Degradacja RNA w mitochondriach człowieka

Autoreferat rozprawy doktorskiej mgr. Łukasza Stanisława Borowskiego
„Degradacja RNA w mitochondriach człowieka”
Promotorzy:
prof. dr hab. Piotr P. Stępień (Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet
Warszawski)
dr Roman J. Szczęsny (Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet
Warszawski) – promotor pomocniczy
Recenzenci:
prof. dr hab. Grzegorz Węgrzyn (Wydział Biologii, Geografii i Oceanologii, Uniwersytet Gdański)
prof. dr hab. Włodzimierz KrzyŜosiak (Instytut Chemii Bioorganicznej, Polska Akademia Nauk)
Praca doktorska wykonana w Instytucie Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet
Warszawski
Ludzkie mitochondria zawierają własny materiał genetyczny i pomimo kilku dekad badań
wiele aspektów jego metabolizmu, np. degradacja RNA, nie zostało poznanych. Degradację
mitochondrialnego RNA (mtRNA) jak dotąd najlepiej scharakteryzowano w droŜdŜach
Saccharomyces cerevisiae. W organizmie tym za proces ten odpowiedzialny jest dwupodjednostkowy
kompleks białkowy, składający się z helikazy RNA kodowanej przez jądrowy gen SUV3 oraz
egzorybonukleazy Dss1 kodowanej równieŜ przez gen jądrowy. Ludzki genom jądrowy koduje
ortolog droŜdŜowej helikazy Suv3 (hSuv3) jednak nie odnaleziono ortologa egzorybonukleazy Dss1.
Eksperymenty w przeprowadzeniu których uczestniczyłem pozwoliły wykazać, Ŝe helikaza hSuv3 jest
niezbędnym składnikiem maszynerii degradującej RNA w ludzkich mitochondriach. JednakŜe do
pełnienia swojej funkcji hSuv3 wymaga współpracy z rybonukleazą.
Dotychczas rybonukleaza odpowiedzialna za degradację ludzkiego mtRNA nie była
zidentyfikowana. Podstawą badań zmierzających do identyfikacji takiego enzymu było załoŜenie, Ŝe
oddziałuje on z hSuv3, o którym wiedzieliśmy, Ŝe jest niezbędny do degradacji mtRNA. W pracach
nad hSuv3 stwierdzono, Ŝe z białkiem tym współoczyszcza się PNPaza – enzym zdolny do
fosforolitycznej degradacji RNA (Roman J. Szczęsny, rozprawa doktorska).
Głównym celem niniejszej rozprawy doktorskiej było sprawdzenie, czy PNPaza jest
poszukiwaną ludzką RNazą mitochondrialną.
Zadanie to było tym trudniejsze, Ŝe istniało juŜ kilka prac na temat PNPazy, w których
postulowano, Ŝe białko to nie jest bezpośrednio zaangaŜowane w metabolizm mtRNA u człowieka.
Stwierdzono m.in. brak wpływu obniŜenia poziomu PNPazy na poziom mitochondrialnych
transkryptów, a ponadto przeprowadzono eksperymenty, które zasugerowały wielu badaczom, Ŝe
PNPaza jest zlokalizowana jedynie w przestrzeni międzybłonowej mitochondriów, podczas gdy
mtRNA zlokalizowany jest w macierzy mitochondrialnej.
1
Wyniki tych badań sprawiły, Ŝe wiele grup badawczych przestało brać pod uwagę PNPazę w
poszukiwaniach ludzkiej mitochondrialnej RNazy. Dlatego teŜ, realizacja celu niniejszej rozprawy
doktorskiej i udowodnienie bezpośredniego udziału PNPazy w degradacji ludzkich mtRNA wymagało
przeprowadzenia szeregu doświadczeń z zastosowaniem róŜnych strategii badawczych oraz
wskazania ewentualnych błędów metodologicznych we wcześniejszych pracach badawczych.
Podobnie jak we wcześniejszych pracach do badania funkcji PNPazy zastosowałem obniŜenie
poziomu tego białka za pomocą siRNA. JednakŜe, w odróŜnieniu od dotychczasowych prac
udowodniłem, Ŝe efekty obserwowane po obniŜeniu PNPazy są konsekwencją braku tego białka, a nie
efektem niespecyficznego działania siRNA (ang. off-target effects). W tym celu otrzymałem stabilne
ludzkie linie komórkowe, umoŜliwiające indukowalną ekspresję egzogennej PNPazy (aktywnej
katalitycznie lub nie) posiadającej mutacje synonimiczne, które powodowały, Ŝe stosowany siRNA
obniŜał poziom endogennej PNPazy, ale nie jej dodatkowo wprowadzonej formy. Wykorzystując taki
model badawczy wykazałem, Ŝe brak PNPazy (podobnie jak obserwowano to wcześniej w przypadku
hSuv3) prowadzi do nagromadzenia półproduktów degradacji mtRNA, w tym duŜych ilości
niekodujących antysensownych mtRNA. Stosując znakowanie RNA za pomocą tiourydyny (4sU)
wykazałem, Ŝe wyciszenie PNPazy wydłuŜa czas półtrwania mtRNA. Co bardzo waŜne,
udowodniłem, Ŝe zmiany w metabolizmie mtRNA obserwowane po obniŜeniu poziomu PNPazy
wynikają z braku aktywności RNazowej tego białka w mitochondriach, poniewaŜ są odwracane tylko
przez ekspresję egzogennej, katalitycznie aktywnej PNPazy (niewraŜliwej na siRNA), a nie przez jej
nieaktywny odpowiednik. Są to pierwsze eksperymenty nad funkcją PNPazy, które obejmują kontrole
typu „rescue”.
Wcześniejsze prace sugerowały, Ŝe PNPaza jest zlokalizowana jedynie w przestrzeni
międzybłonowej mitochondriów. Pomijały one jednak fakt, Ŝe zastosowana metodologia ma
ograniczony poziom detekcji. Za pomocą frakcjonowania organelli komórkowych i trawienia białek w
poszczególnych przedziałach komórkowych, wykazałem, Ŝe PNPaza jest równieŜ obecna w macierzy
mitochondrialnej. Dane te poparłem wynikami eksperymentów udowadniających, Ŝe hSuv3 i PNPaza
tworzą kompleks in vivo.
W pierwszym etapie badań wykazałem, Ŝe zaobserwowane wcześniej współoczyszczanie się
PNPazy z hSuv3 nie jest artefaktem. Stosując stabilną linię komórek produkujących hSuv3 w fuzji ze
znacznikiem TAP oraz linie produkującą PNPazę w fuzji ze znacznikiem FLAG, wykazałem, Ŝe
kompleks PNPaza-hSuv3 jest formowany przed rozpoczęciem oczyszczania białek (w
mitochondriach), a nie w roztworze po lizie błon mitochondrialnych.
Aby potwierdzić formowanie kompleksu PNPaza-hSuv3 in vivo zastosowałem dwie metody
wykorzystujące analizę mikroskopową (BiFC oraz FLIM-FRET), które opierają się na odmiennych
zjawiskach fizycznych. Obie metody pozwoliły mi wykazać, Ŝe kompleks PNPaza-hSuv3 istnieje in
vivo. Co więcej, powstaje on w mitochondriach lokalnie w postaci ognisk nazwanych przez nas Dfoci, poniewaŜ zawierają ludzki mitochondrialny degradosom. Tego typu struktury, związane z
metabolizmem RNA nie były obserwowane w Ŝadnym z dotychczas badanych systemów
mitochondrialnych.
2
Oddziaływanie hSuv3-PNPaza potwierdziłem równieŜ stosując badania funkcjonalne.
Wykazałem, Ŝe nadprodukcja katalitycznie nieaktywnej formy białka hSuv3_G207V z delecją pięciu
aminokwasów, których obecność jest niezbędna do oddziaływania z PNPazą in vitro, nie prowadzi do
wystąpienia fenotypu dominującego-negatywnego, jak to ma miejsce w przypadku ekspresji
nieaktywnego hSuv3 pełnej długości. Wskazuje to, Ŝe hSuv3_G207V moŜe inaktywować kompleks
degradujący mtRNA tylko, gdy oddziałuje z PNPazą.
Uzyskane dane pozwoliły udowodnić, Ŝe:
1) PNPaza jest poszukiwaną rybonukleazą degradującą mtRNA,
2) degradacja mtRNA, przynajmniej częściowo, jest zorganizowana przestrzennie i zachodzi w
odkrytych D-foci,
3) PNPaza i helikaza hSuv3 tworzą kompleks in vivo, którego formowanie jest niezbędne do
degradacji mtRNA.
Uzyskane wyniki zostały opublikowane w czasopiśmie Nucleic Acids Research (Borowski i wsp.,
2012).
W skład rozprawy doktorskiej wchodzą następujące publikacje:
1.
Borowski, L.S., A. Dziembowski, M.S. Hejnowicz, P.P. Stepien, and R.J. Szczesny. 2012. Human Mitochondrial
RNA Decay Mediated by PNPase-hSuv3 Complex Takes Place in Distinct Foci. Nucleic Acids Rresearch.
2.
Borowski, L.S., R.J. Szczesny, L.K. Brzezniak, and P.P. Stepien. 2010. RNA turnover in human mitochondria:
more questions than answers? Biochim Biophys Acta. 1797:1066-1070.
3.
Szczesny, R.J., L.S. Borowski, L.K. Brzezniak, A. Dmochowska, K. Gewartowski, E. Bartnik, and P.P. Stepien.
2010. Human mitochondrial RNA turnover caught in flagranti: involvement of hSuv3p helicase in RNA
surveillance. Nucleic Acids Res. 38:279-298.
4.
Szczesny, R.J., L.S. Borowski, M. Malecki, M.A. Wojcik, P.P. Stepien, and P. Golik. 2012. RNA degradation in
yeast and human mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1819:1027-1034.
3