, przy czym brak jest istotnej pozytywnej korelacji między odpowiedziami anty-DnaJ i anty-HDJ-1. Oczyszczono ludzkie białka HDJ-2 i HDJ-3 nadprodukowane w komórkach bakterii E. coli a następnie, wykorzystując immunoenzymatyczny test ELISA, zbadano reaktywność 43 surowic osób chorych i 35 surowic osób zdrowych z oczyszczonymi białkami. Stwierdzono około 5-krotne podwyższenie poziomu przeciwciał anty-HDJ-2 i 2.5-krotne przeciwciał anty-HDJ-3 w grupie osób chorych w stosunku do poziomu obserwowanego w grupie osób zdrowych. Wynik uzyskany dla białka HDJ-2 przekraczał wartości poziomów reakcji otrzymane wcześniej dla białka DnaJ bakterii Escherichia coli i ludzkiego białka HDJ-1. Analiza statystyczna wyników wykazała obecność statystycznie istotnej, pozytywnej korelacji pomiędzy poziomem reakcji przeciwciał z białkiem DnaJ względem poziomu reakcji z białkiem HDJ-2, u osób chorych. Brak istnienia takiej korelacji w przypadku białek HDJ-3 i HDJ-1 sugeruje istnienie niezależnych odpowiedzi immunologicznych: anty-DnaJ, anty-HDJ-1 i anty-HDJ-3. Wyniki wskazują, że w przeciwieństwie do pozostałych ludzkich homologów (HDJ-1, HDJ-3), białko HDJ-2 może stanowić cel odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez bakteryjny antygen i może być zaangażowane w procesie wywoływania RA. Istotny wzrost poziomu reakcji surowicy krwi ludzi chorych względem białek HDJ-3 i HDJ-1 sugeruje, że białka te mogą uczestniczyć w późniejszych stadiach rozwoju i podtrzymywania choroby. 82 Genetyka człowieka P86. Identyfikacja nowej mutacji genu PAX9 odpowiedzialnej za rodzinnie występującą postać oligodoncji. Adrianna Mostowska (2), Barbara Biedziak (1), Wiesław H. Trzeciak (2) (1) Katedra Ortodoncji, AM w Poznaniu (2) Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, AM w Poznaniu Wrodzony brak zawiązków zębów stałych jest najczęstszą wadą rozwojową uzębienia, która występuje u około 2 do 10% osób w populacji ogólnej. Dane te nie obejmują trzecich zębów trzonowych, których brak stwierdza się u 20-25% osób. Dotychczas, jedynymi genami, których mutacje są odpowiedzialne za powstawanie tej nieprawidłowości rozwojowej są MSX1 oraz PAX9, które kodują czynniki transkrypcyjne ogrywające kluczową rolę podczas odontogenezy. Celem projektu było poszukiwanie mutacji genów MSX1 oraz PAX9 u osób z wrodzonym brakiem zawiązków zębów stałych. Badaniami objęto 9 osób należących do tej samej rodziny (w tym 5 osób z oligodoncją) oraz grupę 150 osób o prawidłowym uzębieniu. W celu wykrycia mutacji sekwencje eksonów genów MSX1 oraz PAX9 amplifikowano z użyciem specyficznych starterów oraz analizowano za pomocą metody polimorfizmu konformacji pojedynczych nici DNA przeprowadzanej w zmiennej temperaturze. Analiza MSSCP eksonu 2 genu PAX9 wykazała zmiany w ruchliwości elektroforetycznej pojedynczoniciowych fragmentów DNA u wszystkich pięciu osób z oligodoncją. Bezpośrednie sekwencjonowanie DNA wykazało obecność nowej, heterozygotycznej mutacji 619_621delATCinsTACCGACCAAG GTAGGGCATCCCT, która nie występowała u innych członków rodziny, jak też u 150 osób o prawidłowym uzębieniu. Nowa insercja może prowadzić do przedwczesnej terminacji translacji przy 210 reszcie aminokwasowej lub też zaburzać splicing, powodować przesunięcie ramki odczytu oraz przedwczesną terminację translacji przy 314 reszcie aminokwas owej(prawdopodobieństwo 0,97 i 0,95, odpowiednio). U osób należących do badanej rodziny zidentyfikowano ponadto polimorfizmy genu MSX1: *6C>T, 452-15delT oraz PAX9: 717C>T, 718G>C, które jednakże nie wykazują związku z występowaniem oligodoncji. Uzyskane wyniki potwierdzają przypuszczenie, że mutacje genu PAX9 stanowią główny czynnik odpowiedzialny za powstawanie niesyndromicznej, rodzinnie występującej postaci oligodoncji. Nowa mutacja może powodować brak zawiązków zębów stałych u badanych chorych w wyniku zmniejszenia zdolności transaktywacyjnej czynnika transkrypcyjnego PAX9, za którą są odpowiedzialne reszty aminokwasowe zlokalizowane na C-końcu białka. Badania finansowane z grantu KBN 2P05A 092 26 P87. Badanie asocjacyjne alleli genu kodującego czynnik nekrozy komórkowej TNFα; w jadłowstręcie psychicznym. Monika Dmitrzak-Węglarz (1, 3) Agnieszka Słopień (1), Filip Rybakowski (1), Piotr Czerski (2, 3), Joanna Hauser (2, 3), Andrzej Rajewski (1) (1) Klinika Psychiatrii Dzieci i Młodzieży Akademii Medycznej w Poznaniu (2) Klinika Psychiatrii Dorosłych Akademii Medycznej w Poznaniu (3) Pracownia Genetyki Psychiatrycznej Akademii Medycznej w Poznaniu Cel badania: Jadłowstręt psychiczny jest chorobą o wieloczynnikowej etiologii, w której postuluje się udział czynników genetycznych i modulujący wpływ czynników środowiskowych. Z tego względu model dziedziczenia jest dotąd nieznany, choć zakłada się udział kilku nawet kilkunastu genów o relatywnie niewielkim wpływie, których efekt kumuluje się. W niniejszej pracy podjęto badanie asocjacyjne polimorfizmu genu kodującego czynnik martwicy nowotworów (TNFα) z jadłowstrętem psychicznym (anorexia nervosa; AN). Osoby badane: Grupę badaną stanowiło 91 pacjentek z rozpoznaniem jadłowstrętu psychicznego, spełniających kryteria diagnostyczne DSM-IV oraz ICD-10. Grupa kontrolna składała się z 66 kobiet. Średnia wieku dla grupy badanej 18,22 (SD=3,13), średnia wieku dla grupy kontrolnej 27,49 (SD=5,52) Metoda: Polimorfizm badanych genów analizowano przy wykorzystaniu metod PCR-RFLP 1. Polimorfizm genu TNF45; polega na substytucji (-308G/A) w rejonie promotora. Wyniki: TNF: Nie stwierdziliśmy istotnej statystycznie różnicy w częstości występowania genotypów i alleli –308G/A genu TNF45; pomiędzy grupą chorych na jadłowstręt psychiczny a grupą kontrolną (p=0,084 dla genotypów, p=0,076 dla 83 Genetyka człowieka alleli). Prowadząc analogiczną analizę w podgrupach uwzględniających podział ze względu na podtyp jadłowstrętu, nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w częstości genotypów (p=0,700), jak i alleli (p=0,305) Wnioski: W przypadku genu TNFa; uzyskano trend częstszego występowania, allelu –308A w grupie osób chorych, jednak nieosiągającego w badanej grupie istotności statystycznej. P88. Comparison of the angiotensin-converting enzyme (ACE) gene polymorphism in patients with abdominal aortic aneurysm (AAA) versus patients with occlusiv disease. Aleksandra Korcz (1), Krzysztof Waliszewski (2), Marcin Gabriel (2), Grzegorz Oszkinis (2), Stanisław Zapalski (2), Ryszard Słomski (1) (1) Institute of Human Genetics, Polish Academy of Sciences, Poznań, Poland, (2) University of Medical Sciences, Poznań, Poland Abdominal aortic aneurysm (AAA) is a life-threatening condition affecting 4-9% of population with a risk increasing with age. Other risk factors include hypertension, atherosclerosis and smoking. Familial occurrence of abdominal aortic aneurysm indicates involvement of genetic factors in development of AAA. Angiotensin I-converting enzyme (ACE) is one of the key factors affecting blood pressure regulation and electrolyte balance. It was shown that half of the individual variability of the ACE plasma concentration is determined by an insertion (I)/deletion (D) polymorphism in intron 16 of the ACE gene. The relationship between insertion/deletion polymorphism in the ACE gene and number of cardiovascular diseases was observed however in case of abdominal aortic aneurysm contradictory results were obtained. In our studies we included patients with AAA and patients with occlusive disease treated in the Department of Vascular Surgery at University of Medical Sciences in Poznan to find if there is a correlation of the ACE genotype and susceptibility to aortic disease. Based on the PCR analysis of DNA samples extracted from peripheral blood we determined ACE genotypes in 3 selected groups: patients with AAA, patients with occlusive disease who underwent surgery and Polish population group. Clinical characteristics of patient from two groups included following data: age, sex, hypertension, hypercholesterolaemia, history of myocardial infarction, diabetes or emphysema and smoking. The frequency of ACE genotypes in two groups of patients was analyzed in relation to type of disease and clinical parameters, especially hypertension, and compared to Polish population group. P89. Występowanie polimorfizmów MTHFR i PON1 u kobiet z zespołem jajników policystycznych. Katarzyna Mel (1), Bartosz Kempisty (1) Joanna Sokołowska (1), Mariusz Łaciński (1), Alina Warenik-Szymankiewicz (2), Wiesław H. Trzeciak (1) (1) Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, (2) Katedra i Klinika Endokrynologii Ginekologicznej, Akademia Medyczna im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu Zespół jajników policystycznych (PCOS) jest jednym z najczęstszych schorzeń endokrynologicznych występujących u kobiet w wieku rozrodczym. Do najważniejszych objawów klinicznych należą: hiperandrogenizm, zaburzenia miesiączkowania, niepłodność oraz hiperinsulinemia. Najnowsze prace wskazują na podwyższenie poziomu homocysteiny (Hcy) w surowicy krwi kobiet z PCOS, wynikające przypuszczalnie z zaburzeń metabolizmu tego aminokwasu. Najczęstszą przyczyną hiperhomocysteinemii są mutacje lub polimorfizmy genów kodujących: reduktazę metylenotetrahydrofolianową (MTHFR), która katalizuje przemianę 5,10-metylenotetrahydrofolianu do 5-metylotetrahydrofolianu (donora grupy metylowej w reakcji remetylacji Hcy do Met) i paraoksonazę (PON1), rozszczepiającą tiolakton Hcy, cytotoksyczną formę tego aminokwasu. Tiolakton Hcy jest donorem reszt acylowych w reakcji homocysteinylacji białek, czego skutkiem jest obniżenie ich właściwości katalitycznych. Wcześniejsze prace odnosiły się wyłącznie do polimorfizmu C677T genu MTHFR. Brak jest natomiast doniesień dotyczących pozostałych polimorfizmów. Celem pracy było zbadanie częstości polimorfizmów: C677T, A1298C, G1793A genu MTHFR oraz A192G genu PON1 u kobiet z PCOS. Materiał do badań stanowiło DNA wyizolowane z krwi obwodowej 60 kobiet z PCOS oraz 100 kobiet zdrowych, stanowiących grupę kontrolną. Identyfikacji genotypów dokonano w oparciu o analizę RFLP-PCR, wykorzystując następujące enzymy restrykcyjne: HinfI (C677T), MboII (A1298C), MbiI (G1793A) oraz MboI (A192G). Częstości genotypów C677T, G1793A oraz A192G w badanych grupach nie wykazywały odstępstw od równowagi Hardy’egoWeinberga. W zakresie tych polimorfizmów nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic między grupą badaną 84 Genetyka człowieka a kontrolną, zarówno pod względem częstości genotypów, jak i częstości alleli. Częstość genotypów polimorfizmu A1298C w grupie z PCOS znacząco odbiega od równowagi Hardy’ego-Weinberga (p<10-6). Różnice częstości genotypów A1298C pomiędzy grupą badaną a kontrolną są istotne statystyczne (p=0.038). Uzyskane wyniki sugerują, że heterozygotyczność A1298C mogłaby zmniejszać ryzyko pojawienia się objawów PCOS. P90. Ocena roli polimorfizmów Pro12Ala i Pro115Gln genu PPAR-gamma w etiologii otyłości i cukrzycy typu II. Ryszard Ślęzak (1), Marek Demissie (2), Bożena Bidzińska (2), Urszula Tworowska (2), Tadeusz Dobosz (3), Andrzej Milewicz (2) (1) Zakład Genetyki Akademii Medycznej we Wrocławiu (2) Klinika Endokrynologii i Diabetologii Akademii Medycznej we Wrocławiu. (3) Zakład Medycyny Sądowej Akademii Medycznej we Wrocławiu. PPAR-gamma; (peroxisome proliferator activated receptor-gamma) jest czynnikiem transkrypcyjnym z grupy jądrowych receptorów sterydowych, uczestniczącym w procesie różnicowania się adipocytów i w metabolizmie lipidów oraz w homeostazie glukozy i insuliny. Sugeruje się, że PPAR poprzez udział w powstawaniu procesu zapalnego w ścianie naczyniowej oraz jako komponent zespołu oporności na insulinę może odgrywać kluczową rolę w powstawaniu naczyniowych powikłań w różnych zespołach metabolicznych. Nadmierna ekspresja PPAR w fibroblastach może prowadzić do przekształcania się tych komórek w komórki tłuszczowe. Wszystkie te dane mogą sugerować ważną rolę tego genu w etiologii otyłości, cukrzycy typu II i miażdżycy.Cel pracy: Przedstawiona praca miała na celu określenie związku między różnymi wariantami polimorficznymi genu PPAR– gamma; z otyłością oraz cukrzycą typu II.Materiał i Metody: Przebadano 220 osób (167 kobiet i 53 mężczyzn) w tym 126 osób z otyłością (BMI30kg/m2) korelując warianty polimorficzne Pro12Ala i Pro115Gln genu PPAR– gamma; z pomiarami antropometrycznymi (BMI, wskaźnik talia-biodro, pomiar ciśnienia tętniczego). W grupie badanej osób otyłych analizowano osobno grupę 53 osób z cukrzycą typu II. DNA wyizolowano z limfocytów krwi obwodowej metodą solno-fenolową, a do reakcji PCR wykorzystano startery flankujące obszary zawierające dwa ww warianty polimorficzne genu PPAR– 2. Produkt amplifikacji poddano działaniu enzymów restrykcyjnych HpaII i HindII. Wyniki: Genotyp Pro12Pro stwierdzono u 56% badanych (59% osób otyłych, 54% z należną masą ciała, 55% kobiet i 54% mężczyzn). Wariant heterozygotyczny Pro12Ala w całej grupie występował u 32%, w tym u 24% otyłych i 38% u osób z BMI< 25kg/m2, u 31% kobiet i 32% mężczyzn. Wariant Ala12Ala obserwowano u 12% osób badanych (17% otyłych i 8% grupy kontrolnej, 13% kobiet i 14% mężczyzn). Częstość allela Ala wynosiła w całej grupie 28%, u osób otyłych 29%, w grupie kontrolnej 27%, u kobiet 29% a u mężczyzn 30%. W grupie chorych na cukrzycę typu II częstość allela Ala wyniosła 25%. Nie stwierdzono znaczących statystycznie różnic w częstości występowania tego allela między grupą osób otyłych a grupą kontrolną, ani między kobietami a mężczyznami oraz w grupie chorych na cukrzycę. Obecność allela Ala nie miała także wpływu na ciśnienie tętnicze krwi. Osoby z wariantem Ala12Ala miały jednak wyższy BMI w porównaniu z grupami Pro12Pro i Pro12Ala. U żadnej z badanych osób nie stwierdzono wariantu Pro115Gln genu PPAR– gamma. P91. Wielokrotne nosicielstwo wariantów polimorficznych genów kandydujących różnicuje osoby z wczesną chorobą niedokrwienną serca od krwiodawców – wyniki badań pilotowych, część 1. Beata Sarecka (1), Anna Balcerzyk (1), Paweł Niemiec (1), Iwona Żak (1), Jolanta Krauze (2), Maria Trusz-Gluza (1) (1) Katedra i Zakład Biochemii i Genetyki Medycznej Śląskiej Akademi Medycznej ul. Medyków 18, 40– 752 Katowice (2) I Katedra i Klinika Kardiologi Ślaskiej Akademi Medycznej ul. Ziołowa 45/47, 40-635 Katowice Wstęp Choroba niedokrwienna serca (CHNS) jest chorobą wieloczynnikową. Polimorfizmy genów kandydujących, których produkty mogą promować inicjację, progresję lub regresję zmian miażdżycowych mogą mieć znaczenie w determinowaniu dziedzicznych predyspozycji do wystąpienia CHNS. Udział pojedynczych genów w patogenezie CHNS jest stosunkowo niewielki. Jednoczesne nosicielstwo wielu wariantów polimorficznych genów kandydujących może być związane z klinicznym obrazem choroby. Cel pracy Ocena zróżnicowania pacjentów z wczesną chorobą niedokrwienną serca oraz krwiodawców pod względem 85 Genetyka człowieka wielokrotnego nosicielstwa wariantów polimorficznych genów kandydujących.� Materiał i metody Badano 168 osób: grupa 1 – pacjenci z wczesną CHNS udokumentowaną koronarograficznie (n=80, wiek śr. 46.8); grupa 2 – krwiodawcy bez ostrych incydentów sercowo-naczyniowych i obciążeń rodzinnych chorobami sercowonaczyniowymi w wywiadzie (n=88, wiek śr 34.7). Genotypowano 9 polimorfizmów genów: polimorfizm I/D genu ACE, epsilon genu APOE, C242T genu CYBA, K469E genu ICAM-1, G→C w intronie 7 genu PPAR, C677T genu MTHFR, A561C genu dla CD62 E i polimorfizmy genu dla fibrynogenu α Thr312Ala i β G455A. Polimorfizm ACE genotypowano metodą PCR, pozostałe PCR-RLFP. Wyniki analizowano w programie STATISTICA 6.0. Wyniki W grupie chorych stwierdzono większą liczbę nosicieli kilku „promiażdżycowych” wariantów polimorficznych jednocześnie w porównaniu z grupą krwiodawców. Obserwacja ta stała się podstawą podziału obu grup na podgrupy A i B, uwzględniające liczbę nosicielskich wariantów polimorficznych (homozygoty jednego rodzaju + heterozygoty): podgrupa A – nosiciele 1 – 4 „promiażdżycowych” wariantów polimorficznych (<50%), podgrupa B – nosiciele 5 – 8 „promiażdżycowych” wariantów polimorficznych (>50%). U żadnej badanej osoby nie wykryto nosicielstwa wszystkich 9 wariantów polimorficznych. W grupie 1 stwierdzono, że połowa osób jest nosicielami 5 do 8 wariantów polimorficznych. W grupie 2 nosiciele 5-7 wariantów polimorficznych stanowią 29.5% a nosiciele 1-4 wariantów – 70.5%. W grupie 2 u żadnej osoby nie stwierdzono nosicielstwa 8 wariantów polimorficznych. Ponad połowa badanych wariantów polimorficznych występuje znacznie częściej wśród chorych niż u krwiodawców (p=0.0067, OR=2.38, CI; 1.26-4.51). Wnioski Wielokrotne nosicielstwo wariantów polimorficznych genów kandydujących różnicuje osoby z wczesną chorobą niedokrwienną serca od krwiodawców. P92. Analiza wielokrotnego nosicielstwa wariantów polimorficznych 9 genów kandydujących u osób z wczesną chorobą niedokrwienną serca – wyniki badań pilotowych, część 2. Beata Sarecka (1), Anna Balcerzyk (1), Paweł Niemiec (1), Iwona Żak (1), Jolanta Krauze (2), Maria Trusz-Gluza (1) (1) Katedra i Zakład Biochemii i Genetyki Medycznej Śląskiej Akademi Medycznej ul. Medyków 18, 40– 752 Katowice (2) I Katedra i Klinika Kardiologi Ślaskiej Akademi Medycznej ul.Ziołowa 45/47, 40-635 Katowice Wstęp Etiologia choroby niedokrwiennej serca (CHNS) jest najczęściej miażdżycopochodna i wynika z współdziałania licznych czynników genetycznych i środowiskowych. Na podłoże genetyczne, predysponujące do miażdżycy mogą składać się polimorficzne geny kandydujące, których produkty pełnią rolę w patogenezie tej choroby.� Cel pracy Wstępne określenie charakterystycznych wariantów polimorficznych dla pacjentów z CHNS – będących wielokrotnymi nosicielami (5-8 wariantów polimorficznych). Materiał i metody Badano 168 osób: grupa 1 – pacjenci z wczesną chorobą niedokrwienną serca potwierdzoną koronarograficznie (n=80, wiek śr. 46.8); grupa 2 – krwiodawcy bez obciążeń chorobami sercowo-naczyniowymi, także w rodzinie (n=88, wiek śr. 34.7). Genotypowano dziewięć polimorfizmów genów: polimorfizm I/D genu ACE, epsilon genu APOE, C242T genu CYBA, K469E genu ICAM-1, G→C w intronie 7 genu PPARα, C677T genu MTHFR, A561C genu dla CD62 E i polimorfizmy genu fibrynogenu (Fb) α Thr312Ala i β G455A. Polimorfizm ACE genotypowano metodą PCR, pozostałe PCR-RLFP. Osoby w obrębie obu badanych grup podzielono na podgrupy A i B, na podstawie liczby „promiażdżycowych” nosicielskich wariantów polimorficznych (homozygoty jednego rodzaju + heterozygoty): podgrupa A – nosiciele 0-4 „promiażdżycowych” wariantów polimorficznych (<50%), podgrupa B – nosiciele 5-9 promiażdżycowych wariantów polimorficznych (>50%). Wyniki Częstości „promiażdżycowych” wariantów polimorficznych wszystkich badanych genów w grupie 1B są wyższe, zarówno od odpowiednich wartości w grupie 1A i w grupie 2A. W grupie 1B częstości „promiażdżycowych” wariantów polimorficznych sześciu genów: ACE, Fbα, CYBA, MTHFR, APOE, ICAM-1 są wyższe; trzech genów: Fbβ, CD62 E, PPARα są niższe od odpowiednich wartości w grupie 2B. W grupie 1B 70% pacjentów jest jednoczesnymi nosicielami „promiażdżycowych” wariantów polimorficznych genów ACE i CYBA, podczas gdy w grupie B krwiodawców wartość ta wynosiła 46%. W grupie 1B 55% osób jest jednoczesnymi nosicielami trzech „promiażdżycowych” wariantów 86 Genetyka człowieka polimorficznych ACE, CYBA i ICAM-1, natomiast 50% nosicielami w genach ACE, CYBA i MTHFR. W grupie 2B wartości te wynosiły odpowiednio 31% i 35%. Wnioski Współwystępowanie „promiażdżycowych” wariantów polimorficznych genów ACE, CYBA, ICAM-1 lub ACE, CYBA, MTHFR jest charakterystyczne dla pacjentów z CHNS, którzy są wielokrotnymi nosicielami (5-8 wariantów polimorficznych). P93. Różnice w profilach polimorficznych alleli genów MTHFR, PON1 i ACE u chorych z zawałem mięśnia sercowego w zależności od współwystępowania nadciśnienia tętniczego i cukrzycy. Ewa Strauss (1), Andrzej L. Pawlak (1), Anna Safian (1), Mikołaj Pawlak (2), Jerzy Głuszek (3) (1) Instytut Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu (2) Klinika Neurologii Akademii Medycznej w Poznaniu (3) Klinika Nadciśnienia i Chorób Naczyń Akademii Medycznej w Poznaniu Polimorficzne genotypy MTHFR 677C>T, 1298A>C, PON1 –108C>T i ACE I/D oznaczono w grupie 107 mężczyzn z zawałem serca (ang. myocardial infarction, MI) oraz w grupie kontrolnej 45 zdrowych mężczyzn bez nadciśnienia tętniczego (AH) i cukrzycy typu 2 (T2DM). W grupie chorych u 33 osób (31%) stwierdzono zaburzenia metabolizmu glukozy, w tym u 31 osób (29%) rozpoznano T2DM, a u 2 osób (2%) nietolerancję glukozy (IGT). Nadciśnienie tętnicze, definiowane jako ciśnienie krwi powyżej 140/90 mm Hg, występowało u 59 osób (55%). U 24 osób (22%) stwierdzono współwystępowanie T2DM/IGT i AH, a 39 chorych (36%) nie miało zaburzeń metabolizmu glukozy i nadciśnienia. W grupie osób z MI stwierdzono podwyższenie częstości genotypów MTHFR 677CT/1298AA, 677CT/1298AC, 677TT/ 1298AA, 677CC/1298CC (67%) w stosunku do grupy kontrolnej (p=0,03), w której genotypy te występowały z częstością 47% (OR=2; 95%CI=1-4). Genotyp PON1 –108TT wiązał się z 2-krotnym wzrostem ryzyka MI (95%CI=1-5). W grupie chorych, u których współwystępowały T2DM/IGT i AH stwierdzono podwyższenie częstości genotypów MTHFR 677CT/1298AA, 677TT/1298AA, 677CC/1298CC (71%) w stosunku do grupy kontrolnej (p=0,003), w której genotypy te występowały z częstością 36% (OR= 4,4; 95%CI=1,5-12,9). W grupie tej stwierdzono również podwyższenie genotypów ACE II i ID (96%) wobec 78% w grupie kontrolnej (p=0,03; OR=6,6; 95%CI=0,8-54,9). W grupie chorych bez T2DM/IGT i nadciśnienia stwierdzono podwyższenie częstości homozygot MTHFR (41%) w stosunku do grupy kontrolnej (p=0,005), w której genotypy te występowały z częstością 16% (OR=3,8; 95%CI=1,410,6). W grupie tej stwierdzono również podwyższenie genotypów PON1 –108TT (36%) wobec 18% w grupie kontrolnej (p=0,03; OR=2,6; 95%CI=0,9-7,1). Granty nr KBN/AM 501-2-02-05 (J.G), KBN 3P05A 121 24 (E.S i A.P) P94. Polimorfizmy genów kodujących enzymy folianozależnych szlaków metabolicznych a ryzyko wystąpienia spina bifida. Jacek J. Pietrzyk, Mirosław Bik-Multanowski Katedra Pediatrii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie, e-mail: [email protected] Wstęp: Wady cewy nerwowej (WCN) należą do najczęstszych i najcięższych wad wrodzonych. Wystąpienie wady z tej grupy zazwyczaj prowadzi do śmierci lub ciężkiego kalectwa dziecka. Okołokoncepcyjna podaż kwasu foliowego jest znanym czynnikiem zmniejszającym o około 50-70% częstość występowania WCN. W ostatnich latach wykazano, że obecność polimorfizmów genów kodujących enzymy i białka związane z folianozależnymi szlakami metabolicznymi (reduktaza 5,10-metylenotetrahydrofolianowa, reduktaza syntazy metioniny, transkobalamina II) może stanowić czynnik ryzyka urodzenia dziecka z WCN. Celem pracy była ocena całkowitej częstości polimorfizmów genowych uznanych za czynniki ryzyka urodzenia dziecka z WCN w grupie matek dzieci z taką wadą. Metodyka: Badana populacja obejmowała 110 matek dzieci z izolowaną wadą cewy nerwowej o typie spina bifida (najczęściej występujący w Polsce rodzaj WCN). Zastosowano technikę PCR-RFLP umożliwiającą stwierdzenie obecności genotypów 677TT, 1298CC i 677T+1298C (gen reduktazy 5,10-metylenotetrahydrofolianowej), 66GG (gen reduktazy syntazy metioniny), 776GG (gen transkobalaminy II) uznanych za czynniki ryzyka wystąpienia WCN. Wyniki: Występowanie co najmniej jednego z powyższych genotypów stwierdzono u 55 (50%) matek. U 18 uczestniczek 87 Genetyka człowieka badania stwierdzono obecność dwóch a u 1 osoby trzech spośród badanych czynników ryzyka wystąpienia WCN. Wnioski: U około 50% matek dzieci z WCN można stwierdzić co najmniej jeden ze znanych genetycznych czynników ryzyka urodzenia dziecka z wadą. W związku z tym badania w kierunku obecności wymienionych polimorfizmów genowych powinny być rutynowo stosowane w ramach poradnictwa genetycznego w rodzinach obciążonych wystąpieniem spina bifida. Farmakogenetyka Komunikaty ustne: W50. Farmakogenetyczne aspekty skutecznej i bezpiecznej farmakoterapii. Barbara Gawrońska-Szklarz Zakład Farmakokinetyki i Terapii Monitorowanej, Katedra Farmakologii, Pomorska Akademia Medyczna w Szczecinie Wykrycie genetycznych różnic w aktywności enzymów metabolizujących leki (polimorfizm) pozwoliło na wyjaśnienie osobniczych różnic w działaniu i skuteczności stosowanej farmakoterapii i zapoczątkowało rozwój nowej dziedziny – farmakogenetyki. W związku z tym staje się bardziej zrozumiałe, dlaczego u niektórych osób ta sama dawka leku jest mniej skuteczna, a u innych wywołuje działania niepożądane. Ma to istotne znaczenie dla leków toksycznych, o wąskim współczynniku terapeutycznym. Różnorodność działania farmakologicznego tego samego leku u poszczególnych osób spowodowana jest zmianami w genotypie pacjenta, w szczególności gdy enzym metabolizujący lek, kodowany jest przez pojedynczy gen, w locus którego mogą występować różne allele. Oznacza to, że w danej populacji możemy wyróżnić fenotypowo odmienne grupy: osoby szybko metabolizujące leki (EM – extensive metabolizers), osoby z defektem enzymatycznym, które źle lub słabo metabolizują niektóre leki (PM – poor metabolizers) lub tzw. ultra-szybkich metabolizerów, wymagających znacznie większych dawek dla zapewnienia efektu terapeutycznego. Dotychczas zidentyfikowano kilkanaście enzymów, które wykazują genetyczny polimorfizm. Do najlepiej poznanych i ważnych z klinicznego punktu widzenia należą: izoenzymy cytochromu P450 (CYP450) odpowiedzialne za reakcje utleniania leków (CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2E1, CYP2D6, CYP3A4/5), enzym katalizujący reakcję acetylacji – N-acetylotransferaza (NAT2), metylotransferaza tiopuryny (TPMT) oraz metylotransferaza tiolowa (TMT) katalizujące reakcje metylacji, dehydrogenaza dihydropirymidyny (DPD) odpowiedzialna za katabolizm 5-fluorouracylu. Genetyczny polimorfizm wykazują także S-transferazy glutationu (GSTT, GSTM), które biorą udział w procesie sprzęgania ze zredukowanym glutationem związków epoksydowych lub aktywnych metabolitów powstałych w reakcjach utleniania. U osobników wolno metabolizujących obserwuje się kumulację leków, nasilone działanie farmakologiczne, ale też częściej występują działania niepożądane, a nawet toksyczne. Niepożądane działania leków mogą być także wynikiem interakcji między stosowanymi jednocześnie lekami, lekiem a składnikami diety lub stosowanymi używkami, które mogą indukować lub hamować aktywność enzymów cytochromu P450. Ma to szczególne znaczenie dla leków immunosupresyjnych, przeciwnowotworowych, hipolipemicznych, leków blokujących kanały wapniowe, psychotropowych i innych. Po sensacyjnych odkryciach końca XX wieku i poznaniu sekwencji wielu genów człowieka okazało się, że efekt farmakologiczny zależy nie tylko od genetycznie uwarunkowanej aktywności enzymów metabolizujących leki, ale także od ekspresji genów kodujących białka biorące udział w mechanizmie działania leków (kanały jonowe, receptory) oraz transporterów dla leków (gen MDR1 kodujący glikoproteinę P). Czynniki genetyczne w istotny sposób mogą zmieniać zarówno procesy farmakokinetyczne (wchłanianie, dystrybucja, metabolizm, wydalanie), którym podlegają leki w organizmie, jak i efekt farmakodynamiczny w miejscu działania leku. Osobnym zagadnieniem, którmu poświęca się obecnie wiele uwagi jest wyjaśnienie mechanizmów i poszukiwanie czynników regulujących ekspresję genów kodujących enzymy, receptory i białka transportujące leki. 88 Genetyka człowieka W51. Badania genotoksycznych właściwości etoksyquinu i jego pochodnych. Alina Błaszczyk (2), Janusz Skolimowski (1), Magdalena Górniak (2) (1) Katerda Chemii Organicznej, Uniwersytet Łódzki, ul. Narutowicza 68, 90-136 Łódź (2) Zakład Cytogenetyki i Biologii Molekularnej Roślin, Uniwersytet Łódzki, ul. Banacha 12/16, 90-237 Łódź Etoksyquin (1,2-dihydro-2,2,4-trimetylochinolina) jest związkiem o właściwościach przeciwutleniających i stosowany jest jako antyutleniacz w żywności oraz w paszy dla zwierząt. W wielu badaniach stwierdzono, że związek ten posiada właściwości antymutagenne i antykarcynogenne. W ostatnich latach jednak pojawiły się doniesienia o chorobach zwierząt karmionych paszą zawierającą etoksyquin, obserwuje się również niekorzystny jego wpływ na zdrowie osób zawodowo narażonych na jego działanie. W związku z powyższym prowadzone są prace nad poszukiwaniem nowych związków (w tym także analogów etoksyquinu), które miałyby równie silne właściwości antyoksydacyjne, a jednocześnie takich, które nie wpływałyby niekorzystnie na zdrowie człowieka i zwierząt. W niniejszej pracy przedstawiono wyniki badania wpływu etoksyquinu i jego pochodnych (chlorowodorku i fosforanu) na materiał genetyczny limfocytów człowieka. Badania przeprowadzono z zastosowaniem testu komety oraz testu mikrojądrowego; analizowano również zdolność tych związków do indukcji apoptozy (metoda TUNEL). Wyniki badań wskazują, że etoksyquin zastosowany w dawkach 0,01 – 0,05 mM ma zdolność do indukcji uszkodzeń DNA w teście komety oraz w wyższych stężeniach (0,05-0,25 mM) indukuje również powstawanie mikrojąder. Badane pochodne etoksyquinu posiadają słabsze właściwości genotoksyczne. Etoksyquin posiada również zdolność do indukowania apoptozy w hodowanych limfocytach człowieka, szczególnie po zastosowaniu go w stężeniach 0,25 i 0,5 mM. Praca finansowana z grantu KBN nr 3 PO4C 021 24. W52. Poziom uszkodzeń endogennych oraz wydajność systemów naprawy DNA w komórkach błony śluzowej żołądka zainfekowanych H. pylori. Michał Arabski (1), Maria Kasprzak (2), Grażyna Klupińska (2), Maria Wiśniewska-Jarosińska (3), Paweł Kaźmierczak (3), Józef Drzewoski (4), Jan Chojnacki (2), Janusz Błasiak (1) (1) Katedra Genetyki Molekularnej, Uniwersytet Łódźki (2) Klinika Gastroenterologii i Chorób Wewnętrznych, Uniwersytet Medyczny (3) Pracownia Gastroenterologiczna, Szpital Zakonu Bonifratrów Św. Jana Bożego (4) Katedra Farmakologii, Zakład Farmakologii Klinicznej z Oddziałem Chorób Wewnętrznych, Uniwersytet Medyczny Helicobacter pylori jest powszechnym patogenem człowieka, który może odgrywać znaczącą rolę w kancerogenezie komórek błony śluzowej żołądka. Rozwój choroby nowotworowej może być związany z obniżeniem wydajności naprawy uszkodzeń DNA oraz wzrostu wrażliwości na mutageny środowiskowe. Ponadto, wydajność naprawy DNA może być zaburzona przez efekty uboczne chemioterapii oraz oporność komórkową na leki stosowane w eradykacji H. pylori. Celem pracy było określenie związku pomiędzy poziomem infekcji H. pylori a wydajnością systemów naprawy komórek żołądka. Zamierzone cele zrealizowaliśmy poprzez: 1) ocenę kinetyki naprawy uszkodzeń DNA komórek błony śluzowej żołądka wywołanych nadtlenkiem wodoru i antybiotykiem-amoksycyliną, 2) określenie poziomu oksydacyjnych i alkilacyjnych uszkodzeń endogennych w komórkach żołądka w zależności od poziomu infekcji H. pylori. W badaniach zastosowaliśmy wersję alkaiczną testu kometkowego (comet assay). Uszkodzenia oksydacyjne i alkilacyjne ocenialiśmy przez zastosowanie glikozylazy formamidopirymidynowej DNA (Fpg) oraz glikozylazy 3-metyloadeninowej DNA II (AlkA). Uzyskane wyniki wskazują na wolniejszą kinetykę naprawy uszkodzeń DNA komórek błony śluzowej żołądka wywołanych nadtlenkiem wodoru i amoksycyliną od osób z infekcją H. pylori w stosunku do grupy kontrolnej. Poziom oksydacyjnych i metylacyjnych uszkodzeń spontanicznych był wyższy u osób z infekcją H. pylori. Uzyskane wyniki wskazują na genotoksyczny efekt infekcji H. pylori, który może odgrywać znaczącą rolę w mechanizmie kancerogenezy. Ocena poziomu uszkodzeń DNA oraz wydajność ich naprawy w powiązaniu z infekcją bakteryjną może stanowić marker rozwoju raka żołądka. Praca wykonana w ramach grantu UŁ 505/450 (MA, JB). 89 Genetyka człowieka W53. Inhibitor kinaz tyrozynowych STI571 przełamuje oporność komórek białaczkowych na doksorubicynę w mechanizmie zależnym do naprawy DNA. Ireneusz Majsterek, Tomasz Śliwiński, Dariusz Pytel, Janusz Błasiak Katedra Genetyki Molekularnej, Uniwersytet Łódzki STI571 (Imatinib mesylate) jest specyficznym inhibitorem onkogennej kinazy tyrozynowej BCR/ABL stosowanym z dużym powodzeniem w leczeniu przewlekłej białaczki szpikowej (CML). Pomimo to dokładny mechanizm odpowiedzi na hamowanie aktywności BCR/ABL przez STI571 jest ciągle niejasny. W naszych badaniach stwierdziliśmy, że jednym z mechanizmów aktywności STI571 może być hamowanie naprawy DNA, a w następstwie przełamywanie lekooporności towarzyszącej leczeniu białaczek. W tym celu posłużyliśmy się komórkami K562 pobranym od BCR/ ABL-pozytywnych pacjentów z CML (K562S) oraz komórkami charakteryzującymi się nabytą opornością na leczenie doksorubicyną (K562R). Lekooporność określana była na podstawie testu przeżywalności MTT. Posługując się metodą elektroforezy pojedynczych komórek (comet assay) wykazaliśmy, że w przeciwieństwie do komórek K562S, komórki z nabyta opornością charakteryzowały się wzmożoną kinetyką naprawy uszkodzeń DNA indukowanych działaniem doksorubicyny w stężeniach 0,5 i 1 mM. Wstępna inkubacja komórek z inhibitorem STI571 w stężeniu 1 mM efektywnie odwracała oporność i powodowała hamowanie naprawy DNA. Analiza Western Blot z przeciwciałami dla białka adaptorowego CRKL szlaku BCR/ABL, wykazała blokowanie jego fosforylacji w odpowiedzi na STI571, co potwierdziło hamowanie aktywności kinazy. Uzyskane wyniki sugerują że jednym z molekularnych mechanizmów aktywności STI571 w komórkach z ekspresją BCR/ABL może być modulowanie szlaku naprawy DNA, co w następstwie prowadzić może do przełamania lekooporności podczas terapii białaczek. Praca finansowana z grantu KBN 3P04 A03325. W54. Asocjacja wariantu allelicznego syntazy leukotrienu C4 z nadwrażliwością na niesteroidowe leki przeciwzapalne. Marek Sanak, Lucyna Mastalerz, Małgorzata Setkowicz, Daniel Potaczek, Andrzej Szczeklik II Katedra Chorób Wewnętrznych, Collegium Medicum UJ, ul. Skawińska 8, 31-066 Kraków Nadwrażliwość na niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) dotyczy 0,5-1% populacji ogólnej i 5-10% chorych na astmę. Manifestuje się wysypką, łzawieniem i/lub napadem astmy oskrzelowej po przyjęciu leku. Objawy te mają związek z uwalnianiem mediatorów zapalnych z mastocytów, a chorych charakteryzuje nadprodukcja leukotrienów cysteinylowych i eozynofilia. Celem badania było ustalenie związku między nadwrażliwością na NLPZ a promotorowym polimorfizmem genu dla syntazy leukotrienu C4 (LTC4S). Enzym ten kontroluje biosyntezę leukotrienów, pochodnych szlaku 5-lipoksygenacji kwasu arachidonowego. Zbadano 186 chorych na astmę, 74 na przewlekłą pokrzywkę idopatyczną i 75 zdrowych. Nadwrażliwość na NLPZ potwierdzono doustną lub wziewną próbą prowokacyjną z kwasem acetylosalicylowym. Polimorfizm A-444>C LTC4S genotypowano techniką PCR-RFLP, wydalanie leukotrienów cysteinylowych (LTE4) mierzono w moczu ELISA. U 76 chorych na astmę i 30 chorych na pokrzywkę wynik prowokacji kwasem acetylosalicylowym był dodatni. Częstość allela – 444C LTC4S była u nich znamiennie większa (astma-0,39, pokrzywka-0,41, p<0,05) niż u chorych tolerujących NLPZ (astma-0,27, pokrzywka-0,22). U zdrowych częstość allela – 444C była jak u chorych tolerujących NLPZ (0.27). Wydalanie LTE4 u chorych z nadwrażliwością na NLPZ było znamiennie większe niż u tolerujących te leki, czy też kontroli. W 2 i 4 godzinie po próbie prowokacyjnej stwierdzono większe przyrosty LTE4 w moczu u nosicieli – 444C niż u homozygot AA. NLPZ, ogólnie dostępne i najczęściej przyjmowane leki, powodują napad astmy lub pokrzywkę u chorych z nadprodukcją leukotrienów cysteinylowych. Wykazano asocjację nadwrażliwości na NLPZ z promotorowym wariantem – 444C LTC4S. 90 Genetyka człowieka Komunikaty plakatowe: P95. Porównanie częstości aberracji chromosomowych, wymian chromatyd siostrzanych (SCE) i kinetyki podziałów komórkowych w hodowli limfocytów poddanych działaniu substancji z Ascaris – frakcji białek i oczyszczonego inhibitora trypsyny. Tomasz Ferenc (1), Wanda Bratkowska (1), Dobrosława Łopaczyńska (1), Henryk Stróżyński (2), Joanna Błaszkowska (3) (1) Zakład Biologii i Genetyki UM w Łodzi, 90-647 Łódź, Plac Hallera 1 (2) Katedra i Klinika Chorób Zakaźnych UM w Łodzi, 91-347 Łódź, ul. Kniaziewicza 1/5 (3) Zakład Biologii i Parazytologii Lekarskiej UM w Łodzi, 90-647 Łódź, Plac Hallera 1 Wcześniejsze badania własne aktywności biologicznej substancji pochodzących z Ascaris suum wykazały, że białka glisty o właściwościach antytryptycznych zaburzają rozwój zarodkowy zwierząt doświadczalnych. Celem pracy było porównanie ewentualnych właściwości mitostatycznych i genotoksycznych związków otrzymanych z tego nicienia – frakcji białek wykazujących aktywność antytryptyczną i wyizolowanego z tej frakcji inhibitora trypsyny. Białka frakcji SF5 (nie oczyszczony inhibitor trypsyny –NIT) otrzymano z homogenatu wora powłokowo-mięśniowego Ascaris suum zmodyfikowaną metodą Roli i Pudlesa. Izolację i oczyszczenie inhibitora trypsyny (IT) z frakcji SF5 homogenatu prowadzono wykonując filtrację żelową na Sephadexie G-25. Otrzymaną frakcję po sączeniu molekularnym poddano elektroforezie SDS-PAGE. Oczyszczony IT wykazywał 10– krotnie wyższą aktywność inhibicją wobec krystalicznej trypsyny w porównaniu z NIT. Ocenę genotoksyczności prowadzono na płytkach metafazowych uzyskanych na drodze makrohodowli limfocytów krwi obwodowej człowieka. Przeprowadzono test aberracji strukturalnych chromosomów (hodowla 48 godz.) i test wymian chromatyd siostrzanych (hodowla 72 godz.). Zarówno IT jak i NIT dodawano na starcie hodowli w obu testach, w dawkach: 25, 50, 100 mg/ml (ekspozycja ciągła). Kinetykę podziałów komórkowych określano za pomocą indeksu replikacyjnego (IR). Indeks mitotyczny (IM) wyrażano jako liczbę metafaz w odniesieniu do 1000 analizowanych jąder. Wstępne wyniki badań przedstawiają ocenę genotoksyczności IT oraz NIT bez egzogennej aktywacji metabolicznej. Badane za pomocą testu aberracji chromosomowych związki ( IT, NIT) nie zwiększały częstości aberracji chromosomowych w porównaniu z kontrolą, natomiast istotnie obniżały wartość indeksu mitotycznego. W teście SCE zanotowano zwiększoną częstość wymian chromatyd siostrzanych po ekspozycji limfocytów zarówno na IT jak i NIT. Analiza wartości IR wykazała stymulujący wpływ na dynamikę podziałów komórkowych obu badanych związków z Ascaris. W zastosowanych testach nie stwierdzono zależności efekt-dawka dla IT i NIT. Uzyskane wyniki dla IT i NIT w testowanych dawkach były zbieżne. Wstępne wyniki wykazały, że różny stopień aktywności antytryptycznej badanych białek z Ascaris nie ma znaczącego wpływu na aktywność mitotyczną limfocytów. */ Praca finansowana przez UM w Łodzi w ramach tematu własnego nr 502-11-771(5). P96. Ocena cyto– i genotoksyczności cis-dichlorobis(dietylo-pirydyn-4-ylometylofosforano-κΝ) platyna II, nowego analogu cis-diamminodichloroplatyny II w komórkach niedrobnokomórkowego raka płuca A549. Katarzyna Dinkler (1), Ksenia Matławska (1), Urszula Kalinowska (2), Renata Kontek (1), Regina Osiecka (1), Justyn Ochocki (2) (1) Zakład Cytogenetyki i Biologii Molekularnej Roślin, Uniwersytet Łódzki (2) Zakład Chemii Bionieorganicznej, Uniwersytet Medyczny, Łódź Cis-diamminodichloroplatyna (II) (cis-DDP) jest obecnie jednym z najczęściej stosowanych leków przeciwnowotworowych. Wykorzystuje się ja m.in. w chemioterapii zarodkowych nowotworów jądra, jajnika, niedrobnokomórkowego i drobnokomórkowego raka płuca, raka pęcherza moczowego, raka szyjki macicy, sutka, żołądka. Cis-DDP powoduje jednak szereg skutków ubocznych takich jak, nefrotoksyczność, neurotoksyczność, mielotoksyczność, ototoksyczność, zaburzenia żołądkowo-jelitowe, co poważnie ogranicza jej zastosowanie 91 Genetyka człowieka w chemioterapii przeciwnowotworowej. Z tego względu nieustannie poszukuje się nowych pochodnych związków platyny, równie skutecznych w eliminowaniu komórek nowotworowych ale charakteryzujących się obniżoną toksycznością w stosunku do zdrowych tkanek i narządów. W Zakładzie Chemii Bionieorganicznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi zsyntetyzowano nowy analog cis-DDP: cis-dichlorobis-(dietylo-pirydyn-4-ylometylofosforano– κΝ) platyna II, (PtEMPA(IV)). Celem badań było oszacowanie potencjalnej cytotoksyczności (test MTT) i genotoksyczności (test elektroforezy pojedynczych komórek w żelu agarozowym – „comet assay”) PtEMPA(IV) w komórkach linii niedrobnokomórkowego raka płuc A549. Uzyskane wyniki wskazują, iż nowy analog cis-DDP wywiera silny efekt cyto– i genotoksyczny na komórki linii A549 w porównaniu z cis-DDP. Otrzymane rezultaty wydają się być bardzo obiecujące i rodzą konieczność kontynuacji badań. Projekt częściowo finansowany z grantu UM 503-100-3. P97. Izomery 5– i 6– fosforanowych pochodnych pirymidyn (analogi 5-fluorouracylu) – ocena potencjalnej genotoksyczności testem komety w linii niedrobnokomórkowego raka płuca A549. Ksenia Matławska (1), Katarzyna Dinkler (1), Kamila Domińska (1), Ewa Złobecka (1), Renata Kontek (1), Urszula Kalinowska (2), Regina Osiecka (1), Justyn Ochocki (2) (1) Zakład Cytogenetyki i Biologii Molekularnej Roślin, Uniwersytet Łódzki (2) Zakład Chemii Bionieorganicznej, Uniwersytet Medyczny, Łódź Niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC; ang. non-small cell lung cancer) stanowi 75 % wszystkich nowotworów płuc (ok. 400 tys. przypadków rocznie w krajach rozwiniętych). Pozostałe rozpoznawane przypadki nowotworów płuca stanowi rak drobnokomórkowy (SCLC). W Polsce co roku na raka płuca zapada ok. 20 tys. osób. NSCLC charakteryzuje się dużą frakcja wzrostową oraz krótkim czasem podwojenia, co wiąże się z jego wrażliwością na cytostatyki. W chemioterapii niedrobnokomórkowego raka płuca czynnikiem ograniczającym jej stosowanie jest szerokie spektrum skutków ubocznych spowodowanych dużą toksycznością aplikowanych leków. Te obserwacje rodzą konieczność poszukiwania nowych związków skutecznych w chemioterapii, ale charakteryzujących się obniżoną toksycznością w stosunku do zdrowych komórek. Zsyntetyzowano fosforanowe pochodne pirymidyn będące nowymi analogami 5fluorouracylu: kwas 5-uracylometylofosfonowy (5-umpa), ester dimetylowy 5-umpa (5umpm), ester dietylowy 5-umpa (5-umpe), kwas 6-uracylometylofosfonowy (6-umpa), ester dimetylowy 6-umpa (6-umpm) i ester dietylowy 6-umpa (6-umpe). Celem badań było oszacowanie potencjalnej genotoksyczności 5-fluorouracylu oraz wyżej wymienionych jego pochodnych w komórkach linii niedrobnokomórkowego raka płuc A549. Jako podstawę oceny skuteczności biologicznej wybrano pomiar poziomu uszkodzeń DNA metodą elektroforezy pojedynczych komórek w żelu agarozowym (test komety). Przeprowadzono alkaliczną wersję testu komety. Uzyskane wyniki wskazują, iż 5-umpa, 5umpm, 5-umpe, 6-umpa, 6-umpm, 6-umpe wywierają efekt genotoksyczny na komórki A549, w zakresie zastosowanych stężeń. Wyniki te wydają się być niezmiernie istotne ze względu na niewielką genotoksyczność ww. nowych analogów 5-fluorouracylu w stosunku do zdrowych komórek – limfocytów krwi obwodowej człowieka [Matławska i wsp., npbl.]. Kontynuacja badań pozwoli w przyszłości na wybranie związku najbardziej aktywnego i selektywnie eliminującego komórki zmodyfikowane nowotworowo. Badania częściowo finansowane z grantu UM 503-100-3. P98. Analiza cytotoksyczności kompleksu trans-Pd EMPA(II) i trans-Pd EMPA(IV) w prawidłowych limfocytach w porównaniu z cis-DDP. Renata Kontek (1), Ksenia Matławska (1), Urszula Kalinowska (2), Justyn Ochocki (2), Regina Osiecka (2) (1) Zakład Cytogenetyki i Biologii Molekularnej Roślin, Uniwersytet Łódzki (2) Zakład Chemii Bionieorganicznej, Uniwersytet Medyczny, Łódź Cis-DDP (cisplatyna) należy do leków powszechnie stosowanych w chemioterapii wielu nowotworów, zwłaszcza raka pęcherza moczowego, jajnika, jądra, piersi, głowy i szyi. Cis-DDP jest lekiem alkilującym, działającym niezależnie od cyklu komórkowego. tworzy wewnątrzkomórkowe oraz międzyniciowe wiązania krzyżowe z DNA, jak również połączenia z białkiem i monoaddukty. Pomimo dużej skuteczności terapeutycznej cis-DDP wykazuje szereg działań niepożądanych, dlatego też współcześnie podejmuje się próby uzyskania nowych analogów cis-DDP, które byłyby skuteczne w chemioterapii przy równoczesnym obniżeniu cytotosyczności. 92 Genetyka człowieka Do badań wykorzystano test MTT {3(4,5-dimethylthaziol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide], który polega na określeniu metabolizmu energetycznego komórek przez pomiar aktywności jednego z enzymów oddechowych. Wyniki ww. testu pozwoliły oszacować wartości IC50 czyli stężenia związku, które powoduje 50% zahamowanie wzrostu komórek po ich inkubacji przez 72h. Prace zostały przeprowadzone na komórkach prawidłowych – limfocytach krwi obwodowej, pochodzących od 2-3 zdrowych, niepalących dawców. Do badań wykorzystano nowe analogi cis-DDP: trans-PdEMPA(II) tj. trans-dichlorobis(dietylo-pirydyn-2-ylometylofosforano– kN)pallad(II) oraz trans-PdEMPA(IV) tj. trans-dichlorobis(dietylo-pirydyn-4-ylometylofosforano– κΝ)pallad(II). Na podstawie przeprowadzonego testu MTT wartość IC50 dla PdEMPA(II) wynosiła 215,49 µΜ, dla PdEMPA(IV) 255,08 µΜ, natomiast dla cis-DDP 6,83 µΜ. Wyniki te wskazują na znacznie niższą cytotoksyczność badanych związków w porównaniu z cis-DDP w prawidłowych limfocytach krwi obwodowej człowieka. Badania częściowo finansowane z grantu UM 503-100-3. Onkogenetyka Komunikaty plakatowe: W55. A High Proportion of Founder BRCA1 Mutations in Polish Breast Cancer Families. B. Górski (1), A. Jakubowska (1), T. Huzarski (1), T. Byrski (1), J. Gronwald (1), E. Grzybowska (2), A. Mackiewicz (3), M. Stawicka (4), M. Bębenek (5), D. Sorokin (5) , Ł. Fiszer-Maliszewska (6), O. Haus (7), H. Janiszewska (7), S. Niepsuj (8), S. Góźdź (9), L. Zaremba (10), M. Posmyk (10) , M. Płużańska (11), E. Kilar (12), D. Czudowska (13), B. Waśko (14), R. Miturski (15), J. R. Kowalczyk (16), K. Urbański (17), M. Szwiec (18), J. Koc (17), A .Rozmiarek (19), T. Dębniak (1), C. Cybulski (1), E. Kowalska (1), A. Tołoczko-Grabarek (1), S. Zajączek (1), J. Menkiszak (20) , K. Mędrek (1), B. Masojć (1), M. Mierzejewski (1), S. Narod (21), J. Lubiński (1) (1) Department of Genetics and Pathology, International Hereditary Cancer Center Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland (2) Department of Clinical Genetics, Bydgoszcz Medical University, Poland (3) Department of Cancer Immunology,Great Poland Cancer Center and University School of Medical Sciences, Poznań, Poland (4) Prophylactic and Epidemiology Center, Poznań, Poland (5) Regional Oncology Center, Wrocław, Poland (6) Institute of Immunology & Experimental Therapy, Wrocław, Poland (7) Department of Tumor Biology, Maria Skłodowska-Curie Memorial Institute Gliwice, Poland (8) Department of Pulmonology and Oncology, Regional Oncology Hospital, Olsztyn, Poland (9) Holycross Oncology Center, Kielce, Poland (10) Regional Oncology Center, Białystok, Poland (11) Department of Chemotherapy, Medical Academy, Łódź, Poland (12) Department of Chemotherapy, Regional Hospital, Świdnica, Poland (13) Oncology Diagnostic Center, Legnica, Poland (14) Regional Hospital No 1, Rzeszów, Poland (15) Department of Gynecology, Medical Academy, Lublin, Poland (16) Cancer Genetics Counseling Unit Medical University, Lublin, Poland (17) Regional Oncology Center, Kraków, Poland (18) Regional Oncology Hospital, Opole, Poland (19) Regional Oncology Hospital, Zielona Góra, Poland (20) Chair and Clinic of Surgical Gynecology and Gynecological Oncology of Adults and Adolescents, Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland (21) Centre for Research in Women`s Health, University of Toronto, Canada Three mutations in BRCA1 (5382insC, C61G and 4153delA) are common in Poland and account for the majority of mutations identified to date in Polish breast and breast-ovarian cancer families. It is not known, however, to what 93 Genetyka człowieka extent these three founder mutations account for all of the BRCA mutations distributed throughout the country. This question has important implications for health policy and for the design of epidemiologic studies. To establish the relative contributions of founder and non-founder BRCA mutations, we established the entire spectrum of BRCA1 and BRCA2 mutations in large set of breast/ovarian cancer families with origins in all regions of Poland. We sequenced the entire coding regions of the BRCA1 and BRCA2 genes in 100 Polish families with three or more cases of breast cancer and in 100 families with cases of both breast and ovarian cancer. A mutation in BRCA1 or BRCA2 was detected in 66% of the breast cancer families and in 63% of the breast-ovarian cancer families. 122 of 129 mutations were in BRCA1 (94.6%) and seven were in BRCA2 (5.4%). Of the 122 families with BRCA1 mutations, 119 (97.5%) had a recurrent mutation (i.e. one that was seen in at least two families). In particular, 111 families (91.0%) carried one of three common founder mutations. The mutation spectrum was not different between families with and without ovarian cancer. These findings suggest that a rapid and inexpensive assay directed at identifying three common founder mutations will have a sensitivity of 86%, compared to a much more costly and labor intensive full sequence analysis of both genes. This rapid test will facilitate large-scale national epidemiology and clinical studies of hereditary breast cancer, including potentially studies of chemoprevention. W56. Analiza częstości mutacji i utraty heterozygotyczności (LOH) w genie PTEN w rakach jajnika. Iwona Kolasa (1), A. Janiec-Jankowska (2), J. Plisiecka-Hałasa (1), A. Dansonka-Mieszkowska (1), B. Konopka (2) Kupryjańczyk (1) (1) Zakład Patologii Molekularnej, Centrum Onkologii-Instytut, ul. Roentgena 5, 02-781 Warszawa (2) Zakład Endokrynologii, Centrum Onkologii-Instytut, ul. Roentgena 5, 02-781 Warszawa Mutacje genu supresorowego PTEN, zlokalizowanego na chromosomie 10q23.3, występują w wielu typach sporadycznych nowotworów. PTEN koduje fosfatazę o podwójnej specyficzności substratowej. Jako fosfataza fosfoinozytolu hamuje aktywację kinazy białkowej AKT, natomiast jako fosfataza białkowa bierze udział w regulacji migracji i inwazyjności komórek. Zbadano 107 guzów jajnika (w tym 62 raki surowicze, 17 endometrioidalnych, 12 śluzowych, 8 jasnokomórkowych i inne) pod kątem zaburzeń genu PTEN. Mutacji poszukiwano we wszystkich 9 egzonach genu techniką PCR-SSCP i sekwencjonowania. Mutacje w genie PTEN stwierdzono w 6 rakach jajnika (ok. 6%): w 4 endometrioidalnych, jednym jasnokomórkowym i jednym surowiczym. Trzy mutacje (Ala126Asp, Arg130Stop, Arg142Trp) wykryto w egzonie 5, kodującym domenę katalityczną fosfatazy, dwie w egzonie 3 (delecję 37 pz i insercję A) oraz jedną w egzonie 7 (delecja 5 pz). W 6 guzach stwierdzono neutralny polimorfizm genetyczny GGCGGT (Gly44Gly) w egzonie 2. Badanie utraty heterozygotyczności (LOH) wykonano na materiale 76 guzów przy użyciu 6 markerów DNA. Poszczególne loci genu z tkanki nowotworowej i kontrolnej amplifikowano metodą fluorescencyjną i rozdzielano na sekwenatorze. LOH stwierdzono w 25 guzach, co stanowi 32% analizowanych przypadków. LOH wykryto w 58% raków endometrioidalnych, 29% jasnokomórkowych i 29% surowiczych oraz w 25% śluzowych. Uzyskane wyniki pokazują, że mutacje w genie PTEN w rakach jajnika są rzadkie (6%). Znacznie częściej występuje utrata drugiego allelu genu (32%). Powyższe zmiany są najliczniejsze w typie endometrioidalnym raka. W57. BMP-1 variants in leiomyoma and other tumors. Aleksandra Auguściak (1), Marta Lesiak (1), Martyna Dubrawska (1), Ksymena Urbanek (1), Maciej Kajor (2), Dariusz Gołka (2), Anna Zborek (3), Gene C. Kopen (4), Aleksander L. Sieroń (1) (1) Katedra i Zakład Biologii Ogólnej, Molekularnej i Genetyki, Śląska Akademia Medyczna, Katowice, Poland (2) Zakład Patomorfologii, Śląska Akademia Medyczna, Katowice, Poland (3) Zakład Biologii Molekularnej, Instytut Onkologii, Gliwice, Poland (4) Neuronyx, Inc., Malvern, PA. http://biolmolgen.slam.katowice.pl Three products of BMP-1 gene that are crucial for conversion of type I, II, III, and V procollagens to self-assembling monomers, activation of laminin-5, prolysyl oxidase, probiglycan, and morphogenetic molecules BMP-2 and BMP-4 have been localized in 21 different human tumors. In most tumors it localized predominantly in extra cellular matrix. However, in leiomyoma and epithelioid sarcoma the protein additionally localized in cytoplasm and nuclei of tumor cells. Distinguished signal for BMP-1 variants in blood vessels was obtained in Ewing tumors. The RT-PCR analysis 94 Genetyka człowieka revealed that the variants detected by immunostaining in non tumor tissues of human uterus were mainly BMP-1 and BMP-1/His (83%). The largest variant of BMP-1 gene product (mTLD) has been detected in 50% of non tumor samples. In leiomyoma the mRNAs for all three variants have been found in 83% of the patients but they expression differed in different patients. In general there has been no evidence of consistence in variants expression regardless of tumor type, thus, it could indicate disregulation of the alternative mRNA splicing under pathological conditions. Therefore, we believe that the enzymes could be potentially an attractive target for development of inhibitors of matrix formation and consequently an inhibition of angiogenesis in tumors. W58. Amplifikacja hTERT i hTERC a aktywność telomerazy w wybranych nowotworach wieku dziecięcego. Jerzy Nowak, D. Januszkiewicz-Lewandowska, M. Zawada, M. Pernak, P. Makowski, K. Nowicka, J. Rembowska, K. Lewandowski Instytut Genetyki Człowieka PAN, Klinika Hematologii i Onkologii Dziecięcej Akademii Medycznej, Zakład Diagnostyki Medycznej Poznań Telomeraza jest kompleksem rybonukleoproteinowym złożonym z odwrotnej transkryptazy (hTERT), białka (TP1) i RNA (hTR) stanowiącego matrycę do syntezy telomerowego DNA. Reaktywacja telomerazy odgrywa istotną rolę w procesie immortalizacji komórki oraz w rozwoju procesu nowotworowego. W wybranych guzach litych (guz Wilmsa, neuroblastoma) oraz w schorzeniach limfoproliferacyjnych (ostra białaczka limfoblastyczna-ALL i nielimfoblastycznaANLL) u dzieci stwierdzono wysoką aktywność telomerazy pozwalającą na odróżnienie komórek nowotworowych od prawidłowych. Podobnie badania ekspresji trzech podjednostek telomerazy udowodniły znaczące różnice ilościowe pomiędzy komórkami prawidłowymi i nowotworowymi. Uzyskane wyniki wskazują, że ilościowe oznaczenie aktywności i ekspresji telomerazy może stanowić pomocny marker diagnostyczny i prognostyczny rozwoju procesu nowotworowego. Ponadto w przypadku guzów litych wyższa aktywność i ekspresja telomerazy sugeruje występowanie mikroprzerzutów w materiale pobranym z obrzeża guza, węzłów chłonnych i szpiku. Badania z zastosowaniem techniki FISH wykazały amplifikację genów hTERT i hTERC w komórkach guzów litych i ostrych białaczek białaczek dzieci. Uzyskane wyniki wskazują, że wysoka aktywność i ekspresja telomerazy w komórkach nowotworowych najprawdopodobniej jest spowodowana amplifikację genów hTERT i hTERC.� Praca wykonana w ramach projektów PBZ-KBN-090/PO5/2003 oraz KBN 6PO5E 10220. W59. Zwiększenie czułości techniki CESH na przykładzie analizy przypadku nowotworu jądra. Beata Grygalewicz (1), Barbara Pieńkowska-Grela (1), Brenda Summersgill (2), Alan Mcintyre (2), Janet Shipley (2) (1) Samodzielna Pracownia Cytogenetyki, Centrum Onkologii Instytut Warszawa ul. Roentgena 5 (2) Male Uriological Cancer Research Centre, Institute of Cancer Research, 15 Cotswold Road, Sutton, UK Zarodkowe guzy jąder stanowią jedynie około 2% wszystkich nowotworów, lecz jednocześnie są najczęściej diagnozowanym nowotworem występującym u młodych dorosłych mężczyzn. Pod względem cytogenetycznym guzy jąder charakteryzują się okołotriploidalną zawartością DNA. Najbardziej charakterystyczną zmianą kariotypową, w tej grupie nowotworów, jest występowanie dodatkowych kopii krótkiego ramienia chromosomu 12, głównie w formie izochromosomu i(12p) jak również pod postacią markerów substytutywnych niosących powielony materiał 12p. Zastosowanie techniki CESH (Comparative Expressed Sequence Hybridisation) umożliwia detekcję profilu ekspresji genów wzdłuż poszczególnych chromosomów. Zasada działania tej techniki jest analogiczna do metody CGH (Comparative Genomic Hybridisation), z tą różnicą, że materiałem wyjściowym do analizy CESH jest RNA, podczas gdy analizę CGH przeprowadza się na podstawie DNA. Obecna praca przedstawia analizę ekspresji przypadku guza przeprowadzoną dwoma metodami: oryginalną, wykorzystującą amplifikację DOP oraz nową, polegającą na bezpośrednim znakowaniu fluorescencyjnym cDNA, z pominięciem etapu amplifikacji DOP. Porównanie uzyskanych wyników wykazało, że użycie zmodyfikowanego protokołu ujawniło znacznie większy poziom ekspresji genów znajdujących się na krótkim ramieniu chromosomu 12 jak również obecność amplikonu na długim ramieniu chromosomu 4 obejmujący locus genu c-kit, który nie był ujawniony przy zastosowaniu oryginalnej metody. Nadekspresja genu c-kit została potwierdzona metodą real-time/ quantitative Taq-Man PCR. 95 Genetyka człowieka W60. Nieinwazyjna diagnostyka raka pęcherza moczowego przy użyciu testu UroVysion. Próba indywidualnej prognozy klinicznej. Aleksandra Binka-Kowalska (1), Edyta Borkowska (1), Maria Constantinou (1), Ewa Zając (1), Agnieszka Nawrocka (2), Józef Matych (3), Bogdan Kałużewski (1) (1).Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi (2). Zakład Patomorfologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi (3). Oddział Urologii i Transplantacji Nerek Szpitala im. Pirogowa w Łodzi Rak pęcherza moczowego jest w Polsce czwartym pod względem częstości zachorowań nowotworem złośliwym i szóstą co do częstości przyczyną zgonów z przyczyn nowotworowych wśród mężczyzn. W badaniu wzięło udział 111 pacjentów pierwotnie diagnozowanych lub monitorowanych w kierunku raka pęcherza moczowego. W celu analizy aberracji chromosomowych w jądrach interfazowych komórek z osadu moczu wykonano oparty na wielobarwnej technice FISH test UroVysion, zawierający trzy sondy centromerowe dla chromosomów 3, 7 i 17 oraz sondę unikalną dla locus 9p21. Dla guzów pierwotnych pęcherza moczowego czułość testu UroVysion wyniosła 96%, dla guzów nawrotowych 87,5%. Aplikacja testu UroVysion potwierdziła jego wysoką czułość umożliwiając diagnostykę zarówno pierwotnych jak i nawrotowych raków pęcherza moczowego. Test UroVysion pozwolił na wykrycie 100% inwazyjnych raków pęcherza moczowego. Obecność guza naciekającego mięśniówkę można więc praktycznie wykluczyć, gdy wynik testu UroVysion jest negatywny. Pentasomia lub wyższa polisomia chromosomu 17 oraz homozygotyczna delecja w locus 9p21 okazały się czynnikami prognostycznymi dla oceny ryzyka nawrotu guzów pęcherza moczowego. W61. Analiza profilu metylacji DNA w raku pęcherza moczowego. Małgorzata Presler (1), Marcin Matuszewski (1), Beata Schlichtholz (2) (1) Katedra i Zakład Biochemii, Akademia Medyczna w Gdańsku, ul. Dębinki 1, 80-210 Gdańsk (3) Katedra i Klinika Urologii, Akademia Medyczna w Gdańsku, ul. Kieturakisa 1, 80-742 Gdańsk Epigenetyczna modyfikacja DNA związana z metylacją reszt cytozyny w promotorowym regionie antyonkogenów jest obecnie uznana za alternatywny mechanizm inaktywacji genów w chorobach nowotworowych. Metylacji ulega cytozyna w dinukleotydowej sekwencji CpG. Celem badań była analiza hipermetylacji promotorów dwóch genów związanych z naprawą DNA, tj. hMLH1 i metylotransferazy DNA O 6-metyloguaniny (MGMT) oraz proapoptotycznej kinazy DAP u 46 pacjentów z rakiem pęcherza moczowego z nabłonka przejściowego (Ta/T1 = 20, T2-T4 = 26). W badaniach zastosowano technikę MSP (ang. methylation-specific PCR), która umożliwia analizę metylacji wybranej sekwencji w oparciu o modyfikację DNA pirosiarczynem sodu. Analiza DNA tkanki nowotworowej wykazała hipermetylację promotora genu hMLH1 w 20 % (9/46) przypadków, MGMT w 35% (1 6/46) natomiast kinazy DAP w 43% (20/ 46). Istotną statystycznie zależność zaobserwowano pomiędzy hipermetylacją promotora genu MGMT a stopniem zaawansowania nowotworu (p = 0,05, dwustronny test Fishera) oraz pomiędzy hipermetylacją hMLH1 a stopniem złośliwości (p = 0,04). Ponadto analiza przeżycia wykazała istnienie korelacji pomiędzy skróconym czasem przeżycia a hipermetylacją promotora MGMT (p = 0,01, test log-rank) oraz hMLH1 (p = 0,008). Badania te wskazują, że hipermetylacja CpG w regionie promotorowym MGMT, hMLH1 i kinazy DAP odgrywa istotną rolę w patogenezie raka pęcherza moczowego oraz zwracają uwagę na potencjalne wykorzystanie, zwłaszcza analizy hipermetylacji promotora MGMT oraz hMLH1, w diagnostyce i prognostyce tego nowotworu. W62. Cell cycle and phenotype changes in C6 rat glioma cells transfected with triple-helix inhibiting IGF-I expression; implications for glioma patients gene therapy Agnieszka Stefańska (1), A. Szpechciński (1), P. Kopiński (1), M. Bierwagen (2), P. Jarocki (3), H. Kasprzak (2), J. Trojan (1, 3) (1) Dept. of Gene Therapy, L Rydygier University School of Medicine, Bydgoszcz (2) Dept. of Neurosurgery, L Rydygier University School of Medicine, Bydgoszcz (3) I Dept. of General Surgery, Collegium Medicum, UJ, Krakow BACKGROUND. Brain tumors expressing Insuline-like Growth Factor-I (IGF-I) lose their malignancy after transfection with vectors encoding 23-oligonucleotide sequence forming triple-helix (triplex) with IGF-I gene promoter. Current clinical trials assess the efficiency of anti-IGF-I triplex based vaccines in gene therapy of glioma patients. METHODS. C6 rat glioma and primary human glioma cell cultures were transfected with anti-IGF-I triplex. Transfected 96 Genetyka człowieka and nontransfected cell lines were examined with flow cytometry for cell cycle, percentage of apoptotic cells and superficial MHC I, MHC II, CD80 and CD86 expression. IGF-I gene expression was assessed with RT-PCR in both transfected and nontransfected C6 line. RESULTS. Anti-IGF-I triplex transfected cells, as compared with non-transfected equivalents, revealed increased MHC I, CD80 and CD86 expression (both in rat and human cells, examined for mean fluorescence intensity and percentage of positive cells), extensive apoptosis and reduced number of G2/S/M cells. We did not find significant changes in MHC II expression. Enhanced expression of MHC I gene was detected in CNS-1 cells after transfection. CONCLUSIONS. Anti-IGF-I triplex transfected glioma cells enter apoptosis and express phenotype changes that can be relevant to reduced glioma malignancy and immune stimulation in vaccinated patients. Komunikaty plakatowe: P99. Monitorowanie chimeryzmu z użyciem zestawu AmpFlSTR SGM Plus u chorych po przeszczepie szpiku aliogenicznego. Jadwiga Sawecka (1), J. Skulimowska (1), B. Mariańska (2), J. Kościelak (1 (1) Zakład Biochemii, Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa (2) Klinika Przeszczepiania Komórek Krwiotwórczych, Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa Badanie chimeryzmu u chorych na białaczkę leczonych metodą transplantacji allogenicznego szpiku (allo BMT) umożliwia wczesne wykrycie przyjęcia przeszczepu, nawrotu choroby i odrzucenia przeszczepu. Celem prezentowanej pracy było wprowadzenie oznaczeń chimeryzmu u chorych po przeszczepie szpiku allogenicznego, metodą opartą na analizie krótkich tandemowych powtórzeń (STR– short tandem repeats) w dziesięciu lokusach (D3S1358, vWA, D16S539, D2S1338, D8S117, D21S11, D18S51, D19S433, THO1, FGA) oraz badaniu genu amelogeniny. W pierwszym etapie metody w reakcji multipleks PCR namnaża się odpowiednie fragmenty DNA, przy czym jeden z prajmerów dla danego lokusa jest znakowany fluorescencyjnie (5-FAM, JOE bądź NED). Następnie w warunkach denaturujących przeprowadza się rozdział elektroforetyczny namnożonego materiału na sekwenatorze ABI PRISM 377. Uzyskane wyniki analizuje się z użyciem programów komputerowych Gene Scan i Genotyper. Wstępne badania przeprowadzono u 6 pacjentów z Kliniki Przeszczepiania Komórek Krwiotwórczych Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie. Chimeryzm oznaczano w różnych odstępach czasu po przeszczepie allogenicznego szpiku (na ogół w 30, 60, 90 dobie oraz 6,9,12, miesiącu po przeszczepie). W pięciu przypadkach DNA dawcy szpiku zastąpił 100% DNA biorcy w 30 dniu po przeszczepie, a w szóstym po 60 dniach. U wszystkich przebadanych pacjentów dotychczas utrzymuje się chimeryzm całkowity. Obecnie zamierzamy podjąć rutynowe badania chimeryzmu i do współpracy zapraszamy inne ośrodki hematologiczne. P100. Aktywność telomerazy w moczu potencjalnym markerem diagnostycznym w raku pęcherza moczowego. Agnieszka Dettlaff-Pokora (1), M. Matuszewski (2), B. Schlichtholz (1) (1) Katedra i Zakład Biochemii Akademii Medycznej w Gdańsku, ul. Dębinki 1, Gdańsk (2) Katedra i Klinika Urologii Akademii Medycznej w Gdańsku, ul. Kieturakisa 1, Gdańsk Przejściowokomórkowy rak pęcherza moczowego powoduje rokrocznie w Polsce ponad 2000 zgonów. Jest to nowotwór dotykający osób w podeszłym wieku i charakteryzujący się częstymi wznowami. Optymalne leczenie wymaga wczesnej diagnozy, zaś rutynowa diagnostyka cytologiczna moczu obarczona jest dużym odsetkiem wyników fałszywie negatywnych, co powoduje potrzebę poszukiwania innych markerów nowotworowych. Telomeraza jest rybonukleoproteiną jądrową, której przydatność diagnostyczna jest dyskutowana od kilku lat. Jest to enzym odpowiedzialny za wydłużanie końcówek chromosomów zwanych telomerami, aktywny w okresie embrionalnym oraz w komórkach pnia. Aktywność telomerazy stwierdzono również w około 85% ludzkich nowotworów i linii nowotworowych. W raku pęcherza moczowego bardzo dobrym materiałem do badań, z uwagi na łatwą dostępność i nieinwazyjność pobierania, jest mocz. Do analizy aktywności telomerazy wykorzystano test oparty na wydłużeniu przez telomerazę sztucznego substratu, powieleniu produktu telomerazy w reakcji PCR oraz detekcji produktów reakcji PCR. W przypadku tkanek detekcję wykonywano przy użyciu testu immunoenzymatycznego, zaś w przypadku moczu przy wykorzystaniu elektroforezy poliakrylamidowej i barwienia srebrem. Analizę moczu wykonywano dla różnych ilości białka na test w celu uniknięcia wpływu inhibitorów reakcji PCR obecnych w moczu na otrzymane 97 Genetyka człowieka wyniki. Przeanalizowano łącznie tkanki nowotworowe oraz mocz 52 pacjentów chorych na raka pęcherza moczowego. Aktywność telomerazy stwierdzono w 48 tkankach nowotworowych (92%). Aktywność telomerazy w tkance była zgodna z aktywnością w osadzie komórek z moczu w 51 przypadkach, co daje specyficzność na poziomie 98%. Analiza aktywności telomerazy w moczu może okazać się bardzo czułą i specyficzną metodą wykrywania zmian nowotworowych zarówno we wczesnej diagnostyce jak i wykrywaniu nawrotów choroby. P101. Analiza niestabilności genomowej w raku pęcherza moczowego z zastosowaniem wybranych markerów mikrosatelitarnych. Jacek Turyn (2), Marcin Matuszewski (1), Beata Schlichtholz (2) (1) Katedra i Klinika Urologii Akademii Medycznej w Gdańsku; ul. Kieturakisa 1; 80-742 Gdańsk (2) Katedra i Zakład Biochemii Akademii Medycznej w Gdańsku; ul. Dębinki 1; 80-211 Gdańsk Cechą charakterystyczną raka pęcherza moczowego jest niestabilność genomowa. W pracy wykonano analizę zmian w sekwencjach mikrosatelitarnych na chromosomach 2p, 3p, 8q, 9p, 9q, 12q, 13q, 18q i 17p u 15 pacjentów z guzami powierzchownymi (T1) i u 31 pacjentów z guzami naciekającymi mięśniówkę (T2-4). Analizę przeprowadzono na DNA izolowanym z: tkanki nowotworowej i osadów komórkowych uzyskanych z moczu, jak również na DNA występującym w osoczu pochodzącym od 16 pacjentów. Do badań zastosowano 12 markerów mikrosatelitarnych. Łączna częstość występowania, utraty heterozygotyczności loci mikrosatelitarnych (LOH) i niestabilności mikrosatelitarnej (MSI) wyniosła 67% (31/46). 41% (19/46) wykazywała zmiany w 2 i więcej loci. LOH/MSI występowało w 73% (11/15) guzów powierzchniowych (T1) oraz u 65% (20/32) pacjentów z nowotworem naciekającym mięśniówkę pęcherza (T2-4). Dwa mikrosatelity, D2S242 i D2S252 były niestabilne u 74% (23/31) pacjentów z wykrytymi zmianami w sekwencjach mikrosatelitarnych. 46% z wszystkich obserwowanych zmian (28/61) znaleźliśmy w tkance nowotworowej i w odpowiadających im osadach komórkowych z moczu. Trzy z 16 zmian (19%) stwierdzono w DNA izolowanym z osocza. Nie znaleziono istotnych statystycznie korelacji pomiędzy występowaniem zmian w mikrosatelitach a czasem przeżycia i częstością wznowy. W badaniach wykazano bardzo wysoką przydatność markerów D9S242 i D9S252 w analizie zmian w sekwencjach mikrosatelitarnych w raku pęcherza moczowego zarówno w tkance nowotworowej, jak i osadach komórkowych z moczu P102. Nietypowa aberracja t(2;11) z rearanżacją genu CCND1 w przypadku chłoniaka z komórek płaszcza. Barbara Pieńkowska-Grela (1), Renata Woroniecka (1) Grzegorz Rymkiewicz (2), Renata Maryniak (2) (1) Samodzielna Pracownia Cytogenetyki, Centrum Onkologii-Instytut Warszawa (2) Zakład Patologii, Centrum Onkologii-Instytut Warszawa Chłoniak z komórek płaszcza (MCL) charakteryzuje się obecnością translokacji t(11;14)(q13;q32), widocznej w ponad 80% kariotypowanych przypadków. Translokacja ta powoduje rearanżację genu CCND1, zlokalizowanego w prążku 11q13, z jego przeniesieniem w rejon promotora genu IGH (14q32). Deregulacja CCND1, kodującego cyklinę D1, jest krytycznym wydarzeniem w patogenezie tych chłoniaków. Silna nadekspresja tej cykliny jest specyficznie związana z komórkami MCL. Przedstawiamy przypadek 53-letniego pacjenta z rozpoznanym w badaniu histopatologicznym B-komórkowym chłoniakiem nieziarniczym z komórek płaszcza. Analiza w cytometrze przepływowym potwierdziła nadekspresję cykliny D1, stwierdzoną w barwieniu immunohistochemicznym. Badanie cytogenetyczne zostało wykonane po krótkotrwałej hodowli komórek węzła chłonnego. Wykonano standardowe badanie metafaz (GTG). Badanie FISH wykonano przy użyciu dwukolorowej sondy, hybrydyzującej do rejonów CCND1/11q13 i IGH/14q32 (Vysis). Sondy znakujące inne lokalizacje na krótkim ramieniu chromosomu 2, w tym IGK/2p12, otrzymano dzięki uprzejmości prof. I. Włodarskiej (KU, Leuven, Belgia). W badanym materiale występowały metafazy z licznymi zmianami kariotypowymi, bez typowego markera t(11;14)(q13;q32). Obraz prążkowy sugerował obecność translokacji t(2;11) z p.p. w ramieniu 2p i w regionie CCND1/ 11p13. Badanie FISH przy użyciu sondy IgH/CCND1 wykazało brak typowej dla MCL translokacji, jednak 12% komórek wykazywało atypowy wzór sygnałów. Analiza znakowanych metafaz wykazała przeniesienie jednego z sygnałów CCND1 na 2p, podczas gdy sygnały IGH pozostawały niezmienione na obu kopiach chromosomu 14. Badanie FISH potwierdziło rearanżację genu CCND1. Dalsze badania przy użyciu sond znakujących regiony krótkiego ramienia chromosomu 2 wykonano dla lokalizacji punktu pęknięcia na tym chromosomie. 98 Genetyka człowieka P103. Clonal bcr/tcr rearrangements as markers for quantitative mrd evaluation in childhood ALL. Monika Jurkowska, Iwona Malinowska, Michał Matysiak, Jerzy Bal Department of Medical Genetics, Institute of Mother and Child and Department of. Paediatric, Haematology and Oncology, Medical University, Warsaw, Poland. Minimal residual disease level in acute lymphoblastic leukaemia treatment is becoming an important prognostic factor that may also influence the therapeutic strategies in this entity. We investigated the applicability of BCR/TCR rearrangements as quantitative markers for minimal residual disease in childhood ALL. IGH and TCR clonal markers were identified in 73.6% of ALL patients. Illegitimate rearrangements were identified in 27% of cases. 50% of samples represented IGH clonality (16% of oligoclonal), 31% and 35% of samples represented TCRγ; and TCRδ; clonal receptors, respectively, with 10% of oligoclonality range. Eventually the applicability of sixteen TCRG (VgJ1) and fourteen TCRD (Vd2Dd3) gene rearrangements as targets for MRD detection by real-time quantitative PCR analysis was investigated. Allele-specific primers were designed and applied in combination with germline primers and TaqMan probes. Reproducible detection of tumor DNA diluted 104 or 105 in “normal” DNA (that reflexes bone marrow status in responding patient) was obtained in 8/12 TCRD but only in 4/9 TCRG targets. Primer efficacy was determined by the characteristics of the junction. In Vd2Dd3 target, overall changes within the junction and correspondent primer sequence (N-nucleotides and deletion of terminal nucleotides) have determined its utility. In VgJ1 rearrangement, diversity of junction expressed in N-nucleotide gains but not in deletions was crucial. Thus efficiency of a specific oligonucleotide depends on the characteristic of the junction within particular marker’s group. The sensitivity of MRD range 10-3/10-5 is possible to obtain with RQ-PCR and TaqMan probes. The project was partially supported by KBN grant 3PO5E 082 24. P104. Utrata heterozygotyczności w chłoniakach indukowanych promieniami gamma u myszy z krzyżówek (BALB/cW x C57BL/10W)F1 i (C57BL/10W x BALB/cW)F1. Mirosława Sitarz, Elżbieta Wirth-Dzięciołowska Zakład Genetyki i Hodowli Zwierząt Laboratoryjnych, Centrum Onkologii-Instytut, Warszawa Podjęto próbę poszukiwania genów supresorowych nowotworów, których udziału nie stwierdzono dotychczas w chłoniakach popromiennych u myszy. W tym celu rozpoczęto testowanie utraty heterozygotyczności (LOH) w DNA chłoniaków indukowanych promieniami gamma w grasicy myszy z krzyżówek przeciwstawnych (BALB/cW x C57BL/ 10W)F1 i (C57BL/10W x BALB/cW)F1. Analizę utraty alleli przeprowadzono w DNA 44 chłoniaków indukowanych w grasicy myszy z krzyżówki (BALB/cW x C57BL/10W)F1 i w DNA 45 chłoniaków indukowanych w grasicy myszy z krzyżówki (C57BL/10W x BALB/cW)F1. Badania utraty heterozygotyczności przeprowadzano przy użyciu markerów mikrosatelitarnych. Dotychczas użyto 50 informatywnych mikrosatelitów zlokalizowanych w różnych miejscach mysiego genomu. Utratę alleli wykryto w 17 loci. Wysoką częstość utraty heterozygotyczności (>20%) w DNA badanych chłoniaków stwierdzono dla mikrosatelitów z chromosomów: 4, 11, 12, 15, 19. Z piśmiennictwa są znane LOH u myszy w chłoniakach popromiennych na chromosomach: 4, 11, 12, 19. Utrata alelli w loci na chromosomie 15 nie była dotychczas analizowana i stanowi przedmiot aktualnych badań. P105. Analiza utraty heterozygotycznosci w regionie 13q w płaskonabłonkowych rakach krtani. Agnieszka Stembalska (2), Nikolaus Blin (1), Sąsiadek Maria (2) (1) Instytut Antropologii i Genetyki Człowieka, Tubingen, Niemcy (2) Zakład Genetyki, Akademia Medyczna we Wrocławiu, ul.Marcinkowskiego 1, 50-368 Wrocławiu Wyniki wielu badań potwierdzają tezę o udziale genów supresorowych zlokalizowanych na długim ramieniu chromosomu 13 w progresji nowotworów głowy i szyi (HNSCC; head-and-neck squamous cell carcinoma). Fakt, że zarówno gen RB1 jak i BRCA 2 nie są inaktywowane w większości przypadków HNSCC sugeruje obecność innych genów supresorowych w regionie 13q. W niniejszej pracy autorzy prezentują wyniki badań własnych nad zmianami genetycznymi w rakach krtani. W pierwszym etapie pracy, na podstawie wyników badań CGH w grupie 52 pierwotnych płaskonabłonkowych raków krtani 99 Genetyka człowieka oznaczono regiony najczęściej ulegające delecji (>40% badanych przypadków). Jako krytyczne wytypowano następujące obszary: 13q21-32 oraz 13q34. Następnie, w celu określenia minimalnego regionu krytycznego delecji przeprowadzono analizę utraty heterozygotyczności (LOH – loss of heterozygosity). Wykorzystano 15 markerów mikrosatelitarnych zlokalizowanych w regionie krytycznym oraz jeden marker dla locus RB (13q14). Badania przeprowadzono na 16 guzach, w których stwierdzono delecję w CGH i 16 w których delecji nie stwierdzono. Znacząco wysoką częstość LOH obserwowano dla markerów zlokalizowanych w: 13q21.1, 13q21.2-q22, 13q31– 32, 13q32.3 oraz 13q34 (test wskaźnika struktury, p<0,001). Stwierdzono istotną statystycznie korelację w występowaniu LOH w markerach zlokalizowanych w regionach 13q21.1 i 13q34, 13q21.1 i 13q31.1 oraz 13q31.1 i 13q31-32 (dokładny test Fishera, p<0,01). P106. Expression of genes involved in DNA repair in lung tissues of non-small lung cancer patients. Maja Zielińska, Elżbieta Speina, Barbara Tudek Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, Warsaw, Poland Lung cancer is one of the most common cancers worldwide. Formation of reactive oxygen species, which accompanies inflammatory processes, was demonstrated to be involved in the induction of lung cancer. We investigated the expression of several DNA repair genes involved in the repair of oxidative DNA damage. Examinated genes encoded for DNA glycosylases: OGG1, ANPG, and TDG, which eliminate from DNA 8-oxoguanine (8-oxoG), 1,N6-ethenoadenine (eA), and 3,N4-ethenocytosine (eC), respectively. We also assayed genes encoding for AP endonuclease (APE) and enzymes of nucleotide excision repair pathway (XPA, XPG, XPD, and XPF). Gene’s expression level was measured using RNase protection assay in normal lung or lung tumor tissue. Our results show that the expression levels of OGG1, ANPG, and TDG glycosylases are much lower than those observed for APE, in both normal lung and lung tumor. Moreover, high individual differences in expression of DNA glycosylases were observed. In contrast, the expression levels of all four types of XP genes were similar for each patient, in both lung tissues. We also investigated repair activities for 8oxoG, eA, and eC using oligodeoxynucleotides with a single modified base. Interestingly, in numerous tissue samples repair activities did not reflect expression profiles of DNA glycosylases. Repair activities in some, but not in all tissues were correlated with the expression of AP-endonuclease. Other factors determining repair activities for oxidative DNA damage are being investigated. P107. Geny MLH1 oraz CDKN2A jako potencjalne molekularne markery wczesnego i późnego procesu karcynogenezy w nowotworach krtani Robert Smigiel (1), Agnieszka Stembalska (2), David Ramsey (3), Tuncay Kayademir (4), Maria Nikolaus Blin (4), Małgorzata Sasiadek (2) (1) Katedra Patofizjologii (2) Zakład Genetyki, Akademia Medyczna, Wrocław (3) Instytut Matematyki Politechniki Wrocławskiej, Wrocław (4) Division of Molecular Genetics, Eberhard Karls University, Tübingen, Germany Mimo intensywnych badań nad genetyczną etiologią raków krtani, nie jest znany model zmian genetycznych leżących u podstaw powstania i rozwoju raka krtani. Celem prezentowanej pracy było wyjaśnienie znaczenia wybranych genów w etiologii genetycznej raków krtani (HPC, APC, MET, nieznany gen supresorowy w 8p22 (TSG), TFF1, TFF2, NM23, CDKN2A, RB1, MSH2, MLH1). Badaną grupę stanowiło 62 pacjentów leczonych operacyjnie z powodu nowotworu krtani. Analizę oparto na ocenie utraty heterozygotyczności (LOH) badanych genów i ocenie wzoru metylacji promotorów genów MLH1, CDKN2A. Wyniki te porównano z poziomem ekspresji białek kodowanych przez geny, u których stwierdzono najwyższą częstość występowania LOH [CDKN2A (55.4%), MLH1 (46.0%), RB1 (35.7%)]. Stwierdzono pozytywną korelację pomiędzy częstością występowania LOH oraz nieprawidłowej metylacji w genie CDKN2A oraz MLH1, a utratą ekspresji. Analiza statystyczna wykazała, ze LOH w badanych genach ma tendencje do występowania w parach lub tripletach. Pary MLH1 / CDKN2A oraz triplety MLH1 / TSG w 8p22 / CDKN2A, a także MLH1 / CDKN2A / RB1, wykazują korelację z stopniem zaawansowania klinicznego (staging) oraz histopatologicznego nowotworu (G, grading). Stwierdzono, że LOH w MLH1 koreluję z najniższym stopniem zaawansowania histopatologicznego G1, natomiast LOH w CDKN2A z najwyższym stopniem G3. 100 Genetyka człowieka P108. Zmiany chromosomu 22 pary w złożonych kariotypach u pacjentów z Zespołem Mielodysplastycznym Małgorzata Jakóbczyk, Zoriana Salamanczuk, Aleksander B. Skotnicki Klinika i Katedra Hematologii CM UJ w Krakowie Zespoły Mielodysplastyczne (MDS) de novo stanowią heterogenną grupę chorób, powstających w wyniku klonalnych nieprawidłowości wielopotencjalnej komórki macierzystej. Klonalne zmiany kariotypu ujawniane w tej chorobie posiadają znaczenie prognostyczne uwzględniane w International Prognostic Scoring System (IPSS). Złożone zmiany uznawane za jeden z niekorzystnych czynników rokowniczych, obecne są w komórkach szpiku kostnego u 15-30% pacjentów w chwili diagnozy. W tej grupie pacjentów bardzo rzadko dochodzi do ujawnienia powtarzających się aberracji chromosomalnych, a mechanizm molekularny, który stanowi podłoże procesu nowotworowego pozostaje niejasny. Analiza złożonych zmian kariotypu z użyciem techniki prążków GTG, jest niewystarczającą z uwagi na obecność fragmentów chromosomów o nieustalonym pochodzeniu. To ograniczenie pokonuje Spektralna analiza kariotypu (SKY), umożliwiając dokładną identyfikację markerów i fragmentów chromosomów w niezrównoważonych translokacjach. Z grupy pacjentów Kliniki Hematologii CM UJ z de novo rozpoznanym MDS wybrano 8 pacjentów, u których analiza kariotypu komórek szpiku kostnego wykazała obecność złożonych aberracji. Badanie cytogenetyczne wykonano w chwili diagnozy, na 24 i 48 godzinnych hodowlach komórek szpiku kostnego zgodnie z obowiązującym protokołem. Chromosomy analizowano z użyciem techniki prążków GTG, zmiany klasyfikowano zgodnie z ICSN 95. W prawie wszystkich przypadkach stwierdzono aberracje chromosomu 22 pary. U trzech pacjentów z powodu obecności markerów w następujących kariotypach: 48, XY, der(1)(q23-q33?), der (2)(?), der(3)(?), der(4)(q31?), i(6)(p10), +18 [pacjent nr1], 42-47, XY, –3, del(5)(q31), +11, –17, –18, +21, +mar1, +mar2 [pacjent 2]; 47, XX, +1, –4, –5, +8, –16, –17, –18, t(22;?)(p10;?), +mar1, +mar2, +mar3, +mar4 [pacjent 3], przeprowadzono analizę spektralną. W tej grupie wykryto obecność następujących translokacji z udziałem chromosomu 22 pary: t(2;22), t(3;22), t(10;22), t(21;22). Nasze wyniki podobne są do wcześniej publikowanych i potwierdzają, że zmiany 22q mogą być często zaangażowane w złożonych kariotypach u pacjentów z MDS. Przebieg choroby u naszych pacjentów był gwałtowny, bez odpowiedzi na stosowaną terapię, z krótkim czasem całkowitego przeżycia, niezależnie od podtypu WHO. Może to wskazywać na znaczącą rolę zmian chromosomu 22 pary w procesie MDS. P109. Polimorfizmy w genach kodujących kluczowe enzymy biosyntezy testosteronu a obraz kliniczny raka prostaty Monika Gos (1), Małgorzata Sadowska (2), Tomasz Demkow (2), Przemysław Janik (1) (1) Zakład Biologii Komórki (2) Klinika Nowotworów Układu Moczowego Centrum Onkologii-Instytut, ul. Roentgena 502-781 Warszawa Rak prostaty jest jednym z najczęściej diagnozowanych nowotworów złośliwych u mężczyzn. Około 90% zachorowań na ten typ nowotworu to przypadki sporadyczne, w których rozwój choroby zależy od kombinacji czynników środowiskowych (wiek, dieta) oraz genetycznych. Niewątpliwą podstawą dla rozwoju raka stercza jest zaburzony metabolizm androgenów, co może wynikać z mutacji o charakterze polimorficznym w kluczowych genach biosyntezy testosteronu. Od zmian tych może również zależeć odpowiedź na leczenie, rozwój hormonooporności oraz ogólny obraz kliniczny nowotworu. Kluczowymi enzymami biorącymi udział w metabolizmie androgenów są: cytochrom P450c17α oraz 5α-reduktaza. Pierwszy z nich bierze udział w przekształceniu progesteronu w androstendion, zaś drugi redukuje testosteron do jego aktywniejszej formy dihydrotestosteronu. Białka te kodowane są przez geny CYP17 i SRD5A2, zaś polimorfizmy zidentyfikowane w tych genach mogą wpływać na poziom hormonów sterydowych.� Celem przeprowadzonych badań jest stwierdzenie, czy zmiany polimorficzne w tych genach mogą stanowić ewentualną predyspozycję do wystąpienia nowotworu gruczołu krokowego. Ponadto częstość występowania polimorfizmów skorelowano z obrazem klinicznym nowotworu. Wśród pacjentów chorych na raka stercza (107) oraz mężczyzn, u których nie zdiagnozowano tego nowotworu (154), została przeprowadzona analiza następujących polimorfizmów: T/C w promotorze genu CYP17 oraz V89L i A49T w SRD5A2. Nie stwierdzono znaczących różnic w częstościach występowania poszczególnych genotypów i alleli w grupie osób chorych i kontrolnych. Jednakże wydaje się, że u mężczyzn posiadających genotyp CC (CYP17) lub kombinację 49AT 101 Genetyka człowieka i 89VV (SRD5A2) częściej rozwija się choroba uogólniona lub w stadium zaawansowania T3/T4. Wariant 89VV może również korelować z wiekiem zachorowania na nowotwór gruczołu krokowego oraz rozwojem hormonooporności. P110. Ocena ekspresji cykliny D1 u pacjentów z chłoniakiem z komórek płaszcza (MCL) oraz z innymi chłoniakami nieziarniczymi. Paweł Swoboda (1), M. Gos (1), G. Rymkiewicz (2), J. Walewski (3), P. Janik (1) (1) Zakład Biologii Komórki (2) Zakład Patologii (3) Klinika Nowotworów Układu Chłonnego Centrum Onkologii – Instytut Chłoniak z komórek płaszcza (mantle cell lymphoma, MCL), dawniej określany jako centrocytarny, wywodzi się z obwodowych komórek B i stanowi około 6-9% wszystkich przypadków chłoniaków nieziarniczych (non-Hodgkin lymphoma, NHL) na świecie. Charakterystycznym i powtarzalnym markerem MCL jest translokacja t(11;14)(q13;q32). Jej następstwem jest przeniesienie genu CCND1 (BCL-1, PRAD1) kodującego cyklinę D1 z chromosomu 11 pod znajdujące się na chromosomie 14 sekwencje regulatorowe genu IGH kodującego łańcuch ciężki immunoglobulin. Wynikiem translokacji jest nadekspresja mRNA dla cykliny D1 oraz wzrost poziomu białka. Dodatkowo podwyższony poziom mRNA wykryto w innych typach chłoniaków linii B. Obecnie szacuje się, że nawet 40% MCL może być źle lub niedokładnie zdiagnozowanych. Metody oparte na technice RT-PCR, pozwalające na ilościowe oznaczenie poziomu mRNA dla cykliny D1, mogą mieć znaczenie diagnostycznoterapeutyczne. Celem pracy było oznaczenie poziomu ekspresji mRNA dla cykliny D1 u chorych z chłoniakiem z komórek płaszcza oraz porównanie go do poziomu ekspresji występującego w przypadku innych chłoniaków nieziarniczych. Materiał w postaci krwi, szpiku lub komórek pochodzących z punkcji cienkoigłowej węzłów chłonnych pobrano od 100 pacjentów ze zdiagnozowanym chłoniakiem z komórek płaszcza oraz innymi chłoniakami nieziarniczymi. Wyizolowane RNA poddano reakcji odwrotnej transkrypcji. Następnie cDNA zostało poddane reakcji PCR z zastosowaniem specyficznych starterów. Poziom ekspresji cykliny D1 w testowanych próbkach został oznaczony w stosunku do poziomu ekspresji markerowego genu β-aktyny. P111. The NOD2 3020insC mutation and the risk of colorectal cancer. Grzegorz Kurzawski (1), Janina Suchy( 1)*, Józef Kładny (2), Ewa Grabowska (3)*, Marek Mierzejewski( 1), Anna Jakubowska (1), Tadeusz Dębniak (1), Cezary Cybulski (1), Elżbieta Kowalska( 1), Zbigniew Szych( 4), Wenancjusz Domagała (5), Rodney J. Scott (6), Jan Lubiński (1) (1) Hereditary Cancer Center – Dept. of Genetics and Pathology, Pomeranian Medical University Szczecin 70-115, Poland, ul. Polabska 4 email: [email protected] (2) Department of General and Vascular Surgery (3) Inter – University Unit of Molecular Biology, University of Szczecin and Pomeranian Academy of Medicine (4) Department of Hygiene and Epidemiology (5) Department of Pathology Pomeranian Medical University (6) Discipline of Medical Genetics, Faculty of Health, University of Newcastle, NSW Australia. email: [email protected] * Janina Suchy and Ewa Grabowska are the recipients of a scholarship from the Postgraduate School of Molecular Medicine affiliated with the Medical University of Warsaw. The authors were partially supported by the grant The Leopold Kronenberg Foundation. Several predispositions to colorectal cancer have been identified but little is known about genetic susceptibilities to disease in older persons. Colorectal cancer is a risk in Crohn’s Disease and is believed to be associated with an inappropriate inflammatory response. Recently, the NOD2 gene has been associated with Crohn’s Disease, which further strengthens the notion that the inflammatory response plays a crucial role in this disease. Several mutations have been identified in the NOD2 gene, which appear with significantly higher frequency in patients with the disease. One such mutation (3020insC) is 102 Genetyka człowieka believed to be clearly causative as it results in a prematurely truncated protein with a predicted reduction in functional efficiency. In this report we have examined the frequency of the 3020insC mutation in a series of 856 individuals including 556 patients with colorectal cancer. The frequency of the 3020insC mutation in a consecutive series of 250 non-HNPCC colorectal cancer patients over the age of 50 years was significantly elevated compared to the control population – OR=2.23, p=0.0046. The results indicate that NOD2 may be a predisposing factor to colorectal cancer characterized by an older average age of disease onset in persons who do not harbor any other genetic predisposition to disease. Key words: NOD2, colorectal cancer, 3020insC, predisposing factor P112. Nuclear pedigree criteria of suspected HNPCC. Józef Kładny (1), G. Möslein (2), T. Myrhřj (3), G. Kurzawski (4), A. Jakubowska (4), T. Debniak (4), W. Petriczko (1), M. Kozlowski (1), T. Al-Amawi (5), M. Brzosko (6), J. Flicinski (6), A. Jawien (7), A. Banaszkiewicz (7), P. Rychter (8), J. Lubinski (4). (1) International Hereditary Cancer Center, Department of Surgical Oncology, Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin, Poland (2) Department of Surgery, University of Duesseldorf, Duesseldorf, Germany (3) The Danish HNPCC Register, Department of Surgical Gastroenterology, Hvidovre Hospital, University of Copenhagen, Denmark (4) Department of Genetics and Pathology, Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin, Poland (5) Department of Hygiene and Epidemiology, Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin, Poland (6) Department of Rheumatology, Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin, Poland (7) Department of General Surgery, Medical University, Bydgoszcz, Poland (8) Department of Surgical Gastroenterology, Medical College, Jagiellonian University, Cracow, Poland Criteria of ICG-HNPCC are very restrictive and they do not allow to diagnose a large number of so-called “suspected HNPCC” cases – this is families without fulfillment of all Amsterdam criteria, but presenting several pedigree and clinical features characteristic for HNPCC. In different series of families “suspected of HNPCC” germline mutations were found in 8-60%. Therefore ICG-HNPCC has been working on pedigree/clinical criteria diagnostic for suspected HNPCC. Material and methods. Part I . The study was based on two series of colorectal cancer (CRC) cases: 1) HNPCC – this group comprised 190 patients affected by CRC from randomly selected families which fulfiled the Amsterdam II criteria registered in Dusseldorf (102 cases of CRC), Denmark (18 CRCs), Leiden (23 CRCs) and Szczecin (47 CRCs). 2) Consecutive CRCs – this group comprised 629 (78,0%) of 806 individuals with newly diagnosed CRC in a period 1991-1997 in the city of Szczecin (ca. 400,000 of inhabitants), Poland. Nuclear pedigrees in both groups were compared for frequency of occurrence of clinical features that have been shown to be associated with HNPCC. Part II. 52 consecutive CRC cases from Szczecin, matching criteria recognized in part I as appropriate for diagnosis of cases “suspected of HNPCC” were studied for the occurrence of germline hMSH2/hMLH1 constitutional mutations using “exon by exon” sequencing. Results Combination of features – occurrence of HNPCC associated cancer (CRC or cancer of the endometrium, small bowel or urinary tract) in 1st degree relative of CRC patient; at least one of this cancers is diagnosed under age of 50 – appeared to be strongly associated to HNPCC with an OR – 431. Constitutional mutations were identified in 18 (10 MLH1 and 8 MSH2 mutations) of 52 (34%) cases matching above features. Conclusions: The results of our studies strongly suggest that it is possible to diagnose HNPCC with a high degree of accuracy just on the basis of nuclear pedigree data and clinical features. P113. Mutation analysis and clinical course in NF2 Polish patients. Mikołaj Łaniewski-Wołłk (1), A. Koziarski (2), A. Wojtkiewicz (3), A. Szpecht-Potocka (1) (1) Institute of Mother and Child, Warsaw (2) Clinic of Neurosurgery CSKWAM, Warsaw (3) Paediatric, Hematology and Oncology Clinic of Medical Academy, Bydgoszcz Neurofibromatosis type 2 (NF2) is an autosomal dominant disease of the nervous system characterized by a tumor predisposition in which affected individuals develop multiple schwannomas, meningiomas and ependynomas. NF2 gene has been hypothesized to function as a tumor suppressor gene. We were looking for mutations in NF2 gene in 23 patients (17 families) with clinical features of NF2, sending from different medical centers in Poland. Using SSCP 103 Genetyka człowieka as a screening method for detection of mutations in blood and tumor samples and sequencing DNA we have found 5 germline nonsense mutations in our tested group. Three of these mutations are known: c.52 C.T in exon 1; c.169 C.T in exon 2; c.592 C.T in exon 6. Two mutations in exon 11 are new: c.1002_1003insG and c.1029_1030insCC. After detailed clinical analysis we conclude that all of these defects correlate with severe clinical course (they generate truncating protein-product). What is very interesting that we did not find any somatic mutations in tested tumor samples suggesting that there are may be any other mechanisms, except of Knudson’s two hit hypotesis, which are involved in expression of NF2 gene. Clinical observations of our patients are consistent with D.Evans’s group results (2002) concerning mortality of NF2 patiens and recommendation that they could be reffered to specialty treatment centers. P114. Mutations in the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene in central nervous system hemangioblastomas. Cezary Cybulski (1), Joanna Matyjasik (1), Marianna Soroka (2), Janusz Szymaś (3), Bohdan Górski (1), Tadeusz Dębniak (1), Anna Jakubowska (1), Andrzej Bernaczyk (4), Lech Zimnoch (5), Grażyna Bierzyńska-Macyszyn (6), Tomasz Trojanowski (7), Teresa Wierzba-Bobrowicz (8), Edmund Prudlak (9), Alicja Markowska-Wojciechowska (10), Przemysław Nowacki (11), Andrzej Roszkiewicz (12), Radzisław Kordek (13), Tadeusz Szylberg (14), Ewa Matyja (15), Krzysztof Zieliński (16), J. Stańczyk (17), Bogdan Woźniewicz (18), Anna Taraszewska (19), Wojciech Kozłowski (20), Rodney J. Scott (21), Jan Lubiński (1) (1) International Hereditary Cancer Center Department of Genetics and Pathology, Pomeranian Medical ul. Połabska 4, 70-115 Szczecin. Tel: 00 48 91 466 1532 (2) Department of Biology, University in Szczecin. (3) Department of Clinical Pathology, Medical Academy, Poznań (4) Department of Pathology, Regional Clinical Hospital, Częstochowa (5) Department of Pathology, Medical University, Białystok (6) Department of Pathology, Medical Academy, Katowice (7) Department of Neurosurgery, University Medical School, Lublin (8) Department of Neuropathology, Institute of Psychiatry and Neurology, Warsaw (9) Department of Pathology, Medical Academy, Wroclaw. (10) Department Otolaryngology, Medical Academy, Wrocław. (11) Department of Neurology, Pomeranian Medical University, Szczecin (12) Department Pathology, Medical University of Gdansk (13) Department of Pathology, Copernicus Memorial Hospital, Lodz (14) Department of Pathomorphology, Military Clinical Hospital, Bydgoszcz. (15) Department of Neuropathology, Medical Research Centre, Polish Academy of Sciences, Warsaw (16) Department of Pathology, Military Clinical Hospital, Łódź (17) Department of Pathology, Regional Hospital, Gorzów (18) Department of Pathomorphology, Child Health Center, Warsaw (19) Department of Neuropathology, Medical Research Centre, Polish Academy of Sciences, Warsaw. (20) Department of Pathology, Military Clinical Hospital, WAM, Warsaw (21) Discipline of Medical Genetics, Faculty of Health, University of Newcastle, Newcastle, Australia Central nervous system hemangioblastomas (cHAB) are rare tumors, which most commonly arise in the cerebellum. Most tumors are sporadic, but as many as one third of cHABs occur in the course of the hereditary disorder – von Hippel-Linadu disease (VHL). In order to diagnose new VHL families in Poland we performed sequencing of the entire VHL gene in archival material (paraffin embedded hemangioblastoma tissues) in a large series of 203 unselected patients with cHAB. VHL gene mutations were detected in 70(41%) of 171 tumor samples from which DNA of relatively good quality was isolated. We were able to obtain blood samples from 19 of the mutation positive cases. Eight (42%) of these harbored germline mutations in persons from distinct undiagnosed VHL families. 104 Genetyka człowieka P115. Comparison of genomic abnormalities between BRCAX and sporadic breast cancers studied by comparative genomic hybridization. Jacek Gronwald (1), Anna Jauch (2), Cezary Cybulski (1), Brigitte Schoell (2), Marcin Lenner (3), Ewa Grabowska (3), Bohdan Górski (1), Barbara Boehm-Steuer (2), Anna Jakubowska (1), Rodney Scott (4), Jan Lubiński (1) (1) Department of Genetics and Pathology, International Hereditary Cancer Center, Pomeranian Medical University, Szczecin 70-115, Połabska 4, Poland (2) Institute of Human Genetics, University of Heidelberg, Germany (3) Inter-University Unit of Molecular Biology, University of Szczecin and Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin, Poland (4) Discipline of Medical Genetics, Faculty of Health, University of Newcastle, Newcastle, Australia Chromosomal regions harbouring genes involved in initiation and progression of BRCAX-assiociated breast cancers are poorly known. In this study we applied comparative genomic hybridization (CGH) to identify the most frequent genomic abnormalities in 18 BRCAX hereditary breast cancers and compared them to abnormalities detected in a group of 27 sporadic breast cancers. The most frequently observed aberrations in BRCAX tumors were gains of 8q (83%), 19q (67%), 19p (61%), 20q (61%), 1q (56%), 17q (56%) and losses of 8p (56%), 11q (44%) and 13q (33%). The sporadic cases most frequently showed gains of 1q (67%), 8q (48%), 17q (37%), 16p (33%), 19q (33%) and losses of 11q (26%), 8p (22%) and 16q (19%). Losses of 8p and gains 8q, 19 as well as gains of 20q (with respect to ductal tumors only) were significantly more often detected in BRCAX than in sporadic breast cancers. Analysis of 8p-losses and 8q-gains indicated that they are early events in tumorigenesis of BRCAX tumors. The findings of this report indicate that there are significant similarities between BRCAX tumors and BRCA2 tumours suggesting a common pathway of disease. P116. Germline mutation and large deletion analysis of the CDKN2A/ARF genes in families with multiple melanomas and in families with an aggregation of malignant melanoma. Tadeusz Dębniak (1), B. Górski (1), R. J. Scott (2), C. Cybulski (1), K. Mędrek (1), E. Złowocka (1), G. Kurzawski (1), B. Dębniak (3), J. Kładny (4), S. Bielecka-Grzela (5), R. Maleszka (5), J. Lubiński (1) (1) Department of Genetics and Pathology, International Hereditary Cancer Center, Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland (2) Discipline of Medical Genetics, Faculty of Health, University of Newcastle, Newcastle, Australia (3) Regional Hospital, Gorzow Wlkp, Poland (4) III Department of Surgery, Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland (5) Department of Dermatology and Venerology, Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland The CDKN2A/ARF genes have been associated with an increased risk of malignant melanoma in families where there are multiple members affected by disease and in families characterized by the constellation of breast cancer and malignant melanoma. The exact contribution of CDKN2A/ARF to disease risk remains poorly characterized especially in diverse populations. In this report the contribution of CDKN2A/ARF germline mutations and large rearrangements to disease in Polish familial melanoma (FMM) and aggregations of breast cancer and malignant melanoma (MM) were assessed using a strategy that included genomic sequencing, RFLP analysis and multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) analysis. We examined 16 FMM cases (group 1), 44 MM probands with a cancer family aggregation (CFA) that included at least one breast cancer in the family (group 2), and 22 breast cancer probands with a CFA and MM in the family (group 3). The results revealed a paucity of mutations in CDKN2A/ARF suggesting that in the Polish population this gene does not contribute significantly to either FMM or MM within the context of a cancer family aggregation of disease. 105 Genetyka człowieka P117. Rarity of germline 1100delC mutation in the CHK2 gene in patients with malignant melanoma of the skin. Tadeusz Dębniak (1), Bohdan Górski (1), Cezary Cybulski (1), Grzegorz Kurzawski (1), Elżbieta Złowocka (1), Józef Kładny (2), Maria Chosia (3), Jan Lubiński (1) (1) Department of Genetics and Pathology, Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin 70-111, Al.Powst.Wlkp.72, Poland (2) III Department of Surgery, Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin 70-111, Al.Powst.Wlkp.72, Poland (3) Department of Pathology, Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin 70-111, ul. Unii Lubelskiej 1, Poland Objectives. In this paper the proportion of consecutive and familial malignant melanoma (MM) cases harbouring the 1100delC of exon 10 of the CHK2 gene was determined to assess whether it is associated with the occurrence of MM. The study consisted of three groups of patients: a series of consecutive 101 patients with histologically confirmed malignant melanoma of the skin, diagnosed in the city of Szczecin; a series of 16 MM patients with a family history of MM in their first degree relatives; and a series of consecutive 1024 individuals selected at random by family doctors from the city of Szczecin. Molecular examination included allele specific polymerase chain reaction assay for CHK2 founder mutation (1100delC), genomic sequencing, LOH analysis using CA-repeat microsatellite markers, and haplotype analysis. Results. CHK2 founder mutation was detected in 1 out of 101 (1%) MM cases, no familial MMs and in 2 out of 1024 individuals (0.2%) from general population. The difference between groups of patients was statistically not significant. The MM patient with CHk2 founder mutation was 56 years old female with a history of brain tumors at age 33 and 40, sarcoma at age 41 and finally MM at age 55. Examination of tumorous DNA isolated from MM and sarcoma from patient with CHK2 mutation revealed no loss of heterozygosity in both tumors. Conclusion. It seems that examination of neither consecutive nor familial MM cases in search for 1100delC germline mutation in CHK2 gene is justified. To evaluate whether CHK2 founder mutation is associated with MM in patients with LFS syndrome, more MM cases from LFS families should be examined. P118. NBS1 is a Prostate Cancer Susceptibility Gene. Cezary Cybulski (1), B. Górski (1), T. Dębniak (1), B. Gliniewicz (2), M. Mierzejewski (1), B. Masojć (1), A. Jakubowska (1), J. Matyjasik (1), E. Złowocka (1), A. Sikorski (2), S. A. Narod (3), J. Lubiński (1) (1) International Hereditary Cancer Center, Department of Genetics and Pathology, Pomeranian Medical University, ul. Połabska 4, 70-115 Szczecin (2) Clinic of Urology, Pomeranian Academy of Medicine, Al. Powstancow Wlkp. 72, 70-112 Szczecin (3) Centre for Research on Womens Health, 790 Bay Street, Toronto Ontario, M5G 1N8 To evaluate whether an inactivating mutation in the gene for the Nijmegen Breakage Syndrome (NBS1) plays a role in the etiology of prostate cancer we compared the prevalence of the 657del5 NBS1 founder allele in 56 patients with familial prostate cancer, in 305 nonfamilial prostate cancer patients and in 1500 controls from Poland. Loss of heterozygosity analysis was also performed on DNA samples isolated from 17 micro-dissected prostate cancers, including eight from carriers of the 657del5 mutation. The NBS1 founder mutation was present in five of 56 (9%) patients with familial prostate cancer (OR = 16; p < 0.0001), in 7 of 305 (2.2%) patients with non-familial prostate cancer (OR = 3.9; p= 0.01) and in 9 of 1500 controls (0.6%). The wild-type NBS1 allele was lost in seven of eight prostate tumors from carriers of the 657del5 allele, but loss of heterozygosity was seen in only one of nine tumors from non-carriers (p = 0.003). These findings suggest that heterozygous carriers of the NBS1 founder mutation exhibit increased susceptibility to prostate cancer, and that the cancers that develop in the prostates of carriers are functionally homozygous for the mutation. P119. Usefulness of polymorphic markers analysis in exclusion of BRCA1/BRCA2 mutations carrier status in families with aggregation of breast/ovarian cancers. Bohdan Górski, Tadeusz Dębniak, Anna Jakubowska, Cezary Cybulski, Tomasz Huzarski, Tomasz Byrski, Elżbieta Złowocka, Jan Lubiński Department of Genetics and Pathology, Pomeranian Medical University, Ul .Polabska 4, Szczecin 70-115, Poland Founder mutations can account for large proportion of BRCA1/BRCA2 genes abnormalities in a given population. However there is still a need to study the entire gene in many families, even in countries where founder mutations have been identified. It is possible to decrease the number of cases which are studied by complex and expensive sequencing/ 106 Genetyka człowieka Southern blot analyses of BRCA1/BRCA2 genes by exclusion of common BRCA1/BRCA2 alleles in a given family by using polymorphic dinucleotide markers. The goal of our study was to describe effectiveness of such methodology in exclusion of BRCA1/BRCA2 constitutional mutations. In each family blood samples for genetic analyses were taken from two affected relatives from the same generation. Six polymorphic microsatellite markers linked to BRCA1/BRCA2 genes were analysed. Results obtained with these markers were verified by applying BRCA1 testing for the most common founder mutations in Poland and using “exon by exon” sequencing of coding fragments of the BRCA2 gene. Polymorphic markers useful in BRCA1/BRCA2 analyses included only 3 of 6 examined – D17S855, D13S260 and D13S267. Occurrences of common alleles of BRCA1 were excluded in 3 families and BRCA2 in 5 out of 30 families. Results obtained by testing for BRCA1 Polish founder mutations and BRCA2 sequencing were in agreement with BRCA1findings using polymorphic markers. The only exception was family No 994 with BRCA1 exon 5 300T/G mutation in which BRCA1 mutation carrier was excluded by using D17S855. Among 14 families without BRCA1 Polish founder mutations abnormalities in this gene were excluded in 2 families and BRCA2 mutation was excluded in one family. P120. A Novel Founder CHEK2 Mutation is Associated with Increased Prostate Cancer Risk. Cezary Cybulski (1), T Huzarski (1), B. Górski (1), B. Masojć (1), M. Mierzejewski (1), T. Dębniak (1), B. Gliniewicz (2), J. Matyjasik (1), E. Złowocka (1), G. Kurzawski (1), A. Sikorski (2), M. Posmyk (3), M. Szwiec (4), R. Czajka (5), S.A. Narod (6), J. Lubiński (1) (1) International Hereditary Cancer Center, Department of Genetics and Pathology, Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland (2) Clinic of Urology, Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin, Poland (3) Regional Oncology Hospital, Białystok, Poland (4) Regional Oncology Hospital, Olsztyn, Poland (5) Department of Obstetrics and Perinatology, Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland (6) Centre for Research on Women’s Health, Toronto Ontario, Canada Variants in the CHEK2 have been found to be associated with prostate cancer risk in the USA and Finland. We sequenced CHEK2 gene in 140 Polish patients with prostate cancer, and then genotyped the three detected variants in a larger series of prostate cancer cases and controls. CHEK2 truncating mutations (IVS2+1G>A or 1100delC) were identified in nine of 1921 controls (0.5%), and in eleven of 690 (1.6%) unselected patients with prostate cancer (OR 3.4; p = 0.004). These mutations were found in four of 98 familial prostate cases (OR 9.0; p = 0.0002). The missense variant I157T was also more frequent in men with prostate cancer (7.8%) than in controls (4.8%), but the relative risk was more modest (OR 1.7; p = 0.03). I157T was identified in 16% of men with familial prostate cancer (OR 3.8;p=0.00002). Loss of the wild type CHEK2 allele was not observed in any of prostate cancers from five men who carried CHEK2 truncating mutations. Our results provide evidence that the two truncating mutations of CHEK2 confer a moderate risk of prostate cancer in Polish men, and that the missense change appears to confer a modest risk. P121. A high frequency of BRCA2 gene mutations in Polish families with ovarian and stomach cancer. Anna Jakubowska, R. Scott, J. Menkiszak, J. Gronwald, T. Byrski, T. Huzarski, B. Gorski, C. Cybulski, T. Debniak, E. Kowalska, T. Starzynska, M. Lawniczak, S. Narod, J.Lubinski Department of Genetics and Pathology, Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin, Poland. [email protected] Germ-line mutations in the BRCA2 gene are associated with a wide range of cancer types, including the breast, ovary, pancreas, prostate and melanoma. In this study, we evaluated the importance of a family history of stomach cancer in predicting the presence of a BRCA2 mutation in Polish patients with ovarian cancer. A BRCA2 mutation was found in eight of 34 women with ovarian cancer and a family history of stomach cancer versus three of 75 women with ovarian cancer and a family history of ovarian cancer, but not of stomach cancer (odds ratio=7.4; 95% CI 1.8-30; P=0.004). The results of this study suggest that, in the Polish population, the constellation of ovarian and stomach cancer predicts the presence of a germ-line BRCA2 mutation and confirms that stomach cancer is part of the spectrum of BRCA2 mutations. It is expected that the penetrance of BRCA2 mutations for stomach cancer will vary from country to country, reflecting local environmental and lifestyle factors. 107 Genetyka człowieka P122. The NOD2 3020insC mutation is the risk of familial pancreatic cancer. Katarzyna Nej (1), Detlef K. Bartsch (2), Mercedes Sina-Frey (3), Harald Rieder (3), Stephan A. Hahn (4), Jan Lubiński (5) (1) Inter-University Unit of Molecular Biology, University of Szczecin and Pomeranian Medica l University, Szczecin, Poland, [email protected] (2) Department of Surgery, Philipps-University, Marburg, Germany (3) Institute of Clinical Genetics, Philipps-University, Marburg, Germany (4) Department of Internal Medicine, Hospital Langendreer, Ruhr-University, Bochum, Germany (5) International Hereditary Cancer Center, Department of Genetics and Pathology, Szczecin, Poland Pancreatic cancer is an aggressive disease with a poor prognosis but despite much investigation little is known about genetic susceptibilities to this cancer. There are several studies showing pancreatic abnormalities in patients with Crohn’s disease. Recently in patients with Crohn’s disease mutations in CARD15/NOD2 have been found. Since the risk of cancers at various sites has been characterized among patients with Crohn’s disease, it was considered to be justified studying the relationship between NOD2 gene mutations and different cancer risks. Here, we report the analyses of the 3020insC mutation in the NOD2 gene in patients with pancreatic cancer. Initially, we have examined the frequency of the 3020insC mutation in 3 groups: 1. consecutive pancreatic cancers; 2. familial cases; 3. healthy children of pancreatic cancer patients from families with at least two pancreatic cancer cases where DNA samples from affected individuals were not available. The control group consisted of 300 consecutive newborns from the clinical hospitals of Szczecin. The frequency of the 3020insC mutation in the control group was 7%. In the group of consecutive cases six C-insertion mutations were identified (4.7%; 6/127). In the four independent familial pancreatic cancer patients no mutation was found, but four changes (14.8%; 4/27) were detected in the group of healthy children of pancreatic cancer patients derived from families with aggregations of these tumors. Since our results indicated there was an increased frequency of 3020insC mutation in familial pancreatic cancer cases we decided to enlarge this group. 30 additional familial pancreatic cancer patients from the German National Case Collection for Familial Pancreatic Cancer of the Deutsche Krebshilfe (FaPaCa) were included in this study. The frequency of the mutant allele in this group did not confirm our initial result since only two changes were found (6.7%; 2/30). However, even if Polish and German familial cases are combined it is still open question whether 3020insC is related to a predisposition to familial pancreatic cancers. Further investigations on larger numbers of cases are needed. In summary we can not conclude that NOD2 is not involved in familial pancreatic cancer but it appears not to be associated with sporadic cases of disease. P123. Ocena czułości wykrywania mutacji punktowych w genie TP53 za pomocą wielotemperaturowego SSCP (MSSCP). Radosław Kaczanowski (2), Agnieszka Dansonka-Mieszkowska (1), Jolanta Kupryjańczyk (1), Krzysztof Kucharczyk (2) (1) Zakład Patologii Molekularnej, Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej Curie, ul. W. Roentgena 5, 02-781 Warszawa (2) Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne, ul. Dzieci Warszawy 31/20, 02-495 Warszawa Planując eksperyment z zakresu genomiki funkcjonalnej należy wybrać taką metodę przesiewowej analizy zmienności genetycznej, aby cały eksperyment zakończył się w określonym czasie przy zazwyczaj określonym budżecie. Dlatego też, do podstawowych parametrów branych pod uwagę przy wyborze przesiewowej metody analizy zmienności genetycznej należą: koszt i czas jednostkowego badania oraz czułość analityczna danej metody. Jedną z powszechnie stosowanych metod do tych celów jest metoda SSCP. W celu zwiększenia jej zdolności do wykrywania mutacji oraz zmniejszenia kosztów i skrócenia czasu analizy opracowaliśmy metodę wielotemperaturowego SSCP (Multitemperature SSCP – MSSCP). W celu porównania czułości analitycznej wykrywania mutacji punktowych oraz małych delecji za pomocą MSSCP, analizowaliśmy tą metodą 104 produkty reakcji PCR zawierające zmiany genetyczne z eksonów 4-8 oraz eksonu 10 ludzkiego genu TP53. Metoda MSSCP wykazała wyższą wykrywalność dowolnych zmian genetycznych w porównaniu z jednotemperaturową analizą SSCP. W przypadku analizowanych prób wykrywalność zmian genetycznych metodą MSSCP wyniosła 89% w porównaniu z 73 % przy zastosowaniu SSCP wykonanego w 5°C, 68 % przy zastosowaniu SSCP 108 Genetyka człowieka wykonanego w 15 °C, oraz 30 % przy zastosowaniu SSCP w 35°C. Interesującym wynikiem było uzyskanie znacząco wyższej wykrywalności zmian genetycznych w produktach PCR przy zastosowaniu wielotemperaturowego SSCP (MSSCP) niż w przypadku SSCP wykonanego w temperaturze będącej średnią arytmetyczną z temperatur użytych w MSSCP – 89 vs. 70%. Wynik ten sugeruje, że fakt zmiany temperatur podczas analizy ruchliwości jednoniciowych konformerów DNA (ssDNA) jest niezależnym czynnikiem zwiększającym prawdopodobieństwo wykrycia zmian genetycznych w produktach reakcji PCR metodą SSCP. Metoda wielotemperaturowego SSCP, (MSSCP) jest szybką i efektywna techniką przesiewową dla wykrywania zmian genetycznych. P124. Detekcja mutacji genu P53 przy użyciu metody MSSCP u chorych na raka pęcherza moczowego Edyta Borkowska (1), Aleksandra Binka-Kowalska (1), Maria Constantinou (1), Hubert Tomczyk (1), Józef Matych (2), Agnieszka Nawrocka (3), Bogdan Kałużewski (1) (1) Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi (2) Oddział Urologii i Transplantacji Nerek Szpitala im. Pirogowa w Łodzi (3) Zakład Patomorfologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Rak pęcherza moczowego jest w Polsce szóstą co do częstości przyczyną zgonów na nowotwory złośliwe mężczyzn. Wyższe ryzyko zachorowania mają osoby palące tytoń oraz zawodowo narażone na kontakt z niektórymi mutagenami chemicznymi (np.: benzopiren, aminy aromatyczne). Wykrycie mutacji genu P53, w komórkach nowotworu pęcherza moczowego może stanowić niezależny czynnik predykcyjny progresji i nawrotu choroby. Celem badań było ustalenie warunków detekcji mutacji w eksonach 5-8 genu P53, przy użyciu metody MSSCP (Multitemperature Single-Strand Conformation Polymorphism) w próbkach DNA uzyskanych z osadu moczu jak również określenie rodzaju i częstości tych mutacji w różnych stopniach zaawansowania klinicznego raka pęcherza moczowego. Analizie poddano 67 mężczyzn i 15 kobiet z rozpoznanym klinicznie guzem pęcherza moczowego. Grupę odniesienia stanowiło DNA pochodzące od 202 zdrowych osób. Otrzymane wyniki porównano z rezultatami analizy utraty heterozygotyczności genu P53 (LOH), nadekspresji białka P53 i antygenu Ki-67 (testy immunohistochemiczne). Częstość mutacji w eksonach 5-8 genu P53 u chorych na raka pęcherza moczowego okazała się niższa niż przewidywana na podstawie danych literaturowych, ale zgodna z obserwacjami, że mutacje te występują głównie w wyższych stadiach zaawansowania klinicznego choroby i stadium carcinoma in situ. W przeprowadzonych badaniach w grupie chorych wykazano wyższy odsetek osób posiadających polimorfizm w kodonie 213 genu P53 (5,88%), w stosunku do grupy odniesienia (2,48%). Nie da się zatem wykluczyć, że obserwowany w/w polimorfizm może być jednym z czynników predysponujących do rozwoju raka pęcherza moczowego. P125. The HtrA1 serine protease is down-regulated during estrogen-induced carcinogenesis in male Syrian hamster kidney. Dorota Żurawa-Janicka (1), Jarosław Kobiela (2), Tomasz Stefaniak (2), Adam Figarski (2), Barbara Lipińska (1), Michał Woźniak (2) (1) Katedra Biochemii, Uniwersytet Gdański, Kładki 24, 80-822 Gdańsk (2) Katedra i Zakład Chemii Medycznej, Akademia Medyczna w Gdańsku, Dębinki 1, 80-211, Gdańsk Estrogens are associated with the causation of variety of human cancers, including breast, endometrium, ovary, prostate, and possibly, brain cancers. Chronic administration of estrogens induces a high frequency of mammary neoplasms in rats and malignant kidney tumors in Syrian hamster. Estrogen-induced and –dependent renal cancer of male Syrian hamster is generated by prolonged exposure to estradiol which causes kidney tumors within 9-12 months. humHtrA1 belongs to the HtrA family of serine proteases, the members of which are involved in a cellular stress response, including heat shock and inflammation process. The humHtrA1 gene is down-modulated in SV-40 transformed human fibroblasts. Down-regulation of the gene, in close correlation with the malignant progression and metastasis, has been observed in ovarian cancers and melanomas. These observations raise the possibility of HtrA1 as a candidate tumor suppressor gene. The aim of this study was to find out whether prolonged estrogenization, accompanying nephrocarcinogenesis of male Syrian hamster, causes any significant changes in expression of the htrA1 gene. To achieve this goal we used a multiplex semi-quantitative RT-PCR method to estimate the mRNA levels in kidneys after 1, 3 and 6 months from the initial implantation of estradiol. 109 Genetyka człowieka An 870 cDNA fragment of hamster htrA1 gene was successfully obtained using RT-PCR method with primers complementary to rat htrA1 gene coding sequence, cloned into pUC18 wector and sequenced with universal primers. Based on the hamster htrA1 sequence information, specific PCR primers were designed. The primers were then used for amplification of the htrA1 cDNA 750 bp fragment in a multiplex semi-quantitative RT-PCR, with 654 bp cDNA of beta-actin as a reference. Although no significant changes in the expression of the gene were detected following 3 months of estrogenization, the htrA1 mRNA level was significantly (p=0.05) decreased by 15% after 6 months of estradiol treatment. These observations were supported by the results of Western blotting analysis, which showed reduced level of the HtrA1 protein in kidney tissues after 6 months of estrogenization. Our results suggest that reduced level of the htrA1 gene expression can be correlated with cancer development during estrogen-induced carcinogenesis in male Syrian hamster. P126. Mutacje i polimorfizmy w genie NBS1 u dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną Maria Mosor (1), Danuta Januszkiewicz-Lewandowska (1, 2), Iwona Ziółkowska (1), Jerzy Nowak (1) (1) Instytut Genetyki Człowieka, Polska Akademia Nauk, Strzeszyńska 32, Poznań (2) Klinika Onkologii, Hematologii i Transplantologii Pediatrycznej, Akademia Medyczna, Fredry 10, Poznań Germinalne mutacje dwóch alleli genu NBS1 związane są z rozwojem zespołu Nijmegen, w którym zaobserwowano zwiększoną predyspozycję do rozwoju nowotworów złośliwych. Występowanie heterozygotycznej mutacji 657del5 w genie NBS1 jest związane z ryzykiem rozwoju niektórych nowotworów zwłaszcza raka piersi i jajnika, czerniaka złośliwego czy rdzeniaka. Brak jest natomiast jednoznacznych danych na temat występowania heterozygotycznych mutacji w genie NBS1 w schorzeniach limfoproliferacyjnych. Celem pracy było określenie częstości występowania mutacji i polimorfizmów w genie NBS1 u dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną (ALL). Materiał badawczy stanowił DNA wyizolowany z komórek krwi obwodowej/szpiku w chwili rozpoznania i/lub remisji choroby. Dodatkowo u części chorych celem różnicowania pomiędzy mutacją germinalną a somatyczną badania przeprowadzono na DNA izolowanym z komórek śluzówki jamy ustnej. W grupie 113 dzieci z ALL przeanalizowano wszystkie 16 eksonów genu NBS1. Jako metodę przesiewową wykorzystano analizę polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów DNA. Reakcję sekwencjonowania zastosowano do bezpośredniej analizy wykrytych mutacji i polimorfizmów. W grupie badanej wykryto 6 nosicieli mutacji w genie NBS1. W trzech przypadkach zidentyfikowano mutację I171V w eksonie 5 genu NBS1. W trzech pozostałych mutacje: 657del5, R215W oraz V210F w eksonie 6 genu NBS1. Analiza DNA z wymazu śluzówki jamy ustnej potwierdziła germinalne pochodzenie wszystkich wykrytych mutacji. Ponadto w kilkunastu przypadkach zidentyfikowano nowe zmiany w sekwencjach intronowych: IVS8-42 G/C (1/113), IVS15+88C/G (7/113)oraz IVS7-18G/A (12/113). Uzyskane wyniki sugerują, że germinalne mutacje w genie NBS1 mogą być czynnikiem ryzyka predysponującym do rozwoju ostrej białaczki limfoblastycznej u dzieci. Praca finansowana z grantu PBZ-KBN-090/005/2003. P127. Wpływ 5-fluorouracylu na ekspresję genu mdr1 oraz bcl-2 w komórkach raka jelita grubego in vitro. Jolanta Rzymowska, Piotr Maj Zakład Medycyny Nuklearnej, Akademia Medyczna Lublin Celem naszych badań było określenie korelacji pomiędzy ekspresją badanych genów a działaniem cytostatyku, to jest 5-fluorouracylu. Badanymi genami był gen oporności wielolekowej (mdr1) oraz gen antyapoptotyczny – bcl-2.� Badania wykonano w układzie in vitro, to jest w hodowli komórek raka jelita grubego – COLO. Komórki hodowli in vitro inkubowane w standardowych warunkach z terapeutyczną dawką 5-fluorouracylu. Po 72 godzinnej inkubacji z cytostatykiem wykorzystywano metodę hybrydyzacji in situ z użyciem znakowanych fluoresceiną starterów dla genów mdr1 oraz bcl-2. Określano także ilość komórek obumierających na drodze apoptozy pod wpływem 5-fluorouracylu. Ilość komórek apoptotycznych analizowano w mikroskopie konfokalnym po wybarwieniu komórek anneksyną oraz jodkiem propidionowym. 110 Genetyka człowieka P128. Analiza cytogenetyczna oraz badanie fuzji genowych w ostrej białaczce limfoblastycznej (ALL) u dzieci. Krystyna Soszyńska, Barbara Mucha, Katarzyna Skonieczka, Ewa Duszenko, Izabela Makowska, Robert Dębski, Mariusz Wysocki, Olga Haus Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej AM w Bydgoszczy Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii AM w Bydgoszczy, Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku AM we Wrocławiu W komórkach szpiku dzieci chorych na ostrą białaczkę limfoblastyczną (ALL) zidentyfikowano wiele aberracji liczbowych i strukturalnych chromosomów. Obecność określonej zmiany genetycznej ma wpływ na rozwój determinowanego przez nią typu białaczki, a co za tym idzie na przebieg kliniczny choroby oraz odpowiedź na leczenie. Badania cytogenetyczne i molekularne komórek szpiku mają znaczenie na każdym etapie procesu diagnostycznego i terapeutycznego ALL, a wynik badania jest niezależnym czynnikiem rokowniczym w tej chorobie. PACJENCI: Badania przeprowadzono u 80 dzieci w wieku od 1 do 18 lat (43 dziewczynki i 37 chłopców) hospitalizowanych w Klinice Pediatrii Hematologii i Onkologii AM w Bydgoszczy, z rozpoznaniem ALL. W tej grupie u 70 dzieci rozpoznano ALL linii B komórkowej (39 dziewczynek + 31 chłopców), u 9 dzieci rozpoznano T– komórkową ALL (3 dziewczynki + 6 chłopców), oraz u 1 dziewczynki rozpoznano „null”ALL. MATERIAŁ badań stanowiły komórki szpiku kostnego poddane stymulowanej i niestymulowanej hodowli komórkowej oraz RNA wyizolowane z komórek szpiku kostnego METODY. Dla każdego pacjenta przeprowadzono: 1) analizę cytogenetyczną techniką prążków GTG i CBG, 2) analizę molekularną metodą RT– PCR w celu określenia obecności lub braku 4 fuzji genowych (BCR/ABL, TEL/AML1, E2A/ PBX1, MLL/AF), 4) analizę techniką FISH do chromosomów metafazowych oraz jąder interfazowych w celu uściślenia lub weryfikacji rozpoznania cytogenetycznego u 16 dzieci. CELEM PRACY była analiza komórek szpiku pochodzących od dzieci z rozpoznaniem ALL pod kątem korelacji zmian cytogenetycznych z obecnością fuzji genowych oraz analiza korelacji genetyczno-klinicznych u tych dzieci. WYNIKI. Kariotyp uzyskano u 68 dzieci. Kariotyp prawidłowy w chwili rozpoznania stwierdzono u 28 dzieci, kariotyp nieprawidłowy u 40 dzieci. Kariotyp hyperdiploidalny >50 chromosomów stwierdzono u 9 dzieci, kariotyp hyperdiploidalny 47-49 chromosomów u 7, pseudodiploidalny u 19, diploidalny u 28 oraz hypodiploidalny < 46 chromosomów u 5. Metodami molekularnymi (RT-PCR) i molekularno-cytogenetycznymi (FISH) określono obecność następujących fuzji genowych: 1.BCR/ABL – odpowiadająca t(9;22)(q34;q11) – u 2 dzieci (u 1 korelowała z wynikiem badania cytogenetycznego, u drugiego translokacja Ph była zamaskowana wariantem translokacyjnym t(19;22). 2.MLL/AF4 – odpowiadająca t(4;11)(q21;q23) – nie znaleziono, natomiast u 5 dzieci stwierdzono aberracje 11q23 (u 1 dziecka jako jedyną aberrację w kariotypie, u 4 dzieci – w kariotypie złożonym), potwierdzone obecnością rearanżacji MLL w technice FISH. 3.E2A/PBX1 – odpowiadająca t(1;19)(q23;p13) – u 2 dzieci (u 1 jako zrównoważona t(1;19)(q23;p13), u drugiego w formie der(19) t(1;19)(q23;p13). 4.TEL/AML1 – odpowiadająca t(12;21)(p13q22) – u 10 dzieci (u 3 towarzyszyła aberracjom widocznym mikroskopowo, u 7 występowała jako pojedyncza aberracja). P129. Dysgerminoma (seminoma), gonadoblastoma oraz guz mieszany z komórek płciowych i komórek sznurów płciowych u dwóch dorosłych kobiet leczonych od 16 roku życia. (1) Zakład Genetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi (2) Klinika Endokrynologii i Terapii Izotopowej I CZMP (3) Klinika Medycyny Matczyno-Płodowej I CZMP (4) Zakład Patomorfologii Klinicznej I CZMP (5) Zakład Andrologii i Endokrynologii Płodności Instytutu Endokrynologii UM w Łodzi Zaprezentowano dwie fenotypowe kobiety w wieku 19 i 26 lat, skierowane do Poradni Genetycznej ze względu na pierwotny brak miesiączki. Z tego powodu obie pacjentki były okresowo leczone od 16 roku życia preparatami estrogenowo-progesteronowymi. Plamienia z dróg rodnych pojawiały się wyłącznie po podstawieniu cyklu. W obu przypadkach stwierdzono kariotyp 46,XY. Analiza hormonalna pozwoliła na wykazanie hipogonadyzmu hipergonadotropowego (FSH i LH odpowiednio 67,08 i 28,45 oraz 38,18 i 11,66 mIU/ml). U każdej z pacjentek 111 Genetyka człowieka rozpoznano czystą dysgenezję gonad. Ze względu na obecność w kariotypie chromosomu Y i związane z tym ryzyko wyjścia z dysgenetycznych gonad zmian nowotworowych, pacjentki zakwalifikowano do obustronnej gonadektomii metodą laparoskopową. Ocena histologiczna umożliwiła wykazanie w dysgenetycznych gonadach u starszej z pacjentek zmian nowotworowych o typie gonadoblastoma z ogniskami dysgerminoma (seminoma). U młodszej chorej w gonadzie prawej stwierdzono guz mieszany z komórek płciowych i komórek sznurów płciowych (mixed cell-sex cord-stromal tumor), współistniejący z dużych rozmiarów dysgerminoma w lewej gonadzie. Przeprowadzono analizę molekularną chromosomu Y, w tym także genu SRY. U starszej pacjentki wykluczono mutację tego genu. W drugim przypadku wstępna analiza SSCP sugeruje możliwość wystąpienia mutacji w obrębie genu SRY. Dyskusji poddano możliwy wpływ leczenia hormonalnego na rozwój nowotworów wywodzących się z płodowych komórek płciowych, wdrożonego bez wstępnej diagnostyki klinicznej. Przedstawione przypadki potwierdzają konieczność przeprowadzania gonadektomii u fenotypowych kobiet z dysgenezją gonad i kariotypem 46,XY, przed podjęciem terapii substytucyjnej. Gonadektomia wykonana drogą laparoskopową wydaje się być zabiegiem oszczędzającym dla pacjentek i godnym polecenia. Praca finansowana w części z grantu KBN nr 6 PO5E 135 21 P130. Wstępne badania korelacji ekspresji genu MDR1 w limfoblastach, poddanych in vitro działaniu prednizolonu, z przebiegiem klinicznym ostrej białaczki limfoblastycznej. Hanna Janiszewska (1), Jan Styczyński (2), Olga Haus (1), Mariusz Wysocki (2) (1) Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej AM w Bydgoszczy (2) Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii AM w Bydgoszczy Oporność komórek na cytostatyki stanowi jeden z głównych czynników ograniczających skuteczność terapii przeciwbiałaczkowej. Może dotyczyć pojedynczego leku lub mieć charakter oporności wielolekowej. Za proces ten odpowiedzialne są białka przezbłonowe, tzw.wielolekowe transportery, ktorych ekspresja w błonie komórek opornych jest znacznie większa. Głównym tego typu białkiem jest glikoproteina-P kodowana przez gen MDR1 (multidrug resistance), zlokalizowany w regionie q21.1 chromosomu 7. Celem pracy była ocena wpływu in vitro prednizolonu na ekspresję genu MDR1 i jego związek z wynikami terapii dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną. Materiał stanowiły limfoblasty pochodzące od 30 dzieci (wiek od 1 miesiąca do 15,5 lat) z ALL (26 de novo, 4 wznowy), które poddano 72 godzinnej inkubacji z prednizolonem. Dwukrotnie, przed i po terapii prednizolonem, wykonano: półilościowe badanie ekspresji genu MDR1 metodą RT-PCR, badanie ekspresji białka P-gp metodą cytometrii przepływowej oraz retencji rodaminy R123 w/bez obecności cyklosporyny A. Ponadto dokonano oceny wyników leczenia przeciwbiałaczkowego w zależności od ekspresji MDR1 w limfoblastach przed i po inkubacji z prednizolonem. U 47% pacjentów (w tym u 2/4 ze wznową) nie stwierdzono ekspresji MDR1, zarówno w dniu 0, jak i w 3 dniu inkubacji limfoblastów z prednizolonem. 53% pacjentów (w tym 2/4 ze wznową) wykazywala ekspresję MDR1 w momencie rozpoznania choroby. Wśród tej grupy u 62% pacjentów (w tym u 1 ze wznową) obserwowano utrzymywanie się ekspresji, lecz z tendencją spadkową w 3 dniu inkubacji z prednizolonem, natomiast u pozostałych 38% (w tym u 1 ze wznową) nie stwierdzono już ekspresji MDR1 po 3 dniach inkubacji limfoblastów z lekiem. Nie stwierdzono korelacji pomiędzy ekspresją MDR1 i ekspresją Pgp, zarówno przed, jak i po inkubacji z prednizolonem (test korelacji Spermana). U pacjentów z ekspresją MDR1 w dniu 0 oraz w dniu 3, zaobserwowano większą retencję rodaminy w obecności cyklosporyny, co wskazuje na blokowanie funkcji glikoproteiny-P przez jej inhibitor cyklosporynę A. P131. Znaczenie polimorfizmu w genie cykliny D1 (CCND1) w kształtowaniu ryzyka wystąpienia nowotworów krtani. Małgorzata Rydzanicz (1), Paweł Golusiński (2), Daniela Mielcarek-Kuchta (2), Krzysztof Szyfter (1, 2) (1) Instytut Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu, ul. Strzeszyńska 32, 60-479 Poznań (2) Klinika Otolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Cyklina D1 jest kluczowym enzymem kontrolującym przejście z fazy G1 do fazy S cyklu komórkowego. Nadekspresja tego białka wiązana jest z rozwojem wielu nowotworów, w tym raków krtani. Jedną z proponowanych przyczyn prowadzących do deregulacji cykliny D1 jest polimorfizm w genie CCND1. Substytucja G870A w kodonie 242 moduluje częstość alternatywnego splicingu. Białko kodowane przez genotyp z allelem A ma unikatowy, krótszy Ckoniec pozbawiony dwóch sekwencji regulatorowych odpowiedzialnych za transport cykliny D1 z jądra do cytoplazmy i jej degradację. W ten sposób może powstać białko o dłuższym okresie półtrwania, co prowadzi do akumulacji cykliny D1 w komórce, zwiększonej proliferacji komórkowej, a tym samym do inicjacji procesu nowotworowego. 112 Genetyka człowieka Stosując technikę PCR-RFLP przeanalizowano rozkład częstości genotypów genu CCND1 w grupie 63 chorych z rakiem krtani, u których wcześniej badano ekspresję cykliny D1 metodami immunohistochemicznymi oraz grupie 102 zdrowych osób. Genotyp GA oraz kombinacja genotypów GA i AA, związany był ze wzrostem ryzyka rozwoju choroby nowotworowej (odpowiednio: OR=3,02, p=0,004 i OR=2.52, p=0.013). Częstość allelu A była wyższa u chorych (0,484) niż u osób zdrowych (0,416) i nieznacznie wpływała na podwyższenie ryzyka raka krtani (OR-1,34, 95% CI-0,84-2,05). Genotyp AA częściej występował u osób, u których wcześniej rozwinął się nowotwór (mediana 51.5) w porównaniu z genotypem GG (mediana 63.0) i związany był z obecnością przerzutów do węzłów chłonnych (OR=3.26). Najwyższy poziom ekspresji cykliny D1 obserwowano głównie w przypadkach z homozygotycznym genotypem AA. Wyniki badań sugerują, że polimorfizm w genie CCND1 może zwiększać podatność na rozwój nowotworów krtani, wpływać na ich progresję i rokowania dla pacjenta. P132. Badania ilościowe chimeryzmu komórek hematopoetycznych u dzieci poddanych allogenicznej transplantacji szpiku kostnego (allo-BMT). Małgorzata Dawidowska (1), J. Jółkowska (1), M. Witt (1), J. Wachowiak (2) (1) Instytut Genetyki Człowieka Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu, Zespół Genetyki Molekularnej i Klinicznej (2) Klinika Hematologii i Onkologii Dziecięcej Akademii Medycznej im.Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Ostra białaczka limfoblastyczna (ALL) stanowi najczęstsze wskazanie do allogenicznej transplantacji komórek hamatopoetycznych (allo-HSCT) u dzieci. Chimeryzm poprzeszczepowy, definiowany jako współwystępowanie w organizmie biorcy własnych komórek hematopoetycznych z komórkami dawcy, pozwala ocenić rekonstytucję hematologiczną, stwierdzić odrzucenie przeszczepu, oraz wykryć molekularne symptomy wznowy i choroby przeszczep przeciw gospodarzowi (GvHD). Stwarza to możliwość modyfikacji procesu terapeutycznego i zwiększenia jego skuteczności. Wartość prognostyczna badań chimeryzmu została przez nas potwierdzona, we wcześniejszych badaniach, obejmujących pacjentów po allo-BMT z powodu różnych wskazań. Obecnie, szczególny obiekt zainteresowania stanowi grupa dzieci z ALL, u których zamierzamy rozszerzyć monitorowanie potransplantacyjne o badania poziomu choroby resztkowej (MRD), charakteryzujące się większą czułością oraz przydatnością na różnych etapach terapii ALL, nie tylko po transplantacji. Badania chimeryzmu wykonano w oparciu o analizę markerów mikrosatelitarnych, amplifikowanych przy użyciu starterów znakowanych fluorescencyjnie i rozdzielanych elektroforetycznie w sekwenatorze DNA ALF Express (Pharmacia Biotech). Identyfikację genotypów i analizę ilościową przeprowadzono z użyciem programu komputerowego Fragment Manager (Pharmacia Biotech). Materiał do badań stanowiły krew obwodowa i szpik kostny, niekiedy mononukleary i limfocyty CD3 izolowane z krwi/szpiku kostnego pacjentów przed transplantacją i w określonych odstępach czasu po zabiegu, oraz krew/szpik dawców. Dotychczas, ilościową analizę chimeryzmu przeprowadzono u 15 dzieci z ALL, identyfikując pełen chimeryzm dawcy u 7 pacjentów, chimeryzm mieszany u 1, oraz zmienny status chimeryzmu w 7 przypadkach. Stwierdzono także korelację wyników badań ze stanem klinicznym pacjentów, co stanowi potwierdzenie przydatności badań chimeryzmu w terapii białaczek, argument za ich upowszechnieniem w rutynowych badaniach po transplantacji allogenicznej, oraz punkt wyjścia do badań porównujących przydatność monitorowania chimeryzmu i choroby resztkowej. P133. Ostra białaczka promielocytowa u pacjenta z zespołem XYY. Ewa Wasilewska (1), K. Głażewska (1), M. Klimiuk (1), B. Panasiuk (2), J. Kłoczko (1) (1) Klinika Hematologii AM w Białymstoku (2) Zakład Genetyki Klinicznej AM w Białymstoku Przedstawiamy kolejną własną obserwację występowania ostrej białaczki szpikowej u 55-letniego mężczyzny z kariotypem 47,XYY. Zespół XYY został wykryty u pacjenta w wyniku badania kariotypu szpiku z powodu ostrej białaczki promielocytowej (AML/M3). Badaniem klinicznym nie obserwowano odchyleń fenotypowych. W badaniu biochemicznym stwierdzono obniżony poziom testosteronu. Ocenę kariotypu komórek szpiku przeprowadzonego3krotnie: w okresie remisji (dwukrotnie) i nawrotu choroby. Stwierdzono występowanie typowej dla tego typu białaczki translokacji chromosomowej wzajemnej t(15;17)(q22;q21). Przedstawiona obserwacja współwystępowania kariotypu konstytucyjnego XYY z białaczką może mieć znaczenie w poradnictwie genetycznym mężczyzn XYY, w aspekcie występowania ryzyka choroby nowotworowej. 113 Genetyka człowieka P134. Wykrywanie wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV) typu 16 w rakach przełyku. Jarosław Sawiniec (1), Henryk Berbeć (2), Magdalena Dmoszyńska-Graniczka (2), Andrzej Dąbrowski (3), Rafał Sawicki (1), Krzysztof Borkowski (1) (1) Katedra i Zakład Biochemii AM Lublin, ul. Chodzki 1 (2) Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej AM Lublin, (3) II Katedra i Klinika Chirurgii Ogólnej AM Lublin Z danych epidemiologicznych ostatnich lat wynika, że przewód pokarmowy jest jedną z najczęstszych lokalizacji nowotworów złośliwych na świecie. Szansa przeżycia chorego zależy przede wszystkim od stadium zaawansowania procesu rozrostowego w chwili jego wykrycia. Rak przełyku cechuje się nikłą symptomatologią we wczesnym okresie, zaś zaawansowane jego postacie charakteryzują się bardzo złymi wynikami leczenia. Dlatego też celowe jest poszukiwanie czynników odpowiedzialnych za transformację nowotworową. Wirus brodawczaka ludzkiego, ze swoim szczególnym tropizmem do komórek płaskonabłonkowych, uważany jest za ważny czynnik onkogenny w rakach szyjki macicy i rakach krtani. Istnieją natomiast kontrowersyjne doniesienia co do obecności i roli HPV w rozwoju raka przełyku. Celem niniejszej pracy było wykrycie obecności wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16 w materiale klinicznym pochodzącym z guzów usuniętych w czasie leczenia operacyjnego 45 przypadków raka przełyku. Matrycowe DNA wyizolowano metodą Blina i wsp. Obecność wirusa wykrywano z zastosowaniem techniki „nested PCR” wykorzystując „Zestaw do wykrywania HPV 16” firmy „DNA-Gdańsk s.c” w modyfikacji własnej. Obecność sekwencji wirusa HPV stwierdzono w 31 (69%) przypadkach. Powyższą metodę wykrywania HPV zastosowano także do identyfikacji jego obecności w materiale klinicznym pochodzącym z 10 guzów płuca. W tym wypadku każdorazowo uzyskiwano rezultat negatywny. Otrzymane wyniki wskazują na współwystępowanie raka przełyku z infekcją wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16, co może wskazywać na istotną rolę tego wirusa w procesie nowotworzenia. P135. Translokacje chromosomowe w zespołach mielodysplastycznych (MDS). Olga Haus (1), Ewa Duszeńko (2) Izabela Makowska (2), Katarzyna Skonieczka (1), Barbara Mucha (1), Krystyna Soszyńska (1) (1) Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej AM w Bydgoszczy (2) Katedra i Klinika Hematologii AM we Wrocławiu Aberracje chromosomów w zespołach mielodysplastycznych są z reguły niezrównoważone. Najczęstszymi z nich są monosomie i delecje długich ramion chromosomów 5 i 7 oraz trisomia 8. Translokacje, w których dochodzi do powstania genów fuzyjnych, należą do rzadkości; występują u ok. 10-15% pacjentów z aberracjami. Celem badań było poznanie częstości i rodzajów translokacji występujących w MDS oraz ich związku z przebiegiem klinicznym choroby. Badania cytogenetyczne komórek szpiku wykonano u 200 nieleczonych chorych z MDS. Komórki do analizy uzyskiwano z 24– i 48-godzinnych, niestymulowanych i stymulowanych GM-CSF, hodowli. U każdego chorego analizowano conajmniej 15 metafaz wybarwionych w technice GTG. Technikę FISH z sondami centromerowymi i malującymi stosowano w celu znalezienia ukrytych aberracji chromosomów 5, 7 i 8 oraz wyjaśnienia charakteru niektórych translokacji. Nieprawidłowy kariotyp stwierdzono u 96 chorych (48%). Najczęstszymi aberracjami były 5q-,+8,7q-,-7,-5,-Y,chromosomy koliste, +21, aberracje 11q23,-18, 6q-. U 12 chorych (12.5% chorych z aberracjami) znaleziono translokacje; u 3 były to translokacje typowe dla ostrych białaczek; t(9;22) – 2x i t(8;21) – 1x. U 9 pacjentów znaleziono rzadkie translokacje o nieprzypadkowych punktach złamań chromosomów. Były to np: niezrównoważona t(1;7)(q10;p10) połączona z delecją 7q i częściową trisomią 7p, która wystąpiła u chorego z hipoplastycznym MDS, zrównoważona t(1;3)(p36;q21), połączona prawdopodobnie z fuzją genów MEL i ryboforyny 1, u chorego z dysplazją trójukładową i niezrównoważona t(17;20)(q21;q13.1) u pacjenta z RARS. Translokacje, nawet zrównoważone, mają niekorzystne znaczenie rokownicze w MDS. W badanej grupie kojarzyły się z cięższym przebiegiem choroby i krótszym czasem przeżycia w stosunku do analogicznych parametrów klinicznych w grupie chorych bez aberracji i z aberracjami liczbowymi. 114 Genetyka człowieka P136. Nowe warianty swoistej translokacji t(X;18) w pięciu guzach mięsaka maziówkowego u człowieka. Mariola Iliszko (1), Janusz Ryś (2), Maria Dębiec-Rychter (4), Maria Chosia (3), Janusz Limon (1) (1) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Akademii Medycznej w Gdańsku (2) Zakład Patologii, Centrum Onkologii Oddział w Krakowie (3) Katedra Patomorfologii Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie (4) Zakład Genetyki Człowieka Uniwersytetu w Leuven, Belgia Mięsaki maziówkowe stanowią 10% wszystkich rodzajów mięsaków i charakteryzują się występowaniem wysoce swoistej chromosomowej translokacji wzajemnej t(X;18)(p11;q11) lub jej wariantów. Materiałem badawczym było pięć guzów, z których wyprowadzono pierwotne hodowle komórkowe in vitro a otrzymane metafazy barwiono metodą prążków G. W wyniku analizy cytogenetycznej stwierdzono następujące kariotypy: Guz I: 46,X,t(X;18;3)(p11;q11;q11)[15]; Guz II: 46,X,t(X;15;18)(p11;p11;q11)[15] Guz III: 52,der(X)t(X;18)(p11;q11),+ der(X)t(X;18)(p11;q11), Y,+Y,+3,inv(5)(p15.3q13),del(6)(p23),+7,+8,der(9)t (X;9)(p11;p13),+12,-13,+14,add(16)(q12),add (18) (p11),add(19)(p13)[cp14] Guz IV: 69-73,der(X)t(X;18)(p11;q11)x2,Y,del(1)(q32), der(1) t(1;3)(p36.3;p23),-3,-4,der(5)t(5;10)(q13;q22) x3,+5,-6,+7,inv(9)(p11q21.2)x2c?,-11,+12, der(13)t(4;13)(p12;q22),-14,der(18)t(5;18)(q13;q11) x2,+18,+der(19)t(8;19)(p13;q13)x2,+21,mar[cp14] Guz V: 91-97,t(X;17;18)(p11;p11;q11)x2,YY,+add(6)(q13), del(11)(p11.2),+12,+15[cp8] W dwóch przypadkach (I –II) stwierdzono kariotyp prosty, a w pozostałych złożony. We wszystkich badanych guzach wykryto nie opisane dotąd warianty swoistej translokacji (wytłuszczonym drukiem), gdzie obok chromosomów X i 18 dodatkowo zaangażowane są kolejno chromosomy: 3 w guzie I, 15 w II, 9 w III, 5 w IV oraz 17 w guzie V. Oprócz translokacji swoistej, w trzech ostatnich guzach występują liczne wtórne aberracje chromosomowe. Wspólną zmianą wtórną dla tych guzów jest dodatkowa kopia chromosomu 12, a w guzach III i IV także chromosomu 7. Są to najczęściej obserwowane wtórne zmiany liczbowe w mięsaku maziówkowym. Wykrycie aberracji swoistej we wszystkich przypadkach potwierdziło histopatologiczne rozpoznanie mięsaka maziówkowego. P137. Analiza mutacji genu BRCA1 w 137 rodzinach obciążonych rakiem piersi i / lub jajnika. Magdalena Perkowska (1), I. Brożek (1), E. Senkus (2), G. Palomba (3), M. Pisano (3), G. Palmieri (3), A. Borg (4), J. Limon (1) (1) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki AMG (2) Katedra i Klinika Onkologii i Radioterapi AMG (3) Institute of Molecular Genetics, Consiglio Nazionale Ricerche, Alghero (4) Department of Oncology, Lund University, Sweden. 3% zachorowań na raka piersi oraz 5-10% zachorowań na raka jajnika ma podłoże genetyczne i jest związane z mutacjami w dwóch genach supresorowych BRCA1 (17q12-21) i BRCA2 (13q12-13). Zmutowane geny charakteryzują się niepełną penetracją z tym że penetracja dla raka piersi jest znacznie wyższa (70% ) niż w raku jajnika (25%). Mutacje w genie BRCA1 stanowią 80% wszystkich wykrytych mutacji w rodzinach z dziedzicznym rakiem piersi i/lub jajnika. Celem przedstawionej pracy było wykonanie kompletnej analizy mutacji genu BRCA1 w grupie 137 pacjentów w rodzinach, w których występowała agregacja zachorowań na raka piersi i/lub jajnika. Materiał do badań stanowił, wyizolowany z limfocytów krwi obwodowej metodą fenol/chloroform DNA, pacjentów chorych na raka piersi i/lub jajnika. Analizę badanych próbek wykonano przy pomocy denaturacyjnej wysokosprawnościowej chromatografii cieczowej (DHPLC). Wszystkie próbki DNA, w których wzór pików różnił się od kontrolnego, były poddane sekwencjonowaniu. Mutacje w genie BRCA1 wykryto u 43 pacjentów (31%). Mutacje założycielskie, które występują najczęściej w populacji 115 Genetyka człowieka Polskiej: 5382insC oraz Cys61Gly stanowiły odpowiednio 45% i 24% przypadków. Zwraca uwagę wysoka częstość (37%) mutacji innych niż założycielskie: 3819del5, 185delAG, L1086X, G855X, 2991del5, IVS14+1G/A, 5465G/A. Uzyskane wyniki wskazują, że w przypadku negatywnych wyników dla mutacji założycielskich należy przeprowadzić pełną analizę genu BRCA1 P138. Analiza LOH genu BRCA1 w sporadycznych i dziedzicznych rakach jajnika. Karolina Ochman (1), I. Brożek (1), J. Dębniak (2), M. Stukan (2), J. Emerich (2), J. Limon (1) (1) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki (2) Instytut Położnictwa i Ginekologii Akademii Medycznej w Gdańsku 85-90% dziedzicznych przypadków raka jajnika związane jest z obecnością germinalnych mutacji genów supresorowych BRCA1 lub BRCA2. Utrata allela „dzikiego” prowadząca do utraty heterozygotyczności (LOH) stanowi zasadniczy mechanizm inaktywacji tych genów w guzie. Celem pracy była analiza częstości zjawiska LOH w dziedzicznej (spowodowanej mutacją genu BRCA1) i sporadycznej postaci raka jajnika oraz analiza zależności pomiędzy LOH, a wybranymi parametrami klinicznymi. Analizą LOH objęliśmy grupę 103 pacjentek z rozpoznaniem raka jajnika operowanych w Instytucie Ginekologii i Położnictwa AM w Gdańsku. DNA wyizolowano z mrożonych fragmentów guza i krwi. Do analizy użyto ośmiu markerów mikrosatelitarnych zlokalizowanych w chromosomie 17. Badanie LOH wykonywano z użyciem elektroforezy kapilarnej systemu ABI PRISM 310 oraz GENESCAN software. Zjawisko LOH dotyczące przynajmniej jednego locus zostało wykryte w 72 guzach (66,9%). W 37 (35.9%) przypadkach zjawisko to występowało w co najmniej pięciu loci, co wskazuje na utratę dużych fragmentów chromosomu 17, a w trzech guzach – ośmiu loci, co może świadczyć o utracie całego chromosomu 17. Przeprowadzono także analizę zależności pomiędzy utratą markera D17S1323, zlokalizowanego w intronie 12 genu BRCA1, a stopniem złośliwości histologicznej guza. Utrata markera była statystycznie częściej obserwowana u chorych z 3/4 stopniem złośliwości w porównaniu z chorymi z 1/2 stopniem (p=0,0047). Zaobserwowano także tendencję w kierunku znamienności porównując liczbę LOH w dwóch grupach pacjentek: z mutacją germinalną (10 pacjentek) oraz bez mutacji (93). U pacjentek z mutacją częściej obserwowano liczne (>4) utraty allela „dzikiego” (p=0,03). P139. Ocena znaczenia klasycznej techniki cytogenetycznej oraz metody hybrydyzacji in situ (FISH) w skutecznym monitorowaniu odpowiedzi na leczenie interferonem alfa(IFN)-doświadczenia własne. Renata Kroll, M. Prątnicka, A. Balcerzak, M. Komarnicki Katedra i Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych Układu Krwiotwórczego AM im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu W przewlekłej białaczce szpikowej (p.b.sz.) stwierdza się obecność typowej aberracji cytogenetycznej, którą określa się mianem chromosomu Filadelfia (translokacja t(9;22)(q34;q11) odpowiadająca fuzji genów BCR/ABL). Jednym ze sposobów leczenia, służącym przedłużeniu życia chorych na p.b.sz. jest terapia za pomoc interferonu-alfa. Wymaga ona jednak stałego monitorowania cytogenetycznego dla określenia odpowiedzi na stosowane leczenie. Otrzymanie wyniku badania cytogenetycznego wiąże się z koniecznością uzyskania odpowiedniej liczby komórek w stadium metafazy. Technika FISH pozwala na analizę komórek interfazowych. Celem pracy jest przedstawienie wyników porównania obu technik badawczych. Badaniami objęto 15 chorych na p.b.sz., w tym 8 mężczyzn i 7 kobiet w wieku 49 (34-70) lat otrzymujących IFN, ocenianych po 12 miesiącach leczenia. Badania wykonywano technik FISH i k.m.c., używając automatycznego systemu do detekcji chromosomów METASYSTEM z programami IKAROS oraz ISIS. Oceniano całkowitą liczbę metafaz, liczbę metafaz Ph+ oraz obecność fuzji genu BCR/ABL w jądrach metafazowych i interfazowych . Uzyskane wyniki wskazują, i technika FISH charakteryzuje się wyższą czułością oznaczeń w porównaniu z klasycznym badaniem cytogenetycznym. Pozwala ona na wykrycie pojedynczej komórki z onkogenem BCR/ABL. Jednakże, ze względu na dotychczas małą liczbę przeprowadzonych badań nie można jednoznacznie określić stopnia przydatności FISH w ocenie wyników leczenia IFN-em u chorych na p.b.sz. Uzasadnia to kontynuację dalszych bada . 116 Genetyka człowieka P140. Hereditary cancer program in Latvia Arvids Irmejs (1), Andris Gardovskis (1), Viktors Borosenko (1), Marianna Bitina (1), Diana Aigare (1), Grzegorz Kurzawski (2), Janina Suchy (2), Bohdan Gorski (2), Janis Gardovskis(1) (1) Hereditary Cancer Institute, Riga Stradins University, Latvia (2) International Hereditary Cancer Center, Pomeranian Medical University, Poland Introduction. Clinical genetics of cancer family syndromes in Latvia has been initiated on larger scale beginning from 1998 due to EC Copernicus multicenter project on Fenotype – genotype correlations in HNPCC and MENI and had it’s successful continuation due to the next EC project entitled Development of network of cancer family syndrome registries in Eastern Europe. In 2001 Hereditary Cancer Institute was established by Riga Stradins University. The main aim of this institute is to study the hereditary cancer syndromes in Latvia and to introduce the obtained knowledge into clinical practice. Materials and methods. From 02/1999 – 09/2002 in several hospitals of Latvia cancer family history was collected from 865 patients with colorectal cancer. Since 2002 cancer family history has been collected also for 148 patients with breast cancer who asked for genetic counseling. In families suspected of hereditary cancer syndromes, DNA testing for MLH1, MSH2 and MSH6 genes in colorectal cancer cases and BRCA1 gene in breast cancer cases was performed. In colorectal cancer cases immunohistochemical (IH) examination of the normal and cancer tissue from large bowel for protein expression in MSH2 and MSH6 genes was performed before DNA sequencing. Results. Among 865 colorectal cancer no one cancer in relatives was recognized in 402 (46.47%) cases. In 463 (53.53%) colorectal cancer cases there was at least one more cancer in relatives. Only 3 (0.35%) pedigrees fulfilled Amsterdam II criteria of Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (HNPCC) although histopathological confirmation of cancer in affected family members of those 3 pedigrees was not possible. 15 cases (1.73%) were suspected of HNPCC. In 69 cases (8%) so called cancer family aggregation (CFA) was detected. Until now 27 immunohistochemical examinations have been performed and in 3 cancers homogenous lack of MSH2 or MSH6 protein was found. In 1 of these cases mutation in MSH6 gene was identified. In 18 patients suspected of HNPCC or matching Amsterdam criteria, DNA DHPLC/ sequencing “exon by exon” for MLH1 and MSH2 founder mutations was performed. Two mutations were found. Among 148 breast cancer patients, 7 (4.7%) fulfilled hereditary breast cancer site-specific (HBC-SS) criteria, 2 (1.4%) – hereditary breast–ovarian cancer (HBOC) criteria, 35 (23.6%) were suspected of HBC-SS and 3 (2%) were suspected of HBOC. In 18 (12.2%) cases, CFA criteria were fulfilled. Until now 22 patients fulfilling the criteria of HBC-SS or HBOC were tested for BRCA1 mutations – 5382insC, C61G and 4153delA. In 5 families mutations were found. For all of families with HNPCC, HBC-SS or HBO diagnosed definitely or with high probability appropriate recommendations concerning prophylactics, surveillance and treatment were elaborated and transmitted in written form. 3 of above families with HBC-SS or HBO participated earlier in another hereditary breast cancer project realized in Latvia. None of these families, including one with identified BRCA1 constitutional mutation, received appropriate special clinical recommendations. Conclusions. Existing pedigree/clinical data suggest that in Latvia the frequency of HNPCC is around 2% of consecutive colorectal cancer patients and features of hereditary breast cancer can be found in almost 30% of breast cancer patients asking genetic counseling. It is crucial that genetics counseling is the integral part of cancer family syndrome programmes. 117 Genetyka człowieka Doniesienia różne Komunikaty plakatowe: P141. Użycie wysokorozdzielczej hybrydyzacji porównawczej genomu (High Resolution-Comparative Genomic Hybridization HR-CGH) do identyfikacji chromosomów markerowych. Mariusz Babicz , Jerzy R. Kowalczyk, Monika Lejman, Anna Gaworczyk, Dorota Winnicka, Rafał Dmowski, Marta Holweg Dziecięcy Szpital Kliniczny AM w Lublinie, Klinika Hematologii i Onkologii Dziecięcej AM w Lublinie Pracownia Cytogenetyczna, ul. Chodźki 2, 20-093 Lublin Chromosom markerowy jest definiowany jako mały, dodatkowy chromosom o nieznanym mechanizmie powstawania. Ok. 90 % chromosomów może pochodzić z krótkich ramion i regionów okołocentromerowych chromosomów akrocentrycznych grupy D i chromosomów metacentrycznych grupy F. Chromosomy markerowe to chromosomy metacentryczne lub akrocentryczne, często zawierające jeden lub dwa centromery, lub przybierające morfologię chromosomów pierścieniowych. Bardzo trudne do identyfikacji za pomocą znanych i dostępnych cytogenetycznych technik prążkowych. Wysokorozdzielcza hybrydyzacja porównawcza genomu (High resolution comparative genomic hybridization HR-CGH) dostarcza informację screening’ową aberracji niezrównoważonych podczas pojedynczej hybrydyzacji do prawidłowych chromosomów ludzkich in situ przygotowanego odpowiednio genomowego DNA badanego i wzorcowego. Rozdzielczość metody jest określana na ok. 5000 par zasad co daje szerokie możliwości w identyfikacji niezrównoważonych nieprawidłowości chromosomowych, a w szczególności trudnych do identyfikacji chromosomów markerowych. Zastosowaliśmy HR-CGH do identyfikacji chromosomów markerowych u pięciu pacjentów z różnymi wskazaniami klinicznymi przyjętych do Poradni Genetycznej Dziecięcego Szpitala Klinicznego w Lublinie. Przy zastosowaniu dostępnych metod prążkowych (G, Q, C, R, NOR, DAPI) identyfikacja poszczególnych markerów była niemożliwa. W 100 % przypadków dodatkowy materiał chromosomowy został zidentyfikowany i przyporządkowany odpowiednim regionom na chromosomach metafazalnych; markery zostały również potwierdzone przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Stosując HR-CGH otrzymaliśmy: {1} izochromosom ramion krótkich chromosomu 18 u pacjenta z kariotypem 47, XY,+ mar[50]. rev ish enh(18p) z cechami klinicznymi dysmorfii twarzowej czaszki, wadami CUN, wnętroctwem; {2} delecję regionu q31;q34 chromosomu 13 u pacjenta z kariotypem 46, XY, del(13)(p;q15)?[63]. rev ish dim(13q31qter) z cechami klinicznymi dysmorfii twarzowej czaszki; {3} izochromosom ramion q chromosomu X u pacjentki z kariotypem 46, X, i(Xq)?[85]. rev ish dim(Xp), enh(Xq) z cechami klinicznymi zespołu Turnera; {4} amplifikację regionu okołocentromerowego chromosomu X (p11.3;q13) u pacjentki z kariotypem 46, XO,+mar[75]. rev ish enh(Xp11.3;q13) z cechami klinicznymi zespołu Turnera; {5} amplifikację regionu terminalnego ramion p chromosomu X (p21;pter) u pacjentki z kariotypem 46, XO,+mar[67]. rev ish enh(Xp21:pter) z cechami klinicznymi zespołu Turnera. Podsumowując, znaczenie kliniczne chromosomÓw markerowych jest szerokie i nie zawsze koreluje z fenotypem badanego pacjenta a wysokorozdzielcza hybrydyzacja porównawcza genomu jest szybką i efektywną metodą ich identyfikacji. 118 Genetyka człowieka P142. Analiza molekularna genów kandydackich odpowiedzialnych za powstawanie niesyndromicznej postaci rozszczepów wargi i podniebienia. Adrianna Mostowska (1), Barbara Biedziak (2), Piotr Wójcicki (3), Kazimierz Kobus (3), Wiesław H. Trzeciak (1) (1) Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, AM Poznań (2) Katedra Ortodoncji, AM Poznań (3) Szpital Chirurgii Plastycznej, Polanica Zdrój Rozszczepy wargi i podniebienia występują w populacji ogólnej z częstością około 2/1000 żywych urodzeń. Etiologia izolowanych postaci tej wady rozwojowej jest bardzo złożona, a w jej powstawaniu bierze udział wiele czynników, zarówno genetycznych jak i środowiskowych. Liczne badania molekularne oraz analizy sprzężeń pozwoliły wyznaczyć szereg genów, których mutacje lub też polimorfizmy są odpowiedzialne za powstawanie CL/P lub też zwiększają ryzyko wystąpienia tej nieprawidłowości rozwojowej. Jednakże dane dotyczące znaczenia wariantów polimorficznych w etiologii CL/P różnią się między sobą i ściśle zależą od badanej populacji. Celem projektu było sprawdzenie czy istnieje związek mutacji oraz polimorfizmów najważniejszych genów kandydackich z występowaniem izolowanych postaci CL/P w populacji polskiej oraz poszukiwanie nowych mutacji genów MSX1 oraz IRF6 u osób z wadami rozszczepowymi twarzy. Badaniami objęto grupę 150 osób z izolowaną postacią CL/P oraz grupę kontrolną składającą się z 150 osób, u których nie występowały żadne nieprawidłowości rozwojowe twarzoczaszki. W celu określenia rodzaju wariantu polimorficznego odpowiednie sekwencje badanych genów kandydackich (TGFA, MTHFR, MSX1 oraz RARA) amplifikowano przy użyciu specyficznych starterów i poddawano analizie restrykcyjnej lub też analizie MSSCP. Przeprowadzone badania pozwoliły wykazać istotny związek polimorfizmów BamHI oraz RsaI genu TGFA z występowaniem CL/P w populacji polskiej (p= 0,0058 i 0,0402 odpowiednio) oraz nie wykazały związku pozostałych badanych polimorfizmów z występowaniem wad rozszczepowych twarzoczaszki. W celu wykrycia mutacji sekwencje eksonów genów MSX1 oraz IRF6 amplifikowano z użyciem specyficznych starterów oraz analizowano za pomocą metody MSSCP. Analiza ta oraz bezpośrednie sekwencjonowanie DNA pozwoliły wykryć obecność wielu wariantów polimorficznych, które jednakże nie wykazują związku z występowaniem rozszczepów wargi i podniebienia w populacji polskiej. Uzyskane wyniki wskazują, że gen TGFA jest jednym z głównych genów kandydackich, którego mutacje / polimorfizmy są odpowiedzialne za powstawanie CL/P lub też zwiększenie ryzyka wystąpienia tej nieprawidłowości w populacji polskiej. Badane warianty polimorficzne pozostałych genów kandydackich, w odróżnieniu od innych populacji, nie wykazują związku z występowaniem CL/P. Badania finansowane z grantu KBN 2P05A 092 26. P143. Zmiana konserwowanej argininy w domenie błonowej białka pasma 3 przyczyną sferocytozy wrodzonej. Monika Maciąg (1), Justyna Spychalska (2), Ewa Jabłońska-Skwiecińska (1), Piotr Centkowski (2), Jerzy Kościelak (2), Ewa Zdebska (2), Anna Adamowicz-Salach (3) i Beata Burzyńska (1) (1) Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa (2) Instytut Hematologii i Transfuzjologii, ul. Chocimska 5, 00-957 Warszawa (3) Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii AM w Warszawie, ul Marszałkowska 24, 00-576 Warszawa Sferocytoza wrodzona jest w Polsce najczęstszą wadą wrodzoną krwinek czerwonych i zależy od zaburzeń budowy białek błonowych erytrocytów. Ocenia się, że sferocytoza wrodzona występuje z częstością 1:2000. Obraz kliniczny sferocytozy wrodzonej jest bardzo zróżnicowany: od przypadków lekkich, z chorobą hemolityczną wyrównaną, do przypadków ciężkich wymagających systematycznych przetaczań krwi. Choroba dziedziczy się w sposób autosomalny dominujący, a rzadziej – autosomalny recesywny. Przedstawiamy analizę molekularną i biochemiczną przypadku sferocytozy wrodzonej; choroba dotyczy 40-letniego mężczyzny pozostającego od 20 lat pod opieką lekarska z powodu niedokrwistości z towarzyszącą żółtaczką i powiększeniem śledziony. Żółtaczkę i powiększenie śledziony obserwowano także u ojca i babki chorego. U trzech synów chorego nie stwierdzono klinicznych ani laboratoryjnych cech niedokrwistości hemolitycznej. W wyniku przeprowadzonych badań u chorego wykryto zaburzenia składu białek błonowych krwinek czerwonych, wyrażające się obniżeniem ilości białka pasma 3 i ankiryny. Analiza sekwencji genów kodujących białka błonowe wykazała obecność mutacji powodujących zmiany aminokwasów w trzech białkach: w białku pasma 3 zamiana argininy na histydynę (R808H), w ankirynie zamiana izoleucyny na treoninę (I1075T) i w beta-spektrynie zamiana seryny na asparaginę (S439N). 119 Genetyka człowieka Mutacje dotyczące genów ankiryny i beta-spektryny znaleziono także u synów chorego, natomiast żaden z nich nie miał mutacji w genie białka pasma 3. Wydaje się więc że, mutacją odpowiedzialną za wystąpienie objawów sferocytozy wrodzonej jest mutacja genu pasma 3; mutacja znajduje się w części genu kodującego domenę błonową białka pasma 3, a powoduje zmianę konserwowanej argininy. P144. Analiza budowy transkryptu receptora CCR5 występującego w dojrzałych plemnikach człowieka. Anna Kozłowska (1), Radosław Januchowski (1) , Andrzej Bręborowicz (2), Leszek Pawelczyk (2), Piotr Jędrzejczak (2), Paweł P. Jagodziński (1) (1) Katedra Biochemii i Biologii Molekularnej, Akademia Medyczna im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu (2) Klinika Niepłodności i Endokrynologii Rozrodu, Akademia Medyczna im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Wykazano, że dojrzałe plemniki zawierają zestaw mRNA, który może dostarczyć informacji o ekspresji genów zachodzącej podczas spermatogenezy. Istnieją również dowody, że niektóre cząsteczki mRNA mogą być wykorzystane podczas wczesnej embriogenezy. Najnowsze badania wskazują na udział chemokin w żeńskim i męskim przedziale rozrodczym. Odkryto, że chemokiny mogą odgrywać istotną funkcje w procesach owulacji, menstruacji, implantacji oraz chemotaksji plemników. Zaobserwowano, że chemokina RANTES (ang. Regulated upon Activation of Normal T-cells Expressed and Secreted) wiążąca się z receptorem CCR5 może powodować chemotaksję plemników człowieka. Celem pracy była analiza budowy transkryptu receptora chemokin CCR5 oraz określenie jego ilości w ludzkich plemnikach. Plemniki izolowano metodą “swim-up” z nasienia płodnych mężczyzn. Z krwi obwodowej tych samych dawców izolowano monojądrzaste komórki krwi (PBMC). Całkowity RNA izolowano z dojrzałych plemników oraz PMBC metodą Chomczyńskiego i Sacchi. RNA traktowano DNazą I i poddano działaniu odwrotnej transkryptazy. Uzyskany cDNA poddano analizie wykorzystującej ilościową reakcje łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (ang. Quantitative Real Time-PCR). Wykorzystując startery komplementarne do różnych egsonów transkryptu CCR5 wykazano, że mRNA uzyskany z ludzkich plemników jest krótszy od transkryptu wyizolowanego z leukocytów krwi obwodowej i składa się z 3 i 4 egsonu. Zidentyfikowana izoforma mRNA receptora chemokin CCR5 może reprezentować bardziej trwały transkrypt, który przypuszczalnie jest wykorzystany w biosyntezie tego białka podczas spermatogenezy lub wczesnej embriogenezy. Badania finansowane przez Akademię Medycznej im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu. (Badania własne 501-1-08-05 i 501-1-02-30). P145. Analiza profilu metylacji wybranych genów u chorych z rakiem pęcherza moczowego. Hubert Tomczyk (1), Maria Constantinou (1), Aleksandra Binka-Kowalska (1), Edyta Borkowska (1), Józef Matych (2), Agnieszka Nawrocka (3), Bogdan Kałużewski (1) (1) Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi (2) Oddział Urologii i Transplantacji Nerek Szpitala im. Pirogowa w Łodzi (3) Zakład Patomorfologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Wyciszanie genów poprzez metylację sekwencji promotorowych jest zjawiskiem powszechnym w chorobie nowotworowej i stanowi alternatywny mechanizm inaktywacji genów supresorowych, uzupełniając hipotezę dwóch uderzeń Knudson’a. Lista poznanych genów inaktywowanych w ten sposób szybko się wydłuża. Najciekawszy jest chyba jednak fakt, że każdy z badanych nowotworów wykazuje specyficzny dla siebie wzór metylacji, co otwiera możliwości nowych strategii diagnostycznych. Badanym przez nas nowotworem jest rak pęcherza moczowego, stanowiący szóstą co do częstości przyczynę zgonów na nowotwory złośliwe. Badania przeprowadzone zostały na DNA izolowanym z moczu. Opierając się na danych literaturowych zostały wyselekcjonowane geny, które przy użyciu metody MSP (methylation specyfic PCR) są poddane analizie, mającej na celu między innymi odpowiedź na pytanie: czy profil metylacyjny może stanowić czynnik rokowniczy i diagnostyczny? 120 Genetyka człowieka P146. Ludzka hybrydoma źródłem rekombinowanych fragmentów Fab specyficznych dla antygenów powierzchniowych plemnika. Dorota Fiszer, Natalia Rozwadowska, Tomasz Pawlukowiec, Beata Grygielska, Alina Domagała, Ewa Wiland, Maciej Kurpisz Instytut Genetyki Człowieka PAN, ul. Strzeszyńska 32, 60-479 Poznań Linie hybrydoma często są niestabilne, tracą zdolność produkowania przeciwciał i/lub wykazują niski poziom ich sekrecji. W tych przypadkach celowym jest zabezpieczenie (swoistości) łańcuchów ciężkich i lekkich produkowanych przez te linie, powodując ich ekspresję na powierzchni fagów i efektywną amplifikację w bakteriach. Celem pracy jest konstrukcja fagowej biblioteki fragmentów Fab skierowanym przeciw antygenom powierzchniowym plemnika. Źródło mRNA stanowiło siedem ludzkich linii hybrydoma wytwarzających przeciwciała przeciwplemnikowe, co zostało udokumentowanie w testach: ELISA, aglutynacji i testach funkcjonalnych. Po odwrotnej transkrypcji amplifikowano łańcuch ciężki (g) i łańcuchy lekkie (k i l), a następnie klonowano je do fagemidu pComb3HSS. Fragmenty Fab poddawane były ekspresji w bakteriach E. coli (XL-1 Blue) przy użyciu faga pomocniczego VCSM13. Selekcja specyficznych fragmentów Fab prowadzona była wobec całych komórek plemnikowych. Przy pomocy techniki ekspresji rekombinowanych fragmentów Fab na powierzchni faga, spodziewane jest wzbogacenie puli przeciwciał wytwarzanych przez linie hybrydoma, specyficznych dla antygenów powierzchniowych plemników. P147. Rola mitotycznej niestabilności w spermatogenezie. Ewa Wiland, Magdalena Zając, Maciej Kurpisz Instytut Genetyki Człowieka PAN, ul. Strzeszyńska 32, 60-479 Poznań U mężczyzn o prawidłowym kariotypie somatycznym aneuploidia chromosomów plemnikowych powstają najczęściej de novo w wyniku błędów w mejozie. U płodnych mężczyzn podział mejotyczny może przebiegać nieprawidłowo nawet w kilku procentach komórek, przy czym średni poziom disomii poszczególnych chromosomów wynosi od 0,01% do 0,3%, zaś średni poziom diploidii od 0,05% do 0,2%. Jednocześnie wiadomo, że istnieje duża zmienność osobnicza w częstości aneuploidii poszczególnych chromosomów w plemnikach, przy czym u części mężczyzn obserwuje się znacząco wyższą częstość aneuploidii niektórych chromosomów. Przyczyny tych indywidualnych różnic są nieznane. Wiadomo również, że w grupie mężczyzn z niepowodzeniami rozrodu (o prawidłowym kariotypie w limfocytach krwi obwodowej), średni poziom disomii i diploidii w plemnikach jest istotnie wyższy w porównaniu z grupą płodnych mężczyzn. Dotyczy to mężczyzn z różnymi typami niepłodności a także ojców dzieci z trisomią. Również w grupie mężczyzn z niepowodzeniami rozrodu występują istotne różnice osobnicze dotyczące częstości aneuploidii autosomów i chromosomów płciowych w plemnikach. Różnic tych nie udało się dotychczas skorelować z określonymi typami niepowodzeń rozrodu. Uważa się jednak, że wzrost częstości aneuploidii w plemnikach może być jednym z wykładników zaburzonego procesu spermatogenezy, stąd aberracjom chromosomowym w plemnikach mężczyzn o prawidłowym kariotypie somatycznym przypisuje się dużą rolę w etiologii niepowodzeń rozrodu. Celem prezentowanych badań była ocena występowania ewentualnych korelacji między podwyższonym poziomem aneuploidii w plemnikach i w komórkach somatycznych (limfocytach krwi obwodowej) u tego samego mężczyzny. Warunkiem zaobserwowania takiej korelacji była ocena poziomu aneuploidii w dużej liczbie komórek, tj. kilku tysiącach plemników i jąder interfazowych limfocytów. Ocenę poziomu aneuploidii prowadzono metodą FISH z zastosowaniem sond centromerowych i telomerowych dla chromosomów 7, 13, 15, 18, 21, X i Y. Badania prowadzono zarówno w grupie kontrolnej płodnych mężczyzn jak i w grupie mężczyzn z niepowodzeniami rozrodu różnego typu. Uzyskane dotychczas wyniki badań własnych, jak i nieliczne dane literaturowe sugerują, że istnieje istotna korelacja pomiędzy kontrolą mitozy w komórkach somatycznych a procesem różnicowania i proliferacji komórek w trakcie spermatogenezy. P148. Układ genów IL-1 – ilościowa analiza ekspresji w prawidłowej lub patologicznej ludzkiej gonadzie męskiej. Natalia Rozwadowska, Dorota Fiszer, Maciej Kurpisz Instytut Genetyki Człowieka PAN, ul. Strzeszyńska 32, 60-479 Poznań Spermatogeneza jest procesem, w którym spotykają się i współzawodniczą: proliferacja i apoptoza. Nieznaczne zachwianie proporcji pomiędzy nimi może prowadzić do patologii, jakimi są np. zaburzenia płodności (przy nadmiernej apoptozie) czy rozrosty nowotworowe przy zbyt dużej proliferacji. Układ genów IL-1 obejmuje geny biorące udział 121 Genetyka człowieka w obu tych procesach. Przy pomocy techniki PCR w czasie rzeczywistym oceniono ilościowo poziom ekspresji genów układu IL-1 w męskiej gonadzie prawidłowej z zachowaną spermatogenezą, w tkance nowotworowej oraz w próbkach z różnymi blokami dojrzewania komórek rozrodczych. Oceniono poziom transkrypcji dla genów: IL-1a (interleukina-1 alfa), IL-1b (interleukina-1 beta), IL-1RA (antagonista receptorowy interleukiny-1), IL-1RI (receptor I dla inetrleukiny-1), IL-1RII (receptor II dla interleukiny-1), IL-1RAcP (cząsteczka związana ze receptorem interleukiny-1), ICE (konwertaza-1), IL-18 (interleukina-18), IL-18Ra (łańcuch alfa receptora dla interleukiny-18) oraz IL-18Rb (łańcuch beta receptora dla interleukiny –18) w cDNA pochodzącym z następujących frakcji: komórki gametogeniczne, komórki interstycjalne, limfocyty krwi obwodowej. Następnie porównano poziomy ekspresji z tkanki zdrowej gonady do ekspresji tych samych genów w gonadzie z blokami dojrzewania oraz w tkance nowotworowej jądra. Dokładniejsze poznanie molekularnych podstaw tych zjawisk przybliża nas do poznania mechanizmu produkcji gamet oraz utworzenia unikatowego tolerogennego mikrośrodowiska niezbędnego do ich powstawania. Będzie to pomocne w dalszych działaniach terapeutycznych. 122 Genetyka zwierząt Ekspresja genów, mapy genomowe, polimorfizm genetyczny, ewolucja Komunikaty ustne: W63. Geny cech ilościowych (QTL) u zwierząt gospodarskich Jolanta Kurył Zakład Immunogenetyki Zwierząt, Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN, Jastrzębiec Streszczenie w suplemencie W64. Zastosowanie polimorfizmu markerów mikrosatelitarnych w kontroli genetycznej myszy szczepów wsobnych kongenicznie opornych utrzymywanych w CO-I. Marcin Choim (1), M. Gajewska (1, 2), E. Wirth-Dzięciołowska (1, 2) (1) Centrum Onkologii-Instytut, ul. Roentgena 5, Warszawa (2) Muzeum i Instytut Zoologii PAN, ul. Wilcza 64, Warszawa Kontrola genetyczna zwierząt laboratoryjnych ma na celu sprawdzanie modelu badawczego ze standardem. Systematycznie i rutynowo prowadzona analiza pozwala na wyeliminowanie błędnych wyników badań. W Zakładzie Genetyki i Hodowli Zwierząt Laboratoryjnych w Centrum Onkologii – Instytut, myszy szczepów kongenicznych opornych poddano kontroli genetycznej przy pomocy markerów mikrosatelitarnych. Badane szczepy kongeniczne różniły się fragmentem chromosomu zawierającym geny głównego kompleksu zgodności tkankowej (H-2). Celem pracy była ocena homozygotyczności myszy badanych szczepów, ocena zgodności tła genetycznego z genotypem szczepu C57BL10/W, zbadanie polimorfizmu genetycznego szczepów kongenicznych w obrębie kompleksu H2 oraz opracowanie panelu mikrosatelitarnego do monitoringu genetycznego myszy ze szczepów kongenicznych. Materiał genetyczny pochodził od myszy dziewięciu szczepów kongenicznie opornych; B10.A, B10.A(2R), B10.A(5R), B10.AKM, B10.BN, B10.BR, B10.P, B10.RBP, B10.S, oraz od myszy szczepu tła C57BL10/W, stosowanego jako kontroli. Ocenę polimorfizmu genetycznego prowadzono przy zastosowani reakcji PCR. Produkty amplifikacji rozdzielano elektroforetycznie na żelu agarozowym. Na podstawie uzyskanych wyników analizy opracowano panel kontrolny do oceny genetycznej myszy szczepów kongenicznych. Zawiera on markery z chromosomu 17, do kontroli genotypów w obrębie kompleksu H2, a także markery z pozostałych chromosomów do oceny zgodności genotypu ze szczepem tła. 123 Genetyka zwierząt W65. Polimorfizm rejonów kodujących i regulacyjnych genów MYOD1 (MYF3) i MYF5 świni. Paweł Urbański, Jolanta Kurył Zakład Immunogenetyki Zwierząt, Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN, Jastrzębiec Geny MYOD1 i MYF5 należą do rodziny genów MYOD. Produkty tych genów są czynnikami transkrypcyjnymi typu bHLH odpowiedzialnymi za prawidłowy przebieg procesu miogenezy oraz transkrypcji genów specyficznych dla mięśni szkieletowych. Białka MYOD1 i MYF 5 są niezbędne w kontroli proliferacji pierwotnych komórek mięśniowych w początkowych etapach miogenezy zarodkowej. Materiał doświadczalny stanowiło około 1000 zwierząt ras: pbz, wbp, duroc, hampshire, linia 990, linia PIC, Torhyb. Do identyfikacji polimorfizmu zastosowano metody: PCR –SSCP, sekwencjonowanie, PCR –RFLP. W obrębie genu MYOD1 zidentyfikowano jeden SNP w rejonie promotora (nie rozpoznawany przez żaden enzym restrykcyjny) oraz dwa SNPs w eksonie 1 rozpoznawane endonukleazą BssSI, natomiast w obrębie genu MYF5 zidentyfikowano trzy SNPs w rejonie promotorowym rozpoznawane enzymami AciI, FokI, HinPI i jeden SNP w 3 eksonie (mutacja nie rozpoznawana przez żaden enzym restrykcyjny). Dwie z mutacji znalezionych w eksonach powodują zamianę sekwencji aminokwasów (Leu – Pro) Częstości genotypów względem każdej z badanych mutacji różnią się w poszczególnych rasach zwierząt. Zostanie oceniony wpływ mutacji w rejonie 5’ flankującym genów na ich ekspresję.� W66. Analiza zależności pomiędzy różnymi wariantami genu ESR/PvuII a cechami nasienia knurów reprodukcyjnych. Marek Kmieć, Arkadiusz Terman Agricultural University of Szczecin, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Doktora Judyma 6, 71-466 Szczecin, Poland Prowadzone w ostatnich latach badania wskazują na możliwość wykorzystania niektórych genów jako markerów dla cech użytkowości rozrodczej u świń, co z kolei może zostać wykorzystane we wczesnej selekcji, która ma na celu zwiększenie skuteczności zapładniania loch, jak również liczby prosiąt w miocie. Na oba te parametry znaczny wpływ wywierają cechy nasienia knurów wykorzystanych do rozpłodu. Istotną rolę w procesach rozrodczych odgrywają między innymi estrogeny, które wpływają na zachowanie płciowe knurów oraz regulujące proces spermatogenezy. U świń, locus genu ESR znajduje się w chromosomie 1. Celem niniejszych badań było określenie częstości występowania genotypów i alleli genu ESR/PvuII u knurów użytkowanych w SHiUZ oraz ustalenie zależności pomiędzy określonymi genotypami a badanymi cechami ilościowymi i jakościowymi nasienia. Genotypy ESR oznaczano poprzez zastosowanie techniki PCR-RFLP. Amplifikowano fragment DNA o długości 120 par zasad, stosując specyficzne sekwencje starterowe. Produkt PCR trawiono 3 jednostkami endonukleazy PvuII przez 3 godziny w temperaturze 37oC i następnie elektroforetycznie rozdzielano w 2,5 % żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny a wyniki odczytywano w świetle UV. Analizę zależności pomiędzy genotypem ESR a badanymi cechami użytkowości rozpłodowej knurów przeprowadzono przy zastosowaniu analizy wariancji, wykorzystując pakiet statystyczny SAS. W analizowanym stadzie knurów stwierdzono występowanie dwóch alleli genu receptora estrogenowego: ESRC (0.8348) oraz ESRD (0.1652), jak również trzech genotypów: ESRCESRC (0.7296), ESRCESRD (0.2103) oraz ESRDESRD (0.0601). W przeprowadzonych badaniach wykazano istotne statystycznie (P≤0,01) zależności pomiędzy genotypami ESR dla wszystkich badanych cech nasienia knurów reprodukcyjnych. Otrzymane wyniki z przeprowadzonych badań sugerują możliwości wykorzystania istniejącego polimorfizmu genu ESR w doskonaleniu niektórych cech użytkowości rozpłodowej knurów.� W67. Zależność pomiędzy polimorfizmem w genie defenzyny. Katarzyna Wojdak-Maksymiec, Marek Kmieć Department of Genetics and Animal Breeding, Agricultural University of Szczecin, ul. Doktora Judyma 6, 71– 466 Szczecin, Poland Niespecyficzna antybiotyczna i cytotoksyczna aktywność defenzyny może być skierowana przeciwko bakteriom, wirusom oraz grzybom, także tym wywołujący zapalenia wymienia u krów mlecznych. Te właściwości decydują o możliwości wykorzystania defenzyny jako potencjalnego markera odporności (podatności) krów na mastitis. Badania naukowe potwierdzają tezę o wysokim polimorfizmie w genie defenzyny oraz o statystycznie istotnych związkach 124 Genetyka zwierząt pomiędzy wariantami defenzyny, a podatnością na zapalania wymienia i mlecznością krów. Badaniami objęto 184 krowy mleczne rasy jersey. Łącznie przeanalizowano zawartość komórek somatycznych w 2532 próbkach mleka, zbieranych podczas próbnych udojów. Od wszystkich krów pobrano krew obwodową a następnie wyizolowano DNA. Na uzyskanym DNA amplifikowano fragment genu DEF. Reakcję PCR przeprowadzono przy wykorzystaniu metodyki zaproponowanej przez Ryniewicz i wsp. Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych w genie defenzyny określono przy użyciu enzymu TaqI. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej. Określone zostały frekwencje genotypów defenzyny. Analiza statystyczna objęła również poszukiwania zależności pomiędzy polimorfizmem laktoferyny a ilością komórek somatycznych w mleku. Jako źródło zmienności uwzględniono ponadto takie cechy jak: rok badania, sezon, kolejność i stadium laktacji, a także wpływ ojca. Zawartość komórek somatycznych w mleku transformowano na skalę logarytmiczną (logarytm naturalny) w celu zrównoważenia rozkładu. Zidentyfikowano łącznie 12 różnych genotypów. Z największą częstością występował heterozygotyczny genotyp A1A2B1B2C1C2. Wpływ badanych genotypów na zawartość komórek somatycznych w mleku okazał się statystycznie wysoko istotny. Zaobserwowano także potwierdzoną statystycznie zależność pomiędzy zawartością komórek w mleku a takimi czynnikami jak ojciec, sezon i stadium laktacji oraz rok badania. Jedynie wpływ kolejnej laktacji okazał się statystycznie nieistotny W68. Wstępne badania QTL związanych z nieśnością kur przy dużym zagęszczeniu markerowymi loci w chromosomie 4. Małgorzata Korczak (1), Barbara Wardęcka (1), Grzegorz Zieba (2), Kazimierz Jaszczak (1). (1) Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt Polskiej Akademi Nauk w Jastrzębcu (2) Akademia Rolnicza w Lublinie, ul. Akademicka 13 Celem badań jest dokładne określenie w chromosomie czwartym rejonów w których znajdują się loci cech nieśności i jakości jaja poprzez analizę ich sprzężeń z gęsto rozmieszczonymi markerami mikrosatelitarnymi. Badania prowadzone są na wielopokoleniowej referencyjnej populacji kur powstałych ze skrzyżowania dwu ras zielononóżki kuropatwianej (Zk) i Rhode Island Red (RIR). Do badań wybrano z bazy danych Roslin Institute 25 sekwencji mikrosatelitarnych (ADL0241, ADL0288, LEI0100, MCW0251, MCW0005, ADL0246, MCW0085, ADL0266, LEI0144, MCW0284, LEI0076, LEI0081, ADL0331, ADL0317, ADL0203, MCW0295, LEI0073, LEI0063, LEI0078, LEI0122, MCW0129, ADL0255, ADL0194, ADL240, MCW122) znajdujących się w chromosomie 4. Amplifikację (PCR) poszczególnych mikrosatelitów przeprowadzono z użyciem starterów wyznakowanych flurescencyjnie (Cy-5). Produkty reakcji PCR poddawano elektroforezie w 6% żelu poliakrylamidowym przy użyciu automatycznego sekwenatora ALFexpress. Dotychczas przeprowadzono, przy pomocy programu Allele Links 1.01, analizę długości 19 sekwencji mikrosatelitarnych. Cztery spośród nich są nieprzydatne do dalszych analiz ze względu na swą homozygotyczność. Wśród 15 sekwencji mikrosatelitarnych przydatnych do dalszych analiz liczba występujących alleli dla badanych cech wynosi od 3 do 6, średnio 4 na jeden locus. Analiza 13 loci mikrosatelitarnych wykazała występowanie alleli charakterystycznych dla rasy zielononóżka kuropatwiana i Rhode Island Red. Wstępna analiza statystyczna przy użyciu programu QTL express i metody interwałowego mapowania wykazała obecność pięciu QTL sprzężonych z cechami nieśności (tempo nieśności hodowlanej, nieśność hodowlana, masa ciała, masa żółtka, masa białka) w chromosomie 4. W69. Wykorzystanie polimorfizmu sekwencji genu cytochromu b do rozpoznawania anonimowych śladów biologicznych oraz w ochronie przyrody. Beata Prusak (1), Tomasz Grzybowski (2), Jarosław Bednarek (2) (1) Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN, Jastrzębiec (2) Zakład Genetyki Molekularnej i Sądowej, Akademia Medyczna Bydgoszcz Na podstawie analizy polimorfizmu sekwencji genu cytochromu b mtDNA dokonano identyfikacji gatunkowej trzech anonimowych próbek biologicznych: plamy krwi, fragmentu tkanki mięśniowej egzotycznego gada oraz włosa znalezionego w ptasim gnieździe. Amplifikację analizowanego fragmentu genu prowadzono w termocyklerze GenAmp PCR System 9600 Thermal Cycler (AB). Oczyszczone produkty PCR (o długości ok. 300 pz) sekwencjonowano wykorzystując zestaw Big Dye Primer Cycle Sequencing RR Kit (ABI Prism) i rozdzielano na automatycznym skwenatorze ABI PISM 377. Anonimowe sekwencje „własne” wykorzystano do określenia gatunkowego pochodzenia śladów poprzez porównanie 125 Genetyka zwierząt z sekwencjami znanych gatunków, opublikowanymi w bazie GenBank. Dla sekwencji genu cytb zidentyfikowanej w DNA z plamy krwi znaleziono w bazie sekwencję łosia, podobną w 98% do sekwencji „własnej” Natomiast najbardziej podobną do sekwencji zidentyfikowanej w DNA z tkanki mięśniowej gada, była sekwencja pytona tygrysiego (podobieństwo 99%). Uzyskanie tak wysokich wartości podobieństwa pozwala przyjąć, iż analizowane anonimowe próbki pochodzą odpowiednio od łosia i pytona tygrysiego, a wystąpienie nieznacznych różnic w sekwencjach można wytłumaczyć istnieniem osobniczej zmienności w obrębie każdego z tych gatunków. Sekwencja genu cytb z mtDNA włosa znalezionego w ptasim gnieździe była identyczna z sekwencją kozy opublikowaną w GenBanku oraz z sekwencją kozy ze stada hodowlanego w Jastrzębcu. Można więc stwierdzić z prawdopodobieństwem tożsamym z pewnością iż jest to włos kozy. Wyniki wskazują, że analiza sekwencji genu cytb mtDNA może być przydatnym narzędziem w nadzorze nad produktami pochodzenia zwierzęcego oraz w logistyce z zakresu ochrony przyrody. W70. Zespół genów kodujących rRNA jako narzędzie w identyfikacji i ewolucji gatunków rodzaju Gyrodactylus. Marek S. Ziętara (1), Jaakko Lumme (2) (1) Stacja Biologiczna Uniwersytetu Gdańskiego, ul. Ornitologów 26, 80-680 Gdańsk (2) Instytut Biologii Uniwersytetu w Oulu, POB 3000, 90014 Finlandia Zespół genów kodujących rybosomalne RNA (rRNA) składa się z trzech odcinków kodujących podjednostki rRNA (18S, 5.8S i 28S) i czterech łączników, trzech podlegających transkrypcji (ETS, ITS1 i ITS2) i jednego (IGS) oddzielającego powtórzone zespoły od siebie. Poszczególne odcinki zespołu ewoluują w różnym tempie, co umożliwia często analizę porównawczą zarówno poniżej poziomu rodzaju jak i powyżej poziomu rodziny. Gatunki rodzaju Gyrodactylus (Plathyleminthes, Monogenea) są liczną grupą, bardzo trudną do identyfikacji ze względu na ich mikroskopijną wielkość i uproszczoną budowę ciała. Około 400 opisanych dotychczas gatunków stanowi mniej niż 2% ich przewidywanej ilości. Prawie wszystkie dotąd opisane gatunki są pasożytami ryb, a niektóre z nich groźnymi gatunkami patogenicznymi. Cechy taksonomiczne poszczególnych gatunków, ograniczające się przede wszystkim do drobnych różnic w budowie organu czepnego. Wykazują one dość wysoka zmienność osobnicza, co w dużym stopniu może utrudniać bezbłędną identyfikację poszczególnych osobników. Różnice w budowie narządu protonefrydialnego posłużyły do wydzielenia sześciu podrodzajów: G. (Gyrodactylus), G. (Mesonephrotus), G. (Metanephrotus), G. (Paranephrotus), G. (Neonephrotus) i G. (Limnonephrotus) i określenia powiązań filogenetycznych między nimi. � Dopiero wykorzystanie w ostatnich kilku latach sekwencji rDNA umożliwiło nie tylko bezbłędna identyfikację gatunków, ale stworzyło również nowe możliwości badania powiązań między poszczególnymi gatunkami i grupami gatunków. Okazało się ponadto, że sekwencje tego regionu umożliwiają śledzenie procesów radiacji gatunków Gyrodactylus po ostatnim zlodowaceniu. Choć analiza filogenetyczna oparta na sekwencjach różnych fragmentów zespołu genów rRNA wykazuje pewne niezgodności z klasyczną filogenezą opartą na budowie sytemu protonefrydialnego to nowe podejście wydaje się obiecujące. W71. Zależności ewolucyjne w obrębie heterochromatyny konstytutywnej i chromosomów B u 7 gatunków z rodziny psowatych (Canidae). Aldona Pieńkowska-Schelling (1) Mariola Zawada (2), Magdalena Przywecka (1), Claude Schelling (3) (1) Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza w Poznaniu (2) Instytut Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu (3) Department of Animal Science, ETH and UNI Zürich Badania przeprowadzono na następujących gatunkach psowatych: jenot (Nyctereutes procyonoides procyonoides), otocjon (Otocyon megalotis), wilk grzywiasty (Chrysocyon brachyurus), fenek (Fenecus zerda), lis polarny (Alopex lagopus), lis pospolity (Vulpes vulpes), pies (Canis familiaris). Celem pracy było: a) ustalenie prawdopodobnego udziału chromosomu B w zmianach ewolucyjnych kariotypów poszczególnych gatunków; b) określenie etiologii chromosomu B jenota euroazjatyckiego i heterochromatyny konstytutywnej lisa polarnego; c) zbadanie homologii pomiędzy materiałem genetycznym zawartym w chromosomach B, a ramionami heterochromatynowymi. Materiałem badawczym były chromosomy metafazowe z limfocytów krwi obwodowej 7 gatunków psowatych. Badanie prowadzono przy użyciu techniki FISH z biotynowanymi sondami uzyskanymi w wyniku mikrodysekcji i DOP-PCR chromosomów B jenota euroazjatyckiego i ramion heterochromatynowych lisa polarnego. Detekcję sond 126 Genetyka zwierząt przeprowadzono z użyciem systemu przeciwciał: awidyna-FITC i biotynowana anty-awidyna. Ustalono, że prawdopodobnie chromosomy B jenota są pochodnymi archaicznych chromosomów, z których wyewoluowały heterosomy. Stwierdzono, że istnieje częściowa homologia pomiędzy badanymi strukturami. Wykazano udział sekwencji zawartych w chromosomach B w ewolucji kariotypów poszczególnych gatunków. W72. Zwiększając efektywność mapowania genów. Maciej Szydłowski Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu Metody obliczeniowe oparte na liczbach losowych mogą zwiększyć szansę lokalizacji chromosomowej genów. Nie ma jednak efektywnych generatorów losowych działających poprawnie, niezależnie od stopnia złożoności rodowodu i typu markerów genetycznych. Zaproponowano generator hybrydowy, który potencjalnie łączy zalety dwóch znanych algorytmów bazujących na metodzie Monte Carlo Markov Chain. Jego aplikację zilustrowano na danych wysymulowanych dla prawdziwej czteropokoleniowej rodziny o złożonej strukturze. Metodę zastosowano do analizy genów identycznych przez pochodzenie (IBD sharing) oraz asocjacji typu allel-cecha (test HHRR). Wykazano, że algorytm zwiększa szansę lokalizacji chromosomowej genu odpowiedzialnego za monogenową chorobę recesywną. W73 Polimorfizm genu H-FABP i jego związek z cechami otłuszczenia świni. Agata Chmurzyńska, Marek Świtoński Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza, Poznań Transport kwasów tłuszczowych poprzez błony komórkowe oraz w obrębie cytoplazmy zachodzi m. in. z udziałem białek wiążących kwasy tłuszczowe (ang. fatty acid-binding protein –FABP). Białka te kodowane są przez 9 tkankowo specyficznych genów o identycznej budowie (4 eksony rozdzielone 3 intronami). Gen H-FABP podlega ekspresji w komórkach mięśnia sercowego i mięśniach szkieletowych. U świni zlokalizowany jest w chromosomie 6, w regionie, w którym wykazano istnienie QTL (ang. quantitative trait loci) dla cech otłuszczenia. Oceniano przydatność 3 polimorfizmów typu SNP (ang. single nucleotide polymorphism) genu H-FABP (jeden w regionie 5’ UTR, a dwa w intronie drugim) świni jako markerów dla cech otłuszczenia. Ponadto, poszukiwano nowych polimorfizmów w rejonie 5’ UTR tego genu. Badaniami objęto osobniki należące do dwóch ras (wielka biała polska i polska biała zwisłoucha) i jednej syntetycznej linii świń (990). Analiza statystyczna, w której uwzględniono również wpływ polimorfizmu C1843T genu RYR1, nie wykazała bezpośredniego wpływu analizowanych mutacji na cechy otłuszczenia świń. Poszukiwanie polimorfizmu techniką SSCP wykazało istnienie kilku wzorów prążkowych. Sekwencjonowanie ujawniło występowanie trzech nieznanych dotąd polimorfizmów typu SNP (C/T, T/G, C/G) w regionie promotorowym genu. Sekwencja z zaznaczonymi miejscami polimorficznymi została umieszczona w bazie GenBank. W74. Rekombinacja w DNA mitochondrialnym małży z rodzaju Mytilus. Artur Burzyński, Małgorzata Zbawicka, Roman Wenne Zakład Genetyki i Biotechnologii Morskiej, Instytut Oceanologii PAN w Sopocie Obowiązujący paradygmat zakłada, że DNA mitochondrialny jest w królestwie zwierząt dziedziczony wyłącznie w linii matki i nie podlega rekombinacji. Taki sposób dziedziczenia zapobiega rozprzestrzenianiu się defektywnych genomów mitochondrialnych poza potomstwo jednej samicy. Małże z rodzaju Mytilus charakteryzują się unikalnym sposobem dziedziczenia mtDNA. Oprócz klasycznych genomów dziedziczonych w linii matki (F) samce tych małży mają drugi genom mitochondrialny o znacznym stopniu dywergencji (M), który jest dziedziczony wyłącznie w linii męskiej (dziedziczenie podwójnie uniparentalne, DUI). Nasze badania rejonu kontrolnego mtDNA omułka bałtyckiego ujawniły obecność w tej populacji genomów będących produktami rekombinacji pomiędzy genomami F i M. 127 Genetyka zwierząt W75. Zróżnicowanie północnoeuropejskich populacji dorsza atlantyckiego (Gadus morhua, L.) na podstawie analizy układów heteroplazmatycznych mtDNA Agnieszka Kijewska (1), Barbara Wiśniewska-Wojtasik (2), Artur Burzyński (1), Roman Wenne (2, 3) (1) Zakład Genetyki i Biotechnologii Morskiej, Instytut Oceanologii PAN w Sopocie (2) The University of Hull, Department of Biological Sciences, Molecular Ecology and Fisheries Group, Hull HU6 7RX, UK (3) Katedra Genetyki, Uniwersytet Gdański, 80 – 822 Gdańsk W mitochondrialnym DNA region kontrolny (CR), zwany również regionem D-loop, podlega najszybszym zmianom. Długość tego odcinka DNA jest często zróżnicowana w obrębie gatunku ze względu na obecność powtarzających się sekwencji nukleotydów. U ryb powtórzenia te mają długość do kilku tysięcy par zasad. U dorsza atlantyckiego (Gadus morhua) mtDNA CR zawiera na końcu 5’ elementy repetytywne o długości 40 pz. Obserwowano maksymalnie osiem powtórzeń w danej sekwencji. U tego gatunku jest obserwowana ponadto heteroplazmia związana z występowaniem innej liczby powtórzeń w różnych kopiach mtDNA. Poszczególne osobniki charakteryzują się zmienną liczbą i układem wariantów wielkości. Przeprowadzono analizy odcinka regionu niekodującego, zawierającego powtórzenia sekwencji amplifikując odcinek 5’ mitochondrialnego CR metodą PCR. Na podstawie wyników uwidocznionych za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym zliczono częstotliwość występowania poszczególnych wariantów wielkości dla populacji dorsza z Morza Bałtyckiego, Morza Północnego i Morza Barentsa (Wyspa Niedźwiedzia, Sorkapp i trawers Hornsundu). Opracowana metoda różnicowania oparta na analizie frekwencji wariantów wielości jest wystarczająco czuła by rozróżnić populacje lokalizowane nawet w niewielkiej odległości od siebie (Morze Barentsa). Analiza statystyczna wykazała, że populacja „hornsundzka” jest istotnie różna od pozostałych z Morza Barentsa, które nie różnią się od siebie. Różnice pomiędzy każdą z populacji z Morza Barentsa a północnomorską i bałtycką były również statystycznie istotne. Uzyskane wyniki są zgodne z publikowanymi wcześniej oraz z przeprowadzoną dla prób z Morza Barentsa analizą izoenzymatyczną. Wyniki analizy uzyskane dla prób z Morza Barentsa sugerują ponadto, że u wybrzeży południowo – zachodniego Spitsbergenu znajduje się granica zasięgu wschodniej populacji dorsza atlantyckiego. W76. Profil ekspresji genów w komórkach nowotworowych mysiego czerniaka B16(F10) hodowanych in vitro w warunkach hipoksji. Aleksander Sochanik, Joanna Jazowiecka, Magdalena Olbryt Zakład Biologii Molekularnej, Centrum Onkologii-Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie, Oddział w Gliwicach Słabe utlenowanie guzów jest wynikiem zaburzeń przepływu krwi lub ograniczonej dyfuzji tlenu. Hipoksja towarzyszy guzom litym (90%)>1mm3. Hipoksja wpływa na wzrost i proliferację guza, niestabilność genetyczną, angiogenezę i apoptozę. Transdukcja sygnału indukowanego hipoksją wpływa na różne czynniki transkrypcyjne. Niedotlenowanie guzów jest zawadą w radioterapii zmniejszając utrwalanie uszkodzeń DNA wywołanych przez promieniowanie jonizujące. Hipoksja powoduje też oporność na chemioterapeutyki zmniejszając tempo podziałów komórki (chemioterapeutyki działają skuteczniej na komórki szybko dzielące się) i modyfikując naczynia kapilarne w pobliżu guza. � Porównano profil ekspresji genów w komórkach mysiego czerniaka B16(F10) hodowanych z dodatkiem chlorku kobaltu, w komorze Billupsa-Rothenberga (1% O2) lub w inkubatorze hipoksyjnym (1% tlenu). Izolowano całkowity RNA, syntezowano cDNA i cRNA. Ekspresję analizowano za pomocą mikromacierzy. Analizę danych przeprowadzono metodą opartą na rozkładzie macierzy względem wartości szczególnych (SVD). Klasteryzacja dla genów wybranych metodą SVD uwidoczniła bardzo wyraźny podział próbek doświadczalnych i kontrolnych. Chlorek kobaltu (chemiczna mimikra hipoksji) powoduje indukcję ekspresji odmiennego zbioru genów niż zastosowanie obniżonego stężenia tlenu. Eksperyment gwałtownie zmienia profil ekspresji genów przy obniżeniu stężenia tlenu. Wśród genów różnicujących dominują geny o wyraźnym wzroście ekspresji (chlorek kobaltu –80/109, komora Billupsa –86/97, inkubator hipoksyjny – 60/85). We wszystkich 3 metodach zanotowano silny wzrost ekspresji dwu genów: białka indukowanego interferonem i białka wiążącego galaktozę; przy obniżeniu stężenia tlenu – białka wiążącego selen i prekursora peptydu związanego z wydalaniem sodu. Przy obniżeniu stężenia tlenu silnie wzrasta ekspresja winkuliny, czynnika wzrostowego tkanki łącznej, VEGF oraz Cyr61. 128 Genetyka zwierząt Komunikaty plakatowe: P149. Ocena ekspresji genów kaspaz w hipokampie w eksperymentalnym zwierzęcym modelu ludzkiej padaczki płata skroniowego. Małgorzata Grabek-Gawłowicz (1), K. Borowicz (2), B. Marzec (1), J. Gawłowicz (1), S. Czuczwar (2), J. Wojcierowski (1) (1) Zakład Genetyki Medycznej Akademii Medycznej w Lublinie (2) Zakład Patofizjologii Akademii Medycznej w Lublinie Kindling polega na wytwarzaniu eksperymentalngo modelu padaczki poprzez powtarzalną stymulację elektryczną mózgu, co powoduje indukcję aktywności drgawkowej. Kindling z ciała migdałowatego u szczura jest uważany za model ludzkiej padaczki płata skroniowego. Relacje miedzy mechanizmem kindlingu a zmianami patomorfologicznymi w ognisku padaczkorodnym pozostają niewyjaśnione. Nasilenie ich występuje m. in. w hipokampie. Wydaje się, że pewną rolę odgrywa tu apoptoza. Apoptoza u ssaków jest regulowana przez białka rodziny nbcl-2, białko Apaf1 i grupę kaspaz. Celem naszej pracy było badnie ekspresji genów kaspaz ( cas-2, cas-3) w hipokampie szczurów, u których stosowano kindling. Materiałem badań były szczury podzielone na następujace grupy:1/ kontrola – zwierzęta z elektrodą implantowaną do ciała migdałowatego, 2/zwierzęta po kindlingu nie wykazujące zmian w EEG; bez drgawek, 3/ zwierzęta po kindlingu z typowymi zmianami w EEG; bez drgawek, 4/ zwierzęta po kindlingu ze zmianami w EEG; z drgawkami behawioralnymi. W każdej grupie badano 6 zwierząt. Z hipokampów szczurów izolowano RNA. Ekspresję genów badano metodą RPA (RNA-se Protection Assay). Uzyskane wyniki nie wykazywały istotności statystycznej. W naszej ocenie przyczyną tego stanu może być bardzo mała liczba komórek ulegających apoptozie w stosunku do liczby komórek otaczających. P150. Nowy SNP/EcoRI w genie bydlęcej katepsyny B. Stanisław Józef Rosochacki, E. Juszczuk-Kubiak., T. Sakowski Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt, Polska Akademia Nauk, Jastrzębiec,05-552 Wólka Kosowska Katepsyny – lizosomalne kwaśne proteinazy uczestniczą w procesie degradacji białek w organizmach żywych jak i w stanie post-mortem. Są to enzymy o masie od 20-40 kDa. Należa do nich – wykazujące aktywność endopeptydaz katepsyny D i L oraz aktywność mieszaną – katepsyny B i H. Katepsyna D jest proteinazą asparaginową, podczas gdy katepsyny B, H, L są katepsynami siarczkowymi. Uczestniczą one w degradowaniu miozyny i aktyny oraz innych białek mięśniowych, a także mają wpływ na kruchość mięsa w stanie post-mortem. Gen katepsyby B leży na chromosomie 8 i składa się z 10 eksonów i dłuższych 9 intronów. Wykazano powiązanie genotypów z aktywnością endogennych enzymów proteolitycznych, a kontrolując genetykę populacji bydła rzeźnego, można lepiej poznać mechanizmy dziedziczenia kruchości wołowiny. Badanie markerów genetycznych powiązanych z proteolizą białka w mięśniach przeprowadzono na bydle czarno-białym pochodzącym z fermy hodowlanej w Jastrzębcu. Wykonano oznaczenie polimorfizmu wybranych genów stosując techniki SSCP, RFLP i sekwencjonowania. Polimorfizm genu katepsyny B (CTSB) bydlęcej określono przy użyciu enzymów EcoRI (na 65 sztukach) i NlaIII (na 31 osobnikach) i wykazano genotypy AB (59) i AA (6) oraz AB (4), AA (26) i BB (1) dla odpowiednich enzymów. Frekwencja alleli wynosiła: A=0.94 i B=0.06 dla EcoRI i dla NlaIII A=0.89 i B=0.11. Nie stwierdzono polimorfizmu dla tego genu przy pomocy enzymów MboII, AluI i NcoI. Analiza sekwencji potwierdziła wystapienie tranzycji C/T przy pomocy enzymu EcoRI w pozycji 390 pz oraz transwersji G/T w pozycji 187 pz (GenBank AF230197) rozpoznawanej przez enzym NlaIII. Wykryte mutacje wystepują w sekwencji niekodującej –w intronie 9. Zależność tego polimorfizmu a cechami fizyko-chemicznymi oraz sensorycznymi są w trakcie obliczeń statystycznych. 129 Genetyka zwierząt P151. Polimorfizm genów GH i GHR u bydła rasy jersey i limousine. Arkadiusz Michalak, Jolanta Komisarek, Zbigniew Dorynek Katedra Hodowli Bydła, Akademia Rolnicza im. A. Cieszkowskiego w Poznaniu, ul. Wojska Polskiego 71 A, 60-625 Poznań Celem badań było określenie polimorfizmu genów hormonu wzrostu (GH) oraz jego receptora (GHR) w populacji bydła rasy jersey oraz limousine. W locus hormonu wzrostu analizowanopolimorfizm C/G w eksonie V, powodujący zastąpienie leucyny przez walinę w pozycji 127 łańcucha polipeptydowego (L127V). Mutacja F279Y w genie receptora hormonu wzrostu polegała na substytucji T/A w eksonie VIII i prowadziła do zamiany fenyloalaniny na tyrozynę w kodowanym białku. Badania prowadzono w populacji obejmującej 99 krów rasy jersey oraz 34 krowy rasy limousine. Genotypy GH i GHR identyfikowano metodą PCR-RFLP. Produkt amplifikacji genu GH o wielkości 404 par zasad (pz), po trawieniu enzymem restrykcyjnym AluI widoczny był na żelu w postaci 3 prążków o długości 36, 132 i 236 pz dla wariantu V kodującego walinę, lub 4 prążków o długości 36, 51, 132 i 185 pz dla wariantu L kodującego leucynę. Allele F i Y genu GHR, identyfikowane przy pomocy enzymu restrykcyjnego VspI, charakteryzowały się wielkością prążków odpowiednio ok. 180pz i ok. 160 i 20 pz. Uzyskane frekwencje genotypów przedstawiały się następująco: Locus GH: LL – 0.28 (jersey), 0.22 (limousine); LV – 0.39 (jersey), 0.43 (limousine); VV – 0.33 (jersey), 0.35 (limousine) Locus GHR: FF – 0.06 (jersey), 0.38 (limousine); FY – 0.43 (jersey), 0.06 (limousine); YY – 0.51 (jersey), 0.56 (limousine) P152. Genetyczne relacje miedzy bydłem Rathi (Bos indicus) a bydłem polskim czerwonym oraz białogrzbietym określone na podstawie analizy sekwencji genu Grzegorz Grzybowski (1), Beata Prusak (1), Chandra Pareek (2) (1) Zakład Immunogenetyki Zwierząt, Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN, Jastrzębiec (2) Katedra Genetyki Zwierząt, Wydział Bioinżynierii Zwierząt, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie Według klasyfikacji Linneusza, bydło garbate (zebu) oraz bezgarbne są odrębnymi gatunkami: odpowiednio – Bos indicus oraz Bos taurus. Trafność takiego podziału jest przedmiotem wielu kontrowersji. Krzyżówki zebu z taurine są płodne i dlatego Bos taurus i Bos indicus są przez niektórych uważane za geograficzne warianty jednego gatunku. Inni badacze argumentują, że duże różnice w eksterierze, a także różnice w polimorfizmie i częstości występowania pewnych izoenzymów, są dowodem na odrębną pozycję systematyczną tych typów. Celem badań było przeprowadzenie porównań filogenetycznych między Bos taurus (bydło polskie czerwone oraz bydło białogrzbiete) a Bos indicus (bydło Rathi/zebu z Radżastanu w Indiach), opartych na polimorfizmie sekwencji genu cytb mtDNA. Modelem i ewolucyjnym tłem przy określaniu różnic między Bos taurus i Bos indicus były sekwencje gatunków: Bison bonasus – żubr europejski i Bison bison – bizon amerykański, które uważane są za gatunki bardzo pokrewne (lub podgatunki w obrębie rodzaju Bison). mtDNA ekstrahowano z sierści (zebu, żubry, bizony) oraz z komórek krwi (pc, białogrzbiety). Produkty PCR o długości ok. 300 pz sekwerncjonowano z wykorzystaniem znakowanych (starterów)a następnie rozdzielano na sekwenatorze ABI PISM 377. Najmniejsza liczba podstawień w sekwencji wynosiła 14 (bizony ↔ zebu, pc, białogrzbiety), a największa 22 (bizony ↔ żubry). Sekwencje genu cytb mtDNA zidentyfikowane u Rathi oraz u bydła polskiego czerwonego i białogrzbietów z hodowli zachowawczej były identyczne. W światowej bazie GenBank znaleziono sekwencje w 100% homologiczne z sekwencją bydła Rathi, pc i białogrzbietów, zidentyfikowane u innych ras bydła Bos taurus oraz Bos indicus. Uzyskane wyniki wskazują, że założycielskie linie żeńskie dla „gatunku” Bos taurus i Bos indicus są identyczne. P153. Struktura genetyczna wybranych ras owiec na podstwie polimorfizmu białek surowicy krwi. Barbara Bojczuk (1), Tadeusz Rychlik (2) (1) Akademia Świętokrzyska, Instytut Biologii, Zakład Genetyki, ul. Świętokrzyska 15, 25 – 406 Kielce (2) Instytut Zootechniki, Zakład Immuno-Cytogenetyki Zwierząt, 32 – 083 Balice koło Krakowa, ul. Krakowska Celem pracy było wykazanie różnic w częstści występowania allei i genotypów transferyny, albuminy i prealbuminy w surowicy krwi owiec. Badaniami objęto 759 zwierząt rasy wrzosówka oraz mieszańce polskiej owcy nizinnej z mouton charolaise i mieszańce merynosa polskiego z mouton charolaise. Polimorficzne formy albuminy i prealbuminy oznaczano za pomocą elektroforezy w żelu skrobiowym, natomiast polimorfizm transeryny w żelu poliakrylamidowym. 130 Genetyka zwierząt Przeprowadzone badania w trzech stadach owiec wykazały duże róznice wewnątrz i międzyrasowe w częstości alleli jak i genotypów. W analizowanym materiale wykryto 15 alleli transferyny warunkujących 55 genotypów, 2 allele albuminy warunkujące 2 genotypy oraz 3 allele prealbuminy warunkujące 6 genotypów. Spośród badanych stad owiec wrzosówka okazała się najbardziej zróżnicowaną genetycznie. Stwierdzono u niej 44 genotypy transferyny. Genotyp TF C1 D1 (!6,3%) oraz allele transferyny C1 (0,3089) i D1 (0,1789) występowały z najwyższą częstością. Polimorfizm transferyny stwierdzono jedynie u wrzosówki, pozostałe dwa badane stada były monomorficzne. Między badanymi stadami owiec stwierdzono istotne różnice w częstości występowania alleli i genotypów transferyny, albuminy i prealbuminy P154. Autoradiograficzna identyfikacja amplikonów genów kodujących glikoproteiny ciążowe PAG (Pregnancy-Associated Glycoprotein) w genomach taksonów: Carnivora, Cetacea oraz Aves. Grzegorz Panasiewicz (1), Marta Majewska (1), Krzysztof Kuber (1), Ewa Chmielnicka (1), Kazimierz Zalewski (2), Bożena Szafrańska (1) (1) Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie, Wydział Biologii, Katedra Fizjologii Zwierząt (2) Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie, Wydział Biologii, Katedra Fizjologii i Biotechnologii Roślin Kosmówkową lokalizację mRNA genów PAG zidentyfikowano na matrycach komplementarnego DNA (cDNA) transkryptomów różnych łożyskowców (Placentalia: Artiodactyla, Perissodactyla, Carnivora, Rodentia). Dotychczas, sekwencje cDNA genów PAG sklonowano (GenBank) jedynie u świń, bydła, owiec, kóz, klaczy, zebry, kotki, myszy oraz jelenia. Celem badań była identyfikacja amplikonów PAG na matrycach genomowego DNA (gDNA) wyizolowanych z leukocytów (LgDNA), cebulek włosowych (HRgDNA), lub archiwalnych tkanek kostnych (ARgDNA). Metodą PCR amplifikowano gDNA taksonów drapieżnych (Carnivora): tchórza (Mustela putorius, Mustelidae-łasicowate), jenota (Nyctereutes procyonoides, Canidae-psowate); ssaków morskich: walenia (Cetacea); lub ptaków (Aves): gęsi (Anser anser) oraz kur (Gallus gallus domesticus). Autoradiograficzną identyfikację amplikonów PAG metodą Southern wykonano z sondami wyprodukowanymi na matrycach cDNA genów klonowanych u świń: pPAG5 oraz pPAG8 (ORF: 404-1014 bp), które wyizolowano z trofoblastycznej biblioteki genowej, a następnie amplifikowano w plazmidach transfekowanych bakterii E. coli szczepu XL1-Blue. Po raz pierwszy wykazano amplikony genów PAG-podobnych w genomach taksonów: Mustelidae, Canidae, Cetacea oraz Aves, u których nie sklonowano dotychczas cDNA genów PAG. Identyfikacja PCR/Southern wykazała różne genotypy PAG u poszczególnych osobników. Zidentyfikowano liczne amplikony PAG na różnych matrycach genomowych: HRgDNA drapieżnych (tchórza: 490, 690 bp; jenota: dodatkowo 860 bp), LgDNA ptaków (gęsi: 329, 436, 544 bp; kur: 329, 436 i 865 bp) oraz ARgDNA walenia (570 i 760 bp). Uzyskane wyniki identyfikacji Southern amplikonów PAG-podobnych powinny ułatwić klonowanie łożyskowego cDNA genów PAG, natomiast zidentyfikowane sekwencje genów PAG mogą być wykorzystane do przygotowania selekcyjnych testów genetycznych, pozwalających na przewidywanie zdolności reprodukcyjnych młodych osobników w oparciu o identyfikację genotypu PAG na różnorodnych matrycach gDNA. *PBZKBN084/P06/02/3.4 oraz UWM020600.805� P155. Polimorfizm genu alfa-laktoalbuminy u krów naturalnie zakażonych wirusem białaczki bydła. Barbara Bojarojć-Nosowicz, Emilia Bongarc, Joanna Małolepszy, Ewa Kaczmarczyk Katedra Genetyki Zwierząt, Wydział Bioinżynierii Zwierząt, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie Gen alfa-laktoalbuminy (LALBA) wykazuje polimorfizm w części regulacyjnej genu. Wykazuje ponadto znaczną homologię budowy z genem lizozymu. Sądzi się, że białkowy produkt genu LALBA uczestniczy w procesach immunologicznych, lecz jego rola nie została dotychczas dokładnie poznana. Celem podjętych badań było określenie zależności między polimorfizmem genu LALBA a podatnością krów na zakażenie naturalne wirusem białaczki bydła (BLV). Badaniami objęto krowy w wieku 3-9 lat z jednego stada. Zakażenie BLV diagnozowano stosując serologiczny test ELISA oraz molekularny test PCR. Polimorfizm genu LALBA identyfikowano w poz. –1689 regionu regulatorowego genu stosując test PCR-RFLP. Amplifikowano fragment genu o długości 483 pz, a uzyskany produkt poddawano trawieniu enzymem restrykcyjnym SduI. Uzyskane wyniki wskazują na częstsze występowanie zakażenia BLV u krów o genotypach BB i AB. 131 Genetyka zwierząt P156. Polimorfizm restrykcyjny genu prolaktyny (PRL/RsaI) w stadzie krów o mlecznym kierunku użytkowania. Marek Kmieć (1), Zbigniew Sobek (2), Joanna Strzałka (1) (1) Agricultural University of Szczecin, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Doktora Judyma 6, 71-466 Szczecin, Poland (2) Department of Genetics and Animal Breeding, August Cieszkowski Agricultural University of Poznań, ul. Wołyńska 33, 60-637 Poznań, Poland Prolaktyna jest jednym z najbardziej wszechstronnych hormonów w organizmie i jako hormon białkowy wydzielana jest przez część gruczołową przysadki mózgowej. Pełni ona w organizmach ssaków wiele funkcji biologicznych wpływając m.in. na regulację funkcji reprodukcyjnych, odpornościowych, wzrost i różnicowanie komórek, jak również pełni kluczową rolę w zapoczątkowaniu i podtrzymywaniu laktacji. Odpowiada również za syntezę białek, laktozy i tłuszczów mleka oraz działa na pęcherzyki mlekotwórcze wzmagając syntezę oraz sekrecję białek mleka. Gen prolaktyny ze względu na fizjologiczne funkcje jego produktu białkowego jest potencjalnym „genem kandydatem” dla cech ilościowych i został on zlokalizowany w chromosomie 23. Wykazano już w nim istnienie kilku miejsc polimorficznych, wśród których mutacja punktowa A→G w III eksonie rozpoznawana przez endonukleazę RsaI, która nie powoduje zmiany w produkcie białkowym. Badania przeprowadzono na 186 krowach rasy jersey utrzymywanych w jednym stadzie na terenie Wielkopolski. Przy użyciu metody PCR-RFLP analizowano polimorfizm fragmentu genu o długości 156 pz z miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny RsaI rozpoznającym sekwencje GT↓AC. Analiza restrykcyjna pozwoliła na wykazanie obecności dwóch alleli: PRLA – brak miejsca restrykcyjnego dla RsaI (156 pz) występującego z częstością 0,3090 oraz allelu PRLB z miejscem restrykcji dla RsaI (82 i 74 pz) którego frekwencja wynosiła 0,6910. Stwierdzono występowanie trzech genotypów na trzy możliwe: PRLAPRLA (0,0910), PRLAPRLB (0,4360) oraz PRLBPRLB (0,4730). Przeprowadzona analiza zależności pomiędzy polimorfizmem genu prolaktyny PRL/RsaI a niektórymi cechami użytkowości mlecznej w trzech pierwszych laktacjach, analizowanego stada krów rasy jersey wykazała istotne statystycznie różnice pomiędzy zwierzętami o różnych genotypach PRL/RsaI w wydajności tłuszczu i białka w I laktacji. P157. Kształtowanie się niektórych cech użytkowości mlecznej w stadzie krów czerwonobiałych z różnymi wariantami genu somatoliberyny (GHRH/HaeIII). Marek Kmieć (1), Inga Kowalewska (1), Hanna Kulig (1), Adam Lepczyński (1), Heliodor Wierzbicki (2), Witold Pietrzyk (1) (1) Agricultural University of Szczecin, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Doktora Judyma 6, 71-466 Szczecin, Poland (2) Agricultural University of Wrocław, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Kożuchowska 7, 51-631 Wrocław, Poland Somatoliberyna (GHRH) jest hormonem przysadkowym, który stymuluje syntezę i wydzielanie przysadkowego hormonu wzrostu (GH). Powoduje ona wzrost stężenia endogennego hormonu wzrostu surowicy krwi, zwiększając średnie oraz pulsacyjne uwalnianie somatotropiny, przez co wpływa na zwiększenie produkcyjności krów, stymulując wytwarzanie mleka podobnie jak bST. Gen somatoliberyny (GHRH) zlokalizowano u bydła w chromosomie 13 i wchodzi on w skład grupy syntenicznej U11. Chcąc doskonalić wydajność i jakość mleka, które są cechami ilościowymi, należy skupić się na identyfikacji loci genów odpowiedzialnych za dziedziczenie tych cech tzw. QTL (quantitative trait loci) bądź genów z nimi sprzężonych tzw. markerów genetycznych. Badania zależności między QTL lub markerami genetycznymi a cechami użytkowości mlecznej prowadzone są na szeroką skalę. Celem przeprowadzonych badań była detekcja mutacji w genie somatoliberyny oraz ustalenie zależności pomiędzy polimorficznymi formami genu GHRH/HaeIII, a cechami użytkowości mlecznej. Badaniami objęto stado 721 krów czerwono-białych z różnym udziałem genów bydła holsztyńsko-fryzyjskiego. Genotypy GHRH oznaczano poprzez zastosowanie techniki PCR-RFLP. Amplifikowano fragment DNA o długości 297 par zasad, stosując specyficzne sekwencje starterowe. Analiza restrykcyjna prowadzona przy użyciu endonukleazy HaeIII wykazała istnienie polimorfizmu w wybranym fragmencie genu. Stwierdzono następujące częstości genotypów: GHRHAGHRHA – 0,0957; GHRHAGHRHB – 0,3689 oraz GHRHBGHRHB – 0,5354. Częstość alleli wynosiła dla allelu GHRHA – 0,2802 i dla allelu GHRH B – 0,7198. Otrzymane wyniki z przeprowadzonej analizy zależności dla trzech kolejnych laktacji pomiędzy genotypami GHRH/HaeIII a badanymi cechami użytkowości mlecznej (wydajność mleka, tłuszczu i białka; zawartość 132 Genetyka zwierząt tłuszczu i białka; suma wydajności tłuszczu i białka) sugerują możliwości wykorzystania istniejącego polimorfizmu genu GHRH w doskonaleniu niektórych cech użytkowości mlecznej krów czerwono-białych. P158. Polimorfizm genu hormonu wzrostu (GH/AluI & GH/MspI) w stadzie krów o mlecznym kierunku użytkowania. Marek Kmieć (1), Inga Kowalewska (1), Witold Pietrzyk (1), Heliodor Wierzbicki (2) (1) Agricultural University of Szczecin, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Doktora Judyma 6, 71-466 Szczecin, Poland (2) Agricultural University of Wrocław, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Kożuchowska 7, 51-631 Wrocław, Poland Hormon wzrostu jest białkiem produkowanym w przednim płacie przysadki mózgowej. Jest hormonem typu anabolicznego, dlatego stymuluje tempo podziałów komórkowych i jest odpowiedzialny za proces różnicowania się niektórych typów komórek. Wykazano doświadczalnie jego wpływ na proces produkcji mleka u bydła i przyrosty masy ciała u zwierząt hodowlanych. Poznane funkcje fizjologiczne i biochemiczne hormonu wzrostu spowodowały, że gen hormonu wzrostu został wytypowany jako jeden z „genów kandydatów” typowanych jako przypuszczalne loci dla cech ilościowych u bydła. Celem obecnie prowadzonych badań nad wpływem polimorfizmu na cechy użytkowe bydła jest zidentyfikowanie polimorfizmu na poziomie DNA, który powstał w wyniku mutacji punktowych w obrębie genu, bowiem mutacje w częściach strukturalnych oraz regulatorowych genów mogą wpływać na poziom cech ilościowych. W przeprowadzonych badaniach wykorzystano technikę PCR-RFLP do określenia wpływu polimorfizmu w V eksonie (AluI) oraz w III intronie (MspI) genu hormonu wzrostu w stadzie liczącym 724 krowy rasy czerwono-białej hodowanych na terenie Opolszczyzny na wybrane cechy użytkowości mlecznej. W analizowanym stadzie wykazano występowanie dwóch alleli dla polimorfizmu GH/AluI: GHL (0,9040) oraz GHV (0,0960) oraz występowanie dwóch genotypów na trzy możliwe GHLGHL występującego z częstością 0,8080 oraz genotypu GHLGHV występującego z częstością 0,1920. Genotypu GHVGHV w badanym stadzie krów mlecznych nie stwierdzono. Natomiast analiza polimorfizmu GH/MspI wykazała obecność dwóch alleli: GH+, który występował z częstością 0,8174 oraz GH– występującego z frekwencja 0,1826. Frekwencja genotypu GH+GH+ wynosiła 0,6460, genotypu GH+GH– – 0,3430, natomiast genotypu GH-GH– – 0,0110. Analiza statystyczna wykazała zróżnicowanie cech użytkowych w badanym stadzie krów mlecznych w zależności tylko od polimorfizmu GH/MspI w genie hormonu wzrostu. P159. Wpływ polimorfizmu LEP/HphI na wybrane cechy użytkowości mlecznej stada krów rasy nizinnej czerwono-białej. Marek Kmieć, Hanna Kulig, Witold Pietrzyk Agricultural University of Szczecin, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Doktora Judyma 6, 71-466 Szczecin, Poland Chcąc doskonalić wydajność i jakość mleka, które są cechami ilościowymi, należy skupić się na identyfikacji loci genów odpowiedzialnych za dziedziczenie tych cech tzw. QTL (quantitative trait loci) bądź genów z nimi sprzężonych tzw. markerów genetycznych. Badania zależności między QTL lub markerami genetycznymi a cechami użytkowości mlecznej prowadzone są na szeroką skalę. Szczególnym zainteresowaniem cieszą się dwie grupy cech, mianowicie wydajność mleka, białka i tłuszczu (kg) oraz zawartość białka i tłuszczu w mleku (%). Polimorfizm sekwencji DNA może wpływać na zróżnicowanie cech ilościowych, a to skłania do poszukiwania zależności miedzy polimorfizmem PCR-RFLP a cechami użytkowymi. Celem przeprowadzonych badań była detekcja mutacji w genie leptyny oraz ustalenie średniej wydajności mleka, tłuszczu, białka i procentowej zawartości tłuszczu i białka w mleku krów z różnymi wariantami genetycznymi genu leptyny. Badaniami objęto stado 197 krów nizinnych czerwono-białych. Miejsce polimorficzne zlokalizowane w drugim eksonie genu, w którym zachodzi tranzycja C→T, a na poziomie białka następuje substytucja Ala/Val, wykrywano endonukleazą HphI po zastosowaniu specyficznych sekwencji starterowych. Analiza restrykcyjna wykazała istnienie polimorfizmu w wybranym fragmencie genu wielkości 331 pz. Stwierdzono następujące częstości genotypów: LEPALEPA – 0,5888; LEPALEPB – 0,3756 oraz LEPBLEPB – 0,0356. Częstość alleli wynosiła dla allelu LEPA 0,7766 i dla allelu LEPB – 0,2234. Statystyczna analiza zależności przeprowadzona dla trzech kolejnych laktacji (średnia wydajność mleka w laktacji wynosiła: dla I laktacji – 6322kg; II laktacji – 7352 kg oraz w III laktacji – 7940 kg) wykazała istotne (P ≤ 0,05) zależności pomiędzy genotypami LEP/HphI a badanymi cechami użytkowości mlecznej krów czerwono-białych hodowanych w jednym z ośrodków hodowlanych na terenie Opolszczyzny. 133 Genetyka zwierząt P160. Polimorfizm w genie CYP21/HaeIII stada loch rasy wielka biała polska. Marek Kmieć, Arkadiusz Terman Agricultural University of Szczecin, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Doktora Judyma 6, 71-466 Szczecin, Poland Postęp w badaniach genomu świni umożliwił identyfikację polimorficznych loci pojedynczych genów kontrolujących cechy reprodukcyjne, o których wiadomo, że mają albo mogą mieć wpływ na poziom reprodukcji tych zwierząt. Gen 21– (hydroksylazy) steroidowej zlokalizowany jest w 7 chromosomie świni w segmencie DNA pomiędzy regionami SLA klasy I i SLA klasy II. Składa się on z około 3050 par zasad, zawiera 10 eksonów oddzielonych przez introny i koduje białko o 492 aminokwasach. Celem przeprowadzonych badań była detekcja mutacji w genie CYP21 oraz ustalenie zależności między poszczególnymi wariantami genetycznymi CYP21 a wybranymi cechami użytkowości rozrodczej loch. Badania przeprowadzono w stadzie świń rasy wielkiej białej polskiej składającym się z 248 loch. Metodą PCR-RFLP określono częstość występowania mutacji w genie CYP21 przy użyciu enzymu restrykcyjnego HaeIII. Zastosowano następujący profil termiczny reakcji PCR: denaturacja wstępna 95şC – 3 min, następnie 30 cykli – (95şC/1 min, 72şC/1 min) wydłużanie końcowe 72şC/5 min. Produkt PCR wielkości 1271 pz trawiono 5 jednostkami endonukleazy HaeIII. Rozdział fragmentów restrykcyjnych DNA prowadzono w 2% żelach agarozowych. Zidentyfikowano dwa allele genu CYP21: allel CYP21A– 448 pz i allel CYP21B – 350 i 98 pz. Alel CYP21A występował z częstością 0,2742, natomiast allel CYP21B z częstością 0,7258. W badanym stadzie świń genotyp CYP21ACYP21A występował z częstością 0,0242, CYP21ACYP21B z częstością 0,5000 natomiast genotyp CYP21B CYP21B z częstością równą 0,4758. Prowadzona analiza zależności między wariantami genetycznymi genu CYP21/HaeIII, a cechami charakteryzującymi użytkowość rozrodczą loch (liczba prosiąt urodzonych żywych i martwych oraz liczba prosiąt odchowanych jak i odsetkiem upadków w okresie odchowu) wykazała szereg różnic pomiędzy lochami z różnymi genotypami CYP P161. Polimorfizm genu hormonu wzrostu (GH/ApaI & GH/CfoI) w stadzie świn rasy wielkiej białej polskiej (WBP). Marek Kmieć, Inga Kowalewska, Filip Napierała Agricultural University of Szczecin, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Doktora Judyma 6, 71-466 Szczecin, Poland Wyniki projektu badania genomu świni (PigMap) umożliwiają rozszerzenie badań nad poszukiwaniem kolejnych polimorficznych loci pojedynczych genów, których produkty białkowe wpływają na kształtowanie się cech ilościowych – QTL (quantitative trait locus). W ostatnich latach pojawiły się doniesienia o bezpośrednim oddziaływaniu GH na męskie i żeńskie procesy rozrodcze. Celem przeprowadzonych badań była detekcja mutacji w genie GH oraz ustalenie zależności między poszczególnymi wariantami genetycznymi genu hormonu wzrostu (GH/ApaI & GH/CfoI) a badanymi cechami reprodukcyjnymi stada świń (liczba prosiąt żywo i martwo urodzonych w I, II, III, IV i dalszych miotach loch, liczba prosiąt odsadzonych, wiek loch w dniu oproszenia). Badania przeprowadzono w stadzie 227 loch rasy wbp. Polimorfizm genu GH określoną metodą PCR-RFLP. W wyniku zastosowania specyficznych sekwencji starterowych uzyskiwano produkt wielkości 605 pz, który poddawany był działaniu dwóch endonukleaz – ApaI oraz CfoI. Dla polimorfizmu GH/ApaI zidentyfikowano dwa allele: GHA (0,4955) i GHB (0,5045), które kontrolowały występowanie trzech genotypów: GHAGHA (0,1810), GHAGHB (0,6290) oraz genotypu GHBGHB (0,1900). Obliczone frekwencje genotypów oraz frekwencje genotypów homozygotycznych istotnie (P ≤ 0,01) odbiegały od frekwencji przewidywanych dla populacji w stanie równowagi genetycznej. Analizując polimorfizm GH/CfoI wykazano obecność czterech alleli: C1 (0,0903), C2 (0,0529), C3 (0,0661) oraz allelu C4 (0,7907), które kontrolowały występowanie pięciu genotypów: C1C3 – 0,0040; C1C4 – 0,1760; C2C4 – 0,1060; C3C4 – 0,1280 oraz genotypu C4C4 – 0,5860. Obliczone frekwencje genotypów oraz frekwencje genotypów homozygotycznych nie odbiegały istotnie od frekwencji przewidywanych dla populacji w stanie równowagi genetycznej. Uzyskane wyniki z przeprowadzonej analizy zależności wskazują na możliwości wykorzystania polimorfizmu GH/ApaI i GH/CfoI w doskonaleniu cech użytkowości rozrodczej świń. 134 Genetyka zwierząt P162. Polimorfizm w genie leptyny w powiązaniu z ilością komórek somatycznych i dzienną wydajnością mleka u bydła mlecznego. Hanna Kulig, Marek Kmieć, Katarzyna Wojdak-Maksymiec, Inga Kowalewska, Arkadiusz Terman Department of Genetics and Animal Breeding, Agricultural University of Szczecin, ul. Doktora Judyma 6, 71– 466 Szczecin, Poland Sugeruje się, że gen leptyny może być ważnym markerem dla cech użytkowych bydła. Leptyna jest hormonem polipeptydowym o masie cząsteczkowej 16 kDa, produkowanym głównie przez komórki tłuszczowe. Mniejsze ilości leptyny są także syntetyzowane w łożysku i gruczole mlekowym w czasie laktacji. Bierze ona udział w regulacji pobierania pokarmu i wydatkowania energii. Ponadto wpływa na reprodukcję oraz działanie układu wewnątrzwydzielniczego i odpornościowego. Podjęte badania miały na celu ustalenie czy istnieją zależności między genotypami leptyny (LEP/HphI) a zawartością komórek somatycznych i dzienną wydajnością mleka u bydła o mlecznym kierunku użytkowania. Badaniami objęto 124 krowy rasy czarno-białej z różnym udziałem genów bydła hf utrzymywanych w jednym stadzie na terenie Pomorza. Oznaczanie genotypów przeprowadzono przy użyciu metody PCR-RFLP. Amplifikowano fragment genu leptyny o długości 331 par zasad zlokalizowany w trzecim (drugim ulegającym translacji) eksonie. Częstość występowania genotypów i alleli LEP/HphI była następująca: AA – 0,605, AB – 0,363, BB – 0,032, A – 0,786, B – 0,214. Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w zawartości komórek somatycznych w mleku pomiędzy krowami o różnych genotypach. Osobniki te różniły się natomiast statystycznie istotnie (P≤0,01) w zakresie dziennej wydajności mleka. Najwyższe wartości tej cechy osiągały krowy z genotypem AA. Analiza uzyskanych wyników wskazuje na możliwość wykorzystania polimorfizmu LEP/HphI w doskonaleniu dziennej wydajności mleka. Doskonaląc tę cechę, należałoby preferować krowy z genotypem LEP/HphI AA. Kontynuowanie badań w tym zakresie pozwoli zweryfikować otrzymane wyniki przed ich ewentualnym wykorzystaniem w programach selekcji bydła mlecznego. P163. Porównanie metod izolacji DNA z archiwalnych łusek troci (Salmo trutta). Aleksandra Benedycka, Robert Szymańczak, Jerzy Sell Katedra Genetyki i Cytologii, Uniwersytet Gdański, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk Gromadzone systematycznie od ponad wieku łuski ryb z rodzaju Salmo można znaleźć w wielu instytutach rybactwa na całym świecie. Zbiory te stały się nieocenionym źródłem DNA, umożliwiając badania zmian zróżnicowania genetycznego populacji tych ryb w czasie. Pozyskiwanie i analizy DNA pochodzącego z muzealnych zbiorów łusek ryb napotykają na szereg problemów technicznych i metodycznych. Na przykładzie gatunku Salmo trutta autorzy przedstawiają sposoby rozwiązania tych trudności oraz wykorzystania otrzymanych wyników w zakresie genetyki populacyjnej ryb. P164. Wpływ polimorfizmu w rejonie promotorowym genu STAT5a na ekspresję genu w wątrobie u bydła i wiązanie czynnika transkrypcyjnego HNF3. Krzysztof Flisikowski, Rafał Radosław Starzyński, Lech Zwierzchowski Zakład Biologii Molekularnej, Instytut Genetyki i Hodowli Zwierzat, Polska Akademia Nauk, Jastrzębiec, 05-552 Wólka Kosowska Czynnik transkrypcyjny STAT5a należy do rodziny przekaźników sygnałów i aktywatorów transkrypcji. Pośredniczy w aktywacji przez prolaktynę genów białek mleka oraz w aktywacji genów regulowanych przez hormon wzrostu (GH). W wyniku aktywacji receptora prolaktyny lub GH na powierzchni komórki przez odpowiedni ligand dochodzi do uaktywnienia cytoplazmatycznego czynnika STAT5, który migruje do jądra komórkowego i łącząc się z sekwencją określaną mianem GAS γ-interferon activated sequence) w promotorach genów docelowych powoduje aktywację transkrypcji genu. Różne formy polimorficzne czynnika STAT5a mogą wykazywać różne powinowactwo do genów białek mleka powodując różnice ich ekspresji, co może mieć wpływ na wydajność mleczną, skład mleka lub tempo wzrostu. Dlatego geny STAT5 są oczywistymi kandydatami na markery cech ilościowych u zwierząt gospodarskich. Przy wykorzystaniu techniki PCR-HD i sekwencjonowania zidentyfikowaliśmy nowy polimorfizm w pozycji –488 pz (substytucja A/G) w promotorze genu STAT5a bydła. W miejscu tym zlokalizowane jest miejsce dla przyłączania się czynnika transkrypcyjnego HNF-3, dlatego też mutacja może mieć wpływ na ekspresję genu STAT5a. Używając RT-PCR, Real-Time PCR i Western blotting, stwierdziliśmy statystycznie istotnie wyższa ekspresję genu STAT5A w wątrobach pobranych od zwierząt o genotypie AA niż u tych o genotypie GG. Dodatkowo, przeprowadzając analizę 135 Genetyka zwierząt EMSA stwierdziliśmy, że tranzycja A→G w pozycji –488 pz zwiększa wiązanie sondy (zawierającej miejsce przyłączanie dla czynnika transkrypcyjnego HNF-3) do białek jądrowych wyizolowanych z bydlęcej wątroby. Nasze wyniki sugerują regulatorowe znaczenie tego miejsca dla działania czynnika STAT5A. P165. Analiza preferencji w składzie nukleotydowym genu cytochromu b mtDNA u kręgowców. Beata Prusak (1), Tomasz Grzybowski (2) (1) Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN, Jastrzębiec (2) Zakład Genetyki Molekularnej i Sądowej, Akademia Medyczna Bydgoszcz Cytochrom b jest centralnym ogniwem III kompleksu oksydacyjnofosforylacyjnego i jako jedyne białko tego kompleksu kodowane jest przez gen umiejscowiony w genomie mitochondrialnym. Białko to odgrywa kluczową rolę w procesie oddychania komórkowego. W związku z występowaniem specyficznych mutacji w genie cytochromu b u ludzi i zwierząt, rozpoznano szereg dysfunkcji mitochondrialnych, zwłaszcza miopatii. Celem przeprowadzonych badań była analiza polimorfizmu sekwencji genu cytochromu b u 14 gatunków kręgowców pod kątem określenia występowania preferencji w składzie nukleotydowym, co mogłoby być miernikiem konserwatywności sekwencji genu i sprawności biologicznej białka. Zidentyfikowane sekwencje nukleotydowe przetwarzano na odpowiadające im sekwencje aminokwasowe wykorzystując program BioEdit Sequence Alingment Editor. Wykazano, że w poszczególnych pozycjach występują charakterystyczne preferencje w składzie kodonów (określane jako codon bias), które są najsilniejsze dla trzeciej pozycji. Ponadto u większości badanych gatunków występowała w nici lekkiej znaczna przewaga adeniny nad cytozyną, a gatunki z rzędu parzystokopytnych charakteryzowały się znaczną przewagą puryn. Większość podstawień występujących w sekwencjach aminokwasowych dotyczyła aminokwasów hydrofobowych. Region obejmujący fragment centrum Qo oraz charakterystyczne dla cytochromu b pozycje histydyny (nr 82 i nr 96) będące ligandami hemu, były u wszystkich wysoce konserwatywne (100 %). Wyniki wskazują, że polimorfizm sekwencji genu cytb mtDNA jest znaczny, lecz zmiany te mają charakter podstawień synonimowych. Analiza różnic występujących w sekwencji nukleotydowej u różnych grup systematycznych jest więc dobrym modelem przy dokonywaniu porównań filogenetycznych. Natomiast ogromna konserwatywność sekwencji białka cytochromu b jest dogodnym narzędziem do diagnozowania dysfunkcji w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym. P166. Warianty alleliczne histonu H1.z różnią się w C-końcowych rejonach cząsteczek. Andrzej Kowalski, Jan Pałyga, Ewa Górnicka-Michalska Zakład Genetyki, Instytut Biologii, Akademia Świętokrzyska, Kielce Różnorodność histonów H1 warunkują warianty niealleliczne, które niejednokrotnie wykazują charakter polimorficzny. We wszystkich zbadanych dotychczas przypadkach formy alleliczne odróżnia występowanie zmiennych fragmentów w domenach N– lub C-końcowych ich cząsteczek. Histony H1.z erytrocytów kaczki pekińskiej (Pałyga i wsp., 1993) i piżmowej (Kowalski i wsp., 2004) są białkami polimorficznymi. W populacjach obu gatunków kaczki wykryto dwie izoformy H1.z1 i H1.z2, które w dwuwymiarowym żelu poliakryloamidowym różniły się ruchliwością elektroforetyczną, wykazując jednocześnie charakterystyczne dla danego gatunku położenie względem najbliżej wędrującego podtypu H1.a. Do specyficznego trawienia polimorficznych form H1.z zastosowano N-bromoimid kwasu bursztynowego (NBS), który rozkłada cząsteczkę histonu H1 przy pojedynczej reszcie tyrozyny. W żelu poliakryloamidowym zawierającym sodowy dodecylosiarczan (SDS), porównano mapy polipeptydowe otrzymane w wyniku cięcia NBS-em histonów H1.z1 i H1.z2 kaczki piżmowej i pekińskiej. Różnice w ruchliwości elektroforetycznej C-peptydów otrzymanych z izoform H1.z1 i H1. z2 kaczki piżmowej przypominały wzory elektroforetyczne C-peptydów uzyskanych pod wpływem działania NBS-u na histony H1.z1 i H1.z2 kaczki pekińskiej (Pałyga i wsp., 1993). Analizy przeprowadzone z użyciem NBS-u wskazują, że zmiany w składzie aminokwasowym, warunkujące występowanie odmian allelicznych histonów H1.z obu badanych gatunków kaczki, lokalizują się w części C-końcowej cząsteczki. Pałyga, J., Górnicka-Michalska, E., Kowalski, A. (1993) Genetic polymorphism of histone H1.z in duck erythrocytes. Biochem. J. 294, 859-863 Kowalski, A., Pałyga, J., Górnicka-Michalska, E. (2004) Identification of histone H1.z components in a Muscovy duck (Cairina moschata L.) population. Comp. Biochem. Physiol. Part B 137, 151-157 136 Genetyka zwierząt P167. Specjacja wewnątrzjeziorna na przykładzie endemicznych równonogów (Isopoda) z reliktowego Jeziora Ochrydzkiego. Tadeusz Sywula, Jerzy Sell, Adrianna Kozera, Marta Budny, Karolina Nowopolska, Lucyna Pobłocka Katedra Genetyki i Cytologii, Uniwersytet Gdański, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk Jezioro Ochrydzkie znajdujące się na granicy Macedonii i Albanii i otoczone wysokimi łańcuchami górskimi, zajmuje unikalną pozycję wśród europejskich jezior. Jest to duże (powierzchnia 358.176 m2), głębokie (średnia głębokość wynosi 163,71 m), oligotroficzne, reliktowe jezioro bogate w endemiczną faunę, która przetrwała tutaj od trzeciorzędu, stanowiąc obecnie doskonały materiał do badań nad procesami specjacji wewnątrzjeziornej. Jezioro Ochrydzkie zamieszkują cztery gatunki ośliczek należące do rodzaju Asellus: A. remyi Monod (1932), A. arnautovici Remy (1932), A. gjorgievici Karaman (1932), i A. aqaticus Linneusz (1758). Pierwsze trzy są endemiczne i należą do podrodzaju Proasellus, a A. aquaticus należy do podrodzaju nominatywnego. Każdy z trzech endemicznych gatunków jest reprezentowany przez dwie lub trzy formy. Tak więc A. gjorgjevici posiada dwie formy (gjorgjevici i litoralis), A. remyi trzy formy (remyi, acutangulus, nudus), A. aranautovici dwie (aranautovici, elongatus). Dla porównania na obszarze Polski występują tylko dwa gatunki rodzaju Asellus, nie zróżnicowane na formy. Badania enzymogenetyczne ujawniły istotne statystycznie różnice we frekwencjach alleli między formami morfologicznymi poszczególnych gatunków, zasiedlającymi strefy jeziora o odmiennych warunkach środowiskowych, do poziomu alleli prywatnych włącznie. Co więcej, zróżnicowanie genetyczne zaobserwowano także między populacjami formy ze źródeł i sublitoralu A. remyi var. remyi ze źródeł i sublitoralu. Przyczyn stwierdzonego zróżnicowania genetycznego badanych form można upatrywać w procesach specjacyjnych o podłożu ekologicznym. P168. Czy endemiczne ośliczki z Jeziora Ochrydzkiego stanowią grupę monofiletyczną? Adrianna Kozera, Anna Wysocka Uniwersytet Gdański, Katedra Genetyki i Cytologii, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk Jezioro Ochrydzkie (powierzchnia 358.176 m2) usytuowane na granicy dwóch państw: Macedonii i Albanii i otoczone wysokimi łańcuchami górskimi zajmuje unikalną pozycję wśród europejskich jezior. Jest to głębokie (średnia głębokość wynosi 163,71 m), oligotroficzne, reliktowe jezioro bogate w endemiczną faunę, która przetrwała tutaj od trzeciorzędu, stanowiąc obecnie doskonały materiał do badań nad procesami specjacji wewnątrzjeziornej. Jezioro Ochrydzkie zamieszkują cztery gatunki ośliczek należące do rodzaju Asellus. Wśród nich wyróżniamy trzy endemiczne gatunki zaliczane do podrodzaju Proasellus, z których każdy jest reprezentowany przez dwie lub trzy formy. Tak więc A. remyi Monod (1932) posiada trzy formy (remyi, acutangulus, nudus), A. arnautovici Remy (1932) dwie (aranutovici, elongatus), A. gjorgievici Karaman (1932) dwie (gjorgjevici i litoralis). Czwartym gatunkiem obserwowanym w jeziorze jest szeroko rozpowszechniony w Europie A. aqaticus Linneusz (1758), należący do podrodzaju nominatywnego. Celem badań jest ustalenie relacji filogenetycznych pomiędzy wymienionymi gatunkami z podrodzaju Proasellus przy A. (Asellus) aquaticus jako grupie zewnętrznej na podstawie analizy sekwencji genu COI mtDNA i 16SrDNA. Wstępne analizy filogenetyczne wskazują na prawdopodobną polifiletyczność grupy endemicznych gatunków ośliczek z Jeziora Ochrydzkiego. Na szczególną uwagę zasługują bliższe związki A. arnautovici var. elongatus z A. gjorgjevici niż z formą nominatywną A. arnautovici var. arnautovici. determinują selekcjonowaną cechę aktywności w otwartym polu. P169. Badanie ekspresji genów receptora gonadoliberyny, podjednostki β lutropiny oraz genu receptora progesteronu w przysadce mózgowej i podwzgórzu szczura. Bartosz Kempisty, Katarzyna Mel, Wiesław H. Trzeciak Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej Akademii Medycznej im. K. Marcinkowskiego, ul. Święcickiego 6, 60-781 Poznań Zespół policystycznych jajników (PCOS) jest złożonym schorzeniem ednokrynologicznym występującym u kobiet w wieku rozrodczym. Do najważniejszych objawów klinicznych należą podwyższony poziom lutropiny (LH), hiperandrogenizm oraz hiperinsulinemia. Dużą rolę w patogenezie PCOS odgrywa układ podwzgórzowo-przysadkowy, 137 Genetyka zwierząt aktywujący syntezę androgenów poprzez stymulujący wpływ LH na komórki osłonki pęcherzyków.Celem pracy było zbadanie ekspresji genów GnRHR, LHβ oraz PR w przysadce mózgowej i podwzgórzu szczura w warunkach in vivo po iniekcji insuliny oraz in vitro po inkubacji z GnRH i progesteronem. Materiał do badań stanowiły samice szczurów szczepu Wistar w wieku około 120 dni. W doświadczeniu in vivo szczury poddawano domięśniowej iniekcji insuliną w dawce 4 jednostek/100 g m.c. Po 12 godz. zwierzęta dekapitowano, po czym pobierano przysadkę mózgową oraz podwzgórze.W doświadczeniu in vitro hodowano komórki przedniego płata przysadki mózgowej do osiągnięcia monowarstwy ciągłej. Komórki inkubowano przez 24 godz. z GnRH (50 lub 100 pmol/ml) oraz progesteronem (50 lub 100 pmol/ml). Z podwzgórza i przysadki mózgowej, jak również z inkubowanych komórek wyizolowano RNA, a PoliA+ RNA przepisywano odwrotnie (RT-PCR). cDNA odpowiadające GnRHR, LHb oraz PR amplifikowano przy użyciu specyficznych starterów. Poziomu ekspresji genów oszacowano densytometrycznie wykorzystując program LabImage 2.7 Demo. Wykazano: stymulujące działanie GnRH na ekspresję LHβ, hamujący wpływ progesteronu na ekspresję LHβ w przysadce mózgowej oraz zbliżony poziom ekspresji PR w przysadce mózgowej i podwzgórzu. Wykazano stymulujące działanie insuliny na poziom ekspresji GnRHR w przysadce mózgowej. Ponadto stwierdzono, że insulina działa hamująco na ekspresję PR na poziomie przysadki. Znacznie słabszy jest hamujący wpływ insuliny na ekspresję PR na poziomie podwzgórza.. Uzyskane wyniki pozwalają przypuszczać, że zwiększenie ekspresji GnRHR pod wpływem insuliny może powodować zwiększenie wydzielania GnRH przez komórki podwzgórza. GnRH z kolei pobudza ekspresję genu LHβ Z drugiej zaś strony insulina blokuje ekspresję PR, a więc mogłaby osłabiać efekt hamowania wydzielania LH przez komórki przedniego płata przysadki mózgowej. P170. Struktura genów czynników transkrypcyjnych CREB i CEBPα świni, zaangażowanych w adipogenezę. Agata Chmurzyńska, Marek Świtoński Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza, Poznań Adipogeneza jest wieloetapowym procesem różnicowania komórek, rozumianym jako zmiana ekspresji genów powodująca przejście komórki od stanu multipotentnego do końcowego fenotypu dojrzałych adipocytów. Na adipogenezę wpływa łączne oddziaływanie wielu czynników, w tym hormonów, czynników wzrostowych, cytokin, prostaglandyn, składników macierzy wewnątrzkomórkowej, a także kilku rodzin czynników transkrypcyjnych. Za kluczowe, spośród czynników transkrypcyjnych, uważa się przede wszystkim białka (ang. CCAAT/enhancer-binding protein), PPARγ (ang. peroxisome proliferator-activated receptor), a być może również CREB (ang. cAMP response element binding protein).Gen C/EBPα zbudowany jest z jednego eksonu, natomiast CREB składa się z 11 eksonów, które w wyniku alternatywnego splicingu tworzą odmienne formy białka. Celem badań było poszukiwanie polimorfizmu w obrębie części kodującej genów CREB i C/EBPα świni. Analizą objęto zwierzęta następujących ras: wielka biała polska, polska biała zwisłoucha, duroc, hampshire, pietrain, złotnicka biała, złotnicka pstra, puławska, wietnamska oraz jedną syntetyczną linię świń, a także dzika. Poszukiwanie polimorfizmu wykonywano techniką SSCP, w różnych warunkach temperaturowych oraz w żelach z dodatkiem lub bez dodatku glicerolu. Przeanalizowano dotychczas siedem eksonów genu CREB i w żadnym z nich nie znaleziono wariantów allelicznych. Ponadto, badano dwa fragmenty DNA tworzące 3’-końcową część genu C/EBPα. Również w tym przypadku nie znaleziono żadnego polimorfizmu. Analizowane fragmenty DNA sekwencjonowano, a otrzymane sekwencje nukleotydowe porównywano z ich odpowiednikami u człowieka. P171. Porównawcza lokalizacja chromosomowa ośmiu genów w genomie czterech gatunków z rodziny Canidae. I. Szczerbal (1), J. Klukowska (2), A.Piasecka-Wengi (3), C. Schelling (3), A. Gmur (2), G. Dolf (2), M. Świtoński (1) (1) Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza im. A.Cieszkowskiego w Poznaniu (2) Uniwersytet w Bernie (Szwajcaria) (3) Szwajcarski Federalny Instytut Technologiczny w Zurychu Badaniami objęto cztery gatunki z rodziny psowatych (Canidae): psa (Canis familiaris), lisa pospolitego (Vulpes vulpes),lisa polarnego (Alopex lagopus) i jenota chińskiego (Nyctereutes procyonoides procyonides). Wykorzystując ludzkie startery dla genów: ABCA4, ESR2, LEP, INSL3, HBB, TPH, ATPA2 i PAX3 przeszukiwano genomową bibliotekę psa, sklonowaną w wektorach BAC-owych. W wyselekcjonowanych klonach poza sekwencjami charakterystycznymi dla wybranych genów zidentyfikowano również sekwencje mikrosatelitarne. Sondy użyto w eksperymentach FISH, na preparatach cytogenetycznych poddanych barwieniu prążkami Q. Lokalizacja chromosomowa wykorzystanych 138 Genetyka zwierząt sond była zgodna z wcześniejszymi wynikami uzyskanymi przez innych autorów za pomocą techniki „malowania chromosomów”. Porównawcza analiza położenia wybranych markerów w chromosomach czterech gatunków psowatych wskazała na wystąpienie, w ewolucji kariotypów tych gatunków, inwersji paracentrycznej fragmentu chromosomowego, w którym zlokalizowany jest gen ATPA2.Wykonane badania istotnie zwiększają nasycenie cytogenetycznej mapy genomu lisów i jenota, a także psa. P172. Polimorfizm w promotorze genu leptyny bydła oraz jego wpływ na wiązanie czynnika transkrypcyjnego Sp1. Tatiana Adamowicz (1), Krzysztof Flisikowski (2) Rafał Radosław Starzyński (2), Lech Zwierzchowski (2), Marek Świtoński (1) (1) Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli ZwierzątAkademia Rolnicza w Poznaniu (2) Zakład Biologii Molekularnej, Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN w Jastrzębcu Leptyna (LEP) jest białkiem wydzielanym głównie przez komórki tłuszczowe, wpływającym na proces pobierania pokarmu, metabolizm, cechy reprodukcyjne oraz system odpornościowy ssaków. Do tej pory wskazano na istnienie licznych związków pomiędzy polimorfizmem tego genu i cechami produkcyjnymi bydła (wydajność mleczna, cechy reprodukcyjne oraz otłuszczenie). W obrębie promotora leptyny zidentyfikowano aż 18 miejsc polimorficznych typu SNP (single nucleotide polymorphism) oraz dwa typu InDel (insertion/deletion). W pozycji –105 występuje miejsce polimorficzne C/G w sekwencji przyłączania czynnika transkrypcyjnego Sp1. Celem badań było poszukiwanie nowych mutacji w promotorze genu leptyny bydła oraz ocena wpływu substytucji C/G w pozycji 105 pz na wiązanie białek jądrowych. Do badań wykorzystano panel rasowy (HF, Limousine, Piemontese, Hereford, Simental, Charolaise, Angus, Białogrzbietka) obejmujący 200 osobników. Analizowano dwa fragmenty (-186 pz do +28 pz oraz –944 pz do –594 pz) promotora genu leptyny, techniką SSCP oraz HD. Zidentyfikowano trzy znane SNP (pozycje –170, –147 oraz –105). Nie wykryto natomiast nowych miejsc polimorficznych. Analizę wiązania białek jądrowych, wyizolowanych z wątroby, tkanki tłuszczowej, przysadki i mięśni zwierząt rasy HF, z dwiema sondami DNA, różniącymi się jednym nukleotydem C lub G w pozycji –105 genu leptyny, przeprowadzano stosując technikę EMSA (electrophoretic mobility shift assay). Sondy molekularne, o długości 20 pz, znakowano radioaktywnie [32P]ATP. Wykazano, że transwersja C/Gpozycji –105 pz wyraźnie obniżała wiązanie białek jądrowych, przypuszczalnie czynnika transkrypcyjnego SP1. Uzyskane wyniki wskazują, iż analizowany rejon promotorowy może odgrywać istotną rolę w ekspresji genu leptyny u bydła. P173. Polimorfizm mikrosatelitarnych sekwencji DNA u jelenia szlachetnego (Cervus elaphus). Andrzej Jacek Rutkowski, Maciej Żurkowski, Chandra Shekhar Pareek Katedra Owczarstwa, Łowiectwa i Hodowli Kóz, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski, Olsztyn 10-718 Przebadana zostanie homologia 95 bydlęcych markerów mikrosatelitanych u jelenia szlachetnego. Bydlęce markery STR zostaną zoptymalizowane na genomowym DNA jelenia szlachetnego. Systematyczna optymalizacja zostanie przeprowadzona początkowo przy użyciu polimerazy DNA (Dyna II), a nastepnie przy użyciu polimerazy Dynazyme EXT przy różnej koncentracji MgCl2 oraz DMSO. W naszej prezentacji przedstawiona zostanie frekwencja alleli zoptymalizowanych markerów mikrosatelitarnych, stopień ich heterozygotyczności oraz Polimorphism information content(PIC), w dwóch różnych populacjach mazurskiego jelenia szlachetnego (n=100). P174. Ilościowa analiza ekspresji genu leptyny (LEP) w tkance tłuszczowej świni. Zofia Madeja, Dorota Lechniak Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza w Poznaniu im. A. Cieszkowskiego, ul. Wołyńska 33, 60-277 Poznań We współczesnej hodowli zwierząt gospodarskich główny nacisk kładziony jest na poszukiwanie tzw. genów głównych (QTL) wywierających duże efekty na cechy użytkowe zwierząt. Geny leptyny (LEP) oraz jej receptora (LEPR) znajdują się w kręgu zainteresowania jako potencjalne loci QTL wpływające na otłuszczenie tuszy. U dorosłych osobników leptyna jest czynnikiem bezpośrednio odpowiedzialnym za regulację wydatków energetycznych oraz procesy związane z pobieraniem pokarmu. Przedmiotem niniejszych badań jest analiza ekspresji genu LEP w tkance tłuszczowej świni w celu określenia ilościowej zmienności mRNA w zależności od lokalizacji tkanki oraz od rasy zwierząt. 139 Genetyka zwierząt Badaniami objęto 30 osobników, 10 rasy polskiej białej zwisłouchej (pbz), 10 rasy wielkiej białej polskiej (wbp) oraz 10 należących do linii 990. Badania prowadzono na pozyskanym poubojowo tłuszczu podskórnym, sródmięśniowym oraz okołonerkowym. Rasy te różnią się odkładaniem tkanki tłuszczowej, której najwięcej jest w linii 990. RNA izolowano stosując TRIZOL, ekstrakcję chloroformem oraz precypitację alkoholem. Odwrotną transkrypcję (RT) przeprowadzono z wykorzystaniem mieszaniny starterów oligo dT oraz random hexameres. Ilościowa ekspresja genu LEP prowadzona jest techniką Real-Time PCR (barwnik fluorescencyjny SYBR Green, urządzenie Light Cycler, Roche) z zastosowaniem starterów obejmujących ekson 2 i 3 genu LEP (produkt PCR długości 186 pz). Na podstawie wstępnych wyników można stwierdzić, że poziom transkryptów genu LEP zmienia się w zależności od analizowanej tkanki, przy czym najniższą ekspresję stwierdzono w tłuszczu podskórnym. W dalszej części badań analizowane będą zależności pomiędzy poziomem transkryptów dla genu LEP a zawartością tłuszczu w zależności od rodzaju tłuszczu i rasy zwierzęcia, z uwzględnieniem genotypu w locus receptora rianodyny (CT843T) związanego z syndromem gorączki złośliwej. P175. Zróżnicowanie populacyjne europejskich małży Mytilus na poziomie DNA mitochondrialnego. Beata Śmietanka, Roman Wenne Zakład Genetyki i Biotechnologii Morskiej, Instytut Oceanologii PAN w Sopocie Małże słonowodne należące do rodzaju Mytilus charakteryzują się unikalnym sposobem dziedziczenia genomu mitochondrialnego (mtDNA). W świecie zwierzęcym mtDNA dziedziczony jest z reguły w sposób uniparentalny w linii matki. U małży Mytilus genom mitochondrialny dziedziczony jest podwójnie uniparentalnie – w linii matki (genom F) i ojca (genom M). Genom matczyny przekazywany jest zarówno samcom jak i samicom, genom ojcowski tylko samcom, powszechne jest zatem występowanie zjawiska heteroplazmii u samców. Badania prowadzono w oparciu o trzy występujące w Europie gatunki Mytilus: M. edulis, M. trossulus i M. galloprovincialis z wybrzeży europejskich od Morza Azowskiego do Morza Białego. Analizowano fragment rejonu kodującego (ND2-COIII) oraz główny rejon niekodujący (D-loop) w genomie mitochondrialnym żeńskim i męskim. Zastosowano metodę PCR-RFLP oraz wybiórczo sekwencjonowanie. Zaobserwowano wysoki polimorfizm mtDNA oraz istnienie introgresji pomiędzy populacjami. Genom męski charakteryzuje się znacznie wyższym stopniem dywergencji w stosunku do genomu żeńskiego. Najniższe zróżnicowanie genomu żeńskiego zaobserwowano u bałtyckiego M. trossulus oraz M. galloprovincialis z Morza Azowskiego, co może wynikać z młodego geologicznie wieku obu mórz. Zaobserwowano bardzo słaby przepływ mtDNA pomiędzy M. galloprovincialis z Atlantyku i Morza Środziemnego. Atlantycki M. galloprovincialis jest genetycznie bliższy atlantyckiemu M. edulis aniżeli populacji M. galloprovincialis z Morza Śródziemnego. U samców we wszystkich badanych populacjach z wyjątkiem bałtyckiego M. trossulus, stwierdzono obecność genomu M o wysokim stopniu dywergencji sekwencji. U małży bałtyckich dochodzi prawdopodobnie do maskulinizacji genomu żeńskiego, który u samców przejmuje rolę genomu męskiego i dziedziczy się w linii męskiej. Analiza zmienności mtDNA wydaje się bardzo użyteczna do ustalania filogeografii oraz śledzenia zmian bioróżnorodności organizmów morskich. P176. Rearanżacje genowe w obrębie głównego rejonu niekodującego genomu mitochondrialnego małży Mytilus. Monika Filipowicz, Artur Burzyński, Beata Śmietanka, Roman Wenne Zakład Genetyki i Biotechnologii Organizmów Morskich, Instytut Oceanologii PAN w Sopocie Gatunki Mytilus są ciekawym obiektem badań ze względu na obecność heteroplazmii w obrębie mitochondrialnego DNA oraz unikalny sposób dziedziczenia mtDNA – DUI (double uniparental inheritance). Polega on na współistnieniu dwóch genomów mtDNA: żeńskiego F oraz męskiego M o wysokim stopniu dywergencji. Zakłada, że istnieją dwie niezależne drogi transmisji mtDNA do potomstwa. Genom F przekazywany jest w linii matki do córek i synów, a genom M tylko w lini ojca do synów. Ponadto dane literaturowe świadczą o występowaniu rekombinacji w obrębie głównego rejonu niekodującego genomu M mtDNA omułków bałtyckich, a także w rejonie kodującym COIII Mytilus z M Czarnego. Z uwagi na to, że doniesienia na temat rekombinacji dotyczą genomów męskich rozpoczęto poszukiwania rearanżacji genowych w puli osobników, u których stwierdzono obecność genomu M. Badano genomy M omułków pochodzących z M.Czarnego, M. Azowskiego, Bałtyku, M. Śródziemnego oraz zachodnich wybrzeży Atlantyku. Przeprowadzono reakcje PCR z zastosowaniem różnych kombinacji starterów komplementarnych 140 Genetyka zwierząt do sekwencji głównego rejonu niekodującego. Uzyskano produkty reakcji PCR z zastosowaniem odwróconych starterów na matrycach DNA osobników pochodzących z M. Azowskiego oraz z Zatoki Biskajskiej. Stanowiło to przesłankę do sformułowania hipotezy o występowaniu duplikacji fragmentu rejonu niekodującego wśród małży Mytilus pochodzących z tych akwenów i skłoniło do podjęcia szczegółowych analiz sekwencji tych osobników. Analiza porównawcza sekwencji osobników z M. Azowskiego oraz Zatoki Biskajskiej z sekwencjami omułków bałtyckich wykazała, że w obrębie głównego rejonu niekodującego tych małży występują rearanżcje genowe podobne do zaobserwowanych wśród małży bałtyckich. Dalsze badania mają na celu dokładne określenie sekwencji zrearanżowanych wariantów oraz ustalenie zasięgu ich występowania, co umożliwiłoby wyjaśnienie korelacji między występowaniem rearanżacji w rejonie kontrolnym mtDNA i hybrydyzacją międzygatunkową. P177. Występowanie transpozonów w genomach ryb morskich. Anita Poćwierz-Kotus, Artur Burzyński, Roman Wenne Instytut Oceanologii PAN w Sopocie Transpozony są elementami genetycznymi zdolnymi do zmiany miejsca położenia w genomie, czyli do transpozycji. Mogą rozprzestrzeniać się zarówno w obrębie pojedynczej komórki, jak i między gatunkami podczas horyzontalnego transferu. Ich aktywność może wywoływać rearanżacje w strukturze genomów prowadzące do zróżnicowania ich wielkości. Transpozony Tc1 stanowią nadrodziną eukariotycznych transpozonów zidentyfikowanych u wielu organizmów, szczególnie zaś wydają się być rozpowszechnione u ryb i płazów. Elementy te zawierają gen kodujący transpozazę oraz 54-nukleotydowe powtórzenia flankujące ten gen. Transpozycja odgrywa rolę w ewolucji genomów ryb i może mieć znaczenie w utrzymywaniu różnorodności populacji. Badano występowanie transpozonów Tc1 w bałtyckich populacjach Platichthys flesus (stornia) i Pleuronectes platessa (gładzica) oraz w pojedynczych próbach ryb i płazów: Scopthalmus maximus (turbot), Salmo salar (łosoś), Reinhardtius hippoglossoides (halibut), Esox lucius (szczupak), Clupea harengus (śledź), Salmo trutta (pstrąg), Neogobius melanostomus (babka), Gadus morhua (dorsz), Perca fluviatilis (okoń), Merluccius merluccius (morszczuk), Rana temporaria (żaba). Na podstawie sekwencji nukleotydowych transpozonów Tc1 u gładzicy, łososia i żaby udostępnianych przez GenBank zaprojektowano parę starterów APK1/APK2 umożliwiających amplifikację fragmentu genu kodującego enzym transpozazę. Użyto również pojedynczego starteru Leaver komplementarnego do odwróconych powtórzeń sekwencji transpozonowej Tc1, o opublikowanej sekwencji (Leaver, 2001). Przeprowadzano reakcje PCR z użyciem pary starterów APK1/APK2 oraz starteru Leaver. Dla wybranych gatunków ryb stosowano także metodę hybrydyzacji typu Southern, gdzie genomowy DNA trawiony enzymami restrykcyjnymi PvuII, BamHI i HindIII hybrydyzowano z sondą wyznakowaną DIG-dUTP. Stwierdzono w ten sposób występowanie transpozonu Tc1 u storni, gładzicy, łososia, szczupaka, pstrąga, babki, okonia, żaby. Przeprowadzenie analizy molekularnej i sekwencjonowania transpozonów Tc1 pozwoli na zbadanie wewnątrzpopulacyjnego polimorfizmu u różnych gatunków ryb morskich.� Leaver M. J. (2001) A family of Tc1 –like transposons from the genomes of fishes and frogs: evidence for horizontal transmission. Gene 271, 203-214. P178. Zmienność mitochondrialnego DNA w strefie hybrydyzacji i introgresji u zwierząt z podwójnie uniparentalnym dziedziczeniem mtDNA. Mytilus edulis i Mytilus trossulus. Tomasz Kijewski (1), Roman Wenne (2) (1) Instytut Oceanologii PAN w Sopocie (2) Instytut Oceanologii PAN, Molecular Ecology and Fisheries Genetics Group, Department of Biological Sciences, University of Hull, Hull, HU6 7RX, UK Zbadano zróżnicowanie mtDNA w 8 populacjach omułka ze strefy hybrydyzacji między Mytilus trossulus i M. edulis w Cieśninach Duńskich i Morzu Bałtyckim. Analizowano rejon kodujący ND2-COIII z zastosowaniem metody PCRRFLP. Stwierdzono występowanie istotnych statystycznie różnic między populacjami z północnej części Cieśnin Duńskich oraz populacjami z południowej części Cieśnin Duńskich i Bałtyku. We wszystkich populacjach stwierdzono występowanie heteroplazmii związanej ze zjawiskiem podwójnie uniparentalnego dziedziczenia mtDNA. W północnej części Cieśnin Duńskich heteroplazmia związana była z występowaniem 2 genomów mitochondrialnych o wysokiej dywergencji, w pozostałych populacjach –genomów o niskiej dywergencji, co jest wiązane ze zjawiskiem maskulinizacji 141 Genetyka zwierząt żeńskiego genomu mitochondrialnego w warunkach hybrydyzacji międzygatunkowej. Uzyskane wyniki świadczą o introgresji genomów mitochondrialnych w kierunku wschodnim. P179. Polimorfizm regionu 5’UTR genu leptyny świni. Mariusz Maćkowski, Marek Świtoński Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu Gen leptyny, kodujący hormon odpowiedzialny za regulacje gospodarki tłuszczowej organizmu, zbudowany jest z trzech eksonów przedzielonych dwoma intronami. Pomimo tego, że u ssaków wykazuje wysoki konserwatyzm dotąd nie ustalono całkowitej sekwencji genomowej tego genu świni. Znana jest sekwencja fragmentu o długości 5920 pz, obejmującego cały ekson drugi i trzeci oraz fragment intronu pierwszego i cały intron drugi. W sekwencji tej zidentyfikowano dotąd pięć mutacji punktowych (SNP), z czego dwie znajdują się w części kodującej genu, jednak żadna z nich nie wpływa na zmianę sekwencji aminokwasowej. W niniejszych badaniach podjęto próbę poszukiwania mutacji w rejonie promotorowym genu leptyny świni. Na podstawie sekwencji fragmentu promotora genu leptyny bydła zaprojektowano cztery zestawy starterów. Przy użyciu jednej z tych par uzyskano specyficzny fragment o długości 246 pz. Fragment ten został poddany sekwencjonowaniu i przeprowadzono analizę porównawczą z odpowiednim fragmentem pochodzącym z genomu bydła i człowieka, która wykazała wysoki stopień podobieństwa, odpowiednio 80% i 70%. W kolejnym etapie badań poszukiwano miejsc polimorficznych przy pomocy techniki SSCP. Wśród 173 zwierząt, reprezentujących rasy: wbp, pbz, duroc, pietrain, hampshire i linię syntetyczną 990, zidentyfikowano 21 zwierząt o odmiennym wzorze SSCP. Sekwencjonowanie fragmentów pochodzących od tych zwierząt ujawniło występowanie kilku mutacji punktowych a szczegółowy ich opis będzie zaprezentowany. Badania finansowane przez KBN (grant PBZ-KBN-036/P06/14). P180. Cechy nasienia knurów z różnymi wariantami genu hormonu wzrostu (GH/MspI & GH/HaeII). Marek Kmieć (1), Heliodor Wierzbicki (2), Sławomir Zych (1) (1) Agricultural University of Szczecin, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Doktora Judyma 6, 71-466 Szczecin, Poland (2) Agricultural University of Wrocław, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Kożuchowska 7, 51-631 Wrocław, Poland Reprodukcja zwierząt gospodarskich odgrywa istotną rolę w pracy hodowlanej. Dynamiczny rozwój genetyki molekularnej stworzył warunki dla poszukiwań genów istotnie wpływających na użytkowość zwierząt. Nadzieje wiąże się z genami wpływającymi na kształtowanie się cech ilościowych – QTL (quantitative trait locus). Hormon wzrostu (GH) jest białkiem produkowanym w przednim płacie przysadki mózgowej. W ostatnich latach pojawiły się doniesienia o oddziaływaniu GH na męskie i żeńskie procesy rozrodcze. Hormon ten wpływać może na nie bezpośrednio lub pośrednio za pomocą mediatorów (IGF-I). Znaleziono specyficzne receptory na wszystkich typach komórek w jądrach knura. Obserwuje się także wpływ GH na ruchliwość plemników i ich zdolność do zapłodnienia. Analizowano zależności pomiędzy polimorfizmem PCR-RFLP genu hormonu wzrostu a cechami nasienia 204 knurów (52 – Polish Landrace; 43 – Duroc x Pietrain; 35 – Polish Large White; 25 – Hampshire x Pietrain; 18 – PIC line; 11 – Pietrain; 8 – Polish Syntetic Line; 6 – Duroc x Hampshire; 4 – Duroc and 2 – Hampshire) użytkowanych w SHiUZ. Produkt PCR wielkości 506 pz trawiono endonukleazą MspI oraz HaeII. W analizowanym stadzie knurów rozpłodowych częstość występowania alleli dla polimorfizmu GH/MspI wynosiła odpowiednio: allelu GHA – 0.7549 i allelu GHB – 0.2451. Natomiast dla polimorfizmu GH/HaeII częstość występowania alleli wynosiła odpowiednio: allelu GHA – 0.5522 oraz allelu GHB – 0.4478. Uzyskane wyniki analizy zależności między cechami nasienia knurów a wariantami genetycznymi genu hormonu wzrostu u knurów sugerują możliwości wykorzystania polimorfizmów GH/MspI oraz GH/HaeII w doskonaleniu cech użytkowości rozpłodowej knurów. Najwyższe wartości badanych cech nasienia występowały zawsze u osobników, u których występował genotyp GHBGHB w przypadku obydwu miejsc polimorficznych genu hormonu wzrostu. 142 Genetyka zwierząt Inżynieria genetyczna, biotechnologia Komunikaty ustne: W77. Klonowanie somatyczne saków: perspektywy dla hodowli i ochrony zagrorzonych gatunków oraz farmacji i medycyny. Prof. J. A. Modliński Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt, Polska Akademia Nauk, Jastrzębiec W78. Manipulacje komórkami zarodkowymi u ptaków. Marek Bednarczyk Katedra Biotechnologii Zwierząt, Akademii Techniczno-Rolniczej w Bydgoszczy Tworzenie chimer kręgowców, w wyniku manipulacji ich komórkami znane jest od dawna. W ostatnim dziesięcioleciu uzyskano praktyczne możliwości manipulacji komórkami embrionalnymi ptaków, wykorzystuje się do tego celu komórki blastodermalne (BC), izolowane z tarczki zarodkowej po zniesieniu jaja lub pierwotne komórki płciowe (PGC), izolowane ze smugi pierwotnej, krwi lub gonad zarodków. Manipulacje komórkami embrionalnymi ptaków dotyczą dwóch podstawowych kierunków badawczych: produkcji ptaków transenicznych oraz biokonserwacji genotypów metodą ex situ. Interesujące są ponadto obserwacje interakcji pomiędzy różnymi genotypami komórek dawców i biorców w organizmie chimery, a zwłaszcza wpływu egzogennych komórek zarodkowych na rozwój gonad i funkcje płciowe chimer, w tym ocena możliwości sterowania płcią ptaków. Zaproponowana w naszym laboratorium metoda tworzenia chimer z wykorzystaniem BC charakteryzująca się znaczną efektywnością (41% wylęgu, 87% chimer fenotypowych) pozwala na rutynową produkcję nie tylko chimer fenotypowych, ale przede wszystkim chimer płciowych (30%), umożliwiając rozwój różnorodnych, często potencjalnych do tej pory kierunków badawczych. Omówiona zostanie realizowana w ostatnich latach problematyka badawcza z tego zakresu, dotycząca: • doskonalenia metod produkcji chimer •poprawy przeżywalności zarodków chimer po iniekcji komórek dawców • metod identyfikacji chimer • zwiększenia stopnia chimeryzmu • metod transfekcji komórek BC i PGC • obserwacji fizjologicznych, genetycznych i produkcyjnych aspektów chimeryzmu, itd. Badania finansowane przez KBN, granty: 2 P06D 029 26 i PBZ-KBN-084/P06/2002 W79. Konstytutywna i regulowana niedotlenieniem nadekspresja oksygenazy hemowej-1 w systemie wektorów AAV: potencjalne zastosowanie w terapii genowej. Barbara Węgiel, Jarosław Cisowski, Alicja Józkowicz, Józef Dulak Zakład Biochemii Komórki, Wydział Biotechnologii UJ, ul. Gronostajowa 7, 30-387 Kraków Oksygenaza hemowa-1 (HO-1), enzym indukowany przez liczne czynniki stresowe, rozkłada hem do biliwerdyny, CO i jonów żelaza. HO-1 i jej produkty wykazują szerokie działanie cytoprotekcyjne i przeciwzapalne, odgrywają także istotną rolę w angiogenezie. Badania wskazują na szczególnie korzystną rolę HO-1 w ograniczaniu miażdżycy i uszkodzeniu serca po zawale. Efekt ten może jednak być znacznie osłabiony u pacjentów, bowiem niedotlenienie nie stymuluje, a nawet może hamować ekspresję HO-1 w ludzkich komórkach. Dlatego zastosowanie wektorów umożliwiających stałą lub indukowaną ekspresję HO-1 w niedotlenionych tkankach może mieć duże znaczenie w terapii genowej. Skuteczność takiej strategii może być dodatkowo zwiększona poprzez wykorzystanie wektorów umożliwiających trwałą ekspresję transgenu i nie wywołujących procesów zapalnych. Warunki takie spełniają wektory oparte na wirusach AAV (ang. adeno-associated viruses). Wektory AAV konstruowano przy pomocy AAV Helper Free System (Stratagene). Sekwencję kodującą cDNA HO-1 uzyskano z biblioteki cDNA ludzkich komórek HepG2. Skonstruowano wektor hHO-1-AAV zawierający cDNA HO-1 143 Genetyka zwierząt pod kontrolą konstytutywnego promotora CMV oraz wektor HRE-hHO-1-AAV, w którym transkrypcja HO-1 zależy od aktywacji sekwencji HRE (ang. hypoxia responsive element), wiążącej czynnik transkrypcyjny HIF-1, indukowany w niedotlenieniu. Zastosowanie wektora reporterowego AAV-β-gal wykazało, że transdukcja jest wydajna w komórkach śródbłonka mikrowaskularnego HMEC-1, natomiast ekspresja po transdukcji keratynocytów HaCaT jest bardzo niska. Po transdukcji hHO-1-AAV stwierdzono w HMEC-1 zwiększoną ekspresję HO-1, potwierdzoną przez RTPCR i Western blot. W HMEC-1 transdukowanych HRE-hHO-1-AAV niska ekspresja HO-1 wzrastała co najmniej kilkakrotnie po aktywacji czynnika HIF-1. Skonstruowany system regulowanej nadekspresji HO-1 w wektorach AAV stwarza możliwości do badań in vivo nad protekcyjną rolą HO-1 w niedotlenieniu tkanek. W80. Cytogenetyczna ocena transgenezy zwierząt. Ewa Michalak (1), Daniel Lipiński (2) Ryszard Słomski (1, 2), (1) Katedra Biochemii i Biotechnologii, Akademia Rolnicza w Poznaniu, ul. Wołyńska 35, 60-637 Poznań (2) Insytut Genetyki Człowieka PAN Poznań Ocena badań nad transgenezą w pierwszym etapie wykonywana jest na poziomie molekularnym za pomocą PCR. W wielu przypadkach konieczna jest jednak ocena kariotypu zwierząt transgenicznych, a także cytogeneczne zmapowanie transgenu. A tym celu najczęściej stosuje się fluoroscencyjną hybrydyzację in situ, w której sondą molekularną jest transgen. W naszym zespole udało się uzyskać ród transgenicznych królików WAP6xHisHGH wywarzających w mleku hormon wzrostu człowieka. Celem niniejszej pracy było potwierdzenie lokalizacji transgenu w chromosomie 7q26-27 (FISH), rozróżnienie homozygot od heterozygot, a ponadto próba określenia liczby kopii transgenu (fiber FISH) wśród 5 transgenicznych królików. Materiałem badawczym były hodowane in vitro fibroblasty uszne 5 królików, z których wykonano preparaty cytogenetyczne, w tym halo DNA. Sondę molekularną stanowił plazmid zawierajacy transgen WAP6xHisHGH znakowany biotyną przy użyciu reakcji random priming. FISH przeprowadzono wg standardowej procedury. Wykonanie badań metodą FISH potwierdziło u wszystkich królików lokalizację transgenu 7q26-27, a także pozwoliło na wyróżnienie 1 homozygoty i 4 heterozygot. Jednocześnie wykazano stabilność integracji transgenu w kolejnych pokoleniach zwierząt i pasażach linii komórkowych rozluźnionej. Sygnały hybrydyzacyjne w postaci liniowej na preparatach z rozluźnioną chromatyną wskazują na wbudowanie znacznej liczby kopii transgenu, jednak szczegółowe poznanie orientacji transgenu wymaga zastosowania innych technik. W81. Skład pożywki do dojrzewania in vitro a występowanie apoptozy w oocytach bydlęcych. Ewelina Warzych, Kamila Matulewicz, Anna Nogowska, Dorota Lechniak Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza w Poznaniu, ul. Wołyńska 33, 60-637 Poznań, e-mail: [email protected] Apoptoza odgrywa ważną rolę w regulacji wzrostu pęcherzyków jajnikowych i oocytów ssaków. Zjawisko to obserwuje się we wszystkich stadiach oogenezy m.in. u człowieka, myszy i bydła. Częstość występowania apoptozy jest stosunkowo niska w oocytach niedojrzałych (u bydła 7%), przy czym wzrasta w oocytach po dojrzewaniu in vitro (23%). Wykazano, że hodowla oocytów w warunkach laboratoryjnych, określanych mianem suboptymalnych, zwiększa udział komórek apoptotycznych. Duże znaczenie ma w tym zakresie skład i rodzaj pożywki do dojrzewania. Celem niniejszych badań jest analiza wpływu warunków dojrzewania in vitro na częstotliwość występowania apoptozy w oocytach bydlęcych. Oocyty hodowano w trzech pożywkach bazujących na podłożu TCM199, różniących się źródłem białka (FCS, faf BSA, PVP). Do detekcji komórek apoptotycznych zastosowano technikę TUNEL. Dotychczasowe badania objęły 290 oocytów, w tym 64 niedojrzałych i 226 po dojrzewaniu. Zaobserwowano małą częstość komórek apoptotycznych wśród oocytów niedojrzałych (3.1%) oraz wzrost ich udziału po dojrzewaniu in vitro (15.5%). Ponadto stwierdzono pewne różnice pomiędzy stosowanymi pożywkami, najwyższy udział oocytów apoptotycznych zaobserwowano w pożywce z PVP –22.4% (FCS –12.7%, BSA –12.5%). Pożywka z PVP charakteryzowała się również najniższym udziałem oocytów dojrzałych do zapłodnienia w stadium metafazy drugiej (MII) –67.1% (FCS –85.7%, BSA 144 Genetyka zwierząt – 79,1%). Oocyty apoptotyczne występowały znacznie częściej wśród komórek niedojrzałych (41.7%) w porównaniu z oocytami w stadium MII (12.9%). Praca naukowa finansowana ze środków KBN w latach 2003-2005 jako projekt badawczy zamawiany nr PBZ/KBN-084/ P06/2002 Komunikaty plakatowe: P181. Charakterystyka genetyczna populacji strusi w Polsce przy użyciu metody DNA fingerprinting. Magdalena Kawka (1), Jarosław O. Horbańczuk (1), Mariusz Sacharczuk (2), Rafał Parada (2), Kinga Boruszewska (2) (1) Zakład Doskonalenia Zwierząt, Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN (2) Zakład Cytogenetyki Molekularnej, Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN Hodowla strusi w Polsce jest jedną z najmłodszych gałęzi produkcji zwierzęcej. Pierwsza ferma powstała w 1993 roku – w Garczynie, koło Gdańska. Dynamiczny rozwój hodowli tych ptaków, nie tylko na świecie, ale również i w Polsce spowodował deficyt wysokiej jakości materiału hodowlanego. Poza tym możliwości prowadzenia pracy hodowlanej za pomocą tradycyjnych metod genetyki populacji są ograniczone m.in. z powodu krótkiego okresu hodowli strusi oraz małej ich liczby w stadzie (Horbańczuk, 2003). Jednak dzięki rozwojowi nowych metod analitycznych genetyki molekularnej staje się możliwe przeprowadzenie analizy genetycznej krajowej populacji strusi, co nie było czynione do tej pory. Techniki te wykorzystują sekwencje mini– i mikrosatelitarne oraz markery chromosomowe. Struś jest ptakiem o mało znanym genomie. Liczba znanych sekwencji mikrosatelitarnych strusia nie jest do końca znana. Pojawia się coraz więcej prac dotyczących odkrycia nowych par starterów u tych gatunków ptaków (Tang, 2003). Na razie jednak najlepszą metodą stosowaną w charakterystyce genetycznej tych ptaków jest analiza sekwencji minisatelitarnych wielopozycyjną techniką DNA fingerprinting. Uzyskiwane wzory prążkowe znajdują szerokie zastosowanie prawie we wszystkich badaniach poznawczych i praktycznych: m.in. w identyfikacji osobników, rodzin, ras czy linii zarówno u ludzi, zwierząt jak i roślin; do mapowania i identyfikacji markerów sprzężonych z QTLs; do oceny autentyczności klonowanych zwierząt; do ustalenia stopnia inbredu. W naszym Instytucie analizę DNA fingerprinting stosuje się w genetycznej charakterystyce zwierząt. Za jej pomocą zidentyfikowano dwujajowe oraz jednojajowe bliźnięta strusia (Sacharczuk i wsp., 2001). Poza tym Jaszczak i wsp. (2001) wykazali skuteczność tej metody w poszukiwaniu genów, jak i eliminacji osobników mających genetyczne predyspozycje do wad szkieletu oraz w określeniu genetycznej charakterystyki gęsi o różnym kariotypie. Obecnie metoda ta używana jest do genetycznej analizy trzech ras strusi (czerwono-, niebiesko– i czarnoszyich). Badania te obejmują określenie zmienności genetycznej wewnątrz i między rasami a także określenie dystansu genetycznego pomiędzy badanymi populacjami strusi. DNA było izolowane z piór tradycyjną metodą z użyciem proteinazy K. Następnie zostało ono poddane trawieniu enzymem Hinf I, elektroforezie w 0,8% żelu agarozowym i hybrydyzacji z sondą minisatelitarną 33.6. Wstępne badania wykonane na małej liczbie osobników potwierdzają przypuszczenia, że największa zmienność genetyczna występuje u strusi czerwonoszyich, najmniejsza zaś u strusi czarnych. P182. Wpływ składu pożywki na zaburzenia wrzeciona podziałowego w oocytach bydlęcych dojrzewających in vitro. Jarosław Sosnowski, Wioletta Pijacka, Izabela Woźniczko, Dorota Lechniak Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza w Poznaniu Celem niniejszych badań była analiza wpływu stosowanych pożywek do dojrzewania in vitro oocytów bydlęcych na występowanie zaburzeń wrzeciona podziałowego. Oocyty hodowano w pożywkach na bazie medium TCM199 uzupełnianego FCS lub fafBSA lub PVP. Do analiz immunoflurescencyjnych wrzecion oocytów używano mysich przeciwciał monoklonalnych przeciw β-tubulinie (przeciwciała pierwszorzędowe, Monoclonal Anti β-tubulin) oraz, jako drugorzędowe, przeciwciała sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (Goat anti-Mouse IgG-FITC). Chromatynę barwiono przy użyciu DAPI. Ocena preparatów polegała na określeniu stadium podziału mejotycznego oocytu oraz analizie struktury wrzeciona podziałowego. Jako nieprawidłowe uznawano wrzeciona podziałowe z więcej niż dwoma biegunami, wrzeciona z widocznymi w ich obrębie opóźnionymi chromosomami, a także komórki z diploidalną liczbą chromosomów w stadium MII. 145 Genetyka zwierząt Ogółem przeanalizowano strukturę wrzecion podziałowych w 542 oocytach, które znajdowały się w stadiach MI, AI, TI oraz MII (wśród ostatnich także MII z diploidalną liczbą chromosomów). Stwierdzono tylko 7 komórek, w których zaobserwowano nieprawidłowości w obszarze wrzeciona podziałowego, co stanowi 1.29% (7/542). Wśród nieprawidłowości stwierdzono 2 oocyty z wrzecionem trójbiegunowym (obie w grupie oocytów dojrzewających w pożywce z dodatkiem PVP) oraz 5 komórek z opóźnionymi chromosomami w obrębie wrzecion. Najwięcej nieprawidłowości obserwowano w grupie 190 oocytów dojrzewających w pożywce uzupełnionej PVP –4 komórki (2.1%, 4/190). Wśród 185 oocytów hodowanych w pożywce z dodatkiem FCS stwierdzono 2 komórki (1.1%, 2/185), a wśród 167 dojrzewających w obecności BSA, 1 komórkę (0.6%, 1/167). Pośród 357 oocytów w stadium MII, 4.5% (16/ 357) było z diploidalną liczbą chromosomów. Poziom diploidii wśród oocytów dojrzałych w pożywce z dodatkiem PVP wyniósł 11.1% (8/72), z dodatkiem FCS 3,1% (5/159) a w pożywce z faf BSA 2,4% (3/126). Praca naukowa finansowana ze środków KBN w latach 2003-2005 jako projekt badawczy zamawiany nr PZB/KBN-084/ P06/2002 Mutacje, diagnostyka genetyczna, terapia Komunikaty ustne: W82. Ekspresja genu Ssty1 u samców myszy z delecją w chromosomie Y. Paweł Grzmil, Agnieszka Dziuba, Józefa Styrna Zakład Genetyki i Ewolucjonizmu, Instytut Zoologii Uniwersytetu Jagiellońskiego, Ingardena 6, 30-060 Kraków Obserwowane przez lekarzy pogorszenie się jakości męskiego nasienia skłania naukowców do intensywnego poszukiwania genów kontrolujących prawidłowy przebieg spermatogenezy u ssaków. W tego typu badaniach niezwykle użyteczne są zwierzęce modele z zaburzeniami płodności. Jednym z genów wpływających na prawidłowy przebieg spermatogenezy u myszy jest występujący w licznych kopiach w długim ramieniu chromosomu Y gen Ssty1. Ostatnio wykryto obecność produktu białkowego tego genu w kanalikach nasiennych. W obecnej pracy wykazaliśmy znaczący ubytek liczby kopii tego genu u samców mutantów B10. BR-Ydel z delecją dwu trzecich długiego ramienia chromosomu Y. Samce te mają znacznie podniesiony w stosunku do kontroli (B10. BR) procent morfologicznie nienormalnych plemników, co dowodzi, że redukcja znacznej liczby kopii genu Ssty1 nie zatrzymuje spermatogenezy, ale wpływa na przebieg spermiogenezy. Ponadto udało się nam również wykazać, że ekspresja tego genu występuje nie tylko w gonadzie męskiej, jak podawano dotychczas w literaturze, ale także w mózgu u samców myszy. Praca finansowana z grantu KBN 3 P04C 033 23 W83. Zmiany cytogenetyczne w komórkach krwi obwodowej i szpiku kostnego myszy po działaniu promieniowania X i nonylfenolu. Urszula Mikulska, Małgorzata Dobrzyńska Zakład Ochrony Radiologicznej i Radiobiologii, Państwowy Zakład Higieny, ul. Chocimska 24, 00-791 Warszawa Nonylfenol i promieniowanie X powszechnie występują w środowisku człowieka. Nonylfenol (NL) należy do grupy związków wykazujących aktywność hormonalną. Występuje w produktach powszechnego użytku, jak wyroby z pcv, farby, folie, pestycydy, detergenty, zabawki. Celem przeprowadzonych badań było określenie wpływu nonylfenolu, promieniowania X oraz skojarzonego działania małych dawek obu czynników na indukcję mikrojąder w retikulocytach oraz w erytrocytach polichromatycznych. Materiał doświadczalny stanowiły niewsobne myszy Pzh: SFIS. Samce napromieniano na całe ciało lub/i podawano im dootrzewnowo nonylfenol rozprowadzony w oleju słonecznikowym, 5 razy w tygodniu przez 2 tygodnie. Każdorazowo dawki wynosiły 0,10 Gy lub 0,20 Gy promieniowania X, 25 mg/kg mc, 50 mg/kg mc lub 100 mg/kg mc nonylfenolu, a w przypadku skojarzonego działania 0,10 Gy + 50 mg/kg mc NL. Krew obwodową pobierano po upływie 1 tygodnia od rozpoczęcia doświadczenia oraz 24h po jego zakończeniu, a szpik kostny po zakończeniu ekspozycji. Stosunek erytrocytów polichromatycznych do normochromatycznych we wszystkich grupach doświadczalnych 146 Genetyka zwierząt oraz kontrolnych wynosił 1:1. Nie stwierdzono zatem efektu cytotoksycznego. Ilość mikrojąder w erytrocytach polichromatycznych wzrosła około dwukrotnie w przypadku dawek 50 mg/kg mc NL i 100 mg/kg mc NL w stosunku do kontroli. Dawki 0,10 Gy i 0,20 Gy promieniowania X zwiększyły ilość mikrojąder odpowiednio o 38% i 180% w odniesieniu do osobników kontrolnych. Natomiast skojarzone działanie promieniowania X i nonylfenolu spowodowało wzrost częstości występowania mikrojąder w erytrocytach polichromatycznych aż o 203%. Napromienianie myszy indukowało powstawanie mikrojąder w retikulocytach szpiku kostnego oraz krwi obwodowej. Po zastosowaniu dawki 0,20 Gy stwierdzono dwukrotnie wyższą ich obecność w stosunku do dawki 0,10 Gy, zaś powyżej ośmiokrotnie wyższą w porównaniu do kontroli. Zwiększoną obecność mikrojąder stwierdzono także w krwi myszy poddanych ekspozycji na 50 mg/kg NL i 100 mg/kg NL. Nie wykazano natomiast istotnych różnic między obiema dawkami. W przypadku skojarzonego działania promieniowania X i nonylfenolu, częstość występowania mikrojąder w retikulocytach szpiku kostnego nie różniła się istotnie od kontroli, w krwi obwodowej wzrosła 2-3-krotnie w stosunku do kontroli, natomiast zmniejszyła się w porównaniu z działaniem samego promieniowania. W84. Antyangiogenna terapia genowa skojarzona z chemioterapią w hamowaniu wzrostu guzów pierwotnych u myszy. Iwona Mitrus, Natalia Wróbel, Klaudia Delić, Ewa Missol-Kolka, Stanisław Szala Zakład Biologii Molekularnej, Centrum Onkologii, Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie, ul. Wybrzeże Armii Krajowej 15, 44-101 Gliwice W leczeniu chorób nowotworowych próbuje się kojarzyć różne metody terapeutyczne. Zastosowanie odmiennych sposobów niszczenia komórek nowotworowych powinno przynieść poprawę efektów leczenia. Eksperymenty terapii skojarzonej przeprowadzano na guzach pierwotnych mysiego czerniaka B16(F10). W czasie badań kojarzono dwie metody: terapię genową z zastosowaniem genu kodującego IL-12 (białko to hamuje angiogenezę i indukuje INF-gamma) oraz chemioterapię przy użyciu cyklofosfamidu. Wykazano, że podawanie genu IL-12 bezpośrednio do guza wywołuje jedynie niewielki efekt terapeutyczny – czas przeżycia myszy leczonych poprzez podawanie tego genu niewiele różni się od czasu przeżycia myszy grup kontrolnych. Znacznie lepsze wyniki daje zastosowanie terapii samym cyklofosfamidem. Czynnik ten podawano dootrzewnowo, według dwóch różnych schematów czasowych i w różnych dawkach, przy czym uzyskane wyniki terapeutyczne były zbliżone. Najlepsze wyniki uzyskano stosując terapię skojarzoną z udziałem genu IL-12 oraz cyklofosfamidu. Leczenie takie powoduje wydłużenie czasu przeżycia zwierząt w porównaniu z myszami leczonymi samą IL-12. Efekt terapii skojarzonej jest wyraźnie widoczny podczas podawania obu leków i jest dużo lepszy od każdego leku z osobna. Ponadto efekt terapeutyczny zależy w dużym stopniu od chwili rozpoczęcia terapii – wczesne rozpoczęcie leczenia podnosi wyniki terapeutyczne. W85. Skojarzona antyangiogenna terapia w hamowaniu przerzutów B16(F10) w płucach myszy. Tomasz Cichoń, Ryszard Smolarczyk, Stanisław Szala Zakład Biologii Molekularnej, Centrum Onkologii, Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie, ul. Wybrzeże Armii Krajowej 15, 44-101 Gliwice Terapia antyangiogenna jest pośrednią metodą niszczenia komórek nowotworowych. W terapii tej zahamowanie wzrostu naczyń okołonowotworowych pociąga za sobą zahamowanie wzrostu guzów pierwotnych oraz przerzutów. W terapii antyangiogennej przerzutów mysiego czerniaka B16(F10) skojarzono dwa rozwiązania terapeutyczne: antyangiogenną terapię genową oraz antyangiogenną chemioterapię. Terapię genową prowadzono na dwa sposoby. Pierwszy polegał na wprowadzeniu genu terapeutycznego do mięśnia podudzia obu łap myszy (elektroporacja) gdzie ulegał on stałej ekspresji wytwarzając białko terapeutyczne wprost do ustroju (terapia systemowa). Drugi opierał się na wprowadzeniu genu terapeutycznego bezpośrednio do płuc za pomocą polietylenoiminy 750 kDa (terapia lokalna). W terapii systemowej stosowano gen sFlt-1 (rozpuszczalny receptor dla VEGF), natomiast w terapii lokalnej geny IL-12 oraz sFlt-1. W obu przypadkach terapię genową rozpoczynano w trzecim dniu po zaszczepieniu myszy komórkami nowotworowymi. W terapii systemowej elektroporację przeprowadzono dwa razy w odstępie sześciu dni, natomiast w terapii lokalnej gen wprowadzano co siedem dni przez okres pięciu tygodni. Chemioterapię rozpoczynano w szóstym dniu po zaszczepieniu myszy komórkami i prowadzono co sześć dni. Chemioterapeutyk (cyklofosfamid) podawano dootrzewnowo w ilości 170mg/kg masy ciała. 147 Genetyka zwierząt W wyniku skojarzenia antyangiogennej terapii genowej z antyangiogenną chemioterapią zaobserwowano wydłużenie czasu przeżycia myszy poddanych terapii skojarzonej w porównaniu do czasu przeżycia myszy w grupach kontrolnych Komunikaty plakatowe: P183. Polimorfizm regionów kodujących i regulatorowych genów MYF6 i MYOG oraz nowa sekwencja genu MYF6 u świni. Joanna Wyszyńska-Koko, Jolanta Kurył, Krzysztof Flisikowski Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN w Jastrzębcu, Jastrzębiec, ul. Postępu 1, 05-552 Wólka Kosowska Procesy miogenezy warunkowane są wieloma czynnikami, z których bardzo ważną rolę odgrywają cztery czynniki transkrypcyjne kodowane przez rodzinę genów MyoD. Do rodziny tej należą geny MYOG i MYF6, które pełnią funkcję odpowiedzialną za proces różnicowania i dojrzewania włókien mięśniowych. MYOG z racji swojej kluczowej roli w miogenezie jest obiektem wielu badań, natomiast MYF6 jest najpóźniej odkrytym i najsłabiej poznanym genem z czterech genów z rodziny MyoD. Do tej pory jego sekwencja u świni nie była znana. W badaniach wykorzystano sekwencje tego genu u myszy i człowieka do zaprojektowania (starterów), których produkty amplifikacji odpowiadają regionowi promotorowemu oraz sekwencji kodującej wraz z występującymi w niej intronami, z wyłączeniem 3’UTR. Otrzymane produkty PCR zsekwencjonowano, a sekwencje po złożeniu zostały zdeponowane w genetycznej bazie danych NCBI pod numerami akcesyjnymi AY238474 i AY327443. Fragmenty obejmujące promotor i wszystkie trzy eksony zostały poddane analizom PCR-SSCP, PCR-RF-MSSCP i HD, w wyniku których wykryto dwie sprzężone transwersje (C do G i A do C) w obrębie pierwszego eksonu oraz tranzycję T do C w rejonie promotorowym. Wykonano analizę frekwencji poszczególnych alleli u różnych ras świń oraz analizę homologii w porównaniu do sekwencji dostępnych bazie danych NCBI. W przypadku genu MYOG znane są tylko mutacje w rejonach niekodujących. Sekwencje kodujące i regulatorowe tego genu również poddano analizom PCR-MSSCP i PCR-RF-MSSCP i wykryto tranzycję C do T występującą w pierwszym eksonie. Przeprowadzono analizę frekwencji poszczególnych alleli u różnych ras świń. P184. Polimorfizm w regionie 5’ genu receptora estrogenu ER bydła. Tomasz Szreder, Lech Zwierzchowski Zakład Biologii Molekularnej, Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt, Polska Akademia Nauk, ul. Postępu 1 Jastrzębiec, 05-552 Wólka Kosowska Receptor estrogenowy należy do nadrodziny receptorów jądrowych i do rodziny receptorów steroidowych. Receptory jądrowe uczestniczą w wielu procesach zachodzących w komórce i w całym organizmie, między innymi reprodukcji, różnicowaniu, rozwoju, homeostazie oraz onkogenezie (Eng i wsp., 1997). Receptor estrogenowy ER, jest białkowym czynnikiem transkrypcyjnym, który indukowany jest przez wiązanie z ligandem. Po utworzeniu kompleksu z ligandem receptor jest zdolny do oddziaływania z DNA i regulowania transkrypcji docelowych genów. U zwierząt i człowieka istnieją dwie izoformy receptora estrogenowego – ERa i ERb. Naturalnymi ligandami dla obu receptorów są 17b estradiol, estron i estriol (piśmiennictwo – patrz: Tkaczyk i Kalita, 2001). W naszych badaniach, na podstawie dostępnych w bazie GenBank sekwencji ER człowieka, owcy i świni, zaprojektowaliśmy startery do PCR, poddaliśmy amplifikacji siedem zachodzących na siebie fragmentów genu ERa bydła, przeprowadziliśmy sekwencjonowanie produktów PCR, a następnie z tych odcinków złożyliśmy sekwencję 2853 pz regionu 5’ flankującego bydła, dotychczas nieznanego. Sekwencja została zdeponowana w bazie GenBank pod nr AY340597. Posługując się uzyskaną przez nas sekwencją stwierdziliśmy także występowanie polimorfizmu w regionie 5’ receptora estrogenu α; prawdopodobnie jest to region promotora leżącego w obrębie eksonu C genu ER bydła. Znaleziony przez nas polimorfizm jest tranzycją – substytucją nukleotydów A/G, rozpoznawaną przez trawienie enzymem BglI. Stwierdziliśmy również występowanie tranzycji A/C, rozpoznawanej przez trawienie enzymem Mnl I. Ten polimorfizm występuje w regionie promotora dla eksonu B. Wstępnie stwierdzono także występowania polimorfizmu w kodującym eksonie 1 genu ERa bydła. Ekson ten jest odpowiedzialny za kodowanie domeny transaktywującej. 148 Genetyka zwierząt P185. Wpływ plazmidowego DNA wprowadzanego za pomocą PEI 750kDa/ albumina na indukcję cytokin prozapalnych u myszy. Ryszard Smolarczyk, Tomasz Cichoń, Aleksander Sochanik, Stanisław Szala Zakład Biologii Molekularnej, Centrum Onkologii, Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie, ul. Wybrzeże Armii Krajowej 15, 44-101 Gliwice Polietylenoimina o masie cząsteczkowej 750kDa z dodatkiem albuminy (PEI 750kDa/albumina) jest wykorzystywana do transferu genów in vivo. Celem pracy było zbadanie i ocena poziomu stanu zapalnego indukowanego przez DNA wprowadzonego in vivo przez ten nośnik. Optymalna dla tego nośnika ilość plazmidowego DNA (1µg) wprowadzana do organizmu nie wywołuje odpowiedzi układu odpornościowego. Ilość cytokin prozapalnych: TNF-alfa, IFN-gamma, IL-12 oznaczonych przy pomocy Quantikine Kit firmy R&D jest na prawie zerowym poziomie. Stwierdziliśmy także, że podanie PEI 750kDa/albumina z plazmidowym DNA co 3 dni umożliwia utrzymanie stale wysokiego poziomu ekspresji genu, co może zapewnić ciągłą obecność białka terapeutycznego w ustroju przez dłuższy okres czasu. Dalsze zwiększenie ilości białka terapeutycznego można osiągnąć podając polipleks w obecności deksametazonu. Naszym zdaniem, PEI 750kDa/albumina dzięki swojej wysokiej efektywności w transferze genów i stosunkowo niskiej indukcji stanu zapalnego może być wykorzystana do transferu genów do płuc, np. do leczenia chorób genetycznych typu mukowiscydozy. P186. Badania wpływu estrów kwasu ftalowego [ftalan dibutylu i ftalan di(2-etyloheksylu)] na gonady samców myszy laboratoryjnych testem kometowym oraz testem anomalii plemnikowych. Ewa Tyrkiel, Małgorzata Dobrzyńska, Urszula Mikulska Państwowy Zakład Higieny – Instytut Naukowo-Badawczy Polskie Towarzystwo Genetyczne Estry kwasu ftalowego należą do grupy związków chemicznych, które ze względu na szerokie zastosowanie i powszechne występowanie w środowisku człowieka, cieszą się szczególnym zainteresowaniem. Znajdują one przede wszystkim zastosowanie jako plastyfikatory przy produkcji polichlorku winylu.Tworzywa sztuczne, które mogą zawierać do 50% wagowych ftalanów, stosowane są w praktyce biomedycznej, stomatologii,farmacji, używane są do produkcji zabawek dla dzieci oraz opakowań do żywnosci. Ftalany znajdują też zastosowanie jako rozpuszczalniki. Przedmiotem niniejszych badań były: ftalan di(2-etyloheksylu /DEHP/ i ftalan dibutylu /DBP/). Związki te charakteryzują się stosunkowo niską toksycznością dla zwierząt: DEHP ( myszy– 33,5 g/kg m.c., szczury – 30,6 g/kg m.c.), DBP (szczury – 8-20 g/kg m.c., myszy – 5-16 g/kg m.c.). Obydwa ftalany wykazują działanie teratogenne i embrioletalne. DEHP, jak wykazano w dotychczas wykonanych badaniach, nie wywiera bezpośredniego działania na DNA. Niemniej jednak stwierdzono, że przy wysokich dawkach związek ten indukuje dominujące mutacje letalne w komórkach rozrodczych u samców myszy, oraz prowadzi do aneuploidalności w komórkach chomika chińskiego (badania na hodowlach komórkowych). Brak natomiast jednoznacznych danych dotyczących oddziaływania DBP na materiał genetyczny zwierząt. W prezentowanych badaniach oceniano oddziaływanie DEHP i DBP na gonady i komórki rozrodcze samców myszy laboratoryjnych stosując test kometowy oraz test anomalii plemnikowych. Test kometowy używany jest do oceny uszkodzeń DNA, może też być przydatny przy ocenie procesów apoptozy. Test anomalii plemnikowych jest testem niespecyficznym określającym zmiany w morfologii plemników. Zmiany te mogą być spowodowane zarówno uszkodzeniami w materiale genetycznym, zaburzeniami w procesach podziałowych komórek, jak i zakłóceniami procesów dojrzewania spermatyd. Badane związki podawano przez 8 tygodni per os sondą dożołądkowo w dawkach stanowiących wartosci ułamkowe wyznaczonej doustnej toksyczności ostrej LD50 . Otrzymane wyniki wskazują na nieznaczny wzrost częstości komet przy najwyższej dawce DEHP (8000 mg/kg m.c.), oraz odsetka plemników o zmienionej morfologii Stwierdzono też obniżenie ciężaru gonad zarówno przy podawaniu zwierzętom DEHP jak i DBP. 149 Genetyka zwierząt P187. Polimorfizm genu białka szoku termicznego hsp 70-1 bydła. Emilia Pers, Tatiana Adamowicz, Dorota Lechniak Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza w Poznaniu, ul. Wołyńska 33, 60-637 Poznań Białko szoku termicznego jest białkiem opiekuńczym powstającym w warunkach stresu termicznego. Zapobiega ono denaturacji białek komórkowych pod wpływem czynników stresowych. Do tej pory opisano zaledwie jedno miejsce polimorficzne typu SNP (single nucleotide polymorphism) w pozycji 238 sekwencji regulatorowej 3’UTR bydlęcego genu hsp 70-1. Celem badań było ustalenie frekwencji poszczególnych form genotypowych pod względem opisanej wcześniej mutacji A → G w pozycji 238 oraz poszukiwanie nowych mutacji we wspomnianym fragmencie tego genu. Badaniami objęto 200 osobników kilku ras bydła (ncbxhf, limousine, białogrzbiete, zebu, hereford, charolaise, angus). Poszczególne genotypy (AA, AG, GG) identyfikowano za pomocą enzymu AluI, a ich frekwencja była następująca: AA – 0.97, AG – 0.025 i GG – 0.005. Fragment sekwencji regulatorowej poddano również analizie SSCP przy użyciu automatycznego sekwenatora AlfExpress. Zidentyfikowano nowe miejsce polimorficzne w analizowanym fragmencie (pozycje nukleotydów od 8 pz do 161 pz) polegające na transwersji G → T oraz opracowano test RFLP umożliwiający identyfikację nowej mutacji. Analiza restrykcyjna dała możliwość rozróżnienia dwóch alleli: G oraz T, a tym samym trzech genotypów GG, GT oraz TT. W badanej populacji obejmującej po 10 zwierząt ras ncbxhf, białogrzbiete, limousin oraz 8 osobników zebu stwierdzono następujące frekwencje genotypów: GG – 0.71, GT – 0.26 i TT – 0.03. Niska frekwencja zmutowanych alleli w przypadku obu analizowanych mutacji odcinka 3`UTR genu hsp 70-1 świadczy o wysokim konserwatyzmie genetycznym badanej sekwencji. P188. Przypadek polimelii u cielęcia. Krzysztof Urbaniak (2), Paweł Antosik (2), Jędrzej M. Jaśkowski (2), Hieronim Frąckowiak (3), Joanna Nowacka (1), Marek Świtoński (1) (1) Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza Poznań, ul. Wołyńska 33, 60-637 Poznań (2) Katedra Weterynarii Rolniczej, Akademia Rolnicza Poznań, ul. Wojska Polskiego 52, 60-625 Poznań (3) Katedra Anatomii Zwierząt AR w Poznaniu, ul. Wojska Polskiego 28, 60-637 Poznań Cielę płci żeńskiej, z czterema prawidłowymi kończynami i jedną dodatkową umiejscowioną między łopatkami urodziło się w lipcu 2003 roku. Poród przebiegł prawidłowo, mimo iż ciąża trwała tylko 310 dni. Urodzeniowa masa ciała była w normie. Dodatkowa kończyna była mniejsza, zgięta w stawie garstkowym, zakończona parzystymi racicami i zwieszona na prawym boku zwierzęcia. Jej obecność nie upośledzała ruchu, a badanie palpacyjne wykazało, że jest ona na trwałe umocowana do łopatki. Kończynę usunięto chirurgicznie i przekazano do badań anatomicznych. Analiza cytogenetyczna zwierzęcia wykazała obecność prawidłowego kariotypu – 60,XX. Jednakże w 28% metafaz (28/100) zaobserwowano liczne pęknięcia różnych chromosomów (od 1 do 3 w metafazie). Analiza rodowodu nie wykazała zinbredowania. Polimelia jest rzadko obserwowaną wrodzoną wadą rozwojową bydła. W minionych trzech latach opisano na świecie dwa takie przypadki – jeden w Szwajcarii u jałówki rasy holsztyńsko-fryzyjskiej oraz drugi w Japonii u buhajka koreańskiej rasy rodzimej. P189. Zaburzenia koniugacji chromosomów płci w spermatocytach samców myszy. Jarosław Sosnowski (1) Magdalena Obarzanek-Fojt (1), Zbigniew Polański (2) (1) Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza w Poznaniu, ul. Wołyńska 33, 60-637 Poznań, e-mail: [email protected] (2) Max-Planck Institute of Immunobiology in Freiburg, Department of Developmental Biology, Stübeweg 51, 79108 Freiburg, Niemcy Występowanie uniwalentów w trakcie przebiegu gametogenezy opisywano u wielu gatunków ssaków. U samców myszy występowanie uniwalentów dotyczy głównie chromosomów płci i może osiągać zróżnicowany poziom w różnych szczepach. Jak dotąd nie jest jasne czy przyczyną tej anomalii jest brak koniugacji chromosomów X i Y czy też ich przedwczesna dysocjacja przed zainicjowaniem anafazy I mejozy (AI). Celem niniejszych badań było porównanie częstości występowania uniwalentów chromosomów płci w spermatocytach samców trzech szczepów wsobnych myszy: CBA, C57/BL oraz SV 129. Z jąder samców (4-5 osobników/szczep) wykonano preparaty uwidaczniające kompleksy synaptonemalne (SC) w stadium pachytenu profazy mejotycznej, oraz uwidaczniające chromosomy w stadium metafazy I (MI). Wykazano, że poziom występowania uniwalentów chromosomów płci w spermatocytach w stadium 150 Genetyka zwierząt MI różni się znacznie pomiędzy szczepami i wynosi odpowiednio: C57/BL – 8.4%, CBA – 17.9% oraz SV129 – 24.9%. Analiza preparatów w mikroskopie świetlnym, uwidaczniających kompleksy synaptonemalne wykazała, że częstość występowania zjawiska braku koniugacji chromosomów płci wynosi odpowiednio: C57/BL – 2.8%, CBA – 9,7% oraz SV129 – 4.2%. W świetle powyższego można wnioskować, że występowanie uniwalentów w MI jest skutkiem ich przedwczesnego rozłączenia, a nie brakiem koniugacji w zygotenie. *J. Sosnowski prowadził badania w ramach stypendium dla młodych doktorów przyznanego w 2001 roku przez Fundację na Rzecz Nauki Polskiej (FNP) Wyklad plenarny: W86. Gene expression in embryos Jaana Peippo MTT Agrifood Research Finland, Animal Production Research, Animal Breeding, FI-31600 Jokioinen, FINLAND Developmental kinetics is an important tool for evaluating embryo viability. Zygotes that cleave early for the first time are the ones most likely to reach the blastocyst stage. Blastulation is necessary to establish the first two differentiated cell lines within an embryo, the inner cell mass and the trophectoderm, which contribute to the embryo and the extraembryonic membranes, respectively. These events are controlled by precise expression of different genes during preimplantation development. After fertilisation, the first cleavages of a zygote are supported by maternally inherited RNA and protein reservoirs established during oocyte maturation. The timing of transition from the maternal to the embryonic control of the development is species– specific. In cattle, a minor activation of the embryonic genome occurs at the one to two-cell stage, followed by the major activation at the eight to 16-cell stage. In terms of viability, the in vivo produced embryos are superior to their in vitro produced counterparts, which, however, are not a homogenous group either as, for example, the in vitro production protocol itself affects the embryo quality. Embryos adjust their gene expression to the culture environment, which may also be used as a tool to improve embryo production protocols. When comparing the gene expression patterns of the in vivo and the in vitro produced embryos, differences can be recognised and analysed. Techniques like Suppressive subtractive hybridisation and Micro array offer efficient tools to carry out such comparisons as thousands of genes can be analysed at the same time. Dziedziczenie wielogenowe Komunikaty ustne: W87. Wpływ mutacji K232A w genie acylotransferazy diacyloglicerolowej 1 (DGAT1) na wartość hodowlaną buhajów dla cech mleczności. Jolanta Komisarek (1), Joanna Szyda (2), Zbigniew Dorynek (1) (1) Katedra Hodowli Bydła, Akademia Rolnicza im. A. Cieszkowskiego w Poznaniu, ul. Wojska Polskiego 71A, 60-625 Poznań (2) Katedra Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza we Wrocławiu, ul. Kożuchowska 7, 51-631 Wrocław Trójglicerydy (triacyloglicerole) stanowią główną frakcję (ponad 98 %) związków tłuszczowych mleka. Szlak ich syntezy rozpoczyna się najczęściej od 3-fosfoglicerolu, którego acylacja prowadzi do powstania kwasu fosfatydowego. W wyniku przekształceń kwasu fosfatydowego powstają diacyloglicerole, a następnie trójglicerydy. Acylotransferaza diacyloglicerolowa 1 (DGAT1) jest jednym z dwóch znanych enzymów katalizujących ostatni etap syntezy 151 Genetyka zwierząt triacylogliceroli. U bydła, locus DGAT1 zlokalizowany jest na chromosomie 14. Jedna z jego mutacji, określana jako K232A, polega na dwunukleotydowym podstawieniu AA –> GC w obrębie eksonu 8. Skutkiem tego, w pozycji 232 białkowego produktu genu, w miejsce lizyny pojawia się alanina. Celem pracy było określenie wpływu polimorfizmu K232A na wartość hodowlaną buhajów reprodukcyjnych dla wydajności mleka, białka i tłuszczu oraz procentowej zawartości białka i tłuszczu w mleku. Badaniami objęto 147 osobników rasy holsztyno-fryzyjskiej. Genotypy identyfikowano metodą PCR-RFLP. Zastosowany model statystyczny zawiera stały efekt DGAT1 oraz losowy efekt addytywnie poligeniczny. Wpływ analizowanego polimorfizmu oszacowano stosując metodę najwyższej wiarogodności, w oparciu o model statystyczny zawierający: (i) stałe efekty reprezentujące sezon-rok oceny oraz DGAT1, (ii) losowy efekt addytywnie poligeniczny buhaja z macierzą (ko)wariancji reprezentowana przez macierz spokrewnień addytywnie poligenicznych i komponent wariancji addytywnie poligenicznej oraz (iii) losowy efekt błędu z macierzą (ko)wariancji reprezentowaną przez diagonalną macierz zawierająca odwrotności liczby córek wykorzystanych do oceny buhaja i komponent wariancji błędu. Wartości obu komponentów przyjęto odpowiednio jako 30% i 70% całkowitej wariancji. W analizowanej populacji frekwencja allelu K kodującego lizynę oraz A kodującego alaninę wynosiła odpowiednio 0.66 i 0.34. Badania finansowane przez KBN (grant 2 P06D 017 26). W88. Identyfikacja loci chromosomowych kontrolujących parametry ruchu plemników w oparciu o analizę wsobnych szczepów rekombinacyjnych u myszy. Aniela Gołas, Paweł Grzmil, Józefa Styrna Zakład Genetyki i Ewolucjonizmu, Instytut Zoologii Uniwersytetu Jagiellońskiego, ul. Ingardena 6, 30-060 Kraków Rekombinacyjne szczepy wsobne myszy zyskują coraz większe uznanie w analizie genów wpływających na cechy ilościowe. Zakład Genetyki i Ewolucjonizmu prowadzi od lat hodowlę takich szczepów wyprowadzonych ze szczepów wsobnych KE i CBA/Kw znacznie różniących się parametrami płodności. Szczepy te są wykorzystywane m.in. do lokalizacji genów zaangażowanych w kontrolę jakości gamet. Dzięki zastosowaniu metody komputerowo wspomaganego systemu analizy jakości plemników (CASA) scharakteryzowano parametry ruchliwości plemników dla samców z poszczególnych rekombinacyjnych szczepów wsobnych (RI EXCB i RI CBXE). W celu zlokalizowania genów kontrolujących ruch plemników dla 11 chromosomów ustalono SDP czyli wzór rozkładu markerów mikrosatelitarnych, którymi różnią się między sobą szczepy wyjściowe. Znaleziono 86 loci różnicujących rekombinacyjne szczepy wsobne a średnia odległość między markerami na chromosomie wynosi 7 cM. Wykazano, że BCF (liczba przemieszczeń główki plemnika z trajektorią średniego śladu) jest kontrolowany przez region 7q11, VSL (droga przebyta przez plemnik ruchem prostoliniowym w jednostce czasu) jest kontrolowany przez 15q22 oraz 12q48 i VAP („wygładzona” droga przebyta przez plemnik w jednostce czasu) jest kontrolowany przez 12q48 (p<0,001 dla wszystkich uzyskanych korelacji). Analiza tych regionów pozwoliła na wytypowanie potencjalnych genów – kandydatów na geny kontrolujące parametry ruchliwości plemników. Praca finansowana z grantu BW/IZ/17a/2003 W89. Dziedziczenie cech behawioralnych w teście otwartego pola w liniach myszy wyprowadzonych z F2 (samica C x samiec L). Elżbieta Wirth-Dzięciołowska, Marta Gajewska, Anna Łuczyszyn Katedra Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierząt, Wydział Nauk o Zwierzętach, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, ul. Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa W wyniku prowadzonej przez 113 pokoleń selekcji ukierunkowanej na zmianę masy ciała uzyskano dwie linie myszy, które zróżnicowały się również pod względem cech behavioralnych. Myszy ciężkie (C) są bardziej aktywne w teście otwartego pola, popełniają mniej błędów w teście labiryntu i wymagają mniej czasu na jego pokonanie niż myszy lekkie (L). Różnice te są statystycznie wysoko istotne. W celu określenia dziedziczenia cech behavioralnych przeprowadzono kojarzenie do F2. Wszystkie zwierzęta przetestowano w teście otwartego pola (OF).Następnie z pokolenia drugiego wybrano dwie grupy zwierząt; 15 samic i samców charakteryzujących się wysoką aktywnością oraz podobną liczbę zwierząt o niskiej aktywności. Różnice między oboma grupami były statystycznie wysoko istotne. Potomstwo uzyskane w grupie zwierząt aktywnych (A) i nieaktywnych (B) różni się między sobą istotnie wzorem zachowań w teście OF. Myszy z grupy A są prawie dwa razy aktywniejsze niż myszy z grupy B. W obu grupach zwierząt stwierdzono wyraźne różnice w aktywności osobników obu płci. Samce są aktywniejsze niż samice zarówno pod względem zachowań eksploracyjnych w OF jak i liczby stójek. Stwierdzono pozytywne koleracje między masą ciała i aktywnością zwierząt. 152 Genetyka zwierząt W90. Analiza efektów matczynych na długość życia wybranych gatunków zwierząt utrzymywanych w ogrodach zoologicznych. Anna Wolc, Anna Feder, Anna Waśniewska, Tomasz Sternicki, Tomasz Szwaczkowski Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu, ul. Wołyńska 33, 60-637 Poznań Długość życia jest cechą podstawową dla istnienia gatunku, co jest szczególnie ważne w odniesieniu do hodowli i restytucji gatunków zagrożonych wyginięciem. Jest ona uwarunkowana zarówno przez czynniki genetyczne jak i środowiskowe. Badania prowadzone na niektórych gatunkach zwierząt gospodarskich wskazują, że przeżywalność osobnika, zwłaszcza w pierwszych dniach może być w znacznym stopniu uwarunkowana przez matkę. Celem pracy była ocena wpływów matczynych genetycznych na długość życia trzech gatunków zwierząt utrzymywanych w ogrodach zoologicznych (oryksa arabskiego, konia Przewalskiego i jelenia Dawida), które w swej historii przeszły przez załamanie liczebności. Analiza objęto 1829 oryksów arabskich, 2083 konie Przewalskiego oraz 422 jelenia Dawida. Dane pochodzą z Międzynarodowego Systemu Informacji o Gatunkach (ISIS). Parametry genetyczne szacowano na podstawie modelu zwierzęcia uwzględniając efekty stałe: płci, roku, miejsca urodzenia oraz efekty losowe: genetyczny addytywny, genetyczny matczyny, kowariancję między efektem genetycznym bezpośrednim i matczynym. Do analizy użyto pakietu DFREML. Niskie estymatory odziedziczalności bezpośredniej (<0.06) uzyskane dla populacji konia Przewalskiego i oryksa arabskiego sugerują znaczny wpływ czynników środowiskowych na kształtowanie analizowanej cechy (współczynnik ten dla jelenia Dawida wyniósł 0.35). Jednak pewne niedoszacowanie parametrów może także wynikać z rozkładu długości życia odbiegającego od normalnego (bardzo wysoka śmiertelność w pierwszych dniach) oraz ograniczonych liczebności badanych populacji. Natomiast powtarzalne wartości oszacowania wariancji genetycznej matczynej na poziomie kilku procent ogólnej zmienności fenotypowej potwierdzają istnienie wpływu matki na długość życia potomstwa. Uzyskano ujemne zależności między efektami genetycznymi bezpośrednimi i matczynymi dla konia Przewalskiego i jelenia Dawida. Natomiast dla oryksa arabskiego zależności (chociaż dodatnie) te były bardzo bliskie zeru. Mimo podobnej historii wszystkich trzech gatunków (odbudowanie obecnej populacji od niewielkiej liczby założycieli), przeprowadzone badania wskazały na ich znaczne genetyczne zróżnicowanie. W91. DNA fingerprinting linii królików selekcjonowanych na aktywność w otwartym polu. Mariusz Sacharczuk, Kazimierz Jaszczak, Tadeusz Jezierski, Rafał Parada, Aleksandra Górecka Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN w Jastrzębcu DNA fingerprinting wykrywa wiele fragmentów DNA, które są dziedziczone wzorem Mendla. Te wysoko polimorficzne fragmenty DNA wywodzą się z minisatelitarnych loci, które są rozproszone na większości chromosomów. Dlatego DNA fingerprinting jest wysoce skuteczną metodą w identyfikacji osobników oraz w określaniu struktury genetycznej populacji i podobieństwa między populacjami. Przy pomocy tej techniki przeprowadzono badania na liniach królików selekcjonowanych rozbieżnie przez 8 pokoleń w kierunku wysokiej (H) i niskiej (L) aktywności w otwartym polu. Analizę zmienności pomiędzy liniami wykonano na mix-ach otrzymanych z wymieszania równej ilości DNA 10-ciu osobników, natomiast stopień zmienności wewnątrz linii określono na podstawie wzorów prążkowych 4 osobników indywidualnych każdej z linii. Zastosowano enzym restrykcyjny HinfI i sondę molekularną 33.6. Stopień zmienności wewnątrzliniowej nie różnił się statystycznie pomiędzy liniami i wynosił odpowiednio 0,7701 i 0,7478 u linii H i L. Na podstawie analizy reprezentacyjnego DNA (10 osobników w każdej linii) stwierdzono obecność prążka ( o m.cz. ok. 15 tys. pz), charakterystycznego tylko dla linii L. Największa zmienność charakteryzowała minisatelity o długości 17-20 tys. pz. Wskaźnik zmienności genetycznej między obiema liniami wynosił 0,7143, natomiast dystansu genetycznego 0,3262. Wystąpienie różnic w obrazie DNA fingerprinting świadczy o powstaniu zróżnicowania genetycznego między selekcjonowanymi liniami królików, a obecność prążka markerowego w linii L o możliwości sprzężenia loci minisatelitarnych z genem (-ami), które determinują selekcjonowaną cechę aktywności w otwartym polu. 153 Genetyka zwierząt Komunikaty plakatowe: P190. Badania nad parametrami genetycznymi cech pokroju u wybranych odmian barwnych norek (Mustela vison Sch.). Dorota Kołodziejczyk, Stanisław Socha Zakład Metod Hodowlanych i Hodowli Zwierząt Futerkowych, Akademia Podlaska, ul. B. Prusa 12, 08-110 Siedlce W okresie 3 lat badaniami objęto fermę hodowlaną norek znajdującą się w Południowo-Wschodniej Polsce. W fermie były następujące odmiany barwne norek: standardowa, pastelowa, biała Hedlunda, szafirowa. Celem pracy było szacowanie wskaźników odziedziczalności oraz korelacji genetycznych, fenotypowych i środowiskowych cech pokroju norek – cech ocenianych podczas jesiennych licencji, w okresie pełnej dojrzałości okrywy włosowej. Wartości wskaźników odziedziczalności cech kształtowała się na zróżnicowanym poziomie, najwyższą wartość uzyskała jakość okrywy (w tym długość i gęstość włosów) 0,613. Odziedziczalność pozostałych cech kształtowała się następująco: wielkość zwierząt (wyrażona w gramach) 0,205, wielkość norek wyrażona w punktach 0,279, czystość barwy 0,419 i łączna suma punktów 0,384. Istniejąca zmienność genetyczna w stadzie norek jest jednym z warunków uzyskania postępu hodowlanego i poprawę wartości użytkowej zwierząt. Korelacje genetyczne wahały się od –0,200 do 0,668. Wysokie korelacje wystąpiły pomiędzy łączną sumą punktów a poszczególnymi cechami: wielkością zwierząt (wyrażoną w punktach) 0,609, czystością barwy 0,668, i jakością okrywy włosowej 0,355. Ujemne korelacje genetyczne stwierdzono: pomiędzy wielkością norek a jakością okrywy (-0,200), oraz pomiędzy czystością barwy a jakością okrywy (-0,198). Korelacje fenotypowe w porównaniu z genetycznym były w węższym przedziale: od –0,071 (pomiędzy wielkością a jakością okrywy) do 0,640 (pomiędzy wielkością a łączną sumą punktów). Wysoka i istotna zależność pomiędzy wielkością norek a łączną sumą punktów świadczy o znaczącym wpływie tej cechy na ocenę łączną. Korelacje środowiskowe w stadzie norek wahały się od –0,199 (wielkością zwierząt a czystością okrywy) do 0,661 (wielkością norek a łączną sumą punktów). P191. Porównanie wzorów zachowań myszy selekcjonowanych na zmianę masy ciała i ich potomstwa z pokolenia F1 i F2. Elżbieta Wirth-Dzięciołowska, Marta Rybicka Katedra Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierząt, Wydział Nauk o Zwierzętach, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, ul. Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa W wyniku prowadzonej przez 113 pokoleń selekcji w kierunku zmiany masy ciała myszy uzyskano dwie linie; lekką (L) o średniej masie ciała 20g i ciężką (C) o średniej masie ciała 40g. Myszy te zróżnicowały się pod względem wielu cech fizjologicznych a także pod względem cech behavioralnych. Myszy L są mniej aktywne w teście otwartego pola (OF), popełniają więcej błędów w teście labiryntu i wymagają więcej czasu na jego pokonanie niż myszy ciężkie. Różnice te są statystycznie wysoko istotne. W celu określenia dziedziczenia cech behavioralnych przeprowadzono kojarzenie do F2 między samicami linii C i samcami linii L. Zwierzęta pokolenia rodzicielskiego, F1 i F2 przetestowano testem OF. Analizowano aktywność zwierząt określaną liczbą pokonanych pól w jednostce czasu, liczbą stójek a także oceniano zachowania świadczące o reakcji stresowej takie jak; grooming, defekacja i urynacja. Myszy L miały inny wzór eksploatacji OF i aktywności niż myszy C. Miały również większą liczbę groomingów, defekacji i urynacji. Stwierdzono nieco inny wzór zachowań samców i samic w obu liniach rodzicielskich. W pokoleniach F1 i F2 również występowały istotne różnice we wzorach zachowań samców i samic. Stwierdzono, że większość analizowanych cech ma charakter cech ilościowych. W przypadku aktywności liczonej liczbą pokonanych pól wystapil wyraźny efekt heterozji. P192. Parametry genetyczne plenności w populacji koni pełnej krwi angielskiej. Anna Bresińska, Anna Wolc, Laura Wachowska, Tomasz Szwaczkowski Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu, ul. Wołyńska 33, 60-637 Poznań Ciąże mnogie stanowią poważny problem ekonomiczny w hodowli koni pełnej krwi angielskiej, gdyż występują tam ze zwiększoną częstością. Przyczyniają się do strat wynikających z poronień i niższej wartości użytkowej źrebiąt. Celem 154 Genetyka zwierząt pracy było oszacowanie odziedziczalności i powtarzalności oraz trendów genetycznych i środowiskowych plenności koni pełnej krwi angielskiej. Badaniami objęto wyniki rozpłodowe 2033 klaczy urodzonych w latach 1929-1993 w jedenastu stadninach. Plenność definiowano jako liczbę urodzonych w sezonie źrebiąt włączając jałowość (plenność I) oraz pomijając ją (plenność II). Parametry genetyczne szacowano na podstawie modelu zwierzęcia uwzględniając efekty stałe: stadniny i roku urodzenia klaczy oraz efekty losowe: genetyczny addytywny i środowiskowy trwały. Analizę danych przeprowadzono stosując algorytm AI-REML. Ciąże bliźniacze wystąpiły u 368 klaczy, natomiast trojacze u 2, co łącznie stanowi 2.7% badanej populacji. Estymatory współczynników odziedziczalności kształtowały się następująco: 0.019 (plenność I) oraz 0.016 (plenność II). Natomiast powtarzalność wynosiła 0.026 (plenność I) i 0.031 (plenność II). Generalnie, oszacowania obu parametrów były bliskie zeru. Koresponduje to z wcześniejszymi badaniami przeprowadzonymi przez autorów w odniesieniu do populacji koni pełnej krwi angielskiej, jak również z wynikami uzyskanymi dla plenności bydła. Uzyskane niskie estymatory odziedziczalności mogą być zarówno wynikiem znacznego wpływu czynników środowiskowych na kształtowanie analizowanej cechy, jak i jej rozkładu odbiegającego od normalnego. Trendy genetyczne i fenotypowe są nieujemne, występują jednak duże fluktuacje. Może to wiązać się z wprowadzeniem do rozrodu określonych osobników męskich, co z kolei sugeruje segregację pojedynczego genu determinującego tę cechę. P193. Poziom inbredu w populacji Panthera uncia. Tomasz Sternicki, Tomasz Szwaczkowski Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt Akademii Rolniczej im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu, ul. Wołyńska 33, 60-637 Poznań Głównym celem badań było określenie poziomu zinbredowania i jego zmian w populacji pantery śnieżnej (Panthera uncia), utrzymywanej w ogrodach zoologicznych oraz innych populacjach zamkniętych. Spośród wielu przedstawicieli dzikich kotów, Panthera uncia jako jedna z nielicznych należy do gatunku, którego hodowla prowadzona jest według ścisłych programów restytucyjnych. Placówki hodowlane, mając do dyspozycji ograniczone liczebnie grupy, z konieczności kojarzą osobniki w bliskim pokrewieństwie, co w konsekwencji prowadzi do wzrostu poziomu zinbredowania. To z kolei zubaża pulę genową populacji, przyczyniając się do ujawnienia się depresji inbredowej, szczególnie w odniesieniu do tzw. cech przystosowawczych. Analizą objęto dane rodowodowe (pochodzące z Międzynarodowego Systemu Informacji o Gatunkach – ISIS) dotyczące 2080 osobników urodzonych w latach 1915-2003. Po dokonaniu selekcji danych, z obliczeń wyeliminowano informacje o osobnikach z niekompletnymi rodowodami. Tak więc, bazując na macierzy spokrewnień addytywnych, współczynniki inbredu oszacowano dla 1709 osobników. Generalnie, średni poziom wzrostu homozygotyczności w badanej populacji był niski (1.22%). Wykazywał jednak stosunkowo duże zróżnicowanie. Największe wartości współczynników inbredu odnotowano dla grupy 29 osobników urodzonych w latach 1971-79. Poziom inbredu tej grupy osobników osiągnął 25%. W kolejnych latach odnotowano tendencję spadkową. P194. Parametry genetyczne udziału jaj pękniętych w kolejnych okresach nieśności. Anna Wolc (1), Małgorzata Twardowska (1), Tomasz Szwaczkowski (2) (1) Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt Akademii Rolniczej w Poznaniu (2) Centrum Hodowli Zarodowej MESSA w Mieni Występowanie jaj pękniętych i uszkodzonych stanowi poważny problem ekonomiczny w produkcji drobiarskiej. Pęknięcie jaja jest wypadkową wielu czynników (grubość i struktura skorupy, masa jaja) mających zarówno podłoże genetyczne jak i środowiskowe. Celem pracy było oszacowanie współczynnika odziedziczalności procentu jaj pękniętych w miesięcznych okresach nieśności. Analizowano dane 932 kur rasy Rhode Island ze stadek selekcyjnych utrzymywanych w Centrum Hodowli Zarodowej MESSA w Mieni. Średni udział jaj pękniętych wynosił 1% (wahając się od 0.26-2.77%). Parametry genetyczne szacowano na podstawie wielocechowego modelu zwierzęcia. Obliczenia wykonano stosując pakiet DFREML. Dla całego badanego okresu uzyskano niski estymator odziedziczalności h2 =0.1. W poszczególnych miesiącach współczynnik ten przyjmował wartości od 0.01 do 0.08. Od 9 miesiąca nieśności zaznaczyła się dla odziedziczalności tendencja rosnąca. Korelacje genetyczne z nieśnością w poszczególnych okresach były ujemne (zawierając się w przedziale od –0.88 do –0.19) z wyjątkiem miesiąca czwartego (0.29). Sugeruje to możliwość obniżania udziału jaj uszkodzonych z jednoczesnym zwiększaniem ich produkcji. 155 Genetyka zwierząt P195. Aktywność LDH, AspAT i AlAT w surowicy krwi osobników rodzicielskich i pokolenia F1 wybranych ras owiec. Jolanta Rysińska (1), Hanna Stępkowska (1), Tadeusz Rychlik (2) (1) Zakład Genetyki, Instytut Biologii, Akademia Świętokrzyska, Kielce (2) Zakład Immunologii i Cytogenetyki, Instytut Zootechniki w Balicach k/Krakowa Do doskonalenia populacji przydatne są te zależności między cechami, które mają istotne znaczenie ekonomiczne i te, które powodują, że selekcja na jedną z tych cech wpływa pozytywnie na inną. Celem eksperymentu było zbadanie, w jaki sposób zachodzi dziedziczenie aktywności LDH, AspAT i AlAT w surowicy krwi wybranych ras owiec. Materiał do badań stanowiła surowica krwi 153 osobników rodzicielskich i pokolenia F1 owiec ras czarnogłówka, leine, merynos polski, charollais i mieszańców międzyrasowych. Analiza statystyczna wyników wskazuje, że różnice w aktywności LDH, AspAT i AlAT dla matek i ojców były istotne statystycznie. Podobny wynik uzyskano porównując aktywność enzymów ojców i dzieci. Natomiast różnice w aktywności analizowanych enzymów dla matek i dzieci okazały się nieistotne statystycznie. Przedstawione wyniki doświadczenia mogą wskazywać na większy wpływ genetyczny matki niż ojca na obserwowaną u ich potomstwa aktywność LDH, AspAT i AlAT w surowicy krwi. P196. Model wielocechowy w ocenie parametrów genetycznych nieśności miesięcznych i kumulowanych kur. Anna Wolc (1), M. Lisowski (2), T. Szwaczkowski (1) (1) Katedra Genetyki i Podstaw Zwierząt, Akademii Rolniczej im. A. Cieszkowskiego w Poznaniu (2) Oddział Badawczy Drobiarstwa Instytutu Zootechniki w Zakrzewie Selekcja kur nieśnych w stadach zarodowych w Polsce ukierunkowana jest głównie na zwiększenie liczby jaj. Efektywność pracy hodowlanej determinowana jest w dużym stopniu wczesnością dokonywanej selekcji. Z tego względu ważnym jest określenie odziedziczalności oraz korelacji genetycznych i fenotypowych cząstkowych okresów nieśności. Stanowiło to przedmiot badań niniejszej pracy. Analizie poddano dane użytkowości nieśnej 6646 kur rodu A22 ( Rhode Island White) utrzymywanych w Oddziale Badawczym Drobiarstwa Instytutu Zootechniki w Zakrzewie w latach 1995-1997. Analizowano pierwszych sześć miesięcy nieśności. Parametry genetyczne nieśności miesięcznych i kumulowanych oszacowano metodą AI-REML na podstawie wielocechowego modelu zwierzęcia. Średnie badanej cechy zawierały się w przedziale od 7.9 w miesiącu pierwszym (okres wchodzenia w nieśność) do 27.1 w miesiącu trzecim (szczyt nieśności). Największym współczynnikiem zmienności charakteryzował się pierwszy miesiąc (94.1%). Dla tego okresu oszacowano także najwyższy udział wariancji genetycznej w wariancji fenotypowej h2 = 0.43. Na podstawie nieśności kumulowanych można zaobserwować, że w miarę wydłużania okresu oceny współczynnik odziedziczalności obniżał się, co wynika z niższego niż w przypadku wariancji fenotypowej wzrostu wariancji genetycznej addytywnej. P197. Parametry genetyczne cech reprodukcyjnych zwierząt futerkowych. Stanisław Socha, Dorota Kołodziejczyk, Aldona Gontarz Zakład Metod Hodowlanych i Hodowli Zwierząt Futerkowych, Akademia Podlaska, ul. B. Prusa 12, 08-110 Siedlce W pracy oszacowano wskaźniki powtarzalności podstawowych cech reprodukcyjnych: liczby urodzonych i odchowanych młodych oraz korelacie pomiędzy tymi cechami a cechami jakości okrywy włosowej. Badaniami objęto populację norek, lisów polarnych i pospolitych oraz szynszyli. Najwyższą plennością charakteryzowały się samice w 2 i 3 roku użytkowania. Do zdecydowanego natomiast zmniejszenia plenności doszło po 4 roku użytkowania samic. Wskaźnik powtarzalności liczby urodzonych młodych w stadzie norek wynosił 0,150, u lisów polarnych 0,187, pospolitych 0,190 i szynszyli 0,157. Wskaźniki powtarzalności odchowanych młodych były natomiast następujące: norek 0,12, lisów pospolitych 0,228, lisów polarnych 0,167 oraz szynszyli 0,180. Uzyskane wartości wskazują, że cechy związane z rozrodem zwierząt – w tym z rozrodem zwierząt futerkowych – są w decydującej stopniu zależne od czynników środowiskowych. Tym niemniej długotrwała selekcja prowadzona w stadach tych zwierząt daje pożądane efekty. Z kolei oszacowane korelacje zarówno fenotypowe, jak również genetyczne pomiędzy cechami reprodukcyjnymi a cechami okrywy włosowej były ujemne. Niskie były korelacje pomiędzy plennością samic a liczebnością miotu, z którego pochodziły. Zmienność cech mierzona wielkością współczynników zmienności wahała się – w zależności od gatunku zwierząt i roku użytkowania samic –od około 20 do 50%. Istniejąca zmienność fenotypowa cech ma swoje uwarunkowanie w założeniach 156 Genetyka zwierząt genetycznych zwierząt, umożliwiających osiąganie postępu hodowlanego w zakresie cech reprodukcyjnych. Pomimo prowadzonej długotrwałej selekcji zmienność cech reprodukcyjnych pozostaje w dalszym ciągu na wysokim poziomie. 157 Notatki 158 Genetyka roślin W92. Splicing intronów typu U12 (AT-AC) u roślin Artur Jarmołowski Zakład Ekspresji Genów, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu Splicing pre-mRNA, czyli proces wycinania intronów i precyzyjnego łączenia ze sobą sekwencji kodujących zwanych egzonami, jest jednym z kluczowych etapów ekspresji genów u wyższych eukariontów; ekspresja wielu genów kodujących białka może być kontrolowana na tym właśnie etapie. Regulacji może podlegać wybór miejsc splicingowych, a także sama wydajność procesu. Prowadzi to do powstania wielu różnych wariantów białek pochodzących z jednego genu, co znacznie zwiększa pojemność genetyczną genomów ekariotycznych. Geny kodujące białka zawierają dwie klasy intronów. Pierwsza z nich, to tak zwane introny typu U2 (inaczej introny zależne od snRNP U2), powszechnie występujące w eukariotycznych genomach jądrowych. Stanowią one zwykle ponad 99,5 % wszystkich zidentyfikowanych sekwencji interweniujących. Druga klasa, to introny typu U12 (inaczej zależne od snRNP U12, dawniej nazywane również intronami ATAC); występują one w pre-mRNA sporadycznie a ich liczba nie przekracza zwykle 0,5 % wszystkich intronów. Obie klasy intronów wycinane są z pre-mRNA przez dwa różne, skomplikowane kompleksy rybonukleoproteinowe zwane spliceosomami U2 i U12. W przypadku usuwania z prekursorów mRNA intronów typu U2, w procesie uczestniczą: U1, U2, U4, U5 i U6 snRNP. W tworzeniu spliceosomu U12 biorą udział: U11, U12, U4atac, U5 i U6atac snRNP. Jedyną wspólną cząstką snRNP w obu spliceosomach jest U5. Pomimo wyraźnych różnic w budowie spliceosomu U2 i U12, wydaje się, że sama reakcja wycinania intronów obu klas przebiega bardzo podobnie. Pierwszy scharakteryzowany intron U12 wyróżniał się od intronów klasycznych nukleotydami występującymi na jego końcach 5’ i 3’: zamiast klasycznego GT-AG, zaczynał i kończył się dwunukleotydami AT-AC. Dalsze badania wykazały, że nie jest to cecha charakterystyczna intronów tej klasy. O przynależności do intronów U12 świadczy natomiast: zachowawcza sekwencja w miejscu splicingowym 5’ (egzon: G/ATATCCTY), charakterystyczna sekwencja w miejscu rozgałęzienia (TCCTTRAY; miejsce rozgałęzienia podkreślono) oraz znacznie mniej zachowawcza sekwencja w miejscu splicingowym 3’ (YAC/G: egzon). W genomie Arabidopsis thaliana zidentyfikowano do tej pory 165 intronów U12, co stanowi około 0,15% wszystkich intronów występujących u tej rośliny. Do badań wybraliśmy trzy genu rzodkiewnika posiadające, oprócz licznych intronów U2, pojedyncze introny U12. Były to geny: CBP20, GSH2 i LD. Eksperymentalnie przeanalizowaliśmy czynniki wpływające na wydajność splicingu intronów U12 w badanych genach. Wykazaliśmy, że na wydajność splicingu intronów U12 u roślin wpływają: wysoka zawartość AT w sekwencji interweniującej, wydajny splicing sąsiadujących z intronem U12 intronów klasycznych typu U2, oraz swoiste sekwencje wzmacniające splicing występujące w egzonach otaczających intron U12 (ESE, ang. exonic splicing enhancer). Co więcej, wykazaliśmy, że RBP45, białko należące do rodziny polipeptydów wiążących się do RNA o wysokiej zawartości AT, bierze udział w selekcji miejsc splicingowych w roślinnych intronach U12. 159 Genetyka roślin Genetyka molekularna Komunikaty ustne: W93. Mosaic cucumber line MSC16 carries mitochondrial genome rearrangement and shows increased alternative oxidase (AOX) expression. Grzegorz Bartoszewski (1), S. Malepszy (1), M. J. Havey (2) (1) Department of Plant Genetics, Breeding and Biotechnology Warsaw Agricultural University Nowoursynowska 166, 02-787 Warsaw Poland (2) Vegetable Crops Unit, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Dep. of Horticulture, 1575 Linden Drive, University of Wisconsin, Madison, WI 53706, USA The mosaic cucumber line MSC16 phenotype shows slower growth and mosaic type of leaf spots (Malepszy et al 1996) and is associated with complex mitochondrial rearrangements causing DNA deletions and duplications (Bartoszewski et al 2004). Alternative oxidase (AOX), a nuclear-encoded component of the plant respiratory chain, functions to prevent the oxygen free radicals formation. AOX is differentially expressed during normal plant development and in response to stresses. AOX expression is influenced by mitochondrial genome rearrangements (Karpowa et al 2002). Using degenerated primers, we cloned and sequenced conserved regions of the cucumber Aox gene. Southern-blot hybridization revealed a single band suggesting that there is one copy or small Aox multigene family in the cucumber genome. Aox transcript level was increased in leaves and male flowers of MSC16 cucumber as compared with control inbred line B. Immunoblotting of total or mitochondrial proteins with anti-AOX monoclonal antibody showed clearly that AOX is present in leaves and flowers of MSC16 and is almost not delectable in control line B. Our experiments indicate that AOX expression is increased in MSC16 cucumber suggesting that this line is experiencing continuous oxidative stress and AOX expression is probably post-translationally regulated. Bartoszewski G, Malepszy S, Havey MJ 2004 Mosaic (MSC) cucumbers regenerated from independent cell cultures possess different mitochondrial rearrangements Curr Genet 45; 45-53 Karpova OV, Kuzmin EV, Elthon TE, Newton, KJ 2002 Differential expression of alternative oxidase genes in maize mitochondrial mutants. Plant Cell 14; 3271-3284 Malepszy S, Burza W, Smiech M 1996 Characterization of a cucumber (Cucumis sativus L.) somaclonal variant with paternal inheritance. J Appl Genet 37; 65-78 W94. Identyfikacja rodzaju cytoplazmy obecnej w polskich populacjach żyta uprawnego z użyciem krzyżowań testowych i markerów SCAR. Stefan Stojałowski (1), Miłosława Jaciubek (2), Marek Szklarczyk (3) (1) Katedra Genetyki i Hodowli Roślin, Akademia Rolnicza w Szczecinie, Słowackiego 17, 71-434 Szczecin (2) Instytut Fizjologii Roślin im. Franciszka Górskiego, Polska Akademia Nauk, Niezapominajek 21, 30-239 Kraków (3) Katedra Genetyki, Hodowli i Nasiennictwa, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie, 29 listopada 54, 31-425 Kraków Cytoplazmy wywołujące męską sterylność (cms) są powszechnie obecne w populacjach żyta uprawnego. W dotychczas przeprowadzonych badaniach stwierdzano, że zarówno w polskich jak i innych europejskich populacjach żyta z dużą częstotliwością występuje sterylizująca cytoplazma typu cms-V. Dlatego istnieje potrzeba opracowania łatwego i szybkiego sposobu identyfikowania typu cytoplazmy występującej w materiałach hodowlanych. Dotychczas stosowana do tego celu metoda bazuje na ocenie płodności potomstw uzyskiwanych z odpowiednio zaprojektowanej serii krzyżowań i jest określana mianem testu plazmotypu z genotypem. Jej podstawową wadą jest czasochłonność, gdyż do pełnej identyfikacji typu cytoplazmy konieczne jest uzyskanie przynajmniej trzech pokoleń mieszańców. Znacznie 160 Genetyka roślin szybsze i mniej pracochłonne jest zastosowanie techniki markerów molekularnych wykorzystujących PCR. W pracy określono typ cytoplazmy 55 roślin pochodzących z siedmiu aktualnie uprawianych w Polsce odmian populacyjnych żyta. Poza klasycznym testem plazotypu z genotypem w badaniach wykorzystano markery SCAR opracowane ostatnio w ramach współpracy pomiędzy Akademiami Rolniczymi w Krakowie i Szczecinie. Uzyskane przy użyciu obu metod rezultaty identyfikacji cytoplazm były w pełni zgodne. Większość z badanych roślin posiadała cytoplazmę sterylizującą z grupy cms-V. Cytoplazma normalna była obecna tylko u 6 roślin wywodzących się z czterech odmian: Amilo, Hegro, Kier i Walet. W badanej grupie roślin nie stwierdzono obecności cytoplazmy cms Pampa. Uzyskane wyniki, pomimo niewielkiej liczebności analizowanych obiektów, świadczą o wiarygodności rezultatów uzyskiwanych przy zastosowaniu nowo opracowanych markerów molekularnych. W95. Występowanie, organizacja i ekspresja sekwencji chimerycznej z mitochondrialnego DNA form męskosterylnych cebuli. Marek Szklarczyk (1), Katarzyna Sala (1), Katarzyna Walinowicz (1), Beata Rogowska (1), Magdalena Simlat (1), Grażyna Ba (2) i Barbara Michalik (1) (1) Katedra Genetyki, Hodowli i Nasiennictwa, Akademia Rolnicza w Krakowie, Al. 29-go Listopada 54, 31-425 Kraków (2) Instytut Ekspertyz Sądowych, ul. Westerplatte 9, 31-033 Kraków Nasiona mieszańcowe cebuli produkuje się przy użyciu linii cytoplazmatycznie męskosterylnych (CMS). W hodowli tego gatunku, oprócz normalnej męskopłodnej cytoplazmy N, wykorzystywane są trzy cytoplazmy sterylizujące: S, C i T. Zastosowaliśmy technikę vectorette PCR do poszukiwania sekwencji mitochondrialnego DNA różnicujących poszczególne typy cytoplazm hodowlanych cebuli. W wyniku tych badań udało się zidentyfikować region genomu mitochondrialnego występujący wyłącznie w cytoplazmach sterylizujących. Analiza sekwencji nukleotydowej ujawniła chimeryczny charakter tego regionu. Zawiera on fragmenty standardowych genów mitochondrialnych jak również odcinek o nieznanym pochodzeniu. Ustalono także, że sekwencje znajdujące się powyżej locus chimerycznego różnicują cytoplazmy S/C i T. Natomiast sekwencje położone bezpośrednio poniżej tego regionu są prawie identyczne, niezależnie od tego, z jakiego źródła sterylności pochodzą. Dzięki znajomości otoczenia genomowego locus chimerycznego zaprojektowano marker typu SCAR do identyfikacji genotypów cytoplazmatycznych cebuli. Marker ten jest obecnie wykorzystywany do testowania materiałów kilku polskich firm prowadzących hodowlę heterozyjną tej rośliny. Zidentyfikowana sekwencja chimeryczna cebuli ulega ekspresji na poziomie RNA. Odpowiednie transkrypty wykryto zarówno techniką RT-PCR jak i Northern blotting. Zaobserwowano zróżnicowaną obróbkę tego mRNA u roślin męskosterylnych i męskopłodnych z cytoplazmą T. Dane te wskazują, że znaleziona u form CMS sekwencja chimeryczna może brać udział w ekspresji cechy męskiej sterylności. W96. Construction of differential expression profiles by cDNA – DSC method in cucumber floral buds (Cucumis sativus L.). Magdalena Ewa Kowalczyk, Zbigniew Przybecki Department of Plant Genetics, Breeding and Biotechnology, Warsaw Agricultural University, Nowoursynowska 166, 02-787 Warsaw, Poland The aim of this study was a construction of differential expression libraries of genes products from cucumber floral buds. Two pairs of cucumber near isogenic lines of different sexes were used (Cucumis sativus L.): monoecious line B10 (ff/MM/GyGy) and gynoecious line 2gg (ff/MM/gygy), gynoecious line Gy3 (FF/MM/GyGy) and hermaphrodite line HGy3 (FF/mm/GyGy). Cucumber floral buds at the stage of 1 – 2 mm are bisexual without any morphological differences between sexes. We applied cDNA – DSC (Luo et al., Nucleic Acid Research, 1999, 27:24e) method to construct differential expression profiles. Expression analysis of products expressed differentially between buds of different sexes could facilitate understanding of sex determination and flower differentiation in cucumber plant. The cDNA – DSC method is one of the methods of subtractive hybridization. As a result four differential subtraction libraries were obtained, which consist: 44 tags for cDNA-DSC B102gg, 23 for cDNA – DSC 2ggB10, 41 for cDNA-DSC Gy3Hgy3 and 14 for cDNA-DSC Hgy3Gy3. The verification of obtained results was performed by dot blot hybridization with previously obtained differential cDNA DH (Przybecki et al., Cell Mol Biol Lett. 2003, 8 (2): 421-38) libraries (obtained by differential hybridization method). Firstly we confirm the presence of homologous sequences coming from DH and cDNA-DSC methods. Secondly, the application of these two methods increases the range of gene products, which are differentially expressed among buds of different sexes. The expression specificity was confirmed by hybridization of libraries with sscDNA. 161 Genetyka roślin W97. Kostytutywna i organo-specyficzna ekspresja antygenu M-HBsAg w tytoniu. Tomasz Pniewski (1), Anna Kostrzak (1), Józef Kapusta (2), Andrzej Płucienniczak (3) (1) Instytut Genetyki Roślin PAN, Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań (2) w trakcie zmiany miejsca pracy (3) Instytut Biotechnologii i Antybiotyków, Starościńska 5, Warszawa Wirusowe zapalenie wątroby typu B (wzwB) jest chorobą dotykającą ponad 350 mln ludzi na całym świecie. Liczba ta powiększa się mimo coraz lepszej dostępności szczepionki pochodzenia drożdżowego, opartej na małym antygenie powierzchniowym S-HBsAg wirusa Hepatitis B (HBV). Koszty produkcji i dystrybucji tej szczepionki pozostają barierą ekonomiczną dla krajów rozwijających się, a ponadto nie jest ona całkowicie skuteczna. Podejmowane są próby wytworzenia nowej generacji szczepionki przeciwko wzwB, zawierającej poza S-HBsAg pozostałe antygeny wirusa lub ich epitopy. Rośliny transgeniczne mogą być tanim źródłem tych białek. Jednym z komponentów nowej szczepionki przeciwko wzwB jest średni antygen powierzchniowy M-HBsAg, który poza domeną S identyczną jak w S-HBsAg, zawiera wysoce immunogenny N-końcowy 55-aminokwasowy fragment preS2, uczestniczący w transporcie białek otoczki wirionu do ER w trakcie cyklu życiowego wirusa. Sekwencja kodująca M-HBs została umieszczona pod kontrolą promotora konstytutywnego 35S lub nasieniowo-specyficznego legA i wklonowana do wektora pGPTV-BAR. Otrzymane wektory binarne wykorzystano do transformacji tytoniu. Transgeniczne rośliny zregenerowano z użyciem systemu selekcji na fosfinotricynę, substancję aktywną niektórych herbicydów. Obecność transgenu M-HBs w DNA genomowym roślin pokolenia T0 i T1 potwierdzono za pomocą PCR i hybrydyzacji Southern. Poziom ekspresji antygenu M-HBs oszacowano za pomocą testu immunoenzymatycznego ELISA z użyciem zestawu firmy Abbott. Poziom M-HBsAg w liściach roślin zawierających transgen pod kontrolą promotora 35S osiągał ponad 5 µg /g świeżej masy. Zawartość antygenu w nasionach roślin z transgenem pod kontrolą promotora legA dochodził do około 2 µg /g. Ekspresja M-HBsAg na stosunkowo wysokim poziomie oznacza możliwość wytwarzania tego białka konstytutywnie lub w nasionach roślin jadalnych, które mogą być następnie komponentem przyszłej szczepionki doustnej. W98. Analiza ekspresji genów kodujących cyklofilinę, białko transportujące tłuszcze i enzym kondensujący długie łańcuchy kwasów tłuszczowych u S. sogarandi. Agnieszka Kiełbowicz-Matuk, Karolina Hofman, Tadeusz Rorat Instytut Genetyki Roślin, Polska Akademia Nauk, 60-479 Poznań, ul. Strzeszyńska 34 Stres niskiej temperatury „chłód” jest istotnym czynnikiem ograniczającym prawidłowy wzrost i rozwój roślin. Rośliny zamieszkujące umiarkowaną i polarną strefę klimatyczną posiadają naturalną zdolność przystosowania się warunków chłodu i przeżywania okresu zimowego. Proces adaptacji, w wyniku którego następuje wzrost tolerancji roślin na zamarzanie podczas traktowania chłodem jest określany jako aklimatyzacja. Podczas aklimatyzacji zachodzą w komórkach liczne zmiany metaboliczne i fizjologiczne oraz zmiany w ekspresji genów, w wyniku których następuje wzrost odporności roślin na stres. W badaniach nad mrozoodpornością ziemniaka wyizolowano z dzikiego gatunku Solanum sogarandinum kilka genów, których poziom ekspresji (mierzony poziomem transkryptów) wzrastał w ciągu kilku minut od zadziałania stresu. Wyizolowane geny wykazywały wysoką homologię do genów kodujących następujące białka: cytoplazmatyczną cyklofilinę (gen SsCyP), białko transportujące tłuszcze (gen SsLTP) i enzym kondensujący długie łańcuchy kwasów tłuszczowych (gen SsCE). Wstępna analiza poziomu ekspresji genów SsCyP, SsLTP i SsCE w odpowiedzi na chłód u dzikiego gatunku S. sogarandinum i odmiany uprawnej S. tuberosum przeprowadzona metodą Northern blot wykazała, że wzrost poziomu akumulacji transkryptów pod wpływem chłodu następował u obu gatunków Solanum, przy czym u gatunku odpornego poziom akumulacji był znacznie wyższy. W przypadku genu SsCyP wzrost poziomu transkryptu obserwowano już po obniżeniu temperatury do 4°C, dla genu SsLTP po 10 min, a dla genu SsCE po 2h od zadziałania stresu. Tak szybka indukcja ekspresji genów Ss pod wpływem chłodu sugeruje, że ich białkowe produkty mogą być związane z uruchamianiem procesów prowadzących do zwiększenia tolerancji Solanum na zamarzanie. 162 Genetyka roślin Komunikaty plakatowe: P198. Charakterystyka molekularna patogena wywołującego kanciastą plamistość ogórka. Helena Olczak-Woltman (1), Aleksander Masny (2), Andrzej Płucienniczak (2), Katarzyna Niemirowicz-Szczytt (1) (1) Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, Wydział Ogrodnictwa i Architektury Krajobrazu, Katedra Genetyki, Hodowli i Biotechnologii Roślin, ul. Nowoursynowska 166, 02-787 Warszawa (2) Instytut Biotechnologii i Antybiotyków, ul. Starościńska 5, 02-516 Warszawa Bakteryjna kanciasta plamistość (wywoływana przez Pseudomonas syringae pv. lachrymans) jest chorobą powszechnie występującą w uprawach ogórka (Cucumis sativus L.) w Polsce, powodującą straty w jakości i ilości plonu. Inokulując rośliny ogórka kilkoma szczepami patogena oraz kilkunastoma izolatami, uzyskanymi z liści ogórka z objawami chorobowymi, zebranymi w różnych częściach Polski (zakwalifikowanymi jako Pseudomonas syringae na podstawie testów LOPAD), stwierdzono duże zróżnicowanie w nasileniu objawów chorobowych. Podjęto więc próbę molekularnej oceny stopnia zróżnicowania pomiędzy szczepami bakterii P. syringae pv. lachrymans oraz P. syringae pv. syringae, otrzymanymi z banków patogenów, a także zebranymi izolatami. Przeprowadzono reakcję PCR z parą starterów D21/D22 (amplifikacja konserwatywnego regionu pomiędzy 16S i 23S rRNA) oraz B1/B2 (amplifikacja fragmentu związanego z syntezą toksyny bakteryjnej) na DNA genomowym wszystkich zebranych w kolekcji szczepów i izolatów. Wyniki reakcji pozwoliły na wyróżnienie obu patowarów wśród zebranych izolatów. W celu szczegółowej analizy stopnia zróżnicowania zastosowano metodę powielania w PCR fragmentów DNA otaczających rzadkie miejsca restrykcyjne (ADSRRS) i metodę powielania w PCR w fragmentów o niskiej stabilności termicznej (PCR melting profiles). Metody te wykazały duże zróżnicowanie zebranych szczepów i izolatów bakterii. Wyniki badań molekularnych pokrywają się jednocześnie z wynikami inokulacji na ogórku, wskazując, że objawy chorobowe na ogórku powodowane są zarówno przez P. syringae pv. lachrymans, jak i P. syringae pv. syringae. P199. Poszukiwanie markerów odporności na porastanie u pszenżyta. Arleta Drozd (1), Piotr Masojć (1), Wojciech Sodkiewicz (2) (1) Katedra Genetyki i Hodowli Roślin, Akademia Rolnicza, ul. Słowackiego 17, 71-374 Szczecin (2) Pracownia Mieszańców Oddalonych, Instytut Genetyki Roślin PAN, ul.Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań Poszukiwano markerów molekularnych wykazujących związek z podwyższoną odpornością na porastanie ziarna pszenżyta, przy użyciu analizy zbiorczych grup segregantów (BSA). Analizą objęto populację F2 (F408), otrzymaną przez krzyżowanie dwóch sublinii odpornych na porastanie z wrażliwymi formami odmianowymi Kitaro. W wyniku przeprowadzonej selekcji, spośród 1000 starterów RAPD, wykryto 4 potwierdzające zdolność do rozróżnienia poszczególnych grup skrajnych segergantów, wyselekcjonowanych w obrębie pokolenia F2 (F408). Otrzymano zestaw 5 markerów molekularnych, na podstawie których, można odróżnić rośliny odporne od wrażliwych na porastanie. W dalszym etapie prac, zestaw markerów testowany będzie w obrębie pokolenia F3 badanej populacji. Metoda RAPD jest metodą skuteczną, szybką i stosunkowo tanią, i stąd przydatność do poszukiwania markerów ważnych cech użytkowych. W dalszych badaniach konieczne jednak będzie przekształcenie wykrytych markerów RAPD na specyficzne markery SCAR lub PCR-RFLP. P200. Zróżnicowanie genetyczne gatunków w obrębie rodzaju Avena. Maria Chrząstek, Edyta Paczos-Grzęda, Danuta Miazga Akademia Rolnicza w Lublinie, Instytut Genetyki i Hodowli Roślin Przedmiotem badań były gatunki owsa o różnym stopniu ploidalności: diploidalne (2n=14) – A. nuda i A. strigosa, tetraploidalne (2n=28) – A. barbata, A. murphyi i A. maroccana oraz heksaploidalne (2n=42) – A. sterilis i A. sativa. W celu określenia stabilności cytogenetycznej i oceny podobieństwa genetycznego poszczególnych gatunków przeprowadzono analizy cytologiczne i molekularne. 163 Genetyka roślin Obserwując konfiguracje chromosomów w metafazie I stwierdzono, że we wszystkich gatunkach chromosomy tworzyły głównie biwalenty, sporadycznie występowały uniwalenty. Nie obserwowano połączeń multiwalentnych. Biwalenty miały najczęściej postać pierścieni. Najwięcej biwalentów otwartych (prętów) notowano u A. barbata (14.11%), najmniej u A. sativa (6.77%). Liczba uniwalentów przypadających na jedną komórkę wahała się od 0.01 (A. nuda, A. strigosa) do 0.08 (A. barbata). W anafazie I we wszystkich gatunkach obserwowano nieliczne chromosomy opóźnione i mosty chromatydowe. Najwięcej tych zaburzeń stwierdzono u A. fatua. Analizowane gatunki różniły się pod względem liczby mikrojąder w tetradach. U A. sativa obserwowano je sporadycznie (0,004/KMP), a najczęściej u A. barbata (0,073/KMP). Średnia żywotność pyłku gatunków diploidalnych wynosiła 92.31%, a przeciętne ziarno pyłku miało wymiary 47.45 x 46.95 mm. Spośród gatunków tetraploidalnych najwięcej żywotnego pyłku wytwarzał A. maroccana (97.23%). Jednocześnie gatunek ten wyróżniał się najmniejszymi wymiarami pyłku (45.46 x 44.60 mm). Pyłek gatunków heksaploidalnych charakteryzował się najlepszą żywotnością i największymi wymiarami. Do oceny podobieństwa genetycznego analizowanych gatunków wykorzystano metodę RAPD. Reakcję przeprowadzono dla 20 dziesięcionukleotydowych starterów o losowych sekwencjach. Matrycę podobieństwa genetycznego Dicea otrzymaną na podstawie 50 polimorficznych fragmentów DNA wykorzystano do konstrukcji dendrogramu metodą UPGMA. Największe podobieństwo genetyczne stwierdzono w obrębie diploidów oraz heksaploidów P201. Transgenic cucumber plants with thaumatin II cDNA under the control of tomato fruit polygalacturonase gene-flanking regions. Maria Szwacka (1), Agnieszka Jankowska (2), Wojciech Burza (1), Anna Pożarowska (1), Maciej Ładyżyński (3), Stefan Malepszy (1) (1) Department of Plant Genetics, Breeding and Biotechnology, Warsaw Agricultural University, Nowoursynowska 166, Warszawa (2) Department of Genetics, Institute of Biochemistry and Biophysics PAS, Pawińskiego 5A, Warszawa (3) Botanical Garden – Centre for Biological Diversity Conservation PAS, Prawdziwka 2, Warszawa After Agrobacterium-mediated genetic transformation of leaf microexplants of highly inbred cucumber (Cucumis sativus L.) line B with the binary plasmid pRDT12, aimed at improvement of quality of fruits, we obtained three independent transformants (ca. 1.5% of transformation efficiency). Vector plasmid pRDT12, derivative of pRD12 (16600 bp, C. Bird, ZENECA), contains thaumatin II cDNA (gene for extremely sweet-tasting protein, 1100 bp) under the control of tomato fruit poligalacturonase gene-flanking regions and nos-nptII-nos construct. Genomic DNA PCR analysis confirmed that the selected transformants contained the thaumatin II gene. For two out of three T0 transgenic plants (T1004 and T1005) T2 generations were obtained and segregation of kanamycin-resistance was investigated. In the progenies of plant T1004, the segregation ratio was consistent with monogenic Mendelian trait (50%) or it did not fit the expected 3:1 ratio. In the progenies of plant T1005 the segregation ratio of 3:1 was observed. The morphology of some T2 plants varied as compared to line B. P202. Sources of enhanced Pseudoperonospora cubensis tolerance in transgenic cucumber lines harboring 35S-thaumatin II chimeric gene. Maria Szwacka (1), Teresa Tykarska (2), Łukasz Wiśniewski (1), Arkadiusz Przybysz (1), Monika Rakoczy-Trojanowska (1), Stefan Malepszy (1) (1) Department of Plant Genetics, Breeding and Biotechnology, Warsaw Agricultural University, Nowoursynowska 166, Warszawa (2) Department of Plant Morphogenesis, University of Warsaw, Miecznikowa 1, Warszawa Some transgenic cucumber lines that express thaumatin II gene from Thaumatococcus daniellii Benth show increased tolerance to downy mildew (Pseudoperonospora cubensis). The aim of the work was explanation of this property. Structure of leaf was compared by SEM (electron scanning microscopy) technique, and presence of thaumatin protein in different layers of leaf was determined (immunocytochemical localization with use of mouse monoclonal antibodies raised against thaumatin). No differences were found in shape, position and number of stomata on the leaf surface of tolerant lines and the parental line, which is susceptible to downy mildew. Data from SEM suggest importance of other pre-existing structures in defense, such as amount and morphology of cuticular waxes and morphology of trichomes. 164 Genetyka roślin P203. Charakterystyka podjednostki gluteninowej Bx za pomocą markerów molekularnych w polskich odmianach i rodach hodowlanych pszenicy heksaploidalnej (Tr). Marcin Moczulski, Bolesław P. Salmanowicz Instytut Genetyki Roślin PAN, ul. Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań Wysokocząsteczkowe podjednostki gluteninowe (HMW-GS) ze względu na obecność, kompozycje i stosunek ilościowy względem białek gliadynowych wpływają na jakość mąki pszennej, a tym samym na właściwości elastomeryczne uzyskiwanego z niej ciasta w procesie wypieku chleba. Rozróżnianie i opisywanie poszczególnych alleli tych podjednostek za pomocą biochemicznych i molekularnych markerów odgrywa istotna rolę w programach hodowlanych pszenicy. Największy polimorfizm podjednostkowy HMW-GS wśród alleli stwierdzono dla genu Glu-1Bx. Klasyczne metody wykorzystujące rozdział zdysocjowanych białek w żelach poliakrylamidowych w obecności siarczanu dodecylowego (SDS-PAGE) pozwalają na rozróżnienie większości z nich. Szczególną uwagę warto zwrócić na podjednostkę Bx7, której ekspresja w niektórych odmianach ulega zwiększeniu, dzięki obecności 43 nukleotydowej tzw. „wstawki” w sekwencji promotorowej genu Glu-1Bx7. Rozróżnienie tych dwóch alleli podjednostki Bx7 i tzw. Bx7OE (nadekspresyjnego) za pomocą SDS-PAGE jest niemożliwe. Bardzo pomocne okazują się markery molekularne wychwytujące różnice wielkości sekwencji promotorowej. W niniejszej pracy przedstawiono szereg dostępnych markerów molekularnych dla alleli Glu-1Bx w celu określenia ich przydatności w programach hodowlanych na przykładzie 80 odmian polskich pszenic jarych i ozimych. P204. Wykorzystanie markerów SSR, ISSR oraz RAPD do fingerprintingu oraz oceny zróżnicowania genetycznego linii wsobnych żyta. Beata Myśków, Paweł Milczarski, Marta Twardowska, Piotr Masojć Katedra Genetyki i Hodowli Roślin, Akademia Rolnicza w Szczecinie [email protected] Głównym zadaniem hodowli mieszańcowej jest gromadzenie i testowanie linii wsobnych pod kątem doboru materiałów jako komponentów rodzicielskich. Do tego celu doskonale nadają się dane o genetycznym podobieństwie uzyskane przy użyciu markerów molekularnych, które są dużo bardziej miarodajne niż informacje o pochodzeniu. Każda z wielu dostępnych obecnie technik molekularnych ma swoje zalety i wady. Korzystne wydaje się zatem zastosowanie do fingerprintingu i oceny zróżnicowania genetycznego kilku metod równocześnie. Umożliwi to wykrycie polimorfizmu w wielu loci pochodzących z różnych obszarów genomu. Wykorzystując 3 techniki markerowe bazujące na metodzie PCR – SSR, ISSR, RAPD – przeprowadzono analizy zróżnicowania genetycznego 48 linii wsobnych żyta. Przy użyciu każdej z metod dokonano fingerprintingu badanych materiałów, oceny ich podobieństwa genetycznego oraz utworzono dla nich dendrogramy. Do badań użyto trzynastu par starterów SSR, pozwalających na wykrycie 34 alleli, ośmiu starterów ISSR, wykrywających polimorfizm w 29 loci oraz dziewiętnastu starterów RAPD generujących amplifikację 48 polimorficznych fragmentów DNA. Każdy z zestawów markerów okazał się wystarczający do odróżnienia wszystkich 48 linii wsobnych żyta. Spośród wszystkich markerów wybrano zestaw najlepszych pod względem łatwości oceny, który pozwolił na dokonanie fingerprintingu przy użyciu możliwie najmniejszej liczby starterów. Na ich podstawie sporządzono dendrogram, który stanowił podstawę dokonania porównania stopnia podobieństwa genetycznego z pokrewieństwem wynikającym z rodowodów. Połączenie kilku metod markerów molekularnych stanowi korzystny sposób uzyskiwania fingerprintingu i analizy podobieństwa genetycznego badanych linii wsobnych żyta i może być z powodzeniem zastosowane do analizy innych materiałów w ramach gatunku. P205. Typy mitochondriów i chloroplastów w liniach diploidalnych ziemniaka i ich mieszańcach somatycznych. Jarosław Przetakiewicz, Dominik Kuć, Wacław Orczyk Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Radzików, 05-870 Błonie Analizowano typy mitochondriów i chloroplastów u mieszańców somatycznych ziemniaka i ich linii wyjściowych. Komponenty fuzji tj. diploidalne linie ziemniaka dobrano tak, aby uzyskać tetraploidalne mieszańce o określonej charakterystyce cech użytkowych. Jednocześnie pochodzenie tych linii, będących potomstwem krzyżowań z wieloma dzikimi gatunkami Solanum, wskazywało na ich potencjalne duże zróżnicowanie cytoplazmatyczne. Uzyskane 165 Genetyka roślin mieszańce somatyczne stanowią unikatowy materiał pozwalający badać czynniki dziedziczenia cytoplazmatycznego oraz ich ewentualny udział w dziedziczeniu wybranych cech fenotypowych. Analiza RFLP z użyciem całkowitego DNA ciętego odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i hybrydyzowanego z sondami (m79, m80, m93 i m112) homologicznymi do określonych genów mitochondrialnych pozwoliła zidentyfikować trzy typy mitochondriów. Typ α występował u linii DG 88-596; typ β u linii DW 84-1920, DG 82258, DG 88-89, DG 92-4294, DG 94-90 i DG 94-503 oraz typ ε u linii DG 82-199. Wszystkie testowane mieszańce somatyczne zawierały mitochondria typu β. Identyfikację różnych rodzajów chloroplastowego DNA wykonano przy wykorzystaniu reakcji PCR, całkowitego DNA komponentów fuzji i ich mieszańców, oraz starterów specyficznych do cpDNA. � Na plakacie zostaną przedstawione wyniki pełnej analizy tych czynników oraz będzie przedyskutowana segregacja organelli obserwowana u mieszańców somatycznych i będąca wynikiem połączenia dwóch różnych cytoplazm. P206. Wykorzystanie sprzężonych markerów STS, AFLP i SSR do identyfikacji locus Pm1 w różnych genotypach pszenicy heksaploidalnej. Łukasz Stępień (1), Jerzy Chełkowski (1), Gerhard Wenzel (2), Volker Mohler (2) (1) Instytut Genetyki Roślin PAN, ul. Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań, (2) Chair of Agronomy and Plant Breeding, Center for Food and Life Sciences Weihenstephan, Technical University Munich, 85350 Freising, Germany Analizowano 98 odmian/linii pszenicy zwyczajnej za pomocą markerów STS (Xsts638-7A), AFLP (XE39M58-777A) oraz SSR (Xgwm344-7A), sprzężonych z locus Pm1. Dzięki wynikom segregacji otrzymanymi dla populacji Chinese Spring x Virest (Pm1e), zmapowano Xgwm344-7A i XE39M58-77-7A dystalnie w stosunku do Pm1e w odległościach 0.9 cM i 4.8 cM, natomiast Xsts638-7A segregował zawsze z locus Pm1e. Wyniki analiz z użyciem markerów Xsts638-7A i XE39M58-77-7A potwierdziły obserwacje fenotypowe, z wyjątkiem odmian Omega, Remus i Weihenstephan Stamm M1N. Markerem SSR Xgwm344 wykryto 15 różnych fragmentów, o długości od 102 pz do 147 pz, jak również 15 prób, które prezentowały allel null położony zarówno na chromosomie 7A, jak i 7B (linie posiadające jeden z alleli genu odporności Pm1). Z uwagi na ich dużą zmienność, wykorzystanie multi-allelicznych markerów SSR do identyfikacji genotypów może być skomplikowane, jednakże łączne wykorzystywanie różnych typów sprzężonych ze sobą markerów jest wielce pomocną metodą w badaniach szerokiego wachlarza materiałów roślinnych. P207. DSC method for genomic subtracted libraries construction in cucumber (Cucumis sativus L.). Ewa Siedlecka, Magdalena Ewa Kowalczyk, Zbigniew Przybecki Department of Plant Genetics, Breeding and Biotechnology, Warsaw Agricultural University, Nowoursynowska 166, 02-787 Warsaw, Poland Differential Subtraction Chain (DSC) seems to be an effective technique for isolating the differences between two highly similar genomes. We have performed widly modified technique elaborated by Luo et al. (Nucl.AcidsRes. 27: 24e, 1999), which occurred to be valuable in our analyses of cucumber lines (NILs) differing in sex. The DSC tags from the genomic DNA of Gy3 line (FF/MM/GyGy, female line) versus HGy3 line (FF/mm/GyGy, hermaphrodite line) and B10 line (ff/ MM/GyGy, monoecious line) versus 2gg line (ff/MM/gygy, female line) were cloned into plasmids vectors (Siedlecka et al., II Krajowy Kongres Biotechnologii, Łódź, 2003). The difference products have restrictions sites for Bam HI, Hind III or Bgl II. We obtained the 27 tags for DSC Gy3 (tester)HGy3(driver)B (B-Bam HI), 26 tags for DSC Gy3HGy3H (H-Hind III), 30 tags for DSC Gy3HGy3BL (BL– Bgl II), 19 tags for DSC HGy3Gy3B, 11 tags for DSC HGy3Gy3H, 29 DSC tags for HGy3Gy3BL, 25 DSC tags for B102ggB, 11 tags for DSC B102ggH, 28 tags for DSC B102ggBL, 24 tags for DSC 2ggB10B, 9 tags for DSC 2ggB10H, 24 tags for DSC 2ggB10BL. For each genomic DSC library we picked six probes derived from flowers cDNA-DSC and DH (Differential Hybridization) libraries for dot blot hybridization analysis. Due to hybridization we found that obtained many of genomic DSC tags were homologous to that in transcriptomes. It means that differences between genomes and transcriptomes showed conformity. We observed the strongest signals on a blot of BglII-digested difference DNAs from genomic DSC. 166 Genetyka roślin P208. Analiza ekspresji genu SsZF kodującego czynnik transkrypcyjny, typu palca cynkowego pod wpływem chłodu u Solanum sogarandinum. Karolina Hofman, Agnieszka Kiełbowicz-Matuk, Tadeusz Rorat Instytut Genetyki Roślin, Polska Akademia Nauk, 60-479 Poznań, ul. Strzeszyńska 34 Przedmiotem badań jest izolacja i identyfikacja genów, których ekspresja jest sprzężona z uruchamianiem procesów prowadzących do wzrostu tolerancji roślin na zamarzanie podczas traktowania roślin chłodem (temp. 3-4°C). Obiektem badań są dwa gatunki Solanum, odporny na zamarzanie dziki gatunek Solanum sogarandinum i nieodporny gatunek uprawny Solanum tuberosum, odm. Aster. Na wstępie przygotowano kolekcję klonów cDNA na matrycy mRNA wyizolowanego z pędów S. sogarandinum, traktowanych chłodem (4°C). Na podstawie selekcji klonów metodą „differential screening” wyodrębniono 93 różne geny, które wykazały wyższy poziom akumulacji odpowiadających im transkryptów u S. sogarandinum. Jeden z wyselekcjonowanych klonów cDNA SsZF wykazywał wysoką homologię do genów kodujących białka posiadające domeny palca cynkowego typu B-box. W kolejnym etapie badań określono poziom akumulacji transkryptu genu SsZF pod wpływem niskiej temperatury. Analizę ekspresji przeprowadzono metodą Northern blot. Dla uchwycenia czasu indukcji ekspresji genu SsZF pod wpływem chłodu (4°C) materiał roślinny zbierano po 5, 10, 20 min. oraz po 1, 2, 4, 8 godzinach od zadziałania stresu. Badania wykazały, że maksimum akumulacji transkryptu genu SsZF obserwowano u S. sogarandinum już po jednej godzinie od zadziałania chłodu (4°C). Nie obserwowano obecności transkryptu w roślinach nie poddanych działaniu stresu. U S. tuberosum wzrost poziom transkryptu SsZF pod wpływem chłodu był nieznaczny. Szybka indukcja ekspresji genu SsZF pod wpływem chłodu może sugerować, iż kodowane białko jest zaangażowane w procesy uruchamiania wzrostu tolerancji S. sogarandinum na zamarzanie. P209. Analiza ekspresji genów kodujących proteazę cysteinową oraz acetylotransferazę serynową u Solanum sogarandinum w odpowiedzi na chłód. Alina Liczbańska, Agnieszka Kiełbowicz-Matuk, Karolina Hofman, Tadeusz Rorat Instytut Genetyki Roślin, Polska Akademia Nauk, 60-479 Poznań, ul. Strzeszyńska 34 Celem badań była analiza ekspresji genów kodujących proteazę cysteinową (SsCysp) oraz acetylotransferazę serynową (SsSat) w odpowiedzi na chłód. Materiałem badawczym były dwa gatunki Solanum, odporny na zamarzanie, dziki gatunek Solanum sogarandinum oraz nieodporny gatunek uprawny Solanum tuberosum, odm. Aster. W badaniach nad mrozoodpornością ziemniaka wyizolowano z dzikiego gatunku Solanum sogarandinum kilka genów, których poziom ekspresji mierzony metodą Northern blot wzrastał w ciągu kilku minut od zadziałania czynnika stresowego. Wyizolowane geny SsCysp oraz SsSat wykazywały wysoką homologię do genów kodujących proteazę cysteinową oraz acetylotransferazę serynową. Bliższa analiza poziomu ekspresji genów SsCysp i SsSat w odpowiedzi na chłód (4°C) u dwóch gatunków Solanum wykazała, że poziom akumulacj transkryptów obu genów był znacznie wyższy u gatunku dzikiego w porównaniu do gatunku uprawnego Solanum tuberosum. W przypadku genu SsSat poziom transkryptu wzrastał już po 5 minutach od zadziałania czynnika stresowego, a w przypadku genu SsCysp po 1 godzinie od obniżenia temperatury do 4°C. Ponieważ ekspresja obu genów ulega szybkiej indukcji pod wpływem chłodu, białka kodowane przez SsCysp i ScSat mogą mieć istotne znaczenie w uruchamianiu odpowiedzi S. sogarandinum na stres niskiej temperatury. P210. Ekspresja genu kodującego białko dehydrynowe 10 kDa (DHN10) pod kontrolą promotora genu glukozylotransferazy (GT) w transgenicznych roślinach dwóch gatunków Solanum. Izabela Pawłowicz, Tadeusz Rorat Instytut Genetyki Roślin, Polska Akademia Nauk, 60-479 Poznań, ul. Strzeszyńska 34 Ekspresję natywnego genu Dhn10 kodującego białko dehydrynowe DHN10 oraz transgenu GT-Dhn10 analizowano u dwóch gatunkach Solanum, dzikim mrozoodpornym S. sogarandinum oraz uprawnym S. tuberosum w odpowiedzi na stres chłodu. Transgen GT-Dhn10 został złożony z regionu promotorowego genu glukozylotransferazy (GT) oraz sekwencji kodującej dehydrynę genu Dhn10 pochodzącego z S. sogarandinum. Sekwencja kodująca genu Dhn10 została wstawiona do transgenu w orientacji sensowej w celu zwiększenia poziomu białka DHN10 w komórkach 167 Genetyka roślin oraz w orientacji antysensowej dla obniżenia poziomu DHN10. Otrzymanymi transgenami w układzie sensowym i antysensowym transformowano odmianę uprawną S. tuberosum Irga. W otrzymanych roślinach transgenicznych rosnących w warunkach kontrolnych oraz w chłodzie (4°C) analizowano ekspresję genu natywnego Dhn10 oraz transgenu GT-Dhn10 na poziomie transkrypcyjnym metodą RT-PCR przy zastosowaniu specyficznych straterów oraz metodą Western blot przy zastosowaniu przeciwciała anty-DHN10. Jak wykazano, na poziomie transkrypcyjnym obydwa geny działały w sposób niezależny od siebie.W transformantach był obecny był zarówno transkrypt pochodzący od genu natywnego jak i transgenu. Analiza Western blot nie wykazała jednak obecności dodatkowego prążka w ekstraktach białkowych pochodzących z roślin transgenicznych, który mógłby być produktem mRNA transgenu GT-Dhn10. Natomiast poziom białka DHN10 pochodzącego od genu natywnego Dhn10 był podobny jak u roślin kontrolnych nietransgenicznych. Histochemiczna analiza aktywności promotora GT za pomocą genu reporterowego uidA kodującego bakteryjne białko β-glukuronidazę wykazała, że ulega on tkankowospecyficznej ekspresji w dolnej epidermie liścia oraz w miękiszu gąbczastym. Brak białkowego produktu transgenu GTDhn10 wskazuje, że poziom białka transgenicznego DHN10 w komórkach jest bardzo niski lub też białko dehydrynowe nie jest syntetyzowane w tkankach okrywających liścia. Chłód nie wywierał wpływu na zmianę poziomu DHN10 w roślinach transgenicznych. P211. Konstrukcja wysokowydajnej roślinnej kasety ekspresyjnej genu stafylokinazy Katarzyna Hnatuszko, Aneta Wiktorek-Smagur, Piotr Łuchniak, Andrzej K. Kononowicz* Zakład Cytogenetyki i Biologii Molekularnej Roślin, Uniwersytet Łódź, ul. S. Banacha 12/16, 90-237 Łódź, *[email protected] W ostatnich latach optymalizacja roślinnych kaset ekspresyjnych pod kątem stabilnej i ekonomicznie opłacalnej ekspresji genów kodujących heterologiczne białka stała się przedmiotem intensywnych badań. Wśród opracowanych konstrukcji na szczególną uwagę zasługują kasety opracowane przez De Jaegera i wsp. (Nature Biotechnol. 20: 1265 – 1268, 2002) z Ghent University. Opracowali oni grupę wektorów zapewniających niezwykle wysoki poziom produkcji rekombinowanych białek w roślinach. Do niedawna możliwy do uzyskania poziom produkcji rekombinowanych białek w roślinach wynosił ok. 1% TSP (Total Soluble Protein), co stanowiło niewątpliwą wadę tego rodzaju systemów produkcyjnych. Przy wykorzystaniu wektora pbetaphas De Jaeger i wsp. (2002) uzyskali akumulację heterologicznego białka (scFV-G4) w roślinach Arabidopsis thaliana sięgającą 36,5% TSP. Tak silna ekspresja transgenów skonstruowanych na bazie opracowanych wektorów jest wynikiem zastosowania kombinacji różnych elementów regulatorowych: silnego promotora (beta-fazeoliny lub sekwencje regulatorowe genu kodującego białko arcelinę 5I), optymalnego 5-UTR oraz sekwencji flankującej arc5I-3-. Uzyskane kasety ekspresyjne pozwoliły także na skierowanie i retencję badanego białka w kanałach siateczki śródplazmatycznej (peptyd sygnałowy ss oraz sekwencja KDEL). Ponadto, na uwagę zasługuje możliwość uzyskania równie wysokiego poziomu ekspresji omówionych transgenów u innych, odległych taksonomicznie gatunków roślin. W niniejszym komunikacie przedstawiono wyniki badań mających na celu skonstruowanie na bazie wektora wahadłowego pATAG5, wysokowydajnej roślinnej kasety ekspresyjnej do produkcji rekombinowanych białek o właściwościach terapeutycznych. Przykładem takiego białka jest stafylokinaza, bakteryjny czynnik o właściwościach fibrynolitycznych, wykazujący aktywność aktywatora plazminogenu.� Praca wykonana w ramach grantu KBN 6 PO4B 003 18 i badań własnych UŁ 505/040424 P212. Ocena podatności na transformację przy pomocy Agrobacterium tumefaciens różnych genotypów kapusty głowiastej białej (Brassica oleracea L.). Karol Gładysz, Małgorzata Madej, Maria Klein Katedra Genetyki, Hodowli i Nasiennictwa, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja, Al.29 Listopada 54, 31-425 Kraków, e-mail: [email protected] Do oceny wybrano 10 późnych odmian kapusty oraz 4 linie DH. Transformację hypokotyli 2-tygodniowych siewek przeprowadzono wg zmodyfikowanej metody Metza. Do transformacji użyto dwóch superwirulentnych szczepów Agrobacterium tumefiaciens: LBA 4404 i AGLO zawierających geny: npt II i gus pod promotorem 35S CMV. Zastosowano 2-dniową prekulturę oraz 1-dniową kokultywację hypokotyli z Agrobacterium tumefaciens na pożywce płynnej. Do eliminacji bakterii użyto karbenicylinę i cefataxime. Ocenę regeneracji transgenicznych pędów przeprowadzono po 2, 4 i 6 tygodniach od wyłożenia eksplantatów na pożywkę regeneracyjno-selekcyjną zawierającą kanamycynę. Początek 168 Genetyka roślin regeneracji pędów obserwowano po około 14 dniach od transformacji. Zachodziła ona bezpośrednio lub z udziałem kalusa. Stwierdzono duże różnice odmianowe w zdolności do transformacji. W zależności od odmiany kalus wytwarzało od 15 do 100% hypokotyli, pędy pojawiały się z częstotliwością od 0 do 50%. Analiza molekularna uzyskanych pędów wykazała obecność transgenów w niektórych odmianach. Duże zróżnicowanie zdolności regeneracyjnych pomiędzy odmianami pozwoli wybrać genotypy posiadające cechy predysponujące je do dalszych prac nad transformacją kapusty, których celem będzie wprowadzenie genów użytkowych. P213. Mapowanie fizyczne genomu Lupinus. Barbara Naganowska, Anna Kaczmarek, Bogdan Wolko Instytut Genetyki Roślin PAN, ul. Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań Struktura genomu łubinów (rodzaj Lupinus, Fabaceae), grupy obejmującej liczne gatunki dzikie i uprawne Starego i Nowego Świata, jest słabo poznana. W ostatnich latach dostosowano do jej analiz metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). U gatunków Starego Świata zostały zlokalizowane loci 18S-25S rDNA i 5S rDNA. Zaobserwowano jeden locus 5S rDNA oraz 1-3 loci 18S-25S rDNA, wśród których wyróżniała się para silnych, dużych sygnałów na chromosomie satelitarnym, wykazująca specyficzne zachowanie w trakcie cyklu komórkowego. Zaobserwowane loci rDNA mogą służyć jako markery 2-4 par chromosomów łubinów, zależnie od gatunku. Badano również występowanie sekwencji telomerowych i kilku syntetycznych oligonukleotydów, jednak nie stanowiły one dobrych markerów do identyfikacji chromosomów. Dalsze etapy analiz cytogenetycznych metodą FISH dotyczyły łubinu wąskolistnego (Lupinus angustifolius cv. Sonet, 2n=40) z grupy gładkonasiennych (Malacospermae), gatunku uprawnego o dużym potencjale wykorzystania w rolnictwie ekologicznym i jako źródło białka. W celu uzyskania preparatów cytologicznych o wysokiej liczbie komórek w stadium metafazy zastosowano metodę synchronizacji podziałów komórkowych poprzez użycie hydroksymocznika jako związku hamującego replikację DNA, rozpuszczonego w płynnej pożywce Hoaglanda, w warunkach napowietrzania. Dla poszerzenia liczby markerów poszczególnych par chromosomów w mapowaniu fizycznym genomu łubinu wąskolistnego wykorzystano klony BAC jako sondy molekularne do fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Pochodziły one z genomowej biblioteki BAC L. angustifolius cv. Sonet skonstruowanej w ramach projektu KBN Nr 3 P06A 009 24. Klony zostały wyselekcjonowane na podstawie przeglądu biblioteki znakowanymi radioaktywnie sondami zawierającymi kodujące sekwencje genów. Wyselekcjonowane klony BAC zweryfikowane metodą PCR zostały wyizolowane i wyznakowane metodą nick translacji. Planowana jest kontynuacja badań z wykorzystaniem kolejnych klonów BAC. P214. Optymalizacja warunków transformacji Arabidopsis thaliana in planta metodą histochemicznej analizy ekspresji genu reporterowego gusA Aneta Wiktorek-Smagur, Katarzyna Hnatuszko, Andrzej K. Kononowicz* Zakład Cytogenetyki i Biologii Molekularnej Roślin, Uniwersytet Łódź, ul. S. Banacha 12/16, 90-237 Łódź *[email protected] Rzodkiewnik pospolity (Arabidopsis thaliana) od blisko 20 lat znajduje się w centrum zainteresowań genetyków, biologów molekularnych i fizjologów roślin. Wśród cech, które z Arabidopsis uczyniły super-model badawczy wymienia się nie tylko łatwość hodowli, o której decydują rozmiary roślin (wysokość 15 – 20 cm), krótki cykl życiowy (6 tygodni od kiełkowania do produkcji dojrzałych nasion), samopłodność i wysoka produkcja nasion (5 000 nasion z jednej rośliny) umożliwiające otrzymywanie kolekcji homozygot, ale także niewielkie rozmiary genomu (125 Mb = 115 409 949 pz), małą liczbę chromosomów (5), bogactwo genów (25 494, należących do 11 000 rodzin genów) a wreszcie unikalną wśród roślin podatność na transformację i inne manipulacje genetyczne (Arabidopsis pozostaje jednym z niewielu gatunków roślin poddających się transformacji ex vitro – metodą in planta). Niniejsza praca stanowi jeden z ważnych elementów programu badań realizowanego w Zakładzie Cytogenetyki i Biologii Molekularnej Roślin Uniwersytetu Łódzkiego mającego na celu konstrukcję transgenicznych roślin do produkcji rekombinowanych białek diagnostycznych i farmaceutyków. Histochemiczna i molekularna analiza ekspresji gernu reporterowego gusA w transgenicznych roślinach Arabidopsis, otrzymanych w wyniku transformacji metodą in planta (Clough i Bent, 1998), pozwoliła na precyzyjną identyfikację najodpowiedniejszych dla transformacji stadiów rozwojowych kwiatów i optymalizację warunków agroinfekcji, a w konsekwencji na opracowanie efektywnego i powtarzalnego systemu transformacji. Praca wykonana w ramach grantu KBN 6 PO4B 003 18 i badań własnych UŁ 505/040424. 169 Genetyka roślin P215. Ocena chemicznych i molekularnych podstaw odporności marchwi [Daucus carota L.] na połyśnicę marchwiankę [Psila rosae (Fabr.)] Magdalena Simlat (1), Łukasz Marczak (2), Barbara Michalik (1) (1) Katedra Genetyki, Hodowli i Nasiennictwa, Wydział Ogrodniczy, Akademia Rolnicza, Kraków (2) Pracownia Fitochemii, Instytut Chemii Bioorganicznej PAN, Poznań. Przeprowadzone badania dotyczyły poszukiwania zależności między wrażliwością marchwi na żerowanie larw połyśnicy, a zawartością fenolowych metabolitów wtórnych i poziomem akumulacji mRNA genów PAL uczestniczących w ich biosyntezie. Do badań wytypowano cztery obiekty marchwi, różniące się wyraźnie podatnością na żerowanie larw szkodnika, co oszacowano na podstawie wcześniejszych doświadczeń polowych [Michalik i Wiech 2000, Simlat 2002]. Odmiany populacyjne Dolanka (POLAN – Snowidza) i Karotan (Rijk Zwaan) stanowiły obiekty wrażliwe natomiast linie 7262A (USDA) i DC 96367 (HRI Wellesbourne) stanowiły genotypy odporne. W okresie penetracji plantacji przez dorosłe muchówki połyśnicy przeprowadzono ocenę względnej zawartości glikozydów flawonoidów w częściach nadziemnych roślin. W liściach starszych obie wrażliwe odmiany wykazywały w porównaniu do odpornych linii wyższy poziom akumulacji 7-O-glukozydu metyloluteoliny i 3-O-glukozydu kempferolu. Z kolei stosunek zawartości obu glikozydów do siebie (7-O-glukozyd metyloluteoliny/3-O-glukozyd kempferolu) wykazywał zależność odwrotną – niższa wartość charakteryzowała obiekty wrażliwe. Analiza poziomu akumulacji transkryptów genów pal1 i pal3 marchwi, metodą hybrydyzacji typu Northern również pozwoliła wykazać różnice między badanymi grupami obiektów. Najwyższy poziom mRNA obu genów charakteryzował odporną linię DC 96367, sygnały hybrydyzacyjne obserwowane u linii 7262A były nieco słabsze, natomiast u obu wrażliwych odmian sygnały te nie zostały zarejestrowane. Zaobserwowane prawidłowości będą wymagały potwierdzenia w kolejnych sezonach wegetacji roślin. Mapowanie genetyczne Komunikaty ustne: W99. Opracowanie dwóch map genomu żyta w oparciu o markery RAPD. Piotr Masojć, Aneta Banek-Tabor, Beata Myśków, Paweł Milczarski, Karolina Lebiecka Katedra Genetyki i Hodowli Roślin, Akademia Rolnicza, Szczecin Budowanie mapy genetycznej określonego organizmu stanowi duże wyzwanie naukowe. O sukcesie przedsięwzięcia decyduje wybór systemu markerowego, który byłby zarówno polimorficzny jak i zapewniający pokrycie segregującymi loci całej długości genomu. W przypadku konstrukcji mapy żyta, pierwotnie najlepsze efekty osiągnięto dzięki zastosowaniu techniki RFLP. W ten sposób opracowano mapę na bazie pokolenia F2 mieszańca DS2 x RXL10. Mapę markerów RFLP zagęszczono markerami RAPD, których zaletą było losowe, dość równomierne rozmieszczenie wzdłuż chromosomów. Korzystając z tego doświadczenia, markery RAPD wykorzystano do konstrukcji od podstaw drugiej mapy żyta, bazującej na mieszańcu międzyliniowym 541 x Ot1-3. Również w tym przypadku markery RAPD okazały się skutecznym narzędziem. Z puli ok. 1200 starterów otrzymano 165 segregacji jednogenowych, z czego grupy sprzężeń odpowiadające chromosomom żyta utworzyło 98 loci RAPD. Dwie otrzymane mapy nie mają, poza kilkoma wyjątkami wspólnych loci markerowych, stąd trudno je ze sobą powiązać. Poszukiwania innych rodzajów markerów mogących efektywnie zagęszczać i rozbudowywać mapę nie przyniosły dobrych efektów. Markery AFLP, chociaż polimorficzne, wykazały silne zblokowania wielu loci w kilku regionach na chromosomie. Natomiast markery SSR dawały małą liczbę loci na chromosom. Zdobyte doświadczenie w mapowaniu genomu żyta sugeruje następującą strategię konstruowania mapy przy użyciu markerów bazujących na reakcji PCR: (1) zastosowanie analizy RAPD dla osiągnięcia krytycznej liczby segregacji jednogenowych (ok. 200), (2) wzbogacenie mapy o kilka do kilkunastu na chromosom loci typu SSR, STS, PCR-RFLP. Otrzymany układ mapy pozwala na prowadzenie analizy QTL dla wielu ważnych cech użytkowych roślin. 170 Genetyka roślin W100. Ocena efektywności MAS na podstawie analizy QTL warunkujących odporność żyta na porastanie. Marta Twardowska, Piotr Masojć, Paweł Milczarski, Aneta Banek-Tabor Katedra Genetyki i Hodowli Roślin, Akademia Rolnicza, Szczecin Porastanie ziarna żyta stwarza stałe zagrożenie ponoszenia znacznych strat materialnych w rolnictwie krajowym. Wyniki badań genetycznych, w tym szczególnie mapowanie interwałowe potwierdziły złożoność genetycznego podłoża tej cechy, która jest dodatkowo silnie uzależniona od warunków atmosferycznych panujących w okresie dojrzewania ziarna. W drodze analizy QTL na mapie markerów molekularnych żyta wytypowano 4 loci markerowe mogące stanowić podstawę selekcji genotypów odpornych na porastanie. Efektywność markerów w selekcji sprawdzano na populacji 360 rodów żyta wyprowadzonych z populacji mapującej 541 x Ot1-3. Selekcja prowadzona z użyciem każdego markera z osobna nie wykazała znaczącej skuteczności. Silny efekt osiągnięto przez równoczesną selekcję wszystkimi czterema markerami. Metoda ta doprowadziła do wyselekcjonowania subpopulacji odznaczającej się wysoką odpornością na porastanie. Zastosowanie podobnej procedury w stosunku do trzech markerów sprzężonych z QTL warunkujących aktywność alfa-amylazy doprowadziło do otrzymania grupy roślin o bardzo niskim poziomie enzymu odpowiedzialnego za rozkład skrobi ziarniaka, a tym samym za niską liczbę opadania. Przeprowadzone badania wykazały, że właściwą drogą zabezpieczenia żyta przed porastaniem jest piramidyzacja korzystnie działających alleli z kilku loci przy wykorzystaniu sprzężonych z nimi markerów molekularnych. W101. Markery molekularne sprzężone z genami kontrolującymi męską sterylność u żyta z cytoplazmą C. Stefan Stojałowski (1), Mirosław Łapiński (1), Miłosława Jaciubek (2), Piotr Masojć (1) (1) Katedra Genetyki i Hodowli Roślin, Akademia Rolnicza w Szczecinie, Słowackiego 17, 71-434 Szczecin (2) Instytut Fizjologii Roślin im. Franciszka Górskiego, Polska Akademia Nauk, Niezapominajek 21, 30-239 Kraków Cytoplazmatyczna męska sterylność (cms) jest powszechnie stosowana w hodowli roślin do otrzymywania nasion odmian mieszańcowych. U żyta prawie wszystkie zarejestrowane odmiany mieszańcowe posiadają cytoplazmę sterylizującą typu Pampa. Źródło sterylizującej pręcikowie cytoplazmy określane symbolem cms-C zostało wytworzone na początku lat 70-tych XX wieku i stanowi alternatywny wobec Pampy system cms, który można wykorzystać do produkcji nasion mieszańców żyta. Identyfikacja markerów molekularnych silnie sprzężonych z genami Rfc kontrolującymi męską jałowość w systemie cms-C może w znaczącym stopniu przyspieszyć prace hodowlane nad wytworzeniem nowych odmian mieszańcowych żyta posiadających to źródło cytoplazmy. Wyniki analiz RAPD przeprowadzone na mieszańcach międzyliniowych żyta z cytoplazmą cms-C, pozwoliły na zlokalizowanie na długim ramieniu chromosomu 4R silnego genu kontrolującego płodność pręcikowia. Gen ten oznaczono symbolem Rfc1. Pozostałe geny warunkujące płodność roślin żyta z cytoplazmą C nie zostały dotąd precyzyjnie zmapowane. Wśród aktualnie wyprowadzanych w oparciu o mieszańca między liniami 544 i L1 rekombinacyjnych linii wsobnych (RIL) znajdują się genotypy dopełniające męską sterylność. Przeprowadzone na tym materiale analizy RAPD potwierdzają bliskie sprzężenie wykrytych markerów ze zlokalizowanym na chromosomie 4RL genem Rfc1 oraz wskazują, że po transformacji w markery typu SCAR mogą one znaleźć praktyczne zastosowanie w pracach selekcyjnych. W102. Estymacja efektu addytywnego działania genów metodą genetyki ilościowej i metodą genetyki molekularnej. Jan Bocianowski, Paweł Krajewski Instytut Genetyki Roślin PAN w Poznaniu, ul. Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań W pracy przedstawiono metody estymacji efektu addytywnego działania genów: metodę genetyki ilościowej – bazującą na obserwacjach jedynie fenotypowych i metodę genetyki molekularnej – uwzględniającą również obserwacje markerowe. Porównanie analityczne obu metod umożliwia podanie warunków, których spełnienie przybliża oceny dokonywane wymienionym wyżej metodami. Porównania numeryczne przeprowadzono na trzech zbiorach danych: dwa dotyczyły linii podwojonych haploidów jęczmienia, jeden – linii wsobnych kukurydzy. W celu sprawdzenia dobroci metod estymacji przeprowadzono badania symulacyjne odpowiadające 108 sytuacjom eksperymentalnym. Uzyskane wyniki wskazują na dużą niezmienniczość obu prezentowanych w pracy metod estymacji efektu addytywnego działania genów. 171 Genetyka roślin Można je stosować do różnych gatunków roślin, o czym świadczy brak wpływu liczby chromosomów na oceny efektów addytywnego działania genów dokonane obiema metodami oraz na wnioski dotyczące porównania zaproponowanych metod estymacji, a także dla różnych map genetycznych, o czym świadczy zaobserwowanie braku wpływu odległości między markerami na oceny badanego parametru. W większości analizowanych sytuacji (w przypadku badań symulacyjnych – we wszystkich) ocena parametru związanego z efektem addytywnego działania genów dokonana na podstawie obserwacji fenotypowych była większa niż ocena metodą wykorzystującą obserwacje markerowe. W103. Identyfikacja i chromosomowa organizacja homeologów wybranych genów szlaku biosyntezy i transdukcji sygnału etylenowego w genomie Brassica oleracea. Danuta Babula, M. Jakubowicz, M. Kaczmarek, W. Nowak, L. Misztal, J. Sadowski Instytut Genetyki Roślin, Polska Akademia Nauk, ul. Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań Zakład Biotechnologii, Instytu Biologii Molekularnej i Biotechnologii, Uniwersytet im. A. Mickiewicza, ul. Międzychodzka 5, 60-379 Poznań Celem prowadzonych badań jest poznanie chromosomowej lokalizacji wybranych genów uczestniczących w syntezie i przekazywaniu sygnału etylenowego u Brassica oleracea L. (rośliny kapustne). Struktura genomów gatunków z rodzaju Brassica charakteryzuje się dużym stopniem zduplikowania segmentalnego, będącego konsekwencją ich poliploidalnego pochodzenia. W związku z tym pochodzeniem geny są z reguły reprezentowane przez kilka kopii (= homeologów genowych). Dlatego też, ważnym etapem badań nad poznaniem funkcji genów w rodzinie Brassicaceae, do której należy także Arabidopsis thaliana, jest identyfikacja ich specyficznych homeologów indukowanych w zróżnicowany sposób np. pod wpływem stresów środowiskowych. Prezentowane badania dotyczyły identyfikacji homeologów wybranych genów biosyntezy etylenu ( SAM, ACS, ACO) oraz kluczowych etapów przekazywania sygnału etylenowego (ETR1, CTR1, MKK4, MKK5, EIN2, EIN3, EREBP, ERF5 i ERF7) w genomie B. oleracea. Homologi w/w genów były identyfikowane w oparciu o hybrydyzację wg Southerna i analizę RFLP z wykorzystaniem sond typu EST z A. thaliana. Równocześnie, pojedyncze homologi niektórych genów były wykrywane w oparciu o specyficzne dla nich startery (projektowane na podstawie sekwencji i specyficznej funkcji danego homeologa z A. thaliana) w reakcji PCR. Wybrane klony EST reprezentowały unikalne sekwencje w genomie A. thaliana, rozproszone na wszystkich 5 chromosomach. Natomiast w genomie B. oleracea wiekszość z zastosowanych sond genowych pozwalała na wykrycie 3-4 homeologów. Porównanie organizacji badanych genów w genomach B. oleracea i A. thaliana wskazuje, ze wiele z analizowanych loci występuje w konserwatywnych regionach chromosomowych. Pozwala to na wstępną identyfikację ortologicznych kopii niektórych z genów. Zidentyfikowane homeologi analizowanych genów będą weryfikowane eksperymentalnie podczas planowanych ekperymentów z zastosowaniem stresu ozonowego i suszy u B. oleracea. W104. Identyfikacja chromosomów z pojedynczymi segmentami chromatyny Festuca arundinacea i F. pratensis w liniach introgresywnych Lolium multiflorum przy użyciu FISH. Arkadiusz Kosmala (1) Agnieszka Leśniewska-Bocianowska (1), Michał Łuczak (1), Elżbieta Zwierzykowska (1), Zbigniew Zwierzykowski (1), Mike W. Humphreys (2), (1) Instytut Genetyki Roślin, Polskiej Akademii Nauk, Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań; (2) Institute of Grassland and Environmental Research, Aberystwyth, Plas Gogerddan, SY23 3EB, UK. Wykorzystanie oddalonych mieszańców traw – F. arundinacea (6x) x L. multiflorum (4x) i L. multiflorum (2x) x F. pratensis (4x) w krzyżowaniach wstecznych z diploidalnymi odmianami L. multiflorum (2n=2x=14) umożliwia transfer genów odporności na suszę i /lub zamarzanie z gatunków Festuca do L. multiflorum. Selekcja roślin w kolejnych pokoleniach wstecznych prowadzi do uzyskania już w pokoleniu BC2 odpornych roślin introgresywnych, u których w garniturze chromosomowym L. multiflorum występują tylko pojedyncze segmenty chromatyny Festuca z genami odporności na stresy. Segmenty te można identyfikować przy zastosowaniu genomowej hybrydyzacji in situ (GISH). Fizyczne zmapowanie obcej chromatyny w genomie L. multiflorum możliwe jest po zastosowaniu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), opartej na sondach 5S i 45S rDNA, co w konsekwencji umożliwia identyfikację niektórych chromosomów Lolium. W prezentowanym komunikacie przedstawiono wyniki analiz cytogenetycznych, które obejmowały identyfikację chromatyny F. pratensis i F. arundinacea oraz jej chromosomową lokalizację w liniach inrogresywnych L. multiflorum odpornych na zamarzanie i/lub suszę. Wykazano, że w badanych liniach introgresywnych chromatyna F. pratensis, zarówno z genami odporności na zamarzanie jak i na suszę zlokalizowana była terminalnie na 172 Genetyka roślin krótkim ramieniu chromosomu 2 Lolium, bądź też obejmowała centromer i oba rejony przycentromerowe chromosomu 4. Natomiast chromatyna F. arundinacea z genami odporności na zamarzanie obejmowała terminalny rejon krótkiego ramienia chromosomu 2 Lolium. W dalszym etapie badań do pojedynczych segmentów chromosomowych Festuca zostaną przypisane markery STS (miejsce znaczone sekwencyjnie; ang. sequence tagged site). Pozwoli to zidentyfikować markery sprzężone z genami odporności i zapewni szybki sposób selekcji odpornych genotypów w hodowli traw. Komunikaty plakatowe: P216. Identyfikacja QTLi reakcji w kulturze in vitro niedojrzałych zarodków żyta ozimego (Secale cereale L.). Maja Boczkowska (1), Hanna Bolobok (1), Monika Rakoczy-Trojanowska (1), Paweł Milczarski (2), Piotr Masojć (2) (1) SGGW, Katedra Genetyki, Hodowli i Biotechnologii Roślin, ul. Nowoursynowska 166, 02-787 Warszawa (2) Katedra Genetyki i Hodowli Roślin, AR, ul. Słowackiego 17, 71-434 Szczecin Poszukiwanie na mapach genetycznych loci cech ilościowych (QTL) związanych z reakcją roślin w kulturze in vitro jest w ostatnich latach jednym z najbardziej intensywnych kierunków badań w tym obszarze. W niniejszej pracy po raz pierwszy zidentyfikowano QTLe reakcji w kulturze in vitro niedojrzałych zarodków żyta ozimego. Materiał roślinny stanowiła populacja mapująca Ot x 541 (otrzymana w AR w Szczecinie) składająca się z 89 rekombinacyjnych linii wsobnych (RIL). Komponenty rodzicielskie tej populacji wykazywały zróżnicowaną reakcję na zmodyfikowanej pożywce MS uzupełnionej 3 mg/dm3 2,4-D, 100 mg/dm3 hydrolizatu kazeiny i 30 g/dm3 maltozy. Po 12 tygodniach od inicjacji kultury niedojrzałych zarodków RIL wykonano pasaż tkanek kalusowych na pożywkę MS bez hormonów, z sacharozą i edaminą, a po kolejnych 2 tygodniach obliczono udział kalusów embriogenicznych i nieembriogenicznych dla każdej RIL. Rozkład obu cech w całej populacji był zbliżony do normalnego. Wykorzystując program Mapmaker zlokalizowano na utworzonej wcześnie mapie markerów molekularnych (głównie RAPD) populacji mapującej 11 QTLi zdolności do embriogenezy i 3 QTLe braku zdolności do embriogenezy. Cztery QTle zdolności do embriogenezy – ESS1.3, ESS2.5, ESS2.7 (V grupa sprzężeń) i ESS2.8 (VII grupa sprzężeń), o wartości LOD większej niż 3.0, położone w odległości mniejszej niż 5 cM od jednego z markerów ograniczających przedział mapowy i wyjaśniające ponad 60% zmienności cechy mogą w przyszłości znaleźć praktyczne zastosowanie w biotechnologii. P217. Markery RAPD w ocenie zmienności genetycznej wybranych genotypów Salix viminalis L. Jerzy Andrzej Przyborowski, Stefan Szczukowski, Józef Tworkowski Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie, Katedra Hodowli Roślin i Nasiennictwa Wierzba wiciowa (Salix viminalis L.) należy do rodziny Salicaceae, jest rośliną wieloletnią i szybko rosnącą. Uprawa szybko rosnących wierzb krzewiastych z przeznaczeniem na cele energetyczne cieszy się wzrastającym wciąż zainteresowaniem, zarówno w kraju jak i zagranicą. Lignino-celulozowa świeża biomasa Salix spp. w nowoczesnej technologii chemicznego przetwarzania może być zmieniona na wtórne nośniki energii: energię cieplną (proces gazyfikacji) i paliwa płynne (metanol). W związku z wzrastającym zainteresowaniem istnieje potrzeba hodowli wydajnych form wierzb krzewiastych. Wybór odpowiednich komponentów krzyżowania w hodowli rekombinacyjnej wymaga poznania zakresu zmienności genetycznej materiałów wyjściowych. Z wykorzystaniem markerów RAPD oceniono zakres zmienności między 16 genotypami S. viminalis, znajdującymi się w naszej kolekcji. Przetestowano 60 starterów, z których w badaniach wykorzystano 38 dających prążki polimorficzne. Uzyskano ogółem 217 produktów amplifikacji, a stopień zróżnicowania określono biorąc pod uwagę całkowitą zgodność oraz różnice w liczbie prążków u badanych form. Całkowita zgodność w liczbie i lokalizacji prążków wahała się od 5,6 do 60%, zaś różnice w liczbie prążków wahały się od 10,1 do 41,7%. 173 Genetyka roślin P218. Wykorzystanie markerów SSR z Medicago truncatula do mapowania genomu Pisum sativum i Lupinus angustifolius. Tomasz Pniewski (1), Thierry Huguet (2), Bogdan Wolko (1) (1) Instytut Genetyki Roślin PAN, Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań (2) Laboratoire des Interactions Plantes Micro-organismes CNRS/INRA, Chemin de Borde Rouge – BP 27 31326 Castanet Tolosan, Francja Tworzenie map genetycznych jest etapem wstępnym w badaniach nad genomiką i genetyką molekularną roślin. Zmapowane markery molekularne, sprzężone z określonymi cechami fizjologicznymi i morfologicznymi, stanowią dogodny punkt wyjścia do wyszukiwania genów determinujących różne właściwości roślin oraz do ukierunkowanej hodowli nowych odmian roślin uprawnych. Mapowanie genetyczne umożliwia również porównawcze badanie struktury genomów i ich ewolucji. Zastosowanie markerów określających położenie mikrosatelitów – SSR (Simple sequence repeats), opracowanych uprzednio dla Medicago truncatula L., miało na celu wzbogacenie o ten typ markerów mapy genetycznej grochu (Pisum sativum L.) oraz łubinu (Lupinus angustifolius L.), a także rozpoczęcie badań nad mapowaniem porównawczym genomów wymienionych gatunków. Markery typu SSR wykazują stosunkowo szeroki polimorfizm, a zatem są dogodne do mapowania. Ponadto są proste w zastosowaniu, ponieważ do wygenerowania wymagają rozdziału produktów PCR na żelach agarozowych lub akrylamidowych. Spośród analizowanych 360 par starterów opracowanych dla markerów M. truncatula, 138 generowało specyficzne produkty PCR w genomowym DNA grochu trzech linii rodzicielskich dwóch populacji mapujących. Spośród 138 markerów, 36 wykazało polimorfizm, a wśród nich było 22 o charakterze dominacyjnym oraz 14 kodominacyjnym. � W przypadku łubinu wąskolistnego analizowano polimorfizm tych samych 360 markerów dla 4 roślin rodzicielskich dwóch populacji mapujących. Spośród 67 specyficznych markerów, 18 wykazało polimorfizm, w tym 5 o charakterze dominacyjnym i 13 kodominacyjnym. Tylko 2 markery były polimorficzne zarówno dla grochu jak i łubinu.� Przeprowadzone badania polimorfizmu markerów SSR umożliwiają ich zastosowanie do porównawczego mapowania M. truncatula, Pisum oraz Lupinus. P219. Wykorzystanie linii DH kapusty głowiastej białej do konstrukcji mapy genetycznej w oparciu o markery AFLP i RAPD. Michał Combik, Dariusz Grzebelus, Adela Adamus, Barbara Michalik Katedra Genetyki Hodowli i Nasiennictwa, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja, Al. 29 Listopada 54, 31-425 Kraków Celem badań jest opracowanie mapy genetycznej kapusty głowiastej białej (Brassica oleracea L. var capitata subvar. alba) w oparciu o populację roślin DH. Materiał roślinny, który posłużył do otrzymania populacji mapującej uzyskano ze skrzyżowania 2 linii wsobnych kapusty różniących się składem chemicznym oraz wczesnością. Mikrospory pobrane z roślin pokolenia F1 tej krzyżówki indukowano w kulturach in vitro w celu otrzymania podwojonych haploidów. Otrzymano 67 roślin DH, z których wyizolowane DNA analizowano przy użyciu markerów AFLP i RAPD. Do chwili obecnej uzyskano kilkadziesiąt segregujących markerów, które posłużyły do sporządzenia wstępnej mapy genetycznej przy wykorzystaniu programu Map Maker. Potomstwo uzyskane przez zapylenie wsobne roślin podwojonych haploidów i ocenione pod względem składu chemicznego pozwoli w przyszłości na zmapowanie loci cech ilościowych. 174 Genetyka roślin Wykład plenarny: W105. W poszukiwaniu genów morfogenezy włośników u Hordeum vulgare poprzez analizę mutacyjną do sekwencji DNA. Iwona Szarejko, Mirosław Kwaśniewski, Agnieszka Janiak, Beata Chmielewska, Małgorzata Nawrot, Jagna Karcz i Mirosław Małuszyński Katedra Genetyki, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, ul. Jagiellońaska 28, 40-032 Katowice Uważa się, że włośniki korzeniowe pełnią podstawową rolę w zaopatrywaniu roślin w wodę i sole mineralne, w zakotwiczaniu roślin w ziemi i w oddziaływaniu z mikroorganizmami glebowymi. Choć ich fizjologiczna funkcja jest dobrze udokumentowana, jedyne informacje na temat genetycznych i molekularnych podstaw rozwoju tych wyspecjalizowanych komórek epidermy korzenia pochodzą z badań na Arabidopsis thaliana. U Arabidopsis, podstawową rolę w różnicowaniu komórek włośnikowych odgrywa pozycja, jaką komórki epidermy zajmują w stosunku do komórek kory pierwotnej korzenia. W przeciwieństwie do tego modelu, u wielu gatunków z rodziny Poaceae, w tym u jęczmienia, każda komórka epidermy, niezależnie od jej położenia, może stać się komórką włośnikową (trichoblastem), a potencjalne trichoblasty są morfologicznie nierozróżnialne od komórek nie formujących włośników (atrichoblastów). Jak dotąd, brak jest informacji o molekularnych podstawach morfogenezy komórek włośnikowych u roślin jednoliściennych. Unikalne mutanty włośnikowe jęczmienia (Hordeum vulgare L.), wyprowadzone w Katedrze Genetyki UŚ po działaniu chemicznych związków mutagenicznych, stanowią idealny materiał do rozpoczęcia analizy mutacyjnej różnicowania i rozwoju włośników u tej grupy roślin. W toku dotychczasowych doświadczeń wyselekcjonowano 13 mutantów ze zmianami w różnych stadiach rozwoju włośników, a 6 z nich poddano pełnej analizie genetycznej. Przebadano wzory rozwoju epidermy w mikroskopie skanningowym i konfokalnym, i określono poziom polimorfizmu AFLP między mutantami i odmianami wyjściowymi. Ustalono, że u analizowanych mutantów zmiany w morfologii strefy chłonnej są cechami recesywnymi, warunkowanymi monogenicznie. Obecnie prowadzone są prace nad lokalizacją genów odpowiedzialnych za zmiany w rozwoju włośników na mapach markerów DNA. Wykorzystując bezwłośnikowego mutanta, podjęto próbę identyfikacji genu odpowiedzialnego za etap inicjacji włośników przy pomocy techniki cDNA RDA, bazującej na subtraktywnej hybrydyzacji fragmentów cDNA amplifikowanych w PCR. Posługujac się tą strategią, a także techniką klonowania RACE i Genome Walking oraz analizą bioinformatyczną, wyizolowano genomową sekwencję o długości 1490 bp i zidentyfikowano ją jako pierwszy opisany gen dla β-ekspansyny jęczmienia (GenBank Acc. AY351785). Wykazano, że ekspresja tego genu (oznaczonego HvEXPB1) jest korzeniowo-specyficzna i kosegreguje z włośnikiowym fenotypem rośliny w potomstwie F2 krzyżówki między bezwłośnikowym mutantem a jego odmiana wyjściową. Ekspansyny stanowią dużą rodzinę białek, których działanie związane jest z rozluźnianiem ściany komórkowej w procesach związanych ze wzrostem i rozwojem roślin. Znaleziono je w wielu rosnących komórkach, z włośnikami włącznie. 175 Genetyka roślin Genetyka rozwoju Komunikaty ustne: W106. The developmental regulation of cucumber SCARECROW gene expression during somatic embryogenesis. Anita Wiśniewska, Sabina Zuzga, Marcin Filipecki, Stefan Malepszy Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego,Katedra Genetyki, Hodowli i Biotechnologii Roślin, ul. Nowoursynowska 166, 02-787 Warszawa Somatic embryogenesis in cell suspension cultures is a convenient, chemically inducible model to study differential gene expression. In our research we concentrate on genes encoding specific transcription factors (TFs) upregulated in the first steps of cucumber somatic embryogenesis. One of TFs analysed is the CsSCR gene, which shows high sequence similarity to SCARECROW gene from Arabidopsis thaliana (AtSCR1), which is a member of GRAS family of TFs and is essential for the asymmetric division of the cortex/endodermis progenitor cells in the root. The genomic sequence of CsSCR was cloned and analyzed. It contains one intron located in similar position like in AtSCR1. When compared with AtSCR the predicted protein sequence of CsSCR shows 57% identical residues overall and reaches 86% identity within the region where high conserved domains are located. The expression analysis showed clear upregulation in somatic embryos when compared to other tissues. The in situ hybridization and the analyses of transgenics containing the promoter CsSCR::GUS fusion, showed specific signal localization in developing roots and root-like structures in tissue culture. The possible factors influencing CsSCR expression are discussed. W107. Wpływ pożywki i źródła pyłku na efektywność partenogenezy u marchwi Agnieszka Kiełkowska, Adela Adamus, Barbara Michalik Katedra Genetyki, Hodowli i Nasiennictwa, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja, Al.29 Listopada 54, 31-425 Kraków, e-mail: [email protected] Celem badań było opracowanie wydajnej metody indukcji haploidów u marchwi. Dotychczasowe prace dotyczące tego zagadnienia przy zastosowaniu metody kultur pylników prowadzone w IWARZ w Skierniewicach i KGHiN w Krakowie okazały się mało efektywne, co skłoniło do poszukania innej drogi otrzymania linii DH. Do indukcji partenogenezy w latach 2002-2003 używane były wyłącznie rośliny heterozygotyczne pod względem allelu Pgi (izomeraza 6-glukozo-fosforanowa). Kwiaty roślin donorowych zapylano pyłkiem trzech innych gatunków: pietruszka, pasternak, kapusta, a następnie z powiększonych zalążni izolowano zalążki i umieszczano na czterech pożywkach o różnym składzie, przygotowanych na bazie MS lub B5. W kulturach zalążków obserwowano niewielką liczbę (do 2%) eksplantatów tworzących zarodki, a dominującą formą rozwoju okazał się kalus, który tworzył się z częstotliwością od 0-3,87%. Pietruszka okazała się lepszym źródłem pyłku, gdyż w większym stopniu stymulowała rozwój eksplantatów. Stwierdzono również wyraźny wpływ pożywki na rozwój zalążków. Pożywka H była najlepsza do indukcji zarodków (1.46%), natomiast pożywka A12 indukowała w większym stopniu rozwój kalusa (3.41%). Analiza ploidalności otrzymanych regenerantów wykazała, że 98% z nich to diploidy, natomiast nie otrzymano roślin haploidalnych. Spośród ocenionych roślin diploidalnych 52% było homozygotami pod względem allelu Pgi, co wskazuje na ich gametyczne pochodzenie. 176 Genetyka roślin Komunikaty plakatowe: P220. Kultury in vitro pylników pszenicy w płynnych pożywkach Aleksandra Ponitka, Aurelia Ślusarkiewicz-Jarzina, Jolanta Woźna Instytut Genetyki Roślin PAN, ul. Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań Badano efektywność uzyskiwania haploidów pszenicy otrzymywanych metodą kultur pylnikowych w płynnych pożywkach. Pylniki pobierano z 10 form pszenicy ozimej pochodzących z pięciu Stacji Hodowli Roślin i wykładano na szalki o średnicy 6 cm zawierające 5 ml pożywki. Przy użyciu mikroskopu z odwróconym światłem obserwowano rozwój mikrospor, które wypłynęły z pękających pylników. Zastosowano dwie pożywki indukcyjne i uzyskano od 0,7 do 105,1 androgenicznych zarodków /100 pylników. Po 3 tygodniach kultury, androgeniczne zarodki, przenoszono na pożywkę regeneracyjną i otrzymano od 0,1 do 21,4 zielonych roślin /100 pylników. Częstotliwość uzyskiwania zarodków i roślin zależała zarówno od stosowanej pożywki indukcyjnej, jak i od genotypu. Porównano wyniki z kultur pylnikowych prowadzonych w pożywkach płynnych i na pożywkach agarowych. Stwierdzono wyższą efektywność androgenezy stosując kultury płynne P221. Amfiploidy Aegilops kotschyi x Secale cereale. Barbara Wojciechowska, Hanna Pudelska Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk, ul. Strzeszyńska 34, 60-479-Poznań Amfiploidy Aegilops kotschyi x Secale cereale (linie samozgodne) otrzymano poprzez kolchicynowanie i propagację in vitro niepłodnych mieszańców F1 (2n=3x=21). Rośliny amfiploidalne (2n=6x=42) charakteryzowały się częściową płodnością, silnym wigorem wegetatywnym oraz zwiększonymi wymiarami w porównaniu z mieszańcami F1. W pierwszym pokoleniu, szczególnie u kolchiamfiploidów odsetek wybarwionych ziaren pyłku i średnia liczba osadzonych ziarniaków w kłosie były niższe niż w dalszych pokoleniach, w których następowała stabilizacja cytogenetyczna. Ziarniaki uzyskano w wyniku samozapylenia, większość z nich była dobrze wykształcona i żywotna. Nie udało się pokonać silnych barier izolacji generatywnej pomiędzy amfiploidem a formą wyjściową żyta. Z krzyżowań wstecznych otrzymano nieliczne zarodki, bardzo słabo wykształcone i niezdolne do dalszego rozwoju w warunkach kultur in vitro. Wykład plenarny: W108. Patterning of the maize embyo. Prof. W. Werr Departament of Development of Biology, University of Cologne, Grmany Streszczenie w suplemencie 177 Genetyka roślin Genetyka populacji Komunikaty ustne: W109. Dziedziczenie odporności na rdzę brunatną ( Puccinia recondita f.sp. tritici) odmian Fidelio Helena Grzesik, Anna Strzembicka Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Zakład Oceny Jakości i Metod Hodowli Zbóż, ul. Zawiła 4, 30-423 Kraków W niniejszej pracy badano dziedziczenie odporności na rdzę brunatną w stadium siewki dwóch odmian pszenżyta ozimego Fidelio i Lamberto. W tym celu wykonano dwie kombinacje krzyżowań typu odporne x wrażliwe: Fidelio x Marko i Lamberto x Marko. Odmiany Fidelio i Lamberto były odporne na rdzę brunatną zarówno w stadium siewki w warunkach polowych jak i w stadium rośliny dorosłej w warunkach polowych natomiast odmiana Marko była podatna (Grzesik i in. 2002).Formy rodzicielskie oraz mieszańce pokolenia F1 i F2 inokulowano w szklarni w stadium siewki izolatami 4c, 40b, 83c i 95b rdzy brunatnej (Puccinia recondita f.sp. tritici).Wymienione patotypy występują w ostatnich latach z dużą częstotliwością w krajowej populacji patogena (Strzembicka i Gruszecka 1997). Charakteryzują się one określoną kombinacją wirulencji/awirulencji w stosunku do 15 linii izogenicznych NIL z genami odporności Lr : patotyp wirulencja/ awirulencja 4c Lr2c,Lr3,Lr11,Lr15,Lr17,Lr21,Lr26,Lr28 / Lr1,Lr2a,Lr2b,Lr9,Lr19, Lr 23,Lr24. 40b Lr3,Lr11,Lr15,Lr17,Lr21,Lr26, / Lr1,Lr2a,Lr2b,Lr2c,Lr9,Lr19,Lr23, Lr24,Lr28. 83c Lr3,Lr11,Lr15,Lr17,Lr21,Lr26,Lr28 / Lr1,Lr2a,Lr2b,Lr2c,Lr9,Lr19, Lr23,Lr 24. 95b Lr2b,Lr2c,Lr3,Lr11,Lr15,Lr17,Lr21,Lr26/Lr1,Lr2a,Lr9,Lr19,Lr23, Lr24,Lr28 (Strzembicka i in.2001). Infekcję w szklarni oceniano po 14 dniach w skali 5.stopniowej: 0; – odporne, 4 – podatne. Wyniki analizowano stosując test X2 Badania prowadzono w latach 2001 – 2003. Wyniki inokulacji rodziców oraz pokolenia F1 i F2 wyraźnie wskazują, że pokolenie F1 było odporne w typie odporności rodziców. Stosunek rozszczepień roślin odpornych do podatnych w pokoleniu F2 w przypadku mieszańca Fidelio x Marko wynosił 3:1, co oznacza, że odporność odmiany Fidelio warunkowana jest jednym genem dominującym. W kombinacji krzyżowania Lamberto x Marko stosunek roślin odpornych do podatnych wynosił 13:3, co wskazuje, że odporność odmiany Lamberto zależy od działania dwóch genów – jednego dominującego i jednego recesywnego. W110. Efektywność hybrydyzacji introgresywnej T.aestivum. Józef Pilch Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Zbóż, Zakład Oceny Jakości i Metod Hodowli Zbóż, 30-423 Kraków, ul. Zawiła 4 Hybrydyzacja introgresywna T. aestivum L. z T. durum Desf. umożliwia introgresje loci Glu-A1, Glu-A3 glutenin i GliA1, Gli-A2 gliadyn genomu A, oraz loci Glu-B1, Glu-B3 glutenin i Gli-B1, Gli-B2 gliadyn genomu B kodujące białka zapasowe endospermu oraz geny amylolityczne alfa – Amy 1 z chromosomów 6A, 6B, geny alfa – Amy 2 z chromosomów 7A, 7B oraz geny alfa – Amy 3 z chromosomów 5A, 5B oraz geny kodujące wysoką zawartość białka prawie wszystkich chromosomów tego gatunku. W efekcie krzyżowania mono-5BChinese Spring, mono-5B Favorit T. aestivum L. z odmianami Mirable, Khapli i Fuensemiduro T. durum Desf. uzyskano 64 introgresywne linie heksaploidalne T. aestivum L./ T. durum Desf o wysokich wskaźnikach technologicznych ziarna klasy E znacznie przewyższającymi komponenty rodzicielskie T. aestivum L., jak i odmianę jakościową Begra: 30 linii miało zawartość białka 14,5 % – 16,0 %, 14 linii miało wskaźnik sedymentacji Zelenyego 52,3 ml – 62,0 ml, 62 linie miały liczbę opadania 232,0 s – 398,0 s, 12 linii miało wartość wypiekową w klasie E. Wykonana elektroforeza SDS-PAGE wysokocząsteczkowych glutenin potwierdziła udział obcych, niezidentyfikowanych podjednostek loci Glu-A1 i Glu-B1 oraz zmiany w locus Glu-D1 pod wpływem chromosomów genomów A, B T. durum Desf u 5 linii oraz powstania nowej niewystępującej u T. aestivum L. 178 Genetyka roślin pary podjednostek 5+12 w locus Glu-D1. Wyniki wykazały, że hybrydyzacja introgresywna T. aestivum L. z gatunkiem tetraploidalnym (AA BB) T. durum Desf może prowadzić do uzyskania w odmianach pszenicy heksaploidalnej wyraźnych i korzystnych zmian technologicznych ziarna uwarunkowanych genetycznie. W111. Zróżnicowanie populacji sudeckich buka (Fagus sylvatica L.). Maria Krzakowa (1), Jan Matras (2) (1) Uniwersytet im.Adama Mickiewicza w Poznaniu, Zakład Genetyki, ul. Międzychodzka 5, 60-371 Poznań (2) Instytut Badawczy Leśnictwa, Zakład Genetyki Drzew Leśnych, Sękocin, 05-090 Raszyn Buk (Fagus sylvatica L.) był obok jodły i świerka podstawowym gatunkiem lasotwórczym regla dolnego. Obecnie, jego rola jest bardzo ograniczona wskutek wzmożonej uprawy świerka. Szczególnie drastyczny ubytek lasów bukowych w Sudetach zmusza leśników do stosowania metod zachowawczych. Poznanie struktury genetycznej ułatwi wybór różnych rodzajów selekcji: populacyjnej, rodowej lub indywidualnej dla zachowania ich puli genowej. Przebadano 5 populacji pod względem szczególnie wybranych dwóch układów enzymatycznych (Px i MDH) wykazujących w innych pracach zmienność geograficzną. Badania enzymatyczne prowadzone są w różnych krajach Europy, co pozwoli porównać skalę zmienności naszych rodzimych populacji. Wszystkie populacje okazały się polimorficzne i różnią się częstością genotypów. Niektóre genotypy okazały się charakterystyczne dla populacji.� W112. Coevolutionary hotspots in man-made habitats: from ecological to molecular evidences. Marlena Lembicz (1), Paweł Olejniczak (2), Artur Jarmolowski (3), Ziemowit Olszanowski (4) (1) Department of Plant Taxonomy, A. Mickiewicz University, Niepodległości 14, 61-713 Poznań, Poland. (2) Institute of Nature Conservation, Polish Academy of Science, Mickiewicza 33, 31-120 Kraków, Poland. (3) Department of Gene Expression, A. Mickiewicz University, Miedzychodzka 5, 61-701 Poznań, Poland. (4) Department of Animal Taxonomy and Ecology, A. Mickiewicz University, Szamarzewskiego 91A, 60-569 Poznań, Poland. The origin and effects of an evolutionary game between species from three different kingdoms, plants, fungi and animals are reported. We present ecological and molecular evidences that the interaction discovered in the man-made habitats leads to early stage of coevolution. The grass Puccinellia distans was observed to rapidly spread in new manmade habitats, while at the same time it is colonised by the fungus Epichloë typhina. Invasion of infected grasses is accompanied by alterations in life histories of both species. P. distans developed features promoting long-distance spreading, E. typhina changed its life cycle by forming sexual structures a second time later in the season. This enables the fungus to make use of the late shoots of the grass for sexual reproduction, even though it cannot be completed, since the vector of spermatia necessary for fertilisation, female Botanophila flies, is not present at the time. This indicates that uncoordinated evolutionary processes have taken place before interactions between organisms become so specialised that it is difficult to imagine they were the result of natural selection. Moreover, the processes could have been initiated in man-made habitats – becoming in particular circumstances – coevolutionary hotspots. W113. Genetyczno-środowiskowe uwarunkowania tolerancji sosny zwyczajnej (Pinus sylvestris L.) na zanieczyszczenia przemysłowe. Wiesław Prus-Głowacki (1), Ewa Chudzińska (1), Aleksandra Wojnicka-Półtorak (1), Leon Kozacki (2), Katarzyna Fagiewicz (2) (1) Zakład Genetyki UAM Poznań (2) Instytut Geografii Fizycznej i Kształtowania Środowiska Przyrodniczego UAM Poznań� Celem badań było określenie poziomu zmienności genetycznej i zbadanie struktury genetycznej populacji Pinus sylvestris pod wpływem silnego zanieczyszczenia środowiska wynikającego z działalności Huty Cynku w Miasteczku Śląskim. Analizowana populacja sosny pochodziła z naturalnego odnowienia i w jej składzie obserwowano drzewa wykazujące niekorzystne objawy wpływu wielostronnego stresu przemysłowego (S– sensitive) i drzewa, które takich objawów nie wykazują (T– tolerant). Zebrano materiał, którym były paki zimowe i 2-letnie igły oraz szyszki z 40 osobników wykazujących wyraźne symptomy uszkodzeń takie jak nekrozy i chlorozy igieł, nietypowy pokrój i słaby wzrost, oraz z 40 drzew nie wykazujących uszkodzeń. Zawartość metali ciężkich (Cd, Cr, Cu, Ni, Pb, i Zn) w glebie badano pobierając próby glebowe po pięć wzdłuż 4 transektów, w odstępach co 50 metrów. Analizy wykonano metodą 179 Genetyka roślin absorpcyjnej spektrometrii atomowej. W celu określenia struktury genetycznej drzew tolerancyjnych i wrażliwych na skażenie posłużono się metodą badania zmienności izoenzymów dla 18 loci genowych w ramach 11 systemów enzymatycznych. W badanych grupach drzew określano częstości alleli i genotypów, średnią liczbę alleli (A/L) i genotypów (G/L) na locus, heterozygotyczność obserwowaną (Ho) i spodziewaną (He), indeks polimorfizmu genotypów (Pg) oraz współczynnik Wright-a (F). Badania cytogenetyczne wykonywano metoda zgniatania stożków wzrostu korzeni kiełkujących nasion pobranych z drzew uszkodzonych i nie wykazujących uszkodzeń. Preparaty rozgniatano w 45% kwasie octowym i barwiono techniką Giemsy. W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że struktura genetyczna w obu grupach drzew różni się znacząco. W grupie T zaobserwowano niższą liczbę alleli i genotypów na locus, wyższy poziom heterozygotyczności oraz niższą liczbę aberracji chromosomowych niż w grupie S, co wskazuje na bezpośredni wpływ zanieczyszczeń na materiał genetyczny drzew. Praca wykonana w ramach projektu interdyscyplinarnego UAM: Genetyczno-środowiskowe uwarunkowania tolerancji drzew leśnych na zanieczyszczenie przemysłowe – PI-II/12003. Komunikaty plakatowe: P222. Ocena interakcji genotypowo-środowiskowej linii DH jęczmienia pod względem cech morfologicznych i fizycznych źdźbła determinujących odporność. Stanisław Jeżowski, Maria Surma, Tadeusz Adamski, Paweł Krajewski, Katarzyna Głowacka Instytut Genetyki Roślin, PAN, 60-479 Poznań, ul. Strzeszyńska 34 Praca przedstawia wyniki badań dotyczące wpływu warunków środowiska na kształtowanie się cech morfologicznych i fizycznych źdźbła oraz stopnia wylegania u wybranych form jęczmienia jarego. Materiał do badań stanowiły linie podwojonych haploidów (DH) uzyskane z mieszańców F1 między oplewioną formą RK63/1 i nagoziarnistą 1N86. Linie DH, formy wyjściowe oraz mieszańce F1 F2 badano w trzyletnim doświadczeniu polowym założonym w układzie bloków losowanych w trzech powtórzeniach. Analizowano długość, średnicę i grubość źdźbła, wskaźnik elastyczności źdźbła (moduł Younga) oraz stopień wylegania, który oceniano na polu w skali bonitacyjnej 1-9, gdzie 1 oznaczał brak wylegania a 9 najwyższe wyleganie. W badaniach stwierdzono istotny wpływ lat, genotypów oraz interakcji lata x genotypy na zmienność analizowanych cech. Ocena i testowanie porównań między oplewionymi a nagoziarnistymi liniami jęczmienia wykazała, że formy oplewione charakteryzowały się istotnie grubszymi i dłuższymi źdźbłami, większa ich elastycznością oraz mniejszym stopniem wylegania. Natomiast wielkość i kierunek różnic miedzy liniami oplewionymi a nagoziarnistymi pod względem analizowanych cech zależny był od warunków środowiskowych. P223. Analiza wpływu biotypów i herbicydów na wybrane cechy ilościowe pszenżyta heksaploidalnego. Czesław Stankiewicz Zakład Genetyki i Fizjologii Roślin, Instytut Biologii, Akademia Podlaska w Siedlcach Pod względem areału uprawy pszenżyto w Polsce zajmuje piąte miejsce. Uprawiane w kraju heksaploidalne odmiany pszenżyta łączą korzystne właściwości żywieniowe pszenicy z małymi wymaganiami glebowymi i dobrą mrozoodpornością żyta. Pod względem ewolucyjnym pszenżyto jest jeszcze młodą rośliną uprawną, co uzasadnia dalsze prowadzenie badań hodowlanych w kierunku plonu ziarna oraz jego cech ilościowych (białko, skrobia, aminokwasy egzogenne, CS, EAAI). Materiał badawczy stanowiło ziarno, które pochodziło z doświadczeń poletkowych prowadzonych w Stacji Doświadczalnej Zawady. Eksperyment polowy wykonano w latach 1999-2001 na glebach klasy bonitacyjnej IVb, na kompleksie rolniczym żytnim dobrym (5). Doświadczenie założono metodą split-plot w czterech powtórzeniach. Zbioru ziarna dokonano w fazie pełnej dojrzałości. Analizy chemiczne wykonano w trzech powtórzeniach. W doświadczeniu analizowano wpływ biotypów (pszenżyto ozime-odmiana Tornado oraz pszenżyto jare-odmiana Wanad) i herbicydów (Arelon 75 WP, Puma Super 069 EW) na zawartość skrobi (metoda spektrofotometryczna) białka ogółem (metoda Kjeldahla), aminokwasy egzogenne oraz biologiczną wartość białka (CS-Mitchella i Blocka, EAAI-Oser). W celu stwierdzenia istotności różnic w wartościach badanych cech ilościowych, wyniki opracowano przy pomocy analizy wariancji w układzie całkowicie losowym oraz testu Tukey-a przy poziomie istotności p=0,05. Dodatkowo stwierdzono istotny wpływ lat na skład chemiczny ziarna pszenżyta. 180 Genetyka roślin P224. Obrazy mikroskopowe parametrów strukturalnych nasion oraz genetyczna zmienność cech u mutantów lędźwianu siewnego (Lathyrus sativus L.). Wojciech Rybiński (1), Wioletta Błaszczak (2), Józef Fornal (2) (1) Instytut Genetyki Roślin PAN, Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań (2) Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności PAN, Tuwima 10, 10-747 Olsztyn Z uwagi na wysoką zawartość białka w nasionach (do 32%), znaczną tolerancję na rodzaj gleb oraz wybitną odporność na suszę, lędźwian siewny może być cennym uzupełnieniem palety roślin strączkowych uprawianych w Polsce. Warunkiem szerszego wprowadzenia tej rośliny do krajowego rolnictwa jest konieczność genetycznego poprawienia szeregu niekorzystnych cech użytkowych. W wyniku zastosowania chemomutagenów uzyskano mutanty lędźwianu siewnego w odniesieniu do cech morfologicznych, terminu dojrzewania oraz parametrów struktury plonu. Szczególnie wartościowe są mutanty o obniżonej wysokości roślin, wyższym osadzeniu najniższego strąka oraz ograniczeniu wielkości biomasy poprzez redukcję liczby rozgałęzień bocznych. Genotypy te charakteryzują się poprawieniem odporności na wyleganie oraz skróconym okresem dojrzewania, co ma podstawowe znaczenie w warunkach klimatycznych Polski. Część mutantów w porównaniu z ich odmianami wyjściowymi – Derek i Krab wyróżniają wyższe parametry struktury plonu jak liczba strąków z rośliny, długość i szerokość strąka, liczba i masa nasion z pojedynczego strąka oraz rośliny. Dla wybranych mutantów i ich form wyjściowych wykonano analizę cech masowych i geometrycznych oraz mikrostruktury w mikroskopie JEOL 5200. Analizowano wymiary nasion, grubość i budowę łupiny nasiennej, wymiary i budowę znaczka i jego szczeliny a także wielkość i budowę komórek liścieni. W odniesieniu do wymienionych cech wykazano zróżnicowanie mutantów w porównaniu z ich formami wyjściowymi. Stwierdzono między innymi, że powierzchnia nasion może być podstawą do identyfikacji badanych obiektów. P225. Struktura interakcji genotypowo-środowiskowej linii podwojonych haploidów jęczmienia pod względem cech technologicznych. Michał Rebarz, K. Krystkowiak, A. Kuczyńska, T. Adamski, Z. Kaczmarek, M. Surma, S. Jeżowski Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk, ul.Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań , e-mail: [email protected] Przedmiotem badań była interakcja genotypowo-środowiskowa linii podwojonych haploidów (DH) jęczmienia dla cech związanych z wartością browarną ziarna. Materiał do badań stanowiło 28 linii DH, w tym 13 dwu– i 15 sześciorzędowych otrzymanych z mieszańców pokolenia F1 browarnej odmiany Maresi (dwurzędowa) z pastewną odmianą Pomo (sześciorzędowa). Podwojone haploidy zostały wytworzone metodą „bulbosową”. Doświadczenia przeprowadzono w sześciu różnych środowiskach. W każdym środowisku eksperyment zakładano w układzie bloków losowanych kompletnych z trzema powtórzeniami. Badano następujące cechy browarne ziarna jęczmienia: zawartość białka, liczba Kolbacha oraz ekstrakt z mąki. Słodowanie próbek ziarna zostało przeprowadzone w mikrosłodowni typu AMS (firmy Phoenix Biosystems). Analizy słodu zostały wykonane zgodnie z zaleceniami EBC (European Brewery Convention). Do oceny interakcji genotypowo-środowiskowej wykorzystano program SERGEN©. Testowano efekty główne dla poszczególnych linii oraz ich interakcję ze środowiskiem. Na podstawie wartości statystyki F dla interakcji genotypowośrodowiskowej linie podzielono na stabilne (interakcja nieistotna statystycznie) oraz niestabilne (interakcja istotna). Linie niestabilne zostały sklasyfikowane jako ekstensywne przypadku, kiedy współczynnik regresji był statystycznie istotny i ujemny oraz intensywne przy dodatnim i istotnym współczynniku regresji. Nie znaleziono różnic w reakcji na warunki środowiska linii dwu– i sześciorzędowych: liczba linii stabilnych i niestabilnych była zbliżona w obu grupach linii DH. Wyselekcjonowano dwie linie (S10 i D2), które wykazywały nieistotny efekt główny dla zawartości białka i liczby Kolbacha, natomiast w przypadku ekstraktu z mąki oceny efektów głównych były dodatnie i stabilne. P226. Analiza białek gliadynowych przy użyciu wolnostrefowej elektroforezy kapilarnej do określenia podobieństwa genetycznego odmian pszenicy jarej. Marcin Moczulski, Jan Bocianowski, Bolesław P. Salmanowicz Instytut Genetyki Roślin PAN, ul. Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań W pracy przedstawiono wyniki oszacowania przydatności wolnostrefowej elektroforezy kapilarnej w celu określenia podobieństwa genetycznego dwudziestu czterech odmian pszenicy jarej na podstawie składu białek gliadynowych. Zastosowana technika zapewnia szybkie, powtarzalne i o wysokiej rozdzielczości rozdziały elektroforetyczne białek, 181 Genetyka roślin również występujących w bardzo małych ilościach w analizowanych próbach. Analizy przeprowadzono na aparacie do wysokosprawnej elektroforezy kapilarnej firmy Beckman (USA) typu PACE System 2100 z użyciem nieusieciowanej kapilary o średnicy wewnętrznej 0,05 mm i długości 270 mm. Porównano czasy migracji poszczególnych białek gliadynowych, którym odpowiadały piki na elektroforegramach. Na ich podstawie wyznaczono współczynniki podobieństwa genetycznego, które posłużyły do hierarchicznego pogrupowania odmian metodą najkrótszych średnich połączeń. Wyniki grupowania przedstawiono w postaci dendrogramu. P227. Substytucje A/Am i ich ekspresja we wtórnych formach pszenżyta tetraploidalnego z kompletnym genomem A. Wojciech Sodkiewicz, Barbara Apolinarska, Teresa Sodkiewicz Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk, ul. Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań Badania mają na celu rozróżnienie chromosomów należących do genomu A pszenżyta heksaploidalnego i chromosomów pochodzących z genomu Am pszenicy diploidalnej (Triticum monococcum) we wtórnych formach pszenżyta, a także sprawdzenie skuteczności tego zabiegu na przykładzie analizy populacji wtórnych form tetraploidalnego pszenżyta z substytucjami A/Am. Genotypy substytucyjne wytworzone zostały poprzez krzyżowanie pszenżyta heksaploidalnego z syntetycznym allotetraploidem T. monococcum/ S. cereale (Am/Am). Porównawcze barwienie chromosomów metodą C-prążkową wykazało, że chromosomy T. monococcum wybarwiają się trudniej w rejonach heterochromatynowych niż chromosomy genomu A z pszenżyta heksaploidalnego. Wykorzystując tę różnicę zaklasyfikowano wstępnie występujące substytucje i określono ich sprzężenie z wyznaczonymi jako markerowe cechami fenotypowymi. Na podstawie obliczonych sprzężeń uściślono pierwotne analizy cytologiczne. Wyznaczono częstość substytucji poszczególnych chromosomów z genomu A do pierwotnego amfitetraploida (AmAmRR). P228. Wewnątrzgatunkowa zmienność Solidago virgaurea w wybranych cechach morfologii w uprawie doświadczalnej. Ewa Maria Pawlaczyk, Maria Anna Bobowicz, Mirosława Szymańska, Ewa Maria Pawlaczyk Zakład Genetyki, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu, ul. Międzychodzka 5, 60-371 Poznań Celem badań było przeanalizowanie genetycznej zmienności cech morfologicznych w warunkach uprawy wybranych polskich populacji dwóch form z rodzaju Solidago – nawłoć: Solidago virgaurea ssp.virgaurea – formy niżowej i Solidago virgaurea ssp. alpestris – formy alpejskiej. Powodem, który przyczynił się do podjęcia tego tematu był dyskusyjny status taksonomiczny Solidago virgaurea L. ssp. alpestris. Niektórzy badacze reprezentowali pogląd, że jest on subalpejskim ekotypem Solidago virgaurea L., lub subalpejską odmianą Solidago virgaurea L. spotykaną w górach Środkowej Europy. Według innego poglądu Solidago virgaurea L. ssp. alpestris był uznawany za podgatunek, lub za odrębny gatunek. Referowane badania przeprowadzono na: 9 cechach liści rozetkowych, 7 cechach pokroju rośliny i 9 cechach kwiatowych. W sumie zbadano 220 roślin z uprawy doświadczalnej założonej na poletku doświadczalnym Zakładu Genetyki UAM na terenie Ogrodu Botanicznego w Poznaniu. Dane z badań biometrycznych zostały następnie opracowane za pomocą wielozmiennych analiz statystycznych. Obliczono: charakterystyki zastosowanych cech, współczynniki korelacji między cechami, wielozmienną analizę wariancji, rozkład i test t-Studenta, analizę zmiennych dyskryminacyjnych i odległości Mahalanobiosa wraz z najkrótszym dendrytem oraz wykonano grupowanie metodą najbliższego sąsiedztwa na podstawie odległości Euklidesa. Analizie poddano dane w 2 wariantach: I wariant – trzy populacje alpejskie, II wariant – dwie populacje niżowe. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono występowanie statystycznie istotnego genetycznego zróżnicowania między formą alpejską a niżową w następujących cechach: długości zewnętrznego kwiatka języczkowego; długości pylników; największej szerokości liścia rozetkowego; długości łodygi; długości kwiatostanu; liczby koszyczków w kwiatostanie. Stwierdzono również, że zmienność między formami jest większa, niż zmienność w obrębie form. Potwierdza to hipotezę o wysokiej randze tych taksonów. W świetle wyników uzyskanych ze wszystkich analiz, można wnioskować, że mamy do czynienia z dwoma dobrze wyróżnionymi formami. 182 Genetyka roślin P229. Wykorzystanie systemu DH-MAS w hodowli syntetycznych odmina rzepaku ozimego (Brassica napus L.). Laurencja Szała, Teresa Cegielska-Taras, Wiesława Popławska, Alina Lierch, Iwona Bartkowiak-Broda Instytut Hodowli i Aklimatyzcji Roślin, Zakład Genetyki Roślin Oleistych, Pracownia Kultur Tkankowych, 60-479 Poznań, ul. Strzeszyńska 36 U rzepaku występuje wysoki efekt heterozji w plonie nasion, który może być wykorzystany w odmianach mieszańcowych i syntetycznych. W przypadku odmian syntetycznych efekt heterozji zależy od stopnia wzajemnego przepylenia linii składowych oraz ich zróżnicowania genetycznego. Podjęto badania nad tworzeniem tego typu odmian z linii podwojonych haploidów (DH). Pierwszy etap badań ma na celu ocenę możliwości selekcji linii DH o wysokim stopniu obcoprzepylenia przy pomocy markerów izoenzymatycznych. Do doświadczenia wybrano 13 linii DH rzepaku ozimego różniących się dwoma układami izoenzymatycznymi-PGI (izomeraza glukofosfora-nowa pH7,0 – EC-Nr 5.3.1.9. oraz LAP (aminopeptydaza leucynowa – pH7,0 – EC Nr 3.4.11.1.). Następnie wykonano badania polimorfizmu tych systemów w pokolenia F1 uzyskanego w wyniku przepylenia tych linii w warunkach kontrolowanych i swobodnego pylenia. P230. Ocena mieszańców międzygatunkowych Lupinus albus (sensu lato) x Lupinus mutabilis pod względem cech morfologicznych. Ewa Sawicka-Sienkiewicz, Renata Galek, Jolanta Augiewicz, Kamila Nowosad Akademia Rolnicza we Wrocławiu, Katedra Hodowli Roślin i Nasiennictwa, ul. Cybulskiego 34, 50-205 Wrocław Południowo amerykański uprawny gatunek Lupinus mutabilis Sweet został uznany jako perspektywiczna roślina dla warunków klimatu umiarkowanego. Wysoka zawartość białka (>40%) i tłuszczu (do 20%) w nasionach była przyczyną określenia go jako andyjskiej soi. Ze względu na długi okres wegetacji poszukuje się form wcześniej dojrzewających. W celu zwiększenia zmienności genetycznej wykonano szereg krzyżowań z gatunkiem Lupinus albus i jego dzikimi odmianami botanicznymi (L. termis, L. vavilovi i L. graecus), który jest dobrze zaadoptowanym gatunkiem do europejskich warunków klimatycznych. Pomimo wytworzonych barier cytogenetycznych udało się uzyskać osiem mieszańców analizowanych aż do pokoleniu F7 i F 8. U międzygatunkowych mieszańców różnice wysokości między wysokością pędu głównego i bocznych rozgałęzień są wyraźnie mniejsze niż u form rodzicielskich. Analizowano liczbę bocznych rozgałęzień, długość kwiatostanu i liczbę okółków kwiatowych pędu głównego i bocznych rozgałęzień oraz liczbę strąków i masę 1000 nasion. Zarówno mieszańce jak formy rodzicielskie odznaczały się istotnym zróżnicowaniem analizowanych cech morfologicznych a wartości współczynników zmienności wahały się od 6% do 49%. Sześć mieszańców pod względem większości cech było podobnych do form matecznych a dwa (L. albus „Wat” x L. mutabilis – Mut-136) i (L. termis x L. mutabilis XM.5) do form ojcowskich. Cztery mieszańce odznaczały się szybkim wzrostem i osiągały pełną dojrzałość na początku września. Żywotność pyłku ośmiu mieszańców i form rodzicielskich była wysoka. P231. Poszukiwanie zmienności genetycznej uzyskanej na drodze mutagenezy mikrospor rzepaku ozimego (Brassica napus L.). Laurencja Szała (1), Teresa Cegielska-Taras (1), Elżbieta Adamska (2), Krystyna Krótka (1) (1) Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Zakład Genetyki Roślin Oleistych, Pracownia Kultur Tkankowych, 60-479 Poznań, ul. Strzeszyńska 36 (2) Instytut Genetyki Roślin PAN, 60-479 Poznań, ul. Strzeszyńska 36 Zastosowanie mutagenezy w połączeniu z systemem podwojonych haploidów (DH) może przyspieszyć programy hodowlane mające na celu tworzenie zmienności, selekcję, dochodzenie do homozygotyczności oraz szybkie namnażanie pożądanych genotypów. Wynikiem prowadzonych badań nad mutagenezą rzepaku ozimego było uzyskanie 400 linii DH. Linie DH otrzymano z mikrospor naświetlanych promieniami UV lub traktowanych MNU. Wyniki analizy wariancji wykazały istotne różnice pomiędzy liniami DH a formą wyjściową we wszystkich badanych cechach. Posługując się metodą obliczonych kontrastów wyselekcjonowano linie o wartościach istotnie mniejszych lub większych od formy wyjściowej w cechach morfologicznych i biochemicznych. Ponieważ mutowane mikrospory pochodziły z homozygotycznej linii można przypuszczać, że każda zmiana występująca w homozygotycznej linii będzie zmianą mutacyjną. 183 Genetyka roślin P232. Morfologiczne i anatomiczne zróżnicowanie populacji kosodrzewiny (Pinus mugo Turra) z Tatr wyrażone w cechach igieł. Ewa Maria Pawlaczyk, Alina Bączkiewicz Zakład Genetyki, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza, ul. Międzychodzka 5, 60-371 Poznań Z 90 osobników kosodrzewiny (Pinus mugo Turra) pochodzących z 3 populacji tego gatunku występujących w Tatrach zebrano dwuletnie igły, które opracowano pod względem 13 morfologicznych i anatomicznych cech. Uzyskane dane poddano kompleksowej analizie z zastosowaniem wielozmiennych metod statystycznych, za pomocą których starano się wykryć zmienność między populacjami. Wykonano analizę zmiennych dyskryminacyjnych, obliczono charakterystyki zastosowanych cech i współczynniki korelacji między nimi. Wyznaczono odległości Mahalanobisa między każdymi dwoma drzewami i oceniono ich istotność za pomocą statystyki F. Przeprowadzono także grupowanie aglomeratywne metodą najbliższego sąsiedztwa na bazie odległości Euklidesa. Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że populacje kosodrzewiny różnią się między sobą wysoce statystycznie istotnie na podstawie zastosowanego zestawu cech igieł. Zaobserwowano, że populacje z Wielkiej Świstówki i Kotła Dziurawe są do siebie bardziej podobne, a populacja z Kotliny Jarząbczej różni się od pozostałych. Cechami, które najbardziej różnią badane populacje są wysokość i szerokość komórki epidermy. Ze względu na te dwie cechy populacje z Wielkiej Świstówki i Kotła Dziurawe tworzą jedną grupę, a populacja z Kotliny Jarząbczej jest wyraźnie różna od nich. P233. Zmienność i odziedziczalność cech mieszańców żyta ozimego. Irena Kolasińska Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Radzików Badano zmienność i odziedziczalność kilkunastu cech mieszańców prostych żyta pochodzących z krzyżowania linii męskosterylnych z restorerami płodności oraz mieszańców trójkomponentowych uzyskanych poprzez krzyżowanie męskosterylnych mieszańców prostych z restorerami. Doświadczenia polowe przeprowadzono w latach 1999-2002 (1-3 miejscowości, 3 powtórzenia, wielkość poletka 5m2). W latach 1999 i 2002 stwierdzono niską zmienność badanych cech zarówno u mieszańców prostych jak i trójkomponentowych. Najwyższe współczynniki zmienności stwierdzono dla wylegania (8.0%), porażenia mączniakiem (6.1%) i rdzą brunatną (6.6%). W 2000 roku obserwowano większą zmienność mieszańców prostych. Największe współczynniki zmienności stwierdzono dla cech: plon ziarna (13.3%), masa ziarna z kłosa (8.9%), termin kłoszenia (11.0%), porażenie rdzą brunatną (15.1%), wyleganie (13.0%), liczba opadania (13.1%). Badania wykazały wysoką odziedziczalność większości cech mieszańców prostych w latach 1999 i 2002. W obu latach stwierdzono wysokie współczynniki odziedziczalności w szerokim sensie – h2(s) ponad 0.7 dla cech: plon ziarna, masa ziarna ziaren kłosa, liczba ziaren w kłosie, masa 1000 ziaren, długość kłosa, pylenie, wysokość. W 1999 roku dodatkowo wysokim h2(s) wyróżniły się cechy: liczba kłosków w kłosie, masa hektolitra, wysokość roślin, termin kłoszenia, porażenie mączniakiem, wyleganie, liczba opadania, zawartość białka i zawartość lizyny. W 1999 roku współczynniki odziedziczalności w wąskim sensie – h2(w) ponad 0.6 stwierdzono dla wszystkich cech z wyjątkiem wylegania i zawartości włókna w ziarnie. Mieszańce tego typu wykazały wyższe współczynniki h2(s) większości cech niż mieszańce trójkomponentowe. U obu typów mieszańców wysoką odziedziczalność w szerokim sensie wykazały cechy: masa ziarna z kłosa, masa 1000 ziaren, długość kłosa. Spośród analizowanych cech najwyższe współczynniki h2(w) stwierdzono dla liczby ziaren w kłosie (0.54), liczby kłosków w kłosie (0.58) i terminu kłoszenia (0.45). P234. Wykorzystanie markerów genetycznych do identyfikacji szczepów w plantacjach nasiennych sosny zwyczajnej. Ireneusz J. Odrzykoski (1), Wojciech Wesoły (2), Wiesław Prus-Głowacki (1) (1) Zakład Genetyki, Instytut Biologii Eksperymentalnej, Uniwersytet im. A. Mickiewicza, Poznań (2) Zakład Selekcji, Nasiennictwa i Szkółkarstwa Leśnego, Katedra Hodowli Lasu, Akademia Rolnicza w Poznaniu Opracowano prostą metodę badania jednorodności genetycznej szczepów sosny zwyczajnej, opartą na markerach izoenzymatycznych. Wykorzystano polimorfizm produktów 17 loci o średniej heterozygotyczności He = 0.27. W odróżnieniu od metod stosowanych do tej pory, ekstrakty uzyskiwane są z diploidalnych pąków zimowych (zamiast haploidalnych endospermow), co pozwala na obniżenie kosztów genotypowania i przyspieszenie analiz. Metodę tę wykorzystano do weryfikacji mapy rozmieszczenia szczepów w plantacji nasiennej PN-34, w nadleśnictwie Zdrojowa 184 Genetyka roślin Góra (RDLP Piła). Na powierzchni 9,6 ha rośnie tu około 3000 szczepów z 71 drzew doborowych. Stwierdzono, że spośród 500 zbadanych szczepów rosnących w pięciu sektorach tej plantacji, 13% ma genotyp niezgodny z genotypem drzew doborowych wykorzystywanych do szczepień. Omówione będą możliwe przyczyny tej niezgodności. P235. Wstępna ocena mutantów odmiany Emir pod względem grubości ścian strąka i okrywy nasiennej na tle wybranych rodów i odmian (Lupinus angustifolius). Honorata Kalińska (1), Ewa Sawicka-Sienkiewicz (1), Renata Galek (1), Stawiński Stanisław (2) (1) Akademia Rolnicza, Katedra Hodowli Roslin i Nasiennictwa, ul. Cybulskiego 34 50-205 Wrocław (2) Hodowla Roślin Smolice Sp. z.o.o, Oddział Przebędowo 62-095 Murowana Goślina Postęp w hodowli łubinu wąskolistnego dotyczy głównie otrzymania form samokończących wegetację (o zdeterminowanym typie wzrostu), termoneutrealnych, odpornych na pękanie strąków i osypywanie nasion, dających wyższy plon, odpornych na choroby oraz otrzymania form o niskiej zawartości alkaloidów. Prace hodowlane powinny iść również w kierunku podwyższenia zawartości białka i tłuszczu w nasionach łubinu wąskolistnego (31 – 34% białka i 6,5 % tłuszczu). Według Clementsa i in. (2002) grubość ścian strąka oraz okrywy nasiennej ma istotny wpływ na zawartość związków odżywczych w nasionach oraz plon nasion. Selekcja genotypów w kierunku niższej proporcji ścian strąka i okrywy nasiennej mogłaby doprowadzić do zwiększenia koncentracji białka i tłuszczu w nasionach. W australijskich badaniach procentowy udział ścian strąka i okrywy nasiennej w całym strąku u 125 genotypów łubinu wąskolistnego wynosił od 21,8% do 26,2%, a ścian strąka od 32 do 35%. Dla porównania nasiona soi i grochu charakteryzują się kolejno 7% i 9% udziałem okrywy nasiennej w całym nasieniu, oraz 13% udziałem ścian strąka u grochu. W naszych pracach określono procentowy udział ścian strąka oraz okrywy nasiennej w stosunku do całego strąka dla 244 linii mutacyjnych z odmiany „Emir” oraz 16 rodów i odmian Lupinus angustifolius. Analizę przeprowadzono według metodyki Clementsa i in. (2002). Wstępnie wyselekcjonowano 18 linii mutacyjnych charakteryzujących się najniższymi wartościami powyższych cech w stosunku do kontroli. Procentowy udział okrywy nasiennej dla linii mutacyjnych wynosił od 14,91 % do 19, 55%, a dla kontroli (odmiana Emir) od 19,77% do 22,02%. Procentowy udział ścian strąka wynosił od 24,39% do 62,56% dla linii mutacyjnych, a dla kontroli od 34,56% do 42,63%. Linie mutacyjne pod względem grubości ścian strąka i okrywy nasiennej porównano z kolekcją rodów i odmian łubinu wąskolistnego. Dla kolekcji procentowy udział okrywy nasiennej wynosił 18,88% – 22,98%, a udział ścian strąka w całym strąku 30,32% – 38,62%. P236. Wstępne badania nad przyczynami obniżonej płodności u wybranych form L. angustifolius. Renata Galek (1), Ewa Sawicka-Sienkiewicz (1), Stanisław Stawiński (2), Patrycja Maniukiewicz (1) (1) Akademia Rolnicza, Katedra Hodowli Roslin i Nasiennictwa, ul. Cybulskiego 34 50-205 Wrocław (2) Hodowla Roślin Smolice Sp. z.o.o, Oddział Przebędowo 62-095 Murowana Goślina Materiał do badań nad płodnością stanowiło sześć wybranych odmian i rodów Lupinus angustifolius zróżnicowanych pod względem typu wzrostu (samokończenia) – dwa rody samokończące oraz trzy odmiany (ELF, EMIR, GRAF) i jeden ród o tradycyjnym typie wzrostu. Materiał pochodził ze Stacji Hodowli Roślin w Przebędowie. Badano następujące cechy na pędzie głównym: długość kwiatostanu [cm], liczbę kwiatków, oraz zawiązanych i zebranych strąków. Określono indeks płodności [%] u badanych obiektów. W trakcie maksymalnego pylenia roślin pobrano słupki ze środkowej i górnej części kwiatostanu głównego. Po wykonaniu preparatów obserwowano przebieg kiełkowania pyłku na znamieniu, przerastanie łagiewki pyłkowej oraz liczbę zalążków w zalążni w świetle mikroskopu fluorescencyjnego. Najwyższy indeks płodności stwierdzono u samokończących rodów (41,2% i 32,4%). U form o tradycyjnym wzroście indeks płodności wahał się od 26 (ród hodowalny oraz Emir) do 32,7% (Elf). Odmiana Graf miała indeks płodności na poziomie 29,2%. Stwierdzono obecność pyłku na znamieniu w 77% w części środkowej kwiatostanu, natomiast w górnej części kwiatostanu pyłek osadzał się tylko w 45%. W części środkowej kwiatostanu pyłek kiełkował u 70 % analizowanych znamion słupków, a w górnej u 43%. Obiekty o dobrym indeksie płodności tworzyły mniej niż cztery zalążki w zalążni w środkowej części kwiatostanu, a w górnej zaobserwowano mniejszą ich liczbę, szczególnie u jednego z rodów samokończących (1,7). U odmiany Elf, o tradycyjnym wzroście wystąpiła wyraźna zależność między wyższą płodnością a zmniejszoną liczbą zalążków w górnej części kwiatostanu (2,7). U pozostałych obiektów liczba zalążków w środkowej i górnej części kwiatostanu wynosiła cztery. W górnej części kwiatostanu stwierdzono średnio o jeden 185 Genetyka roślin zalążek mniej. Należy nadmienić, iż badane epigonalne formy charakteryzowały się dwa razy dłuższymi kwiatostanami od form o tradycyjnym wzroście. Powyższe wyniki wskazują, iż przyczyną obniżonej płodności łubinu w górnej i środkowej części kwiatostanu może być brak substancji pokarmowych lub fitohormonalnych, o czym świadczy niemożność osadzenia się pyłku na znamieniu, brak przerastania łagiewki pyłkowej przez szyjkę słupka, a w efekcie opadanie niezapłodnionych słupków oraz niedojrzałych zarodków. P237. Ocena podobieństwa genetycznego form żyta jarego na podstawie wybranych cech ilościowych. Henryk Bujak, Renata Galek Akademia Rolnicza we Wrocławiu, Katedra Hodowli Roślin i Nasiennictwa Przeprowadzone badania miały określić wzajemne podobieństwo genotypów żyta jarego pochodzących z różnych stref klimatycznych oraz określić ich przydatność do wznowionej hodowli tego gatunku. Materiałem badawczym było 20 kolekcyjnych form żyta jarego. Doświadczenia polowe założono metodą losowanych bloków w dwóch miejscowościach. Analizowano 9 cech struktury plonu oraz 3 cechy jakościowe ziarna. Średnie wartości cech pogrupowano na rozłączne grupy jednorodne testem Haufe-Geidel (1984). Do oceny zróżnicowania badanych genotypów i ich podziału na grupy wykorzystano metodę skupień Warda. Wykonano dendrogram metodą najdalszego sąsiedztwa i określono podobieństwo między obiektowe badanych genotypów za pomocą statystyki Fα (Mądry 1993). Dendrogram przecięto linią prosta na poziomie Fα otrzymując skupienia zawieszone na odpowiednich gałęziach. Skupienia te stanowią grupy jednorodne genotypów pod względem analizowanych cech. Analiza wariancji wykazała istotny wpływ środowisk na ekspresję badanych cech. Stwierdzono również istotne zróżnicowanie badanych genotypów dla większości cech z wyjątkiem krzewistości, zbitości kłosa i zawartości włókna w ziarnie. Dla liczby pięterek w kłosie, zbitości kłosa, masy 1000 ziaren, masy hektolitra, zawartości białka ogólnego i lizyny w ziarnie wystąpiła również istotna interakcja genotypowośrodowiskowa. Wykreślony dendrogram według metody najdalszego sąsiedztwa Warda pozwolił na podział badanych genotypów na grupy jednorodne i określenie odległości między nimi. Najbardziej podobne pod względem badanych cech okazały się genotypy leżące w blisko siebie na dendrogramie. Większość badanych genotypów stanowi samodzielne grupy jednorodne pod względem kompleksowej oceny wszystkich cech. P238. Możliwości poprawienia jakości nasion rzepaku ozimego (Brassica napus L.) przy udziale mutagenezy. Jan Olejniczak (1), Małgorzata Adamczak (1), Christian Moellers (2) (1) Instytut Genetyki Roślin PAN, Poznań 60-479 ul. Strzeszyńska 34 (2) Instytut Hodowli Roślin i Agronomii, Uniwersytet George-August Getynga D-37-075, ul. Von Siebold 8, Niemcy Od kilku lat zwiększa się wykorzystanie oleju rzepakowego do celów spożywczych i przemysłowych (biopaliwa, olej hydrauliczny). Wartość pokarmowa i przemysłowa oleju rzepakowego zależy głównie od zawartości oleju, białka, glukozynolanów oraz spektrum kwasów tłuszczowych. Na drodze mutagenezy można skutecznie zwiększać zakres zmienności cech decydujących o jakości oleju (RÖBBELEN 1990, OLEJNICZAK i in. 2000, 2003). Selekcję mutantów przeprowadzono w pokoleniu M3/M6 linii DH-0120 potraktowanej różnymi dawkami azydku sodu (SA) oraz N-nitrozo-N-metylomocznika (MNUA). Wyselekcjonowano 1576 linii mutantów, które następnie analizowano metodą spektrometrii odbiciowej w bliskiej podczerwieni (NIRS). Zawartość składników chemicznych w badanych liniach mutantów wahała się odpowiednio: olej 39.4 – 51.7%, białko 17.2 – 31.1%, glukozynolany 4.3 – 31.1 µM, kwas oleinowy 50.4 – 69.7%, kwas linolowy 6.1 – 14.4%, kwas linolenowy 6.1 – 14.4% i kwas erukowy 0.1 – 28.0%. Analizowane linie wykazały wyraźnie zwiększoną zmienność badanych cech w porównaniu do linii wyjściowej DH0120. Spośród badanej populacji linii mutantów dodatkowo analizowano metodą chromatografii gazowej (GLC) spektrum kwasów tłuszczowych dziewięciu form o wyraźnie zwiększonej zawartości kwasu oleinowego oznaczonego wstępnie metodą NIRS. Stwierdzono nieznaczne różnice dotyczące zawartości kwasu oleinowego oznaczonej metodą NIRS i GLC. Powyższy wynik wskazuje, iż metoda NIRS jest metodą efektywną, skuteczną i tanią, co ma istotne znaczenie w hodowli rzepaku. 186 Genetyka roślin P239. Zróżnicowanie wątrobowca Aneura pinguis (L.) Dumort. w Polsce na podstawie analiz cpDNA. Witold Wachowiak (1), Alina Bączkiewicz (2), Katarzyna Buczkowska (2, 3), Ewa Chudzińska (2) (1) Polska Akademia Nauk, Instytut Dendrologii, ul. Parkowa 5, 62– 035 Kórnik. (2) Uniwersytet im. A. Mickiewicza, Zakład Genetyki, Instytut Biologii Eksperymentalnej, 60-371 Poznań, ul. Międzychodzka 5, [email protected] (AB). (3) Uniwersytet im. A. Mickiewicza, Instytut Biologii Eksperymentalnej Pracownia i Zielnik Wątrobowców, ul. Szamarzewskiego 89/91, 60-568 Poznań. Aneura pinguis jest gatunkiem kosmopolitycznym, występującym od Arktyki poprzez strefę umiarkowaną do tropikalnej i spotykana jest w bardzo różnych siedliskach (Schuster, 1992). Tak szerokie rozprzestrzenienie nasuwa przypuszczenie, że gatunek ten może być geograficznie zróżnicowany na genetycznie odmienne warianty. Ze względu na brak wykrytych różnic w budowie morfologiczno – anatomicznej, w tym brak różnic w budowie sporofitów (bardzo istotnej cechy w klasycznej taksonomii mszaków), dotychczas nie znaleziono podstaw do wydzielenia podgatunków w obrębie A. pinguis (Schuster 1992). Badania izoenzymatyczne wskazują jednak na zróżnicowanie genetyczne w obrębie tego gatunku, a nawet istnienie gatunków kryptycznych (Szweykowski i Odrzykoski 1990). Celem pracy było zweryfikowanie powyższej hipotezy poprzez analizę wybranych rejonów DNA. W prezentowanej pracy przeprowadzono analizę sekwencyjną intronu genu tRNALeu cpDNA u osobników pochodzących z różnych regionów Polski: z Wielkopolski, Bieszczadów, Tatr i Białowieży. U osobników pochodzących z Wielkopolski w sekwencji badanego rejonu stwierdzono istnienie kilku substytucji nukleotydowych różniących je od osobników pochodzących z Bieszczadów i Tatr. U osobników z Białowieży wykryto sekwencje charakterystyczne dla osobników z pozostałych regionów geograficznych. Wynik ten wspiera hipotezę o istnieniu co najmniej dwóch gatunków kryptycznych. Uzyskane dane sekwencyjne posłużą do opracowania markerów PCR-RFLP pozwalających na analizę osobników z różnych części zasięgu gatunku a także analizę materiału zielnikowego. Badania przeprowadzone w ramach grantu KBN 0216/PO4/2002/22. Literatura: 1. Schuster, R.M. (1992): The Hepaticae and Anthocerotae of North America, Chicago:Field Museum of Nat. Hist. p. 937. Szweykowski, J. i Odrzykoski, I.J. (1990): Chemical differentiation of Aneura pinguis (L.) Dum. (Hepaticae, Aneuraceae) in Poland and some comments on application of enzymatic markers in bryology. In: Bryophytes Their Chemistry and Chemical Taxonomy, edited by Zinsmeister, H.D. and Mues, R.Oxford:Clarendon Press. p. 437-448. P240. Genetyczna zmienność wątrobowca Aneura pinguis (L.) Dumort. Alina Bączkiewicz, Katarzyna Buczkowska, Ewa Chudzińska Zakład Genetyki, Instytut Biologii Eksperymentalnej, Uniwersytet im. A. Mickiewicza, 60-371 Poznań, ul. Międzychodzka 5, [email protected] (AB). Aneura pinguis (L.) Dumort. jest taksonem o szerokim holarktycznym zasiegu. W Polsce występuje zarówno na niżu jak i w górach. Nie jest jednak gatunkiem częstym ze względu na wąską skalę wymagań ekologicznych – rośnie tylko na nieeutroficznych siedliskach o zasadowym podłożu. Głównym celem pracy była ocena poziomu izoenzymatycznej zmienności tego gatunku. Przeanalizowano w sumie 91 populacji, w tym 52 z niżu (Białowieski Park Narodowy, Wielkopolska, Pomorze) oraz 39 z gór (Bieszczady, Tatry). Zbadano 8 układów enzymatycznych, w tym 9 loci: GOT, GDH, DIA, SDH, MDH-1, MDH2, IDH, PGM, PGI. Na podstawie otrzymanych wyników obliczono szereg parametrów genetycznych m. in. częstości alleli i genotypów, średnią liczbę alleli (A) i genotypów na locus (A/G), całkowite zróżnicowanie genetyczne HT, genetyczną zmienność w obrębie populacji HS, genetyczną zmienność pomiędzy populacjami DST oraz współczynnik genetycznego zróżnicowania GST. Uzyskane wyniki wskazują na duże zróżnicowanie genetyczne badanych populacji. Stwierdzono polimorfizm 96.9 % loci, średnia liczba alleli na locus wynosiła 3.6 (4.2 na locus polimorficzny). Wewnętrzne zróżnicowanie genetyczne HS było równe 0.35. Współczynnik zróżnicowania genetycznego GST okazał się wysoki dla 3 loci: GOT, MDH-2 i SDH osiągając średnią wartość równą 0.262. Zróżnicowanie geograficzne znalazło odbicie w strukturze genetycznej populacji. Na podstawie odległości genetycznych 187 Genetyka roślin i innych wyników można powiedzieć, że badane populacje niżowe różnią się od populacji górskich, ważną rolę w powyższym podziale odegrał genotyp GOT. Badania przeprowadzone w ramach grantu KBN 0216/PO4/2002/22. P241. Ocena zdolności kombinacyjnej form rodzicielskich pszenicy twardej ozimej (Triticum durum Desf.) na podstawie oceny cech ilościowych mieszańców F4. Dariusz Zalewski (1), Jaroslaw Bojarcyuk (2) (1) Katedra Hodowli Roślin i Nasiennictwa, Akademia Rolnicza we Wrocławiu, ul. Cybulskiego 34, 50-205 Wrocław (2) Hodowla Roślin Smolice sp. z o.o. Zmiany zachodzące w ostatnich latach w rolnictwie spowodowały wzrost zainteresowania uprawą Triticum durum w Polsce. Zwiększenia się spożycia makaronu a także wysokie ceny semoliny w połączeniu z problemami zbytu ziarna pszenicy zwyczajnej zachęcają do zajęcia się hodowlą tego gatunku zwłaszcza, że do Polski corocznie sprowadza się od 50 do 150 tys. ton ziarna pszenicy twardej. Dla prowadzenia hodowli tego gatunku istotne znaczenie ma poznanie zdolności kombinacyjnej przeznaczonych do krzyżowania odmian i linii, co w znacznej mierze może ułatwić uzyskanie korzystnych rekombinacji. Dlatego celem niniejszej pracy było oszacowanie ogólnej i swoistej zdolności kombinacyjnej użytych do krzyżowań form matecznych i ojcowskich linii pszenicy twardej ozimej (Triticum durum Desf.). Doświadczenie z uzyskanymi mieszańcami pszenicy twardej założono metodą wzorcową w Hodowli Roślin Smolice w sezonie wegetacyjnym 2002/2003. Analizę statystyczno-genetyczną przeprowadzono w oparciu o wyniki oceny sześciu cech: wysokości roślin, masy tysiąca ziaren, zawartości białka ogólnego, szklistości ziarna, liczby opadania oraz przezimowania w 208 mieszańcach F4 pszenicy twardej ozimej. Mieszańce te uzyskano w wyniku krzyżowania 25 linii z 11 testerami w układzie niekompletnym. W wyniku przeprowadzonej analizy wariancji stwierdzono istotne zróżnicowanie dla testerów i dla form matecznych dla wszystkich ocenianych cech. Dla użytych w krzyżowaniu linii i testerów obliczono efekty ogólnej i swoistej zdolności kombinacyjnej. Przeprowadzona analiza pozwoliła wskazać wartościowe genotypy o dobrej zdolności przekazywania cech. Wyodrębniono też grupę kombinacji krzyżowań dla wyboru korzystnych genotypów. Uzyskane wyniki wskazują na możliwość uzyskania wartościowych odmian krajowych. Pewnym problemem może być uzyskanie form dobrze zimujących, jednak stwierdzona znaczna zmienność pod względem tej cechy oraz wykazane liczne kombinacje o wysokiej zimotrwałości pozwalają oczekiwać postępu również dla tej cechy. 188 Genetyka Mikroorganizmów Wykład plenarny: W114. Komórki bakterii jako model w badaniach niestabilności ludzkich sekwencji mikrosatelitarnych. Adam Jaworski Zakład Genetyki Drobnoustrojów Uniwersytetu Łódzkiego, Łódź, Banacha 12/16, tel: (42)-635-44-66 e-mail: [email protected] Genom człowieka jest bogaty w różne sekwencje powtarzające się, które stanowią około 30 % jego DNA. Badania ostatnich 10 lat dostarczają coraz wiecej dowodów, że niestabilność genetyczna różnego typu sekwencji mikrosatelitarnych jest przyczyną wielu chorób genetycznych człowieka. W badaniach molekularnych mechanizmów leżących u podłoża niestabilności trójnukleotydowych sekwencji (TRS– trinucleotide repeat sequences), a także innych sekwencji powtarzających się zdolnych do tworzenia różnorodnych struktur przestrzennych, niezwykle przydatnymi modelami są bardzo dobrze zdefiniowane mutanty Escherichia coli oraz różnorodne wektory plazmidowe i fagowe. W czasie wykładu przedstawi się wyniki prac doświadczalnych z wykorzystaniem różnych mutantów E. coli oraz wektorów i systemów plazmidowych, które wskazują na rolę replikacji, transkrypcji, rekombinacji oraz systemów naprawy DNA w generowaniu w obrębie badanych sekwencji mikrosatelitarnych mutacji dynamicznych, w tym różnorodnych delecji oraz ekspansji. Wyniki omawianych prac dowodzą, że u podłoża niestabilności badanych ludzkich sekwencji leży ich zdolność do tworzenia w żywej komórce różnorodnych struktur przestrzennych, które z jednej strony stanowią zawadę dla procesów replikacji i transkrypcji DNA, z drugiej zaś jako nowego typu „uszkodzenia DNA” są rozpoznawane przez białka i systemy naprawcze. Ponadto, w miarę wydłużania się tego typu sekwencji w komórce stają się one tarczą dla procesów homologicznej rekombinacji. Modele molekularnych mechanizmów odpowiedzialnych za niestabilność ludzkich sekwencji mikrosatelitarnych, zbudowane w opraciu o wyniki prac doświadczalnych z wykorzystaniem komórek bakterii, w wielu przypadkach zostały już potwierdzone w badaniach z wykorzystaniem komórek drożdzy oraz linii komórkowych. Mutacje, rekombinacja, replikacja Komunikaty ustne: W115. Reguły wyznaczania regionu inicjacji replikacji w genomach bakteryjnych. Paweł Mackiewicz (1), Jolanta Zakrzewska-Czerwińska (2), Anna Zawilak (2), Mirosław R. Dudek (3), Stanisław Cebrat (1) (1) Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wrocławski, ul. Przybyszewskiego 63/77, 51-148 Wrocław (2) Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej, Polska Akademia Nauk, ul. Weigla 12, 53-114 Wrocław (3) Instytut Fizyki, Uniwersytet Zielono-Górski, ul. Szafrana 4A, 65-516 Zielona Góra Region inicjacji replikacji (oriC) jest miejscem, od którego rozpoczyna się replikacja chromosomu bakteryjnego. Replikacja podlega regulacji na poziomie inicjacji. Do identyfikacji potencjalnego regionu oriC zastosowano trzy niezależne metody komputerowej analizy sekwencji: badanie asymetrii w składzie nukleotydowym między różnie replikowanymi nićmi, wyznaczenie rozkładu boksów wiążących inicjatorowe białko DnaA oraz określenie położenia 189 Genetyka mikroorganizmów genu dnaA, kodującego białko DnaA. Analizy przeprowadzono na 120 zsekwencjonowanych genomach bakteryjnych. Określono skuteczność zastosowanych metod w identyfikowaniu regionu oriC, a chromosomy poklasyfikowano ze względu na zgodność tych metod. Analiza asymetrii DNA okazała się najbardziej uniwersalną metodą, jednak większą skuteczność przewidywania uzyskuje się uwzględniając wyniki wszystkich trzech metod. Trzy zastosowane metody zgodnie identyfikowały ten sam region jako oriC u wszystkich analizowanych mikroorganizmów należących do Bacilli i Clostridia, oraz większości przedstawicieli Actinobacteria i g-Proteobacteria. Sygnały związane z regionem inicjacji replikacji zostały natomiast utracone u bakterii, które prowadzą wewnątrzkomórkowy pasożytniczy lub symbiotyczny tryb życia, a ich genomy uległy znacznej redukcji. W większości chromosomów stwierdzono, że boksy DnaA pojawiają się częściej niż wynikałoby to z ich losowego występowania na chromosomie. Ponadto w wielu chromosomach zaobserwowano obecność więcej niż jednego zgrupowania boksów DnaA w okolicy regionu oriC. Zgrupowania te mogą uczestniczyć w regulacji procesu replikacji przez miareczkowanie stężenia aktywnego białka DnaA. W116. Wykorzystanie systemu rekombinacji miejscowo-specyficznej gd do badania roli białka FIS w organizacji superhelikalnych domen chromosomu bakteryjnego. Joanna Połeć, Paweł Stączek Zakład Genetyki Drobnoustrojów, Uniwersytet Łódzki, ul. Banacha 12/16, 93-208 Łódź, e-mail: [email protected] Obowiązujący obecnie model organizacji chromosomu bakterii z rodziny Enterobacteriaceae zakłada występowanie wielu (~50) niezależnych pętli, domen superhelikalnych, co powoduje, że zmiany poziomu superskręcenia w jednej z domen nie zmieniają tej wartości w pozostałych regionach chromosomu. Spośród grupy białek wewnątrzkomórkowych mogących potencjalnie odgrywać istotną rolę w organizacji przestrzennej chromosomu bakteryjnego, w literaturze naukowej zwraca się ostatnio uwagę na histonopodobne białko FIS. Dzięki swoim zdolnościom do wiązania się ze specyficznymi sekwencjami, wprowadzania zakrzywień w obrębie DNA oraz stabilizacji rozgałęzionych struktur superhelikalnych (badania in vitro), białko to może prawdopodobnie prowadzić zmiany w architekturze genomu, a tworzenie lokalnych stabilnych struktur DNA mogłoby stanowić barierę dla swobodnego przemieszczania się fali superskrętów. Postanowiono zbadać in vivo wpływ białka FIS na organizację domen chromosomu bakteryjnego. Do tego celu wykorzystano system rekombinacji miejscowo-specyficznej gd (gamma-delta) oraz zastosowano warunki wzrostu, w których białko FIS występuje w komórkach w podwyższonym stężeniu. Warunkiem koniecznym dla efektywnego procesu rekombinacji miejscowo-specyficznej gd jest brak barier ograniczających swobodną dyfuzję fali superskręcenia niezbędną do prawidłowego kontaktu dwóch oddziałujących ze sobą sekwencji. Badając częstość rekomobinacji w warunkach indukcji białka FIS można obserwować proces powstawania takich barier definiujących rozmiar domeny superhelikalnej.� Przy użyciu metody RT-PCR wykazano, iż w zastosowanych warunkach eksperymentalnych, gen fis ulega wzmożonej ekspresji. Ponadto, wzrost stężenia FIS w komórkach został potwierdzony techniką Western-blot. Wykazano, że w okresie czasu, w którym dochodzi do wzmożonej ekspresji fis, ma miejsce spadek częstości rekombinacji miejscowo-specyficznej gd. Może to świadczyć o potencjalnej zdolności białka FIS do zwiększania liczby barier organizujących domeny chromosomalne. W117. Wpływ białka CgtA z E. coli na ekspresję genów dnaA, seqA oraz recA. Celina Kanka, Aleksandra Sikora, Grzegorz Wegrzyn Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk Białka podrodziny Obg/GTP1 występują u wszystkich badanych pod tym kątem organizmów od bakterii do człowieka włącznie. Mimo ich powszechnego występowania, specyficzna rola, jaką odgrywają w procesach zachodzących w komórce pozostaje w dużej mierze niewyjaśniona. Szczególnie wyraźnie widać to na przykładzie regulacji replikacji DNA i innych procesów związanych z funkcjami chromosomu bakteryjnego. Dotychczasowe wyniki wskazują, że CgtA może brać udział w kontroli procesu replikacji chromosomalnego DNA B. subtilis (Kok et al., 1994) oraz pozachromosomalnych replikonów u E. coli (Ulanowska et al., 2003). Zaburzenia metabolizmu chromosomalnego DNA obserwowano również podczas nadprodukcji białka CgtAE w komórkach E. coli (Dutkiewicz et al., 2002). Sugerowano również niezależny od replikacji DNA udział tego białka w rozdziale chromosomu i podziale komórki (Kobayashi et al., 2001). Wykazano natomiast wpływ mutacji w genie cgtA na wydajność naprawy DNA (Zielke et al., 2003). Niemniej jednak, nawet w przypadku, gdy dane procesy związane z funkcjami chromosomów bakteryjnych są wyraźnie zaburzone w warunkach dysfunkcji lub nadekspresji genu cgtA, bardzo niewiele wiadomo jest o mechanizmie regulacji 190 Genetyka mikroorganizmów tych procesów przez białko CgtA. Teoretycznie może to być regulacja bezpośrednia lub pośrednia, na przykład poprzez kontrolę translacji mRNA genów, których produkty są zaangażowane w metabolizm DNA. Taką możliwość sugeruje fakt, że CgtA oddziałuje bezpośrednio z podjednostkami rybosomów. Faktycznie sugerowano, a w dwóch przypadkach wykazano eksperymentalnie, że białko CgtA może uczestniczyć w regulacji ekspresji różnych genów (Maddock et al., 1997; Ulanowska et al., 2003; Zielke et al., 2003). Przy użyciu metody ,,dot-blot RNA”określiliśmy poziom transkryptów genów dnaA, seqA oraz recA w warunkach inaktywacji genu cgtA. Nie zaobserwowaliśmy zmian w poziomie mRNA genu seqA, natomiast ekspresja genów dnaA oraz recA była obniżona. W celu sprawdzenia czy produkt genu cgtAE wpływa na ekspresję genów kodujących białka DnaA (takie sugestie już się pojawiły), SeqA oraz RecA skonstruowaliśmy fuzje transkrypcyjne promotorów tych genów z genem reporterowym lacZ. W118. Kofeina i jej pochodne zapobiegają mutagennemu działaniu MPTP (1-metylo-4fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyny). Katarzyna Ulanowska (1), Jacek Piosik (2), Anna Gwizdek-Wiśniewska (3), Agata Czyż (4), Grzegorz Węgrzyn (1) (1) Katedra Biologii Molekularnej UG, Kładki 24, 80-822 Gdańsk (2) Katedra Biologii Molekularnej i Komórkowej; Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii Uniwersytetu Gdańskiego i Akademii Medycznej w Gdańsku (3) Katedra Technologii lLeków i Biochemii Politechniki Gdańskiej, Narutowicza 11, 80-952 Gdańsk (4) Pracownia Biologii Molekularnej afiliowana przy UG, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN MPTP (1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyna) jest substancją neurotoksyczną, wywołującą u zwierząt laboratoryjnych objawy charakterystyczne dla choroby Parkinsona. Opublikowane w ostatnich latach badania wykazały, że kofeina może chronić przed wystąpieniem objawów parkinsonizmu bądź zmniejszyć progresję choroby. W tym celu przeprowadzono badania na zwierzętach, u których sztucznie wywoływano objawy chorobowe za pomocą MPTP oraz podawano kofeinę. Badania te wykazały, że kofeina podana wraz z MPTP przeciwdziała między innymi ubytkowi dopaminy wywoływanego przez tą neurotoksynę. Nie wysunięto jednak jednoznacznej hipotezy wyjaśniającej mechanizm takiego ochronnego wpływu kofeiny. Inną właściwością MPTP jest jego mutagenne działanie wobec komórek bakteryjnych. Wykorzystując test mutagenności na komórkach Vibrio harveyi wykazaliśmy, że kofeina jak i jej pochodne tzn.: pentoksyfilina i teofilina, przeciwdziałają mutagennemu działaniu MPTP. Kofeina oraz wiele neurotoksyn (w tym MPTP) są heterocyklicznymi związkami aromatycznymi. Jedną z właściwości kofeiny jest to, że może tworzyć mieszane kompleksy stakingowe z innymi związkami aromatycznymi, co zostało opisane chociażby na przykładach bezpośredniego oddziaływania mutagenów akrydynowych (ICR191 i ICR170 ) z kofeiną i innymi metyloksantynami. Dlatego też wysoce prawdopodobnym wydaje się fakt, że jednym z mechanizmów ochronnego działania kofeiny wobec neurotoksyn jest bezpośrednie oddziaływanie między tymi związkami poprzez tworzenie hydrofobowych kompleksów stakingowych. Wyniki badań mikrokalorymetrycznych wykazały egzotermiczny efekt cieplny występujący podczas miareczkowania roztworu wodnego MPTP kofeiną i pentoksyfiliną. Efekt ten może świadczyć o bezpośredniej interakcji pomiędzy badanymi substancjami Komunikaty plakatowe: P242. Interakcja genu CSM1 kodującego białko, które wpływa na segregację chromosomów w mejozie I, z elementami kompleksu replikacji DNA w drożdżach. Monika Wysocka, Joanna Rytka, Anna Kurlandzka Zakład Genetyki, IBB PAN, Pawińskiego 5A, Warszawa, 02 –106 Rola białka Csm1 została częściowo poznana i postuluje się, że jest ono elementem monopoliny, kompleksu, który wiąże się z centromerami i odpowiada za orientację kinetochorów. Jego brak powoduje poważne zaburzenia w mejozie. Delecja genu Csm1 powoduje zwiększoną wrażliwość szczepu haploidalnego na benomyl oraz chlorek manganu oraz zaburzenia w segregacji chromosomów w czasie mejozy. Wydajność sporulacji diploida csm1delta/csm1delta jest niska i powstają nietypowe worki. Analiza interakcji białka Csm1 w systemie dwuhybrydowym wykazała, że większość białek łączących się z Csm1p jest zaangażowanych w replikację DNA. Poprzez koimmunoprecypitację wykazano, że Csm1p oddziałuje z trzema białkami 191 Genetyka mikroorganizmów rodziny Mcm2-7 (Mcm3, Mcm5, Mcm7) tworzącymi kompleks prereplikacyjny DNA. Nasze badania pozwoliły na wysunięcie przypuszczenia, że Csm1 stanowi element kompleksu odpowiedzialnego za przedmejotyczną rundę replikacji DNA.. P243. Mutageneza transpozonowa Mycobacterium smegmatis mc2 jako próba identyfikacji i charakterystyki genów zaangażowanych w biosyntezę ściany komórkowej. Arkadiusz Rainczuk (1), Piotr Bielecki (1), Anna Rumijowska-Galewicz (2), Jarosław Dziadek (2) (1) Zakład Genetyki Drobnoustrojów, Uniwersytet Łódzki (2) Centrum Biologii Medycznej PAN, Łódź Jednym z najważniejszych czynników patogenezy Mycobacterium tuberculosis (czynnik etiologiczny gruźlicy) jest unikatowa ściana komórkowa będąca istotną barierą przepuszczalności zarówno dla związków hydrofobowych jak i hydrofilowych. Ściana komórkowa prątków warunkuje również ich oporność na szereg potencjalnych leków oraz uczestniczy w reakcjach pomiędzy drobnoustrojem i systemem immunologicznym gospodarza. Ponadto jednymi z najskuteczniejszych tuberkulostatyków są inhibitory biosyntezy poszczególnych składników budujących ścianę komórkową prątków. Ze względu na powolny wzrost M. tuberculosis i związane z tym trudności metodyczne, najczęściej stosowanym modelem do badań mykobakterii są saprofityczne prątki M. smegmatis. � W niniejszej pracy zastosowano system genetyczny oparty o sztuczny transpozon skonstruowany na bazie sekwencji insercyjnej IS1096 pozwalający na skuteczną i wydajną mutagenezę szczepu M. smegmatis mc2 155. Przy zastosowaniu metody hybrydyzacji typu Southern wykazano, że element ten wbudowuje się w przypadkowe miejsca (random) w obrębie chromosomalnego DNA szczepu biorcy. Opracowano również metodę selekcji rekombinowanych prątków o zwiększonej przenikalności osłon komórkowych. Obecnie prowadzone są prace zmierzające do szczegółowej analizy genetycznej i fizjologicznej otrzymanych mutantów. P244. Izolacja trzech nowych genów drożdży piekarniczych Saccharomyces cerevisiae komplementujących mutację aci+. Ewa Boniewska (1), B. Machnicka (2), R. Grochowalska (2), T. M. Lachowicz (2) (1) Katedra Biologii Molekularnej i Eksperymentalnej, Uniwersytet Opolski (2) Instytut Biotechnologii, Uniwersytet w Zielonej Górze Działając na haploidalny szczep S. cerevisiae D273-10B/A1 EMS-em wyizolowano 32 mutanty (aci+), reprezentujące 17 grup komplementacyjnych, zakwaszające podłoże pełne z purpurą bromokrezolową. Analizie molekularnej poddano mutanta ER 24 reprezentującego III grupę komplementacyjną. Wykonano transformację drożdżowym bankiem genów zlokalizowanym na wielokopijnym plazmidzie pFL44L, izolowano plazmidy przywracające fenotyp dziki i sekwencjonowano ich wstawki pochodzące z genomowego DNA drożdży. Wyniki badań wykazały, że trzy, nieznane dotąd geny, komplementują cechę aci+ u badanego mutanta. Wyizolowanymi genami, umieszczonymi na plazmidzie wielokopijnym, transformowano przedstawicieli pozostałych grup komplementacyjnych. Okazało się, że w przypadku niektórych grup komplementacyjnych, po transformacji, dochodzi do przywrócenia fenotypu dzikiego u badanych mutantów. P245. Replikacja plazmidu pochodzącego od profaga Gifsy-1 z Salmonella enterica serotyp Typhimurium. Bartosz Słomiński (1), Borys Wróbel (2), Piotr Golec (1), Grzegorz Węgrzyn (1, 2) (1) Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk (2) Instytut Oceanologii, Polska Akademia Nauk, ul. Św. Wojciecha 5, 81-347 Gdynia Profag Gifsy-1 jest jednym z profagów obecnych w większości szczepów Salmonella enterica serotyp Typhimurium. Jest on jednym z fagów determinujących wirulencję szczepów S. enterica – niesie gen gipA, nizbędny w efektywnej kolonizacji jelita człowieka przez bakterie. Usunięcie profaga Gifsy-1 (jak również innego profaga obecnego w genomie S. enterica serotyp Typhimurium, Gifsy-2) prowadzi do istotnego obniżenia wirulencji bakterii. Co więcej, wydaje się, że przenoszenie cech wirulencji przez bakteriofagi na szczepy, które wcześniej nie były patogenne dla człowieka jest 192 Genetyka mikroorganizmów podstawowym mechanizmem prowadzącym do ewolucji patogenności wśród bakterii z rodzaju Salmonella. Poznanie budowy i funkcjonowania tych bakteriofagów ma niewątpliwie ogromne znaczenie w walce z patogennymi szczepami S. enterica. Bakteriofag Gifsy-1 należy do rodziny fagów lambdoidalnych ze względu na podobieństwo strukturalne budowy wirionów jak i organizacji i sekwencji materiału genetycznego. Rejon replikacyjny faga Gifsy-1 zawiera otwarte ramki odczytu, które odpowiadają genom obecnym w rejonie replikacyjnym bakteriofaga λ: cro, cII, O i P. Po amplifikacji tego rejonu metodą PCR i ligacji z genem determinującym oporność na antybiotyk powstał plazmid pGifsy-1, który funkcjonuje jako niezależny replikon w komórkach Escherichia coli. W pracy tej dokonano podstawowej charakterystyki plazmidu pGifsy-1 jak np. określenie liczby kopii plazmidu w komórkach E. coli. Zbadano też zależność replikacji plazmidu od funkcji białek szoku termicznego z rodziny Hsp 70, zdolność replikacji plazmidu w szczepach z mutacjami w genach dnaA oraz dnaA i seqA, zmapowano prawdopodobne miejsce origin replikacji. Udowodniono, że do replikacji plazmidu Gifsy-1 nie jest bezwzględnie wymagana obecność odpowiednika białka P faga λ oraz wykazano jego toksyczność w komórkach E. coli. Zbadano wpływ aktywacji transkrypcyjnej origin na amplifikację plazmidu pGifsy-1 oraz wskazano na możliwość istnienia zjawiska dziedziczenia kompleksu replikacyjnego. P246. Optymalizacja biologicznego testu wykrywania substancji mutagennych w środowisku morskim. Beata Podgórska (1), Ewa Chęć (1), Grzegorz Węgrzyn (1,2) (1) Instytut Oceanologii PAN, Sopot ul Powstańców Warszawy 55 (2) Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk Morza i oceany spełniają rolę ostatecznego odbiornika odpadów działalności człowieka. Niektóre z tych substancji wykazują szczególnie groźne działanie mutagenne. Związki mutagenne są często kancerogenne i powodują powstawanie nowotworów zarówno u zwierząt jak i człowieka. W środowisku morskim mutageny występują w bardzo niskich stężeniach i stanowią jedynie frakcję pośród wszystkich związków zanieczyszczających. Stanowi to poważną trudność w ich wykrywaniu i identyfikacji metodami chemicznymi. Z tego względu szczególnie użyteczne są testy biologiczne. Najczęściej stosowany jest test Ames’a, w którym do określenia mutagenności badanego materiału wykorzystuje się kilka szczepów bakterii Salmonella enterica serotyp Typhimurium, ale z uwagi na słabą ich przeżywalność w wodzie morskiej test ten jest tylko sporadycznie wykorzystywany w badaniach środowiska morskiego. Dlatego do badań tego środowiska stworzyliśmy nowy biologiczny test mutagenności na bazie genetycznie zmodyfikowanych szczepów bakterii Vibrio harveyi (mikroorganizm, który naturalnie występuje w morzu). Celem badań jest optymalizacja i adaptacja stworzonego przez nas biologicznego testu do wykrywania mutagenów w środowisku morskim. Sprawdzamy czy na wynik testu mają wpływ następujące czynniki: czas inkubacji z mutagenem, skład podłoża, w którym szczepy poddawane są działaniu substancji mutagennych oraz faza wzrostu bakterii. Ekspresja genów Komunikaty ustne: W119. Promotor p54 genu rpoH jest czynnym promotorem. Anna Janaszak, Wiktor Majczak, Beata Nadratowska, Grażyna Konopa, Jacek Jasiecki, Alina Taylor Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański Odpowiedź szoku termicznego u Escherichia coli kontrolowana jest przez dwa znane regulony: zależny od σ32 i zależny od σ24. Są jednak geny indukowane przez szok termiczny, kontrolowane przez σ54, produkt genu rpoN. Należy do nich operon pspA-E oraz gen kodujący małe białko szoku termicznego ibpB. W 1999 roku zauważono obecność sekwencji consensus promotora pσ54 przed genem rpoH kodującym σ32. Nasze analizy rejonu promotorowego genu rpoH pozwoliły stwierdzić występowanie potencjalnych sekwencji wiążących aktywatory PspF i NtrC oraz białko zginające DNA, IHF. Inicjacja transkrypcji z promotorów pσ54 jest ściśle kontrolowana na etapie topnienia DNA w obrębie sekwencji 193 Genetyka mikroorganizmów promotora. RNAPσ54 wiąże się z sekwencją promotora tworząc stabilny kompleks zamknięty. Izomeryzacja do kompleksu otwartego zależna jest od ATP i wymaga oddziaływania polimerazy z aktywatorem związanym do enhancera. Sekwencje enhancerów położone są w odległości 100 nt lub więcej od promotora, dlatego oddziaływanie to wymaga wypętlenia DNA ułatwianego przez IHF. Oczyszczono białka σ54, PspF, ∆HTH PspF i NtrC. W teście opóźniania migracji w żelu wykazano, iż holoenzym RNAPσ54 rzeczywiście wiąże się w rejonie regulatorowym genu rpoH. Doświadczenia z użyciem mikroskopii elektronowej potwierdziły ten wynik i wykazały, że holoenzym RNAPσ54 wiąże się w miejscu odpowiadającym sekwencji consensus promotora pσ54 genu rpoH. W testach opóźniania migracji w żelu wykazano również, że znany aktywator operonu pspA-E, białko PspF wiąże się w rejonie regulatorowym genu rpoH, podobnie jak NtrC, aktywator genów związanych m.in. z metabolizmem azotu. Doświadczenie „primer extension” wykazuje, że promotor pσ54 genu rpoH jest czynnym promotorem, jakkolwiek poziom transkrypcji z tego promotora jest znacznie niższy niż ze znanych promotorów genu rpoH: P1, P3, P4 i P5. W komórkach ∆rpoN nie stwierdzono transkrypcji z pσ54, a komplementacja tej mutacji przywraca transkrypcję. Doświadczenia transkrypcji in vitro wskazują, że białko PspF jest aktywatorem tego promotora. Operon psp aktywowany jest w odpowiedzi na warunki uszkadzające błonę komórkową. Być może więc w takich warunkach byłaby aktywowana transkrypcja z pσ54 genu rpoH, zapewniając dodatkowy poziom ekspresji tego genu. W120. Specyficzność substratowa IbpA i IbpB, małych białek szoku termicznego E. coli. Joanna Kwiatkowska, Dorota Kuczyńska-Wiśnik, Magdalena Kulma, Ewa Laskowska Katedra Biochemii UG, ul Kładki 24, 80-822 Gdańsk Białka IbpA i IbpB E. coli należą do grupy białek szoku termicznego. Oba białka są składnikami agregatów białkowych powstających w warunkach stresu termicznego w komórkach E. coli. Małe białka szoku termicznego IbpA i IbpB wiążą zdenaturowane termicznie lub chemicznie polipeptydy, dzięki czemu zapobiegają powstawaniu trwałych agregatów białkowych. Agregaty te ulegają następnie dysocjacji przy udziale innych białek opiekuńczych. Dotychczasowe doświadczenia wykazały, że w komórkach, w których białko IbpA jest nieobecne, tylko niewielka część IbpB (~ 2%) wiąże się ze zagregowanymi polipeptydami, podczas gdy większość IbpB znajduje się we frakcji białek rozpuszczalnych. Większość IbpA, zarówno w obecności jak i przy braku IbpB, związana jest z agregatami. Ponadto, w komórkach, w których nadprodukowano IbpA, zaobserwowano agregację prekursora β-laktamazy, kodowanego przez gen znajdujący się na plazmidzie niosącym gen ibpA. Podobnego efektu nie zaobserwowano w komórkach, w których nadprodukowano samo IbpB. Wyniki te sugerują, że białka IbpA i IbpB mogą rozpoznawać różne substraty. Możliwe jest także, że IbpA i IbpB rozpoznają te same polipeptydy, ale w różnym stadium denaturacji: IbpB – rozfałdowane, ale jeszcze niezagregowane białka, natomiast IbpA –polipeptydy w formie agregatów. W celu identyfikacji naturalnych substratów wiązanych przez białka IbpA i IbpB w warunkach szoku termicznego zastosowałyśmy dwie metody: chromatografię powinowactwową i koimmunoprecypitację. Skonstruowano plazmidy nadprodukujące białka fuzyjne: His-IbpA, His-IbpB oraz IbpA-His, IbpB-His. Obecność znacznika (His)6 na końcu aminowym lub karboksylowym białek fuzyjnych umożliwiła wiązanie kompleksów IbpA i IbpB z potencjalnymi substratami na kolumnie afinitywnej z jonami niklu (Ni-TED). Wstępne wyniki wykazały, że każde z białek, IbpA i IbpB, wiąże przynajmniej kilka różnych substratów. Białka te zostaną zidentyfikowane metodą spektroskopii masowej. � W121. Gen regulatorowy rosR w Rhizobium leguminosarum bv. trifolii: identyfikacja i funkcja w syntezie egzopolisacharydu. Monika Janczarek, Anna Skorupska Zakład Mikrobiologii Ogólnej, Uniwersytet im. M. Curie-Skłodowskiej, ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin Bakterie Rhizobium leguminosarum bv. trifolii syntetyzują znaczne ilości kwaśnego zewnątrzkomórkowego polisacharydu (EPS), który odgrywa istotną rolę w symbiotycznych oddziaływaniach z gospodarzem roślinnym –koniczyną. Rizobia produkujące EPS wykazują przewagę konkurencyjną w ryzosferze i zasiedlaniu brodawek gospodarza. Mutanty R. leg. bv. trifolii niezdolne do syntezy EPS indukują brodawki defektywne w redukcji azotu atmosferycznego. Gen rosR wyizolowano z genomowego DNA R. leg. bv. trifolii w reakcji PCR ze starterami homologicznymi do regionów flankujących gen rosR pokrewnego gatunku Rhizobium etli. Produkt reakcji PCR o wielkości 1,3 kpz. zawierał otwartą ramkę odczytu kodującą białko o masie 15,7 kDa, które było w 80% identyczne z białkiem RosR R. 194 Genetyka mikroorganizmów etli, Ros Agrobacterium tumefaciens, RosR Agrobacterium radiobacter i MucR Sinorhizobium meliloti. Wszystkie wymienione białka należą do rodziny transkrypcyjnych represorów, zawierających w swej sekwencji domeny wiążące DNA o strukturze palców cynkowych (C2H2). Białko represorowe Ros wiąże się do sekwencji Ros – box o długości 40 pz. zlokalizowanej powyżej promotora, zawierającej 9-nukleotydowe odwrócone powtórzenia. Pomimo wysokiego podobieństwa sekwencji aminokwasowej, białka Ros poszczególnych gatunków Rhizobium wykazują ogromne różnice funkcjonalne. Wszystkie te białka wpływają na produkcję egzopolisacharydu, ale mutanty w genie ros R. etli, A. tumefaciens i A. radiobacter nie tworzą EPS, podczas gdy mutant w homologicznym genie mucR S. meliloti syntetyzuje alternatywny EPS II. Funkcja białka RosR w R. leg. bv. trifolii jest badana. Praca finansowana z grantu KBN nr 2 PO4 A 034 26 W122. Genetyczne i molekularne aspekty transportu siarczanu u grzyba Aspergillus nidulans. Sebastian Piłsyk, Renata Natorff, Marzena Sieńko, Andrzej Paszewski � Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Pawińskiego 5A, 02-106 Warszawa� U grzyba nitkowatego Aspergillus nidulans pobieranie siarczanu odbywa się przez permeazę siarczanową, kodowaną przez gen sB, zlokalizowany na chromosomie VI. Dotychczas otrzymane mutacje w tym genie dają fenotyp braku wzrostu na siarczanie, jako jedynym źródle siarki. Jednakże brak szczelnego fenotypu uniemożliwiał użycie tych szczepów jako biorców do klonowania genu sB przez komplementację. Ostatnio w naszym laboratorium został otrzymany szczelny mutant metS1, posiadający defekt w samym pobieraniu siarczanu. Szczegółowa analiza molekularna wykazała, że mutacja metS1 dotyczy wyłącznie rearanżacji obszaru promotora permeazy siarczanowej. Mutant ten stanowił punkt wyjściowy do klonowania genu sB. Sklonowano trzy różne supresory mutacji metS1, jednak żaden z nich nie koduje genu permeazy siarczanowej. Pierwszy ze sklonowanych genów okazał się być nieznanym dotąd genem kodującym białko o charakterze transportera (alternative sulphate transporter – astA), należącego do rodziny permeaz alantoinianowych. Gen astA komplementuje mutację metS1 zastępując funkcję genu sB. Gen astA podlega regulacji na poziomie transkrypcji przez dostępne źródła siarki. Drugim supresorem jest dobrze znany gen metR, kodujący czynnik transkrypcyjny genów metabolizmu siarkowego (Natorff i in. 2003). Mechanizm supresji mutacji metS1 polega na nadekspresji białka METR, a w konsekwencji, derepresji nieaktywnego genu sB z pozostałego fragmentu promotora. Trzeci supresor mutacji metS1 (roboczo nazwany neo), koduje białko transmembranowe, o nieznanej dotychczas funkcji, specyficzne wyłącznie dla grzybów nitkowatych. Białko NEO posiada słabe motywy receptorów zwiazanych z białkami G, oraz motywy wiązania ściany komórkowej. Mechanizm supresji przez ten gen nie jest dotychczas poznany. W123. Nadekspresja genu BDF1 znosi efekty delecji genu YAF9, kodujacego podjednostkę kompleksu NuA4 w drożdżach S. cerevisiae. Anna Chełstowska (1), Michele Bianchi (2), Antonella Cavalli (2), Giovanna Constanzo (2), Dorota Grabowska (1), Eugenia Piccini (2), Laura Frontali (2), Rodolfo Negri (2), Piotr Słonimski (1), Joanna Rytka (1) (1) Zakład Genetyki, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawa (2) Department of Cell and Developmental Biology, University of Rome, Italy Gen YAF9 koduje podjednostkę konserwowanego ewolucyjnie kompleksu acetylo-transferazy histonu H4 (NuA4). Mutanty niosące delecję genu YAF9 charakteryzują się plejotropowym fenotypem: między innymi nie rosną na pożywkach zawierających benomyl, CsCl, MMS, HU i DMSO. Zidentyfikowano wielokopijne supresory znoszące nadwrażliwość mutantów yaf9-delta na CsCl i DMSO, wśród nich gen BDF1, kodujący białko, które oddziałuje z acetylowanymi lizynami w N-terminalnych fragmentach histonu H4. Wykazano genetyczną interakcję pomiędzy genami BDF1 i YAF9, prowadzącą do nieżywotności szczepu niosącego podwójną delecję yaf9-delta bdf1-delta. Poprzez porównawczą analizę transkryptomu szczepu typu dzikiego, szczepu mutanta yaf9-delta oraz szczepu yaf9-delta nadeksprymującego gen BDF1, wykazano wpływ genów YAF9 i BDF1 na poziom ekspresji kilku grup genów. 195 Genetyka mikroorganizmów W124. Apoptotyczna funkcja białka Ydr533p z drożdży Saccharomyces cerevisiae, homologa białka DJ-1, którego mutacja powoduje chorobę Parkinsona. Arkadiusz Miciałkiewicz, Adrianna Skoneczna, Marek Skoneczny Instytut Biochemii i Biofizyki PAN Stosując analizę transkryptomu (mikromacierze DNA) poszukiwano genów o podobnych profilach ekspresji w warunkach indukcji proliferacji peroksysomów (hodowla w obecności kwasu olejowego oraz w niekompetencji oddechowej). Spośród wyodrębnionej grupy genów zwrócono uwagę na ramkę odczytu YDR533c kodującą białko o nieznanej funkcji. W wyniku analizy bioinformatycznej stwierdzono, że większość łańcucha polipeptydowego białka Ydr533p stanowi domena ThiJ/PhpI występująca w kilku rodzinach białek pochodzących z różnych grup systematycznych, między innymi w prokariotycznych regulatorach transkrypcji typu AraC, proteinazach cysteinowych, bakteryjnych białkach opiekuńczych oraz w ludzkim białku DJ-1. Mutacja w genie kodującym DJ-1 powoduje powstanie wczesnej, dziedzicznej formy choroby Parkinsona. W genomie S. cerevisiae występują jeszcze trzy inne geny charakteryzujące się wysokim stopniem homologii do YDR533c: YPL280w,YOR391c oraz YMR322c. Skonstruowano kolekcję szczepów drożdżowych z delecjami w obrębie tych genów. Zarówno pojedyncze delecje, jak i delecja wszystkich czterech ramek odczytu nie przejawia się w żaden łatwo rozpoznawalny sposób. Wykonano szereg testów w poszukiwaniu fenotypu delecji. Analiza wyników tych testów wskazuje na udział tych białek w odpowiedzi na stres wysokotemperaturowy. Wydaje się również, że białka te uczestniczą w reakcji komórki na stres oksydacyjny. Ponadto otrzymane wyniki sugerują udział badanych białek w procesach prowadzących do apoptotycznej śmierci komórki. Powyższe dane mogą przyczynić się do poznania funkcji ludzkiego homologa Ydr533p –DJ-1 i jego udziału w etiologii choroby Parkinsona. Komunikaty plakatowe: P247. Geny kodujące reduktazy metylenotetrahydrofolianu u Aspergillus nidulans. Marzena Sieńko, Natorff R., Hejduk A., Paszewski A. Zakład Genetyki, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, ul. Pawińskiego 5A, 02-106 Warszawa� Biosynteza metioniny u Aspergillus nidulans łączy ze sobą dwa szlaki metaboliczne – szlak metabolizmu folianów, który dostarcza grupy metylowe pochodzące z 5-metylotetrahydrofolianu – CH3-THF i szlak metabolizmu aminokwasów siarkowych, w którym zachodzi synteza akceptora grup metylowych – homocysteiny. Synchronizacja wydajności obu tych szlaków jest bardzo istotna i odbywa się za pomocą CH3-THF, który jest aktywatorem gamma-syntazy cystationinowej (enzymu biorącego udział w biosyntezie homocysteiny). 5-metylotetrahydrofolian powstaje w wyniku redukcji 5,10-metylenotetrahydrofolianu (CH2-THF) w reakcji katalizowanej przez reduktazę metylenotetrahydrofolia nu (MTHFR). Z tego powodu enzym ten jest bardzo istotny w utrzymaniu niskiego poziomu homocysteiny w komórce. U A. nidulans, podobnie jak u Saccharomyces cerevisiae i Schizosaccharomyces pombe wystepują dwa geny kodujące reduktazę metylenotetrahydrofolianu – metA i metF. Mutanty w genie metA są auksotrofami metioninowymi i ulegają supresji przez mutacje w genach cysA i cysB (w drodze głównej biosyntezy cysteiny) oraz przez mutacje w genach scon – negatywnych regulatorach szlaku metabolizmu aminokwasów siarkowych. Efektem fizjologicznym tych mutacji jest podwyższony poziom homocysteiny w komórce. Gen metF został zidentyfikowany niedawno, po udostępnieniu genomu A. nidulans przez Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research. Skonstruowano szczep z delecją w genie metF, który okazał się również auksotrofem metioninowym, wymagającym do wzrostu 4-krotnie większego stężenia metioniny niż szczep metA. Delecja metF nie ulega supresji przez mutacje w genach cys ani scon. Regulacja ekspresji obu genów kodujących reduktazy MTHF przebiega podobnie, homocysteina jest aktywatorem transkrypcji zarówno genu metA jak i metF. P248. Charakterystyka aktywatora transkrypcji METR (Aspergillus nidulans). Renata Natorff, Jerzy Brzywczy , Andrzej Paszewski Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, 02-106 Warszawa, ul. Pawińskiego 5A� Gen metR Aspergillus nidulans koduje czynnik transkrypcyjny specyficzny dla metabolizmu siarkowego. Białko METR posiada motyw bZIP odpowiedzialny za wiązanie się z DNA i dimeryzację. W odpowiedzi na podwyższony poziom 196 Genetyka mikroorganizmów aminokwasów siarkowych (warunki represji) METR jest przypuszczalnie kierowany do degradacji przez kompleks ligazy ubikwitynowo-białkowej (typu SCF), w skład którego wchodzą białka SCON. Mutacje w genie metR prowadzące do utraty funkcji są recesywne i epistatyczne wobec mutacji w negatywnie działających genach scon. Brak aktywnego białka METR powoduje auksotrofię metioninową.� Obecnie przedstawiamy nowego typu mutanty w genie metR, które zostały wyizolowane jako dominujące supresory mutacji w genie metB. Okazało się, że trzy niezależne mutacje prowadzą do zamiany aminokwasu fenyloalaniny w pozycji 48 białka METR na serynę lub leucynę. Mutacje te identyfikują istotne miejsce w strukturze białka, które może mieć wpływ na jego stabilność. Mutacja sG8, prowadząca do derepresji szlaku asymilacji siarczanu, została ostatnio zlokalizowana w genie metR. Mutacja ta prowadzi do zmiany C-końcowej części białka METR na skutek zmiany fazy odczytu od pozycji 239. Mutacja jest recesywna, a mutanty sG8 nie są supresorami mutacji w genie metB. W celu zbadania regulacji poziomu białka METR w mutantach A. nidulans postanowiono oczyścić je do homogenności. Gen metR (kopia cDNA) został umieszczony w bakteryjnym wektorze ekspresyjnym pET30a(+) (Novagen), pod promotorem polimerazy RNA faga T7. Gen ulega silnej ekspresji w Escherichia coli BL21 (DE3) pLysE (Novagen), produkując zrekombinowane białko zawierające 6xHisTag na N-końcu. Białko to ulega wydajnemu oczyszczaniu przez IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography) na złożu TalonBD (Clontech) zawierającym związane jony kobaltu (Co2+). P249. Klonowanie, sekwencjonowanie i ekspresja genu nadA kodującego syntetazę chinolinową z Pseudomonas fluorescens szczepu 267. Monika Marek-Kozaczuk (1), Anna Skorupska (1), Jerzy Rogalski (2) (1) Zakład Mikrobiologii Ogólnej, UMCS, ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin (2) Zakład Mikrobiologii Ogólnej i Zakład Biochemii, UMCS, ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin Pseudomonas fluorescens 267 (P. f. 267), należący do grupy bakterii PGPR (plant growth promoting rhizobacteria), stymuluje wzrost koniczyny w układzie symbiotycznym z Rhizobium leguminosarum bv. trifolii 24.1. Ten promujący efekt szczepu 267 należy łączyć m.in. ze zdolnością bakterii do efektywnej kolonizacji korzeni roślin oraz syntezą rozpuszczalnych w wodzie witamin z grupy B, w tym niacyny (B3). Witamina B3 synetyzowana jest w płynnym podłożu minimalnym M1 w ilości 92 µg/ (Marek-Kozaczuk, Skorupska, Biol. Fertil. Soils, 2001, 33: 146-151). Dla wykazania roli niacyny w działaniu promującym szczepu 267 na wzrost roślin, przeprowadzono mutagenezę z użyciem transpozonu Tn5, w której uzyskano mutanta P. fluorescens 1106 auksotroficznego dla witaminy B3. Zastosowanie technik klonowania oraz sekwencjonowania umożliwiło identyfikację mutacji w szczepie P.f. 1106 w genie nadA dla syntetazy kwasu chinolinowego oraz sklonowanie genu nadA z dzikiego szczepu P. f. 267. U wielu mikroorganizmów produkt genu nadA wraz z genami nadB (oksydaza L-asparaginy) i nadC (pirofosforylaza mononukletodu nikotynowego) uczestniczą w biosyntezie de novo dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD) oraz NADP, które należą do kluczowych kofaktorów reakcji oksydacji i redukcji w komórce. Do szczepu dzikiego Pseudomonas fluorescens 267 wprowadzono dodatkowe kopie genu nadA oraz przeprowadzono test komplementacji w szczepie 1106. Efekt wprowadzenia dodatkowych kopii genu nadA do bakterii zbadano w testach roślinnych oraz chromatograficznie oznaczono syntezę kwasu chinolinowego, prekursora witaminy B3. � P250. Rola białka Faf1 w procesie biogenezy rybosomów w Saccharomyces cerevisiae. Bożenna Rempoła, Iwona Karkusiewicz, Robert Gromadka, Marcin Grynberg, Joanna Rytka Instytut Biochemii i Biofizyki PAN Nowo odkryty gen Saccharomyces cerevisiae, FAF1, koduje białko niezbędne do życia komórki drożdżowej. Wykazaliśmy, że białko to zlokalizowane jest w jąderku. Analiza rRNA w szczepie niosącym mutację w genie FAF1 wykazała zmniejszenie ilości 18S rRNA względem szczepu dzikiego. Wynika ono, jak wykazano analizując poziom prekursorowych form rRNA, z defektu w procesowaniu pre-rRNA na etapie trawień w miejscach A0, A1 i A2. Trawienia te są niezbędne dla syntezy 18S rRNA i biogenezy podjednostek 40S. Analiza profilu polisomów w szczepie mutanta potwierdziła obniżenie poziomu podjednostek 40S. Uzyskane wyniki wskazują na zaangażowanie białka Faf1 w biogenezę rybosomów. 197 Genetyka mikroorganizmów P251. Rola małych białek szoku termicznego IbpA i IbpB w powstawaniu i przetwarzaniu ciał inkluzyjnych. Dorota Kuczyńska-Wiśnik, Ewa Laskowska Katedra Biochemii, Uniwersytet Gdański, Kładki 24, 80-822 Gdańsk Najczęściej stosowanym sposobem uzyskiwania białek w celach badawczych i przemysłowych jest ich nadprodukcja w komórkach Escherichia coli i oczyszczanie powstających ciał inkluzyjnych (IB). Izolowane z lizatów bakteryjnych IB zawierają głównie nadprodukowane białko, które odzyskuje się w aktywnej formie po rozpuszczeniu ciał inkluzyjnych i refałdowaniu. Na wydajność tych procesów decydujący wpływ mają obecne w IB zanieczyszczenia –współagregujące endogenne białka E. coli. Białkami, które stanowić mogą nawet do 10% zanieczyszczeń IB są małe białka szoku termicznego, IbpA i IbpB. Celem naszej pracy było sprawdzenie, jak brak cytoplazmatycznych białek IbpAB (szczep deltaibpAB) wpływa na powstawanie i właściwości ciał inkluzyjnych. W doświadczeniach użyliśmy ciała inkluzyjne tworzone przez: białko fuzyjne cro-beta –galaktozydazę, białko fuzyjne OmpA-beta-laktamazę, beta-laktamazę pozbawioną sekwencji sygnałowej, niezmutowane białko beta-laktamazę oraz rHtrA1 –szczurzy homolog bakteryjnej proteazy HtrA. Stosując standardowe metody oczyszczania IB wykazaliśmy, że formowanie wszystkich typów ciał inkluzyjnych jest tak samo wydajne w komórkach mutanta deltaibpAB jak i w szczepie dzikim. W warunkach przedłużającego się stresu przy braku IbpAB IB są bardziej stabilne. W komórkach pozbawionych IbpAB zaobserwowaliśmy podwyższony poziom białek szoku termicznego DnaK i DnaJ w warunkach powstawania ciał inkluzyjnych, w odniesieniu do szczepu niezmutowanego. Cytoplazmatyczne IB pozbawione białek IbpAB charakteryzowały się wyższą rozpuszczalnością w najczęściej stosowanych denaturantach: chlorowodorku guanidyny i moczniku, co może świadczyć o ich rozluźnionej strukturze. Brak białek IbpA i IbpB nie wpływał natomiast na rozpuszczalność periplazmatycznych IB. Przy braku białek IbpAB w IB znajdowało się mniej aktywnych białek. Potwierdza to teorię, wg. której sHsps wiążą nienatywne białka i zapobiegają ich nieodwracalnej agregacji. P252. Odporność odmian i linii pszenic jarych na fuzariozę kłosa i mączniaka prawdziwego. Halina Wiśniewska (1), Krzysztof Kowalczyk (2) (1) Instytut Genetyki Roślin PAN, ul. Strzeszyńska 34, POZNAŃ (2) Instytut Genetyki i Hodowli Roślin, Akademia Rolnicza, ul. Akademicka 15, LUBLIN W latach 1998-2002 badano odporność na fuzariozę kłosa i mączniaka prawdziwego w liniach i odmianach pszenicy jarej. Analizowano18 linii pochodzących ze szkółki odpornościowej w CIMMYT– Meksyk i 12 odmian polskich: Alkora, Banti, Eta, Hera, Henika, Igna, Ismena, Jasna, Olimpia, Omega, Santa i Sigma. Wszystkie linie i odmiany inokulowano punktowo silnie patogenicznym izolatem Fusarium culmorum KF 846. Odmianami kontrolnymi były odporne odmiany Frontana i Sumai 3. Porażenie linii i odmian pszenicy przez mączniaka prawdziwego określono w doświadczeniu polowym w warunkach naturalnej infekcji. Ocenę porażenia przeprowadzono w skali 9-stopniowej. W celu określenia genów odporności na mączniaka prawdziwego (Pm) w odmianach polskich wykorzystano test inokulacyjny. Zastosowano 11 różnicujących izolatów Blumeria graminis f. sp. tritici otrzymanych od dr S.L.K. Hsama z Uniwersytetu w Monachium. Identyfikację genów Pm wykonano przez porównanie reakcji badanych odmian z reakcją linii izogenicznych zawierających określone geny Pm. W pięcioletnich badaniach stwierdzono, że procent ziarniaków z wyraźnymi objawami fuzariozy (FDK) w liniach pszenicy jarej otrzymanych z CIMMYT wynosił 16.7% (wartość średnia z pięciu lat badań) i był niższy niż w polskich odmianach 28.31%. U odmian kontrolnych wynosił odpowiednio 20% (odmiana Frontana ) i 12% odmiana Sumai 3. W trzech iniach IPG-SW-14, IPG-SW-16 i IPG-SW-30 stwierdzono niską podatność na fuzariozę kłosa – podobną do odmiany Sumai 3. Porażenie przez mączniaka prawdziwego badanych linii i odmian wahało się na przestrzeni 5 lat od 0-5. Na podstawie przeprowadzonych badań wykazano, że odmiany polskie były mniej porażone niż linie meksykańskie. Spośród odmian polskich najmniej były porażone Eta, Henika, Ismena, Jasna i Olimpia, zaś najbardziej Alkora, Igna i Omega. Spośród wszystkich badanych form linia IPG-SW-14 charakteryzowała się najmniejszą podatnością fusariozę kłosa i mączniaka prawdziwego podczas 5-letnich badań. Za pomocą testu inokulacyjnego wykazano, że odmiana Alkora zawiera gen Pm3d, a Henika gen Pm5. Obecność genu Pm3d stwierdzono również w odmianie Jasna, a w kombinacji z nieznanym genem lub genami odporności w odmianie 198 Genetyka mikroorganizmów Eta. W odmianach Santa i Torka postulowano obecność genu Pm5 w kombinacji z innym lub innymi genami odporności na mączniaka prawdziwego. Cztery odmiany Banti, Ismena, Olimpia i Sigma były odporne na 11 różnicujących izolatów Blumeria graminis f. sp. tritici. P253. Białka zaangażowane w terminację translacji mitochondrialnej u drożdży Saccharomyces cerevisiae. Jan Kutner, Magda Boguta Zakład Genetyki, Instytut Biofizyki i Biochemii PAN Gen MRF1 koduje czynnik terminacji translacji mitochondrialnej u drożdży S. cerevisiae. W naszej pracowni scharakteryzowano szereg mutacji mrf1 typu zmiany sensu, które powodowały zwiększony poziom błędności translacji mitochondrialnej. Najsilniejszy efekt fenotypowy obserwowano dla mutacji mrf1-13 i mrf1-780, które powodowały znaczne zahamowanie translacji, obniżenie ekspresji białek mitochondrialnych, w rezultacie, niekompetencję oddechową (gly-). Natomiast całkowita delecja chromosomalnego genu MRF1 prowadzi do nieodwracalnej degradacji mt DNA. Celem obecnych badań było sprawdzenie czy zmiana poziomu ekspresji genu MRF1 wpływa na wzrost komórki w obecności niefermentowalnych źródeł węgla oraz znalezienie innych białek lub procesów komórkowych, które wpływają na funkcję białka mRF1. Poziom ekspresji MRF1 regulowano przy użyciu systemu tetracyklinowego (E. Gari i in., (1997) Yeast vol. 13: 837-848) i kontrolowano przy użyciu specyficznych przeciwciał anty-mRF1. Stwierdzono, że podwyższona ekspresja MRF1, obserwowana w nieobecności tetracykliny osłabia wzrost komórek w pożywce zawierającej niefermentowalne źródła węgla. W obecności tetracykliny, wbrew przewidywaniom, nie dochodziło do obniżenia ekspresji MRF1 poniżej poziomu obserwowanego w szczepie dzikim. Zaobserwowano jednak, że drożdże z podwyższona ekspresją rosły słabiej na niefermentowalnym źródle węgla. Szczep z mutacją mrf1-780 transformowano wielokopijnym bankiem genów S. cerevisiae i znaleziono transformanta gly+, który zawierał we wstawce gen RSM10. Fenotyp był słaby i niepowtarzalny. Białko Rsm10 jest homologiem bakteryjnego rybosomalnego białka Rps10 i wykazuje podobieństwo w strukturze do domeny mRF1 odpowiedzialnej za rozpoznawanie kodonu stop. Wprowadzenie wielokopijnego banku drożdżowego do szczepu z mutacja mrf1-780 zawierajacego plazmid niosący na wstawce gen RSM10 pozwoli na znalezienie genu odpowiedzialnego za wzmocnienie fenotypu oraz na potwierdzenie hipotezy o roli Rsm10 w mitochondrialnej terminacji translacji. P254. Klonowanie supresorów delecji genu MAF1 u drożdży Saccharomyces cerevisiae. Małgorzata Cieśla, Magdalena Boguta Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Zakład Genetyki, ul. Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa� Maf1 jest negatywnym regulatorem RNA polimerazy III (pol III) u drożdży S. cerevisiae. Komórki mutantów maf1 akumulują tRNA; jest to wynik wzrostu aktywności transkrypcji pol III. Wykazano, że Maf1 oddziałuje z elementami pol III. Poszukiwano mutacji, które kompensują brak białka Maf1 w komórce. Wyizolowano ok. 300 spontanicznych supresorów, które odwracają termowrażliwy (ts) fenotyp delecji genu MAF1. Skoncentrowano się na identyfikacji genu supresorowego reprezentowanego przez mutację R119. Jest to pojedyncza mutacja chromosomalna i wykazuje własny fenotyp zimnowrażliwy (cs). Szczep R119 transformowano bankiem genów drożdżowych i poszukiwano fragmentów, które komplementują fenotyp cs. Wyizolowano genomowy fragment zawierający gen RPB10 (jeden raz) oraz fragment zawierający gen RBS1 (cztery razy). Gen RPB10 koduje wspólną podjednostkę dla trzech polimeraz RNA zaś RBS1 koduje białko o bliżej nieokreślonej funkcji, wiążące się do RNA. Analiza molekularna mutanta R119 ujawniła obniżony poziom tRNA w porównaniu do kontroli. Odtworzenie kontrolnej ilości tRNA obserwowano w obecności plazmidu centromerycznego z genem RPB10, ale również w obecności wielokopijnego plazmidu z genem RBS1. Obniżony poziom tRNA wskazuje na istotną rolę mutacji R119 w procesie transkrypcji RNA z udziałem pol III. Mutacja R119 mapuje się w rejonie RPB10 i ma prawdopodobnie charakter regulatorowy. Analiza Northern blot wykazała obniżony poziom mRNA RPB10 w mutancie R119. Obecność plazmidu z genem RBS1 w komórkach R119 powodowała zwiększenie poziomu mRNA RPB10. Przedstawione wyniki wskazują na mechanizm kompensacji braku represora Maf1 poprzez mutację regulatorową R119 prowadzącą prawdopodobnie do obniżenia aktywności pol III. Istotną rolę w tym mechanizmie odgrywa produkt genu RBS1. 199 Genetyka mikroorganizmów P255. Białko GFP jako bioindykator komórkowej reakcji na fenol. Marzena Matejczyk (1), Stanisław Józef Rosochacki (1, 2) (1) Katedra Biologii Sanitarnej i Biotechnologii, Politechnika Białostocka, ul. Wiejska 45 E (2) Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt, PAN, Jastrzębiec k/Warszawy Fenol jest popularnym związkiem chemicznym wykorzystywanym w różnych gałęziach przemysłu, ponadto to produkt naturalnych procesów zachodzących w ekosystemach, takich jak rozkład szczątków roślinnych i zwierzęcych. Ze względu na notowany w ostatnich latach wzrost zanieczyszczenia rzek fenolem istnieje ogromna potrzeba opracowania tanich, szybkich metod wykrywania tego rodzaju związków w wodach. Ogromne możliwości w tej dziedzinie stwarza technologia genów reporterowych, szczególnie genów, których produktem ekspresji jest światło, do których należy pochodzący z meduzy Aequorea victoria gen gfp (green fluorescent protein), którego produktem ekspresji jest świecące w świetle UV białko GFP. Okazuje się, że dynamika emitowanej przez zmodyfikowane genetycznie bakterie fluorescencji jest bardzo użytecznym narzędziem w analizie ekspresji genów u Procaryota po ekspozycji na określone związki chemiczne, w tym i fenol. Stąd w badaniach własnych postanowiono przeanalizować w oparciu o dynamikę emitowanej fluorescencji reakcję szczepu E. coli MM294 z genem gfp po ekspozycji na fenol. Zmodyfikowane genetycznie komórki E. coli MM294 z genem gfp poddano godzinnej ekspozycji na fenol w stężeniu 0,01 g/l, w buforze PBS. Następnie przy użyciu spektrofluorymetru fluorescencyjnego (Hitachi, Japan, F-2500) mierzono dynamikę emitowanej przez bakterie fluorescencji, wartość intensywności fluorescencji wyrażano jako wielkość SFI= IF(395, 509)/OD(600), gdzie SFI-specyficzna intensywność fluorescencji, IF intensywność fluorescencji odczytana ze spektrofluorymetru, OD– optyczna gęstość hodowli bakteryjnej. � Ekspozycja E. coli MM294 z genem gfp na fenol w stężeniu 0,01 g/l wywołała pojawienie się istotnych statystycznie (P?0,05) różnic w emisji fluorescencji między 0 a 30 minutą analizy. Po godzinnym potraktowaniu hodowli bakteryjnej fenolem w tym stężeniu zarejestrowano początkowo w czasie 0 oraz 30 minucie stymulację ekspresji genu gfp w stosunku do kontroli, odpowiednio o 1,3 i 0,43 %, po czym od 60 minuty zauważono inhibicję ekspresji genu o 2,2 % w 60 minucie do 5, 20 % w 150 minucie i 1,10 % w 240 minucie analizy. Wydaje się, że w przedstawionych warunkach analizy na poziom ekspresji genu gfp w E. coli MM294 mają wpływ jednocześnie dwa mechanizmy: ograniczenie podaży substancji odżywczych oraz dodatkowe oddziaływanie fenolu, co wskazuje na fakt, że dynamika fluorescencji białka GFP w E. coli MM294 jest użytecznym narzędziem w analizie ekspresji genów. P256. Ligaza ubikwitynowo-białkowa Rsp5 S. cerevisiae posiada funkcjonalną sekwencję NLS kierującą ją do jądra. Piotr Chołbiński, Małgorzata Lewandowska, Marta Kwapisz, Teresa Żołądek Zakład Genetyki, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa� Ligaza ubikwitynowo-białkowa Rsp5 reguluje szereg procesów komórkowych. Mutanty rsp5 wykazują między innymi zaburzenia eksportu tRNA z jądra do cytoplazmy (Neumann i wsp., EMBO Rep. 2003, 4, 1156). W celu bliższego poznania funkcji Rsp5p zbadano interakcje genetyczne pomiędzy genem RSP5 a genami, LOS1, CCA1 i TEF2, kodującymi białka zaangażowane w eksport tRNA. LOS1 koduje eksportynę tRNA, CCA1 koduje nukleotydylotransferazę tRNA, a TEF2 koduje czynnik elongacji translacji eEF-1A. Stwierdzono syntetyczny defekt wzrostu mutantów podwójnych rsp5-13 tef2∆; i rsp5-13 cca1-1 w porównaniu ze wzrostem mutantów pojedynczych. Ponadto TEF2 okazał się wielokopijnym supresorem fenotypu termowrażliwości mutanta rsp5-13. Nie zaobserwowano jednakże interakcji pomiędzy genami RSP5 i LOS1. W toku badań nad Rsp5p zidentyfikowano również potencjalną sekwencję NLS (ang.: nuclear localization sequence) 477-PEDLKKRL-454 i metodą immunofluorescencji wykazano, że jest ona zdolna do kierowania białka reporterowego, β-galaktozydazy, do jądra. Dotychczas nie wykazano jednakże jądrowej lokalizacji białka Rsp5. Zatem nie jest jasne czy Rsp5p oddziałuje na transport tRNA z cytoplazmy jako element kaskady sygnałowej, czy też krąży pomiędzy jądrem a cytoplazmą i bezpośrednio reguluje eksport tRNA. Metodą mutagenezy PCR wprowadzono do genu RSP5 mutacje powodujące podstawienie asparaginy w miejsce aminokwasów zasadowych sekwencji NLS, co w konsekwencji doprowadziło do unieczynnienia tego regionu. Dalsze badania będą kontynuowane w kierunku poznania konsekwencji tych mutacji dla funkcjonowania i lokalizacji Rsp5p, a uzyskane wyniki zostaną zaprezentowane. 200 Genetyka mikroorganizmów P257. Udział terminacji translacji i prionu [PSI+] w regulacji ekspresji genu COX5b u drożdży Saccharomyces cerevisiae. Agnieszka Jankowska, Joanna Towpik, Magdalena Boguta Instytut Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk, ul. Pawińskiego 5A, 02-106 Warszawa� U Saccharomyces cerevisiae geny COX5a i COX5b kodują dwie alternatywne wersje podjednostki kompleksu oksydazy cytochromowej. Ekspresja genu COX5b jest negatywnie regulowana przez tlen i hem za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego Ord1. Gen ORD1 posiada dodatkową ramkę odczytu bezpośrednio za kodonem stop. Błędne odczytanie kodonu stop jako kodon sensowny prowadziłoby do syntezy przedłużonej formy białka Ord1. Celem doświadczeń jest zbadanie ewentualnej zależności ekspresji genu COX5b od obecności prionu [PSI+], który wpływa na terminację translacji. W układzie in vitro wykazano, że w ekstraktach pochodzących ze szczepów [PSI+] i [psi-] wydajność odczytu kodonu stop w genie ORD1 wynosi odpowiednio 11% i 0,9%. Wykazanie różnicy w ekspresji genu COX5b w tych szczepach świadczyłoby o jej regulacji przez prion [PSI+] za pośrednictwem Ord1. Wykonano analizę Nothern blot RNA wyizolowanego z płynnych kultur szczepów [PSI+] i [psi-]. Nie stwierdzono różnicy w poziomie ekspresji genu COX5b w obu szczepach. Analizowano także wpływ [PSI+] na fenotyp wzrostu mutantów deltacox5a. Wiadomo, że zmutowany szczep deltacox5a z pojedynczą kopią genu COX5b wykazuje słaby wzrost na pożywkach zawierających niefermentowalne źródła węgla. Wprowadzenie genu COX5b na wysokokopijnym plazmidzie zwiększa poziom oddychania od 12% do 69% w porównaniu do szczepu dzikiego. Gen COX5b namnożono PCR z genomowego DNA, sklonowano na wysokokopijnym plazmidzie i wtransformowano do skonstruowanych uprzednio szczepów deltacox5a [PSI+] i deltacox5a [psi-]. Wyselekcjonowane transformanty analizowano na pożywkach z niefermentowalnymi źródłami węgla. P258. Identyfikacja promotorów genów hemolizyn clyA i clyC Campylobacter jejuni. Marta Jaśkowska, Agnieszka Sałamaszyńska, Danuta Klimuszko Zakład Bakteriologii i Biologii Molekularnej, Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej SGGW w Warszawie Celem pracy jest identyfikacja promotorów genów kodujących białka o charakterze hemolizyn Campylobacter jejuni oraz określenie ich aktywności. Campylobacter jejuni jest czołowym przedstawicielem grupy patogenów wywołujących infekcje przewodu pokarmowego. Uważany jest za główna przyczynę ostrego, bakteryjnego zapalenia jelit i żołądka u ludzi na całym świecie powodowanego przez żywność zakażoną C.jejuni. W krajach rozwiniętych przyczynił się do większej liczby nieżytów układu pokarmowego niż np. Salmonella. Toksyny z grupy hemolizyn, obok rzęsek, adhezyn oraz toksyn CDT należą do istotnych czynników wirulencji tych bakterii. Wiadomo, że sekwencja promotorowa Campylobacter jejuni ma niespotykany do tej pory układ. Region 10 podobny jest do regionu rozpoznawanego przez czynnik 70 E. coli, ale region –16 przypomina już region typowy dla bakterii grammdodatnich, a region –35 jest zupełnie różny od dotychczas poznanych. Sklonowano dwa geny C.jejuni clyC i clyA (Cj0183 i Cj0588) kodujące białka posiadające domeny hemolityczne. Fragmenty położone powyżej genu strukturalnego, zawierające prawdopodobne miejsca promotorowe, przeklonowano do wektorów wahadłowych pMW10 i pWM1001 posiadających geny reporterowe bez promotorów, odpowiednio lacZ i gfp. Uzyskane konstrukty wprowadzono do szczepu E.coli DH5a metodą transformacji i do dzikich szczepów Campylobacter jejuni za pomocą elektroporacji. Przeprowadzono test na aktywność �-galaktozydazy pozwalający stwierdzić obecność i określić siłę promotora. W przeklonowanym fragmencie genu clyA znajduje się promotor. Wykazano także różnice w aktywności tego promotora w E.coli i C.jejuni. Oznaczenie aktywności promotora genu clyC stanowi kolejny etap naszych badań. P259. DraD mutants for determination of the functional regions. Katarzyna Bury, Beata Zalewska, Rafał Piątek, Józef Kur Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Mikrobiologii, ul. Narutowicza 11/12 80-952 Gdańsk Pathogenic Escherichia coli strains cause a wide variety of infectious diseases by colonizing and infecting different tissues. Regardless of the infection place, the establishment of the bacterium in the host requires the production of bacterial adhesins and invasins that prevent clearance from eukaryotic host by mediating a strong interaction between the bacteria and epithelial cells. The DraD invasin is encoded by a dra operon of uropathogenic E. coli strains causing urinary tract infections. The dra gene cluster was shown to contain six open reading frames (ORF): draA, draB, draC, 201 Genetyka mikroorganizmów draD, draP i draE. Very little is known about the DraD invasin, which is 100% identical to the AfaD invasin that was proposed to support the uptake of adherent bacteria into HeLa cells. The aim of the presented study was a determination of the functional region of the DraD protein responsible for adhesion and invasion process. Several DraD mutants were prepared by changing the sequence of draD gene using PCR based site-directed mutagenesis (selected amino acid residues were replaced for alanine residue: E2A; R25A; C28A; R29A; H36A; N40A; Q90A; D94A; D98A; Q101A; E107A; C116A). pInvDsyg-C-His plasmid (pET30LIC plasmid with a cloned draD gene) was used as a template in PCR reaction. The resulted draD mutants were sequenced. The obtained plasmids were used for expression of the proteins with polihistidine domain at the C-terminus in E. coli BL21(DE3) strain. After expression the proteins were isolated from a periplasm and purified by metal-affinity chromatography on a Ni2+ – IDA – Sepharose column. A detection of the proteins in E. coli lysates, periplasm and elution fraction after purification was made by Western blotting analysis with policlonal antibodies against the DraD invasin and monoclonal antibodies against the polihistidine domain. P260. Analiza genetyczna i funkcjonalna regionu genomu Listeria monocytogenes EGD, determinującego aktywność autilizyny. Magdalena Popowska Uniwersytet Warszawski, Instytut Mikrobiologii, Zakład Fizjologii Bakterii, 02-096 Warszawa, ul.Miecznikowa 1 Gramdodatnia pałeczka Listeria monocytogenes jest fakultatywnym, wewnątrzkomórkowym patogenem ludzi i zwierząt. Zakażenie jest przeważnie związane ze spożyciem żywności zanieczyszczonej tymi bakteriami, dlatego też listeriozę zaliczono do grupy chorób przenoszonych drogą pokarmową. Najczęstszymi postaciami tej choroby są: zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i mózgu, bakteriemia oraz zakażenia okołoporodowe. Patogenność L. monocytogenes jest uwarunkowana głównie przez następujące czynniki wirulencji: listeriolizynę O, internaliny A i B, białko CwhA, białko ActA, dwie fosfolipazy C oraz metaloproteazę. Na uwagę zasługuje fakt, że L. monocytogenes koduje 133 białka powierzchniowe, w tym aż 41 białek z motywem LPXTG –związanych kowalencyjnie z peptydoglikanem, co wyróżnia ją spośród innych bakterii gramdodatnich. Wśród tej klasy białek znajdują zarówno czynniki wirulencji jak i hydrolazy peptydoglikanu. Do tej pory, u tej bakterii scharakteryzowano pięć białek o właściwościach autolizyn: CwhA, P45, Ami, MurA i Auto. Analiza genomu L. monocytogenes wykazała obecność 11 genów, kodujących białka z charakterystycznymi domenami dla tej grupy enzymów. W prezentowanej pracy otrzymano oraz scharakteryzowano 3 mutanty insercyjne, odpowiednio w genach lmo0325, lmo0326 i lmo0327. Analiza genetyczna badanych genów oraz charakterystyka fizjologiczna mutantów, pozwoliły zidentyfikować nowe białko powierzchniowe o właściwościach hydrolazy peptydoglikanu – Lmo0327, posiadające charakterystyczną domenę dla internalin: LRR oraz motyw LPXTG. Wyniki przeprowadzonych badań wskazują na udział tego białka w takich procesach jak: wzrost i/lub podział komórki a zwłaszcza etap oddzielania się komórek potomnych po podziale, autoliza i obrót metaboliczny mureiny. Zidentyfikowano także dwa regulatory transkrypcji Lmo0325 i Lmo0326 pozytywnie wpływające na ekspresję bądź aktywność białka Lmo0327, którego gen położony jest poniżej genów lmo0325 i lmo0326. P261. Regulacja ekspresji genów metabolizmu folianów u Aspergillus nidulans. Irmina Lewandowska (1), Zbigniew Zieliński (2), Andrzej Paszewski (1) (1) Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Zakład Genetyki, Pawińskiego 5A, 02-106 Warszawa� (2) Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN, Zakład Biochemii Komórki, Pasteura 3, 02-093 Warszawa Metabolizmy: folianów i aminokwasów siarkowych łączą sie ze sobą poprzez dostarczanie przez te pierwsze grupy metylowej, wykorzystywanej w syntezie metioniny. Istotne są zatem powiązania systemów regulujących ekspresję genów, odpowiedzialnych za te dwie domeny metaboliczne. Ustaliliśmy, że gen metH, kodujacy syntazę metioninową, jest silnie indukowany przez homocysteinę i reprymowany przez cholinę (Biochem J. 2003, 376(Pt2); 517-24). Obecnie przedstawiamy dane, pokazujące regulację ekspresji, na poziomie transkrypcji, trzech innych genów kodujących enzymy folianowe. Zależnie od warunków hodowli, gen SHMT (hydroksymetylotransferaza serynowa) ulega 3-4-krotnej indukcji przez serynę, FPGS (syntetaza folilopoli-gamma-glutaminianów) 2-krotnej indukcji przez homocysteinę, co wskazuje na bezpośrednią regulację jego ekspresji przez poziom aminokwasów siarkowych. Trzeci badany gen C1-THFS (syntaza grup C1 tetrahydrofolianu) nie ulega regulacji w badanych warunkach. Otrzymane wyniki pokazują, że systemy regulujące metabolizmy: folianowy i siarkowy mogą mieć wspólne elementy, lecz nie całkowicie pokrywają się. 202 Genetyka mikroorganizmów P262. Zdolność do odpowiedzi na stres środowiskowy i energetyczny jest niezbędna do rozwoju biofilmu Bacillus subtilis. Krzysztofa Nagórska (1), Arletta Nowodworska (2), Daria Julkowska (1), Michał Obuchowski (2) (1)Uniwersytet Gdański, Katedra Biologii Molekularnej, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk (2) Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii UG-AMG, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk Bakterie Bacillus subtilis zamieszkujące naturalnie powierzchniowe warstwy gleby są narażone na wiele różnych czynników stresowych takich jak brak lub nadmiar wody, wahania temperatury, pH czy zawartości tlenu. W wyniku adaptacji do tak różnorodnego środowiska bakterie wykształciły bardzo skomplikowany mechanizm regulacji odpowiedzi na stres, która to umożliwia czasowe dostosowanie swojego metabolizmu do aktualnie panujących warunków. Aktywacja odpowiedzi na stres może zachodzić dwoma drogami: w odpowiedzi na stres środowiskowy lub w odpowiedzi na stres energetyczny. Podczas wzrostu w warunkach laboratoryjnych regulon odpowiedzi na stres wydaje się być zbędny, gdyż bakterie jego pozbawione nie wykazują żadnych efektów fenotypowych w klasycznej hodowli płynnej. Inaczej jednak jest w momencie, gdy bakterie rozpoczynają tworzenie biofilmu –złożonej struktury spotykanej powszechnie w środowisku naturalnym. Prezentowane wyniki wskazują, iż zdolność do odpowiedzi na stres jest niezbędna do utworzenia prawidłowego biofilmu. Co więcej, potrzebne są obie drogi aktywacji odpowiedzi na stres muszą być sprawne komórka bakteryjna była w stanie wziąć udział w tworzeniu kolonii nazywanej biofilmem. � P263. Lokalizacja i funkcja białkowej fosfatazy PrpE w komórkach Bacillus subtilis. Krzysztof Hinc (1), Elżbieta Ratajczak (2), Adam Iwanicki (1), Michał Obuchowski (1) (1) Uniwersytet Gdański, Katedra Biologii Molekularnej, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk (2) Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii UG-AMG, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk W ostatnich dwóch dekadach fosforylacja białek została określona jako jeden z najważniejszych sposobów regulacji aktywności enzymów w organizmach eukariotycznych. Przeprowadzona w naszym laboratorium analiza biochemiczna wykazała, że produkt genu prpE wykazuje trzy aktywności: fosfatazy białkowej, hydrolazy Ap4A i ATPazy. Wszystkie wyżej wymienione aktywności są zależne od dwuwartościowych jonów niklu. Dokładniejsze badania pozwoliły stwierdzić, iż badane białko jest w stanie usuwać grupy fosforanowe z reszt fosfotyrozyny, ale nie z fosfoseryny i fosfotreoniny. Było to pewnym zaskoczeniem, ponieważ dane literaturowe mówią, że co prawda, głównymi substratami dla fosfataz z rodziny PPP jest fosfoseryna i fosfotreonina, ale niektóre enzymy są również zdolne defosforylować reszty fosfotyrozyny. Badane białko jest pierwszym enzymem z tej grupy, który in vitro wykazuje aktywność tylko w stosunku do fosfotyrozyny. Kolejną niespodzianką był fakt, że cząsteczka Ap4A jest hydrolizowana niesymetrycznie do cząsteczki AMP i ATP. Najlepiej znany enzym tego typu, ApaH, pochodzący z E.coli i wykazujący znaczną homologię z badanym białkiem (25% identyczności) jest symetryczną hydrolazą Ap4A. Natura odmiennego sposobu degradacji Ap4A pozostaje w dalszym ciągu niewyjaśniona. Ostatnia z wykrytych aktywności enzymatycznych, ATPazy nie stanowi zaskoczenia, ponieważ może ona towarzyszyć hydrolazom Ap4A. W niniejszej pracy przedstawiono wyniki badań in-vivo, dotyczące lokalizacji fosfatazy PrpE w komórkach Bacillus subtilis. W tym celu zastosowano fuzję translacyjną PrpE z białkiem GFP. Otrzymane wyniki wskazują, że fosfataza ta lokalizuje się w sporach (komórkach przetrwalnikowych Bacillus subtilis). Dalsze wyniki z użyciem szczepów delecyjnych i nadprodukujących PrpE sugerują, że białko to prawdopodobnie uczestniczy w germinacji spor. P264. Wpływ aktywności genów operonu pL położonych między genami exo i xis na przebieg infekcji bakteriofagiem λ. Joanna Woźniak (1), Marcin Łoś (1), Grzegorz Węgrzyn (1, 2) (1) Uniwersytet Gdański, Katedra Biologii Molekularnej, Kładki 24, 80-822 Gdańsk (2) Instytut Oceanologii PAN, Św. Wojciecha 5, 81-347 Gdynia Funkcja większości genów bakteriofaga λ została już stosunkowo dobrze poznana. Istnieją jednak pewne wyjątki, które w dużej części dotyczą genów zbędnych fagowi do rozwoju w warunkach laboratoryjnych. Jedna z grup takich genów znajduje się w operonie pL pomiędzy genami exo i xis. Znajdują się w niej geny wczesne ea22 i ea8.5 oraz otwarte ramki odczytu orf60a, orf61 i orf63. Geny te zostały umieszczone na plazmidzie pGAW3775. Zauważono, że ich obecność 203 Genetyka mikroorganizmów powoduje zmianę morfologii łysinek tworzonych przez faga λ. W niniejszej pracy wykazano, że za obserwowany fenotyp łysinek odpowiada gen ea8.5. Wykazano też, że zwiększona mętność łysinek może być spowodowana przez zwiększoną przeżywalność komórek bakteryjnych posiadających plazmid pGAW3775. Za obserwowany fenotyp nie odpowiada zwiększona wydajność lizogenizacji, której częstość jest niższa dla szczepów eksprymujących badane geny w porównaniu ze szczepami kontrolnymi, ani różnica w zdolności adsorpcji cząstek fagowych na powierzchni komórek bakteryjnych, która wydaje się być podobna dla szczepu posiadającego plazmid pGAW3775 jak i dla szczepu kontrolnego. Również nie wynika ona z obniżonego plonu fagowego, ponieważ jest on podobny dla obu szczepów. Dzięki użyciu odpowiednich fuzji promotorowych z genem lacZ zaobserwowano, że aktywność badanych genów może powodować nieznaczne obniżenie aktywności promotora pL. Ponadto ekspresja genu ea8.5 powoduje obniżenie aktywności promotorów pI oraz paQ, a ekspresja genów ea22 i/lub orf60a, orf61, orf63 hamuje aktywność promotora pE. Wykazano również, że ekspresja badanych genów powoduje zwiększenie częstości indukcji spontanicznej jak i wymuszonej profaga λ. P265. Oddziaływanie pomiędzy kinazą białkową PrkC i fosfatazą białkową PrpC. Michał Obuchowski, Adam Iwanicki Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk Białka PrpC i PrkC stanowią parę enzymów zaangażowaną w fosforylację białek w komórkach Bacillus subtilis. Kinaza PrkC jest białkiem zakotwiczonym w błonie komórkowej, posiadającą zewnątrzkomórkową domenę działającą prawdopodobnie jako sensor. Fosfataza jest białkiem cytoplazmatycznym. PrpC wydajnie usuwa grupy fosforanowe z autofosforylowanej cząsteczki kinazy PrkC. Cząsteczka kinazy jest fosforylowana w trzech rejonach: pętli aktywacyjnej (4 fosforylowane reszty treoniny), płacie katalitycznym (1 fosforylowana reszta seryny) oraz rejonie przymembranowym (3 fosforylowane reszty treoniny). Fosfataza PrpC nie traktuje wszystkich fosforylowanych rejonów jednakowo wykazując preferencje do w pełni fosforylowanej pętli katalitycznej i rejony przymembranowego. Ponadto uzyskane wyniki pozwoliły stwierdzić, iż defosforylacja każdej reszty aminokwasowej bez względu na jej otoczenie jest oddzielnym zdarzeniem. Oba białka są zaangażowane w regulację wytwarzania przetrwalników (spor) oraz powstawanie biofilmu. � P266. Influence of Escherichia coli DnaK AND DnaJ chaperones on stability of UmuC, GreA, GreB AND CysB proteins. Anna M. Grudniak, Monika Maciąg , Krystyna I. Wolska Uniwersytet Warszawski, Wydział Biologii, Instytut Mikrobiologii, Zakład Genetyki Bakterii, ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa Escherichia coli proteins DnaK and DnaJ are the members of the DnaK-DnaJ-GrpE chaperone team and are classified as stress proteins because they are induced under stress conditions. By virtue of being molecular chaperones DnaK and DnaJ proteins are able to promote proper protein folding and to influence protein conformation, transport, oligomeric structure and stability. DnaK and DnaJ chaperones are involved in a variety of important cellular processes executed by protein complexes. We decided to studied three of such a processes: – error prone repair, – transcription of cysPTWA operon, a member of cys regulon and –expression of tnaA gene coding for tryptophanase. As the effect of DnaK and DnaJ chaperones on all three activities are documented their influence on the stability of UmuC, CysB and GreA/GreB proteins which are respectively the main activators of these processes were also determined. Transcription of tnaA, cysPTWA and reversion frequency executed by UmuC (error prone repair) was studied in null dnaJ and dnaKdnaJ mutants at permissive temperature, 30oC, and after 1h exposure to 42oC. The stability of UmuC, CysB and GreA/GreB was determined by densitometric (analysis of autoradiograms). Proteins were synthesized from genes cloned under T7 promoter; the bulk of cellular proteins production was knock-out by rifampicin. The simultaneous deprivation of DnaK and DnaJ influences the stability of UmuC, CysB, GreA/GreB, the deprivation of DnaJ protein only does not have any effect. This result points to the involvement of DnaK (or DnaK, DnaJ tandem) on the stability of proteins studied. 204 Genetyka mikroorganizmów Wykład plenarny W125. Molecular Mechanism Of Bacterial Virulence From Global Genome Analysis To Structure-Function And Prevention Of Chronic Infection. B. Nowicki, S. Nowicki, Y. Fofanov, A. Hart-Van Tassell, P. Urvil, P. Goluszko, OB /Gyn. and Microbiology at University of Texas Medical Branch, Galveston, TX and University of Houston, Houston, TX Infectious diseases remain the major cause of human morbidity and mortality. Infectious diseases result from interaction between the pathogenic bacteria and the human host. Some microbes develop acute infection and some avoid human defenses and cause chronic or sub-clinical infection. Microbial virulence is encoded by clusters of genes contained in pathogenic islands which have been acquired by horizontal transfer. Understanding microbial virulence strategies become essential in prevention of chronic infections and require novel genetic approaches to enhance our chances to develop cures. The availability of complete genomic sequences of several pathogens allows now the global analysis of genome organization and better understanding of evolution of microbial virulence. We have used recently developed algorithm, similarity-plot (S-plot) which identifies DNA sequences of unusual statistical properties and visualize 2D genome organization of related bacteria. Using the S-plot we compared genomes of two E. coli, strain K12 and uropathogenic E. coli CFT073. The S-plot identified several regions of unusual DNA properties and visualized them as blue lines. The blue lines contained the genetic and pathogenic islands unique to uropathogenic E. coli with several virulence factors of which some may be recognized as family of Dr and/or afimbrial adhesins associated with chronic infections. We consider that chronic infection process may require retention of these GI’s which allow colonization (attachment) and invasion of epithelial cells but not necessarily powerful toxins. Using the genetic approaches we constructed recombinant systems in which we investigate attachment and invasion of Dr E. coli associated with chronic infection of the kidney (pyelonephritis). Using site directed mutagenesis we identified unique domains of E. coli fimbrial Dr adhesin and epithelial receptor DAF (CD55) that signal invasion process. Computer modeling of receptor mutants allowed us to propose a novel hypothesis that distribution of a negative charge in the receptor binding pocket may be involved in the invasion process. In vivo experimental model of chronic kidney infection showed that the chronic infection is dependent on E. coli Dr fimbriae since the isogenic fimbriae negative mutant was eliminated by the host. A recombinant vaccine of Dr fimbriae was used to prevent pyelonephritis. While vaccine protected mice from mortality it did not protect mice from the kidney infection. This further emphasizes a need for understanding of global genomic organization of pathogens and the human host and designing alternative genetic strategies to protect humans from chronic debilitating infections. Genomika i ewolucja molekularna Komunikaty ustne: W126. Zależność stabilności genów od ich długości. Paweł Mackiewicz (1), Natalia Polak (1), Paweł Mackiewicz (1), Joanna Banaszak (1), Małgorzata Dudkiewicz (1), Maria Kowalczuk (1), Dorota Mackiewicz (1), Kamila Smolarczyk (1), Mirosław R. Dudek (2), Stanisław Cebrat (1) (1) Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wrocławski, ul. Przybyszewskiego 63/77, 51-148 Wrocław (2) Instytut Fizyki, Uniwersytet Zielono-Górski, ul. Szafrana 4A, 65-516 Zielona Góra Długość genu jest wynikiem kompromisu między presją mutacyjną i selekcyjną. Presja mutacyjna najczęściej powoduje skracanie genów z powodu generowania kodonów stop wewnątrz ramek odczytu. Natomiast presja selekcyjna stara się utrzymać długość genu optymalną ze względu na funkcję kodowanego białka. Przy pomocy symulacji komputerowych zbadano związek między stabilnością genów a ich długością. W symulacjach sekwencje genów pochodzące z genomu 205 Genetyka mikroorganizmów Borrelia burgdorferi poddano presji mutacyjnej opisanej macierzą 12 przejść nukleotydowych i określonej w wyniku analiz porównawczych genów i pseudogenów w tym genomie. Zastosowano dwa rodzaje presji selekcyjnej. W kolejnych krokach symulacji, po wprowadzeniu losowych mutacji, sprawdzano dla każdego genu jak zmienił się ogólny składu aminokwasowy kodowanego przez niego białka w stosunku do białka kodowanego przez jego niezmutowaną formę. W przypadku, gdy ta zmiana przekraczała wartość tolerancji gen był eliminowany. W drugim rodzaju selekcji gen był eliminowany, jeśli mutacji uległ jego kodon start lub stop lub jeśli pojawił się kodon stop wewnątrz genu. Stwierdzono, że przy selekcji na skład aminokwasowy efekt eliminowania genu jest większy dla genów krótkich niż dla długich, co można tłumaczyć większym prawdopodobieństwem supresji wenątrzgenowych w genach długich. Geny długie były z kolei częściej eliminowane z powodu pojawiania się kodonów stop wewnątrz ich sekwencji. Liczba eliminowanych genów nie zależała natomiast od długości, jeśli geny były eliminowane tylko z powodu zmiany kodonu startu lub stopu. Wstępne analizy porównawcze genomów zdają się świadczyć o tym, że tempo dywergencji genów nie zależy od ich długości. Wyniki symulacji pozwolą więc na określenie relacji ilościowych między mutacjami zmieniającymi sekwencję aminokwasową a mutacjami generującymi kodony stop. W127. Ewolucja genów w asymetrycznych genomach bakteryjnych. Kamila Smolarczyk (1), Paweł Mackiewicz (1), Natalia Polak (1), Joanna Banaszak (1), Małgorzata Dudkiewicz (1), Maria Kowalczuk (1), Dorota Mackiewicz (1), Mirosław R. Dudek (2), Stanisław Cebrat (1) (1) Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wrocławski, ul. Przybyszewskiego 63/77, 51-148 Wrocław (2) Instytut Fizyki, Uniwersytet Zielono-Górski, ul. Szafrana 4A, 65-516 Zielona Góra Większość chromosomów bakteryjnych wykazuje wyraźną asymetrię w składzie nukleotydowym między różnie replikowanymi nićmi (wiodącą i opóźniającą) wynikającą z różnych presji mutacyjnych związanych z syntezą tych nici. Asymetryczną naturę posiadają również geny, u których jedna z nici jest kodująca (sensowna), a na drugiej nici (antysensownej) odbywa się proces transkrypcji. Ta asymetria wynika z presji selekcyjnej na skład aminokwasowy kodowanych białek. W związku z istnieniem tych dwóch mechanizmów generujących asymetrię, stabilność genu zależy od jego położenia na chromosomie. Stosując symulacje komputerowe zbadano wpływ asymetrycznej presji mutacyjnej na ,,przeżywalność” genów. Sekwencje nukleotydowe genów należące do genomu Borrelia burgdorferi poddawano presji mutacyjnej opisanej macierzą 12 przejść nukleotydowych. Po każdym kroku symulacji, po wprowadzeniu mutacji, sprawdzano jak bardzo zmienił się ogólny skład aminokwasowy kodowanego przez dany gen białka w stosunku do białka kodowanego przez ten gen przed mutacją. Gdy ta zmiana przekraczała przyjętą wartość tolerancji –gen był eliminowany i zastępowany przez jego allel z innego genomu. Zastosowano stałą presję mutacyjną (przez całą symulację gen był poddany jednej presji) i zmienną (gen był poddawany presjom mutacyjnym na przemian z nici wiodącej i opóźniającej). Stwierdzono, że prawdopodobieństwo eliminacji genów było większe, jeśli geny były poddawane presji pochodzącej z nici przeciwnej. Natomiast efekt zabijania zmniejszał się, jeśli geny były poddawane zmiennej presji mutacyjnej. Poszczególne geny wykazywały różną stabilność w zależności od częstości zmiany presji i czasu pozostawania pod wpływem danej presji. Wyniki tłumaczą dane uzyskane z analiz porównawczych genomów wskazujących, że geny relatywnie często zmieniają położenie względem różnie replikowanych nici i wobec tego poddawane są zmiennym presjom mutacyjnym. W128. Punkt izoelektryczny białek – analizy proteomów i symulacje komputerowe. Joanna Banaszak (1), Paweł Mackiewicz (1), Natalia Polak (1), Maria Kowalczuk (1), Dorota Mackiewicz (1), Kamila Smolarczyk (1), Małgorzata Dudkiewicz (1), Mirosław R. Dudek (2), Stanisław Cebrat (1) (1) Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wrocławski, ul. Przybyszewskiego 63/77, 51-148 Wrocław (2) Instytut Fizyki, Uniwersytet Zielono-Górski, ul. Szafrana 4A, 65-516 Zielona Góra Wartości punktów izoelektrycznych białek wszystkich analizowanych proteomów mają rozkład bimodalny. Zbiory białek kwaśnych i białek zasadowych są rozdzielone wyraźną strefą wokół pI = 7,5, w której białka nie występują. Przyczyna tego wydaje się trywialna, ponieważ rozpuszczalność białek w pH bliskim ich punktowi izoelektrycznemu jest najniższa. Okazuje się jednak, że stabilność genów poddanych presji mutacyjnej charakterystycznej dla danego genomu jest najmniejsza dla genów kodujących białka o pI = 7,5. Ponadto stwierdzono pozytywną korelację między długością genów a punktem izoelektrycznym kodowanych przez nie białek kwaśnych i negatywną korelację między długością genów a punktem izoelektrycznym kodowanych przez nie białek zasadowych. Obserwowane korelacje wynikają z możliwości buforowania zmian pI wprowadzanych przez substytucje aminokwasowe w większych cząsteczkach białkowych. Wykazano również, że presja mutacyjna, dzięki strukturze uniwersalnego kodu genetycznego również generuje bimodalny rozkład produktów genów, jeżeli presja selekcyjna utrzymuje jedynie rozkład długości 206 Genetyka mikroorganizmów genów charakterystyczny dla danego genomu. Tak więc bimodalny rozkład wartości pI białek jest ewolucyjnie bardzo starą cechą organizmów żywych, być może ,,pamiętającą” czasy ewolucji uniwersalnego kodu genetycznego. W129. Poszukiwanie sekwencji kodujących wśród krótkich ORFów w genomie drożdży Saccharomyces cerevisiae. Krystian Bączkowski (1), Paweł Mackiewicz (1), Maria Kowalczuk (1), Mirosław R. Dudek (2), Stanisław Cebrat (1) (1) Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wrocławski, ul. Przybyszewskiego 63/77, 51-148 Wrocław (2) Instytut Fizyki, Uniwersytet Zielono-Górski, ul. Szafrana 4A, 65-516 Zielona Góra W projekcie sekwencjonowania genomu drożdży Saccharomyces cerevisiae, systematycznie analizowano otwarte ramki odczytu (ORFs –ang. Open Reading Frames) dłuższe niż 100 kodonów. Granica 100 kodonów została arbitralnie przyjęta, aby nie przeoczyć stosunkowo długich ORFów najprawdopodobniej kodujących oraz, aby uniknąć dużej liczby przypadkowych ORFów niekodujących wśród ramek krótkich. Poszukiwanie sekwencji kodujących wśród ORFów krótkich (smORFs –ang. small ORFs) jest utrudnione ze względu na dużą liczbę fałszywych ramek niekodujących. Zidentyfikowanie krótkich ORFów jest jednak istotne, ponieważ wiele z nich może kodować białka pełniące istotne funkcje regulatorowe. W celu znalezienia potencjalnych genów w obrębie smORFów do analiz wybrano 34 583 ORFów dłuższych niż 20 kodonów nieadnotowanych w bazie MIPS w czasie jej pobierania, które nie zachodziły na ORFy o przypisanej już funkcji lub na ORFy wykazujące istotną homologię ze znanymi sekwencjami kodującymi. ORFom przypisano prawdopodobieństwo kodowania w oparciu o parametry asymetrii w składzie nukleotydowym między nicią sensowną (kodującą) i antysensowną (niekodująca). Wcześniejsze analizy wykazały, że zastosowane parametry właściwie identyfikują znane sekwencje kodujące białka nie tylko w genomie drożdży. Dla wybranych ORFów przeszukano dostępne bazy danych w celu znalezienia sekwencji homologicznych do ich produktów białkowych (BLASTP) oraz znanych motywów, domen i regionów konserwatywnych (RPS BLAST, INTERPROSCAN). Parametry programów zoptymalizowano ze względu na krótkie sekwencje. Dla ponad 3000 ORFów poszukiwania dały statystycznie istotne wyniki (E-value < 0.001). Przypisane prawdopodobieństwa kodowania wykazały wysoką korelację z parametrami istotności statystycznej (E-value) uzyskanych poszukiwań, co umożliwia wybranie z rankingu do dalszych analiz eksperymentalnych ORFy o dużym potencjale kodowania. W130. Genotypic characterization of Cyanobacteria based on PCR-RFLP analysis of rpoC1 gene. K. Waleron, J. Głowacka, M. Waleron, M. Całusińska, M. Szefel, A. J. Podhajska Department of Biotechnology, Faculty of Biotechnology University of Gdańsk and Medical University of Gdańsk. Kładki 24, 80-822 Gdańsk, Poland. Cyanobacteria are the most numerous and the most spread photosynthetic prokaryotes, which taxonomy is still discussed. Molecular methods are very useful tools in improving the identification, classification and genotypic characterization of Cyanobacteria. We have tested a technique, based on analysis of rpoC1 gene polymorphism, to determine its usefulness for molecular taxonomy of Cyanobacteria. The DNA –dependent RNA polymerase of Cyanobacteria and Algae contains a unique core component γ, encoded by rpoC1 gene. This gene was used for molecular characterization of different species of Cyanobacteria, for example: Synechococcus (Toledo and Palenik 1997); Cylindrospermopsis raciborskii (Wilson et al. 2000). We try to design universal primers that allow amplification of rpoC1 gene isolated from Cyanobacteria belonging to all of five sections. Our genotypic characterization was performed on 88 strains of Cyanobacteria belonging to 28 genera. The 700bp fragments of rpoC1 gene were amplified with DNA of all tested strains. The PCR products were digested with three endonucleases TasI, TruI, TaqI. All enzymes gave characteristic RFLP profiles: TasI gave 53 RFLP patterns; Tru1I and TaqI allowed to describe 43 and 52 RFLP patterns respectively. The results of the rpoC1-RFLP analysis of PCR products revealed the presence of 69 different rpoC1 restriction groups. Our results indicated that PCR-RFLP analysis of the rpoC1 gene fragment is a useful tool for identification of cyanobacterial species, as well as for strains differentiation. Obtained RFLP profiles will serve to create a Molecular Key for Cyanobacteria. On this basis we conduct further identification of cyanobacterial species isolated from different biotops of Northern Poland. Acknowledgements: Supported by grant KBN 0365/PO4/2003/24. 207 Genetyka mikroorganizmów W131. Development of universal primers for amplification recA gene of Cyanobacteria. K. Waleron, M. Szefel, M. Waleron, J. Głowacka, M. Całusińska, A. J. Podhajska Department of Biotechnology, Faculty of Biotechnology University of Gdańsk and Medical University of Gdańsk. Kładki 24, 80-822 Gdańsk, Poland. At present, classification system of Cyanobacteria is based on their morphological characters and data derived from 16S rDNA sequence comparisons. The molecular systematic of Cyanobacteria based on 16S rDNA is still discussed due to horizontal transfer of rrn operons among microorganisms. Polyphasic analysis of highly conserved genes seems to be a useful molecular approach to construct the taxonomic system of these bacteria. Therefore, we studied possibility of using house-keeping genes, which are universally present in cells and show a high degree of sequence conservation. In this project we analyzed the recA gene polymorphism. We tried to design universal primers to amplify recA gene fragment for all cyanobacterial species. The set of six primers were designed on the basis of published recA gene sequences of few species of Cyanobacteria. The primers recA4/5 appeared to be most universal. The product of amplification was observed for 59 of 77 tested cyanobacterial strains, belonging to 21 different genera. The other primers were selective for particular groups of cyanobacteria, eg. primers recava1/2 were more specific for filamentous species. On the basis of obtained results we decide to sequence amplified recA gene fragments to have more data, which could be used to design more universal degenerate primers. The RFLP analysis of recA PCR products will be performed. The RFLP patterns obtained from tested species of Cyanobacteria will be applied in construction a molecular key for their identification. Acknowledgements: Supported by grant KBN 0365/PO4/2003/24. W132. Testowanie hipotez filogenetycznych z użyciem ważonych najmniejszych kwadratów. Borys Wróbel (1, 2), Rafael Sanjuan (1) (1) Institut Cavanilles de Biodiversitat i Biología Evolutiva, Universitat de Valencia (2) Instytut Oceanologii Polskiej Akademii Nauk Najbardziej wydajne obliczeniowo metody rekonstrukcji filogenetycznej to szeroko stosowane metody oparte na odległościach, do których należy algorytm najbliższego sąsiada oraz algorytm Fitch-Margoliash. Na ich wydajność obliczeniowa pozwala zastąpienie matrycy danych (matrycy cech morfologicznych czy zestawienia sekwencji) matryca odległości miedzy jednostkami taksonomicznymi. Możliwe jest tez zastosowanie metod odległościowych w przypadku, gdy same odległości są danymi pierwotnymi czy kiedy konieczne jest uśrednienie odległości otrzymanych w różnych pomiarach. Większość metod testowania hipotez filogenetycznych (zarówno dotyczących gałęzi, jak i porównywania drzew) wymaga otrzymania pseudopowtórzen matrycy danych na drodze wybierania z podstawianiem (bootstrapping). Jest to kosztowne obliczeniowo i niemożliwe, gdy danymi pierwotnymi są odległości. Tych wad nie maja metody analityczne, jednak zaproponowane do tej pory metody wymagają oszacowania wariancji i kowariancji odległości. Szczególnie konieczność oszacowanie kowariancji może być problematyczne. Metoda ważonych najmniejszych kwadratów, którą prezentujemy, nie ma tej wady. Opracowany test względnej wiarygodności można zastosować zarówno dla oceny wiarygodności gałęzi, gdy dana jest topologia, jak i do porównania kilku topologii. Przedstawione zostaną wyniki symulacji, oraz analiza realnych danych. Wyniki wskazują, ze test gałęzi oparty na ważonych najmniejszych kwadratach prowadzi do zbliżonych wniosków, co testy oparte na psuedopróbkowaniu (test Felsensteina czy Dopazo). Szczegolnie interesujące są wyniki porównania z testem Felsensteina; mimo ze test ten ma chwiejne podłoże teoretyczne, jest on najszerzej stosowany w pracach filogenetycznych. Nasze symulacje wskazują, ze tradycyjnie przyjmowany próg akceptacji kladow (obecność w 70% topologii otrzymanych z użyciem pseudozestawień) jest arbitralny. Zaprezentowane zostanie zastosowanie nowej metody w przypadku, gdy nie jest możliwe pseudopróbkowanie (w analizie zależności miedzy sekwencjami wirusa nabytego braku odporności otrzymywanymi z różnych organów różnych pacjentów). Planujemy użyć nowa metodę w przypadku, gdy nie można użyć innych ze względu na trudności obliczeniowe wynikające z dużej ilości analizowanych sekwencji oraz wysokiego podobieństwa miedzy nimi. Implementacja metody (program WeightLESS) jest dostępna na stronie http://www.iopan.gda.pl/~wrobel. 208 Genetyka mikroorganizmów Komunikaty plakatowe: P267. Zróżnicowanie genotypowe izolatów Phytophthora citricola otrzymanych z roślin szkółkarskich z objawami fytoftorozy. Teresa Orlikowska, Katarzyna Wiejacha, Aleksandra Trzewik Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa, 96-100 Skierniewice, ul. Pomologiczna 18 W wyniku inspekcji prowadzonych w szkółkach drzew i krzewów ozdobnych w latach 1995-2004, otrzymano z roślin wykazujących objawy fytoftorozy 193 izolaty Phytophthora. Kwalifikacji do rodzaju dokonano na podstawie cech morfologicznych strzępek i zarodni na pożywce PDA i wyciągu glebowym a kwalifikacji do gatunku dokonano przy użyciu techniki PCR ze specyficznymi starterami. Spośród 119 oznaczonych tą techniką, 77 izolatów należało do gatunku P. citricola. Były one patogenami następujących gospodarzy: Chamaecyparis lawsoniana, Thuja occidentalis, Thuja plicata (Cupressaceae), Taxus bacctaca L. (Taxaceae), Picea omorica and Abies concolor (Pinaceae), Azalea sp., Calluna vulgaris, Rhododendron, Vaccinium vitis-ideae (Ericaceae sp.), Fagus sylvatica L. (Fagaceae), Fraxinus sp. (Oleaceae). Przy tak dużej liczbie gospodarzy zachodzi pytanie o specjalizację izolatów do porażania różnych gatunków roślin. Z tego powodu analizowano stopień polimorfizmu DNA. Profile otrzymywano za pomocą techniki PCR, ze starterami ISSR i RAPD. Analiza polimorfizmu pozwoliła na stworzenie macierzy 0/1, na podstawie której określono współczynnik zróżnicowania genetycznego i wykreślono dendrogramy, grupujące izolaty o podobnym stopniu zróżnicowania. W pierwszym etapie przeanalizowano polimorfizm 24 izolatów. Zróżnicowanie genotypowe pomiędzy izolatami wahało się od 10 do 60%. Stwierdzono większe różnice pomiędzy izolatami otrzymanymi z roślin należących do różnych rodzin botanicznych. P268. Selekcja naturalna w ewolucji molekularnej wirusów czarnej pierścieniowej plamistości pomidora (TBRV) i pierścieniowej plamistości buraka (BRSV). Magdalena Jończyk, Natasza Borodynko, Henryk Pospieszny Instytut Ochrony Roślin w Poznaniu Stosunek częstości mutacji niesynonimicznych (dN) do synonimicznych (dS) jest ważnym wskaźnikiem presji selekcyjnej działającej na sekwencję kodującą (w=dN/dS). Jeśli w<1 sekwencja jest pod działaniem selekcji negatywnej, gdy w=1 można przypuszczać, że gen był pod wpływem dryfu genetycznego, natomiast przy w>1 na sekwencję oddziałuje ewolucja adaptacyjna (różnicująca). Zwykle uśredniona w dla wszystkich miejsc aminokwasowych rzadko przekracza 1. Wiąże się to z faktem, że większość aminokwasów jest pod silną presją selekcyjną warunkującą funkcjonalność i poprawną strukturę białka. Pod wpływem ewolucji różnicującej znajduje się zwykle kilka-kilkanaście miejsc (kodonów) lub tylko kilka linii ewolucyjnych. Zróżnicowanie presji selekcyjnej pomiędzy poszczególnymi klasami miejsc w sekwencji C-końca polimerazy TBRV i BRSV badano programem codeml z pakietu PAML. W tym celu zastosowano kilka z dostępnych modeli substytucji w odniesieniu do kodonu jako miejsca oddziaływania presji selekcyjnej (modele: M0. M1, M2 i M3). Badana populacja izolatów TBRV i BRSV wykazała przewagę selekcji negatywnej w ewolucji obu gatunków. Udało się jednak wskazać gałęzie, w których prawdopodobnie mogła wystąpić selekcja adaptacyjna. Wyróżniono także te miejsca, w których silna selekcja negatywna może sugerować istnienie nie tylko ograniczeń związanych ze strukturą i funkcją białka, ale również ze strukturą RNA wirusa. P269. Genomotypowanie mikrosymbiontów Genista tinctoria metodą AFLP. Michał Kalita, Wanda Małek, Marta Dmochowska, Łukasz Motyczka, Urszula Słupna Zakład Mikrobiologii Ogólnej, Instytut Mikrobiologii i Biotechnologii UMCS, ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin Analizę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (AFLP) wykorzystano do badania stopnia zróżnicowania genomowego i genomotypowania mikrosymbiontów Genista tinctoria pochodzących z Anglii, Polski i Ukrainy. W metodzie tej wykorzystano jeden enzym restrykcyjny PstI, jeden adaptor i dwa selekcyjne startery: Pst-G i PstGC odpowiednio, z G i G+C na końcach 3’. W reakcji PCR z bardziej selekcyjnym starterem Pst-GC powstało 57% 209 Genetyka mikroorganizmów polimorficznych amplikonów, które pozwoliły odróżnić badane izolaty i szczepy referencyjne reprezentujące różne gatunki rodzaju Bradyrhizobium. Wielkość produktów amplifikacji wynosiła od 0.28 do 2.15 kb. Wśród nich, trzy bandy DNA z amplifikacji ze starterem Pst-G i cztery z reakcji PCR ze starterem Pst-GC były monomorficzne niemal dla wszystkich mikrosymbiontów G. tinctoria niezależnie od ich geograficznego pochodzenia. Stopień podobieństwa genomowego rizobiów specyficznych dla G. tinctoria określono stosując macierz prostokątną opartą na profilach AFLP. Wynosił on, dla poszczególnych izolatów, od 0.32 do 1.00 i wskazywał na ich dużą heterogenność genomową. Współczynniki podobieństwa DNA mikrosymbiontów G. tinctoria, włączając także referencyjne bradyrizobia, przedstawiono na dendrogramie skonstruowanym w oparciu o metodę grupowania UPGMA. Badane izolaty zostały umieszczone w trzech podgrupach, zgodnie z ich geograficznym pochodeniem podobnie jak na fenogramie. Wynik ten wskazuje na duże znaczenie analizy AFLP w badaniach taksonomicznych tj. w klasyfikacji i identyfikacji rizobiów. Wykłady plenarne: W133. Genetyczne podstawy patogenezy prątka gruźlicy. Metabolizm steroidów. Jarosław Dziadek Centrum Biologii Medycznej, PAN, Lodowa 106, Łódź. Mycobacterium tuberculosis, zidentyfikowany w 1882 roku jako czynnik etiologiczny gruźlicy jest wciąż najgroźniejszym bakteryjnym patogenem człowieka odpowiedzialnym rocznie za 3 mln przypadków śmiertelnych. Zakażenie M. tuberculosis może nastąpić poprzez inhalację nawet kilku prątków i ich kontakt z tkanką płucną. W 90-95% przypadków u zdrowych, dorosłych osób prątki są szybko inaktywowane przez makrofagi płucne oraz swoistą odpowiedź immunologiczną, co zabezpiecza przed uszkodzeniem tkanki i rozwojem infekcji. W niektórych przypadkach jednakże ani odpowiedź wrodzona, ani swoista odpowiedź immunologiczna nie są w stanie kontrolować przebiegu zakażenia. Makrofagi płucne uwalniają wiele różnych czynników chemotaktycznych indukujących napływ neutrofili i limfocytów oraz nieaktywnych monocytów krwi, a następnie wytworzenie ziarniniaków (granuloma) zbudowanych z makrofagów i komórek epitelialnych. Ziarniniaki mogą ulegać zwapnieniom, bądź zanikają przez upłynnienie. W późniejszej fazie zakażenia prątki rozprzestrzeniają się przez oskrzeliki płucne lub naczynia krwionośne i limfatyczne tworząc kolejne zmiany ziarniniakowe. Wnikanie M. tuberculosis do makrofagów, ich zdolność do wewnątrzkomórkowego przeżywania, a także długotrwałe przeżywanie prątków gruźlicy w organizmie człowieka, pomimo stosowanej terapii antybiotykowej, związane jest z właściwościami samych bakterii i ich zdolnością do przystosowywania się do zmian środowiska. Niespotykana u innych organizmów liczba genów M. tuberculosis, których produkty zaangażowane są w przemiany steroidów sugerowałyby znaczenie tych elementów dla patogenezy prątków. Należą do nich komponenty biosyntezy ściany komórkowej takie jak lipidy, glikolipidy, lipoglikolipidy czy poliketydy. Genom M. tuberculosis wyposażony jest również w geny kodujące enzymy cyklu b-oksydacji czy alternatywnych szlaków oksydacji lipidów. Prace ostatnich lat wskazują na rolę cholesterolu we wnikaniu mykobakterii do makrofagów a także w wytwarzaniu białka ochronnego (TACO) odpowiedzialnego za zahamowanie fuzji fago i lizosomów. Postuluje się również, że degradacja kwasów tłuszczowych jest głównym źródłem energii w czasie zakażenia, a bogate w tłuszcze osłony komórkowe prątków ulegają przeorganizowaniu, co wiąże się z degradacją lub resyntezą różnorodnych lipidów ściany komórkowej. Przedmiotem wykładu będzie aktualny stan wiedzy dotyczący wybranych zagadnień metabolizmu steroidów prątków gruźlicy i ich znaczenie dla procesu patogenezy. W134. Evolution of Neisseria species virulence: what else can be deleted? Stella Nowicki (1) Sergei Chumakov (2), Audrey Hart-van Tassell (1), Bogdan Nowicki (1), Catherine Putonti (2), Petri Urvil (1), Meizhuo Zhang (2), Yuriy Fofanov (2) (1) Department of Obstetrics and Gynecology, and Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch, Galveston, TX. (2) Department of Computer Science University of Houston, Houston, TX Infectious diseases remain the major cause of human morbidity/mortality. Microbial virulence factors are carried on pathogenecity (PAI) and/or genomic islands (GI) acquired by the horizontal gene transfer. These virulence factors have unique statistical properties of DNA (G/C ratio) and have been the major targets for diagnosis, treatment and vaccine development. To investigate global organization of virulence and to analyze (retrospectively) evolution of bacterial 210 Genetyka mikroorganizmów virulence, a novel algorithm Similarity Plot was used. The S-plot visualized 2-D organization of genomes against each other and identified genomic regions of unusual statistical properties. Here we show that S-plot identified several new GI visualized as blue lines of which majority contained virulence like-genes such as toxins, hemagglutinin/hemolysin not characterized yet. These genes were clustered with t-RNA, bacteriophage or transposase. Based on sequence alignment majority of GI’s had similar genomic location in all pathogenic Neisseria spp, suggesting that these GI’s were acquired before ancestral parent strain Chromobacterium violaceum separated into neuro– and genital– pathogens (N. meningitidis and N. gonorrhoeae). In comparison to N. memingitidis, gonococci lacked eight common GI’s or deleted segments of GI in less virulent strains, suggesting that evolution of N. gonorrhoeae progressed primarily by deletion of GI’s and virulence determinants. Diagnostyka, terapia, inżynieria genetyczna, biotechnologia Komunikaty ustne: W135. Konstrukcja i charakterystyka fuzji genu cjaA Campylobacter z genem extB E. coli kodującym podjednostkę B toksyny LT, białko o charakterze adjuwantu. Agnieszka Wyszyńska, Joanna Lampkowska, Elżbieta. K. Jagusztyn-Krynicka Zakład Genetyki Bakterii, Instytut Mikrobiologii, Uniwersytet Warszawski, 02-096 Warszawa, ul. Miecznikowa 1, Polska Bakterie rodzaju Campylobacter są aktualnie najczęściej izolowanymi ludzkimi enteropatogenami. Jak dotąd, nie opracowano skutecznej szczepionki anty-Campylobacter ani dla ludzi z grup podwyższonego ryzyka ani dla kurcząt będących głównym źródłem ludzkich infekcji. Celem prezentowanych badań było skonstruowanie i scharakteryzowanie fuzji genu cjaA (cj0982c) Campylobacter kodującego 30 kDa protekcyjny antygen z genem extB E. coli kodującym podjednostkę B toksyny LT E. coli, białko wykazujące właściwości adjuwantowe. Przygotowano rekombinacyjne plazmidy zawierające oba geny wyrażane z własnych promotorów, fuzje translacyjną extB-cjaA oraz fuzję kodująca białko hybrydowe CjaAxLT-A2xLT-B. Prawidłowość konstrukcji potwierdzono analizą restrykcyjną oraz na drodze sekwencjonowania. Konstrukty genetyczne zostały wprowadzone do komórek E. coli oraz po przeklonowaniu do plazmidu pYA3341 (Asd+) do komórek awirulentnej Salmonella enterica sv. Typhimurium χ3987 stosowanej jako nośnik heterologicznych antygenów w badaniach szczepionkowych. Hybrydowe białka przebadano pod kątem ich lokalizacji w komórce (analiza obecności białka w izolowanych frakcjach komórkowych), reakcji ze specyficznymi przeciwciałami (Western blot) oraz zdolności do rozpoznawania GM1 receptorów (test ELISA). Awirulentna Salmonella eksprymująca hybrydowe białka zostanie użyta do immunizacji dwu gatunków zwierzat –myszy i kurcząt. Ten cykl eksperymentów pozwoli na ocenę adjuwantowego efektu LT-B na dwu modelach zwierzęcych. W136. Analiza funkcjonalna produktu genu cjaA (cj0982) Campylobacter na drodze ukierunkowanej mutagenezy. Agnieszka Wyszyńska (1), Joanna Życka (1), Nadzieja Drela, Renata Godlewska (1), E. K. Jagusztyn-Krynicka (1) (1) Zakład Genetyki Bakterii, Instytut Mikrobiologii Uniwersytetu Warszawskiego, 02-096 Warszawa, ul. Miecznikowa 1, Polska (2) Zakład Immunologii, Instytut Zoologii Uniwersytetu Warszawskiego, 02-096 Warszawa, ul. Miecznikowa 1, Polska Immunodominujące białko CjaA (Cj0982) Campylobacter zostało zidentyfikowane w bibliotece genomowego DNA przy użyciu króliczej surowicy anty-Campylobacter. Jak wykazano stosując izogeniczne mutanty cjaA– antygen ten jest dwufunkcyjną lipoproteiną. Celem prezentowanych badań było potwierdzenie roli białka w procesie transportu glutaminy oraz interakcji z komórkami eukaryotycznymi jak i jego lokalizacji w komórce na drodze ukierunkowanej mutagenezy. Określono motywy/aminokwasy białka zaangażowane w omawiane procesy. Mutagenezie poddano pięć kodonów genu cjaA: 1– dwa zlokalizowane w kieszeni wiążącej substrat (K115G, H195G), 2 – dwa wchodzące w skład 211 Genetyka mikroorganizmów motywu RGD potencjalnie odpowiedzialnego za rozpoznawanie integrynowych receptorów (R189G, D191A) oraz 3 – kodon dla cysteiny sekwencji sygnalnej (C20A). Prawidłowość wprowadzonych zmian w sekwencjach kodujących potwierdzono poprzez określenie sekwencji nukleotydowych odpowiednich fragmentów DNA. Przeprowadzone testy fizjologiczne udokumentowały rolę Lis 115 i His 195 w wiązaniu glutaminy oraz wpływ powierzchniowo zlokalizowanego motywu RGD na proces adhezji do komórek Hela. Dodatkowo wykazano, że Cys 20 sekwencji sygnałowej warunkuje błonową lokalizację CjaA potwierdzając, że zgodnie z przewidywaniami białko to jest lipoproteiną procesowana przez sygnałową peptydazę II. W137. Rekombinantowe antygeny Toxoplasma gondii – oszacowanie przydatności w immunodiagnostyce. Lucyna Holec, Elżbieta Hiszczyńska-Sawicka, Artur Gąsior, Józef Kur Katedra Mikrobiologii, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska, ul. G. Narutowicza 11/12, 80-952 Gdańsk Toksoplazmoza jest chorobą rozpowszechnioną na całym świecie. Szacuje się, iż liczba osób seropozytywnych w Polsce wynosi 60%. Szczególnie istotny problem stanowi toksoplazmoza wrodzona, która jest przyczyną aborcji lub wad wrodzonych u dzieci. Obecnie w Polsce nie prowadzi się badań przesiewowych u kobiet ciężarnych i noworodków w kierunku zarażenia Toxoplasma gondii. Systematyczne badania prenatalne odgrywałyby bardzo istotną rolę we wczesnej identyfikacji zarażeń pasożytem oraz leczeniu. Wprowadzenie do diagnostyki toksoplazmozy metody, która byłaby czuła, szybka i tania, pozwoliłoby na wykonywanie badań przesiewowych. Ponadto bardzo ważne jest, aby metoda diagnostyczna pozwoliła odróżnić fazę ostrą od fazy przewlekłej toksoplazmozy. Obecnie w stosowanych testach diagnostycznych wykorzystuje się głównie antygeny natywne (spreparowane całe tachyzoity, antygeny powierzchniowe bądź somatyczne). Rekombinantowe białka antygenowe mogą być alternatywnym źródłem antygenów stosowanych w diagnostyce. Bardzo duża liczba białek antygenowych T. gonidii, powoduje, że konieczne jest przebadanie ich pod kątem przydatności do immunodiagnostyki. Wykorzystując metody Westen blotting, dot blot, oraz test ELISA zbadano zdolność do oddziaływania kilkunastu rekombinantowych białek antygenowych T. gondii (GRA1, GRA2, GRA6, GRA7, SAG1, SAG4, p22, p35, ROP1, ROP9, MAG1, LDH1 i LDH2) z przeciwciałami pochodzącymi z surowicy ludzkiej. Zastosowano pulę surowic pochodzącą od pacjentów seropozytywnych oraz seronegatywnych. Wyniki przeprowadzonych badań pozwoliły podzielić antygeny na te, które reagują z surowicą pochodzącą od pacjentów z ostrą (GRA7, p35) lub przewlekłą (SAG4, MAG1) toksoplazmozą, a tym samym umożliwiają różnicowanie jej faz. W138. Chimeryczne fimbrie typu Dr-SAG1 – potencjalna szczepionka przeciwko toksoplazmozie. Artur Gąsior, Elżbieta Hiszczyńska-Sawicka, Lucyna Holec, Józef Kur Katedra Mikrobiologii, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska, ul. G. Narutowicza 11/12, 80-952 Gdańsk Toksoplazmoza jest chorobą wywoływaną przez pierwotniaka Toxoplasma gondii. U zwierząt zarażonych T. gondii występują niespecyficzne objawy kliniczne (utrata apetytu, biegunka, znaczny spadek masy ciała i ogólne osłabienie), a także w bardzo dużej ilości przypadków poronienia. Z tego powodu zarażenie pasożytem jest bardzo poważnym problemem powodującym duże straty w hodowli zwierząt. Leczenie toksoplazmozy jest bardzo długotrwałe i skomplikowane, dlatego najlepszym sposobem walki z tą chorobą byłyby szczepienia. Ciągły rozwój immunologii, biologii molekularnej, prowadzi do nowych strategii w konstruowaniu ,,idealnej” szczepionki. Eksponowanie określonych sekwencji białkowych (epitopów) na powierzchni bakterii w postaci fimbrii zbudowanych z chimerycznych podjednostek DraE otwiera nową drogę do biotechnologicznej produkcji szczepionek anty-T. gondii. Długie, zbudowane z kilkuset takich samych rekombinantowych podjednostek DraE, fimbrie chimeryczne mogą zawierać bardzo wiele kopii wybranego przez nas epitopu. Biorąc pod uwagę fakt, że są to organella powierzchniowe oraz że ich liczba na powierzchni pojedynczej komórki wynosi około 500, można przypuszczać, że będą one bardzo dobrymi immunogenami. Przypuszczenia te potwierdzają liczne badania nad wykorzystaniem fimbrii natywnych, bądź chimerycznych, w szczepieniu zwierząt. Skonstruowano system ekspresji chimerycznych fimbrii typu Dr-SAG1 zbudowanych z podjednostek białkowych adhezyny DraE z determinantą antygenowa pochodzącą z antygenu SAG1 T. gondii. Antygen SAG1, będący białkiem powierzchniowym pasożyta, został wybrany w oparciu o wyniki badań, w których wykazano jego silną indukcję odpowiedzi immunologicznej zarówno u zwierząt jak i ludzi. Ekspresja białka adhezyny DraE zawierającej sekwencję antygenową została potwierdzona metodą Western blotting z użyciem przeciwciał anty-DraE. Natomiast obecność 212 Genetyka mikroorganizmów chimerycznych fimbrii typu Dr-SAG1 na powierzchni komórek bakteryjnych Escherichia coli BL21(DE3) potwierdzono wykorzystując metodę mikroskopii immunofluorescencyjnej. � W139. Wykrywanie oporności na pyrazynamid wśród szczepów Mycobacterium tuberculosis complex metodą SSCP-PCR. Albert Jaworski, Ewa Augustynowicz-Kopeć, Krzysztofa Janus, Anna Zabost, Zofia Zwolska Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, Zakład Mikrobiologii, 01-138 Warszawa, ul. Płocka 26 Pyrazynamid (PZA), wraz z izoniazydem, ryfampicyną i etambutolem należy do zestawu podstawowych leków stosowanych w leczeniu gruźlicy. Wykonanie dla danego szczepu testu lekowrażliwości na PZA jest trudne i możliwe tylko za pomocą systemu hodowlanego Bactec. Od niedawna wiadomo, że za oporność na PZA odpowiedzialne są mutacje punktowe w ok. 600 nukleotydowym fragmencie genu PncA. Celem pracy było stworzenie prostego testu określającego wrażliwość szczepu Mycobacterium tuberculosis na PZA opartego na metodach biologii molekularnej. Materiały i metody: Z wyhodowanych na podłożu L-J 26 szczepów M. tuberculosis complex wyizolowano DNA i poddano reakcji amplifikacji z dwoma starterami PncA1 i PncA2. Otrzymany produkt wielkości 623 pz zsekwencjonowano metodą ABI Prism-BigDye-Terminator Cycle Sequencing Kit. Sekwencje genu PncA dla szczepów klinicznych porównywano z sekwencjami tego genu otrzymanymi dla szczepów wzorcowych: M.tuberculosis H37Rv (PZA-wrażliwy) i M.bovis BCG (PZA-oporny), w celu znalezienia mutacji punktowych odpowiedzialnych za oporność na lek. Równocześnie otrzymane produkty PCR cięto enzymami restrykcyjnymi, podzielonymi na dwie grupy: a) (BstEII, Tsp45I) i b) (BsaHI, AflIII). Następnie uzyskane fragmenty analizowano metodą SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) na renaturującym żelu poliakrylamidowym. Początkową analizę przeprowadzono dla szczepu H37Rv oraz M.bovis BCG w celu wystandaryzowania metody, a następnie analizowano fragmenty DNA otrzymane dla poszczególnych 26 szczepów klinicznych. Wyniki: 1. Analiza SSCP pokazała, że lepiej dobranymi fragmentami do wykrywania mutacji w genie PncA są enzymy z grupy b. 2.Jakość rozdziału na żelu poliakrylamidowym zależała od miejsca mutacji w sekwencji genu PncA. 3. Metoda ta pozwala na wykryć 80% mutacji w genie PncA odpowiedzialnych za oporność na PZA. W140. Wykrywanie genetycznych podtypów Mycobacterium kansasii metodą hsp65 RFLP wśród szczepów izolowanych w IGiChP w Warszawie. Krzysztofa Janus (1), E. Augustynowicz-Kopeć (1), A. Jaworski (1), M. Klatt (1), A. Zabost (1), B. Roszkowska (2), D. Górska (3), Z. Zwolska (1) (1) Zakład Mikrobiologii, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, 01-138 Warszawa, ul. Płocka 26 (2) III Klinika Chorób Płuc, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, 01-138 Warszawa, ul. Płocka 26 (3) II Klinika Chorób Płuc i Gruźlicy, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, 01-138 Warszawa, ul. Płocka 26 Mycobacterium kansasii jest jednym z głównych gatunków prątków atypowych (MOTT), wywołujących mykobakteriozę u ludzi. Równocześnie jest gatunkiem środowiskowym, dla którego naturalnym rezerwuarem jest woda wodociągowa. Rzadko występuje w glebie, w wodach jezior i rzek i sporadycznie izoluje się go od zwierząt. Najważniejszym jednak spostrzeżeniem jest fakt, że wyhodowanie szczepu M. kansasii od chorego nie stanowi dowodu mykobakteriozy Molekularna analiza szczepów M. kansasii na podstawie genu hsp65 (heat shock protein) pozwala podzielić je na pięć podtypów, z których tylko jeden (podtyp I), jest uważany za typowy patogen dla człowieka, pozostałe zaś są szczepami środowiskowymi. Celem pracy było przeprowadzenie analizy pokrewieństw genetycznych metodami biologii molekularnej szczepów Mycobacterium kansasii wyizolowanych z materiałów klinicznych pacjentów IGiChP i porównanie ich z gatunkami wyhodowanymi z wody. Materiały i metody: Wyizolowano i zidentyfikowano 39 szczepów M. kansasii z materiałów klinicznych i 11 – z wymazów z ujęć wody z dwóch oddziałów. Następnie przeprowadzono analizę restrykcyjną genu hsp65. Gen zamplifikowano przy użyciu specyficznych primerów. Otrzymany produkt pocięto enzymami restrykcyjnymi HaeIII i BstEII i rozdzielano na 4% żelu agarozowym. Wszystkie szczepy zostały również poddane analizie RFLP z markerem TR2. Otrzymane wzory RFLP były analizowane i porównywane. Wyniki i Wnioski: 1.Wśród analizowanych szczepów dominował podtyp IV i III ( 90 %). 2. Wśród szczepów należących do podtypu IV 72 % miało identyczne wzory RFLP. 3. Z dwóch próbek wody wyizolowano podtyp II 4. Podsumowując sugerujemy, aby w każdym przypadku wyizolowania od chorego szczepu M. kansasii określić jego podtyp przed podjęciem decyzji o leczeniu. 213 Genetyka mikroorganizmów W141. Identyfikacja genów wirulencji i systemu globalnej regulacji ekspresji egzobiałek agr w nosicielskich i patogennych szczepach Staphylococcus aureus. Kinga Wójcik (1), Magdalena Kowalska (1), Anna Kędzierska (2) (1) Zakład Mikrobiologii, Wydział Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie (2) Katedra Immunologii Klinicznej i Patologii, Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii CM UJ Szczepy Staphylococcus aureus produkują różnorodne czynniki wirulencji w tym adhezyny, białka maskujące powierzchnię komórki oraz egzobiałka degradujące tkanki gospodarza i inaktywujące składniki odpowiedzi obronnej makroorganizmu. Większość genów czynników wirulencji S. aureus należy do regulonu, w którym ekspresja białek kontrolowana jest przez system globalnej regulacji agr, który koduje elementy dwuskładnikowego systemu transdukcji sygnału, ulegającego aktywacji poprzez zwiększenie gęstości komórek bakterii. Na podstawie różnic w sekwencji genów loci agr podzielono populacje szczepów S. aureus na cztery grupy agr. Celem niniejszej pracy było określenie potencjału wirulencji patogennych i oportunistycznych szczepów S. aureus. W kolekcji szczepów S. aureus pochodzących od chorych i od nosicieli określono występowanie genów kodujących czynniki wirulencji: adhezyny, egzotoksyny i egzoenzymy metodą amplifikacji fragmentów poszukiwanych genów z zastosowaniem PCR oraz oznaczono grupy agr. We wszystkich badanych szczepach zaobserwowano obecność licznych genów czynników wirulencji. Połowa testowanej kolekcji szczepów S. aureus pochodzących od bezobjawowych nosicieli zawierała agr grupy trzeciej, podczas gdy w szczepach wyizolowanych od chorych przeważała pierwsza grupa agr, a trzecia – nie przekraczała 30 % szczepów. Otrzymane wyniki sugerują możliwość znaczącego wpływu przynależności do danej grupy systemu globalnej regulacji ekspresji genów agr na wirulencję testowanych szczepów S. aureus. Praca finansowana przez KBN nr projektu 3P05A 092 22 Komunikaty plakatowe: P270. Sekwencje minisatelitarne jako markery patogeniczności owadobójczego grzyba Conidiobolus coronatus wobec larw Galleria mellonella. Wioletta Wieloch (1), Mariusz Sacharczuk (2), Mieczysława I. Boguś (1), Kazimierz Jaszczak (2) (1) Instytut Parazytologii PAN. Ul. Twarda 51/55. 00-818 Warszawa (2) Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN. Jastrzębiec, ul. Postępu 1. 05-552 Wólka Kosowska Conidiobolus coronatus (Entomophthoraceae) jest grzybem entomopatogennym szybko zabijającym żywicieli za pomocą toksycznych metabolitów i może posłużyć jako potencjalne źródło insektycydów. Celem pracy było zbadanie czy zróżnicowana wirulencja poszczególnych kolonii C. coronatus ma podłoże genetyczne. Sto czterdzieści jeden kolonii grzybowych wyprowadzonych z pojedynczych zarodników hodowano na podłożu Sabouroud wzbogaconym homogenatem z mola woskowego (G. mellonella). Patogeniczność kolonii testowano na larwach siódmego stadium G. mellonella. Testy wykazały zróżnicowaną śmiertelność larw (10% – 100%) po 20-to godzinnej ekspozycji na zarodnikujące kolonie. DNA wybranych kolonii o różnej patogeniczności zostało przebadane przy użyciu techniki DNA fingerprinting z użyciem enzymów MspI/HaeIII oraz sondy Jeffreys’a 33.6, którą użyto po raz pierwszy do badania genomu grzybowego. Analizowano fragmenty w zakresie najlepszego rozdziału elektroforetycznego tj. od 2-20 tys. par zasad. Liczba prążków dla poszczególnych kolonii wynosiła od 14 do 20. Indeks podobieństwa pomiędzy koloniami o tej samej patogeniczności mieścił się w przedziale od 0,97 do 0,80. Dystans genetyczny, oszacowany na podstawie indeksów podobieństwa wewnątrz i między koloniami o różnej patogeniczności, wynosił od 0,03 do 0,28. Wyróżnionych zostało kilka specyficznych prążków różnicujących kolonie o niskiej (10%) i wysokiej (100%) patogeniczności wobec larw. Analiza statystyczna wskazuje na korelację pomiędzy patogenicznością a genetycznym podobieństwem analizowanych kolonii. Można przypuszczać, że te specyficzne prążki, przez kolokację w genomie, są związane z genami odpowiedzialnymi za proces porażania owadów. Hybrydyzacja ludzkich sekwencji minisatelitarnych z genomem grzybowym wskazuje, że są to sekwencje szeroko rozpowszechnione wśród Eucaryota, zachowywane w procesie ewolucji. 214 Genetyka mikroorganizmów P271. Zastosowanie sond DNA i wyznaczników molekularnych dla zróżnicowania dermatofitów z rodzaju Trichophyton i Microsporum. Anita Dobrowolska (1), Łukasz Bojarski(1)*, Aleksandra Kaszuba (2), Paweł Stączek (1) (1) Zakład Genetyki Drobnoustrojów, Uniwersytet Łódzki, ul. Banacha 12/16, 90-237 Łódź , e-mail: [email protected] *(obecny adres) Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej, ul. Ks. Trojdena 4, 02-109 Warszawa (2) II Katedra Dermatologii i Wenerologii, Klinika Dermatologii i Dermatologii Dziecięcej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, ul. Kniaziewicza 1/5, 91-347 Łódź Tradycyjne metody diagnostyki mikologicznej oparte są na analizie cech morfologicznych i biochemicznych grzybów chorobotwórczych. Ocena cech fenotypowych jest trudna, czasochłonna i dość często prowadzi do postawienia błędnej diagnozy. W prezentowanej pracy podjęto próbę opracowania techniki identyfikacji gatunków dermatofitów, opartej na hybrydyzacji kwasów nukleinowych metodą dot-blot i Sothern-blot. Opracowano metodę izolacji genomowego DNA z komórek grzybów chorobotwórczych o szerokim spektrum przynależności systematycznej. Uzyskane preparaty DNA wykorzystano jako matryce w reakcji PCR-RAPD. Analiza uzyskanych profili RAPD, wykazała obecność produktów, które z dużym prawdopodobieństwem mogą zawierać specyficzne rodzajowo i gatunkowo sekwencje nukleotydowe. Wyselekcjonowano produkty reakcji PCR-RAPD zsekwencjonowano, a uzyskane wyniki poddano analizie komputerowej, obejmującej m.in. poszukiwanie homologii z sekwencjami zgromadzonymi w światowym banku genów GeneBank. Spośród analizowanych produktów PCR wybrano dwa, z których udało się uzyskać trzy sondy molekularne, które mogą być specyficzne dla grzybów z gatunków Trichophyton rubrum i Microsporum canis oraz z rodzaju Trichophyton. Specyficzność sond potwierdza się obecnie poprzez hybrydyzację kwasów nukleinowych metodą dot-blot i Southernblot. Ponadto, przedstawi się wyniki wskazujące, że technika PCR, skojarzona z analizą restrykcyjną produktów amplifikacji określonych regionów rDNA, może zostać zastosowana z powodzeniem w naszych laboratoriach diagnostyki chorobotwórczych dermatofitów. P272. Studies of methylation activity of MmeI restriction endonuclease and methyltransferase. Joanna Nakonieczna, Sylwia Firasiewicz, Anna Podhajska Intercollegiate Faculty of Biotechnology University of Gdańsk and Medical University of Gdańsk, Kładki 24, 80-822 Gdańsk Restriction endonuclease MmeI (R.MmeI) and methyltransferase MmeI (M.MmeI) are isolated from methylotrophic bacteria Methylophilus methylotrophus. Both components of MmeI restriction-modification system recognize partially degenerated sequence: 5’-TCCRAC-3’/3’-AGGYTG-5’, where R= G or A, Y=T or C. R.MmeI cuts DNA molecule after 20th and 18th nucleotide away from recognition sequence on top and bottom strand respectively. We also notice that R.MmeI exerts methyltransferase activity modifying only one strand of recognition sequence, namely adenine in 5’TCCRAC-3’ sequence. Stimulation of restriction activity by SAM (S-adenosyl-L-methionine; methyl donor) and SIN (Sinefungin; non-hydrolizable SAM analogue) together with hemimethylation ability (methylation of one strand) decide of uniqueness of this enzyme. Hemimethylation does not protect host DNA from MmeI cleavage. Methyltransferase MmeI methylates both adenines in recognition sequence making it resistant to MmeI restriction. On the basis of these facts we proposed hypotesis of functional cooperation between both R-M.MmeI enzymes. In 2004 R.MmeI gene was isolated and cloned in Escherichia coli (R.Morgan, NEB-INC.). Plasmid containing R.MmeI gene is hosted in E. coli cells and is resistant to MmeI cleavage. In such circumstances we carried out series of experiments in order to verify our previous observation. In present study we used several different DNA molecules (dsDNA oligonucleotides, long DNA fragments) as substrates for methylation activity tests. All experiments included in this study were based on in vitro tests and need to be confirmed by in vivo analysis. On the basis of obtained data we are able to conclude that R.MmeI is sufficient to protect DNA from autorestriction. M.MmeI may be an independently acting methyltransferase or it recognizes sequence that overlaps R.MmeI recognition site. Given thesis is based on observation that methylation of both adenine residues in 5’-TCCRAC-3’/3’-AGGYTG-5’ sequence prevents M.MmeI methylation of the above DNA sequence. Our observation led to conclusion that specificity of M.MmeI should be thoroughly verified. Acknowledgements Supported by BW B051-5-0113-4 215 Genetyka mikroorganizmów P273. Transmisja prątków gruźlicy pomiędzy blisko spokrewionymi osobami. Albert Jaworski (1), Ewa Augustynowicz-Kopeć (1), Krzysztofa Janus (1), Dorota Krawiecka (2), Maria Błezowska (3), Lidia Maciak (4), Krystyna Podolak (5), Zofia Zwolska (1) (1) Zakład Mikrobiologi, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, 01-138 Warszawa , ul. Płocka 26 (2) Kujawsko-Pomorskie Centrum Pulmonologii w Bydgoszczy (3) Dolnośląskie Centrum Chorób Płuc we Wrocławiu (4) Wojewódzki Szpital Zakaźny w Gdańsku (5) Specjalistyczny Szpital Gruźlicy i Chorób Płuc w Rzeszowie Śledzenie dróg transmisji Mycobacterium tuberculosis w środowisku człowieka stanowi jeden z najważniejszych elementów w programach walki z gruźlicą. Przez wiele lat z powodu braku odpowiednich metod badawczych wiedza o transmisji choroby była bardzo ograniczona. Obecnie, zastosowanie techniki RFLP opartej na analizie polimorfizmu występowania i liczbie sekwencji IS6110 w genomie szczepów prątków umożliwia takie badania. Celem pracy było stwierdzenie czy miała miejsce aktywna transmisja w obrębie czterech rodzin, których członkowie chorowali na gruźlicę. Materiał stanowiły szczepy M. tuberculosis wyhodowane w czterech województwach Polski od chorych na gruźlicę dorosłych i ich dzieci. 1. –szczepy wyhodowane z płynu m-rdzeniowego od kobiety, która zmarła w połogu oraz od jej dziecka– noworodka z popłuczyn żołądkowych, 2.szczepy wyhodowane z plwocin pobranych od ojca i dziecka, 3. szczepy wyizolowane plwociny od matki i córki, 4. szczepy wyhodowane z plwocin od matki i córki. Wszystkie szczepy miały wykonaną identyfikację gatunkową oraz oznaczony test lekoowrażliwości. Metody: DNA wyizolowany z hodowli prątków na pożywce płynnej trawiono endonukleazą PvuII, fragmenty rozdzielano na 1 % żelu agarozowym, przenoszono na membranę nylonową i poddawano hybrydyzacji ze znakowanymi barwnie sondami będącymi fragmentami IS 6110. Otrzymane wzory RFLP ze szczepów „rodzinnych” były porównywane pomiędzy sobą. Wyniki i wnioski: 1. We wszystkich badanych przypadkach 4 rodzin otrzymano identyczne wzory RFLP u szczepów izolowanych od dzieci i ich rodziców. 2. Zastosowanie metod biologii molekularnej umożliwiło potwierdzenie aktywnej transmisji gruźlicy w ramach osób blisko spokrewnionych. 3. Według naszej wiedzy, w Polsce po raz pierwszy udowodniono powyższą transmisję. P274. Fizjologiczno-morfologiczna charakterystyka drożdży Saccharomyces cerevisiae opornych na jony kobaltu. Małgorzata Grządka (1), Ryszard Adamski (2), Bogdan Barwiński (3), Zbigniew Kotylak (1) (1) Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Rzeszowski ul. Rejtana 16C 35-959 Rzeszów (2) Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wrocławski (3) Instytut Fizyki Doświadczalnej, Uniwersytet Wrocławski Tolerancja na metale ciężkie może być wynikiem modyfikacji w obrębie zewnętrznych osłon komórkowych, chelatowania metali, precypitacji, wewnątrzkomórkowej separacji, np. w wakuolach, zwiększonej produkcji melaniny lub niskocząsteczkowych substancji organicznych. Do badań wybrano auksotroficzne szczepy Saccharomyces cerevisiae, które wykazywały oporność na wysokie stężenia jonów kobaltu (2mM) oraz szczep wrażliwy na koncentrację 0.6mM. Przebadano wpływ różnych stężeń metalu na kinetykę wzrostu tych szczepów w zależności od: składu podłoża hodowlanego (pełne i minimalne z glukozą, etanolem, glicerolem), temperatury (30oC, 35oC) i pH podłoża (pH3, pH8). Istotnym problemem było ustalenie ilości kobaltu akumulowanego w komórkach drożdży w zależności od jego koncentracji w podłożu i warunków hodowli. Analizę tę przeprowadzono metodą absorpcyjnej spektrometrii atomowej (ASA). Okazało się, że istnieją wyraźne różnice w akumulacji między szczepami opornymi do 2mM. Aby stwierdzić czy badane szczepy S. cerevisiae akumulują kobalt wewnątrz komórki, czy też ulega on sorpcji w obrębie zewnętrznych osłon komórkowych dokonano analizy w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM). Uzyskane wyniki korelują z danymi dotyczącymi stopnia akumulacji tego pierwiastka. Wartość akumulacji kobaltu ustala się na stałym poziomie przy koncentracji 1mM, jest on wówczas wiązany w obrębie ściany komórkowej. Natomiast w przypadku 2mM stężenia ilość akumulowanego metalu nie zmienia się. Prawdopodobnie jest on częściowo transportowany do wnętrza komórki i separowany w wakuoli. Wykonano również badania za pomocą mikroskopu atomowego (AFM) metodą kontaktową. Wykazały one, że powierzchnia komórki drożdży ulega zmianie w zależności od stężenia kobaltu, a w przypadku wysokich koncentracji obserwowano wytrącanie się charakterystycznych krystalicznych złogów. Może to być jeden z systemów obronnych komórki przed toksycznością tego metalu. 216 Genetyka mikroorganizmów P275. Wykorzystanie metody PCR do wykrywania inwazji Babesia canis u psów z okolic Warszawy. Agnieszka Sobczyk (1), Grzegorz Kotomski (2), Halina Wędrychowicz (2) (1) Zakład Biologii Ogólnej i Parazytologii Akademii Medycznej, Chałubińskiego 5, 02-004 Warszawa (2) Zakład Parazytologii Wydziału Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa Celem pracy było opracowanie testu diagnostycznego opartego o metodę PCR do wykrywania inwazji Babesia canis, pierwotniaka powodującego babeszjozę, ciężką, nierzadko śmiertelną chorobę psów. Krew pobrano od 62 psów z okolic Warszawy z podejrzeniem o zarażenie Babesia canis. DNA izolowano przy pomocy zestawu Blood DNA Prep Plus. Zaprojektowano startery komplementarne do sekwencji regionu konserwowanego, kodującego podjednostkę 18S rybosomu Babesia canis. W celu zwiększenia specyficzności zastosowano metodę touchdown PCR. Program obejmował następujące etapy: pierwsza denaturacja w temp. 94oC przez 2 min., przyłączanie starterów w 60oC przez 30 s, elongacja w 72oC przez 30 s. W kolejnych 2 cyklach obniżano temp. przyłączania starterów o 2oC; następnie 15 cykli zostało przeprowadzonych z przyłączaniem starterów w temp. 54oC (etapy denaturacji i wydłużania starterów były prowadzone w wyżej opisanych warunkach); w kolejnych 15 cyklach temp. przyłączania starterów wynosiła 52oC. Amplifikowane fragmenty trzech reakcji PCR zostały sklonowane w plazmidzie pBluescriptSK+. Zsekwencjonowane fragmenty miały długość 509 pz i wykazywały duży stopień homologii. Sekwencje umieszczono w Banku Genów pod numerem akcesyjnym (AY 321119). Analizę porównawczą wykonano przy pomocy programu BLAST. Wykazała ona przynależność izolatów do podgatunku Babesia canis canis. Wynik pozytywny uzyskano w 34 przypadkach (częstość zarażenia 54,8%). Czułość metody została określona na 0,00015%. Oznaczono ją poprzez wykonanie PCR z DNA wyizolowanego z kolejnych rozcieńczeń krwi. Wysoka czułość metody PCR w diagnozowaniu Babesia canis jest niezbędna, gdyż w przypadku nosicielstwa liczba zarażonych krwinek jest bardzo niska. Utrudnia to wykrywanie inwazji przy pomocy innych metod, w tym powszechnie stosowanej obserwacji mikroskopowej rozmazów krwi barwionych Giemsą. P276. Identification of trichomonadid protozoa from the oral cavity of humans by PCR-RFLP. Monika Turkowicz Akademia Medyczna, Zakład Biologii Ogólnej i Parazytologii, ul. Chałubińskiego 5, 02-004 Warszawa Objectives. Accurate identification of trichomonads based on conventional techniques is time-consuming and poorly reliable. Routine diagnostic tests usually depend on microscopic observation of motile flagellates in wet-mount preparations. Although rapid and inexpensive, the wet mount is not sensitive. The most reliable method of diagnosis is culture though requires frequent microscopic observation for up to 7 days. None of these methods are sufficient for the species differentiation. In comparison molecular techniques are highly sensitive and specific, therefore PCR-RFLP was performed for identification of oral trichomonads in humans. Materials and methods. 226 humans (144 females and 82 males at the age of 6-76) were examined. Saliva samples were collected. A pair of primers was designed to amplify ITS regions and 5.8S rRNA gene. The PCR products were digested with the restriction enzyme DdeI. Results. 10.2% of humans were positive for oral trichomonads. All PCR products were 368 bp long. The digestion resulted in 4 restriction fragments: 116, 125, 50 and 77 bp that are characteristic for Trichomonas tenax –the most frequent trichomonadid protozoa in the oral cavity of humans. Conclusions. The PCR and RFLP analysis is a rapid, sensitive and reliable method for specific identification of trichomonads isolated from the human oral cavity. The primers, designed to amplify a fragment characteristic for Trichomonadidae family, can be used for the detection of different species occuring in humans and animals. The restriction analysis requires a selection of an appropriate enzyme that would distinguish the trichomonad species. 217 Genetyka mikroorganizmów P277. Analiza mutantów drożdży Saccharomyces cerevisiae opornych na podwyższoną temperaturę. Zbigniew Kotylak, Małgorzata Kus-Liśkiewicz, Anna Żaczek Uniwersytet Rzeszowski, Instytut Biotechnologii, Zakład Genetyki i Mikrobiologii, ul. Rejtana 16C, 35-959 Rzeszów Badania prowadzone są nad szczepami drożdży Saccharomyces cerevisiae izolowanymi z naturalnego środowiska. Wszystkie szczepy sprawdzano pod względem zdolności do wzrostu w temperaturze wyższej niż optymalna (40 stopni), po czym wybrano tylko te, które wykazywały oporność na podwyższoną temperaturę. Dalsza analiza szczepów wykazała, że są one prototrofami i poliploidami. Wyizolowano formy haploidalne poprzez kilkukrotną izolację spor. Po mutagenezie, przeprowadzonej za pomocą promieniowania UV, otrzymano mutanty auksotroficzne, u których sprawdzono, czy nadal utrzymuje się cecha termooporności. Stwierdzono, że wyizolowane mutanty auksotroficzne zachowują cechę termooporności, w związku z tym poddano je analizie genetycznej w celu stwierdzenia charakterystyki determinanty genetycznej. W tym celu krzyżowano je ze szczepem wrażliwym na podwyższoną temperaturę. Analiza tetrad takiej krzyżówki wykazała, że cecha termooporności segreguje 2:2, ale nie jest cechą stabilną –nie utrzymuje się przy dalszym pasażowaniu. Wśród tetrad segregujących mendlowsko, pojawiły się takie, które segregowały w kierunku termowrażliwości. W związku z tym wydaje się, że cecha termooporności jest pod kontrolą wielu genów. W celu sprawdzenia czy cecha termooporności zależna jest od funkcjonalnego oddychania tlenowego, wyizolowano ze szczepów termoopornych mutanty rho– i sprawdzono, czy szczepy nadal zachowują tą cechę. Mutanty rho– otrzymane w wyniku działania bromkiem etydyny nie utraciły termooporności. Wykonano również testy wzrostowe na podłożu z różnymi źródłami węgla przeprowadzane w temperaturze optymalnej i podwyższonej. Sprawdzono też termotolerancję badanych mutantów oraz zawartość trehalozy, która jest uważana jako czynnik znoszący negatywne działanie podwyższonej temperatury. Doniesienia różne: Komunikaty plakatowe: P278. Interakcje genu CCZ1 kodującego białko wymagane w procesie transportu wakuolarnego w komórkach drożdży Saccharomyces cerevisiae. Róża Kucharczyk, Marta Hoffman, Aleksandra Jaszcza, Joanna Rytka Zakład Genetyki IBB PAN, ul. Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa Białko Ccz1 jest niezbędne w procesie fuzji pęcherzyków transportowych z wakuolą. Delecja genu CCZ1 powoduje fragmentację wakuoli, zaburzenia w homeostazie wapniowej, niezdolność do sporulacji homozygoty ccz1delta/ccz1delta. Poszukiwano supresorów znoszących nadwrażliwość mutantów ccz1delta na podwyższoną zawartość jonów Ca2+ w podłożu, przywracających sporulację homozygoty, mutacji nieżywotnych w połączeniu z ccz1delta oraz białek współdziałających z Ccz1p w systemie dwuhybrydowym. Wykazano genetyczne interakcje CCZ1 z genami PMC1 i PMR1, kodującymi Ca2+ATP-azy, GTP-azami rodziny ras: YPT7, RHO2, YPT1, ARL1, oraz genami YKT6 i VPS39 kodującymi białka zaangażowane w proces fuzji pęcherzyków z wakuolą. 218 Genetyka mikroorganizmów P279. Aminoestry jako inhibitory H+-ATPazy błony komórkowej drożdży Saccharomyces cerevisiae. Ewa Obłąk (1), Tadeusz M. Lachowicz (1), Jacek Łuczyński (2), Stanisław Witek (2) (1) Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wrocławski, ul. Przybyszewskiego 65/73, 51-148 Wrocław (2) Instytut Technologii Organicznej i Tworzyw Sztucznych, Politechnika Wrocławska, 51-148 Wrocław Badaniami objęto grupę estrów alkilowych kwasów a-dimetyloamino tłuszczowych (MEM-n, n-MEM-8s) oraz N,N-dimetyloalaninian dodecylowy (DMAL-12s) w postaci szczawianów. Testowane związki różniły się długością hydrofobowego podstawnika alkilowego oraz jego pozycją w cząsteczce estru. Porównywano aktywność biologiczną w stosunku do komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae w zależności od struktury chemicznej związku. Najbardziej aktywnymi okazały się związki z podstawnikiem decylowym (MEM-10s) i dodecylowym (DMAL-12s). Związki te hamują aktywność H+-ATPazy błony komórkowej drożdży, nie działają zaś na ATPazę mitochondrialną, hamują także pobieranie aminokwasów przez komórki drożdży. Aktywność biologiczna aminoestrów zależy również od pH środowiska (pH 8 bardziej uwrażliwia drożdże na te aminoestry niż pH 6) i od kompetencji oddechowych (formy rhoo są bardziej wrażliwe niż rho+). 219 Notatki 220 Notatki 221 Notatki 222 Notatki 223 Notatki 224 Notatki 225 Notatki 226 Notatki 227 Notatki 228 Notatki 229 Notatki 230 Suplement Integrating DORNRÖSCHEN into Arabidopsis shoot meristem function Wolfgang Werr Departament of Developmental Biology, University of Cologne, Germany The dominant DORNRÖSCHEN(drn-1d) mutant was identified in an activation tagging approach and is due to the ectopic expression of an AP2/ERF-type transcription factor. Overexpression of DRN causes a complete reorganisation of the shoot apical meristem (SAM), which ultimately leads to meristem arrest. Genetically, manifestation of the dominant drn-1d phenotype is independent of the SHOOT MERISTEMLESS (STM), WUSCHEL (WUS) or CLAVATA (CLV) pathways. In wildtype the DRN expression domain is confined to the L1 layer at the apical tip of the SAM, and detected in primordia anlagen. However, in the mutant drn-1d SAM DRN,WUS and CLV3 are coexpressed in a large central domain of the enlarged meristem, whereas STM is mutually excluded from this central domain. Different experimental approaches to integrate DRN into SAM function will be discussed, which include the loss of function phenotype, protein interaction partners and a potential connection to auxin signalling. Geny cech ilościowych (QTLs) u zwierząt gospodarskich Jolanta Kurył Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN, Jastrzębiec Wartość cechy ilościowej jest wynikiem oddziaływania wielu genów (QTLs - quantitative trait loci) oraz wpływu środowiska. Aktualnie istnieją dwie strategie identyfikacji QTLs. Pierwsza, to mapowanie genów potencjalnie kształtujących daną cechę, z wykorzystaniem odpowiednio skonstruowanych, kilkupokoleniowych rodzin referencyjnych lub populacji zwierząt. Druga, to selekcja genów kandydujących (candidate genes) , które z racji ich udziału w przebiegu odpowiednich szlaków metabolicznych lub procesów fizjologicznych związanych z daną cechą, są uznane za potencjalnie ją kształtujące. Obydwie strategie oparte są na statystycznej ocenie istotności zależności (sprzężenia) między wartością cechy ilościowej a określonym wariantem analizowanego genu. W odniesieniu do zwierząt gospodarskich, badania koncentrują się głównie na poszukiwaniu genów kształtujących tempo wzrostu, rozwój tkanki mięśniowej, odkładanie tkanki tłuszczowej w tuszy, wydajność w produkcji mleka i jego skład, efektywność reprodukcji, zdrowotność. Programy mapowania genomu zwierząt gospodarskich i poszukiwania QTLs uruchomiono z początkiem lat 90-tych. Umożliwiły one konstrukcję map genomu świni, bydła, owcy, konia, kury oraz pozwoliły zlokalizować rejony genomów potencjalnie zawierające QTLs kształtujące szereg cech ilościowych. Analiza porównawcza tych map z mapą genomu człowieka czy myszy umożliwiła identyfikację szeregu genów warunkujących cechy istotne dla zdrowia zwierząt i ich produkcyjności. Między innymi zidentyfikowano mutacje genowe warunkujące: hipertrofię mięśni u bydła (gen miostatyny), podwyższony poziom glikogenu w mięśniach szkieletowych świń (gen podjednostki gamma kinazy białkowej AMP-zależnej), oporność prosiąt na biegunki wywołane infekcją Escherichia coli [gen α (1,2)fukozyltransferazy] oraz kształtujące zawartość białka i tłuszczu w mleku (gen acyl-CoA:diacylglicerol acyltransferazy 1), czy fizyko-chemiczne parametry jakości mięsa wieprzowego (gen receptora ryanodiny, gen kalpastatyny). Badania te umożliwiają nie tylkpoznanie genetycznych uwarunkowań wielu cech istotnych dla hodowli zwierząt, ale mogą również służyć jako modelowe dla rozpoznania uwarunkowań niektórych schorzeń metabolicznych człowieka. Suplement Diagnostyka genetyczna Toxoplasma gondii. Adam Master (1), Karolina Świtaj (2), Magdalena Skrzypczak (1),, Piotr Zaborowski (2), Andrzej Płucienniczak (1) (1) Instytut Badań DNA, (2) Klinika Chorób Odzwierzęcych i Tropikalnych Instytutu Chorób Zakaźnych i Pasożytniczych Akademii Medycznej w Warszawie Toksoplazmoza jest chorobą wywoływaną przez pierwotniaka Toxoplasma gondii, bezwzględnego pasożyta wewnątrzkomórkowego powszechnie zarażającego wiele ssaków w tym ludzi. W Polsce zarażeni stanowią ponad 59% populacji, a każdego roku odnotowuje się 200-400 przypadków toksoplazmozy wrodzonej. Ustalenie właściwego rozpoznania choroby utrudnia jej skąpo- lub bezobjawowy przebieg i wymaga wykonania wielu badań diagnostycznych, które mają znaczące ograniczenia. Jak dotąd nie ma wystandaryzowanej procedury szybkiego i pewnego wykrywania zarażeń Toxoplasma gondii. Autorzy niniejszego doniesienia prezentują metodę genetycznej diagnostyki zarażeń poprzez wykrywanie i analizę DNA pasożyta izolowanego bezpośrednio z krwi pacjenta. W badaniach zastosowano techniką PCR w połączeniu z elektroforezą kapilarną i laserową detekcją fluorescencji. Identyfikacja pasożyta oparta jest na wykrywaniu sekwencji wielokopijnych genów B1 (35 kopii/genom) oraz 529 bp (200-300 kopii/genom), wysoce specyficznych dla Toxoplasma gondii. Szczegółowa charakterystyka pasożyta bazuje na analizie genetycznej fragmentów genu GRA6, HSP70 oraz wybranych sekwencji STR, wykazujących polimorfizm determinujący przynależność do określonego szczepu. Metodę przetestowano na próbkach kontrolnych: zawiesiny płynu otrzewnowego pobranego od myszy zarażonych szczepem RH Toxoplasma gondii (kontrola pozytywna) oraz wymazu z jamy ustnej niemowlęcia, u którego matki nie stwierdzono obecności przeciwciał przeciwko pasożytowi (kontrola negatywna). W kontroli pozytywnej wykryto produkty specyficzne dla sekwencji B1 oraz 529 bp o oczekiwanej długości, natomiast analiza produktów PCR ze starterami specyficznymi dla GRA6 i HSP70 wykazała obecność fragmentów o długości charakterystycznej dla szczepu RH. W próbce kontroli negatywnej nie wykryto żadnych produktów PCR. Wstępne badania próbek pełnej krwi obwodowej pacjentów, u których toksoplazmozę podejrzewano lub stwierdzono w oparciu o testy immunologiczne wykazały obecność DNA pasożyta. Uzyskane wyniki świadczą o przydatności metody do wczesnej, szybkiej, swoistej, czułej i jednoznacznej diagnostyki zarażeń wywoływanych przez Toxoplasma gondii i jej potencjalnym szerokim zastosowaniu w medycynie i weterynarii nie tylko w zwalczaniu, ale i badaniach przesiewowych. Uszkodzenie genu BCL11B w wyniku INV(14)(q11.2q32.31) prowadzi do ekspresji transkryptu fuzyjnego BCL11B-TCRD i jest związane z brakiem prawidłowego transkryptu genu BCL11B. Grzegorz K. Przybylski (1, 2), Willem A. Dik (3), Jens Wanzeck (2), Piotr Grabarczyk (2), Stine Majunke (2), Jose I. Martin-Subero (4), Reiner Siebert (4), Gottfried Dölken (2), Wolf-Dieter Ludwig (5), Brenda Verhaaf ‡, Jacques J. M van Dongen (3), Christian A. Schmidt (2) and Anton W. Langerak (3) (1) Instytut Genetyki Człowieka, PAN, Poznan (2) Klinik für Innere Medizin C, Universität Greifswald, Greifswald, Niemcy (3) Department of Immunology, Erasmus MC, University Medical Center, Rotterdam, Holandia (4) Institute of Human Genetics, University Hospital Schleswig-Holstein, Campus Kiel, Niemcy (5) Robert-Rössle-Clinic, HELIOS Clinic Berlin-Buch, Charité, Niemcy Ostra białaczka limfatyczna z limfocytów T (T-ALL) jest związana z występowaniem aberracji chromosomalnych charakteryzujących się przyłączeniem proto-onkogenów do genów receptora limfocytów T (TCR), prowadzących do zaburzenia transkrypcji zaangażowanych proto-onkogenów. W tej pracy przedstawiamy molekularną charakteryzację nowej aberracji chromosomalnej, inv(14)(q11.2q32.31), w T-ALL, z udziałem opisanego ostatnio genu BCL11B i genu TCRD. W wyniku inwersji doszło do połączenia części 5’ BCL11B, zawierającej egzony 1-3, z segmentem TRDD3, oraz segmentu TRDV1 z czwartym egzonem BCL11B. Region połączenia segmentów TRDV1-BCL11B, o długości 1344 pz, zawierał fragmenty z chromosomów 20q11.22, 3p21.33 i 11p12, wskazując na złożony charakter aberracji. Zaobserwowano silną ekspresję, zgodnego z ramką odczytu transkryptu fuzyjnego części 5’ genu BCL11B i stałego regionu genu TCRD (TRDC). W odróżnieniu od prawidłowych limfocytów T i innych przypadków T-ALL, w opisywanej próbce nie wykryto ekspresji dzikiego genu BCL11B. Ponieważ gen BCL11B wydaje się odgrywać ważną rolę w różnicowaniu komórek T, uszkodzenie BCL11B i jego zaburzona ekspresja mogą mieć udział w rozwoju nowotworów z komórek T u ludzi. 232 Suplement Ekspresja genu Dhn24 kodującego białko dehydrynowe 24 kDa u Solanum sogarandinum jest specyficznie indukowana pod wpływem chłodu Tadeusz Rorat, Bartosz Szabała, Zhimin Yin Instytut Genetyki Roślin PAN, Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań Z dzikiego nieuprawnego gatunku Solanum (S. sogarandinum), odpornego na mróz wyizolowaliśmy trzy geny, Dhn10, Dhn15 i Dhn24 kodujące różne białka dehydrynowe. Poziom ich ekspresji wzrastał w odpowiedzi na chłód zarówno na poziomie transkryptów jak i kodowanych białek. W warunkach niestresowych poziom ekspresji genu Dhn10, kodującego dehydrynę DHN10 był zależny od organu rośliny. U dwu-tygodniowych pędów najwyższy poziom białka obserwowano w części apikalnej pędu i w łodydze, a najniższy w liściach. U roślin poddanych działaniu chłodu wzrost poziomu DHN10 obserwowano tylko w dojrzałych, nie obserwowano natomiast wzrostu poziomu białka DHN10 pod wpływem stresu w części apikalnej pędu, w liściach starszych oraz w korzeniach. Zwiększenie poziomu białka DHN10 w dojrzałych liściach następowało także pod wpływem suszy (Rorat 2004). Drugi gen, Dhn24, kodujący białko dehydrynowe DHN24 ulegał ekspresji w warunkach niestresowych we wszystkich organach pędów ziemniaka; przy czym najwyższy poziom białka obserwowano w części apikalnej pędów, korzeniach i łodydze. Analiza aktywności transkrypcyjnej promotora genu Dhn24 z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazała, że jego ekspresja zachodzi w sitach wiązek przewodzących organów ziemniaka. Pod wpływem chłodu następuje zwiększenie poziomu ekspresji genu Dhn24 we wszystkich organach pędów, ale najwyższy wzrost poziomu białka DHN24 obserwuje się w łodygach i części apikalnej pędów. Pod wpływem suszy, za wyjątkiem części apikalnej pędów następuje obniżenie poziomu ekspresji genu Dhn24 we wszystkich organach. Ponadto, ekspresja genu Dhn24 nie ulega zmianom pod wpływem stresów osmotycznych (Rorat 2004, dane niepublikowane). W przeciwieństwie do genów Dhn10 i Dhn24, zwiększona ekspresja genu Dhn15 następowała tylko pod wpływem ABA i stresów osmotycznych. Wyniki te wyraźnie wskazują, że w warunkach stresowych zwiększona ekspresja genu Dhn24 ma miejsce tylko w odpowiedzi na chłód. W związku z tym, gen Dhn24 może być zaangażowany w procesy prowadzące do zwiększenia tolerancji ziemniaka na niskie temperatury. Badanie przyczyn różnej ekspresji wrodzonej łamliwości kości typu I w rodzinie Anna Galicka, Andrzej Gindzieński Zakład Chemii Medycznej, Akademia Medyczna, Białystok Wrodzona łamliwość kości (osteogenesis imperfecta, OI) jest autosomalną dominującą chorobą tkanki łącznej. Na podstawie klinicznych, genetycznych i radiograficznych cech wyodrębniono 7 typów choroby (I-VII). W większości przypadków choroba spowodowana jest mutacją w genach kodujących kolagen typu I. Mutacje mogą prowadzić do zmniejszonej ilości syntezowanego kolagenu i/lub syntezy kolagenu o nieprawidłowej strukturze, co w efekcie dramatycznie zaburza strukturę kostną. Charakterystyczną cechą OI jest różnorodna ekspresja choroby u osób z tym samym defektem genetycznym. Celem naszych badań były próby znalezienia czynników, które mogłyby być przynajmniej częściowo odpowiedzialne za przyczynę tego zjawiska u 10-letniej dziewczynki i jej 45-letniego ojca z najłagodniejszym typem I choroby. U ojca wystąpiły 2 złamania kompresyjne kręgów lędźwiowych i prowadzi on aktywny tryb życia, natomiast dziewczynka była wielokrotnie hospitalizowana z powodu złamań kości udowych. Fibroblasty skórne w hodowli komórkowej syntetyzowały prawidłowy kolagen w zredukowanej ilości, z tym że ilość kolagenu w fibroblastach dziewczynki była zredukowana o 25% więcej niż w fibroblastach ojca. Wiadomo, iż ważną rolę w regulacji biosyntezy kolagenu odgrywa prolidaza (EC 3.4.13.9) odpowiedzialna za resyntezę kolagenu z produktów degradacji białek, zawierających L-prolinę. W regulacji enzymu, jak również metabolizmu kolagenu biorą udział integryny i receptory wiążące IGF-I (IGFR). W fibroblastach dziewczynki o cięższym przebiegu choroby stwierdzono znacznie większe obniżenie aktywności prolidazy i ekspresji receptorów (ß-1 integryny i IGFR) niż w fibroblastach ojca i fibroblastach kontrolnych. Na podstawie uzyskanych wyników można sądzić, iż oprócz poznanych czynników genetycznych, u chorych z OI mogą wystąpić zaburzenia aktywności i ekspresji czynników biorących udział w regulacji metabolizmu kolagenu, co może przyczynić się do różnego przebiegu choroby u osób z tym samym defektem genetycznym. 233 Suplement Genotyping of candidate SNPs by APEX microarray technology Kamiński S.(1), Ahman A. (2), Ruść A. (1), Wójcik E. (1), Malewski T. (3), Brym P. (1) (1) University of Warmia and Mazury, Olsztyn, Poland (2) AsperBiotech Ltd, Tartu, Estonia (3) Institute of Genetics and Animal Breeding, Jastrzębiec, Poland Many reports suggust that milk protein content is a polygenic trait determined by milk protein genes and other putative loci dispersed in the cattle genome. Identification of those loci is a subject of whole genome scanning by microsatellite genotyping and positional cloning. Alternative appoach is SNP genotyping in candidate genes. Among more than 300 preselected bovine SNPs (database “SNPs for MILKPROT”, http://matman.uwm.edu. pl/~snp), 81 bovine SNPs within 43 loci were selected representing most of known genes directly or potentially associated with milk protein biosynthesis. 77 SNPs were suceessully optimised in 34 singleplex and 13 multiplex PCRs. PCR products were then genotyped in microarray platform based on APEX method (Arrayed Primer Extention). 12 Polish Holstein bulls, 1 Polish Red bull, 1 bison (Bos bonasus), 11 Jersey cows, 25 Polish Holstein were screened to validate 77 SNPs. 30 SNPs were found with no variation, 13 SNP showed two genotypes, and remaing 34 - three genotypes for entire population under study. Finally, 14 most promising SNPs were chosen to genotype 5 sib-families of heterozygous Polish Holstein bulls. Statistical analysis is underway. We expect to found SNPs or the combination of SNPs associated with the milk performance traits. The results may be used in Marker Assisted Selection in dairy cattle. 234 Notatki 235 Notatki 236 Skorowidz nazwisk Skorowidz nazwisk A Adamczak Małgorzata 186 Adamowicz Tatiana 139, 150 Adamowicz-Salach Anna 119 Adamska Elżbieta 183 Adamski Ryszard 216 Adamski Tadeusz 181 180 Adamus Adela 174, 176 Agnieszka Pollak 39 Ahman A. 234 Aigare Diana 117 Al-Amawi T. 103 Alina Warenik-Szymankiewicz Alina 84 Ałaszewski Wojciech 55, 75 Antosik Paweł 150 Apolinarska Barbara 182 Arabski Michał 89 Augiewicz Jolanta 183 Augustynowicz-Kopeć E. 213 Augustynowicz-Kopeć Ewa 213, 216 Auguściak Aleksandra 94 B Ba Grażyna 161 Babicz Mariusz 51, 118 Babula Danuta 172 Badura Magdalena 25, 41, 60 Bal J. 32, 52 Bal Jerzy 16, 22,23, 23, 65, 99 Balcerska A. 47 Balcerzak A. 116 Balcerzyk Anna 80, 86 Balwierz W. 47 Banaszak Joanna 205, 206 Banaszkiewicz A. 103 Banecka-Majkutewicz Zyta 56 Banecki Bogdan 56 Banek-Tabor Aneta 170, 171 Barcikowska Maria 19, 20 Barciszewska Anna-Maria 24 Barciszewska Mirosława Z. 24 Barciszewski Jan 24 Barczyk A. 36 Bartkowiak-Broda Iwona 183 Bartnik Ewa 46, 60 Bartoszewski Grzegorz 160 Bartsch Detlef K. 108 Bartusiak K. 35 Barwiński Bogdan 216 Bąbol Katarzyna 39 Bączkiewicz Alina 184, 187 Bączkowski Krystian 207 Bąk Daniel 18, 40 Bednarczyk Marek 143 Bednarek Jarosław 125 Benedycka Aleksandra 135 Berbeć Henryk 114 Bernaczyk Andrzej 104 Bębenek M. 93 Białecka Magdalena 67 Bianchi Michele 195 Bidzińska Bożena 85 Biedziak Barbara 83, 119 Bieganowska K. 79 Biegański Tadeusz 73 Bielecka-Grzela S. 105 Bielecki Piotr 192 Bielicka-Cymermann Jolanta 69 Bien-Willner Gabriel 33 Bierła Joanna 82 Bierwagen M. 96 Bierzyńska-Macyszyn Grażyna 104 Bik-Multanowski Mirosław 87 Binka-Kowalska Aleksandra 96, 109, 120 Bitina Marianna 117 Blin Maria Nikolaus 100 Blin Nikolaus 99 Blitek Aleksander 46 Błasiak Janusz 39, 48, 89, 90 Błaszczak Wioletta 181 Błaszczyk Alina 89 Błaszkowska Joanna 91 Błezowska Maria 216 Bobowicz Maria Anna 182 Bocian Ewa 32, 34, 59 Bocianowski Jan 171, 181 Boczkowska Maja 173 Bodalski J. 47 Boehm-Steuer Barbara 104 Boespflug-Tanguy Odile 29 Bogdanowicz J. 33 Bogdanowicz Joanna 50 Boguś Mieczysława I. 214 Boguta Magdalena 199, 201 Bojarcyuk Jaroslaw 188 Bojarojć-Nosowicz Barbara 131 Bojarski Łukasz 215 Bojczuk Barbara 130 Bolobok Hanna 173 Bongarc Emilia 131 Boniewska Ewa 192 237 Skorowidz nazwisk Borg A. 115 Borg K. 34 Borkowska Edyta 30, 96, 109, 120 Borkowski Krzysztof 114 Borodynko Natasza 209 Borosenko Viktors 117 Borowicz K. 129 Borowski Dariusz 55 Borowski J. 54 Borucka-Mankiewicz M. 3, 15, 38, 47, 79 Boruszewska Kinga 145 Bratkowska Wanda 48, 91 Bresińska Anna 155 Bręborowicz Andrzej 120 Brożek I. 37, 115, 116 Brożek Izabela 76 Brycz-Witkowska Joanna 70 Brym P. 234 Brzosko M. 103 Brzywczy Jerzy 196 Bubała H. 47 Buczkowska Katarzyna 187 Budny Bartłomiej 25 Budny Marta 137 Bujak Henryk 186 Bury Katarzyna 201 Burza Wojciech 164 Burzyńsk Artur 127 Burzyńska Beata 119 Burzyński Artur 128, 140 Busza H. 35 Busza Halina 67 Byrski Tomasz 93, 106, 107 C Całusińska M. 207, 208 Cassiman Jean-Jacques 76 Cavalli Antonella 195 Cebrat Stanisław 189, 205, 206, 207 Cegielska-Taras Teresa 183 Centkowski Piotr 119 Cettler Sylwia 75 Chelly Jamel 16 Chełkowski Jerzy 166 Chełstowska Anna 195 Chen W. 25 Chęć Ewa 193 Chilarska Tatiana 62, 64, 72,73 Chlubek Dariusz 19 Chmara Magdalena 31, 37 Chmielewska Beata 175 Chmielnicka Ewa 131 Chmurzyńska Agata 127, 138 Choim Marcin 123 Chojnacki Jan 89 Chołbiński Piotr 200 Chosia Maria 105, 115 Chrzanowska Krystyna 9, 15, 16, 47, 74 238 Chrzanowska Krystyna H. 47 Chrząstek Maria 163 Chudzińska Ewa 179, 187 Chumakov Sergei 210 Chybicka A. 47 Ciara Elżbieta 8,15, 38, 47, 79 Cichoń Tomasz 147, 149 Cieśla Małgorzata 199 Cieśliński Andrzej 79 Cisowski Jarosław 143 Combik Michał 174 Constantinou Maria 70, 96, 109, 120 Constanzo Giovanna 195 Creveaux Isabelle 29 Cutting Garry 18, 36 Cybulski Cezary 32, 93, 102, 104, 105, 106, 107 Czajka R. 107 Czartoryska Barbara 8 Czemarmazowicz Halina 35, 67 Czerska Kamila 40, 52 Czerski Piotr 81, 83 Czerwiecka M. 74 Czerwionka-Szaflarska M. 41 Czuczwar S. 129 Czudowska D. 93 Czyż Agata 191 Czyżewska J. 33, 50 D Dansonka-Mieszkowska Agnieszka 94, 108 Dawidowska Małgorzata 113 Dawydzik B. 32 Dąbrowski Andrzej 114 Delić Klaudia 147 Demissie Marek 85 Demkow Tomasz 101 Dettlaff-Pokora Agnieszka 97 Dębiec-Rychter Maria 115 Dębniak B. 105 Dębniak J. 116 Dębniak Tadeusz 93, 102, 103, 104, 105, 106, 107 Dębski R. 33 Dębski Robert 111 Diehl S. R. 55 Dik Willem A. 232 Dinkler Katarzyna Dinkler Katarzyna 91, 92 Dmitrzak-Węglarz Monika 81, 83 Dmochowska Marta 209 Dmoszyńska-Graniczka Magdalena 114 Dmowski Rafał 51, 117 Dobosz Tadeusz 85 Dobrowolska Anita 215 Dobrzyńska Małgorzata 146, 149 Dolf G. 138 Dölken Gottfried 232 Dołowy Krzysztof 36 Domagała Alina 121 Skorowidz nazwisk Domagała Wenancjusz 102 Domińska Kamila 92 Dongen Jacques J. M van 232 Dorynek Zbigniew 130, 151 Drac Hanna 17, 22, 28 Drela Nadzieja 211 Drozd Arleta 163 Druszczyńska M. 45 Druszczyńska Magdalena 44 Drzewoski Józef 39, 48, 89 Dubrawska Martyna 94 Dudarewicz Lech 44, 54 Dudek Mirosław R. 189, 205, 206, 207 Dudkiewicz Małgorzata 205, 206 Dulak Józef 11, 143 Duszenko Ewa 43, 74, 75, 111, 114 Dworniak Daniela 48 Dyrek Isabelle Alice 66 Dziadek Jarosław 192, 210 Dziedziejko Violetta 19 Dziedzina Sylwia 80 Dziuba Agnieszka 146 E Emerich J. 115 Empel Joanna 17 F Fagiewicz Katarzyna 179 Feder Anna 153 Ferenc Tomasz 48, 91 Fidziańska Elżbieta 25 Figarski Adam 109 Filipecki Marcin 176 Filipek Sławomir 20 Filipowicz Monika 140 Filipowska Anita 30 Firasiewicz Sylwia 215 Fiszer Dorota 121 Fiszer-Maliszewska Ł. 93 Flicinski J. 103 Flisikowski Krzysztof 135, 139, 148 Florczak Jolanta 24 Fofanov Yuriy 205, 210 Fornal Józef 181 Frąckowiak Hieronim 150 Frontali Laura 195 G Gabriel Marcin 84 Gacia Magda 19 Gadomski A. 47 Gajdulewicz M. 9, 15, 47, 74 Gajewska E. 41 Gajewska M. 123 Gajewska Marta 152 Galek Renata 183, 185, 186 Galicka Anna 233 Gardovskis Andris 117 Gardovskis Janis 116 Garwoliński J. 33 Gawłowicz J. 129 Gaworczyk Anna 47, 51, 118 Gawrońska Iwona 24 Gawrońska-Szklarz Barbara 88 Gąsior Artur 212 Geremek Maciej 54, 55 Gielicz Anna 80 Gieruszczak-Bialek Dorota 61, 62, 69, 70 Gil Justyna 66 Gindzieński Andrzej 233 Giżewska Maria 63 Glazar Renata 25, 32, 61 Glaze Daniel 31 Gliniewicz B. Gliniewicz B. 106, 107 Gloser C. 47 Gładkowska-Dura M. 47 Gładysz Karol 168 Głażewska K. 113 Głowacka J. 207, 208 Głowacka Katarzyna 180 Głuszek Jerzy 87 Głuszkiewicz E. 59 Gmur A. 138 Godlewska Renata 211 Golan Maciej 20 Golec Piotr 192 Golusiński Paweł 112 Goluszko P. 205 Gołas Aniela 152 Gołąbek Bożena 60 Gołka Dariusz 94 Gontarz Aldona 156 Gorski B. 107 Gorski Bohdan 117 Goryluk-Kozakiewicz Bożenna 71, 74 Gos Monika 101, 102 Górecka Aleksandra 153 Górniak Magdalena 89 Górnicka-Michalska Ewa 136 Górska D. 213 Górski Bohdan 93, 104, 105, 106, 107 Góżdź S. 93 Grabarczyk Piotr 232 Grabek-Gawłowicz Małgorzata 129 Grabowska Dorota 195 Grabowska Ewa 102, 104 Gremida M. 51 Grochowalska R. 192 Gromadka Robert 197 Gronwald Jacek 93, 104, 107 Grudniak Anna M. 204 Grygalewicz Beata 95 Grygielska Beata 121 Grynberg Marcin 197 Grynkiewicz Grzegorz 30 239 Skorowidz nazwisk Grządka Małgorzata 216 Grzebelus Dariusz 174 Grzesik Helena 178 Grzmil Paweł 146, 152 Grzybowska E. 93 Grzybowski Grzegorz 130 Grzybowski Tomasz 125, 136 Gutkowska Anna 62, 67, 71, 74 Gwizdek-Wiśniewska Anna 191 H Hahn Stephan A. 108 Hansmann I. 47 Hart-Van Tassell Audrey 205, 210 Haus Olga 42, 43, 68, 75, 93, 111, 112, 114 Hauser Joanna Hauser Joanna 81, 83 Hausmanowa-Petrusewicz Irena 17, 21, 22 Havey M. J. 160 Hawuła Wanda 55, 62, 64, 72, 75 Hejduk A.196 Helias-Rodzewicz Z. 59 Helszer Zofia 27, 30, 36 Hertmanowska Hanna 27 Heubner Angela 46 Hilczer Maciej 64 Hinc Krzysztof 203 Hiszczyńska-Sawicka Elżbieta 212 Hnatuszko Katarzyna 63, 168, 169 Hoeltzenbein M. 16, 25 Hoffman Marta 218 Hoffman-Zacharska Dorota 17, 19 Hofman Karolina 162, 167 Holec Lucyna 212 Holweg Marta 118 Hoon K. 32 Horbańczuk Jarosław O. 145 Horz M. 31 Hubert E. 68 Huguet Thierry 174 Humphreys Mike W. 172 Huzarski Tomasz 93, 106, 107 I Iliszko M. 63 Iliszko Mariola 115 Ilnicka A. 33, 50 Inoue Ken 41 Irmejs Arvids 117 Iwanicki Adam 203, 204 Iwańczak Franciszek 46 Iwona Płowaś 30 J Jabłońska-Skwiecińska Ewa 119 Jaciubek Miłosława 160, 171 Jaczyńska Renata 65 Jagodziński Paweł P. 120 Jagusztyn-Krynicka Elżbieta K. 211 Jakóbczyk Małgorzata 101 240 Jakóbkiewicz-Banecka Joanna 30, 56 Jakubiuk-Tomaszuk Anna 68 Jakubowicz M. 172 Jakubowska Anna 93, 102, 103, 104, 106, 107 Jakubowski Lucjusz 44, 55, 63, 64, 72, 73, 75 Jalal Syed M. 33 James A. 32 Jamrich M. 26 Jamroz Ewa 29 Janaszak Anna 193 Janczarek Monika 194 Janiak Agnieszka 175 Janiak Katarzyna 55 Janiec-Jankowska A. 94 Janik P. 102 Janik Przemysław 101 Janiszewska Hanna 93, 112 Jankowska Agnieszka 164, 201 Januchowski Radosław 120 Janus Krzysztofa 213, 216 Januszkiewicz-Lewandowska Danuta 27, 53, 95, 110 Jaowiec I. 32 Jarmołowski Artur 159, 179 Jarocki P. 96 Jaruzelska Jadwiga 82 Jasiecki Jacek 193 Jaszcza Aleksandra 218 Jaszczak Kazimierz 125, 153, 214 Jaśkowska Marta 201 Jaśkowski Jędrzej M. 150 Jauch Anna 104 Jawien A. 103 Jaworski Adam 189, 213 Jaworski Albert 213, 216 Jazowiecka Joanna 128 Jelska Anna 42, 75 Jezela-Stanek Aleksandra 9, 59 Jezierski Tadeusz 153 Jeziorowska Anna 64 Jeżowski Stanisław 180, 181 Jędrzejczak Piotr 82, 120 Jędrzejowska Maria 22 Jończyk Magdalena 209 Jółkowska J. 113 Józkowicz Alicja 143 Julkowska Daria 203 Juraszek Anetta 75 Jurkiewicz D. 15, 38, 79 Jurkiewicz Dorota 47 Jurkowska Monika 99 Juszczuk-Kubiak E. 129 K Kabzińska Dagmara 17, 20, 21, 22, 28 Kaczanowski Radosław 108 Kaczmarczyk Ewa 131 Kaczmarek Anna 169 Kaczmarek M. 172 Skorowidz nazwisk Kaczmarek Z. 181 Kaczor Marcin 40 Kadziński Leszek 56 Kajor Maciej 28, 94 Kalinowska Urszula 91, 92 Kalińska Honorata 185 Kalita Michał 209 Kalscheuer V. M. 16, 25 Kałużewski Bogdan 27, 30, 36, 70, 96, 109, 120 Kamerys Juliusz 48 Kamińska Anna 69 Kamiński S. 234 Kanka Celina 190 Kapellerova A. 5 Kapelski Paweł 81 Kapusta Józef 162 Karcz Jagna 175 Karczmarewicz Elżbieta 28 Karhukorpi J. 44, 45 Karkusiewicz Iwona 197 Karttunen R. 44, 45 Kasprzak H. 96 Kasprzak Maria 89 Kasznicki Jacek 39, 48 Kaszuba Aleksandra 215 Kawalec W. 74 Kawka Magdalena 145 Kawulak Marta 21 Kayademir Tuncay 100 Kazanowska B. 47 Kaźmierczak Paweł 89 Kądziołka Bartosz 23 Kempisty Bartosz 84, 137 Kennerson Marina 21 Kędzierska Anna 214 Khoshnevisan M. 55 Kielkowska Agnieszka 176 Kiełbasiewicz-Binikowska Jolanta 62 Kiełbowicz-Matuk Agnieszka 162, 167 Kijewska Agnieszka 128 Kijewski Tomasz 141 Kilar E. 93 Klapecki Jakub 65 Klatt M. 213 Klein Maria 168 Klimek Beata 6 Klimiuk M. 113 Klimuszko Danuta 201 Kloska Anna 56 Klukowska A. 44 Klukowska J. 138 Klupińska Grażyna 89 Kładny Józef 102, 103, 105 Kłoczko J. 113 Kmieć Marek 124, 132, 133, 134, 135, 140 Kobiela Jarosław 109 Kobryś Małgorzata 19 Kobus Kazimierz 35, 119 Koc J. 93 Kochański Andrzej 17, 20, 21, 22, 28 Kolasa Iwona 94 Kolasińska Irena 184 Kołodziej Łukasz 72 Kołodziejczyk Dorota 154, 156 Kołowska Jolanta 16, 61 Komarnicki M. 116 Komisarek Jolanta 130, 151 Konarska Zofia 70 Kononowicz Andrzej K. 168, 169 Konopa Grażyna 193 Konopka B. 94 Kontek Renata 91, 92 Kopen Gene C. 94 Kopiński P. 96 Kopyta Ilona 29 Korcz Aleksandra 84 Korczak Małgorzata 125 Kordek Radzisaw 104 Korniszewski Lech 39, 49, 51, 61, 62, 68, 69, 70 Korzon M. 47 Kosmala Arkadiusz 172 Kostrzak Anna 162 Kostyk Ewa 32, 59 Kostyrko Andrzej 26 Kościelak Jerzy 44, 97, 119 Kotecki Maciej 82 Kotlarz Agnieszka 82 Kotomski Grzegorz 217 Kotylak Zbigniew 216, 218 Kowalczuk Maria 205, 206, 207 Kowalczyk J. 47 Kowalczyk Jerzy R. 51, 93, 118 Kowalczyk Krzysztof 198 Kowalczyk Magdalena Ewa 161, 166 Kowalewska Inga 132, 133, 134, 135 Kowalska Anna 18, 24 Kowalska E. 93, 107 Kowalska Elżbieta 102 Kowalska Magdalena 214 Kowalski Andrzej 136 Kowalski P. 15, 38, 47, 79 Kozacki Leon 179 Kozakiewicz-Goryluk B. 9 Kozak-Klonowska B. 68 Kozarzewski Marek 75 Kozera Adrianna 137 Koziarski A. 103 Kozlowski M. 103 Kozłowska Anna 120 Kozłowska J. 35 Kozłowska Magdalena 55 Kozłowska Magdalena 75 Kozłowski Wojciech 104 Kozubski Wojciech 18, 24 241 Skorowidz nazwisk Krajewska-Walasek Małgorzata 8, 15, 38, 47, 59, 62, 67, 71, 74, 79 Krajewski Paweł 171, 180 Krauze Jolanta 80, 86 Krauze Jolanta 86 Krawczuk-Rybak M. 47 Krawczyński Maciej 25, 41 Krawczyński Maciej R. 37 Krawiecka Dorota 216 Kroll Renata 116 Krótka Krystyna 183 Kruczek A. 32, 34 Krull Kevin 31 Krysa Wioletta 19 Krystkowiak K. 181 Krzakowa Maria 179 Krzewski Konrad 82 Krzymińska Anna 64 Krzyśko Krystiana 20 Kubalska J. 31, 33, 37 Kuber Krzysztof 131 Kucharczyk Krzysztof 108 Kucharczyk Róża 218 Kucinskas V. 68 Kuczyńska A. 181 Kuczyńska-Wiśnik Dorota 194, 198 Kuć Dominik 165 Kujawa Alicja 64 Kulczycki Jerzy 20 Kulecka Alicja 13 Kulig Hanna 132, 133, 135 Kulma Magdalena 194 Kupryjańczyk Jolanta 94, 108 Kur Józef 201, 212 Kurlandzka Anna 191 Kurpisz Maciej 121 Kurylak Danuta 74 Kurył Jolanta 124, 148, 231 Kurzawski Grzegorz 102, 103, 105, 106, 107, 117 Kus-Liśkiewicz Małgorzata 218 Kusz Kamila 82 Kutkowska-Kaźmierczak Anna 34, 59, 65 Kutner Jan 199 Kuźmicz M. 47 Kuźnicki Jacek 20 Kwapisz Marta 200 Kwaśniewski Mirosław 175 Kwiatkowska Joanna 194 L Lach Joanna 30 Lachowicz Tadeusz M. 192, 219 Lampkowska Joanna 211 Lange Agata 71, 73 Langer S. 49 Langerak Anton W. 232 Laskowska Ewa 194, 198 Lassota Maria 32, 42 242 Latos-Bieleńska Anna 16, 25, 32, 41, 42, 60, 68, 82 Lauda-Świeciak Anna 43, 74 Lawniczak M. 107 Lebiecka Karolina 170 Lechniak Dorota 139, 144, 145, 150 Lejman Monika 51, 118 Lembicz Marlena 179 Lemka Małgorzata 63 Lenner Marcin 104 Lenzner S. 25 Lepczyński Adam 132 Lescher J. 32 Lesiak Marta 94 Leszczyńska-Rodziewicz Anna 81 Leśniewicz R. 49 Leśniewska-Bocianowska Agnieszka 172 Lewandowska Irmina 202 Lewandowska Małgorzata 200 Lewandowski Krzysztof 27, 95 Liczbańska Alina 167 Lierch Alina 183 Limon Janusz 31, 37, 41, 42, 76, 115, 116 Lipczyńska-Ojkowska Wanda 20 Lipińska Barbara 82, 109 Lipiński Daniel 144 Lipiński T. 33 Lipska Elżbieta 69 Lisiecka Krystyna 72 Lisik Małgorzata 45 Lisowski M. 156 Liwem Izabela 27 Lockhart Lillian H. 33 Lubiński Jan 93, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 Lubiński Wojciech 63 Lubka M. 42 Lukamowicz Jolanta 44 Lumme Jaakko 126 Lupski James R. 14, 21, 26, 28, 31, 33, 34, 41 Luszawska-Kutrzeba T. 47 Ł Łaciński Mariusz 84 Łaczmańska Izabela 35, 66, 67 Ładyżyński Maciej 164 Łaniewski-Wołłk Mikołaj 65, 103 Łapiński Mirosław 171 Łopaczyńska Dobrosława 48, 91 Łosowska-Kaniewska Danuta 73 Łoś Marcin 203 Łuchniak Piotr 168 Łuczak Michał 172 Łuczyński Jacek 219 Łuczyszyn Anna 152 Łuczywek Elżbieta 20 Łusakowska A. 28 M Machnicka B. 192 Maciak Lidia 216 Skorowidz nazwisk Maciąg Monika 119, 204 Maciejka-Kapuścińska L. 47 Mackiewicz A. 93 Mackiewicz Dorota 205, 206 Mackiewicz Paweł 189, 205, 206, 207 Maćkowski Mariusz 142 Madej Małgorzata 168 Madeja Zofia 139 Maj Piotr 110 Majczak Wiktor 193 Majewska Marta 131 Majsterek Ireneusz 39, 48, 90 Majunke Stine 232 Makowska Izabela 111 Makowska Izabela 114 Makowski P. 95 Malepszy Stefan 160, 164, 176 Maleszka R. 105 Malewski T. 234 Malinowska Iwona 99 Małdyk J. 47 Małek Wanda 209 Małolepszy Joanna 131 Małunowicz E. M. 8 Małuszyński Mirosław 175 Maniukiewicz Patrycja 185 Mańkowska Barbara 63 Marczak A. 71 Marczak Łukasz 170 Marek-Kozaczuk Monika 197 Mariańska B. 97 Markowska-Wojciechowska Alicja 104 Marszał Elżbieta 28, 29, 66 Marszałek Bożena 35 Martin-Subero Jose I. 232 Maruszak Aleksandra 19 Maryniak Renata 98 Marzec B. 129 Masny Aleksander 163 Masojć B. 93, 106, 107 Masojć Piotr 163, 165, 170, 171, 173 Mastalerz Lucyna 90 Master Adam Master Adam 50, 232 Matejczyk Marzena 200 Materna-Kiryluk Anna 25, 41, 60 Matławska Ksenia 91, 92 Matras Jan 179 Matulewicz Kamila 144 Matuszewski Marcin 96, 97, 98 Matych Józef 96, 109, 120 Matyja Ewa 104 Matyjasik Joanna 104, 106,107 Matysiak M. 47 Matysiak Michał 99 Mayer Magdalena 16 Mazurczak Tadeusz 16, 22, 23, 32, 34, 59, 60, 65 Mcintyre Alan 95 Mejnartowicz J. P. 41 Mel Katarzyna 84, 137 Menkiszak J. 93, 107 Mędrek K. 93, 105 Miazga Danuta 163 Michalak Arkadiusz 130 Michalak Ewa 144 Michalik Barbara 161, 170, 174, 176 Miciałkiewicz Arkadiusz 196 Midro Alina Teresa 32, 42, 49, 52, 68, 75 Mielcarek-Kuchta Daniela 112 Mierzejewski Marek 93, 102, 106, 107 Mierzewska H. 31 Mikulska Urszula 146, 149 Milczarski Paweł 165, 170, 171, 173 Milewicz Andrzej 85 Milewski Michał 18, 22, 36 Missol-Kolka Ewa 147 Misztal L. 172 Mitrus Iwona 147 Miturski R. 93 Moczulski Marcin 165, 181 Modestowicz Renata 24 Modliński J. A. 143 Modrzyńska K. 54 Moellers Christian 186 Mohler Volker 166 Moll Jadwiga 62 Mordalska Anna 48 Möslein G. 103 Mosor Maria 53, 110 Mostowska Adrianna 83, 119 Mościcki R. 58 Motyczka Łukasz 209 Mucha Barbara 43, 111, 114 Mueller-Malesińska Małgorzata 39, 49 Myrhřj T. 103 Myśków Beata 165, 170 N Nadratowska Beata 193 Naganowska Barbara 169 Nagórska Krzysztofa 203 Nakonieczna Joanna 215 Nalewajek Hanna 64 Napierała Filip 134 Narod S. 93, 107 Narod S. A. 106, 107 Natorff Renata 195, 196 Nawara Magdalena 16 Nawrocka Agnieszka 96, 109, 120 Nawrot Małgorzata 175 Negri Rodolfo 195 Nej Katarzyna 108 Nicholson Garth 21 Niemiec Paweł 80, 86 Niemirowicz-Szczytt Katarzyna 163 243 Skorowidz nazwisk Niepsuj S. 93 Nogowska Anna 144 Norek Aleksandra 40 Northup Jill K. 33 Nowacka Joanna 150 Nowacki Przemysaw 104 Nowak Jerzy 27, 53, 54, 95, 110 Nowak Stanisław 24 Nowak W. 172 Nowakowska B. 34 Nowakowski Adam 17, 20, 21 Nowicka Karina 27, 95 Nowicki Bogdan 205, 210 Nowicki Grzegorz 55, 75 Nowicki Stella Nowicki Stella 205, 210 Nowodworska Arletta 203 Nowopolska Karolina 137 Nowosad Kamila 183 Nowosławska Emilia 73 Nyka Walenty 56 O Obarzanek-Fojt Magdalena 150 Obersztyn Ewa 32, 34, 59, 60, 65 Obłąk Ewa 219 Obuchowski Michał 203, 204 Ochman Karolina 76, 116 Ochocki Justyn 91, 92 Odrzykoski Ireneusz J. 184 Olbryt Magdalena 128 Olczak-Woltman Helena 163 Olejniczak Jan 186 Olejniczak Paweł 179 Olszanowski Ziemowit 179 Ołdak Monika 61, 69, 70 Oracz Grzegorz 40 Oralewska Beata 40 Orczyk Wacław 165 Orlikowska Teresa 209 Osiecka Regina 91, 92 Ostrowska Katarzyna 62, 72 Oszkinis Grzegorz 84 P Paczos-Grzęda Edyta 163 Palmieri G. 115 Palomba G. 115 Pałyga Jan 136 Panasiewicz Grzegorz 131 Panasiuk Barbara 42, 49, 52, 68, 113 Paprocka J. 59 Parada Rafał 145, 153 Pareek Chandra Shekhar 130, 139 Pasińska Magdalena 43 Paszewski A. 196 Paszewski Andrzej 195, 196, 202 Pawelczyk Leszek 82, 120 Pawlaczyk Ewa Maria 182, 184 244 Pawlak Andrzej L. 87 Pawlak Mikołaj 87 Pawlik J. 55 Pawlukowiec Tomasz 121 Pawłowicz Izabela 167 Pawłowska B. 33, 50 Peippo Jaana 151 Pepłońska Beata 20 Perek D. 47 Perkowska Magdalena 115 Pernak Monika 27, 95 Pernak Monika. Pers Emilia 150 Petriczko Elżbieta 72 Petriczko W. 103 Piasecka-Wengi A. 138 Piątek Rafał 201 Piccini Eugenia 195 Piechota Janusz 46 Piekutowska-Abramczuk Dorota 15, 38, 47, 79 Pieńkowska-Grela Barbara 95, 98 Pieńkowska-Schelling Aldona 126 Pietrzak Marek 26 Pietrzyk Jacek J. Pietrzyk Jacek J. 77, 87 Pietrzyk Witold 132, 133 Pignatti Pier Franco 57 Pijacka Wioletta 145 Pilch Jacek 15, 28, 29, 32, 42, 54 Pilch Józef 178 Piłsyk Sebastian 195 Pinkier Iwona 64, 75 Piosik Jacek 191 Piotrowicz Małgorzata 62, 68, 71, 72, 73 Piotrowska Ewa 30 Pisano M. 115 Plewa R. 35 Plisiecka-Hałasa J. 94 Płoski Rafał 39, 49, 51 Płowaś Iwona 27, 36, 70 Płucienniczak Andrzej 50, 162, 163, 232 Płużańska M. 93 Pniewski Tomasz 162, 174 Pobłocka Lucyna 137 Poćwierz-Kotus Anita 140 Podgórska Beata 193 Podhajska Anna 215 Podhajska Anna J. 208, 207 Podolak Krystyna 216 Poirier Karine 16 Polak Natalia Polak Natalia 205, 206 Polański Zbigniew 150 Pollak Agnieszka 49 Połeć Joanna 190 Ponitka Aleksandra 177 Popławska Wiesława 183 Skorowidz nazwisk Popowska Ewa 8, 15, 38, 47, 79 Popowska Magdalena 202 Posmyk M. Posmyk M. 93, 107 Posmyk Renata 68 Pospieszny Henryk 209 Potaczek Daniel 90 Potocki Lorraine 31 Potrzebowska Agnieszka 64, 72 Pożarowska Anna 164 Prątnicka M. 116 Presler Małgorzata 96 Pronicka Ewa 10, 28, 31, 37, 38, 51 Pronicki M. 38 Pruchnik-Wolińska Danuta 24 Prudlak Edmund 104 Prusak Beata 125, 130, 136 Prus-Głowacki Wiesław 179, 184 Przetakiewicz Jarosław 165 Przybecki Zbigniew 161, 166 Przyborowski Jerzy Andrzej 173 Przybylski Grzegorz K. 232 Przybyłowska Karolina 39, 48 Przybysz Arkadiusz 164 Przygocka Jarosława 71 Przywecka Magdalena 126 Pudelska Hanna 177 Pulka Grażyna 80 Purzycka J. 50 Putonti Catherine 210 Pyrkosz A. 59 Pyrkosz Antoni 66 Pytel Dariusz 90 R Rainczuk Arkadiusz 192 Rajewski Andrzej 83 Rakoczy-Trojanowska Monika 164, 173 Ramsey David 100 Ratajczak Bogumiła 26 Ratajczak Elżbieta 203 Ratajska Dorota 46 Ravazzolo Roberto 60 Rebarz Michał 181 Religa Dorota 19 Rembowska Jolanta 27, 95 Rempoła Bożenna 197 Respondek-Liberska Maria 55, 75 Rieder Harald 108 Roa B. B. 32 Rodney J. Scott 102 Rogalski Jerzy 197 Rogowska Beata 161 Rokicka Anna 29 Rokicka-Milewska R. 47 Ropers H. H. 16, 25 Rorat Tadeusz 162, 167, 233 Rosińska Zdzisława 63 Rosochacki Stanisław Józef 129, 200 Rossa Grzegorz 24 Roszkiewicz Andrzej 104 Roszkowska B. 213 Roszkowski T. 33 Rowińska E. 51 Rowińska-Marcińska Katarzyna 17, 21 Rozmiarek A. 93 Rozwadowska Natalia 121 Różycka Agata 26 Rudnicka W. 44, 45 Rumijowska-Galewicz Anna 192 Ruść A. 234 Rutkiewicz E. 54, 55 Rutkowski Andrzej Jacek 139 Rybakowski Filip 83 Rybicka Marta 154 Rybiński Wojciech 181 Rychlik Tadeusz 130, 156 Rychter P. 103 Rydzanicz Małgorzata 112 Rymkiewicz Grzegorz 98, 102 Ryniewicz Barbara 17, 21, 22, 25, 28 Rysińska Jolanta 156 Ryś Janusz 115 Rytka Joanna 191, 195, 197, 218 Rzymowska Jolanta 110 S Sacharczuk Mariusz 145, 153, 214 Sadowska Małgorzata 101 Sadowski J. 172 Safian Anna 87 Safranow Krzysztof 19 Saifi Gulam Mustafa 21, 28 Sakowski T. 129 Sala Katarzyna 161 Salamanczuk Zoriana 101 Salmanowicz Bolesław P. 165, 181 Sałamaszyńska Agnieszka 201 Sanak Marek 40, 80, 90 Sanjuan Rafael 208 Sarecka Beata 80, 86 Sawecka Jadwiga 44, 97 Sawicka A. 52 Sawicka-Sienkiewicz Ewa 183, 185 Sawicki Rafał 114 Sawiniec Jarosław 114 Sawuła Wojciech 56 Sąsiadek Małgorzata 35, 66, 100 Sąsiadek Maria 99 Schelling Claude 126, 138 Schlichtholz Beata 96, 97, 98 Schmidt Christian A. 232 Schoell Brigitte 104 Schwanitz Gesa 42 Scott Rodney 104, 105, 107 Sell Jerzy 135, 137 245 Skorowidz nazwisk Senkus E. 115 Setkowicz Małgorzata 90 Shaw Christine J. 31, 41 Shipley Janet 95 Siebert Reiner 232 Siedlecka Ewa 166 Sielska Danuta 22 Sieńko Marzena 196, 195 Sieroń Aleksander L. 66, 94 Sikora Agnieszka 48 Sikora Aleksandra 190 Sikorski A. 106, 107 Simlat Magdalena 161, 170 Sina-Frey Mercedes 107 Sitarz Mirosława 99 Skarżyński Henryk 39, 49 Skibińska Maria 81 Skolimowski Janusz 89 Skoneczna Adrianna 196 Skoneczny Marek 196 Skonieczka Katarzyna 43, 111, 114 Skorupa Ewa 30 Skorupska Anna 194, 197 Skorupski Włodzimierz 79 Skotnicki Aleksander B. 101 Skórka Agata 39, 49, 61, 62, 69, 70 Skrzypczak Magdalena 50, 232 Skrzypczak U. 54 Skulimowska J. 44, 97 Słomiński Bartosz 192 Słomski Ryszard 84, 144 Słonimski Piotr 195 Słopień Agnieszka 81, 83 Słupna Urszula 209 Smigiel Robert 100 Smolarczyk Kamila 205, 206 Smolarczyk Ryszard 147, 149 Sobczyk Agnieszka 217 Sobczyńska-Tomaszewska Agnieszka 40, 52 Sobek Zbigniew 132 Sobiczewska J. 50 Socha Jerzy 40 Socha Stanisław 154, 156 Sochanik Aleksander 128, 149 Sodkiewicz Teresa 182 Sodkiewicz Wojciech 163, 182 Sokołowska Joanna 79, 84 Sołtysińska Ewa 21 Sońta-Jakimczyk D. 47 Soroka Marianna 104 Sorokin D. 93 Sosnowski Jarosław 145, 150 Soszyńska Krystyna 74, 75, 111, 114 Sośnierz-Chmielińska E. 74 Speicher M. 49 Speina Elżbieta 100 Spik Anna 82 246 Spodar K. 9, 15, 47, 67, 71, 74 Spółczyńska A. 52 Spychalska Justyna 119 Stankiewicz Czesław 180 Stankiewicz Paweł 33, 34, 41 Stańczak Halina 70 Stańczyk J. 104 Starostecka Ewa 71 Starzynska T. 107 Starzyński Rafał Radosław 135, 139 Stawerska Renata 73 Stawicka M. 93 Stawiński Stanisław 185 Stączek Paweł 190, 215 Stefaniak Tomasz 109 Stefańska Agnieszka 96 Stefańska K. 47 Steinborn Barbara 26 Stembalska Agnieszka 35, 66, 99, 100 Stepnowska Magdalena 56 Sternicki Tomasz 153, 155 Stępień Łukasz 166 Stępkowska Hanna 156 Stojałowski Stefan 160, 171 Stolarska M. 47 Stolarski B. 51 Strapagiel Dominik 45, 44 Strauss Ewa 87 Stróżyńska Jolanta 48 Stróżyński Henryk 48, 91 Strzałka Joanna 132 Strzembicka Anna 178 Stukan M. 115 Styczyńska Maria 20 Styczyński Jan 112 Styrna Józefa 146, 152 Sucharski Piotr 65 Suchenek Kamila 34, 59 Suchy Janina 102, 117 Sułek Anna 17, 19 Summersgill Brenda 95 Sun C. 55 Surma M. 181 Surma Maria 180 Swoboda Paweł 102 Syczewska M. 47 Sykut-Cegielska J. 38 Sywula Tadeusz 137 Szabała Bartosz 233 Szafrańska Bożena 131 Szala Stanisław 147, 149 Szała Laurencja 183 Szarejko Iwona 175 Szczałuba Krzysztof 16, 23, 60 Szczech Józef 24 Szczecina R. 33 Szczeklik Andrzej 40, 80, 90 Skorowidz nazwisk Szczeklik Wojciech 80 Szczepankiewicz Aleksandra 81 Szczepański T. 47 Szczerbal I. 138 Szczukowski Stefan 173 Szefel M. 207, 208 Szigeti Kinga 28 Szirkowiec W. 33 Szklarczyk Marek 160 161 Sznurkowska K. 47 Szołna Adam 23 Szpechciński A. 96 Szpecht-Potocka Agnieszka 32, 65, 103 Szreder Tomasz 148 Szwacka Maria 164 Szwaczkowski Tomasz 153, 155, 156 Szwiec M. 93, 107 Szych Zbigniew 102 Szyda Joanna 151 Szydłowski Maciej 127 Szyfter Krzysztof 112 Szylberg Tadeusz 104 Szyma Janusz 104 Szymańczak Robert 135 Szymańska Mirosława 182 Ś Ślęzak Ryszard 35, 67, 85 Śliwiński Tomasz 90 Ślusarkiewicz-Jarzina Aurelia 177 Śmietanka Beata 140 Śmigiel Robert 35, 46 Świątkowska Ewa 44 Świtaj Karolina 50, 232 Świtoński Marek 127, 138, 139, 142, 150 T Taraszewska Anna 104 Taylor Alina 193 Teisseyre Mikołaj 40 Terman Arkadiusz 124, 134, 135 Tołoczko-Grabarek A. 93 Tomankiewicz-Zawadzka A. 33, 50 Tomczyk Hubert 109, 120 Tońska K. 10 Tońska Katarzyna 46, 60 Towpik Joanna 201 Treadwell-Deering Diane 31 Trojan J.96 Trojanowski Tomasz 104 Trusz-Gluza Maria 80, 85, 86 Trzeciak Wiesław H. 26, 35, 64, 79, 83, 84, 119, 137 Trzewik Aleksandra 209 Tudek Barbara 100 Turkowicz Monika 217 Turyn Jacek 98 Twardowska Małgorzata 155 Twardowska Marta 165, 171 Tworkowski Józef 173 Tworowska Urszula 85 Tykarska Teresa 164 Tylki-Szymańska Anna 7, 15, 30 Tyrkiel Ewa 149 Tzschach A. 25 U Ulanowska Katarzyna 191 Ulańska Anna 62, 64, 72, 73 Urbanek Ksymena 94 Urbaniak Krzysztof 150 Urbańsk Paweł 124 Urbański K. 93 Urvil Petri 205, 210 Velagaleti Gopalrao V.N. 33 Verhaaf Brenda 232 W Wachowiak J. 47, 113 Wachowiak Witold 187 Wachowska Laura 155 Wakulińska A. 47 Walczak Mieczysław 41, 63, 72 Waleron K. 207, 208 Waleron M. 207, 208 Walewski J. 102 Waligora Jarosław 39, 49, 61, 62, 69, 70 Walinowicz Katarzyna 161 Waliszewski Krzysztof 84 Walizada Gina 21 Wang S. 55 Wanzeck Jens 232 Wardęcka Barbara 125 Warzych Ewelina 144 Wasilewska Ewa 113 Waśko B. 93 Waśniewska Anna 153 Wegrzyn Grzegorz 190 Wender Mieczysław 18, 24, 27 Wender-Ożegowska E. 53 Wenne Roman 127, 128, 140, 141 Wenzel Gerhard 166 Werr Wolfgang 177, 231 Wesoły Wojciech 184 Wędrychowicz Halina 217 Węgiel Barbara 143 Węgrzyn Alicja 30, 56 Węgrzyn Grzegorz 30, 56, 191, 193, 203 Wieczorek M. 47 Wieczorek-Cichecka Nina 62 Wiejacha Katarzyna 209 Wieloch Wioletta 214 Wierzba Jolanta 63, 76 Wierzba-Bobrowicz Teresa 104 Wierzbicka A. 31, 37 Wierzbicki Heliodor 132, 133, 140 Więckiewicz K. 54 Wiktorek-Smagur Aneta 168, 169 Wiland Ewa 121, 121 247 Skorowidz nazwisk Winnicka Dorota 118 Wirth-Dzięciołowska E. 123 Wirth-Dzięciołowska Elżbieta 99, 152, 154 Wisniewska Marzena. 25 Wiszniewska Joanna 32 Wiszniewski Wojciech 22, 26, 28 Wiśniewska Anita 176 Wiśniewska Barbara 73 Wiśniewska Halina 198 Wiśniewska K. 41 Wiśniewska Marzena 16, 61 Wiśniewska-Jarosińska Maria 89 Wiśniewska-Wojtasik Barbara 128 Wiśniewski Łukasz 164 Witek Stanisław 219 Withers Marjorie 41 Witt Michał 42, 54, 55, 113 Wojaczyńska-Stanek Katarzyna 28, 29 Wojciechowska Barbara 177 Wojcierowski J. 129 Wojda Alina 42 Wojdak-Maksymiec Katarzyna 124, 135 Wojnicka-Półtorak Aleksandra 179 Wojtkiewicz A. 103 Wolc Anna 153, 155, 156 Wolf-Dieter Ludwig 232 Wolko Bogdan 169, 174 Wolnik-Brzozowska 68 Wolska Krystyna I. 204 Woroniecka Renata 98 Woźna Jolanta 177 Woźniak Joanna 203 Woźniak Michał 109 Woźniczko Izabela 145 Woźniewicz Bogdan 104 Wójcicki Piotr 35, 119 Wójcik E. 234 Wójcik Kinga 214 Wraith J. E. 7, 58 Wróbel Borys 192, 208 Wróbel Natalia 147 Wyrobek E. 47 Wysocka Anna 137 Wysocka Monika 191 Wysocki Mariusz 111, 112 Wyszynski D. F. 55 Wyszyńska Agnieszka 211 Wyszyńska-Koko Joanna 148 Y Yin Zhimin 233 Z Zaborowski Piotr 50, 232 Zabost A. 213 Zabost Anna 213 Zadurska M. 64 Zagulski Marek 40 Zając Ewa 96 248 Zając Magdalena 121 Zajączek Stanisław 63, 72, 93 Zakrzewska-Czerwińska Jolanta 189 Zalewska Beata 201 Zalewski Dariusz 188 Zalewski Kazimierz 131 Zapalski Stanisław 84 Zapolska B. 47 Zaremba B. 50 Zaremba C. M. 26 Zaremba Jacek 19, 22, 25, 33 Zaremba L. 93 Zawada M. 95 Zawada Mariola 27, 126 Zawiejska A. 53 Zawilak Anna 189 Zbawicka Małgorzata 127 Zborek Anna 94 Zdebska Ewa 119 Zdzienicka Elżbieta 25, 33 Zekanowski Cezary 19 Zhang Meizhuo 210 Zhang Y. J. 55 Zieba Grzegorz 125 Zielińska Maja 100 Zieliński Krzysztof 104 Zieliński Zbigniew 202 Ziętar Marek S. 126 Ziętkiewicz E. 42, 54, 55 Zimnoch Lech 104 Zimowski Janusz 11, 22, 25 Ziółkowska Iwona 53, 110 Ziółkowska L. 74 Złobecka Ewa 92 Złowocka Elżbieta 105, 106, 107 Zuzga Sabina 176 Zwierzchowski Lech 135, 139, 148 Zwierzykowska Elżbieta 172 Zwierzykowski Zbigniew 172 Zwolska Z. 213 Zwolska Zofia 213, 216 Zych Sławomir 140 Ż Żaczek Anna 218 Żak Iwona 80, 86 Żekanowski Cezary 20 Żołądek Teresa 200 Żukiel Ryszard 24 Żurawa-Janicka Dorota 109 Żurawek Magdalena 53 Żurkowski Maciej 139 Życka Joanna 211
