Pobierz dokument

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12)
(96)
TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO
Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
05.03.2004 04717941.1
(97)
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej
Polskiej
O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono:
11.11.2009 Europejski Biuletyn Patentowy 2009/46
(19)
PL
(11)
PL/EP 1603541
(13)
T3
(51) Int. Cl.
C07H21/04
C12N15/00
C12N1/20
C12N9/24
C12N9/00
C12P21/06
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
EP 1603541 B1
(54) Tytuł wynalazku:
Rozpuszczalna glikoproteina o aktywności hialuronidazy (sHASEGP), sposób jej wytwarzania, zastosowanie i
zawierające ją kompozycje farmaceutyczne
(30) Pierwszeństwo:
US20030452360P
05.03.2003
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
14.12.2005 Europejski Biuletyn Patentowy 2005/50
(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:
30.04.2010 Wiadomości Urzędu Patentowego 04/2010
(73) Uprawniony z patentu:
Halozyme, Inc., San Diego, US
(72) Twórca (y) wynalazku:
PL/EP 1603541
T3
BOOKBINDER Louis H., San Diego, US
KUNDU Anirban, San Diego, US
FROST Gregory I., Del Mar, US
(74) Pełnomocnik:
Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych Patpol Sp. z o.o
rzecz. pat. Żebrowska-Kucharzyk Agnieszka
02-770 Warszawa 130
skr. pocz. 37
Uwaga:
W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw
dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą
wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
EP-1603541B1PL
OPIS
Odniesienia do odpowiadającego/odpowiadających zgłoszenia/szeń patentowych.
[0001] Niniejsze zgłoszenie zastrzega pierwszeństwo ze zgłoszenia złożonego 5 marca 2003 r., Stany
Zjednoczone, numer seryjny 60/452,360 zgodnie z 35 U.S.C.§119(e).
5
TŁO WYNALAZKU
DZIEDZINA WYNALAZKU
[0002] Niniejszy wynalazek ogólnie dotyczy działających w obojętnym pH, rozpuszczalnych
glikoprotein o aktywności hialuronidazy (sHASEGP), ich części, w szczególności domen o aktywności
hialuronidazy. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy chemicznych modyfikacji, kompozycji
10
farmaceutycznych, plazmidów ekspresyjnych, sposobów wytwarzania i metod terapeutycznych
wykorzystujących glikoproteiny o aktywności hialuronidazy i ich domeny oraz kodujące je cząsteczki
kwasów nukleinowych do modyfikacji glikozoaminoglikanów o terapeutycznym zastosowaniu w
leczeniu choroby jak również zastosowania ich do zwiększenia dyfuzji wstrzykiwanych zwierzętom
cząsteczek o średnicy mniejszej niż 200 nm.
15
PODSTAWA WYNALAZKU
[0003]
Glikozaminoglikany
(GAG)
są
złożonymi
liniowymi
polisacharydami
macierzy
zewnątrzkomórkowej (ECM). Cechą charakterystyczną GAG są powtarzające się disacharydowe
podjednostki złożone z N-podstawionej
D-heksozoaminy
i kwasu uronowego [hialuronian (HA),
siarczan chondroityny (CS), chondroityna (C), siarczan dermatanu (DS), siarczan heparanu (HS),
20
heparyna (H)] lub galaktozy [siarczan keratanu (KS)]. Z wyjątkiem HA, wszystkie GAG występują w
formie kowalencyjnie związanej z białkami rdzeniowymi. Ze względu na swoją strukturę, GAG w
połączeniu z białkami rdzeniowymi strukturalnie zaliczane są do proteoglikanów.
[0004] U ssaków hialuronian (HA) występuje głównie w tkance łącznej, skórze, tkance chrzęstnej i
mazi stawowej. Hialuronian stanowi także główny składnik ciała szklistego oka. W tkance łącznej
25
cząsteczki wody pochodzące z uwodnionego hialuronianu kształtują przestrzeń między tkankami,
tworząc w ten sposób środowisko sprzyjające przemieszczaniu się komórek i ich proliferacji.
Hialuronian odgrywa kluczową rolę w zjawiskach biologicznych związanych z ruchliwością komórki, w
tym w zjawiskach takich jak szybki rozwój, regeneracja, proces naprawczy, embriogeneza, rozwój
embrionalny, proces gojenia ran, angiogeneza, tumorogeneza (Toole 1991 Cell Biol. Extracell. Matrix,
30
Hay (ed), Plenum Press, New York, 1384-1386; Bertrand et al.1992 Int. J. Cancer 52:1-6; Knudson et
al., 1993 FASEB J. 7:1233-1241). Co więcej, poziom hialuronianu koreluje ze stopniem agresywności
raka (Ozello et al. 1960 Cancer Res. 20:600-604; Takeuchi et al. 1976, Cancer Res. 36:2133-2139;
Kimata et al. 1983 Cancer Res.43:1347-1354).
[0005] HA występuje w macierzy zewnątrzkomórkowej wielu tkanek, w szczególności w miękkich
35
tkankach łącznych. Przypisuje się mu różne funkcje fizjologiczne, takie jak utrzymywanie stanu
homeostazy białek w wodzie i osoczu (Laurent TC et al. (1992) FASEB J 6:2397-2404). Produkcja HA
wzrasta w komórkach proliferujących i może odgrywać rolę w procesie mitozy. Jest on także
zaangażowany w ruchliwość i migrację komórek oraz wydaje się odgrywać istotną rolę w regulacji,
rozwoju i różnicowaniu (Laurent et al., supra).
40
[0006] HA znalazł zastosowanie w medycynie klinicznej. Jego ochronne i reologiczne właściwości
okazały się przydatne w chirurgii oka do ochrony śródbłonka rogówki w czasie operacji usunięcia
katarakty. Obecność HA w surowicy jest markerem diagnostycznym chorób wątroby i różnorakich
stanów zapalnych takich jak reumatoidalne zapalenie stawów. Obrzęk śródmiąższowy spowodowany
nagromadzeniem HA może prowadzić do zaburzenia pracy wielu różnych organów (Laurent et al.,
supra).
5
[0007] Oddziaływania między hialuronianem a białkami są również zaangażowane w utrzymanie
struktury macierzy zewnątrzkomórkowej lub substancji podstawowej.
[0008] Hialuronidazy to enzymy występujące u zwierząt i działające w obojętnym lub kwaśnym pH.
Różnią się między sobą specyficznością substratową i mechanizmem działania.
[0009] Istnieją trzy główne klasy hialuronidaz:
10
[0010] 1. Hialuronidazy ssacze (EC 3.2.1.35) są endo-beta-N-acetyloheksozaminidazamiy, a ich
główny produkt końcowy stanowią tetra- lub heksasacharydy. Enzymy te posiadają zarówno
aktywność hydrolityczną jak i transglikozydazową i mogą degradować hialuronian oraz grupy
siarczanowe chondroityny (CS), szczególnie chondroityny C4-S i C6-S.
[0011] 2. Hialuronidazy bakteryjne (EC 4.2.99.1) degradujące hialuronian oraz w różnym stopniu CS i
15
DS. Są one endo-beta-N-acetyloheksozaminidazami działającymi poprzez reakcję beta-eliminacji,
której produktem końcowym są głównie disacharydy.
[0012] 3. Hialuronidazy (EC 3.2.1.36) występujące u pijawek, innych pasożytów i skorupiaków są
endo-beta-glukuronidazami, których produkty końcowe, tetra- i heksasacharydowe powstają w wyniku
hydrolizy wiązania β (1,3).
20
[0013] Hialuronidazy ssacze mogą być podzielone na dwie podgrupy: enzymy działające w pH
obojętnym i kwaśnym. W genomie człowieka zidentyfikowano sześć genów kodujących enzymy z
grupy hialuronidaz: HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4, HYALP1 oraz PH20/SPAM1. HYALP1 jest
pseudogenem, a w przypadku HYAL3 nie wykazano aktywności tego enzymu względem żadnego
znanego substratu. HYAL4 jest chondroitynazą i nie hydrolizuje hialuronianu. HYAL1 jest
25
prototypowym przedstawicielem enzymów aktywnym w pH kwaśnym, a PH20 prototypowym
enzymem aktywnym w pH obojętnym. Hialuronidazy aktywne w kwaśnym pH, takie jak HYAL1 i
HYAL2 tracą aktywność w środowisku o obojętnym pH, np. HYAL1 nie posiada zdolności
katalitycznych in vitro w środowisku o pH powyżej 4.5 (Frost et al. Anal Biochemistry, 1997). HYAL2
jest enzymem działającym w kwaśnym pH, o bardzo niskiej specyficzności in vitro.
30
[0014] Do enzymów z grupy hialuronidaz należą również takie, które są przyłączone do błony
komórkowej kotwicą fosfatydyloinozytolową, jak ludzka HYAL2 i PH20 (Danilkovitch-Miagkova, et al.
Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Apr 15;100 (8):4580-5, Phelps et al., Science 1988) i takie, które są
rozpuszczalne jak np. ludzka HYAL1 (Frost et al, Biochem Biophys Res Commun. 1997 Jul
9;236(1):10-5). Jednakże istnieje między nimi zmienność międzygatunkowa. Wołowa PH20 jest
35
związana z błoną bardzo słabo i nie jest zakotwiczona poprzez wrażliwą na fosfolipazę kotwicę
(Lalancette et al., Biol Reprod. 2001 Aug;65(2):628-36.). Ta unikalna cecha wołowej hialuronidazy
umożliwia zastosowanie hialuronidaz pozyskanych z ekstraktów jądrowych do celów klinicznych
(Wydase®, Hyalase®). Inne rodzaje PH20 są zakotwiczone w błonie poprzez lipidy i przechodzą w
formę rozpuszczalną jedynie po użyciu detergentów lub lipaz. Przykładowo ludzka PH20 jest
40
zakotwiczona w błonie cytoplazmatycznej za pomocą kotwicy GPI. Próby uzyskania konstruktów DNA,
które kodowałyby białkową część PH20 bez lipidowej kotwicy kończyły się uzyskaniem katalitycznie
nieaktywnego lub nierozpuszczalnego enzymu (Arming et al Eur J Biochem. 1997 Aug 1;247(3):810-
4). Hialuronidaza naturalnie obecna w spermie makaków występuje zarówno w formie rozpuszczalnej
jak i błonowej. Forma błonowa o masie 64 kDa jest enzymatycznie aktywna w pH 7.0, natomiast forma
o masie 54 kDa jest aktywna jedynie w środowisku o pH 4.0 (Cherr et al., Dev Biol. 1996 Apr
10;175(1):142-53.). Z tego powodu formy rozpuszczalne PH20 często nie wykazują aktywności
5
enzymatycznej w środowisku o obojętnym pH.
[0015] Chondroitynazy to enzymy powszechnie występujące w świecie zwierząt. Enzymy te degradują
glikozaminoglikany w reakcji endoglikozydazowej. Szczególnymi przykładami znanych chondroitynaz
są: chondroitynaza ABC (izolowana ze szczepu Proteus vulgaris; Japanese Patent Application Laidopen No 6-153947, T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, and S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523
10
(1968), S. Suzuki, H. Saito, T. Yamagata, K. Anno, N. Seno, Y. Kawai, and T.Furuhashi, J. Biol.
Chem., 243, 1543 (1968)), chondroitynaza AC (izolowana z Flavobacterium heparinum; T. Yamagata,
H. Saito, O. Habuchi, and S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968)), chondroitynaza AC II
(otrzymana z Arthrobacter aurescens; K. Hiyama, and S. Okada, J. Biol. Chem., 250, 1824 (1975), K.
Hiyama and S. Okada, J. Biochem. (Tokyo),80, 1201 (1976)), hialuronidaza ACIII (izolowana z
15
Flavobacterium sp. Hp102; Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi,Keiichi Yoshida, Kiyoshi Morikawa, i
Kiyochika Tokuyasu, Seikagaku, 61, 1023 (1989)), chondroitynaza B (izolowana z Flavobacterium
heparinum; Y. M. Michelacci and C. P. Dietrich, Biochem. Biophys. Res. Commun., 56, 973 (1974), Y.
M. Michelacci and C. P. Dietrich, Biochem. J., 151, 121 (1975), Kenichi Maeyama, Akira Tawada,
Akiko Ueno, i Keiichi Yoshida, Seikagaku, 57, 1189 (1985)), chondroitynaza C (izolowana z
20
Flavobacterium sp. Hp102; Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi, Kelichi Yoshida, Kiyoshi Morikawa,
and Kiyochika Tokuyasu, Seikagaku, 61, 1023 (1939)) i im podobne.
[0016] Glikoproteiny zbudowane są z polipeptydowego łańcucha, do którego kowalencyjnie związana
jest jedna lub więcej cząsteczek węglowodanów. Istnieją dwie główne kategorie glikoprotein, w
których łańcuch węglowodanowy przyłączony jest do części białkowej wiązaniem N- bądź O-
25
glikozydowym. N- i O- glikany są przyłączone do polipeptydów odpowiednio przez wiązanie między
asparaginą a N-acetylo-D-glukozaminą oraz między seryną (treoniną) a N-acetylo-D-galactosaminą.
Kompleksowe N-glikany nie zawierają terminalnych reszt mannozy. Zawierają jedynie terminalną
resztę N-acetyloglukozaminy, galaktozę i/lub reszty kwasu sjalowego. Hybrydowe N-glikany zawierają
w swojej strukturze zarówno terminalne reszty mannozy jak i terminalną N-acetyloglukozaminę,
30
galaktozę i/lub reszty kwasu sjalowego.
[0017] Podczas syntezy białek zachodzącej w retikulum endoplazmatycznym z połączonymi przez
atom N glikoproteinami, prekursory oligosacharydowe wiązane są z grupą aminową asparaginy.
Reszta oligosacharydowa jest sekwencyjnie procesowana przez serię specyficznych enzymów, które
odcinają bądź dodają reszty cukrowe. Obróbka ta rozpoczyna się w retikulum endoplazmatycznym i
35
jest kontynuowana w czasie przejścia przez kompartmenty cis, środkowe i trans Aparatu Golgiego.
STRESZCZENIE WYNALAZKU
[0018] Przedmiotem niniejszego wynalazku są przedstawiciele rodziny rozpuszczalnych, aktywnych w
obojętnym pH glikoprotein o aktywności hialuronidazy, a szczególnie rozpuszczalne glikoproteiny o
aktywności ludzkiej hialuronidazy PH-20 (określane także jako sHASEGP). Przedmiotem niniejszego
40
wynalazku są także przedstawiciele rodziny sHASEGP, określanej tu jako sHASEGP. Przedmiotem
wynalazku jest również rozpuszczalna domena o aktywności hialuronidazy i jej zastosowania.
[0019] Wynalazek opiera się na odkryciu, że rozpuszczalne hialuronidazy, aktywne w obojętnym pH,
można uzyskać z wysoką wydajnością w eukariotycznym systemie ekspresyjnym opartym na
komórkach ssaczych poprzez wprowadzenie kwasów nukleinowych w formie cDNA, pozbawionych
sekwencji krótkiego regionu kodującego aminokwasy na C-końcu ludzkiej PH-20. Wynalazek
5
dostarcza również dodatkowe modyfikacje glikoprotein sHASEGP, które wzmacniają sekrecję za
pomocą sztucznego peptydu liderowego. Dalej wynalazek dotyczy sposobów modyfikacji sHASEGP,
które pozwalają przedłużyć czas połowicznego przeżycia przez maskowanie białka glikolem
polietylenowym i potranslacyjne modyfikacje natywnych glikanów. Wcześniejsze próby wytworzenia
sekrecyjnych ludzkich sHASEGP, aktywnych w obojętnym pH, zakończyły się niepowodzeniem.
10
Wyciągnięto zatem wniosek, że skrócenie polipeptydu ludzkiej sHASEGP powodowało zarówno utratę
aktywności enzymatycznej w obojętnym pH, jak i niezdolność komórek do sekrecji rekombinowanych
białek w eukariotycznych systemach ekspresyjnych opartych na komórkach ssaczych (Arming, et al
Eur J Biochem 1997 Aug1;247 (3):810-4). Z punktu widzenia komercyjnej produkcji i zastosowania
terapeutycznego istotne jest uzyskanie sekrecyjnej formy glikoproteiny sHASEGP o aktywności
15
hialuronidazy. Wynalazek ujawniony w niniejszym dokumencie przezwycięża wymienione trudności.
[0020] W pierwszym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza zasadniczo oczyszczoną glikoproteinę,
obejmującą aktywny w środowisku obojętnym rozpuszczalny polipeptyd hialuronidazy zawierający co
najmniej jedno ugrupowanie cukrowe połączone przez atom N, które jest kowalencyjnie związane z
asparaginą wchodzącą w skład tego polipeptydu; Zasadniczo oczyszczona glikoproteina zawiera
20
sekwencję aminokwasową objętą sekwencją ID. SEKW. Nr 1 albo sekwencję, która jest w 91%
identyczna z sekwencją aminokwasową objętą sekwencją ID. SEKW. Nr 1; i ta Zasadniczo
oczyszczona glikoproteina jest rozpuszczalna. Przedstawione poniżej wyniki badań pokazują, że
ludzka PH-20 wymaga dla swojej aktywności katalitycznej N-glikozylacji, podczas gdy hialuronidazy
wołowe i z jadu pszczelego są aktywne bez obecności N-glikanów. Domena ludzkiej hialuronidazy
25
pozbawiona połączonych przez atom N ugrupowań jest katalitycznie nieaktywna. Tak więc klasyczna
technologia oparta na rekombinowanym DNA nie pozwala na wytwarzanie katalitycznie aktywnej
formy ludzkiej sHASEGP, w przeciwieństwie do HASEGP z jadu pszczelego, która może być
wytwarzana w komórkach E. coli.
[0021] Wynalazek obejmuje sposoby i komórki do wytwarzania połączonego przez atom N polipeptydu
30
glikoproteiny sHASEGP, z wykorzystaniem komórek zdolnych do umieszczania wspomnianych
połączonych przez atom N ugrupowań cukrowych na polipeptydzie sHASEGP. Sposoby identyfikacji
prawidłowo glikozylowanych sHASEPG są ujawnione w części dalszej.
[0022] Wynalazek dostarcza modyfikacje sHASEGP przedłużające czas jej połowicznego przeżycia
oraz chemiczne modyfikacje sHASEGP za pomocą polimerów takich jak glikol polietylenowy i
35
dekstran. Takie modyfikacje chronią sHASEGP przed usuwaniem z krążenia i rozpoznaniem przez
układ odpornościowy lub receptory glikanów np. receptory dla mannozy lub asialoglikoprotein. Dalej
wynalazek dostarcza sposobów przyłączania do specyficznych grup funkcjonalnych takich jak miejsca
glikozylacji, dodatnio naładowane aminokwasy i cysteina.
[0023] Wynalazek dostarcza również testy do identyfikacji efektorów, takich jak związki chemiczne,
40
włączając w to związki drobnocząsteczkowe, warunki takie jak pH, temperatura i siła jonowa, które
modulują aktywację, ekspresję lub/i aktywność sHASEGP. W przykładowych testach oszacowano
efekty wpływu testowanych związków chemicznych na zdolność domeny o aktywności hialuronidazy z
sHASEGP do trawienia znanego substratu, zwykle glikozaminoglikanów lub proteoglikanów. Czynniki,
modulujące aktywność wspomnianej domeny o aktywności hialuronidazy, ogólnie związki chemiczne,
szczególnie związki drobnocząsteczkowe są potencjalnymi związkami chemicznymi modulującymi
aktywność glikoproteiny o aktywności hialuronidazy sHASEGP. Domeny o aktywności hialuronidazy
5
mogą być również użyte do wytwarzania przeciwciał specyficznych dla hialuronidazy, o funkcji
zaburzającej jej aktywność. Domeny hialuranidazy będące przedmiotem niniejszego wynalazku
zawierają, lecz nie tylko, N-końcową glikozylowaną domenę o aktywności glikozylazy i hydrolazy,
pozbawioną fragmentu na C-końcu i wykazującą aktywność katalityczną in vitro.
[0024] Niniejszy wynalazek obejmuje również cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące białka i
10
domeny o aktywności hialuronidazy, a także cząsteczki kwasów nukleinowych, które kodują
rozpuszczalną domenę o aktywności hialuronidazy lub jej katalitycznie aktywne fragmenty oraz takie
kwasy nukleinowe, które kodują pełną cząsteczkę sHASEGP. Kwas nukleinowy kodujący domenę o
aktywności hialuronidazy i kwas nukleinowy poniżej sekwencji kwasu nukleinowego kodującego
domenę o aktywności hialuronidazy jest przedstawiony w sekwencji ID. SEKW. Nr 6. Domena o
15
aktywności hialuronidazy z sHASEGP jest przedstawiona w sekwencji ID. SEKW. Nr 1(aminokwasy
35-464). Sekwencja białka i kodująca sekwencję DNA pełnej cząsteczki sHASEGP jest przedstawiona
w ID. SEKW. Nr 1 i 6.
[0025] Wynalazek dostarcza także cząsteczki kwasów nukleinowych, które hybrydyzują z kwasem
nukleinowy kodującym sHASEGP na całej swojej długości lub co najmniej w 70%, 80% lub 90% całej
20
cząsteczki DNA kodującej pełną domenę o aktywności hialuronidazy lub jej fragment. Ogólnie
specyficzność hybrydyzacji zmienia się w warunkach co najmniej nisko, ogólnie w co najmniej
umiarkowanie i często w wysoko rygorystycznych warunkach hybrydyzacji.
[0026] Takim wyizolowanym fragmentem kwasu nukleinowego jest DNA, włączając w to genomowe
DNA, RNA lub inne składniki takie jak kwas peptydonukleinowy lub inne analogi nukleotydów.
25
Izolowany kwas nukleinowy może zawierać dodatkowe składowe, takie jak heterologiczne lub
natywne promotory lub inne sekwencje regulujące transkrypcję i translację. Geny te mogą być
połączone z innymi genami, takimi jak geny reporterowe, geny markerowe lub geny kodujące markery.
[0027] Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję,
która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej kodującej sHASEGP lub do jej fragmentu.
30
[0028] Przedmiotem wynalazku są również oligonukleotydy lub ich fragmenty, które mogą być użyte
jako sondy lub primery i które zawierają co najmniej około 10, 14, 16 nukleotydów, ogólnie mniej niż
1000 lub mniej niż/lub równo 100, przedstawione w sekwencji ID. SEKW. Nr 6 (lub sekwencje
komplementarne); lub zawierają co najmniej około 30 nukleotydów (lub do nich komplementarnych)
lub zawierają oligonukleotydy, które hybrydyzują na całej długości (lub przynajmniej w około 70, 80 lub
35
90% ich długości) z dowolnym fragmentem lub oligonukleotydem. Długość tych fragmentów zależy od
ich zastosowania i/lub złożoności genomu będącego przedmiotem zainteresowania. Zazwyczaj sondy
i primery zawierają mniej niż 50, 150 lub 500 nukleotydów.
[0029] Przedmiotem wynalazku są plazmidy zawierające dowolne cząsteczki DNA będące
przedmiotem niniejszego wynalazku. Przedmiotem wynalazku są także komórki zawierające te
40
plazmidy. Komórkami zawierającymi plazmidy mogą być, lecz nie tylko, komórki bakteryjne,
drożdżowe, grzyby, komórki roślinne, owadzie i zwierzęce.
[0030] Przedmiotem wynalazku są także ulepszone systemy ekspresyjne, oparte na komórkach
ssaków, wykorzystujące sekwencje sygnałowe umożliwiające wydajną sekrecję sHASEGP.
Przykładem takiej wydajnej aminokwasowej sekwencji sygnałowej i takiego białka fuzyjnego z
sHASEGP jest sekwencja ID. SEKW. Nr 43 i 46.
5
[0031] Ponadto przedmiotem wynalazku jest Sposób wytwarzania zasadniczo oczyszczonej
glikoproteiny obejmująca: wprowadzenie funkcjonalnie połączonego z odpowiednim promotorem
kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd będący przedmiotem wynalazku do komórki zdolnej do
przyłączenia przez atom N ugrupowań cukrowych do tego polipeptydu; hodowlę komórkową, w
warunkach której kodowany polipeptyd jest ekspresjonowany przez komórkę; odzyskiwanie
10
wyekspresjonowanego polipeptydu/ów.
[0032] Przedmiotem wynalazku są komórki, ogólnie komórki eukariotyczne takie jak komórki ssacze i
drożdżowe, w których polipeptyd sHASEGP jest ekspresjonowany na powierzchni. Takie komórki są
wykorzystywane w testach przesiewowych leków do identyfikacji związków chemicznych, które
modulują aktywność polipeptydu sHASEGP. W takich testach, włączając w to testy wiązania in vitro i
15
testy oparte na transkrypcji, ocenia się bezpośrednie lub pośrednie przekazywanie sygnału przez
sHASEGP np. przez aktywację czynników wzrostu.
[0033] Przedmiotem niniejszego wynalazku są także peptydy kodowane przez takie cząsteczki kwasu
nukleinowego. Wśród wspomnianych polipeptydów znajduje się domena o aktywności hialuronidazy
sHASEGP lub polipeptyd z aminokwasami podstawionymi w taki sposób, że specyficzność i/lub
20
aktywność hialuronidazy pozostaje w znacznym stopniu nie zmieniona. W szczególności wynalazek
dostarcza ssaczą, zasadniczo oczyszczoną, sekrecyjną glikoproteinę sHASEGP, która zawiera
aktywną katalitycznie domenę działającą w obojętnym pH.
[0034] Wynalazek obejmuje także katalityczną domenę o aktywności hialuronidazy i może dodatkowo
obejmować inne domeny. sHASEGP może tworzyć zarówno homodimery jak i heterodimery z
25
niektórymi innymi białkami takimi jak białko błonowe. Przedmiotem wynalazku jest również
Zasadniczo oczyszczona glikoproteina zawierająca sekwencję aminokwasową, która jest w co
najmniej 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identyczna z sHASEGP, a procent
identyczności jest wyznaczony przy zastosowaniu standardowych algorytmów i parametru kosztów
przerwania sekwencji, które zwiększają procent identyczności.
30
[0035] Niniejszym wynalazkiem objęte są warianty splicingowe sHASEGP, szczególnie te z aktywną
katalitycznie domeną o aktywności hialuronidazy.
[0036] W innym wariancie wykonania wynalazek dotyczy zasadniczo oczyszczonych polipeptydów,
które zawierają domenę o aktywności hialuronidazy z sHASEGP lub jej katalitycznie aktywną część,
ale nie zawierają pełnej sekwencji aminokwasowej przedstawionej w sekwencji ID. SEKW. Nr 1. W
35
grupie tej są polipeptydy zawierające sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 95% lub
100% identyczna z sekwencją ID. SEKW. Nr 1 i 3.
[0037] W szczególnym wykonaniu niniejszy wynalazek dostarcza kwasu nukleinowego kodującego
eukariotyczną glikoproteinę o aktywności hialuronidazy określaną jako sHASEGP. W szczególności
ten kwas nukleinowy zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną w sekwencji ID. SEKW. Nr 6, w
40
szczególności przedstawioną jako nukleotydy 106-1446 w sekwencji ID. SEKW. Nr 6 lub jej część,
która koduje katalitycznie aktywny polipeptyd.
[0038] Wynalazek dotyczy także kwasów nukleinowych, które hybrydyzują z sekwencją ID. SEKW. Nr
6 lub jej zdegenerowaną formą w warunkach co najmniej nisko rygorystycznych, najczęściej
umiarkowanie, a zazwyczaj w warunkach wysoce rygorystycznych.
[0039] W jednym z wariantów wykonania fragment wyizolowanego kwas nukleinowego hybrydyzuje w
5
warunkach wysoce rygorystycznych z kwasem nukleinowym zawierającym sekwencję przedstawioną
w ID. SEKW. Nr 6 (lub jej zdegenerowaną formę). Pełna sekwencja sHASEGP jest przedstawiona w
ID. SEKW. Nr 1 i jest kodowana przez DNA o sekwencji ID. SEKW. Nr 6 lub jego formę
zdegenerowaną.
[0040] Wynalazek dotyczy również mutein domeny o aktywności hialuranidazy z sHASEGP, w
10
szczególności mutein, w których reszta Cys w wolnej formie domeny o aktywności hialuronidazy tzn.
nie tworzącej mostków dwusiarczkowych z każdą inną resztą Cys w obrębie domeny o aktywności
hialuronidazy jest podstawiona innym aminokwasem, zazwyczaj, choć nie koniecznie, aminokwasem
konserwatywnym lub takim, że aktywność jest zachowana, oraz muteiny, w których miejsce(a)
glikozylacji są usunięte.
15
[0041] Wynalazek dotyczy polipeptydów sHASEGP, włączając w to, lecz nie tylko, warianty
splicingowe i kwasy nukleinowe kodujące glikoproteiny sHASEGP oraz ich domeny, pochodne i
analogi. Wynalazek dotyczy pojedynczego łańcucha sekrecyjnej glikoproteiny o aktywności
hialuronidazy, który posiada N-koniec funkcjonalnie odpowiadający N-końcowi formy sHASEGP
wytworzonej w wyniku działania peptydazy sygnałowej formującej sHASEGP. W obrębie cząsteczki
20
sHASEGP istnieje siedem potencjalnych miejsc N-glikozylacji w pozycjach N82, N166, N235,
N254,N368, N393, N490, jak pokazano w ID. SEKW. Nr 1. Mostki dwusiarczkowe utworzone między
resztami Cys C60-C351 i resztami C224-C238 tworzą rdzeniową domenę o aktywności hialuronidazy.
Jednakże, aby zachować aktywność katalityczną enzymu sHASEGP w środowisku obojętnym
niezbędne są dodatkowe reszty cysteinowe na C-końcu w regionie od aminokwasu w pozycji 36 do
25
Cys464 w sekwencji ID. SEKW. Nr 1 zawierającej minimalnie aktywny region domeny ludzkiej
sHASEGP. Dlatego miejsce N-glikozylacji N490 nie jest konieczne dla uzyskania odpowiedniej
aktywności.
[0042] N-glikozylacja glikoprotein sHASEGP jest krytyczna dla stabilności i aktywności katalitycznej
tych cząsteczek. Podczas gdy zmiana typu glikanu modyfikującego sHASEGP może silnie wpłynąć na
30
właściwości antygenowe białka, fałdowanie jej struktury, rozpuszczalność i stabilność, uważa się, że
większość enzymów nie wymaga glikozylacji do uzyskania optymalnej aktywności. A zatem
glikoproteiny sHASEGP są unikatowe skoro usuniecie N-glikanów może skutkować niemal całkowitą
utratą aktywności hialuronidazy. Obecność N-związanych glikanów jest decydująca dla otrzymania
aktywnej sHASEGP. Wynalazek dotyczy również systemów ekspresyjnych białek odpowiednich do
35
wprowadzenia istotnych N-glikanów do struktury sHASEGP. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest
też wprowadzenie deglikozylowanego polipeptydu sHASEGP w obecności ekstraktów pozwalających
na N-glikozylację wspomnianych polipeptydów. W jednym aspekcie wynalazku opisano glikozylację
typu kompleksowego zwieńczoną etapem sjalowania, przy czym nie wyklucza się również innych
typów glikozylacji zakończonej przyłączeniem terminalnych reszt mannozy. Korzystnie reszty kwasu
40
sjalowego znajdują się na końcach N-glikanów cząsteczki sHASEGP.
[0043]
Przyłączone
przez
atom
N
oligosacharydy
dzieli
się
na
kilka
głównych
typów
(wysokomannozowe, kompleksowe, hybrydowe i siarczanowane), a wszystkie z nich posiadają rdzeń
(Man)3-GlcNAc-GlcNAc połączony przez amidowy atom azotu reszty asparaginy, która wchodzi w
skład sekwencji Asn-X-Thr/Ser (gdzie X nie jest Pro). Glikozylacja w obrębie sekwencji -Asn-X-Cys
została opisana dla białka C-reaktywnego. Miejsca N-glikozylacji są często identyfikowane pośrednio
poprzez "pusty"cykl w procesie sekwencjonowania. Identyfikacja obecności miejsca glikozylacji może
5
być przeprowadzona po zwolnieniu oligosacharydów w wyniku trawienia enzymem PNGazą F, która
przekształca glikozylowaną Asn w Asp. Uwolnione w wyniku traktowania PNGazą F N połączone
oligosacharydy mogą być oczyszczone przy użyciu chromatografii na złożu Bio-Gel P-6, a następnie
poddane rozdziałowi z wykorzystaniem preparatywnej wysokosprawnej chromatografii jonowymiennej
(HPAEC) (Townsend et al., (1989) Anal. Biochem. 182, 1-8). Pewne izomery oligosacharydów mogą
10
być rozdzielone przy pomocy HPAEC. Obecność w strukturze reszt fukozy będzie przesuwała pik
danej cząsteczki na pozycję wcześniejszą na chromatogramie HPAEC, podczas gdy dodatkowe
reszty kwasu sjalowego będą zwiększały czas retencji. Równoległe potraktowanie glikoprotein o
znanych strukturach oligosacharydowych (takich jak: fetuina wołowa, kwaśna glikoproteina a-1,
owoalbumina, RNAza B, transferyna) może ułatwić opisanie odpowiadających oligosacharydom
15
pików. Zebrane oligosacharydy mogą być scharakteryzowane przy użyciu kombinacji metod takich jak
analiza jakościowa i analiza metylacyjna wskazujące na skład i pozycję wiązań glikozydowych
(Waeghe et al., (1983) Carbohydr Res. 123, 281-304.), oraz spektroskopia NMR pozwalająca określić
konfigurację anomeryczną wiązań glikozydowych (Van Halbeek (1993) in Methods Enzymol 230).
[0044] Wynalazek dostarcza także formulacji cząsteczek sHASEGP. Glikoproteiny sHASEGP mogą
20
być przygotowane w formie liofilizowanej oraz w formie stabilnych roztworów. Formulacje zawierające
specyficzne jony metali, takie jak wapń, magnez i sód są użyteczne przy uzyskiwaniu optymalnej
aktywności enzymu w obojętnym pH. Oprócz formulacji w postaci stabilnego roztworu niniejszy
wynalazek dotyczy również formy preparatów wolno uwalnianych, służących jako środek o
przedłużonym działaniu do usuwania glikozaminoglikanów. Wynalazek dostarcza niniejszym gotowe
25
do użycia zestawy zawierające opakowane strzykawki napełnione sHASEGP do podawania w czasie
zabiegów chirurgicznych w obrębie gałki ocznej oraz w czasie innych zabiegów chirurgicznych
wymagających użycia małych objętości. Wynalazek dostarcza także formulacji w buforowanym
roztworze soli (ang. balanced salt solution) do użytku ex vivo w technikach sztucznego zapłodnienia.
[0045] Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie glikoprotein o aktywności hialuronidazy
30
sHASEGP do usuwania glikozaminoglikanów. Degradując glikozaminoglikany sHASEGP otwierają
kanały w przestrzeni śródmiąższowej, co pozwala na dyfuzję cząsteczek o rozmiarach mniejszych niż
500 nm. W zależności od użytej dawki i formulacji kanały te pozostają otwarte przez okres 24 - 48
godz. Wspomniane kanały mogą ułatwiać penetrację egzogennych zewnętrznie podawanych płynów,
małych cząsteczek, białek, kwasów nukleinowych i wektorów stosowanych w terapii genowej, a także
35
innych cząsteczek o rozmiarach mniejszych niż 500 nm.
[0046]
Glikoproteiny
sHASEGP
mogą
być
także
stosowane
do
usuwania
nadmiaru
glikozaminoglikanów, nagromadzonych np. w wyniku reperfuzji obszaru niedokrwiennego, zapalenia,
miażdżycy, obrzęku, nowotworu, uszkodzenia rdzenia kręgowego i innych form bliznowacenia tkanek.
W niektórych przypadkach glikoproteiny sHASEGP mogą być podawane regularnie poprzez wlew
40
dożylny. Taka droga podania może się okazać przydatna w sytuacji, kiedy dostęp miejscowy nie jest
możliwy, jak w przypadku serca, mózgu lub rozsianego po całym organizmie nowotworu. Jeżeli chodzi
o czas połowicznego przeżycia w surowicy i dystrybucję w organizmie, silnie usjalowanie glikoproteiny
sHASEGP mają przewagę nad nieusjalowaną formą hialuronidazy
[0047] W pewnych okolicznościach, takich jak uszkodzeniu rdzenia kręgowego, jaskra i zabiegi
kosmetyczne korzystne jest przedłużone podawanie sHASEGP.
5
[0048] W innym wskazaniu bardziej korzystna jest jedna, krótko działająca dawka. Okresowe
usunięcie glikozaminoglikanów może być stosowane w celu ułatwienia penetracji roztworów i leków do
przestrzeni śródmiąższowych, co może być użyteczne w przypadkach dyfuzji anestetyków i przy
podawaniu terapeutycznych płynów, cząsteczek i białek. Podskórne i domięśniowe podawanie
cząsteczek w obecności glikoprotein sHASEGP ułatwia ich szybszą dystrybucję ogólnoustrojową.
10
Takie metody są niezwykle użyteczne w sytuacji, kiedy podanie dożylne jest niemożliwe lub istnieje
potrzeba szybszego podania ogólnoustrojowego. Tak duże cząsteczki jak czynnik VIII, słabo dostępne
po podaniu podskórnym, mogą być wstrzykiwane razem glikoproteinami sHASEGP w celu
zwiększenie ich biodostępności.
[0049] Wynalazek dostarcza również zastosowania glikoprotein sHASEGP do enzymatycznego
15
usuwania macierzy wzgórka jajonośnego otaczającego oocyty. Usuwanie macierzy wzgórka
jajonośnego stosując oczyszczone sHASEGP, wolne od toksycznych zanieczyszczeń, jakie są
obecne w ekstraktach zwierzęcych hialuronidaz jest metodą łagodniejszą i zwiększa przeżywalność
oocytów. Dodatkowo glikoproteiny sHASEGP mogą być produkowane bez potrzeby używania
ekstraktu wołowego lub pochodzącego z komórek innych organizmów, które mogą być potencjalnym
20
źródłem wirusów i innych patogenów a także encefalopatii gąbczastej.
[0050] Iniekcja małych objętości sHASEGP do gałki ocznej może być również stosowana w przypadku
innych niewielkich przestrzeni. Glikoproteiny sHASEGP mogą być wstrzykiwane do komory przedniej
oka celem usunięcia nadmiaru wiskoelastycznego środka podawanego w trakcje zabiegu
chirurgicznego. Wewnątrzgałkowa iniekcja glikoprotein o aktywności hialuronidazy sHASEGP może
25
być również stosowana do obniżania ciśnienia wewnątrzgałkowego w jaskrze, do rozpuszczania
agregatów w ciele szklistym oka lub mętów w ciele szklistym, do usuwania skutków wylewu do ciała
szklistego, leczenia zwyrodnienia plamki żółtej, ułatwia oddzielanie ciała szklistego od siatkówki w
retinopatii cukrzycowej a w mieszaninie z innymi enzymami przy wspomaganiu dopasowania kształtu
rogówki do soczewek kontaktowych. W niektórych przypadkach może okazać się, że pożądane byłoby
30
użycie trwałej formy sHASEGP jak jest postać pegilowana.
[0051] Można również przewidzieć użycie mieszanin z sHASEGP w autostrzykawkach do podawania
małych objętości lub szybkich podskórnych iniekcji. Postaci takich leków mogą być oparte na
przykładach takich jak Epipen®, insulina i inne płyny. Sposoby według niniejszego wynalazku
obejmują podawanie polipeptydu sHASEGP lub kompozycji farmaceutycznych zawierających
35
sHASEGP przed, równolegle lub po podaniu innych cząsteczek terapeutycznych. sHASEGP może
być podawany w inne miejsce lub w to samo co wspomniana cząsteczka terapeutyczna.
[0052] Zatem niniejszy wynalazek dostarcza rodziny eukariotycznych sekrecyjnych, aktywnych w
neutralnym pH glikoprotein o aktywności hialuronidazy określanych tu jako sHASEGP i ich
funkcjonalnych domen, a w szczególności ich domen katalitycznych o aktywności hialuronidazy, ich
40
mutein i ich innych pochodnych oraz analogów. Wynalazek dostarcza również kwasy nukleinowe
kodujące sHASEGP. Dodatkowo wynalazek dostarcza formulacji i zastosowań wspomnianych
sHASEGP do leczenia schorzeń oraz jako enzymy modyfikujące tkanki.
KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW
[0053] Figura 1 przedstawia mapę wektora HZ24-sHASEGP
SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU
[0054] A. DEFINICJE: Jeżeli nie zdefiniowano inaczej, wszystkie techniczne i naukowe terminy
5
używane w niniejszym dokumencie mają takie samo znaczenie jak powszechnie rozumiane przez
specjalistę w dziedzinie, do której wynalazek należy. Wszystkie patenty, zgłoszenia patentowe,
opublikowane zgłoszenia patentowe i publikacje, sekwencje ze strony GenBanku, strony internetowe i
inne opublikowane materiały, do których odniesienia znajdują się w całym niniejszym ujawnieniu,
jeżeli nie zaznaczono inaczej, są integralną częścią dokumentu jako całość. W przypadku, kiedy
10
istnieje wiele definicji terminów użytych w tym dokumencie, należy brać pod uwagę te, które są
zamieszczone w tej części zgłoszenia.
[0055] Jeżeli odnośnik dotyczy URL lub innego identyfikatora stron internetowych lub adresu, rozumie
się, że taki identyfikator może ulegać zmianom, a poszczególne informacje, do których odsyła, mogą
być zamieszczane i usuwane, jednakże przeszukiwanie zasobów sieci internetowej umożliwia
15
odnalezienie informacji równoważnej. Odnośniki do informacji równoważnej są dowodem na
udostępnienie i publiczne rozpowszechnienie tej informacji.
[0056] W rozumieniu niniejszego dokumentu skróty oznaczające dowolne grupy ochronne,
aminokwasy i inne związki chemiczne, jeżeli nie zaznaczono inaczej, są zgodne z powszechnie
używanymi i uznanymi skrótami lub nomenklaturą TUPAC-IUB Commission on Biochemical
20
Nomenclature (patrz (1972) Biochem. 11: 942-944).
[0057] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „eukariotyczna hialuronidaza” oznacza
zróżnicowaną rodzinę endoglukozaminidaz glikozoaminoglikanów, w której reszta glutaminianu w
obrębie cząsteczki hialuronidazy hydrolizuje wiązanie β(1,4) hialuronianu i siarczanu chondroityny
poprzez mechanizm katalizy kwasowo-zasadowej.
25
[0058] Szczególnym przedmiotem zainteresowania są sHASEGP ssacze, w tym pochodzenia
ludzkiego. Specjalistom w danej dziedzinie powszechnie wiadomo, że ogólnie podstawienie
pojedynczego aminokwasu w mało istotnym regionie polipeptydu nie wpływa znacząco na aktywność
biologiczną (patrz np. Watson et al., (1987) Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, The
Benjamin/Cummings Pub. co., p. 224).
30
[0059] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie “zakotwiczona w błonie sHASEGP” oznacza
rodzinę zakotwiczonych w błonie hialuronidaz o strukturze podobnej do opisanej w niniejszym
wynalazku.
[0060] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „rozpuszczalna hialuronidaza” oznacza
polipeptyd charakteryzujący się rozpuszczalnością w warunkach fizjologicznych. Za przykład może
35
służyć rozpuszczalna sHASEGP, którą wyróżnia spośród innych hialuronidaz np. zdolność
przechodzenie do fazy wodnej w roztworze Triton-X114 o temperaturze 37oC (Bordier et al. J Biol
Chem. 1981 Feb 25; 256 (4): 1604-7) w przeciwieństwie do sHASEGP zakotwiczonej za
pośrednictwem lipidów, która zwykle przechodzi do fazy bogatej w detergent, ale dopiero po
traktowaniu fosfolipazą C - do fazy o niskiej zawartości detergentu lub do fazy wodnej.
40
[0061] Stąd odnośnik np. do “sHASEGP” obejmuje wszystkie glikoproteiny kodowane przez gen dla
rodziny sHASEGP, włączając w to, lecz nie tylko, ludzką sHASEGP, mysią sHASEGP, równoważne
cząsteczki otrzymane z jakiegokolwiek innego źródła, otrzymane syntetycznie lub wykazujące taką
samą aktywność. Sekwencje kodujących cząsteczek kwasów nukleinowych i kodowanych
aminokwasów przykładowych sHASEGP i/lub ich domen przedstawiono np. w sekwencji ID. SEKW.
Nr 4. Termin ten obejmuje także sHASEGP, w której dokonano podstawienia aminokwasów, nie
zmieniającego znacząco aktywności, a także warianty splicingowe sHASEGP. Odpowiednie
5
podstawienia, z uwzględnieniem lub tez pominięciem konserwatywnych aminokwasów, są znane
specjalistom w danej dziedzinie i mogą być przeprowadzone bez zmiany aktywności otrzymanej w
rezultacie cząsteczki.
[0062] W rozumieniu niniejszego dokumentu każde odwołanie do terminu „sHASEGP” w treści
niniejszego dokumentu obejmuje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej zawartej w sekwencji ID.
10
SEKW. Nr 1 lub sekwencję w 91% homologiczną do sekwencji aminokwasowej przedstawionej w
sekwencji ID. SEKW. Nr 1.
[0063] W szczególności ujawniony jest polipeptyd sHASEGP z domenami o aktywności hialuronidazy,
jak przedstawiono w sekwencji ID. SEKW. Nr 4. Polipeptyd ten występuje w formie jedno- lub
dwuniciowej. Wynalazek dotyczy również jego mniejszych części w dalszym ciągu wykazujących
15
aktywność hialuronidazy. Domeny o aktywności hialuronidazy, pochodzące z sHASEGP, różnią się
wielkością i składem chemicznym, w tym insercjami i delecjami w pętli domeny powierzchniowej.
Dlatego, dla potrzeb niniejszego dokumentu, domena katalityczna jest częścią sHASEGP, jak tu
zdefiniowano i jest homologiczna do domeny innych podobnych do hialuronidazy sekwencji takich jak
HYAL1, HYAL2, HYAL3 wcześniej zidentyfikowanych. Nie stwierdzono jednakże, aby izolowana
20
jednoniciowa forma domeny o aktywności hialuronidazy może być funkcjonalnie aktywna w testach in
vitro. Reszty asparaginianu i glutaminianu niezbędne dla aktywności są obecne w motywach
konserwatywnych.
[0064] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „domena rozpuszczalnej formy sHASEGP o
aktywności hialuronidazy” oznacza domenę pochodzącą z sHASEGP o aktywności β(1,4)
25
endoglukozaminidazy, która wykazuje aktywność hialuronidazy w obojętnym pH, jest rozpuszczalna w
opisanych warunkach, homologiczna oraz podobna strukturalnie do domen rodziny hialuronidaz o
aktywności glikozylo-hydrolazowej, zawiera jednak dodatkowe sekwencje na końcu karboksylowym,
niezbędne dla aktywności w obojętnym pH. Jest to zatem możliwie najmniejsza część domeny, która
wykazuje aktywność hialuronidazy, jak ustalono w standardowych testach in vitro i pozostaje w formie
30
rozpuszczalnej. Wynalazek obejmuje wspomniane domeny o aktywności hialuronidazy i ich
katalitycznie aktywne części. Wynalazek obejmuje także skróconą część domeny o aktywności
hialuronidazy, zawierającą możliwie najmniejszy jej fragment, który jako pojedynczy łańcuch posiada
aktywność katalityczną.
[0065] Określenie „domena o aktywności hialuronidazy sHASEGP”, kiedykolwiek w niniejszym
35
dokumencie przywołane, obejmuje co najmniej jeden, wszystkie lub ich dowolną kombinację bądź
część katalitycznie aktywną N-glikozylowanego polipeptydu, który zawiera sekwencję aminokwasową
przedstawioną w sekwencji ID. SEKW. Nr 1, a także wszystkie lub dowolną kombinację lub część
katalitycznie aktywną polipeptydu kodowanego przez sekwencję nukleotydów hybrydyzujących, w
warunkach
40
nisko,
umiarkowanie
lub
wysoko
rygorystycznych
do
sekwencji
nukleotydów
przedstawionej w ID. SEKW. Nr 6, wszystkie lub dowolną kombinację bądź część katalitycznie
aktywną polipeptydu, który zawiera sekwencję aminokwasów przedstawioną w sekwencji ID. SEKW.
Nr 1, wszystkie lub dowolną kombinację bądź część katalitycznie aktywną polipeptydu, który zawiera
sekwencję aminokwasową wykazującą przynajmniej około 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,
85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99%
identyczności do sekwencji aminokwasowej przedstawionej w sekwencji ID. SEKW. Nr 1, i/lub
domeny o aktywności hialuronidazy polipeptydu kodowanego przez warianty splicingowe sHASEGP.
5
[0066] Stąd dla potrzeb niniejszego dokumentu określenie „domena o aktywności hialuronidazy”,
zgodnie z przedstawiona definicja jest częścią sHASEGP i jest homologiczna do domeny innych
glikoprotein sHASEGP. W obrębie szeroko pojętej rodziny hialuronidaz domeny katalityczne
sHASEGP są pod względem sekwencji aminokwasowej w dużej mierze do siebie podobne. Reszty
Asp i Glu, niezbędne dla aktywności, są obecne w motywach konserwatywnych.
10
[0067] Przez określenie “forma aktywna” rozumie się formę aktywną in vivo i/lub in vitro. Jak opisano
w niniejszym dokumencie domena o aktywności hialuronidazy może także występować jako
rozpuszczalne białko sekrecyjne. W niniejszym dokumencie pokazano, że przynajmniej w warunkach
in vitro formy o pojedynczym łańcuchu sHASEGP i domeny katalityczne lub ich części enzymatycznie
aktywne (zwykle skrócone fragmenty C-końcowe) wykazują aktywność hialuronidazy. W związku z
15
tym wynalazek dostarcza izolowanych postaci domen o aktywności hialuronidazy sHASEGP i ich
zastosowania w testach przesiewowych leków in vitro, służących do identyfikacji czynników
modulujących aktywność wspomnianych domen.
[0068] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „domena sHASEGP aktywna katalitycznie”
oznacza aktywną w obojętnym pH domenę endoglukozaminidazy jak zdefiniowano w warunkach in
20
vitro wykorzystując do tego celu substraty glikozaminoglikanowe.
[0069] Grupa cząsteczek sHASEGP, będąca przedmiotem zainteresowania, obejmuje hialuronidazy,
które w warunkach in vivo i in vitro wykazują aktywność względem siarczanów chondroityny oraz
proteoglikanów (CSPG's), w skład których wchodzą cząsteczki siarczanu chondroityny a także te
hialuronidazy, które wykazują aktywność względem hialuronianu. W rozumieniu niniejszego
25
dokumentu ludzka sHASEGP jest kodowana przez kwas nukleinowy, taki jak DNA obecny w genomie
ludzkim, włącznie ze wszystkimi wariantami allelicznymi i wariantami konserwatywnymi pod
warunkiem, że nie są one spotykane u innych ssaków.
[0070] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „kwas nukleinowy kodujący domenę o
aktywności hialuronidazy lub jej katalitycznie aktywną domenę sHASEGP” jest rozumiane jako
30
oznaczające kwas nukleinowy kodujący wyłącznie wymieniony pojedynczy łańcuch domeny o
aktywności hialuronidazy lub jej aktywną katalitycznie część, lecz nie części sąsiadujące w obrębie
sHASEGP jako sąsiadujące sekwencje.
[0071] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin “schorzenie” lub “zaburzenie” oznacza stan
patologiczny w organizmie będący skutkiem np. infekcji lub defektu genetycznego, opisany
35
rozpoznawalnymi objawami.
[0072] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „warianty splicingowe” oznacza wariant uzyskany
w wyniku różnicującej obróbki pierwotnego transkryptu genomowego kwasu nukleinowego, tak jak
DNA, czego rezultatem jest więcej niż jeden typ mRNA. Wynalazek dostarcza niniejszym wariantów
splicingowych sHASEGP.
40
[0073] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „domena o aktywności hialuronidazy białka
sHASEGP” oznacza domenę o aktywności hialuronidazy białka sHASEGP, która wykazuje aktywność
endoglukozaminidazy w obojętnym pH. Tak więc jest to minimalny fragment białka, który wykazuje
aktywność endoglukozaminidazy, jak ustalono w standardowych testach in vitro. Przykładowa domena
o aktywności hialuronidazy obejmuje przynajmniej fragment sekwencji aminokwasowej przedstawionej
w sekwencji ID. SEKW. Nr 4, który jest co najmniej wystarczającej długości by wykazywać aktywność
endoglukozaminidazy.
5
[0074] Wynalazek obejmuje cząsteczki kwasów nukleinowych, które kodują polipeptyd posiadający
aktywność endoglukozaminidazy w testach hialuronidazowych in vitro i który wykazuje co najmniej
70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%,
95%, 96%, 97%, 98% lub 99% homologii do pełnej długości polipeptydu będącego domeną o
aktywności hialuronidazy polipeptydu sHASEGP, lub który hybrydyzuje w 100% lub co najmniej w
10
70%, 80% lub 90% do kwasów nukleinowych, które kodują domenę o aktywności hialuronidazy, w
szczególności w warunkach umiarkowanie rygorystycznych lub ogólnie wysoko rygorystycznych.
[0075] Dla domeny o aktywności hialuronidazy, reszty na N-końcu mogą być krytyczne ale nie
wystarczające dla aktywności. W niniejszym dokumencie pokazano, że domena o aktywności
hialuronidazy z sHASEGP jest katalitycznie aktywna. Zatem domena o aktywności hialuronidazy
15
ogólnie do utrzymania aktywności wymaga obecności N-końcowych aminokwasów. C-koniec może
być skrócony aż do ostatniej Cys, ale do optymalnej aktywności wymagana jest obecność kilku
dodatkowych aminokwasów. Liczbę aminokwasów, które można usunąć, określa się doświadczalnie
testując polipeptydy o aktywności hialuronidazy in vitro w testach mierzących aktywność katalityczną.
[0076] Zatem wynalazek dotyczy mniejszych fragmentów domen hialuronidazowych, w szczególności
20
domen w formie pojedynczego łańcucha, które zachowały aktywność hialuronidazy. Takie mniejsze
wersje ogólnie są skrócone o C-koniec domeny o aktywności hialuronidazy. Domeny o aktywności
hialuronidazy różnią się wielkością i składem chemicznym, w tym insercjami i delecjami w pętli
powierzchniowej. Domeny te wykazują cechy struktury konserwatywnej, w tym co najmniej jedną
cechę strukturalną, taką jak donor protonów i/lub inne cechy domeny endoglukozaminidaz o
25
aktywności hialuronidazy. Dlatego dla potrzeb niniejszego dokumentu domena hialuronidazowa jest
definiowana jako fragmentem sHASEGP w formie pojedynczego łańcucha, jak tu zdefiniowano, jest
homologiczna i podobna strukturalnie oraz posiada podobny czas retencji do sekwencji domeny o
aktywności hialuronidazy lub innych podobnych sekwencji. Glikoproteina ta, jako pojedynczy łańcuch,
wykazuje aktywność hialuronidazy.
30
[0077] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „ homologia” oznacza identyczność sekwencji
kwasu nukleinowego większą niż około 25%, taką jak 25% 40%, 60%, 70%, 80%, 90% lub 95%. W
razie potrzeby procent homologii zostanie określony. Terminy “homologia” i “identyczność” są często
stosowane zamiennie. Ogólnie sekwencje są przyrównywane w taki sposób, żeby otrzymać jak
najwyższy stopień dopasowania (patrz np. : Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford
35
University Press, New York, 1988; Biocomputing: and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic
Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part/, Griffin, A. M., and Griffin, H. G.,
eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G.,
Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M
Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) et al. (1988) Slam J Applied Math 48] : 1073).
40
[0078] Liczba konserwatywnych aminokwasów jest wyznaczana przez porównywanie sekwencji w
standardowych programach, według standardowych algorytmów z zastosowaniem parametru tzw.
przerwy ustawionego indywidualnie przez producenta programu. Znacząco homologiczne cząsteczki
kwasów nukleinowych hybrydyzowałyby zazwyczaj w warunkach umiarkowanie rygorystycznych lub
wysoko rygorystycznych w 100% lub 70%, 80% 90% pełnej długości cząsteczki będącej przedmiotem
zainteresowania. Wynalazek obejmuje również cząsteczki kwasów nukleinowych o kodonach
zdegenerowanych w miejscu kodonów znajdujących się w obrębie hybrydyzującej cząsteczki kwasu
5
nukleinowego.
[0079] To, czy jakiekolwiek cząsteczki kwasu nukleinowego posiadają sekwencje nukleotydów, które
są przynajmniej w np. 80%, 85%,90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% „identyczne” można określić
przy użyciu algorytmów programów komputerowych takich jak program „FASTA”, stosując domyślne
parametry jak w Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444), inne programy zawierają
10
pakiet GCG (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTN, FASTA (Atschul,
[S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,]
Academic Press, San Diego, 1994, and [CARILLO ETA/.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073).
Przykładowo do wyznaczenia identyczności może być użyty BLAST, program bazy danych z National
Center for Biotechnology Information. Inne komercyjne lub publicznie dostępne programy to
15
DNASTAR "MEGALIGN" PROGRAM (Madison, WI) i program GAP (University of Wisconsin Genetics
Computer Group (UWG) (Madison WI)). Procent homologii lub identyczności białek i/lub kwasów
nukleinowych może być wyznaczony np. porównując sekwencje w programie GAP jak w Needleman
et al. (1970), J Mol Biol. 48: 443, poprawione przez Smith and Waterman Adv. Appl. Math (1981)
2:482). W skrócie program GAP definiuje podobieństwo jako liczbę zestawionych ze sobą podobnych
20
symboli (np. nukleotydów lub aminokwasów), podzieloną przez całkowitą liczbę symboli w krótszej z
porównywanych sekwencji. Domyślne parametry programu GAP obejmują: (1) macierz jednostkową
(wynik 1 oznacza identyczność, wynik 0 oznacza brak identyczności) i macierz średnioważoną w
Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745, jak opisano w Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of
Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2)
25
koszt przerwania ciągłości sekwencji 3.0 dla każdej przerwy i dodatkowy koszt przerwania ciągłości
sekwencji 0,1 dla każdego symbolu w każdej przerwie; (3) brak kosztów przerwania ciągłości
sekwencji dla przerw na końcach sekwencji. Dlatego, w rozumieniu niniejszego dokumentu, termin”
identyczność” oznacza porównanie analizowanego i referencyjnego polipeptydu lub polinukleotydu.
[0080] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin co najmniej “ w 90% identyczny z” oznacza
30
procent identyczności w przedziale od 99 do 99,99 w odniesieniu do referencyjnych polipeptydów.
Identyczność na poziomie 90% lub wyższym wskazuje na to, że np. analizowana i referencyjna
cząsteczka polinukleotydowa o długości 100 aminokwasów zostały ze sobą porównane i nie więcej niż
10% (tj. 10 spośród 100) aminokwasów w analizowanym polipeptydzie różni się od aminokwasów w
polipeptydzie
35
referencyjnym.
Podobne
porównania
mogą
zostać
przeprowadzone
między
analizowanymi i referencyjnymi polinukleotydami. Różnice mogą oznaczać obecność przypadkowo
rozproszonych na całej długości cząsteczki mutacji punktowych lub skupisk mutacji o zmiennej
długości do maksymalnej dozwolonej długości np. 10/100 aminokwasów innych niż w cząsteczce
referencyjnej (około 90% identyczności). Różnice definiuje się jako substytucje bądź delecje kwasów
nukleinowych lub aminokwasów. Na poziomie homologii lub identyczności powyżej około 85%-90%
40
wynik nie powinien zależeć od użytego oprogramowania i zestawu parametrów dotyczących kosztów
przerwania ciągłości sekwencji. Tak wysoki stopień identyczności może być też bez trudu oszacowany
bez użycia programu.
[0081] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „primer” oznacza oligonukleotyd zawierający dwa
lub więcej dezoksyrybonukleotydów lub rybonukleotydów, zazwyczaj więcej niż trzy, od których
inicjowana jest synteza produktu będącego przedłużeniem primera. Warunki eksperymentalne
sprzyjające
5
syntezie
obejmują
obecność
nukleozydów
trójfosforanowych
i
czynników
odpowiedzialnych za polimeryzację oraz wydłużanie, takich jak polimeraza DNA, odpowiedni bufor,
temperatura i pH.
[0082] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „zwierzęta” obejmuje dowolne zwierzęta takie jak,
lecz nie tylko, kozy, krowy, jelenia, owcę, gryzonie, świnię i człowieka. Określenie „zwierzęta inne niż
człowiek” oznacza objętą wynalazkiem grupę zwierząt z wykluczeniem człowieka. Cząsteczki
10
sHASEGP, będące przedmiotem niniejszego wynalazku, pochodzą z dowolnego źródła zwierzęcego,
roślinnego, od organizmów prokariotycznych czy grzybów. Większość sHASEGP pochodzi ze świata
zwierząt, w tym z organizmów ssaków.
[0083] W rozumieniu niniejszego wynalazku terapia genowa obejmuje transfer heterologicznego
kwasu nukleinowego, takiego jak DNA, do określonych komórek - komórek docelowych tj. ssaczych, a
15
w szczególności ludzkich z nieprawidłowościami w funkcjonowaniu lub w stanie, który wymaga
zastosowania takiej terapii. Kwas nukleinowy, jak DNA, ulega ekspresji, w wyniku której produkowany
jest czynnik terapeutyczny.
[0084] Alternatywnie heterologiczny kwas nukleinowy, taki jak DNA, może w pewien sposób wywierać
wpływ na ekspresję DNA, który koduje czynnik terapeutyczny, może też kodować produkt, taki jak
20
białko lub RNA, który w pewien sposób wpływa pośrednio lub bezpośrednio na ekspresję czynnika
terapeutycznego. Terapia genowa może być także stosowana w celu dostarczenia kwasu
nukleinowego kodującego produkt genu, który ma zastąpić gen defektywny lub uzupełniać niedobór
produktu genu produkowanego przez komórki ssaków lub komórki, do których został wprowadzony.
Wprowadzony kwas nukleinowy może kodować substancję terapeutyczną, taką jak inhibitor czynnika
25
wzrostu, TNF lub jego inhibitor, taki jak jego receptor, który zazwyczaj nie jest produkowany w
ssaczych komórkach gospodarza lub jest produkowany, lecz w ilościach lub w czasie nieodpowiednim
dla uzyskania efektu terapeutycznego. Heterologiczny kwas nukleinowy, taki jak DNA, kodujący
produkt terapeutyczny, może być modyfikowany przed wprowadzeniem do komórek chorego
gospodarza w celu wzmocnienia ekspresji lub innego rodzaju zmiany produktu lub jego ekspresji.
30
Terapia genowa może także obejmować dostarczania inhibitorów, represorów lub modulatorów
ekspresji genów.
[0085] W rozumieniu niniejszego wynalazku określenie „heterologiczny kwas nukleinowy” to kwas
nukleinowy, (jeżeli DNA koduje RNA i białka), który nie jest naturalnie wytwarzany in vivo przez
komórki, w których jest ekspresjonowany lub na które wywiera wpływ albo w których koduje
35
mediatory, zmieniające ekspresję endogennego kwasu nukleinowego, jak DNA, wpływając na
transkrypcję, translację lub inne procesy biochemiczne. Heterologiczny kwas nukleinowy może
oznaczać też obcy kwas nukleinowy, taki jak DNA. Dowolny kwas nukleinowy, taki jak DNA, który
byłby uznany przez specjalistę w dziedzinie za heterologiczny lub obcy dla komórki, w której podlega
ekspresji, jest tu objęty terminem " heterologiczny kwas nukleinowy”. Heterologiczny kwas nukleinowy
40
obejmuje egzogennie wprowadzony DNA, który jest ekspresjonowany endogennie. Przykładami
heterologicznego DNA są, lecz nie tylko, kwasy nukleinowe, które kodują wykrywalne białka
markerowe, takie jak białka odpowiedzialne za oporność na leki, kwasy nukleinowe kodujące
substancje czynne takie jak środki przeciwnowotworowe, enzymy, hormony i kwasy nukleinowe, takie
jak DNA, które kodują inne typy białek, takie jak przeciwciała. Przeciwciała kodowane przez
heterologiczne kwasy nukleinowe mogą być wydzielane lub ekspresjonowane na powierzchni
komórki, do której wprowadzono wspomniany heterologiczny kwas nukleinowy.
5
[0086] Ogólnie heterologiczny kwas nukleinowy, otrzymany w sposób sztuczny lub z innej komórki, nie
jest endogenny dla komórki, do której został wprowadzony.
[0087] Ogólnie, lecz niekoniecznie, taki kwas nukleinowy koduje RNA i białka, zazwyczaj nie
wytwarzane przez komórkę, która je ekspresjonuje.
[0088] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „produkt terapeutycznie skuteczny” to produkt
10
kodowany przez heterologiczny kwas nukleinowy, zwykle DNA, który, po wprowadzeniu do komórki
gospodarza ,ulega ekspresji i w rezultacie łagodzi, eliminuje i leczy objawy schorzeń wrodzonych i
nabytych.
[0089] W rozumieniu niniejszego dokumentu stwierdzenie „glikoproteina składa się w głównej mierze z
domeny o aktywności hialuronidazy” oznacza, że jedyną częścią polipeptydu sHASEGP jest domena
15
o aktywności hialuronidazy lub jej fragment katalitycznie aktywny. Opcjonalnie i ogólnie polipeptyd
zawiera dodatkowe sekwencje aminokwasowe nie pochodzące z cząsteczki sHASEGP.
[0090] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „domena” oznacza część cząsteczki np.
glikoprotein lub kodujących kwasów nukleinowych, które strukturalnie i/lub funkcjonalnie odróżniają się
od innych części cząsteczki.
20
[0091] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „hialuronidazy” to enzymy katalizujące hydrolizę
glikozaminoglikanów.
[0092] Dla uściślenia, termin "hialuronidaza" oznacza wszystkie formy hialuronidazy, a szczególne jej
formy specjalnie oznaczone. Dla celów niniejszego dokumentu, domena o aktywności hialuronidazy
zawiera zarówno formę błonową sHASEGP jak i jej formę rozpuszczalną.
25
[0093] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin "kwasy nukleinowe" obejmuje DNA, RNA i ich
analogi, w tym kwas peptydonukleinowy (PNA) i mieszaninę wymienionych elementów. Kwas
nukleinowy może być jedno- lub dwuniciowy. W odniesieniu do sond i primerów, opcjonalnie
znakowanych wykrywalnym znacznikiem, wynalazek obejmuje fluorescencyjnie lub radioaktywnie
znakowane jednoniciowe cząsteczki. Cząsteczki te mają zazwyczaj taką długość, że rozpoznawana
30
przez nie sekwencja docelowa w przeszukiwanej bibliotece lub w czasie hybrydyzacji jest
statystycznie unikalna lub występuje w małej liczbie kopii (zazwyczaj mniej niż 5, ogólnie mniej niż 3).
Ogólnie sonda lub primer zawierają co najmniej 14, 16 lub 30 sąsiadujących ze sobą nukleotydów
(ang. contiguous of sequence) komplementarnych do genu będącego przedmiotem zainteresowania
lub identycznych jak we wspomnianym genie. Sondy i primery mogą mieć długość 10, 20, 30, 50, 100
35
lub więcej nukleotydów.
[0094] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „kwas nukleinowy kodujący fragment lub
część sHASEGP” oznacza kwas nukleinowy kodujący tylko wymieniony fragment lub część
sHASEGP, lecz nie kodujący innych sąsiadujących części sHASEGP.
[0095] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „funkcjonalne wiązanie heterologicznego
40
kwasu nukleinowego do sekwencji regulatorowych lub efektorowych nukleotydów takich jak
promotory, enhansery, miejsca zatrzymania translacji i transkrypcji i inne sekwencje sygnałowe”
oznacza zależność między kwasem nukleinowym, takim jak DNA, i wymienioną sekwencją
nukleotydową. Przykładem może być funkcjonalne połączenie heterologicznego DNA z promotorem,
oznaczające fizyczny związek między DNA a promotorem. W wyniku wspomnianej zależności
transkrypcja takiego DNA jest inicjowana przez polimerazę RNA od promotora, która specyficznie
rozpoznaje, wiąże się i przepisuje DNA. W celu optymalizacji ekspresji i /lub transkrypcji in vitro
5
niezbędne może być usunięcie, dodanie lub zmiana 5' nietranskrybowanej części DNA klonów celem
eliminacji potencjalnie nieprawidłowej inicjacji translacji ( tj. kodonów start) lub innych sekwencji, które
zaburzają lub obniżają ekspresję, zarówno na poziomie transkrypcji jak i translacji. Zamiennie w
pozycji 5' od kodonu start można wprowadzić miejsca wiązania rybosomów (patrz np. Kozak J. Biol.
Chem. 266: 19867- 19870 (1991) i w ten sposób wzmacniać ekspresję. Potrzeba takiej modyfikacji
10
może być ustalona doświadczalnie.
[0096] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „sekwencja komplementarna” co najmniej do
części RNA, w odniesieniu do antysensownych oligonukleotydów, oznacza sekwencję o takiej
komplementarności, która wystarczy aby hybrydyzować ze wspomnianym RNA, ogólnie w
umiarkowanie rygorystycznych warunkach hybrydyzacji lub w warunkach wysoko rygorystycznych,
15
tworząc stabilne dwuniciowe kompleksy. W przypadku dwuniciowych nukleotydów antysensownych
dla sHASEGP, testować można zarówno pojedynczą nić dupleksu DNA (lub dsRNA) jak i tworzenie
potrójnych kompleksów. Zdolność do hybrydyzacji zależy od stopnia komplementarności i długości
antysensownego kwasu nukleinowego. Ogólnie im dłuższy jest hybrydyzujący kwas nukleinowy, tym
więcej może zawierać zasad nie pasujących do RNA kodującego sHASEGP i mimo to może tworzyć
20
stabilny dwuniciowy (lub trójniciowy, co może się zdarzyć) kompleks. Specjalista może ustalić
akceptowalną ilość przypadków niedopasowania hybrydyzowanego kompleksu stosując standardowe
procedury do wyznaczania temperatury topnienia.
[0097] Dla celów niniejszego zgłoszenia substytucję aminokwasu można przeprowadzić w dowolnej
sHASEGP i domenie o aktywności hialuronidazy, pod warunkiem jednak, że nie wpłynie to na
25
aktywność otrzymanego w rezultacie białka. Podstawienie aminokwasu, którego dotyczy wynalazek,
obejmuje substytucję konserwatywną, która nie wyklucza aktywności proteolitycznej, tak jak
przedstawiona w Tabeli 1. Jak opisano w niniejszym dokumencie substytucje, które zmieniają
właściwości białek, takie jak usunięcie miejsc trawienia i innych miejsc są także przedmiotem
wynalazku. Takie substytucje są ogólnie niekonserwatywne, ale mogą być szybko i z powodzeniem
30
przeprowadzone przez specjalistę w danej dziedzinie.
[0098] Odpowiednie konserwatywne substytucje aminokwasów są znane specjalistom i mogą być
przeprowadzane bez zmiany aktywności biologicznej, np. aktywności enzymatycznej otrzymanej w
wyniku substytucji cząsteczki. Specjaliści rozumieją, że ogólnie pojedyncze podstawienie aminokwasu
w mało istotnym regionie polipeptydu nie zmienia znacząco biologicznej aktywności (patrz np. Watson
35
et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224).
Definicja ta obejmuje także katalitycznie aktywny fragment sHASEGP, a w szczególności pojedynczy
łańcuch
części
hialuronidazy.
Przykładowe
konserwatywne
podstawienia
aminokwasów
są
przeprowadzone według Tabeli 1 jak następuje:
[0099] Tabela 1 Oryginalna reszta aminokwasowa Substytucja reszty konserwatywnej Ala (A) Gly;
40
Ser, Abu Arg (R) Lys, om Asn (N) Gln ; His Cys (C) Ser Gin (Q) Asn Glu (E) ASP Gly (G) Ala ; Pro His
(H) Asn; Gin Ile (I) Leu; Val; Met; Nle ; Nva Leu (L); Val; Met; Nle ; Nv Lys (K) Arg; Gin ; Glu Met (M)
Leu; Tyr; Ile ; NLe Val ornityna Lys; Arg Phe (F) Met; Leu; Tyr Ser (S) Thr Thr (T) Ser Trp (W) Tyr Tyr
(Y) Trp; Phe Val (V) ILE; Leu; Met; Nle, Nv. Inne substytucje są także dozwolone i mogą być ustalone
metodą doświadczalną lub przeprowadzone według znanych już substytucji konserwatywnych.
[0100] W rozumieniu niniejszego dokumentu Abu to kwas 2-aminobutanowy; Orn to ornityna. W
rozumieniu niniejszego dokumentu aminokwasy występujące w rożnych, zamieszczonych w
5
niniejszym dokumencie sekwencjach, są identyfikowane według dobrze znanych trójliterowych lub
jednoliterowych skrótów. Nukleotydy występujące w różnych fragmentach DNA są oznaczone za
pomocą standardowego, rutynowo używanego w stanie techniki oznaczenia jednoliterowego.
[0101] W rozumieniu niniejszego dokumentu sonda lub primer, zaprojektowany w oparciu o
ujawnione w niniejszym dokumencie sekwencje, zawierają co najmniej 10, 14, zazwyczaj co najmniej
10
16 sąsiadujących ze sobą bez przerw nukleotydów sekwencji ID. SEKW. Nr 6, a sondy co najmniej
30, 50 lub 100 sąsiadujących ze sobą bez przerw nukleotydów sekwencji ID. SEKW. Nr 6. Długość
sondy lub primera do uzyskania specyficznej hybrydyzacji jest zależna od złożoności budowy genomu
będącego przedmiotem zainteresowania.
[0102] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „złagodzenie objawów konkretnego
15
zaburzenia poprzez podanie szczególnej kompozycji farmaceutycznej” oznacza jakiekolwiek
zmniejszenie, utrzymujące się lub czasowe, trwające lub przejściowe, które może być przypisane lub
powiązane z podaniem wspomnianej kompozycji.
[0103] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „antysensowne polinukleotydy” oznacza
sekwencje z syntetycznych zasad nukleotydowych komplementarnych do mRNA lub sensowną nić
20
dwuniciowego DNA. Mieszanie sensownych i antysensownych polinukleotydów w odpowiednich
warunkach prowadzi do związania się tych dwóch cząsteczek lub inaczej ich hybrydyzację. Kiedy
wspomniane polinukleotydy wiążą się (hybrydyzują) z mRNA, następuje zahamowanie syntezy białek
(translacji). Kiedy wspomniane polinukleotydy wiążą się do dwuniciowego DNA, zachodzi
zahamowanie syntezy RNA (transkrypcji).
25
[0104] W efekcie zahamowanie translacji/transkrypcji prowadzi do zahamowania syntezy białek
kodowanych przez nić antysensowną. Cząsteczka antysensownego kwasu nukleinowego zazwyczaj
zawiera wystarczającą liczbę nukleotydów, aby specyficznie wiązać się do docelowego DNA,
generalnie co najmniej 5 sąsiadujących nukleotydów, często przynajmniej 15 lub 16 lub 30
sąsiadujących nukleotydów lub zmodyfikowanych nukleotydów komplementarnych do kodującej
30
części cząsteczki kwasu nukleinowego, która koduje gen będący przedmiotem zainteresowania, np.
kwas nukleinowy kodujący pojedynczy łańcuch domeny hialuronidazy z sHASEGP.
[0105] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „macierz” oznacza paletę elementów, takich jak
przeciwciała, zawierającą trzy lub więcej elementów składowych. Macierz (ang. addressable array)
charakteryzuje się tym, że każdy jej element składowy jest identyfikowalny, zazwyczaj według pozycji
35
na stałym nośniku. Uogólniając zatem, elementy składowe macierzy są immobilizowane w odrębnych
identyfikowalnych pozycjach na powierzchni fazy stałej.
[0106] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „przeciwciała” oznacza immunoglobuliny,
naturalne albo częściowo czy też całkowicie syntetyczne, w tym dowolne ich pochodne, których
specyficzność wiązania jest taka jak specyficzność przeciwciał. Zatem przeciwciała obejmują dowolne
40
białko posiadające domenę wiążącą, która jest homologiczna lub w znacznym stopniu homologiczna
do immunoglobulinowej domeny wiążącej. Przeciwciała obejmują immunoglobuliny dowolnej klasy w
tym IgG, IgM, IgA, IgD i IgE.
[0107] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „ fragmenty przeciwciał” oznacza dowolne
pochodne przeciwciał o długości mniejszej niż długość pełnej cząsteczki przeciwciała, zachowujące
przynajmniej część zdolności wiązania pełnej cząsteczki przeciwciała. Przykłady fragmentów
przeciwciał obejmują, lecz nie tylko, Fab, Fab', F(AB)2, pojedynczy łańcuch FVS (SCFV), FV, dsFV
5
przeciwciało dwuspecyficzne (ang. diabody) i fragmenty Fd. Fragment może zawierać kilka łańcuchów
połączonych ze sobą np. mostkiem dwusiarczkowym. Ogólnie fragment przeciwciała zawiera co
najmniej około 50 aminokwasów, a zazwyczaj co najmniej 200 aminokwasów.
[0108] W rozumieniu niniejszego dokumentu fragment Fv składa się z jednego łańcucha ciężkiego i
jednej części zmiennej łańcucha lekkiego połączonych oddziaływaniami niekowalencyjnymi.
10
[0109] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „dsFV” oznacza Fv ze sztucznie wprowadzonym
mostkiem dwusiarczkowym.
[0110] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „fragment F (AB)2” oznacza fragment przeciwciała
powstały w wyniku trawienia immunoglobulin za pomocą pepsyny w pH 4.0-4.5. Fragment ten może
być ekspresjonowany jako białko rekombinowane celem wytworzenia odpowiadającego fragmentu.
15
[0111] W rozumieniu niniejszego dokumentu fragment Fab jest fragmentem przeciwciała powstałym w
wyniku trawienia immunoglobulin za pomocą papainy; może być ekspresjonowane jako białko
rekombinowane celem wygenerowania odpowiadającego fragmentu.
[0112] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „scFVs” oznacza fragment przeciwciała, który
zawiera zmienny łańcuch lekki V i zmienny łańcuch ciężki (VH) kowalencyjnie związany w dowolnej
20
kolejności przez łącznik polipeptydowy. Łącznik jest takiej długości, że dwie zmienne domeny są
połączone mostkiem nie stanowiąc dla siebie nawzajem przeszkody. Łączniki to reszty (Gly-Ser)n z
rozproszonymi w obrębie sekwencji Glu lub Lys dla zwiększenia rozpuszczalności.
[0113] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „humanizowane przeciwciała” oznacza
przeciwciała modyfikowane w taki sposób, by zawierały sekwencje aminokwasów pochodzące od
25
ludzi. Podawanie takich przeciwciał ludziom nie wywołuje odpowiedzi układu odpornościowego.
Sposoby preparacji takich przeciwciał są znane. Na przykład w celu wytworzenia wspomnianych
przeciwciał komórki hybrydomy, komórki prokariotyczne lub eukariotyczne jak E. coli lub CHO, które
ekspresjonują przeciwciała monoklonalne, są zmieniane technikami rekombinacji DNA tak, by
ekspresjonować przeciwciało o składzie aminokwasowym regionu stałego jak w przeciwciele ludzkim.
30
Do identyfikacji takich regionów służą programy komputerowe.
[0114] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „przeciwciała dwuspecyficzne” oznacza dimer
scFV, zwykle posiadający krótszy łącznik peptydowy niż ScFVs i ,ogólnie, dimeryzujący.
[0115]
W
rozumieniu
niniejszego
dokumentu
określenie
„wytwarzanie
z
zastosowaniem
rekombinantów” oznacza użycie metod rekombinowanego DNA, tj. użycie dobrze znanych metod
35
biologii molekularnej, do ekspresji białek kodowanych przez klonowane DNA.
[0116] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „oszacować” zakłada jakościowe i ilościowe
oznaczanie w sensie otrzymania absolutnej wartości dla aktywności sHASEGP lub jej domeny
obecnej w próbce a także w znaczeniu otrzymania wskaźnika, stosunku, odsetka, efektu
wskazującego na poziom aktywności. Oszacowanie może odbywać się pośrednio lub bezpośrednio, a
40
związki chemiczne w rzeczywistości wykrywane nie muszą być z oczywistych względów produktami
proteolizy, lecz mogą być na przykład pochodnymi lub innymi substancjami.
[0117] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „aktywność biologiczna” oznacza aktywności in
vivo związku chemicznego lub fizjologiczną odpowiedź, otrzymaną po podaniu in vivo związku
chemicznego, kompozycji lub innej mieszaniny. Wobec tego biologiczna aktywność obejmuje efekt
terapeutyczny i aktywność farmakologiczną takich związków chemicznych, kompozycji lub innej
5
mieszaniny. Aktywność biologiczna może być obserwowana przy użyciu zaprojektowanych do tego
celu systemów in vitro. Zatem dla celów niniejszego dokumentu aktywność biologiczna lucyferazy
odzwierciedla aktywność oksygenazy, w taki sposób, że w wyniku utleniania substratu emitowane jest
światło.
[0118] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „aktywność funkcjonalna” oznacza polipeptyd lub
10
jego część, która wykazuje jedną lub kilka aktywności związanych z cząsteczką białka o pełnej
długości.
[0119] Funkcjonalne aktywności obejmują, lecz nie tylko, aktywność biologiczną, katalityczną i
enzymatyczną, antygenowość (zdolność do wiązania lub kompetycji z polipeptydem o wiązanie do
przeciwciała skierowanego przeciwko temu polipeptydowi), immunogenność, zdolność do tworzenia
15
multimerów, zdolność do specyficznego wiązania z receptorem lub ligandem polipeptydu.
[0120] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „koniugat” oznacza związki chemiczne, będące
przedmiotem niniejszego wynalazku, które zawierają jedną lub więcej cząsteczek sHASEGP, w tym
sHASEGP, a w szczególności pojedynczy łańcuch jej domeny o aktywności hialuronidazy i jeden lub
więcej czynników kierujących. Koniugaty te obejmują takie cząsteczki, które wytworzono metodą
20
rekombinowanego białka fuzyjnego i takie, które wytworzono metodami chemicznymi jak poprzez
chemiczne połączenie przez np. grupy sulfhydrylowe i takie cząsteczki, które wytworzono inną
dowolną metodą, gdzie przynajmniej jedna sHASEGP lub jej domena jest związana bezpośrednio lub
pośrednio poprzez łącznik (łączniki) do czynnika kierującego.
[0121] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „czynnik kierujący” jest dowolną cząsteczką białka
25
lub jego częścią czynną, zapewniającą specyficzne wiązanie koniugatu do receptora na powierzchni
komórki, która może internalizować koniugat części sHASEGP. Czynnik kierujący może także
wspomagać lub ułatwiać np. izolację lub oczyszczanie na zasadzie powinowactwa koniugatu,
przyłączenia koniugatu do powierzchni lub detekcji koniugatu lub kompleksu zawierającego koniugat.
[0122] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „koniugat przeciwciała” oznacza koniugat w
30
którym czynnikiem kierującym jest przeciwciało.
[0123] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „pochodna” lub „analog” cząsteczki oznacza
część pochodzącą z cząsteczki lub z jej zmodyfikowanej wersji.
[0124] W rozumieniu niniejszego dokumentu wyrażenie „efektywna ilość związku chemicznego do
leczenia poszczególnych schorzeń” jest ilością wystarczającą do złagodzenia lub w pewien sposób
35
zredukowania objawów związanych z tym schorzeniem. Ilość taka może być podawana jako
pojedyncza dawka lub według ustalonego trybu postępowania, dzięki któremu jest efektywna.
Wspomniana ilość może doprowadzić do wyleczenie choroby, lecz zazwyczaj jest podawana po to by
złagodzić jej objawy. Często, aby uzyskać pożądany efekt złagodzenia symptomów niezbędne jest
wielokrotne podawanie związku chemicznego.
40
[0125] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „ równoważny” w odniesieniu do dwóch sekwencji
kwasów nukleinowych oznacza, że wskazane sekwencje kodują tą samą sekwencję aminokwasów lub
równoważne białko. Jeżeli termin „ równoważny” jest zastosowany w odniesieniu do dwóch białek lub
peptydów, oznacza to, że dwa białka lub peptydy posiadają w znacznym stopniu taką samą
sekwencję aminokwasową, różniącą się jedynie podstawieniami aminokwasów (konserwatywnych
lecz nie tylko, zmiany konserwatywne jak przedstawiono w Tabeli 1 powyżej), które nie wpływają
znacząco na aktywność lub funkcje białek lub peptydów. Jeżeli termin „ równoważny” odnosi się do
5
właściwości, wspomniana właściwość nie musi występować w takim samym stopniu (np. dwa peptydy
mogą wykazywać różny poziom tej samej aktywności enzymatycznej), ale aktywność ta jest
zazwyczaj w znacznym stopniu taka sama. Termin „komplementarny” w odniesieniu do dwóch
sekwencji nukleotydowych oznacza, że wspomniane dwie sekwencje nukleotydów są zdolne do
hybrydyzacji, zwykle przy mniej niż 25%, 15%, 5% lub 0% niedopasowanych par nukleotydów.
10
Procent komplementarności w razie potrzeby zostanie oznaczony. Zazwyczaj, w warunkach wysoko
rygorystycznych hybrydyzują dwie najbardziej do siebie komplementarne cząsteczki.
[0126] W rozumieniu niniejszego dokumentu czynnik modulujący aktywność protein, ekspresję genu
lub kwasu nukleinowego podnosi, obniża bądź zmienia aktywność białka lub w pewien sposób
zwiększa lub zmniejsza bądź zmienia ekspresję kwasu nukleinowego w komórce.
15
[0127] W rozumieniu niniejszego dokumentu wyrażenie „inhibitor aktywności sHASEGP” dotyczy
dowolnej substancji, która uniemożliwia lub obniża wytwarzanie, post-translacyjną(e) modyfikację(e),
dojrzewanie oraz lokalizację sHASEGP w błonie lub dowolną substancję, która zaburza lub obniża
wydajność proteolityczną, szczególnie w przypadku postaci pojedynczego łańcucha testowanego w
badaniach przesiewowych in vitro.
20
[0128] W rozumieniu niniejszego dokumentu wyrażenie „sposób leczenia lub zapobiegania chorobie
nowotworowej” oznacza, że sposób pozwala na zredukowanie, złagodzenie, zapobieżenie, przejście
w stan remisji lub utrzymanie w stanie remisji dowolnych objawów takich jak guz, jego przerzut,
unaczynienie guza i inne cechy charakterystyczne dla danej choroby. Oznacza to również, że
przejawy choroby nowotworowej i przerzuty mogą zostać wyeliminowane, zmniejszone lub można im
25
poprzez leczenie zapobiec. Przykłady znamion choroby zawierają, lecz nie tylko, niekontrolowaną
degradację błony podstawnej i przyległą macierz zewnątrzkomórkową, migrację, podział i organizację
komórek śródbłonka w struktury funkcjonalnych naczyń włosowatych o trwałości kapilar.
[0129] W rozumieniu niniejszego dokumentu farmaceutycznie dopuszczalne sole, estry i inne
pochodne koniugatów, obejmują dowolne sole, estry i pochodne, które potrafi bez trudu wytworzyć
30
specjalista w dziedzinie przy użyciu metod dla takiej derywatyzacji i które prowadzą do wytworzenia
związków chemicznych, które mogą być podawane zwierzętom lub ludziom bez znaczących efektów
toksycznych i które są w postaci proleku lub w postaci farmakologicznie aktywnej.
[0130] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „prolek” oznacza związek, który po podaniu in
vivo, jest metabolizowany lub w inny sposób przekształcany do biologicznie, farmakologicznie lub
35
leczniczo aktywnej formy związku chemicznego. Aby otrzymać prolek, farmakologicznie aktywny
związek chemiczny modyfikuje się do postaci, która uaktywnia się w pełni dopiero w chwili, gdy
ulegnie przemianom metabolicznym. Możliwe jest takie zaprojektowanie proleku, które pozwala na
zmianę stabilności metabolicznej lub parametrów transportu leku, neutralizację ubocznych efektów
toksycznych, polepszenie smak leku. Pozwala też wpłynąć na inne jego cechy lub właściwości.
40
Specjalista, z racji wiedzy na temat procesów farmakodynamicznych i metabolizmu leków in vivo, jest
w stanie zaprojektować prolek, jeżeli znany jest mu farmakologicznie aktywny związek chemiczny
(patrz Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New
York, pages 388-392).
[0131] W rozumieniu niniejszego dokumentu wyrażenie „lek zidentyfikowany metodą testów
przesiewowych” odnosi się do dowolnego związku chemicznego, który potencjalnie mógłby być użyty
5
jako terapeutyk lub jako wiodąca substancja wyjściowa (ang. lead compound) do zaprojektowania
terapeutyku. Do tego typu związków zalicza się małe cząsteczki, w tym organiczne związki
drobnocząsteczkowe, peptydy, peptydomimetyki, cząsteczki antysensowne lub dsRNA jak RNAi,
przeciwciała, fragmenty przeciwciał, przeciwciała rekombinowane i inne związki, które mogą służyć
jako potencjalne leki lub wiodące substancje wyjściowe.
10
[0132] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin peptydomimetyk” oznacza związek, który
naśladuje konformację i określone stereochemiczne cechy biologicznie aktywnej formy konkretnego
peptydu. Ogólnie peptydomimetyki projektuje się w taki sposób, aby móc naśladować pewne
pożądane cechy związku i wyeliminować cechy niepożądane, takie jak elastyczność, która prowadzi
do utraty biologicznie aktywnej konformacji i przerwania wiązania. Peptydomimetyki można wytworzyć
15
w oparciu o biologicznie aktywne związki, zastępując bioizosterami pewne grupy lub wiązania, które
przyczyniają się do występowania niepożądanych właściwości. Bioizostery są znane specjalistom w
danej dziedzinie. Przykładem jest metyleno-bioizoster CH2S, który zastępuje grupę amidową w
analogach enkefaliny (patrz np. Spatola (1983) pp. 267-357 in Chemistry and Biochemistry of Amino
Acids, Peptides and Proteins, Weistein, Ed. volume 7, Marcel Dekker, New York). Morfina, która może
20
być podawana doustnie, jest peptydomimetykiem peptydu endorfiny. Dla celów tego zgłoszenia
peptydy cykliczne są włączone w grupę peptydomimetyków.
[0133] W rozumieniu niniejszego dokumentu wyrażenie „region promotorowy lub część promotorowa”
oznacza odcinek DNA lub RNA, który kontroluje transkrypcję DNA lub RNA i z którymi jest
funkcjonalnie połączony. Region promotorowy zawiera specyficzną sekwencję, rozpoznawaną i
25
wiązaną przez polimerazę RNA, od której inicjowana jest transkrypcja.
[0134] Wspomniana część regionu promotorowego określana jest jako „promotor”. Ponadto region
promotorowy zawiera sekwencję, która moduluje rozpoznanie, wiązanie i inicjację transkrypcyjnej
aktywności polimerazy RNA. Tego typu sekwencje mogą regulować ekspresję genu na zasadzie cis
(ang. cis-acting element) lub trans (ang. trans-acting element). Promotor, zależnie od sposobu
30
regulacji, może być promotorem konstytutywnym lub regulowanym. Przykładowym promotorem dla
Procaryota w tym wynalazku jest bakteriofagowy promotor T7 i T3.
[0135] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „receptor” oznacza cząsteczkę wykazującą
powinowactwo do danego ligandu. Receptory mogą występować naturalnie lub w formie syntetycznej.
W stanie techniki mogą oznaczać anty-ligandy. W rozumieniu niniejszego dokumentu terminy
35
„receptor” i „anty-ligand” stosuje się zamiennie. Receptory mogą być stosowane w formie
niezmienionej lub jako agregaty z innego typu receptorami. Można je przyłączyć kowalencyjnie,
niekowalencyjnie w pośrednim lub bezpośrednim kontakcie fizycznym do wiążącego czynnika poprzez
specyficzną substancję wiążącą lub łącznik. Przykłady receptorów zawierają, lecz nie ograniczają się
do przeciwciał, internalizujących receptorów błonowych, przeciwciał monoklonalnych, surowic
40
odpornościowych skierowanych przeciwko determinantom antygenowym (zlokalizowanym na
powierzchni wirusów, komórek lub na innych powierzchniach), leków, polinukleotydów, kwasów
nukleinowych, peptydów, czynników, lektyn, cukrów, polisacharydów, komórek, błon komórkowych i
organelli komórkowych.
[0136] Przykłady receptorów i ich zastosowania obejmują, lecz nie tylko:
a) enzymy: pewną grupa białek transportowych lub enzymów niezbędnych dla przeżycia
5
mikroorganizmów, które mogłyby służyć jako „cel” w selekcji antybiotykami (ligandem);
b) przeciwciała: identyfikacja miejsc wiążących ligandy w obrębie cząsteczki przeciwciała, w
kombinacji z epitopem dla antygenu będącego przedmiotem zainteresowania; ustalenie sekwencji
naśladującej epitop antygenowy może prowadzić do stworzenia szczepionki, w której immunogen
opiera się na wspomnianej sekwencji lub prowadzi do podobnych czynników diagnostycznych lub
10
związków chemicznych przydatnych w leczeniu np. chorób autoimmunologicznych
c) kwasy nukleinowe: identyfikacja ligandu,takiego jak białko lub RNA, miejsc wiążących;
d) polipeptydy o aktywności katalitycznej: polimery w tym polipeptydy, które sprzyjają reakcji
chemicznej typu konwersja jednego lub wielu reagentów do jednego lub więcej produktów; ogólnie
takie polipeptydy zawierają miejsce wiązania specyficzne dla co najmniej jednego reagentu lub
15
produktu pośredniego reakcji oraz miejsce aktywne najbliższe miejscu wiązania, w którym możliwa
jest chemiczna modyfikacja związanego do niego reagenta (patrz np. U. S. Patent No. 5,215,899);
e) receptory hormonów: wyznaczenie ligandów, które wiążą receptor z wysokim powinowactwem
znajduje zastosowanie w zastępczych terapiach hormonalnych; np. identyfikacji ligandów :
wyznaczenie ligandów, które wiążą się do tego typu receptorów może prowadzić do opracowania
20
nowych leków kontrolujących ciśnienie krwi; f) receptory opiatowe: wyznaczenie ligandów wiążących
się do receptorów opiatów w mózgu znajduje zastosowanie w opracowaniu mniej uzależniających
zamienników dla morfiny i podobnych leków.
[0137] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „próbka” oznacza dowolny obiekt zawierający
analit, dla którego zostanie przeprowadzony test analityczny. Próbka może mieć charakter
25
biologiczny, jak w przypadku płynu fizjologicznego lub tkanki. Przykładem płynu fizjologicznego jest
mocz, krew, osocze, surowica, ślina, nasienie, stolec, flegma, płyn mózgowo-rdzeniowy, łzy, śluz,
sperma, wody płodowe i inne. Tkanki to zespoły komórek, zwykle określonego typu, występujące
razem z substancją międzykomórkową, która tworzy jeden z materiałów budulcowych w organizmie
człowieka, zwierzęcia, rośliny, bakterii, grzyba i w strukturze wirusa, włączając w to tkanki łączne,
30
nabłonkowe, mięśniowe i nerwowe. Przykładami tkanek biologicznych są także organy, guzy
nowotworowe, węzły chłonne, tętnice i pojedyncze komórki.
[0138] W rozumieniu niniejszego dokumentu rygorystyczność warunków hybrydyzacji jest określana
przez stopień niedopasowania nukleotydy ( ang. mismatch) w następujący sposób : 1) wysoka
rygorystyczność warunków : 0.1 x SSPE, 0.1 % SDS, 65°C 2) umiarkowana rygorystyczność
35
warunków : 0.2 x SSPE, 0.1 % SDS, 50°C 3) niska rygorystyczność warunków: 1.0 x SSPE, 0.1 %
SDS, 50°C. Specjalistom wiadomo, że etap odmywania selekcjonuje stabilne hybrydy oraz znany jest
skład SSPE (patrz np. , Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, in: Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, Cold spring Harbor Laboratory Press 1989 Vol 3, p. B. 13, patrz także wiele informatorów
opisujących powszechnie stosowane w laboratorium rozwiązania). SSPE to bufor fosforanowy o pH
40
7.4 i zawierający 0.18 NaCl. Co więcej specjalistom wiadomo, że stabilność hybryd jest zależna od
TmT, która jest funkcją stężenia jonów sodu i temperatury (Tm = 81.5° C-16.6 + 0.41 (% G+C)-
600/L)), zatem jedynymi parametrami krytycznymi dla stabilności hybrydy w trakcie etapu odmywania
są stężenie jonów sodu w SSPE (lub SSC) i temperatura.
[0139] Zrozumiałe jest, że równoważne rygorystyczne warunki mogą być uzyskane stosując zamienne
bufory, sole lub temperatury. Przykładem są, lecz nie tylko, metody, w których stosuje się warunki
5
nisko rygorystyczne jak następuje (patrz także Shilo and Weinberg, Proc. Natl. Acad Sci USA 78:
6789-6792 (1981)): membrany z DNA są wstępnie inkubowane przez 6 godzin w temperaturze 40oC w
roztworze zawierającym 35% formamid, 5x SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.1 % PVP,
0.1 % Ficoll 1% BSA, i 500ug/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia (10x) SSC, 1.5 M chlorku
sodu, 0.15 M cytrynianu sodu o pH 7).
10
[0140] Hybrydyzacja jest przeprowadzana w tym samym roztworze z następującymi modyfikacjami:
0.02% PVP, 0.02% Ficoll 0.2% BSA, 100VG/M DNA ze spermy, 10% (wt/obj) siarczan dekstranu i 520 X 106 cpm sonda znakowana 32P. Membrany są inkubowane w mieszaninie hybrydyzacyjnej przez
18-20 godzin w 40oC i następnie płukane przez 1,5 godziny w 550C w roztworze zawierającym 2X
SSC, 25 mM Tris-HCI (pH 7.4), 5 mM EDTA, i 0.1 % SDS. Roztwór myjący jest zastępowany świeżą
15
0
porcją, a inkubacja jest kontynuowana przez dodatkowe 1,5 godziny w temperaturze 60 C. Membrany
są osuszane i eksponowane na kliszy fotograficznej (autoradiografia). Jeżeli zachodzi taka
konieczność membrany są płukane trzeci raz w temperaturze 65-68oC i ponownie eksponowane na
kliszy fotograficznej. Inne warunki nisko rygorystyczne, które mogą być zastosowane są powszechnie
znane (np. wykorzystanie międzygatunkowej hybrydyzacji).
20
[0141] Za przykład mogą służyć, lecz nie tylko, metody, w których zastosowano warunki umiarkowanie
rygorystyczne w tym np., lecz nie tylko, metody w których zastosowano warunki umiarkowanie
rygorystyczne jak następuje: membrany z DNA są wstępnie inkubowane prze 6 godzin w 55oC w
roztworze 6x SSC, 5x roztwór Denharta, 0.5% SDS i 100ug/ml zdenaturowane DNA ze spermy
łososia. Hybrydyzacja jest przeprowadzana w tym samym roztworze i 5-20 x 106 sondy znakowanej
25
32
P. Membrany są inkubowane w mieszaninie hybrydyzacyjnej przez 18-20 godzin w temperaturze
55oC i następnie płukane dwukrotnie przez 30 minut w 60oC w roztworze zawierającym 1x SSC i 0.1%
SDS. Membrany są płukane i eksponowane na kliszy fotograficznej. Inne warunki umiarkowanie
rygorystyczne są powszechnie znane w stanie techniki. Płukanie membran jest przeprowadzane w
temperaturze 37oC przez 1 godzinę w roztworze zawierającym 2x SSC, 0.1 % SDS.
30
[0142] Przykładem nie zawężającym zakresu niniejszego wynalazku mogą być procedury stosujące
następujące wysoko rygorystyczne warunki: wstępna hybrydyzacja membran z DNA jest
o
przeprowadzana w przedziale czasowym 8 godzin-przez noc w temperaturze 65 C w buforze
złożonym z 6x SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, i
500 ug/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia. Membrany są hybrydyzowane przez 48 godzin
35
o
w temperaturze 65 C w mieszaninie prehybrydyzacyjnej zawierającej 100 ug/ml zdenaturowanego
DNA ze spermy łososia i sondę znakowaną 32P (5-20 x 106 CPM). Płukanie membran jest prowadzone
w temperaturze 37oC przez 1 godzinę w roztworze zawierającym 2x SSC, 0.01 % PVP, 0.01 % Ficoll, i
0.01 % BSA, a w kolejnym etapie, przed autoradiografią, w temperaturze 50oC przez 45 min. w 0.1x
SSC. Inne wysoko rygorystyczne warunki hybrydyzacji, które mogą być zastosowane, są powszechnie
40
znane w stanie techniki.
[0143] Określenie „ znacząco podobny” lub „w znaczącym stopniu homologiczny” lub termin „podobny”
specjaliści interpretują w różny sposób w zależności od kontekstu. Ogólnie określenie to oznacza co
najmniej 60% lub 70%, korzystnie oznacza co najmniej 80%, 85%, korzystniej co najmniej 90% i
najkorzystniej co najmniej 95% identyczności.
[0144] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „w znacznym stopniu identyczny z produktem”
oznacza „wystarczająco podobny”, tak więc właściwość będąca przedmiotem zainteresowania jest
5
wystarczająco niezmieniona, a znacząco identyczny produkt może zastąpić produkt pierwotny.
[0145] W rozumieniu niniejszego dokumentu wyrażenie „ zasadniczo oczyszczony” oznacza „na tyle
homogenny”, że wydaje się być wolny od łatwowykrywalnych zanieczyszczeń standardowymi
metodami takimi jak chromatografia cienkowarstwowa (TLC), elektroforeza w żelu i chromatografia
wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) stosowanymi przez specjalistów do oszacowania
10
takich zanieczyszczeń lub oczyszczenia w wystarczającym stopniu i na tyle, że dalsze oczyszczanie
nie zmieniłoby w sposób wykrywalny fizycznych i chemicznych właściwości takich jak enzymatyczna i
biologiczna aktywność substancji. Sposoby stosowane do oczyszczania związków są znane
specjalistom w dziedzinie. Chemicznie zasadniczo oczyszczony związek może być mimo to
mieszaniną stereoizomerów lub izomerów. W takim przypadku dalsze oczyszczanie mogłoby
15
podnieść specyficzną aktywność wspomnianego związku.
[0146] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „komórka docelowa” oznacza komórkę, która
ekspresjonuje sHASEGP in vivo.
[0147] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „substancja testowana (testowany związek
chemiczny)” oznacza chemicznie zdefiniowany związek (np. związek organiczny, związek
20
nieorganiczny,
związek
organiczny/nieorganiczny,
białka,
peptydy,
kwasy
nukleinowe,
oligonukleotydy, lipidy, polisacharydy, sacharydy lub hybrydy wymienionych cząsteczek takie jak
glikoproteiny, itd.) lub mieszaniny związków (np. biblioteki testowanych związków, naturalne ekstrakty
lub pożywki znad hodowli komórkowej, itd.), które wywierają wpływ na sHASEGP, a szczególnie
forma pojedynczego łańcucha, która zawiera domenę o aktywności hialuronidazy lub wystarczającą
25
dla utrzymania aktywności cześć tej domeny, jak wykazano metodami in vitro np. testem będącym
przedmiotem wynalazku.
[0148] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „ czynnik (środek) terapeutyczny”, „tryb
leczenia”,
„czynnik
chroniący
przed
promieniowaniem”
lub
„chemioterapeutyk”
oznacza
konwencjonalne leki i terapie w tym szczepionki, znane specjalistom. Czynniki stosowane w
30
radioterapii są także dobrze znane w stanie techniki.
[0149] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „ leczenie” oznacza dowolny sposób łagodzenia
objawów choroby, nieprawidłowości i schorzeń lub jakiejkolwiek w tym względzie korzystną dla
pacjenta zmianę.
[0150] Leczenie obejmuje także jakiekolwiek użycie farmaceutyku będącego przedmiotem niniejszego
35
wynalazku.
[0151] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „wektor (lub plazmid)” odnosi się do
poszczególnych elementów zastosowanych do wprowadzenia heterologicznego kwasu nukleinowego
do komórki w celu jego ekspresji i replikacji. Wektory zwykle pozostają w formie episomalnej, ale
mogą być zaprojektowane w ten sposób, by prowadziły do integracji genu lub jego części z
40
chromosomem
w
genomie.
Wynalazek
obejmuje
również
wektory,
które
są
sztucznymi
chromosomami, jak chromosom drożdżowy i ssaczy. Wybór i użycie takich nośników jest dobrze
znane specjalistom w dziedzinie. Wektor ekspresyjny obejmuje wektor zdolny do ekspresji DNA, który
jest funkcjonalnie połączony z sekwencjami regulatorowymi, takimi jak region promotorowy zdolny do
wydajnej ekspresji fragmentów DNA. Dlatego też termin „wektor ekspresyjny” oznacza konstrukty
rekombinowanego DNA lub RNA, takie jak plazmidy, fagi, rekombinowane wirusy i inne tego typu
wektory, które po wprowadzeniu do odpowiedniej komórki gospodarza mają zdolność ekspresji
5
klonowanego DNA. Odpowiednie wektory są dobrze znane specjalistom i obejmują takie, które są
replikowalne w komórkach eukariotycznych i/lub prokariotycznych i takie, które pozostają w formie
episomalnej lub takie, które integrują się z genomem gospodarza.
[0152] W rozumieniu niniejszego dokumentu wyrażenie „sekwencja wiążąca białka” oznacza
sekwencję białka lub peptydu zdolną do specyficznego wiązania do innej sekwencji białka lub
10
peptydu, a ogólnie, do zestawu sekwencji lub do określonej sekwencji białka lub peptydu.
[0153] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „znaczniki epitopów” oznacza krótki odcinek
aminokwasowy odpowiadający epitopowi służący do ułatwiania kolejnych biochemicznych i
immunologicznych testów białka lub peptydu ze znacznikiem dla epitopu, tzw. tagiem. Znakowanie
epitopu otrzymuje się włączając w odpowiednim wektorze ekspresyjnym sekwencję znacznika do
15
sekwencji kodującej białko. Białka o znakowanym epitopie mogą być oczyszczane na zasadzie
powinowactwa przy zastosowaniu wysoko specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko
wspomnianym znacznikom.
[0154] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „sekwencja wiążąca metal” ogólnie oznacza
sekwencję białka lub peptydu zdolną do specyficznego wiązania jonów metalu, do zestawu jonów
20
metali lub do jednego szczególnego jonu metalu.
[0155] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „kombinacja” oznacza dowolny związek między
dwoma lub więcej elementami.
[0156] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „kompozycja” oznacza dowolną mieszaninę.
Mieszanina może być w postaci wodnego lub innego rodzaju roztworu, zawiesiny, płynu, proszku i
25
pasty .
[0157] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „ciecz” oznacza jakikolwiek skład, który ma
zdolność przepływu. Stąd ciecze posiadają strukturę w formie półpłynnej, past, roztworów, mieszanin
wodnych, żeli, emulsji, kremów i innych struktur.
[0158] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „ ekstrakt komórkowy” oznacza frakcję
30
wypreparowaną z lizatu otrzymanego w wyniku lizy komórek lub inna metodą dezintegracji komórek.
[0159] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie czynnika jako „przypadkowo wybranego”
oznacza, że czynnik ten jest wybrany bez uwzględniania określonej sekwencji zaangażowanej w
wiązanie samego białka lub białka wraz z związanymi z nim substratami, czynnikami wiążącymi itp.
Przykładem wybrania czynników w sposób przypadkowy jest wykorzystanie do tego celu biblioteki
35
chemicznej lub peptydowych bibliotek kombinatoryjnych lub hodowli w bulionie odżywczym z
czynnikiem selektywnym lub kondycjonowanej pożywce.
[0160] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie czynnika jako „racjonalnie wybranego” lub
„racjonalnie zaprojektowanego” oznacza, że czynnik ten jest wybrany w oparciu o nieprzypadkowe
kryteria, które uwzględniają sekwencję konkretnego miejsca docelowego dla czynnika i/lub
40
konformację tego miejsca z uwzględnieniem działania danego czynnika. Jak opisano w części
eksperymentalnej, proponowane miejsca wiążące hialuronidazy i miejsca (katalityczne) znajdują się w
glikoproteinach o sekwencjach ID. SEKW. Nr 1 lub ID. SEKW. Nr 4. Czynniki mogą być racjonalnie
wybrane lub racjonalnie zaprojektowane przez wykorzystanie sekwencji peptydowych, które tworzą
takie miejsca. Przykładem takiego racjonalnie wybranego czynnika peptydowego może być peptyd,
którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją aminokwasową miejsc wiążących lub
domen ATP lub kalmoduliny.
5
[0161] Zakłada się, że oligosacharydy posiadają koniec redukujący i koniec nieredukujący, niezależnie
od tego czy reszta cukrowa na końcu redukującym jest czy też nie jest w istocie cukrem redukującym.
W zgodzie z przyjętą nomenklaturą, przedstawione tutaj graficznie struktury oligosacharydów
posiadają koniec nieredukujący po lewej stronie i koniec redukujący po prawej stronie. Wszystkie
przedstawione tutaj oligosacharydy są opisane z wykorzystaniem nazwy lub skrótu danego cukru
10
nieredukującego (np. Gal), a następnie konfiguracji wiązania glikozydowego (α lub β), pozycji atomu
węgla w pierścieniu cukru nieredukującego zaangażowanego w wiązanie glikozydowe, pozycji atomu
węgla w pierścieniu cukru redukującego zaangażowanego w wiązanie glikozydowe, a następnie
nazwy lub skrótu dla cukru redukującego (np. GlcNAc). Wiązanie pomiędzy dwoma resztami
cukrowymi może być na przykład przedstawione w następujący sposób: 2,3, 2→3 lub (2,3). Każdy
15
monocukier jest piranozą.
[0162] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie ugrupowanie cukrowe połączone przez atom
N („N-glikan”) odnosi się do oligosacharydu związanego przez amidowy atom azotu reszty Asn w
cząsteczce sHASEPG. Wyróżnia się kilka głównych typów połączonych przez atom N
oligosacharydów (N-glikanów) (wysokomannozowy, kompleksowy, hybrydowy, siarczanowany), a
20
wszystkie z nich posiadają rdzeń (Man)3-GlcNAc-GlcNAc połączony wiązaniem amidowym z grupą
aminową Asn, która wchodzi w skład sekwencji –Asn-Xaa-Thr/Ser- (gdzie Xaa nie jest Pro). Miejsca
N-glikozylacji często są pośrednio identyfikowane podczas sekwencjonowania przez pojawienie się
tzw. „pustych” cykli. Bezpośrednią identyfikację można przeprowadzić po zwolnieniu oligosacharydów
w wyniku trawienia enzymem PNG F, który przekształca glikozylowaną Asn w Asp. Połączone przez
25
atom N oligosacharydy, uwolnione w wyniku traktowania PNG F, mogą być oczyszczone przy użyciu
chromatografii żelowej na złożu Bio-Gel P-6, a następnie poddane rozdziałowi z wykorzystaniem
preparatatywnej (w warunkach wysokiego pH) wysokosprawnej chromatografii jonowymiennej
(HPAEC) (Townsend et al., (1989) Anal. Biochem. 182, 1-8). Pewne izomery oligosacharydów mogą
być rozdzielone przy pomocy HPAEC. Obecność w strukturze reszt fukozy będzie przesuwała pozycję
30
elucji danej cząsteczki na chromatogramie HPAEC na pozycję wcześniejsza, podczas gdy dodatkowe
reszty kwasu sjalowego będą zwiększały czas retencji. Równoległe poddanie tej metodzie glikoprotein
o znanych strukturach oligosacharydowych (takich jak: fetuina wołowa, kwaśna glikoproteina α-1,
owoalbumina, RNAza B, transferyna) może ułatwić opisanie odpowiadających oligosacharydom
pików. Zebrane oligosacharydy mogą być scharakteryzowane przy użyciu kombinacji metod takich jak
35
analiza jakościowa i analiza metylacyjna pozwalających określić skład i pozycję wiązań glikozydowych
(Waeghe et al., (1983) Carbohydr Res. 123, 281-304.), oraz spektroskopia NMR pozwalająca określić
konfigurację anomeryczną wiązań glikozydowych (Van Halbeek (1993) in Methods Enzymol 230).
[0163] Alternatywnie, oligosacharydy mogą być identyfikowane przy pomocy elektroforezy cukrów
wspomaganej fluorescencją (Callewaert et al. (2001) Glycobiology 11, 275-281).
40
[0164] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „kwas sjalowy” odnosi się do każdego członka
rodziny 9-węglowych cukrów posiadających grupę karboksylową. Najpowszechniej występującym
przedstawicielem rodziny kwasów sjalowych jest kwas N-acetyloneuraminowy (kwas 2-keto-5-
acetamido-3,5-dideoksy-D-glicero-D-galakto-nonulozonowy (często określany skrótem Neu5Ac, NeuAc
lub NANA). Drugim członkiem tej rodziny jest kwas N-glikolilo-neuraminowy (Neu5Gc lub NeuGc), w
którym N-acetylowa grupa NeuAc jest hydroksylowana. Trzeci członek rodziny kwasów sjalowych to
kwas 2-keto-3-deoksy-nonulozonowy (KDN) (Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:11550-11557;
5
Kanamori et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 21811-21819). Grupa ta obejmuje również podstawione w
pozycji 9 kwasy sjalowe takie jak 9-O-C1-C6 acylo-Neu5Ac: 9-O-laktylo-Neu5Ac lub 9-O-acetyloNeu5Ac, 9-deoksy-9-fluoro-Neu5Ac i 9-azydo-9-deoksy-Neu5Ac (Patrz np.: Varki (1992) Glycobiology
2: 25-40, Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. Springer-Verlag, N.Y.
(1992)). Synteza i zastosowanie kwasów sjalowych w procesie sjalilacji zostały ujawnione w
10
międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 92/16640, opublikowanym 01.10.1992.
[00165] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „PNGaza” odnosi się do N-glikozydazy F
specyficznej dla peptydów zawierających asparaginę, takiej jak N-glikozydaza-peptydowa
występująca u Flavobacterium maningoseptum. Specyficzność PNGazy dotyczy raczej połączonych
przez atom N niż połączonych przez atom O oligosacharydów. Charakterystykę wydajności PNGazy
15
można przeprowadzić zarówno przy użyciu SDS PAGE lub elektroforezy cukrów wspomaganej
fluorescencją.
[0166] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „w znacznym stopniu podstawione
terminalnymi resztami kwasów sjalowych” odnosi się do połączonych przez atom N oligosacharydów
zakończonych terminalną resztą kwasu sjalowego. Terminalny kwas sjalowy może być identyfikowany
20
z wykorzystaniem analizy FACE węglowodanów uwolnionych w wyniku traktowania neuraminidazą.
[0167] Okres półtrwania glikoprotein w krwi w wysokim stopniu zależy od składu i struktury
połączonych przez atom N ugrupowań węglowodanowych. Fakt ten ma istotne znaczenie w
przypadku terapeutycznych glikoprotein przeznaczonych do podawania pozajelitowego. Ogólnie, dla
zapewnienia maksymalnego okresu półtrwania glikoproteiny wymagane jest, aby połączone przez
25
atom N grupa węglowodanowe były zakończone sekwencją NeuAc-Gal-GlcNAc. Glikoproteina
pozbawiona w strukturze N-glikanów terminalnego kwasu sjalowego (NeuAc) jest szybko usuwana z
krążenia w wyniku mechanizmów opartych na rozpoznaniu odkrytych reszt N-acetylo-galaktozaminy
(GalNAc) lub galaktozy (Gal) (Goochee et al. (1991) Biol/Technology 9: 1347-1355). Z tego powodu
zapewnienie obecności terminalnego kwasu sjalowego w strukturach połączonych przez atom N
30
węglowodanów terapeutycznych glikoprotein jest ważnym zagadnieniem z punktu widzenia ich
komercjalizacji.
[0168] Krążące glikoproteiny są wystawione na działanie sjalidaz(y) (lub neuraminidazy), które
usuwają terminalne reszty kwasów sjalowych. Zazwyczaj usunięcie kwasu sjalowego odkrywa reszty
galaktozy, które następnie są rozpoznawane i wiązane przez specyficzne dla galaktozy receptory
35
obecne na powierzchni hepatocytów (omówione w: Ashwell and Harford (1982) Ann. Rev. Biochem.
51:531). Inne specyficzne dla cukrów receptory biorące udział w usuwaniu glikoprotein z krążenia
znajdują się także w wątrobie. Takie receptory rozpoznają także N-acetyloglukozaminę, mannozę,
fukozę i fosforan mannozy. Glikoproteiny, usunięte w wyniku działania receptorów galaktozowych,
ulegają znacznej degradacji, a następnie dostają się do żółci. Natomiast glikoproteiny, usuwane w
40
wyniku działania obecnych na komórkach Kupffera receptorów mannozowych, docierają do układu
siateczkowo-śródbłonkowego (omówiono w: Ashwell and Harford (1982) Ann. Rev. Biochem. 51: 53).
[0169] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „aktywne w obojętnym pH” odnosi się do
glikoproteiny sHASEGP o aktywności katalitycznej in vitro względem glikozoaminoglikanów w
środowisku o pH 5.0 - 8.0, w warunkach, w których stężenie soli jest mniejsze niż 150 mM a siła
jonowa wynosi mniej niż 50 mM
5
[0170] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „stabilizowany roztwór” odnosi się do roztworu
sHASEGP, w którym glikoproteina, przechowywana przez 30 dni w temperaturze pokojowej,
zachowuje więcej niż 60% swojej początkowej aktywności.
[0171] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „jednostka”, jeśli nie zaznaczono inaczej,
wyrażana jest w jednostkach redukcji zmętnienia (jednostka turbidymetrycznaTRU, ang. Turbidity
10
Reducing Unit). Jedna jednostka TRU zdefiniowana jest jako ilość jednostek aktywności hialuronidazy
wymagana do redukcji zmętnienia zakwaszonego roztworu kwasu hialuronowego i jest równoważna
jednostkom opisanym w USP-NF [(Farmakopea Stanów Zjednoczonych – Receptariusz NF (National
Folmulary, NF XIII)]. Wyniki krzywej standardowej dla próbki hialuronidazy sporządzonej w oparciu o
opisany w niniejszym dokumencie test typu ELISA mogą być wyrażone w jednostkach TRU,
15
jednostkach zawartych w NF i USP (np. USP lub standard WHO) wg standardów Farmakopei
Amerykańskiej (USP). Dlatego też, aktywności enzymatyczne zmierzone w oparciu o wspomniany test
typu ELISA odnoszą się w rzeczywistości do TRU, chyba, że aktywność ta nie jest faktycznie
mierzona za pomocą pomiaru zmętnienia (Dorfman et al., 1948, J. Biol. Chem. 172:367).
[0172] W rozumieniu niniejszego dokumentu termin „moc” odnosi się do ilości sHASEGP wymaganej
20
do degradacji substratu w warunkach in vitro. Moc wyrażona jest w jednostkach TRU lub względnych
jednostkach TRU.
[0173] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie „specyficzna aktywność” odnosi się do
jednostek aktywności na miligram białka. Ilość sHASEGP jest oznaczana spektrofotometryczne przez
pomiar absorpcji dla roztworu sHASEGP przy długości fali równej 280 nm z uwzględnieniem
25
molowego współczynnika ekstynkcji o wartości około 1.7 M-1 cm-1.
[0174] Glikol polietylenowy (PEG) jest szeroko stosowany w biomateriałach, biotechnologii i
medycynie, przede wszystkim dlatego, że jest biokompatybilnym, nietoksycznym, nieimmunogennym i
rozpuszczalnym w wodzie polimerem (Zhao and Harris, ACS Symposium Series 680: 458-72, 1997).
Jeśli chodzi o dziedzinę dotyczącą dostarczania leku, pochodne PEG są szeroko stosowane jako
30
składniki kowalencyjnie związane z białkami (tzw. „pegilacja”), co obniża immunogenność białek, ich
proteolizę i klirens przez nerki oraz zwiększa ich rozpuszczalność (Zalipsky, Adv. Drug Del. Rev.
16:157-82, 1995). Analogicznie, PEG jest przyłączany do drobnocząsteczkowych, względnie
hydrofobowych leków w celu zwiększenia ich rozpuszczalności, zredukowania toksyczności i
zróżnicowania biodostępności. Pegilowane leki wstrzykuje się zazwyczaj jako roztwory.
35
[0175]
Ponieważ
większość
reakcji
chemicznych
wykorzystywanych
do
projektowania
degradowalnych, rozpuszczalnych nośników leków jest taka sama,może być także zastosowana w
projektowaniu degradowalnych żeli, np. syntezy usieciowanych degradowalnych pochodnych PEG lub
formulacji do wykorzystania przy podawaniu leków (Sawhney et al., Macromolecules 26: 581-87,
1993). Wiadomo też, że międzycząsteczkowe kompleksy mogą być formowane przez zmieszanie
40
roztworów dwóch komplementarnych polimerów. Takie kompleksy są ogólnie stabilizowane przez
oddziaływania elektrostatyczne (polianion-polikation) i\lub wiązania wodorowe (polikwas-polizasada)
między
zaangażowanymi
polimerami
i/lub
hydrofobowe
oddziaływania
między
polimerami
znajdującymi się w środowisku wodnym (Krupers et al., Eur. Polym J. 32:785-790, 1996). Na przykład
w pewnych warunkach zmieszanie roztworów kwasu poliakrylowego (PAAc) i poli(tlenku) etylenu
(PEO) prowadzi do tworzenia kompleksów stabilizowanych poprzez wiązania wodorowe. Zjawisko
dysocjacji tych kompleksów w warunkach fizjologicznych wykorzystywano do podawania leków w
5
stanie wolnym (takich jak leki niepegilowane). Ponadto kompleksy komplementarnych polimerów
przygotowywano zarówno z homopolimerów jak i kopolimerów.
[0176] W jednym aspekcie wykonania wynalazku, masa cząsteczkowa glikolu polietylenowego
zawiera się w granicach od około 3 kDa do około 50 kDa, i korzystnie od około 5 kDa do około 30
kDa. Przyłączenie cząsteczki PEG do leku poprzez wiązanie kowalencyjne (znane jako „PEGilacja”)
10
może być przeprowadzone przy użyciu znanych technik syntezy chemicznej. Przykładowo, w jednym
wariancie wykonania wynalazku, pegilacja białka może być przeprowadzona w odpowiednich
warunkach w wyniku reakcji PEG aktywowanego przy pomocy NHS z białkiem.
[0177] Mimo iż opisano liczne rodzaje reakcji pegilacji, największe zastosowanie mają te, które
zapewniają kierunkowość reakcji, przebiegają w łagodnych warunkach i nie wymagają dalszych
15
złożonych procedur do usunięcia toksycznych katalizatorów lub produktów ubocznych. Przykładowo,
monometoksy-PEG (mPEG) posiada jedynie jedną reaktywną terminalną grupę hydroksylową i
dlatego wykorzystanie tego związku ogranicza w pewien sposób heterogenność otrzymanej
mieszaniny PEG-produkt białkowy. Ogólnie aktywacja grupy hydroksylowej znajdującej się na końcu
polimeru, po drugiej stronie względem terminalnej grupy metoksy, jest niezbędna dla wydajnej
20
pegilacji białka, a jej celem jest otrzymanie pochodnej PEG, która będzie bardziej podatna na atak
nukleofilowy. Atakującym nukleofilem jest zazwyczaj grupa ε-NH2- reszty lizyny, jednak w
sprzyjających warunkach mogą nim być także inne aminy (np. grupy α-NH2- na N-końcu białka lub
grupy aminowe pierścienia histydyny). W przypadku białek posiadających jedną resztę lizyny lub
cysteiny możliwe jest bardziej ukierunkowane przyłączenie. Reagent PEG-maleimid może zostać
25
wykorzystany do sprzęgania PEG z grupą tiolową wspomnianej cysteiny. Alternatywnie, hydrazyd
PEG może zostać poddany reakcji z utlenionym nadjodanem sHASEGP, a następnie redukcji w
obecności NaCNBH3. Bardziej specyficznie, pegilowane związki cukrów z CMP mogą być poddawane
reakcji z sHASEGP w obecności odpowiednich glikozylotransferaz. Jedną z metod jest taka metoda
„pegilacji”, w której do polipeptydu będącego przedmiotem wynalazku przyłączanych jest wiele
30
polimerów. Zastosowanie tej techniki osłabia odpowiedź immunologiczną, powodując, że układ
odpornościowy ma trudności w rozpoznawaniu epitopów białkowych w strukturze pegilowanego
polipeptydu, odpowiedzialnych za indukcję przeciwciał. Aby polipeptydy (tj. preparaty farmaceutyczne)
podawane człowiekowi bezpośrednio do układu krążenia wywołały określony efekt fizjologiczny
typową możliwą odpowiedzią układu odpornościowego w takim przypadku jest wytworzenie
35
przeciwciał typu IgG i/lub IgM, podczas gdy polipeptydy podawane wziewnie (tj. peptydy
przemysłowe) potencjalnie mogą indukować produkcje przeciwciał typu IgE (tj. IgE-zależna odpowiedź
na alergen). Jedna z teorii wyjaśniająca opisane zjawisko osłabienia odpowiedzi immunologicznej
mówi, że polimer(y) maskują epitop(y) na powierzchni polipeptydu odpowiedzialnego za indukcje
mechanizmów układu odpornościowego prowadzących do wytwarzania przeciwciał. Inna teoria lub co
40
najmniej jedna z przyczyn tego zjawiska to zależność polegająca na tym, że im większa jest masa
cząsteczkowa danego koniugatu tym większy jest efekt osłabienia odpowiedzi immunologicznej.
[0178] Takimi polimerami związanymi z polipeptydem mogą być jakiekolwiek polimery o masie
cząsteczkowej zdefiniowanej zgodnie z niniejszym wynalazkiem, włączając w to naturalne i
syntetyczne homopolimery, takie jak poliole (tj. poli-OH), poliaminy (tj. poli-NH2) i kwasy
polikarboksylowe i inne heteropolimery, tj. polimery zwierające jedną lub więcej różnych grup
5
wiążących, na przykład grupę hydroksylową i grupę aminową.
[0179] Przykłady odpowiednich polimerów obejmują polimery wybrane z grupy zawierającej tlenki
polialkenów (PAO), takie jak glikole polialkilenowe (PAG) (włączając w to glikole polipropylenowe
(PEG), glikole metoksy-polietylenowe (mPEG) i polipropylenowe glikole), PEG-glicydylowe etery
(Epox-PEG), PEG-oksykarbonylodiimidazol (CDI-PEG), rozgałęzione glikole polietylenowe, alkohol
10
poliwinylowy (PVA), polikarboksylany, poliwinylopirolidon, poliaminokwasy D- i L, kopolimer polietylenu
i
bezwodnika
kwasu
hydroksybutanodiowego,
kopolimer
polistyrenu
i
bezwodnika
kwasu
hydroksybutanodiowego, dekstrany (włączając w to karboksymetylodekstran), heparynę, homologi
albuminy,
celulozę
(właczając
w
to
metylocelulozę,
karboksymetylocelulozę,
etylocelulozę,
hydroksyetylocelulozę, karboksyetylocelulozę i hydroksypropylocelulozę), hydrolizaty chitosanu,
15
skrobię (takie jak hydroksyetylowana skrobia, hydroksypropylowana skrobia), glikogen, agarozy i ich
pochodne, guma guar, pullulan, inulina, guma ksantanowa, karagenian, pektyna, hydrolizaty kwasu
alginowego i biopolimerów.
[0180] Korzystnymi polimerami są nietoksyczne polimery takie jak metoksylowa forma glikolu
polietylenowego (mPEG), które mogą być kowalencyjnie wiązane do enzymów przy pomocy
20
stosunkowo prostych reakcji chemicznych.
[0181] Korzystne polimery w ogólnym rozumieniu to tlenki polialkenów (PAO), takie jak tlenki
polietylenu, takie jak PEG, a szczególnie mPEG. Wynika to z faktu, że w porównaniu do
polisacharydów takich jak dekstran, pullan i im podobne związki, wspomniane korzystne polimery
posiadają niewiele reaktywnych grup powodujących niepożądane w tym przypadku usieciowanie
25
polimerów.
B. TKANKOWE PROFILE EKSPRESJI sHASEGP.
[0182] Dzięki wykorzystaniu bardziej czułych technik takich jak RT-PCR, okazało się, że sHASEGP,
początkowo uważana za specyficzną dla ludzkich jąder, jest ekspresjonowana w wielu ludzkich
tkankach. Transkrypt sHASEGP występuje w rdzeniu (mózg), śródbłonku naczyń włosowatych,
30
prostacie, tkance piersi, siatkówce, frakcji ludzkich melanocytów, sercu płodu i macicy kobiety
ciężarnej. Glikoproteina sHASEGP jest także ekspresjonowana w nowotworach zarodkowych.
Ogólnie, aby oznaczyć poziom transkryptów sHASEGP, w tkankach innych niż jądra, wymagane jest
użycie techniki RT-PCR.
C. TESTY NA AKTYWNOŚĆ ENZYMATYCZNĄ sHASEGP
35
[0183]
TEST
AKTYWNOŚCI
HIALURONIDAZY
OPARTY
NA
MIKROMIARECZKOWANIU
TURBIDYMETRYCZNYM.
[0184] Aktywność hialuronidazy można oznaczyć w zakwaszonym roztworze surowicy za pomocą
zmodyfikowanego testu turbidymetrycznego.
Poniżej przedstawiono wymagane odczynniki.
Dwukrotnie dejonizowana,
sterylizowana UV woda lub
sterylna woda do irygacji
Hylumed Medical - Hialuronian
Braun
R5000-01
Genzyme Advanced
4876
sodu, wysokocząsteczkowy HA
Standard referencyjny
hialuronidazy
Octan potasu, granulat, USP,
ACS
Kwas octowy, lodowaty, >99%
Fosforan sodu jednozasadowy,
monohydrat, USP, granulat
Fosforan sodu dwuzasadowy,
bezwodny
Chlorek sodu, kryształy, GR,
ACS
Enzymatyczny hydrolizat
żelatyny
Surowica końska, pulowana,
testowana na komórkach,
testowana na komórkach
hybrydomy, pochodzenie: USA
20% albumina surowicy ludzkiej
Kwas solny, odczynnik ACS
Chlorek wapnia, podwójnie
uwodniony, granulat, USP, -FCC
Biomaterials
USP
31200
JTBaker
2914-01
Sigma
A-6283
Mallinkrodt
7774
Mallinkrodt
7771
EMScience
SX0420-5
Sigma
G-0262
Sigma
H-1270
Griffols
Sigma
H-7020
JTBaker
1336-01
[0185] Przygotowuje się następujące odczynniki: bufor octanowy: 14.0 g octanu potasu i 25.0 ml
lodowatego kwasu octowego rozpuszcza się w wodzie do objętości 1000 ml; bufor fosforanowy: 2.5 g
jednozasadowego fosforanu sodu, 1.0 g bezwodnego, dwuzasadowego fosforanu sodu i 8.2 g chlorku
5
sodu rozpuszcza sie w wodzie do objętości 1000 ml; Roztwór podstawowy do rozcieńczania enzymu:
500 ml buforu fosforanowego dodaje się do 500 ml wody. Roztwór roboczy do rozcieńczania enzymu:
33 mg hydrolizatu żelatyny w 50 ml roztworu podstawowego do rozcieńczania enzymu,
przygotowywany na 2 godz. przed użyciem; Bufor stabilizujący próbki (roztwór „SSB”): 125 µl 20%
albuminy surowicy ludzkiej i 50 µl 1M chlorku wapnia w 50 ml roztworu roboczego dla enzymu, mocno
10
zmieszane; Roztwór podstawowy surowicy: surowicę końską rozcieńcza się w stosunku 1:9 buforze
octanowym, pH doprowadza się do wartości 3.1 przy pomocy 4 M kwasu solnego, roztwór pozostawia
się w temperaturze pokojowej na okres od 18 do 24 godz. Roztwór przechowuje się w 4 °C i
wykorzystuje w ciągu 30 dni. Roztwór roboczy surowicy: 10 ml roztworu podstawowego surowicy w 30
ml buforu octanowego, temperatura roztworu doprowadzona do temperatury otoczenia. Roztwór
15
podstawowy kwasu hialuronowego: 5.0 mg/ml kwasu hialuronowego w wodzie. Roztwór roboczy
kwasu hialuronowego: 0.75 ml roztworu podstawowego kwasu hialuronowego w 4.25 ml buforu
fosforanowego. Roztwór podstawowy standardu: zawartość jednego opakowania standardu
hialuronidazy (USP, wzorzec zgodny z wymogami Farmakopei Amerykańskiej) rozpuszcza się w
wodzie tak, aby stężenie wynosiło 1000 U/ml, dzieli na 50 porcji i przechowuje w 20 °C. Roztwór
20
roboczy standardu: 40 µl roztworu podstawowego standardu w 960 µl schłodzonego roztworu
roboczego do rozcieńczania enzymu, rozcieńczenie enzymu takie, aby uzyskać stężenie 40 U/ml,
roztwór przygotowywany bezpośrednio przed użyciem.
[0186] Wszystkie próbki enzymów rozcieńczano na 96-dołkowej płytce, o powierzchni zapewniającej
słabe wiązanie białek, zgodnie z następującymi wskazówkami:
25
[0187] a) zakres maksymalnej czułości tego testu zawiera się w granicach 10-30 U/ml. Aby
zminimalizować liczbę powtórzeń testu niezbędnych do ustalenia rozcieńczeń pozwalających na
uzyskanie wyników o wartościach zawartych w podanym zakresie, należy najpierw określić
przybliżoną wartość stężenia enzymu w próbce (U/ml), a następnie wybrać takie rozcieńczenie (liczba
całkowita), aby końcowe stężenie enzymu wynosiło około 20 U/ml.
[0188] b) minimalne objętości próbek potrzebne do wykonania testu: frakcje FPLC: 50 µl, supernatanty
5
hodowli tkankowych: 1 ml, oczyszczony i zagęszczony preparat końcowy: 10 µl.
[0189] c) dla próbek otrzymanych w wyniku seryjnych rozcieńczeń: rozcieńczenia 1:10
przygotowywane w trzech powtórzeniach na 96-dołkowej płytce, o powierzchni zapewniającej słabe
wiązanie białek, poprzez zmieszanie w każdym dołku 360 µl roztworu SSB i 40 µl roztworu próbki.
[0190] W celu przygotowania standardu USP należy, zgodnie z wymogami Farmakopei Amerykańskiej
10
(USP), wykonać krzywą standardową na 96-dołkowej płytce, o powierzchni zapewniającej słabe
wiązanie białek:
Krzywa standardowa USP:
Dołki:
Standard:
Roztwór podstawowy do Roztwór
roboczy
do Stężenie końcowe
rozcieńczania [µl]:
rozcieńczania enzymu [µl]:
[U/ml]
A1-A3
St01
0
100
40
B1-B3
St02
20
80
32
C1-C3
St03
40
60
24
D1-D3
St04
60
40
16
E1-E3
St05
80
20
8
F1-F3
St06
90
10
4
G1-G3
St07
100
0
0
[0191] W celu przygotowania próbek kontrolnych kwasu hialuronowego w kolumnach 1-3, należy na
15
96-dołkowej płaskodennej płytce w następujący sposób przygotować kontrolę HA:
[0192]
Kontrole HA:
Dołki:
H1-H3
Kontrola:
Ko01
Roztwór roboczy kwasu
Roztwór
roboczy
hialuronowego [µl]
enzymu [µl]
0
60
do
rozcieńczania
[0193] Płytka reakcyjna: 30 µl roztworu roboczego kwasu hialuronowego nanosi się, przy użyciu 8kanałowej pipety o objętości 50 µl, na każdy dołek 96-dołkowej płaskodennej płytki, pozostawiając
20
dołki H1-H3 puste. Następnie do dołków H1-H3 znajdujących się na tej samej płytce dodaje się 60
µl/dołek roztworu roboczego do rozcieńczania enzymu, który posłuży jako kontrola.
[0194] Roztwór roboczy surowicy: 40 ml roztworu roboczego surowicy wlewa się do odpowiedniego
pojemnika na reagenty i następnie umieszcza się w bloku grzejnym.
[0195] Etap poprzedzający ogrzewanie: po przygotowaniu obu płytek, płytkę 96-dołkową, o
25
powierzchni zapewniającej słabe wiązanie białek, zawierającą rozcieńczone próbki, standardy i
kontrole oraz płaskodenną płytkę 96-dołkową zawierającą roztwór roboczy kwasu hialuronowego,
umieszcza się w bloku grzejnym i pozostawia na 5 min. w 37 °C.
[0196] Reakcję rozpoczyna się przez dodanie enzymu do substratu: 30 µl roztworu z płytki
zawierającej roztwory enzymu dodaje się, przy użyciu 8-kanałowej pipety o objętości 5 - 50 µl, do
dołków w kolumnie 1 na płaskodennej 96-dołkowej płytki (zawierającej substrat). W celu otrzymania
jednorodnego roztworu, mieszaninę reakcyjną enzym\substrat miesza się, w ciągu pierwszych 15 s,
5
przez 5-krotne zasysanie i ponowne dozowanie próbki. Po zmieszaniu enzymu i substratu należy,
przed dodaniem roztworów do dołków w kolejnej kolumnie, usunąć zużyte końcówki do pipet i
zastąpić nowymi. Należy zrestartować stoper i w czasie (t)=0:30, powtórzyć opisaną procedurę dla
dołków w kolumnie 2. Po następnych 30 s, w czasie (t)=1:00, procedura powtarzana jest dla kolumny
3. W ten sposób, poruszając się wzdłuż płytki od strony lewej do prawej, co 30 s powtarzamy opisany
10
proces dla wszystkich dołków zawierających mieszaninę enzym/substrat.
[0197] Zatrzymanie reakcji: Z chwilą, gdy stoper pokaże wartość (t)=6:00 należy, przy użyciu 8kanałowej pipety o objętości 50-300 µl, dodać do każdego dołka kolumny 1 płaskodennej 96-dołkowej
płytki 240 µl roztworu roboczego surowicy z pojemnika na odczynniki o objętości 50 ml. W celu
otrzymania jednorodnego roztworu, mieszanina jest mieszana przez pierwsze 10 s przez 3-krotnie
15
zasysanie i ponowne dozowanie próbki. Procedurę powtarza się co 30 s dla kolejnych kolumn od 1 do
12. Po zakończeniu mieszania w ostatniej kolumnie (kolumna dwunasta), należy wyciągnąć płytkę
reakcyjną z bloku grzejnego i umieścić ją w czytniku nastawionym na długość fali równą 640 nm.
Funkcja dopasowania liniowego krzywej generowana w oparciu o krzywą standardową, pozwala na
ekstrapolację wyników testowanych próbek.
20
[0198] ALTERNATYWNE TESTY HIALURONIDAZY
[0199] TEST MIKROMIARECZKOWANIA OPARTY NA BIOTYNYLOWANYM HIALURONIANIE
[0200] Wolne grupy karboksylowe kwasu glukuronowego hialuronianu są biotynylowane w
jednoetapowej reakcji przy użyciu hydrazydu biotyny (Pierce), sulfo-NHS (Pierce) i 1-etylo-3-(3dimetylaminopropylo)karbodiimidu (Sigma). Taki biotynylowany substrat HA jest kowalencyjnie
25
wiązany z powierzchnią 96-dołkowej płytki w drugiej reakcji. Pozostały po zakończeniu reakcji
enzymatycznej substrat wykrywa się przy użyciu reakcji awidyna-peroksydaza odczytując wynik
reakcji przy użyciu standardowego czytnika do płytek ELISA. Ponieważ w przypadku tego testu
substrat jest kowalencyjnie związany z płytką, nie występują tu artefakty takie jak zależne od pH
przemieszczanie się biotynylowanego substratu. Czułość testu pozwala na szybki pomiar aktywności
30
hialuronidazy pochodzącej z hodowli komórkowych i próbek biologicznych cechujący się w obrębie
testu zmiennością równą 10%.
[0201] Specyficzność hialuronidazy wyrażana jest w jednostkach redukcji zmętnienia (TRU, ang.
turbidity reducing unit). Jedna jednostka TRU zdefiniowana jest jako ilość jednostek aktywności
hialuronidazy wymagana do redukcji zmętnienia zakwaszonego roztworu kwasu hialuronowego i jest
35
równoważna do jednostek opisanych w USP-NF [(Farmakopea Stanów Zjednoczonych –
Receptariusz NF (National Folmulary, NF XIII)]. Wyniki krzywej standardowej dla próbki hialuronidazy
sporządzonej w oparciu o opisany w niniejszym dokumencie test typu ELISA mogą być wyrażone w
jednostkach TRU, jednostkach zawartych w NF i USP (np. USP lub standard WHO) wg standardów
farmakopei Amerykańskiej (USP). Dlatego też aktywności enzymatyczne zmierzone w oparciu o
40
wspomniany test typu ELISA odnoszą się w rzeczywistości do TRU, chyba, że aktywność ta nie jest
faktycznie mierzona za pomocą pomiaru zmętnienia (Dorfman et al., 1948, J. Biol. Chem. 172: 367).
[0202] Wiele testów na aktywność hialuronidazy oparto na pomiarach obecności nowopowstałych
redukujących grup N-acetylo-aminowych (Bonner and Cantey, Clin. Chim. Acta 13:746-752, 1966) lub
na pomiarach spadku lepkości (De Salegui et al., Arch. Biochem. Biophys. 121:548-554, 1967) lub
zmętnienia (Dorfinan and Ott, J. Biol. Chem. 172:367, 1948). Wszystkie te metody są wydajne w
5
przypadku oznaczania obecności lub braku aktywności endoglukozoaminidazowej enzymu w
stosunku do oczyszczonych substratów.
[0203] W znaczącym stopniu oczyszczone substraty glikozoaminoglikanów mogą być zastosowane w
teście spowolnienia migracji w żelu. Glikozoaminoglikany miesza się z rekombinowaną sHASEGP w
celu zbadania jej aktywności endoglukozoaminidazowej, która objawia się spowolnieniem mobilności
10
substratu w żelu. Siarczan chondroityny-4 i 6, siarczan dermatanu, siarczan heparanu można uzyskać
z firmy Sigma Chemical. Hialuronian izolowany z ludzkiej pępowiny można uzyskać z ICN. Każdy
testowany substrat jest rozcieńczany do stężenia 0.1 mg/ml w buforze o pH w zakresie 3.5 - 7.5.
Próbki oczyszczonej sHASEGP lub kondycjonowane pożywki komórek ekspresjonujących sHASEGP,
o objętości 10 µl, miesza się z 90 µl substratu w odpowiednim buforze i inkubuje przez 3 godz. w 37
15
°C. Następnie próbki są neutralizowane buforem do prób (Tris-EDTA, pH 8.0, błękit bromofenolowy i
glicerol) i poddawane rozdziałowi w elektroforezie. Glikozoaminoglikany identyfikuje się przez
barwienie żelu przez noc 0.5% roztworem barwnika Alcian Blue w 3% lodowatym kwasie octowym, a
następnie odbarwianie żelu 7% lodowatym kwasem octowym. Poziom degradacji oznacza się przez
porównanie mobilności substratu w obecności i przy braku enzymu.
20
[0204] Aktywność hialuronidazy może być także oznaczona przy użyciu zymografii (Guentenhoner et
al., 1992, Matrix 388-396). W teście tym próbka nanoszona jest na żel poliakryloamidowy zawierający
SDS i kwas hialuronowy, a następnie białka w tej próbce rozdzielane są elektroforetycznie (SDSPAGE). Żel po rozdziale inkubowany jest w buforze odpowiednim dla testu, a następnie barwiony w
celu identyfikacji w żelu kwasu hialuronowego. Białka o aktywności hialuronidazy identyfikuje się przez
25
wizualizację jako bezbarwne prążki w żelu zawierającym substrat.
[0205] D. IDENTYFIKACJA I IZOLACJA GENÓW POLIPEPTYDU sHASEGP.
[0206] Domeny i/lub całe geny polipeptydu sHASEGP można otrzymać metodami izolacji DNA dobrze
znanymi w stanie techniki. Do identyfikacji kwasów nukleinowych kodujących pożądany gen można
zastosować dowolną metodę znaną specjalistom w dziedzinie. Każda metoda znana w stanie techniki
30
może być zastosowana do uzyskania cDNA o pełnej długości tj. obejmującej cały region kodujący lub
klon genomowego DNA kodujący polipeptyd sHASEGP. Przykładem metody jest reakcja łańcuchowej
polimeryzacji, którą można zastosować do namnożenia sekwencji z biblioteki cDNA lub genomowego
DNA, ekspresjonowanej w normalnej tkance np. kwasów nukleinowych kodujących polipeptyd
sHASEGP (SEQ. Nr 1 i 2). Primery oligonukleotydowe, które hybrydyzują do sekwencji na 3' i 5' końcu
35
identyfikowanych sekwencji mogą być użyte jako primery do namnożenia w PCR sekwencji na
podstawie próbek matryc kwasów nukleinowych (RNA lub DNA, ogólnie bibliotek cDNA, z
odpowiedniego źródła (np. jądra, prostaty, piersi).
[0207] PCR może być przeprowadzony np. przy użyciu termocyklera Cetus firmy Perkin Elmer i
polimerazy Taq (GeneAmp). Namnażane DNA może zawierać mRNA lub cDNA lub genomowe DNA z
40
różnych gatunków Eucariota. Do reakcji PCR można wybrać kilka różnych primerów o charakterze
zdegenerowanym.
[0208] Rygorystyczne warunki hybrydyzacji, stosowane w reakcji PCR w fazie przyłączania primerów,
do namnożenia homologów kwasu nukleinowego (np. do otrzymania sekwencji polipeptydu sHASEGP
z gatunków/organizmów innych niż człowiek lub do otrzymania sekwencji nukleotydowej z homologią
do polipeptydu sHASEGP) można modyfikować pozwalając na elastyczność w podobieństwie
5
sekwencji nukleotydów między znanymi sekwencjami nukleotydów a izolowanymi homologami
kwasów nukleinowych. W przypadku hybrydyzacji międzygatunkowej stosuje się warunki nisko lub
umiarkowanie rygorystyczne. Dla niektórych gatunków prowadzi się hybrydyzację w warunkach od
umiarkowanie do wysoko rygorystycznych. Warunki te mogą być ustalone doświadczalnie.
[0209] Po zakończonym powodzeniem namnażaniu kwasu nukleinowego, zawierającego całą lub
10
część sekwencji zidentyfikowanego polipeptydu sHASEGP lub całą lub część sekwencji kodującej
całą lub część homologicznego polipeptydu sHASEGP, jego fragment może być sklonowany i
sekwencjonowany oraz użyty jako sonda do izolacji kompletnej cząsteczki cDNA lub klonu
genomowego DNA. To z kolei pozwala na wyznaczenie kompletnej sekwencji nukleotydowej genu,
analizy jego ekspresji i wytwarzania produktu jego ekspresji do celów analizy funkcjonalnej. Po
15
wyznaczeniu sekwencji można, przy zastosowaniu dowolnej odpowiedniej do tego metody znanej w
stanie techniki, zlokalizować otwartą ramkę odczytu (ORF) produktu białkowego np. używając
publicznie
dostępnych
programów
komputerowych
przeznaczonych
do
analizy
sekwencji
nukleotydowych. Jeżeli otwarta ramka odczytu jest wyznaczona, określenie sekwencji aminokwasów
białka kodowanego od wspomnianej ramki odczytu jest czynnością standardową. W powyższy sposób
20
można zidentyfikować zarówno sekwencję nukleotydową całych genów polipeptydu sHASEGP jak i
sekwencję aminokwasową białka sHASEGP oraz jego analogów.
[0210] Źródłem kwasu nukleinowego do klonowania genu polipeptydu sHASEGP może być każda
komórka eukariotyczna. Kwasy nukleinowe mogą być izolowane z komórek kręgowców, ssaków,
człowieka, świni, wołowych, kocich, ptasich, końskich, psich a także z komórek naczelnych, owadzich,
25
roślinnych i innych organizmów. DNA można otrzymać według standardowych procedur znanych w
stanie techniki, poczynając od klonowania DNA (np. bibliotek DNA), poprzez chemiczną syntezę,
klonowanie cDNA lub genomowego DNA lub ich fragmentów, oczyszczanie z danych komórek (patrz
np. Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M. Ed., 1985, DNA Cloning : A Practical
30
Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U. K. Vol. 1,11). Klony, otrzymane z genomowego DNA,
zawierają, oprócz regionów kodujących, regiony DNA intronowego i regulatorowego. Klony otrzymane
z cDNA zawierałyby tylko sekwencje egzonów. Niezależnie od źródła DNA, wspomniany gen w celu
namnożenia jest klonowany do odpowiedniego wektora.
[0211] W procesie molekularnego klonowania genu z genomowego DNA, wytwarzane są fragmenty
35
DNA, z których niektóre będą kodować gen będący przedmiotem zainteresowania.
[0212] DNA może być trawiony w różnych specyficznych miejscach cięcia przy użyciu różnego rodzaju
enzymów restrykcyjnych.
[0213] Alternatywnie, do fragmentacji DNA można zastosować DNAzę w obecności jonów magnezu
lub metody fizyczne np. sonifikację. Fragmenty linearnego DNA mogą być rozdzielone w zależności
40
od wielkości standardowymi technikami w tym, lecz nie tylko, przy pomocy elektroforezy w żelu
agarozowym lub poliakryloamidowym albo na kolumnie chromatograficznej.
[0214] Identyfikacja wytworzonych fragmentów DNA może być dokonana wieloma sposobami.
[0215] Przykładem jest część genu polipeptydu sHASEGP (dowolnego rodzaju) (np. produkt
namnażania w reakcji PCR otrzymany, jak powyżej opisano lub oligonukleotyd o sekwencji będącej
częścią znanej sekwencji nukleotydowej) lub specyficzny dla sHASEGP RNA lub jego oczyszczony i
wyznakowany fragment, a wytworzone fragmenty DNA mogą być przeszukiwane metodą hybrydyzacji
5
ze znakowanymi sondami (Benton and Davis, Science 196: 180 (1977); Grunstein and Hogness,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 3961 (1975)). Hybrydyzować będą fragmenty DNA charakteryzujące
się znaczącą homologią do sondy. Odpowiedni fragment można też zidentyfikować przez trawienie
enzymami
restrykcyjnymi
i
porównywanie
wielkości
fragmentów
do
wielkości
fragmentów
oczekiwanych kierując się mapą restrykcyjną, jeżeli jest dostępna. Identyfiakcji można również
10
dokonać przez analizę sekwencji DNA i porównywanie do znanej sekwencji nukleotydowej
polipeptydu sHASEGP. Dalszą selekcję można przeprowadzać na podstawie właściwości genu.
Alternatywnie obecność genu można wyznaczać w teście opartym na fizycznych, chemicznych lub
immunologicznych właściwościach ekspresjonowanego produktu. Przykładem są klony cDNA lub
klony DNA selekcjonujące poprzez hybrydyzację odpowiedni RNA, w oparciu o który wytwarzane jest
15
białko o podobnej lub identycznej migracji w żelu, o podobnych lub identycznych parametrach w
fokusowaniu izoelektrycznym, proteolitycznej mapie miejsc trawienia, właściwościach antygenowych i
aktywności hialuronidazy. Wspomniane powyżej białko może być identyfikowane przez wiązanie
znakowanych przeciwciał skierowanych przeciwko polipeptydowi sHASEGP (jeżeli są dostępne) do
klonów
20
potencjalnie
syntetyzujących
polipeptyd
sHASEGP
w
teście
typu
ELISA
(teście
immunoenzymatycznym).
[0216] Alternatywą do izolowania genomowego DNA dla polipeptydu sHASEGP, lecz nie tylko, jest
synteza chemiczna sekwencji genu według znanej już sekwencji lub przepisanie cDNA na RNA, który
koduje białko sHASEGP.
[0217] Przykładowo, RNA, który jest przepisywany na cDNA przeznaczone do klonowania genu białka
25
sHASEGP, można wyizolować z komórek ekspresjonujących wspomniane białko. Wyizolowane i
zidentyfikowane kwasy nukleinowe mogą być następnie wprowadzone do odpowiedniego wektora. W
stanie techniki znanych jest wiele systemów wektor/komórka gospodarza. Potencjalne wektory
obejmują, lecz nie tylko, plazmidy lub zmodyfikowane wirusy, które, jako narzędzia do wprowadzania
DNA, muszą być kompatybilne z używanymi komórkami gospodarza. Takie wektory obejmują, lecz nie
30
ograniczaja się do, bakteriofagów, jak pochodne faga lambda, plazmidów pBR322, pUC lub ich
zmodyfikowanych pochodnych, wektor Bluscript (Stratagene, La Jolla, CA). Wklonowanie do wektora
może być zakończone etapem ligacji fragmentu DNA do lepkich końców wspomnianego wektora.
[0218] Jeżeli komplementarne miejsca restrykcyjne, wykorzystywane do cięcia DNA na fragmenty, nie
są obecne w wektorze do klonowania, końce DNA mogą być poddane enzymatycznej modyfikacji.
35
Alternatywnie, każde potrzebne miejsce może być wygenerowane poprzez ligację sekwencji
nukleotydowej (łącznika) do końców DNA. Ligowane łączniki mogą zawierać specyficzne, chemicznie
syntetyzowane oligonukleotydy, kodujące miejsca restrykcyjne rozpoznawane przez endonukleazy. W
metodzie alternatywnej trawiony wektor i gen białka sHASEGP mogą być modyfikowane przez
homopolimeryczne dołączenie homopolimerycznego łącznika.
40
[0219]
Rekombinowane
cząsteczki
można
wprowadzać
do
komórek
gospodarza
metodą
transformacji, transfekcji, transdukcji, elektroporacji, metodą z fosforanem wapnia i innymi metodami,
które pozwalają w rezultacie na wygenerowanie wielu kopii sekwencji wprowadzanego genu.
[0220] W specyficznym wykonaniu wynalazku, transformacja komórek gospodarza rekombinowaną
cząsteczką DNA, która inkorporuje wyizolowany gen dla białka sHASEGP, cDNA lub syntetyzowanej
sekwencji DNA pozwala na wytworzenie wielu kopii wspomnianego genu.
[0221] Zatem gen w dużej ilości kopii można otrzymać hodując transformanty, a następnie izolując z
5
nich rekombinowany DNA i, kiedy zachodzi taka konieczność, odzyskiwać gen-insert z wyizolowanego
rekombinowanego DNA.
[0222] WEKTORY, PLAZMIDY I KOMÓRKI, ZAWIERAJĄCE KWAS NUKLEINOWY KODUJĄCY
BIAŁKO sHASEGP LUB JEGO DOMENĘ O AKTYWNOŚCI HIALURONIDAZY ORAZ EKSPRESJA
POLIPEPTYDU sHASEGP W TYCH WEKTORACH I KOMÓRKACH.
10
[0223] W celu ekspresji rekombinanta jednego lub wielu białek sHASEGP, kwas nukleinowy,
zawierający wszystkie lub część sekwencji nukleotydowych kodujących sHASEGP, może być
wstawiony do odpowiedniego wektora ekspresyjnego np. do wektora zawierającego elementy
składowe, niezbędne do tego by zaszła transkrypcja i translacja wprowadzonej sekwencji kodującej
wspomniane białko. Potrzebne sygnały transkrypcji i translacji mogą być uzupełnione o natywny
15
promotor dla genów sHASEGP i/lub sekwencje flankujące.
[0224] Wynalazek obejmuje także wektory zawierające kwas nukleinowy kodujący glikoproteiny o
aktywności hialuronidazy sHASEGP, które mogą być wprowadzone do systemu ekspresyjnego w
którym jest możliwe wytwarzanie rozpuszczalnej, aktywnej w obojętnym pH glikoproteiny sHASEGP o
aktywności hialuronidazy.
20
[0225] Wynalazek obejmuje również wektory. Termin „komórki” obejmuje zarówno komórki
eukariotyczne jak i prokariotyczne i odpowiednie dla tych komórek wektory.
[0226] Wynalazek dotyczy komórek eukariotycznych, w tym komórek jajnika chomika chińskiego (ang.
Chinese Hamster Ovary Cells) pozbawionych aktywności reduktazy dihydrofolianowej (DG44).
Określenie „ odpowiednie komórki” obejmuje komórki drożdżowe, grzybów, roślinne, owadzie i
25
zwierzęce. Wymienione komórki są stosowane do produkcji glikoproteiny sHASEGP lub domeny o
aktywności hialuronidazy glikoproteiny sHASEGP w kolejnych etapach :a) hodowla wymienionych
powyżej komórek w warunkach w których kodowana glikoproteina sHASEGP lub jej domena o
aktywności
hialuronidazy
jest
w
tych
komórkach
ekspresjonowana,
b)
odzyskanie
wyekspresjonowanej domeny o aktywności hialuronidazy z pożywki. W przykładowym wykonaniu
30
domena o aktywności hialuronidazy jest sekrecjonowana do medium.
[0227] W jednym wykonaniu wynalazek dotyczy wektora zawierającego sekwencję nukleotydów
kodującą białko, będące pochodną sHASEGP, które wykazuje aktywność hialuronidazy i zawiera
domenę o aktywności hialuronidazy albo wyłącznie jej część lub wielokrotność kopii domeny o
aktywności hialuronidazy lub części tej domeny. Wynalazek dotyczy także wektorów, które zawierają
35
sekwencję nukleotydów kodującą domenę o aktywności hialuronidazy i, oprócz tej domeny,
dodatkową część białka sHASEGP, która może być różnej długości a nawet tak długa, że razem z
domeną o aktywności hialuronidazy tworzy kompletną cząsteczkę sHASEGP. Wynalazek obejmuje
także wielokrotność kopii sekwencji nukleotydów kodującej domenę o aktywności hialuronidazy i,
oprócz tej domeny, dodatkową część białka sHASEGP o różnej długości, aż do takiej, która razem z
40
domeną o aktywności hialuronidazy tworzy kompletną cząsteczkę sHASEGP. Do ekspresji
glikoproteiny sHASEGP lub jej domeny o aktywności hialuronidazy można wybrać takie wektory
ekspresyjne, które pozwolą na uzyskanie sekrecyjnej postaci ekspresjonowanej glikoproteiny
sHASEGP. Alternatywnie, sekwencja sygnałowa niezbędna do sekrecji kodowanych białek może
obecna w wektorach. W czasie ekspresji domeny o aktywności hialuronidazy kwas nukleinowy
łączony jest z kwasem nukleinowym kodującym sekwencję sygnałową, taką jak sekwencja sygnałowa,
czynnika koniugacji u Saccharomyces cerevisiae, jej część lub natywna sekwencja sygnałowa.
5
[0228] W celu wytworzenia rozpuszczalnej, aktywnej w obojętnym pH glikoproteiny o aktywności
hialuronidazy, potrzebne są komórki zdolne do N-glikolizacji. W korzystnym wykonaniu ssacze
komórki CHO z niedoborem reduktazy dihydrofolianowej, tj. komórki DG44, są elektroporowane w
obecności plazmidu kodującego w następującej kolejności: silny ssaczy promotor, tj. CMV, kwas
nukleinowy kodujący sHASEGP następnie sekwencję IRES (ang. Internal Ribosome Entry Site) i mysi
10
gen dla reduktazy dihydrofolianowej, sekwencję poliadenylacji wirusa SV40, co przedstawiono w
sekwencji ID. SEKW. Nr 51. Elekroporowane komórki są początkowo hodowane w pożywce
komórkowej o ściśle określonym składzie chemicznym nie zawierającej hipoksantyny i tymidyny, a
następnie w pożywce z dodatkiem metotreksatu o stopniowo zwiększającym się stężeniu.
[0229] Do ekspresji sekwencji kodujących białko można zastosować wiele różnych systemów
15
ekspresyjnych typu wektor/komórka gospodarza. Takie systemy obejmują, lecz nie tylko, systemy
ekspresyjne oparte na komórkach ssaczych transdukowane np. wirusem krowianki lub adenowirusem,
itd., systemy ekspresyjne oparte na komórkach owadzich infekowanych wirusem (np. bakulowirusem),
systemy ekspresyjne oparte na mikroorganizmach takich jak drożdże zawierające wektory lub
systemy ekspresyjne oparte na bakteriach transformowanych bakteriofagiem, DNA, plazmidowym
20
DNA lub kosmidem. Elementy wektorów odpowiedzialne za ekspresję różnią się „siłą działania” i
specyficznością. W zależności od zastosowanego systemu wektor/komórka gospodarza można
wykorzystać dowolny wspomniany element. Należy zauważyć, że przeprowadzając w bakteriach
ekspresję DNA dla sHASEGP nie otrzymuje się cząsteczki sHASEGP katalitycznie aktywnej. Dopiero
wspólne działanie najpierw bakteryjnego systemu ekspresyjnego, a w kolejnym etapie mechanizmu
25
prawidłowej glikozylacji prowadzi do otrzymania cząsteczki sztucznie glikozylowanej.
[0230] W celu wprowadzenia do wektora insertu w postaci fragmentów kwasu nukleinowego można
użyć dowolnych, znanych specjalistom, metod obejmujących gen chimeryczny zawierający
odpowiednie sekwencje kodujące sygnały dla transkrypcji i translacji jak również białko. Metody te
mogą obejmować techniki sztucznej rekombinacji DNA in vitro oraz techniki rekombinacji in vivo
30
(rekombinacja genetyczna). Ekspresja sekwencji kwasu nukleinowego kodującego glikoproteinę
sHASEGP lub jej domeny, pochodne, fragmenty lub homologi może być regulowana przez drugą
sekwencję, zatem wspomniane geny lub ich fragmenty są ekspresjonowane w komórkach gospodarza
transformowanych cząsteczką/cząsteczkami rekombinowanego DNA. Przykładowo ekspresja białek
może być kontrolowana przez dowolny promotor/wzmacniacz znany w stanie techniki. W
35
specyficznym wykonaniu promotor nie jest natywny dla genów glikoproteiny sHASEGP. Promotory,
które można zastosować, obejmują, lecz nie tylko, wczesny promotor SV40 (Bernoist and Chambon,
Nature 290: 304-310 (1981)), promotor znajdujący się na 3' końcu długiej powtarzającej się sekwencji
wirusa Rous Sarcoma (Yamamoto et al., Ce//22: 787-797 (1980)), promotor dla kinazy tymidynowej
wirusa opryszczki (Wagner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445 (1981)), sekwencje
40
regulatorowe genu metalotioneiny (Brinster et al., Nature 296: 39-42 (1982)), promotory
prokariotycznych wektorów ekspresyjnych, taki jak promotor β-laktamazy (Villa-Kamaroff et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 75 : 3727-3731 1978)) lub promotor TAC (Deboer et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 80: 21-25 (1983)); patrz także "Useful Proteins from Recombinant Bacteria" : in Scientific
American 242: 79-94 (1980)); promotory wektorów ekspresyjnych stosowanych w komórkach
roślinnych, taki jak promotor syntetazy opalin (Herrar-Estrella et al., Nature 303: 209-213 (1984)) lub
promotor 35S RNA wirusa mozaiki kalafiora (Garder et al., Nucleic Acids RES. 9 : 2871 (1981)) i
5
promotor enzymu fotosyntezującego karboksylazy rybulozo-bisfosforanu (Herrera-Estrella et al.,
Nature 310: 115-120 (1984)), elementy promotora z drożdży i innych grzybów jak promotor Gal4,
promotor dehydrogenazy alkoholowej, promotor kinazy fosfoglicerolowej, promotor alkalicznej
fosfatazy i następujące regiony kontrolujące transkrypcję w komórkach zwierzęcych, które wykazują
specyficzność tkankową i zostały zastosowane w zwierzętach transgenicznych: region kontrolujący
10
gen elastazy I aktywny w komórkach groniastych trzustki (Swift Et et al., Cell 38 : 639-646 (1984);
Omitz Et et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409 (1986); Macdonald, Hepatology 7:
425-515 (1987)); region kontrolujący gen insuliny aktywny w komórkach beta trzustki (Hanahan et al.,
Nature 315: 115-122 (1985)), region kontrolujący gen immunoglobulin aktywny w komórkach
limfoidalnych (Grosschedl et et al., Cell 38: 647-658 (1984); Adams et al., Nature 318: 533-538
15
(1985); Alexander et et al., Mol. Cell Biol. 7: 1436-1444 (1987)), region kontrolujący wirusa mysiego
raka sutka aktywny w komórkach jąder, sutka, komórkach limfoidalnych i tucznych (Leder et et al.,
Cell 45 : 485-495 (1986)), region kontrolujący gen albuminy aktywny w wątrobie (Pickert et et al.,
Genes and Devel. 1: 268- 276 (1987)), region kontrolujący gen α-fetoproteiny aktywny w wątrobie
(Krumlauf et et al., Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648 (1985); Hammer et et al., Science 235: 53-58 1987)),
20
region kontrolujący gen α1-antytrypsyny aktywny w wątrobie (Kelsey et al., Genes And Devel. 1: 161171 (1987)), region kontrolujący gen β-globiny aktywny w komórkach mieloidalnych (Mogram et al.,
Nature 315: 338-340 (1985); Kollias et et al., CE//46: 89-94 (1986)) region kontrolujący gen dla
podstawowego białka mieliny aktywny w komórkach oligodendrytycznych mózgu (Readhead et al.,
Cell 48: 703-712 (1987)), region kontrolujący gen 2 lekkiego łańcucha miozyny aktywny w komórkach
25
mięśni szkieletowych (Sani, Nature 314: 283-286 (1985)), region kontrolujący gen uwalniania
gonadotropiny aktywowany w gonadotropach podwzgórza (Mason et al., Science 234: 1372-1378
(1986)).
[0231] W specyficznym wykonaniu zastosowany wektor zawiera promotor funkcjonalnie połączony z
kwasami nukleinowymi kodującymi glikoproteinę sHASEGP lub jej domenę, fragment, pochodną lub
30
homolog, jedno lub więcej miejsc inicjacji replikacji i fakultatywnie jeden lub więcej markerów
selekcyjnych (np. gen oporności na antybiotyk).
[0232] Do wydajnej translacji sekwencji sHASEGP mogą być wymagane specyficzne sygnały inicjacji.
Sygnały te zawierają kodon inicjacji ATG i sekwencje przyległe. W przypadku, kiedy kod inicjacji i
sekwencje położone powyżej, w kierunku 5', są wprowadzone do odpowiedniego wektora
35
ekspresyjnego, nie są potrzebne żadne dodatkowe kontrolne sygnały translacji. Jednakże w
przypadku, kiedy wprowadzona jest wyłącznie sekwencja kodująca lub jej część, muszą być
dostarczone egzogenne sygnały kontrolujące inicjację transkrypcji zawierające kodon inicjacji ATG.
Co więcej, żeby transkrypcja objęła cały insert, kodon inicjacji musi znajdować się w prawidłowej
ramce odczyty. Egzogenne elementy transkrypcji i kodony inicjacji mogą być różnorakiego
40
pochodzenia, zarówno naturalnego jak i syntetycznego. Wydajność ekspresji można podnieść przez
włączenie w elementy transkrypcyjne odpowiednich dla stosowanego systemu komórkowego
wzmacniaczy (Scharf D et al (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62; Bittner et al (1987) Methods
in Enzymol 153:516-544)
[0233] Co więcej komórki gospodarza mogą być wybrane ze względu na zdolność do modulacji
ekspresji wprowadzonych sekwencji lub ze względu na pożądany sposób przebiegu procesu
5
ekspresji. Tego typu modyfikacje białka obejmują, lecz nie tylko, acetylację, karboksylację,
glikozylację, fosforylację i acylację. Obróbka posttranslacyjna, w czasie której trawione jest probiałko
może być także istotna dla prawidłowej insercji, fałdowania i/lub funkcji. Różne komórki gospodarza
takie jak CHO (DG44, DXB 11 CHO-K1), HeLa, MDCK, 293, WI38), itd. posiadają specyficzną
maszynerię komórkową i charakterystyczne mechanizmy dla takich post-translacyjnych aktywności i z
10
tego względu mogą być wybrane w celu zapewnienia prawidłowej modyfikacji i obróbki
wprowadzonego do nich obcego białka.
[0234]
Dla
celów
długotrwałego,
wysoko-wydajnego
wytwarzania
rekombinowanego
białka
preferowana jest ekspresja stabilna. Przykładowo, linie komórkowe, które stabilnie ekspresjonują
sHASEGP, mogą być transformowane z zastosowaniem wektorów ekspresyjnych zawierających
15
miejsca inicjacji replikacji pochodzenia wirusowego lub endogenne elementy ekspresyjne i gen
markerowy. Po wprowadzeniu wektora, komórki rosną we wzbogaconej pożywce, a 1-2 dni później w
pożywce selekcyjnej. Marker selekcyjny zapewnia oporność na czynnik selekcyjny, dzięki czemu
komórki, które z powodzeniem ekspresjonują wprowadzoną sekwencję, mogą przetrwać selekcję i
ulegać podziałom. Agregaty stabilnie transformowanych opornych komórek mogą być rozmnażane
20
przy zastosowaniu technik hodowli komórkowych dostosowanych do danego typu komórki.
[0235] Do uzyskania linii transformowanych komórek można stosować dowolną ilość systemów
selekcyjnych. Systemy selekcyjne obejmują, lecz nie tylko, geny kinazy tymidynowej wirusa
opryszczki (Wigler M. et al. (1977) Cell 11:223-32) i fosforybozylotransferazy adeniny (Lowy I. et al.
(1980) Cell 22:817-23) wykorzystywane w komórkach odpowiednio TK lub APRT. Oporność na
25
antymetabolity, antybiotyki i herbicydy może być także wykorzystana jako podstawa do selekcji, np.
DHFR jest odpowiedzialna za oporność na metotreksat (Wigler M. et al. (1980) Proc Natl Acad Sci
77:3567-70); np. odpowiedzialny za oporność na antybiotyki aminoglikozydowe jak neomycyna czy G418 (Colbere-Garapin F. et al. (1981) J Mol Biol 150:1-14), a także als lub pat odpowiedzialne za
oporność odpowiednio na chlorsulfuron i fosfinotrycynę/acetylotransferazę fosfinotrycyny (Murry,
30
supra). Opisano także inne geny odpowiedzialne za selekcję jak np. trpB, który pozwala komórkom na
wykorzystanie indolu zamiast tryptofanu lub gen hisD, który umożliwia komórkom wykorzystanie
histynolu zamiast histydyny (Hartman S C and R C Mulligan (1988) Proc Natl Acad Sci 85: 8047-51).
W ostatnim czasie popularne stało się stosowanie genów markerowych ekspresjonujacych widzialny
produkt, taki jak antocyjany, β-glukuronidaza wraz z substratem, GUS, lucyferaza wraz z substratem
35
lucyferyną. Widzialne markery znalazły zastosowanie nie tylko w identyfikacji transformantów, lecz
także w ilościowym określaniu wydajności przejściowej lub stabilnej ekspresji związanej ze
specyficznym systemem wektorów (Rhodes C A et al. (1995) Methods Mol Biol 55:121-131).
[0236]
IDENTYFIKACJA
TRANSFORMANTÓW
ZAWIERAJĄCYCH
SEKWENCJĘ
POLINUKLEOTYDOWĄ.
40
[0237] Wprawdzie obecność/nieobecność genu markera ekspresji sugeruje, że gen będący
przedmiotem zainteresowania jest także obecny, obecność DNA i ekspresja aktywnej sHASEGP
powinna zostać potwierdzona. Przykładowo, gdy DNA dla sHASEGP jest insertem w obrębie
sekwencji genu markerowego, rekombinowane komórki posiadające sHASEGP można rozpoznać
stwierdzając braku funkcjonowania tego genu.
[0238] OCZYSZCZANIE sHASEGP
[0239] Komórki gospodarza transformowane sekwencją nukleotydową sHASEGP mogą być
5
hodowane w warunkach odpowiednich dla ekspresji oraz odzyskiwania kodowanego białka z hodowli
komórkowej. Białko wytwarzane przez rekombinowaną komórkę jest korzystnie sekrecjonowane, ale
może być także ekspresjonowane do wnętrza komórki w zależności od zastosowanej sekwencji i/lub
wektora. Jak rozumieją to specjaliści w danej dziedzinie, wektory ekspresyjne z sHASEGP mogą być
zaprojektowane tak, by zawierały sekwencję sygnałową, która ułatwia bezpośrednią sekrecję
10
sHASEGP przez błonę komórkową Procariota lub Eucariota. W innego typu konstruktach sekwencja
kodująca sHASEGP może być dołączana do sekwencji nukleotydowej kodującej domenę białkową,
ułatwiającą oczyszczanie rozpuszczalnego białka (Kroll D J et al. (1993) DNA Cell Biol 12:441-53; por.
dyskusja dotycząca wektorów zawierających białko fuzyjne).
[0240] sHASEGP może być również ekspresjonowana jako białko rekombinacyjne z jednym lub
15
kilkoma dodatkowymi domenami polipeptydowymi dodanymi do izolowanego białka, aby ułatwić jego
oczyszczanie. Tego typu domeny zawierają, lecz nie tylko, peptydy chelatujące metale, takie jak
motywy histydyna-tryptofan, pozwalające na oczyszczanie na złożach z unieruchomionymi jonami
metali przejściowych, domeny z białkiem A, które umożliwiają oczyszczanie na złożu z
immobilizowanymi immunoglobulinami i domeny ze znacznikiem FLAG, który umożliwia oczyszczanie
20
metodą chromatografii powinowactwa (Immunex Corp, Seattle Wash.). Proces oczyszczania ułatwia
wprowadzenie sekwencji łącznika, którą można rozciąć np. proteazą Faktor XA lub enterokinazą
(Invitrogen, San Diego Calif.) między domeną ułatwiającą oczyszczanie, a sHASEGP. Jeden z tego
typu wektorów ekspresyjnych dostarcza białko fuzyjne, które składa się z sHASEGP i kwasu
nukleinowego kodującego motyw 6 reszt histydyny oraz miejsca cięcia dla tioredoksyny i
25
enterokinazy. Motyw histydynowy ułatwia oczyszczanie na IMIAC (chromatografia powinowactwa na
unieruchomionych jonach metali,wg. opisu Porath et al. (1992) w Protein Expression and Purification
3: 263-281) natomiast miejsce cięcia dla enterokinazy dostarcza narzędzia do oczyszczania chemokin
z elementu fuzyjnego.
[0241] Oprócz wytwarzania metodą rekombinacyjną, fragment sHASEGP można wytwarzać w
30
bezpośredniej syntezie peptydu stosując techniki syntezy na nośniku stałym (por. Stewart et al. (1969)
Solid-Phase Peptide Synthesis, W H Freeman Co, San Francisco; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc
85:2149-2154). Syntezę białek in vitro można przeprowadzić technikami manualnymi lub
automatycznie. Automatycznie można syntetyzować w syntezatorze Applied Biosystems 431A
Peptide Synthesizer (Perkin Elmer, Foster City Calif.) zgodnie z instrukcją dostarczoną przez
35
producenta. Poszczególne fragmenty sHASEGP mogą być osobno syntezowane chemicznie i
łączone metodami chemicznymi aż do otrzymania kompletnej cząsteczki.
[0242] Wektory ekspresyjne, zawierające sekwencje kodujące sHASEGP lub ich części, są otrzymane
przykładowo przez klonowanie kodującej części w miejsce EcoRI każdego z trzech wektorów pGEX,
wektorów ekspresjonujących S-transferazę glutationową (Smith and Johnson, Gene 7: 31-40 (1988)).
40
Pozwala to na ekspresję produktów w prawidłowej ramce odczytu. Przykładowymi wektorami i
systemami do ekspresji domeny o aktywności hialuronidazy białka sHASEGP są dobrze znane
wektory oparte na komórkach Pichia (dostępne na przykład w firmie Invitrogen, San Diego, CA), w
szczególności te, które zostały zaprojektowane do sekrecji kodowanych białek. Białko może być
również ekspresjonowane do cytoplazmy lub ciałek inkluzyjnych. Jeden tego typu wektora został
opisany w przykładach.
[0242] Wektory do transformacji E. coli obejmują np. wektor ekspresyjny pET (patrz U. S patent
5
4,952,496; dostępny w firmie Novagen, Madison, WI ; także pozycje literaturowe opublikowane przez
Novagen opisujące system).
[0244] Tego typu plazmidy obejmują pET11a, który zawiera T71 ac promotor, T7 terminator,
indukowalny operon lac z E. coli i represor genu lac; pET12A-C, który zawiera T7 promotor, T7
terminator i sekwencję sygnałową OMPT z E. coli.; pET15B i pET19B (Novagen, Madison, Wi), który
10
zawiera sekwencję znacznika His-tag stosowaną przy oczyszczaniu na kolumnie His i miejsce
trawienia dla trombiny, które wykorzystuje się po etapie oczyszczania na kolumnie; T7 region
promotorowy i T7 terminator.
[0245] Wektory są wprowadzane do komórek gospodarza takich jak komórki Pichia i komórki
bakteryjne jak E. coli i odbywa się w nich ekspresja białek. Przykładowe szczepy Pichia obejmują np.
15
GS115. Przykładowe szczepy bakteryjnych komórek gospodarza zawierają chromosomalne kopie
DNA kodujące T7 polimerazę RNA funkcjonalnie połączoną do indukowalnego promotora, takiego jak
promotor LACUV (patrz U. S. Patent Nr 4,952,496). Tego typu komórki gospodarza obejmują, lecz nie
tylko, lizogenny szczep E. coli BL21 (DE3).
[0246] Domeny sHASEGP, pochodne i analogi mogą być wytwarzane różnymi metodami znanymi w
20
stanie techniki. Przykładowo, kiedy stwierdzi się obecność białka sHASEGP, jego domeny, fragmentu
lub pochodnej, produkt genu może być wyizolowany i zanalizowany. Analizy można dokonać za
pomocą testów opartych na fizycznych i/lub funkcjonalnych właściwościach białka, w tym, lecz nie
tylko, za pomocą analizy znakowanego radioaktywnie produktu w elektroforezie na żelu,
immunotestów, sieciowania produktu znakowanego markerem i testów aktywności proteolitycznej.
25
[0247] Białko sHASEGP może być izolowane i oczyszczane standardowymi metodami znanymi w
stanie techniki (również z naturalnych źródeł oraz z komórek gospodarza ekspresjonujących
kompleksy białek), obejmującymi lecz nie tylko, kolumnę chromatograficzną (np. chromatografia
jonowymienna, powinowactwa, sączenie molekularne, wysokociśnieniowa chromatografia odwróconej
fazy (HPLC), szybka chromatografia cieczowa białek (FPLC), wirowanie różnicowe, rozpuszczalność
30
różnicową i inne standardowe techniki stosowane do oczyszczania białek,
[0248] W jednym wykonaniu sHASEGP można oczyszczać do stanu homogenności z chemicznie
zdefiniowanych pożywek hodowlanych, przeznaczonych do hodowli komórek DG44 transfekowanych
wektorem HZ24 i namnażanych w obecności metotreksatu, techniką : 1) diafiltracji ze sztucznym
przepływem, 2) wiązania i elucji ze złoża anionowej chromatografii powinowactwa, 3) przepływu przez
35
kolumnę ze złożem Sefaroza z grupami fenylowymi, 4) wiązania i elucji ze złoża chromatograficznego
na bazie boronianu fenylu, 5) wiązania i elucji ze złoża chromatograficznego hydroksyapatytu.
[0249] Właściwości funkcjonalne można ocenić stosując odpowiedni test znany w stanie techniki.
[0250] Alternatywnie, kiedy stwierdzi się obecność białka sHASEGP, jego domeny, fragmentu lub
pochodnej, o sekwencji aminokwasowej można wysnuć wniosek na podstawie sekwencji
40
nukleotydowej genu, który ją koduje. W konsekwencji białko lub jego domena mogą być
syntetyzowane standardowymi metodami chemicznymi znanymi w stanie techniki (np. patrz
Hunkapiller et al., Nature 310: 105-111 (1984)), a następnie poddawane glikozylacji in vitro.
[0251] Modyfikacje białka sHASEGP mogą być przeprowadzone na poziomie białka. Wynalazek
obejmuje białka sHASEGP, jego domeny, pochodne i analogi, które są odmiennie modyfikowane w
czasie lub po translacji np. przez glikozylację, acetylację, fosforylację, amidację, pegilację,
derywatyzację ze znanymi grupami ochronnymi/blokującymi, trawienie proteolityczne, łączenie z
5
cząsteczką przeciwciała i innymi ligandami komórkowymi.
[0252] Modyfikację można przeprowadzić jedną z wielu znanych chemicznych technik modyfikacji,
które obejmują, lecz nie tylko, specyficzne trawienie chemiczne bromkiem cyjanu, trypsyną,
chymotrypsyną, papainą, V8, NaBH4, acetylacją, formylacją, utlenianiem, redukcją, metaboliczną
syntezą w obecności tunikamycyny i innych czynników.
10
[0253] Dodatkowo domeny, analogi i pochodne białka sHASEGP mogą być syntetyzowane
chemicznie. Na przykład peptyd odpowiadający części białka sHASEGP, który zawiera pożądaną
domenę, lub który wpływa na aktywność in vitro, może być syntetyzowany przy użyciu syntezatora
peptydów.
[0254] Co więcej, jeżeli istnieje taka potrzeba, do sekwencji białka sHASEGP można wprowadzić
15
przez substytucję lub dodanie nieklasyczne aminokwasy lub analogi aminokwasów obejmujące, lecz
nie tylko, izomery D zwykłych aminokwasów,
[0255] W przypadkach, kiedy podejrzewa się, że produkty naturalne są mutantami lub są izolowane z
nowych gatunków, sekwencja aminokwasowa białka sHASEGP z naturalnego źródła, a także ta
ekspresjonowana in vitro lub syntetyzowana z wektorów ekspresyjnych in vivo lub in vitro, może być
20
określona
na
podstawie
analizy
sekwencji
DNA
lub
alternatywnie,
przez
bezpośrednie
sekwencjonowanie izolowanego białka. Tego typu analizę można przeprowadzić manualnie lub z
wykorzystaniem automatycznego sekwenatora aminokwasów.
[0256] Modyfikacje – wynalazek obejmuje różnorodne modyfikacje białek sHASEGP i domen. Kwas
nukleinowy kodujący sHASEGP może być modyfikowany według różnych strategii znanych w stanie
25
techniki (Sambrook et al. (1990), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor,New York). Sekwencje mogą być trawione w odpowiednich miejscach
endonukleazą/endonukleazami restrykcyjnymi, w kolejnym etapie poddawane, jeżeli zachodzi taka
potrzeba, dalszym modyfikacjom enzymatycznym, izolowane i ligowane in vitro. W procesie
wytwarzania genu kodującego domenę, pochodną lub analog sHASEGP, należy upewnić się, że
30
modyfikowany gen posiada oryginalną ramkę odczytu, a translacja nie zostanie przerwana kodonem
stop w regionie genu, gdzie kodowany jest pożądany region aktywny.
[0257] Dodatkowo kodujące cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być poddawane mutacjom in vitro i
in vivo w celu umożliwienia i/lub uniemożliwienia translacji, inicjacji, i/lub terminacji sekwencji lub w
celu stworzenia zmian w regionie kodującym i/lub utworzeniu nowych miejsc restrykcyjnych lub
35
zniszczenia już istniejących, w celu ułatwienia dalszych modyfikacji in vitro. Jak opisano także w
niniejszym dokumencie wynalazek obejmuje również muteiny ze zmianami w pierwotnej sekwencji,
takimi jak zamiana reszt cysteiny, usunięcie lub dodanie miejsc glikozylacji. W sekwencji ID. SEKW.
Nr 1 SHASEGP posiada siedem potencjalnych miejsc glikozylacji. Tego typu mutacje mogą być
przeprowadzone dowolną techniką mutagenezy znaną w stanie techniki, w tym, lecz nie tylko,
40
techniką mutagenezy chemicznej i techniką mutagenezy punktowej in vitro (Hutchinson et al., J. Biol.
Chem. 253: 6551-6558 (1978), TABE Linkers (Pharmacia)).W jednym wykonaniu np. białko
sHASEGP lub jego domena jest modyfikowana przez przyłączenie znacznika fluorescencyjnego. W
innym wykonaniu białko sHASEGP lub jego domena jest modyfikowana przez przyłączenie reagentu
heterobifunkcyjnego, który może być wykorzystany do sieciowania kompleksów białek w membranie.
[0258] Dodatkowo domeny, analogi i pochodne sHASEGP mogą być modyfikowane chemicznie.
Przykładowo peptyd odpowiadający części sHASEGP, który zawiera pożądaną domenę lub wywiera
5
wpływ na pożądaną aktywność może być syntetyzowany z wykorzystaniem syntezatora peptydów. Co
więcej, jeżeli jest to pożądane, nieklasyczne aminokwasy lub chemiczne analogi aminokwasów mogą
być wprowadzone jako substytucja lub addycja do sekwencji sHASEGP. Nieklasyczne aminokwasy
obejmują, lecz nie tylko izomery D popularnych aminokwasów, kwas 4-aminobutanowy, Abu, kwas 2amino butanowy, S-ABU, e-Ahx, kwas 6-amino kapronowy, Aib, kwas 2-amino izobutanowy, kwas 3-
10
amino propionowy, ornityna, norleucyna, norwalina, hydroksyprolina, sarkozyna, cytrulina, kwas
cysteinowy,t-butyloglicyna, t-butyloalanina, fenyloglicyna, cykloheksyloalanina, β-alanina, fluoro
aminokwasy, syntetyczne aminokwasy takie jak ti-metylo aminokwasy, ca-metylo aminokwasy, nametylo aminokwasy i generalnie analogi aminokwasów. Ponadto aminokwas może być d
(prawoskrętny) lub 1 (lewoskrętny).
15
[0259] F. WYTWORZENIE FUNKCJONALNIE AKTYWNEJ GLIKOZYLOWANEJ sHASEGP Z NGLIKANAMI.
[0259] F. OTRZYMYWANIE FUNKCJONALNIE AKTYWNEJ GLIKOZYLOWANEJ sHASEGP Z
POŁĄCZONYMI PRZEZ ATOM N UGRUPOWANIAMI CUKROWYMI.
[0260] Aby wytworzyć katalitycznie stabilne białko wymaganE jest otrzymanie prawidłowo N-
20
glikozylowanej ludzkiej sHASEGP. N-glikozylacja sHASEGP może być prowadzona przy pomocy
różnych technik. Glikozylację można przeprowadzić przez wprowadzenie do komórek pochodzenia
eukariotycznego kwasów nukleinowych kodujących takie sHASEGP, które zapewniają prawidłową Nglikozylację lub alternatywnie, przez umieszczenie polipeptydu z sHASEGP w kontakcie z ekstraktami
komórkowymi lub oczyszczonymi enzymami, zapewniającymi wprowadzenie do struktury polipeptydu
25
ugrupowania cukrowego połączonego przez atom N.
WYBÓR SYSTEMU EKSPRESYJNEGO
[0261] Systemy ekspresyjne oparte na komórkach ssaków różnią się stopniem i typem glikozylacji
wprowadzanej do ektopowo ekspresjonowanych peptydów, na przykład komórki CHO są wysoce
wydajne, jeśli chodzi o N-glikozylację aktywnego polipeptydu sHASEGP.
30
[0262] Dodatkowe systemy ekspresyjne oparte na komórkach eukariotycznych, które pozwalają na Nglikozylację i wytworzenie funkcjonalnej sHASEGP, można przetestować poprzez wprowadzenie
plazmidu ekspresyjnego dla sHASEGP do wspomnianych komórek i testowanie pod kątem
aktywności w obojętnym pH. Identyfikację czy N-glikozylacja zaszła prawidłowo można wykonać przy
użyciu analizy FACE glikanów uwolnionych w wyniku traktowania glikoproteiny PGNazą. Profile
35
glikozylacji dla katalitycznie aktywnych glikoprotein sHASEGP są przedstawione w dalszej części
dokumentu. Weryfikację glikozylacji można także przeprowadzić poprzez traktowanie PGNazą F
glikoproteiny sHASEGP otrzymanej ze wspomnianych komórek lub przez wklonowanie kwasów
nukleinowych kodujących sHASEGP do wspomnianych komórek i hodowlę tych komórek w medium
zawierającym tunikamycynę.
40
[0263] N-glikozylacja polipeptydu sHASEGP in vitro. Polipeptyd sHASEGP może być poddany Nglikozylacji przez kontakt z ekstraktami komórek o aktywności pozwalającej na wprowadzenie
połączonych przez atom N cukrów do struktury polipeptydu sHASEGP, takimi jak mikrosomy psów lub
przez komercyjnie dostępny system połączonej transkrypcji i translacji (Promega Madison WI).
[0264] Zakłada się, że oligosacharydy posiadają koniec redukujący i koniec nieredukujący, niezależnie
od tego czy reszta cukrowa na końcu redukującym jest czy też nie jest w rzeczywistości cukrem
5
redukującym. W zgodzie z przyjętą nomenklaturą, przedstawione tutaj graficznie struktury
oligosacharydów posiadają koniec nieredukujący po lewej stronie i koniec redukujący po prawej
stronie. Wszystkie przedstawione tutaj oligosacharydy są opisane z wykorzystaniem nazwy lub skrótu
danego cukru nieredukującego (np. Gal), a następnie konfiguracji wiązania glikozydowego (alfa lub
beta), pozycji atomu węgla w pierścieniu cukru nieredukującego zaangażowanego w wiązanie
10
glikozydowe, pozycji atomu węgla w pierścieniu cukru redukującego zaangażowanego w wiązanie
glikozydowe, a następnie nazwy lub skrótu dla cukru redukującego (np. GlcNAc). Wiązanie pomiędzy
dwoma resztami cukrowymi może być na przykład wyrażone jako 2,3, 2→3 lub (2,3). Każdy
monocukier jest piranozą.
[0265] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie połączone przez atom N ugrupowanie
15
cukrowe („N-glikan”) odnosi się do oligosacharydu związanego przez amidowy atom azotu reszty Asn
sHASEPG. Wyróżnia się kilka głównych typów połączonych przez atom N oligosacharydów
(wysokomannozowy, kompleksowy, hybrydowy, siarczanowany), a wszystkie z nich posiadają rdzeń
(Man)3-GlcNAc-GlcNAc połączony wiązaniem amidowym z grupą aminową Asn, która wchodzi w
skład sekwencji –Asn-Xaa-Thr/Ser- (gdzie Xaa nie jest Pro). Miejsca N-glikozylacji są często
20
pośrednio identyfikowane podczas sekwencjonowania przez pojawienie się tzw. „pustych” cykli.
Bezpośrednią identyfikację można przeprowadzić po zwolnieniu oligosacharydów w wyniku trawienia
enzymem PNG F, który przekształca glikozylowaną Asn w Asp. Połączone przez atom N
oligosacharydy, uwolnione w wyniku traktowania PGN F, mogą być oczyszczone przy użyciu
chromatografii żelowej na złożu Bio-Gel P-6, a następnie poddane rozdziałowi z wykorzystaniem
25
prepartatywnej (wysokie pH) wysokosprawnej chromatografii jonowymiennej (HPAEC) (Townsend et
al., (1989) Anal. Biochem. 182, 1-8). Pewne izomery oligosacharydów mogą być rozdzielone przy
pomocy HPAEC. Obecność w strukturze reszt fukozy będzie przesuwała pozycję elucji danej
cząsteczki na chromatogramie HPAEC na pozycję wcześniejsza, podczas gdy dodatkowe reszty
kwasu sjalowego będą zwiększały czas retencji. Równoległe poddanie tej metodzie glikoprotein o
30
znanych strukturach oligosacharydowych (takich jak: fetuina wołowa, kwaśna glikoproteina a-1,
ovoalbumina, RNAza B, transferyna) może ułatwić opisanie odpowiadających oligosacharydom pików.
Zebrane oligosacharydy mogą być scharakteryzowane przy użyciu kombinacji metod takich jak
analiza jakościowa i analiza metylacyjna wskazujące na skład i pozycję wiązań glikozydowych
(Waegheet al., (1983) Carbohydr Res. 123, 281-304.), oraz spektroskopia NMR pozwalająca określić
35
konfigurację anomeryczną wiązań glikozydowych (Van Halbeek (1993) in Methods Enzymol 230).
[0266] Alternatywnie, oligosacharydy mogą być identyfikowane w elektroforezie cukrów z użyciem
znaczników fluorescencyjnych (FACE) (Callewaert et al. (2001) Glycobiology 11, 275-281).
[0267] G. DETEKCJA I CHARKTERYSTYKA POŁĄCZONYCH PRZEZ ATOM N UGRUPOWAŃ
CUKROWYCH sHASEGP.
40
[0268] Pierwszym etapem w analizie glikanów glikoprotein jest sprawdzenie czy otrzymane białko
rzeczywiście
jest
glikozylowane.
Metodą
z
wyboru
jest
użycie
elektroforezy
w
żelu
poliakryloamidowym w warunkach denaturujących w obecności siarczanu dodecylu sodu (SDS-
PAGE) jako ostatniego etapu przed sekwencjonowaniem białka. Glikozylowane proteiny często
migrują podczas analizy SDS-PAGE w postaci rozdyfundowanych prążków. Wskazaniem na
obecność N-glikanów jest znaczące zmniejszenie szerokości prążka i zmiana jego pozycji migracji w
wyniku
5
traktowania
glikoproteiny
amidazą
cząsteczki
peptyd-N4-(N-acetylo-D-glukozaminylo)-
asparagina (PNGazą F). W przypadku obecności innych typów glikozylacji należy użyć innych metod.
Immunobloting z wykorzystaniem lektyn jest metodą, która nie pozwala na rozróżnienie rodzaju
glikolizacji (N od O). Lektyny będące białkami wiążącymi węglowodany, posiadają zarówno wysokie
powinowactwo jak i wąską specyficzność względem szerokiej gamy zdefiniowanych cukrowych
epitopów obecnych w glikanach glikoprotein (Cummings, R. D. (1994) Methods in Enzymol. 230, 66-
10
86.). Można je łatwo identyfikować, kiedy są skoniugowane z biotyną lub dioksygeniną, na membranie
otrzymanej techniką western-blot poprzez reakcję kolorymetryczną z wykorzystaniem awidyny lub
skierowanych przeciwko dioksygeninie przeciwciał koniugowanych z alkaliczną fosfatazą (Haselbeck,
et al. (1993) Methods in Mol. Biol. 14, 161-173.), analogów drugorzędowych przeciwciał
koniugowanych z alkaliczną fosfatazą. Testy wiązania glikoproteiny z wykorzystaniem panelu lektyn o
15
dobrze zdefiniowanej specyficzności pozwalają na uzyskanie istotnych informacji o glikanach
obecnych na jej powierzchni. Istotne jest, że wzmocnienie wywoływania koloru w przypadku tej
metody jest wystarczająco wysokie aby można było łatwo zobaczyć od 10 do 15 ng glikoproteiny
przeniesionej na membranę techniką western-blot. Mimo, iż lektyny posiadają bardzo wysokie
powinowactwo do swoich ligandów, niektóre z nich wykazują znaczącą awidność do podobnych pod
20
względem struktury epitopów. Dlatego też, wybierając panel lektyn do testu należy pamiętać o
możliwości
wystąpienia
reakcji
krzyżowych
i
wybierać
te
lektyny,
które
z
dużym
prawdopodobieństwem są w stanie rozróżnić złożone i wysokomannozowe N-glikany od O-glikanów.
[0269] W celu zbadania czy sHASEGP jest glikozylowana można wykorzystać analizę składu
cukrowego, która w przypadku analizy z wykorzystaniem lektyn dostarcza dodatkowej informacji o
25
strukturze glikanów. Jakościowa analiza składu cukrowego i) pozwala zidentyfikować glikozylowane
białka, ii) pozwala oznaczyć stosunek molowy poszczególnych cukrów do cząsteczki białka, iii)
pozwala zidentyfikować, w niektórych przypadkach, typy glikanów, iv) stanowi pierwszy etap
projektowania strategii analizy strukturalnej i vi) pozwala ocenić powtarzalność procesu wytwarzania
rekombinowanych glikoprotein o właściwościach terapeutycznych. W ostatnich latach do analizy
30
składu cukrowego intensywnie wykorzystuje się wysokosprawną chromatografię jonowymienną (w
warunkach wysokiego pH) z pulsacyjną detekcją amperometryczną (HPAEC-PAD) (Townsend, et al.
(1995)
in
Carbohydrate
Analysis:
High-performance
liquid
chromatography
and
capillary
electrophoresis (Z. E1 Rassi ed.). pp. 181-209.). Niedawno wprowadzono metody oparte na
znakowaniu cząsteczek fluoroforami i obecnie dostępnych jest wiele gotowych zestawów opartych na
35
takich metodach. Zaletą wyróżniającą metody fluorescencyjne jest ich wyższa czułość (50-krotna).
Natomiast jedną z potencjalnych wad jest to, że różne monocukry mogą wykazywać podczas reakcji
wiązania zróżnicowaną selektywność względem fluoroforu, zarówno w hydrolizacie jak i w mieszaninie
zewnętrznych standardów. Mimo tego, metoda ta jest atrakcyjna z powodu podwyższonej czułości i
możliwości określenia składu cukrowego w małej porcji dostępnej próbki glikoproteiny, jak i możliwości
40
podwyższenia czułości przy wykorzystaniu fluorescencji znakowanej laserem.
[0270] Najlepszym sposobem analizy składu cukrowego małych ilości sHASEGP jest poprzedzony
rozdziałem
elektroforetycznym
elektrobloting
z
wykorzystaniem
membran
PVDF
(PSQ)
(Weitzhandleret al, (1993) J. Biol. Chem. 268, 5121-5130.), a w przypadku jeszcze mniejszych ilości –
dot-blot. PVDF jest idealną matrycą do analizy cukrów ponieważ nie wiąże ani monocukrów ani
oligosacharydów, kiedy zostają one uwolnione w wyniku kwaśnej lub enzymatycznej hydrolizy.
[0271] Analiza FACE jest wydajną metodą w przypadku oznaczania profili glikozylacji glikoprotein
5
sHASEGP. Analiza profili glikozylacji metodą FACE (Prozyme), przy użyciu żeli zawierających 30%
oligosacharydów, jest jedną z takich technik. Do detekcji profili glikozylacji sHASEGP można
wykorzystać rozdzielone elektroforetycznie glikany uwolnione enzymatycznie w wyniku traktowania Nglikanazą (znaną także jako PNGaza) z powierzchni 100 pg glikoproteiny i znakowane fluoroforem
ANTS. Względną pozycję prążków odpowiadających glikanom oznacza się analizując jednocześnie
10
próbke, jej rozcieńczenia i standardy glikanów i wyznaczając odległość migracji w jednostkach stopnia
polimeryzacji (DP).
[0272] METODY SKRININGU DO IDENTYFIKACJI ZWIĄZKÓW CHEMICZNYCH MODULUJĄCYCH
AKTYWNOŚĆ sHASEGP
[0273] Przedstawiono i opisano tutaj kilka przykładów takich testów. Zrozumiałe jest, że domeny
15
hialuronidazy mogą być wykorzystywane również w innych testach. Jednakże jak pokazano tutaj,
domeny hialuronidazy posiadają aktywność katalityczną.
[0274] I jako takie są doskonałe do skriningowych testów in vitro.
[0275] wspomniane domeny mogą być wykorzystane również w testach wiązania.
[0276] Rozważa się wykorzystanie zymogenów pełnej glikoproteiny sHASEGP, aktywowanych
20
enzymów i domen hialuronidazy w każdym teście skriningowym znanym specjaliście w danej
dziedzinie, włączając w to testy przedstawione w niniejszym dokumencie. Stąd poniższy opis, jeśli
dotyczy testu na aktywność hialuronidazy, dotyczy zastosowania jednego łańcucha domeny o
aktywności hialuronidazy lub katalitycznie aktywnej części każdej hialuronidazy, włączając w to
sHASEGP. Przedmiotem niniejszego wynalazku są inne testy, takie jak testy wiązania, w
25
szczególności do wykorzystania z sHASEGP, włączając w to każdy ich wariant, na przykład warianty
splicingowe.
[0277] 1. Testy aktywności katalitycznej do identyfikacji czynników modulujących aktywność
hialuronidazowej białka sHASEGP.
Przedmiotem niniejszego wynalazku są sposoby identyfikacji modulatora aktywności katalitycznej
30
sHASEGP, szczególnie jednego łańcucha domeny o aktywności hialuronidazy lub jej katalitycznie
aktywnej części. Sposoby te mogą polegać na: doprowadzeniu do kontaktu sHASEGP, tzn. pełnej
cząsteczki zymogenu lub aktywnej formy sHASEGP, a w szczególności jednego łańcucha jej domeny
katalitycznej, z substratem dla sHASEGP w obecności testowanej substancji, detekcji proteolizy tego
substratu, względem którego testowana jest aktywność sHASEGP, a następnie porównaniu tej
35
aktywności z próbką kontrolną. Kontrolą może być na przykład aktywność sHASEGP testowana przez
doprowadzeniu do kontaktu sHASEGP, włączając w to pełną cząsteczkę zymogenu lub aktywną
formę sHASEGP, a w szczególności jeden łańcuch jej domeny katalitycznej, z substratem dla
sHASEGP i detekcji proteolizy tego substratu, względem którego testowana jest aktywność
sHASEGP. Porównywane są wyniki uzyskane dla próbek zawierających i pozbawionych testowanych
40
związków chemicznych. Różnica w aktywności pokazuje czy dany związek moduluje aktywność
sHASEGP. Niniejszy wynalazek dostarcza również aktywatorów proteolitycznej aktywacji sHASEGP,
a testy do ich identyfikacji opisano poniżej.
[0278] W jednym wariancie wykonania wynalazku, przy użyciu opisanych powyżej metod skriningu,
testowanych jest na raz wiele substancji. W innym wariancie wykonania, sHASEGP izolowana jest z
komórek docelowych, co pozwala na identyfikację czynników, które potencjalnie są specyficzne dla
tych komórek docelowych.
5
[0279] W jeszcze innym wariancie wykonania wynalazku, testowana substancja jest związkiem
terapeutycznym, dla którego różnica w aktywności sHASEGP mierzona w próbkach zawierających i
pozbawionych tej testowanej substancji pokazuje, że komórki docelowe odpowiadają na testowany
związek terapeutyczny.
[0280] Jeden ze sposobów obejmuje następujące etapy: (a) doprowadzania do kontaktu polipeptydu
10
sHASEGP lub jego domeny o aktywności hialuronidazy z jednym lub wieloma testowanymi związkami
chemicznymi w warunkach pozwalających na oddziaływanie między ligandem a tymi związkami
chemicznymi i (b) identyfikowanie spośród tych związków jednego lub więcej substancji, które
specyficznie wiążą ten ligand.
[0281] Inny sposób będący przedmiotem wynalazku obejmuje etapy: a) doprowadzania do kontaktu
15
polipeptydu sHASEGP lub jego domeny o aktywności hialuronidazy z substratem polipeptydu
sHASEGP i detekcję degradacji tego substratu, względem którego testowana jest aktywność
polipeptydu sHASEGP; b) doprowadzania do kontaktu danego polipeptydu sHASEGP z jego
substratem w obecności testowanej substancji i detekcji degradacji tego substratu, względem którego
testowana jest aktywność polipeptydu sHASEGP i c) porównywanie aktywności polipeptydu
20
sHASEGP określonej w etapach a) i b), przy czym aktywność zmierzona podczas etapu a) różni się
od aktywności zmierzonej w etapie b) i wskazuje, że testowana substancja moduluje aktywność
wspomnianego polipeptydu sHASEGP.
[0282] W innym wariancie wykonania wynalazku, testowanych jest jednocześnie wiele substancji.
Podczas porównywania aktywności polipeptydu sHASEGP w obecności lub przy braku testowanej
25
substancji, w celu sprawdzenia czy ta substancja jest modulatorem polipeptydu sHASEGP, nie jest
konieczne badanie tych aktywności równolegle chyba, że taki równoległy pomiar jest standardem.
Aktywność polipeptydu sHASEGP można mierzyć w jednym punkcie czasowym i porównywać ją z
wartościami aktywności uzyskanymi we wcześniejszych pomiarach.
[0283] Można na przykład mierzyć aktywność polipeptydu sHASEGP w obecności testowanej
30
substancji i porównywać ją z wartością aktywności zmierzoną we wcześniejszym pomiarze dla
polipeptydu sHASEGP przy braku testowanej substancji. Możliwa jest również odwrotna kolejność.
Pomiar taki można wykonać opierając się na ulotce lub instrukcji dostarczonej razem z gotowym
zestawem do przeprowadzenia testu.
[0284] Metody wyboru substratów dla poszczególnych glikoprotein sHASEGP opisano w części
35
eksperymentalnej razem z konkretnymi przykładami testów na aktywność hialuronidazy.
[0285] Przedmiotem niniejszego wynalazku są kombinacje i gotowe zestawy zawierające te
kombinacje, potencjalnie mogące zawierać instrukcje wykonania testu. Wspomniane kombinacje
obejmują testowany polipeptyd sHASEGP i jego substrat, a opcjonalnie mogą obejmować reagenty do
detekcji proteolizy tego substratu. Substraty, które mogą być cząsteczkami chromo- i fluorogennymi
40
zawierającymi glikozoaminoglikany i mogą być trawione proteolitycznie przez poszczególne
polipeptydy sHASEGP, mogą być identyfikowane doświadczalnie przez testowanie zdolności
sHASEGP do ich trawienia. Identyfikuje się najefektywniej trawione substraty, to znaczy takie, które są
trawione przy najniższych stężeniach i/lub z największą szybkością lub w oczekiwanych warunkach.
[0286] Dodatkowo niniejszy wynalazek dostarcza gotowego zestawu zawierającego opisaną powyżej
kombinację. Taki kit opcjonalnie zawiera instrukcję identyfikacji modulatora aktywności polipeptydu
5
sHASEGP. W niniejszym wynalazku każdy polipeptyd sHASEGP może być użyty do identyfikacji
modulatorów jego aktywności.
[0287] 2. Testy wiązania. Przedmiotem niniejszego wynalazku są również sposoby identyfikacji i
izolacji czynników, szczególnie związków chemicznych wiążących się do glikoprotein sHASEGP.
Testy te zaprojektowano do identyfikacji czynników, które wiążą się do wyizolowanej domeny
10
hialuronidazy (lub białka, innego niż polipeptyd sHASEGP, które zawiera domenę o aktywności
hialuronidazy z polipeptydu sHASEGP), aktywnej formy, włączając w to aktywną formę domeny
otrzymanej z pełnej cząsteczki zymogenu lub z przedłużonej domeny o aktywności hialuronidazy.
Zidentyfikowane związki chemiczne są potencjalnymi lekami lub służą do identyfikacji związków do
leczenia zaburzeń i chorób związanych z anormalną aktywnością hialuronidazy. Polipeptydy
15
sHASEGP zastosowane w sposobach obejmują, jak zdefiniowano w niniejszym opisie, każdy
polipeptyd sHASEGP, w tym pojedynczy łańcuch domeny o aktywności hialuronidazy z sHASEGP lub
jego proteolitycznie aktywną część.
[0288] Niniejszy wynalazek dostarcza różnorodnych sposobów. Sposoby takie mogą obejmować
reakcje w roztworach lub reakcje w fazie stałej, w przypadku których polipeptyd(y) sHASEGP lub jej
20
domena(y) o aktywności hialuronidazy są bezpośrednio lub pośrednio (przez łącznik) związane ze
stałym nośnikiem. Testy skriningowe opisano w części eksperymentalnej i wykorzystano je do
identyfikacji potencjalnych związków chemicznych.
[0289] Dla potrzeb niniejszego wynalazku, wszystkie testy wiązania opisane powyżej są przygotowane
do testowania sHASEGP.
25
[0290] Przedmiotem niniejszego wynalazku są sposoby identyfikacji czynnika, takiego jak związek
chemiczny, który specyficznie wiąże się do jednołańcuchowej domeny o aktywności hialuronidazy z
sHASEGP, pełnej aktywnej cząsteczki sHASEGP lub jej dwułańcuchowej domeny o aktywności
hialuronidazy. Sposób może polegać na (a) doprowadzeniu do kontaktu sHASEGP z jednym lub z
wieloma testowanymi czynnikami w warunkach sprzyjających wiązaniu między sHASEGP i danym
30
czynnikiem, i (b) zidentyfikowaniu pośród tych związków jednego lub większej liczby czynników, które
specyficznie wiążą daną sHASEGP.
[0291] Przykładowo, stosując takie sposoby dany polipeptyd sHASEGP miesza się z potencjalnym
partnerem wiążącym lub ekstraktem lub frakcją komórkową w warunkach pozwalających na asocjację
potencjalnego partnera wiążącego z tym polipeptydem. Po zmieszaniu peptydy, białka lub inne
35
cząsteczki, które asocjowały z sHASEGP są oddzielane od mieszaniny. Czynnik wiążący, który
związał się z sHASEGP może być następnie oddzielony i poddany dalszej analizie. W celu
identyfikacji i izolacji czynnika wiążącego, może zostać wykorzystane całe białko, na przykład całe
ujawnione białko o sekwencji ID. SEKW. Nr: 1. W innym wykonaniu wynalazku, wykorzystany może
być fragment tego białka.
40
[0292] W celu uzyskania ekstraktów komórkowych lub płynów ustrojowych, surowicy, moczu, potu,
mazi stawowej, CSF i inne tego typu płynów mogą być wykorzystane różnorodne metody.
[0293] Przykładowo komórki można dezintegrować zarówno przy pomocy metod fizycznych jak i
chemicznych. Przykładami fizycznych metod dezintegracji komórek, w żaden sposób jednak nie
ograniczonymi do poniższej listy, są sonikacja i cięcie mechaniczne. Przykładami metod lizy
chemicznej, w żaden sposób jednak nie ograniczonymi do poniższej listy, są liza detergentami i
5
trawienie enzymatyczne. Specjalista w danej dziedzinie łatwo dostosuje metody przygotowania
ekstraktów komórkowych do uzyskania ekstraktów potrzebnych w przedstawionych metodach.
[0294] Po uzyskaniu ekstraktu komórkowego jest on mieszany z sHASEGP w warunkach
sprzyjających asocjacji białka z partnerem wiążącym. Można w tym wypadku zastosować różnorodne
warunki, w tym warunki zbliżone do tych, które panują w cytoplazmie ludzkiej komórki lub w płynach
10
ustrojowych, takich jak krew. Wprowadzając zmiany stosowanych parametrów, takich jak
osmolarność, pH, temperatura i stężenie ekstraktu komórkowego, można optymalizować zjawisko
asocjacji białka z partnerem wiążącym. Analogicznie do opisanego przypadku, znane są metody
izolacji cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania z płynów ustrojowych.
[0295] Po zmieszaniu w odpowiednich warunkach, kompleks białko-partner wiążący jest izolowany z
15
mieszaniny. Do rozdziału takiej mieszaniny można zastosować różne metody. Na przykład jedna z
takich metod opiera się na immunoprecypitacji kompleksu białko-czynnik wiążący w wyniku reakcji
czynnika z przeciwciałami specyficznymi dla sHASEGP. Alternatywnie, można zastosować
standardowe techniki separacji takie jak chromatografia i wirowanie w gradiencie gęstości.
[0296] Po usunięciu niezwiązanych składników ekstraktu komórkowego, doprowadza się, przy użyciu
20
konwencjonalnych metod, do dysocjacji czynnika wiążącego z kompleksu. Przykładowo, do dysocjacji
kompleksu można doprowadzić przez zmianę stężenia soli lub pH mieszaniny.
[0297] Aby ułatwić wyizolowanie partnera wiążącego dla sHASEGP z ekstraktu, można immobilizować
sHASEGP na nośniku stałym. Białko może być na przykład związane z nitrocelulozą lub kuleczkami.
Związanie białka lub jego fragmentu ze stałym nośnikiem ma na celu ułatwienie oddzielenia pary
25
peptyd/czynnik
wiążący
od
innych
składników
znajdujących
się
w
ekstrakcie.
Takimi
zidentyfikowanymi partnerami wiążącymi mogą być zarówno pojedyncze białka lub kompleksy dwóch
lub więcej białek.
[0298] Alternatywnie, cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące pojedynczy łańcuch hialuronidazy
mogą być wykorzystane w drożdżowych systemach dwuhybrydowych. Drożdżowe systemy
30
dwuhybrydowe używano do identyfikacji innych kompleksów białkowych i z powodzeniem można je
zaadoptować
do
zastosowania
opisanych
w
niniejszym
dokumencie
cząsteczek
kwasów
nukleinowych.
[0299] Jeszcze inny test wiązania in vitro, szczególnie przydatny dla testowania glikoprotein
sHASEGP, polega na zastosowaniu mieszaniny polipeptydu, który zawiera co najmniej jedną domenę
35
katalityczną jednego z tych białek, i jednego lub większej liczby potencjalnych czynników wiążących
lub substratów. Po inkubacji takiej mieszaniny w odpowiednich warunkach, bada się zdolność danej
sHASEGP lub jej polipeptydowego fragmentu zawierającego domenę katalityczną do wiązania lub
oddziaływania z potencjalnym substratem. W testach wiązania opartych na ekstraktach komórkowych
jeden ze składników zawiera lub jest związany z wykrywalnym znacznikiem. Znacznik pozwala na
40
bezpośrednią detekcję, opartą o zjawisko radioaktywności, luminescencji, pomiar gęstości optycznej
lub elektronowej itp. lub detekcję pośrednią poprzez zastosowanie znacznika, enzymu itp. W celu
detekcji znacznika można zastosować różnorodne metody, które dobiera się w zależności od natury
znacznika i innych składników testu. Znacznik może być wykrywany na przykład jako związany z
substratem w formie stałej lub część kompleksu zawierającego znacznik może być oddzielona od
substratu, który występuje w formie stałej, po czym dochodzi do detekcji znacznika.
[0300] 3. Detekcja przekazywania sygnału przez sHASEGP, która jest białkiem zakotwiczonym w
5
błonie komórkowej, może być przeprowadzona bezpośrednio i opierać się na receptorze
powierzchniowym komórki lub pośrednio wykorzystując białka aktywujące, takie jak czynniki wzrostu,
które mogą inicjować transdukcję sygnału.
[0301] Dodatkowo, sekrecyjna sHASEGP, taka jak rozpuszczalna domena sHASEGP opisana
sekwencją ID. SEKW. Nr 4, może być zaangażowana w transdukcję sygnału zarówno bezpośrednio,
10
przez związanie lub oddziaływanie z receptorem powierzchniowym komórki, lub pośrednio przez
białka aktywujące, takie jak czynniki wzrostu, które inicjują transdukcję sygnału. Testy oceny sygnału
transdukcji są dobrze znane specjaliście w danej dziedzinie i mogą być łatwo zaadoptowane do
wykorzystania z polipeptydem sHASEGP.
[0302] Przedmiotem niniejszego wynalazku są testy do identyfikacji czynników, które modulują lub
15
wpływają na sygnał transdukcji przekazywany bezpośrednio lub pośrednio przez aktywację czynników
wzrostu przez sHASEGP, szczególnie całe białko lub jego część, która wystarcza do tego aby
zakotwiczyć jej domenę zewnątrzkomórkową na powierzchni komórki. Takie testy, obejmują na
przykład testy oparte na transkrypcji, w których modulacja transdukcji sygnału badana jest przez
pomiar efektu genu reporterowego na ekspresję (patrz: Patent US Nr 5436128).
20
[0303] 4. Metody identyfikacji czynników modulujących ekspresje kwasu nukleinowego kodującego
sHASEGP.
W innym wariancie wykonania, wynalazek dostarcza spsobu identyfikacji czynników modulujących
ekspresję kwasu nukleinowego kodującego sHASEGP. Takie testy mogą wykorzystywać każdy
dostępny sposób monitorowania zmian w poziomie ekspresji kwasów nukleinowych kodujących
25
sHASEGP.
[0304] Monitorowanie zdolności czynnika do modulacji ekspresji kwasu nukleinowego kodującego
sHASEGP można przeprowadzić w formie testu. Na przykład ekspresja mRNA może być
monitorowana bezpośrednio poprzez hybrydyzację do kwasów nukleinowych. Opisano również testy
enzymatyczne służące detekcji czynników modulujących ekspresję sHASEGP.
30
[0305] W odpowiednich warunkach linie komórkowe są poddawane działaniu testowanych czynników
w określonym czasie i całkowite RNA lub mRNA izolowane jest przy użyciu standardowych procedur
(patrz np. Sambrook et al (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed. Cold
Spring Harbor Laboratory Press). Sondy do wykrywania różnic między poziomami ekspresji RNA w
komórkach poddanych działaniu danego czynnika a poziomami ekspresji RNA w komórkach
35
kontrolnych mogą być wykonane z kwasów nukleinowych. Zazwyczaj, ale nie koniecznie, projektuje
się sondy, które hybrydyzują tylko z docelowym kwasem nukleinowym w wysoce rygorystycznych
warunkach. Tylko wysoce komplementarny kwas nukleinowy tworzy hybrydy w warunkach wysoce
rygorystycznych.
Wobec
tego,
rygorystyczność
warunków
testu
determinuje
poziom
komplementarności, który powinien charakteryzować dwie nici kwasów nukleinowych aby mogły one
40
utworzyć hybrydę. Aby zmaksymalizować różnice w stabilności kompleksów sonda-hybryda docelowa
i potencjalna sonda- hybryda niedocelowa, powinno się stosować warunki rygorystyczne.
[0306] Na przykład N- i C-końcowe fragmenty danego sHASEGP mogą być ekspresjonowane w
bakteriach i użyte do poszukiwania wiążących się do nich białek. Substratami mogą być białka
fuzyjne, takie jak białka zawierające znacznik His lub GTS połączony z N- lub C-końcem sHASEGP.
Takie białka fuzyjne mogą być na przykład połączone z kuleczkami glutation-sefaroza i użyte jako
5
sondy do testowania z lizatów komórkowych lub płynów ustrojowych. Przed etapem lizy, komórki lub
płyny ustrojowe można poddać działaniu potencjalnych czynników modulujących sHASEGP lub białek
oddziałujących z domenami sHASEGP. Obecne w lizatach białka, związane z białkami fuzyjnymi,
można rozdzielić techniką SDS-PAGE, wyizolować i zidentyfikować za pomocą sekwencjonowania lub
spektrometrii mas, tj. sposobami znanymi w stanie techniki.
10
[0307] Sondy będące przeciwciałami uzyskuje się przez immunizację odpowiednich ssaków, zgodnie
z właściwymi protokołami immunizacji, polipeptydami lub białkami o odpowiedniej długości (np.: 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40 lub więcej konstytutywnych aminokwasów
polipeptydu sHASEGP) lub, jeśli zaistnieje potrzeba zwiększenia immunogenności, polipeptydami lub
białkami o odpowiedniej długości skoniugowanymi z odpowiednimi nośnikami. Metody preparacji
15
immunogennych koniugatów zawierających nośniki takie jak, albumina surowicy wołowej (BSA),
hemocyjanina izolowana ze skałoczepu (ang. keyhole limpet hemocyanin, KLH) lub inne białka
nośnikowe. W
pewnych okolicznościach skuteczna może być bezpośrednia koniugacja z
wykorzystaniem karbodiimidu. W innych przypadkach, aby zapewnić dostęp do haptenu, wskazane
może być użycie innych związków sprzęgających takich jak odczynniki produkowane przez Pierce
20
Chemical Co. (Rockford, IL). Aby ułatwić związanie nośnika peptydowe hapteny mogą być
przedłużane na N- lub C-końcu o jedną resztę cysteiny lub kilka reszt Cys może być włączanych do
struktury takich haptenów.
[0308] Ogólnie takie immunogeny podaje się przez ich injekcję w określonym przedziale czasowym
razem z odpowiednimi adiuwantami, co jest dobrze opisane w stanie techniki. W celu monitorowania
25
jakości humoralnej odpowiedzi immunologicznej, w trakcie trwania procesu immunizacji mierzone są
miana przeciwciał
[0309] Przeciwciała skierowane przeciwko peptydom można produkować wykorzystując syntetyczne
polipeptydy obejmujące na przykład N-końcowe aminokwasy sHASEGP.
[0310] Peptydy syntetyczne mogą mieć długość od 1 do 3 aminokwasów, ogólnie długość
30
odpowiadającą co najmniej czterem lub większej liczbie aminokwasów. Peptydy można skoniugować
z KLH przy użyciu standardowych metod a następnie wykorzystać do immunizacji zwierząt takich jak
króliki lub zwierzęta kopytne. Następnie przeciwciała poliklonalne oczyszcza się na przykład
wykorzystując kuleczki Actigel zawierające kowalencyjnie związany peptyd.
[0311] W przypadku niektórych zastosowań takie poliklonalne przeciwciała mogą spełniać stawiane im
35
wymagania, jeśli chodzi jednak o kompozycje farmaceutyczne, to ogólnie stosowane są przeciwciała
monoklonalne. Unieśmiertelnione linie komórkowe, które wydzielają pożądane przeciwciała
monoklonalne przygotowuje się metodą Kohler'a i współp. (Nature 256: 495-7 (1975) lub stosując
ogólnie znane modyfikacje wpływające na proces unieśmiertelniania limfocytów lub komórek
śledziony. Unieśmiertelnione linie komórkowe wydzielające pożądane przeciwciała są przeszukiwane
40
przy pomocy testów immunochemicznymi, w których antygenem jest hapten peptydowy, polipeptyd
lub białko.
[0312] Po zidentyfikowaniu właściwej unieśmiertelnionej linii komórkowej wydzielającej pożądane
przeciwciało, komórki takie hoduje się zarówno metodami in vitro lub przez ich namnażanie in vivo w
płynie puchliny brzusznej. Szczególnie przedmiotem zainteresowania są przeciwciała monoklonalne,
które rozpoznają domenę katalityczną lub miejsce proteolitycznej aktywacji sHASEGP.
5
[0313] Produkowane mogą być również przeciwciała lub ich fragmenty, a także pochodzące od
różnych gatunków chimery obejmujące regiony specyficznie wiążące pożądane regiony receptorowe.
[0314] Czynniki testowane przy pomocy opisanej powyżej metody mogą być wybrane przypadkowo
lub racjonalnie wybrane lub zaprojektowane.
[0315] Przykładami takich czynników są peptydy, związki drobnocząsteczkowe i węglowodany.
10
Specjalista w danej dziedzinie szybko oceni, że nie istnieją żadne ograniczenia w stosunku do
struktury takich czynników.
[0316] Czynniki będące peptydami można przygotować stosując standardowe, znane w stanie
techniki, metody syntezy peptydów (synteza na podłożu stałym lub w roztworze). Dodatkowo, DNA
kodujące te peptydy może być syntezowane przy użyciu komercyjnie dostępnych protokołów syntezy
15
oligonukleotydów
i
produkowane
technika
rekombinacji
z
zastosowaniem
standardowych
ekspresyjnych systemów rekombinacyjnych.
[0317] I. SPOSOBY LECZENIA.
[0318] Glikoproteiny sHASEGP oznaczone opisanymi niniejszym sposobami są stosowane do
leczenia lub zapobiegania nieprawidłowemu gromadzeniu się substratów sHASEGP u zwierząt,
20
szczególnie u ssaków, w tym u człowieka. W jednym wykonaniu wspomniany sposób obejmuje
podawanie ssakowi efektywnej ilości glikoproteiny sHASEGP, którą leczona jest lub którą zapobiega
się chorobie lub zaburzeniu.
[0319] W innym wykonaniu inhibitor sHASEGP może zostać zastosowany w leczeniu nadmiernej
aktywności hialuronidazy. Przedstawicielem ssaków może być człowiek. Inhibitory będące
25
przedmiotem wynalazku są inhibitory zidentyfikowane w badaniach przesiewowych. Dodatkowo
wynalazek obejmuje przeciwciała, antysensowne kwasy nukleinowe, dwuniciowe RNA (dsRNA) i
RNAi.
[0320] 1. Leczenie nukleinowymi kwasami antysensownymi: W specyficznym wykonaniu, jak opisano
powyżej, w celu zapobieżenia nadmiernej aktywności chondroitynazy, funkcje białka sHASEGP są
30
zredukowane lub zahamowane przez specyficzne antysensowne kwasy nukleinowe. Wynalazek
dotyczy terapeutycznego lub profilaktycznego zastosowania kwasów nukleinowych składających się z
co najmniej 6 nukleotydów, ogólnie do około 150 nukleotydów, które są antysensowne do sekwencji
genu lub cDNA kodującego białko lub jego część sHASEGP. Określenie „antysensowny” kwas
nukleinowy białka sHASEGP”, w rozumieniu niniejszego wynalazku oznacza kwas nukleinowy zdolny
35
do hybrydyzacji z częścią RNA (ogólnie mRNA) białka sHASEGP w rezultacie pewnej
komplementarności sekwencji i ogólnie w warunkach wysoko rygorystycznych. Antysensowny kwas
nukleinowy może być komplementarny do kodującego i/lub niekodującego regionu mRNA białka
sHASEGP. Tego typu antysensowny kwas nukleinowy znajduje zastosowanie w terapiach, które
redukują lub hamują funkcję białka sHASEGP i mogą być stosowane w leczeniu lub zapobieganiu
40
zaburzeń jak opisano powyżej.
[0321] Antysensowne kwasy nukleinowe białka sHASEGP składają się z co najmniej 6 nukleotydów i
są ogólnie oligonukleotydami (obejmujące zakres od 6 do 150 nukleotydów w tym zakres od 6 do 50
nukleotydów). Cząsteczka antysensowna może być komplementarna do całej domeny hialuronidazy
lub do jej części. Przykładowo oligonukleotyd zbudowany jest z co najmniej 10 nukleotydów, co
najmniej 15 nukleotydów, co najmniej 100 nukleotydów i co najmniej 125 nukleotydów.
Oligonukleotydy mogą być jak DNA lub RNA, mogą być chimerą, pochodnymi lub ich
5
zmodyfikowanymi wersjami, jednoniciowe lub dwuniciowe. Oligonukleotyd może być zmodyfikowany
w miejscu zasady, reszty cukrowej i szkieletu fosforanowego. . Oligonukleotyd może zawierać inne
dołączone grupy takie jak peptydy lub czynniki ułatwiające transport przez membranę komórkową
(patrz np. Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553-6556 (1989); Lemaitre et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84: 648-652 (1987); PCT Nr WO 88/09810, opublikowany 15 grudni 1988) lub
10
barierę krew-mózg (patrz np. PCT Nr WO 89/10134, opublikowany 25 kwietnia 1988), czynniki
rozpoczynające hybrydyzację (patrz np. Krol et al., BioTechniques 6: 958-976 (1988)) lub czynniki
interkalarne (patrz np. Zon. Pharm. Res. 5: 539-549 (1988)).
[0322] Antysensowny kwas nukleinowy białka sHASEGP jest ogólnie oligonukleotydem, zwykle
jednoniciowym DNA lub RNA, ich analogiem lub ich mieszaniną. Przykładowo wspomniany nukleotyd
15
zawiera sekwencję antysensowną do części kwasu nukleinowego kodującego ludzkie białko
sHASEGP. Oligonukleotyd może być modyfikowany w dowolnej pozycji w strukturze zwykle
jednoniciowy podstawnikami ogólnie znanymi w stanie techniki.
[0323] Antysensowny oligonukleotyd białka sHASEGP może zawierać co najmniej jedną
zmodyfikowaną zasadę wyselekcjonowaną z grupy obejmującej, lecz nie tylko, 5-fluorouracyl, 5-
20
bromouracyl,
5-chlorouracyl,
5-jodouracyl,
(karboksyhydroksymetylo)uracyl,
karboksymetyloaminometylouracyl,
hipoksantyna,
ksantyna,
4-acetylocysteina,
5-karboksymetyloaminometylo-2-tiourydunę,
dihydrouracyl,
beta-D-galaktozylokueozynę,
inozynę,
55N6-
izopentenyloadeninę, 1-metyloguaninę, 1-metylolizynę, 2,2-dimetyloguanine, 2-metyloadeninę, 2metyloguanine,
25
3-metylocytozynę,
metyloaminometylouracyl,
mannosylokuenozynę,
5-metylocysteinę,
5-metyolaminometylouracyl,
N6-adeninę,
7-metyloguaninę,
5-metoksyaminometylo-2-tiouracyl,
5-apos-metoksycarboksymetylouracyl,
5-metoksyuracyl,
5b-D-
2-metylotio-N6-
isopentenyloadeninę, kwas uracylo-5-oksyoctowy (v), wybutoksozynę, pseudouracyl, kuenozyne, 2tiocytozynę, 5-metylo-2-tiouracyl, 2-tiouracyl, 4-tiouracyl, 5-metylouracyl, metyloester kwasu uracylo-5oksyoctowego,
30
(v),
kwas
uracylo-5-oksyoctowy
(v),
5-metylo-2-tiouracyl,
3-(3-amino-3-n-2
karboksypropylo)-uracyl, (ACP3) i 2,6-diaminopuryna.
[0324] W kolejnym wykonaniu wspomniany nukleotyd zawiera co najmniej jedną zmodyfikowaną
resztę cukrową wybraną z grupy obejmującej, lecz nie tylko, arabinozę, 2-fluoroarabinozę, ksylulozę i
heksozę. Oligonukleotyd może zawierać co najmniej zmodyfikowany szkielet fosforanowy wybrany
spośród tiofosforanów, ditiofosforanów, amidotiofosforanów, amidofosforanów, diamidofosforanów,
35
metylofosfonianów, alkilowanych fosfotriestrów i formacetalów lub ich analogów.
[0325] Oligonukleotyd może być α-anomerycznym nukleotydem. α-Anomeryczny oligonukleotyd
tworzy specyficzne dwuniciowe hybrydy z komplementarnym RNA, w których nici biegną do siebie
równolegle.
[0326] Oligonukleotyd może być skoniugowany z inną cząsteczką taką jak, lecz nie tylko, peptyd,
40
inicjujący hybrydyzację czynnik sieciujący, czynnik transportowy i inicjujący hybrydyzacje czynnik
tnący. Oligonukleotydy mogą być syntetyzowane standardowymi sposobami znanymi w stanie techniki
np. z wykorzystaniem automatycznego syntetyzera DNA (takiego jak komercyjnie dostępny z firmy
Biosearch, Applied Biosystems, itd.). Przykładowo tiofosforany oligonukleotydów mogą być
syntetyzowane metodą opisaną przez Stein et al., Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988)),
metylofosfoniany oligonukleotydów mogą być przygotowane przy wykorzystaniu polimerowej podpory
ze szkła o kontrolowanej porowatości (Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7448-7451
5
(1988)),itd. W specyficznym wykonaniu antysensowny oligonukleotyd białka sHASEGP zawiera
katalityczne RNA lub rybozym (patrz np. PCT Nr WO 90/11364, opublikowana 4 października1990;
Sarver et al., Science 247: 1222-1225 (1990)). W innym wykonaniu oligonukleotyd jest 2'-Ometylorybonukleotydem (Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148 (1987)), lub chimerycznym
analogiem RNA-DNA (Inoue et al., FEBS Lett. 215: 327-330 (1987)).
10
[0327] Alternatywnie oligonukleotyd może być dwuniciowym RNA (dsRNA) lub jak RNAi.
[0328] W alternatywnym wykonaniu antysensowny kwas nukleinowy białka sHASEGP jest wytwarzany
w procesie transkrypcji wewnątrzkomórkowo i na podstawie egzogennej sekwencji.
[0329] Przykładowo wektor może być wprowadzony in vivo w taki sposób, że jest pochłaniany przez
komórkę, w komórce tej ulega transkrypcji wytwarzając antysensowne kwasy nukleinowe (RNA). Taki
15
wektor zawierałby sekwencję antysensownego kwasu nukleinowego białka sHASEGP. Wektor tego
typu może pozostać episomalny lub może integrować się z genomem tak długo jak może być
transkrybowany i wytwarzać pożądane antysensowne RNA. Taki wektor może być skonstruowany
techniką rekombinacyjnego DNA standardową w stanie techniki. Wektorami mogą być plazmidy
wirusowe lub inne znane w stanie techniki stosowane do replikacji i ekspresji w komórkach ssaczych.
20
Ekspresja sekwencji kodującej antysensowny RNA białka sHASEGP może odbywać się spod
dowolnego znanego promotora działającego w komórkach ssaczych, znanego w stanie techniki. Takie
promotory mogą być konstytutywne lub indukowalne. Takie promotory obejmują, lecz nie tylko,
wczesny promotor SV40 (Bernoist and Chambon, Nature 290: 304-310 (1981), promotor znajdujący
się na 3' końcu długiej powtarzającej się sekwencji wirusa Rous sarcoma (Yamamoto et al., Cell 22:
25
787-797 (1980), promotor dla kinazy tymidynowej wirusa opryszczki (Wagner et al. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 78: 1441-1445 (1981), sekwencje regulatorowe genu metalotioneiny (Brinster et al., Nature
296: 39-42 (1982)),itd.
[0330] Antysensowne kwasy nukleinowe zawierają sekwencje komplementarne do co najmniej części
transkryptu RNA genu białka sHASEGP w tym genu ludzkiego białka sHASEGP. Absolutna
30
komplementarność nie jest wymagana. Ilość antysensownego kwasu nukleinowego białka sHASEGP,
efektywna w leczeniu i zapobieganiu chorobom nowotworowym zależy od natury choroby i może być
wyznaczona doświadczalnie standardowymi technikami klinicznymi.
[0331] Jeżeli jest to możliwe, zanim antysensowny kwas nukleinowy zostanie przetestowany i
zastosowany u ludzi, pożądane jest wyznaczenie cytotoksyczności komórkowej antysensownego
35
kwasu nukleinowego in vitro, a następnie na odpowiednim modelu zwierzęcym.
[0332] 2. Interferencja RNA (RNAi) (patrz np. Chuang et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:
4985) może zostać wykorzystany do hamowania ekspresji genu kodującego sHASEGP. Fragmenty
interferującego RNA (RNAi), szczególnie dwuniciowe (ds) RNAi, mogą być wykorzystane do
generowania tzw. utraty funkcji przy braku obecności białka sHASEGP. Metody związane z
40
wykorzystaniem RNAi do wyciszania genów w organizmach w tym ssaków, C. elegans, Drosophila,
roślinnych i ludzkich są znane (patrz np. Fire et al. (1998) Nature 391: 806-811; Fire (1999) Trends
Genet. 15: 358-363; Sharp (2001) Genes Dev. 15: 485-490; Hammond et al. (2001) Nature Rev,
Genet. 2: 110-119; Tuschl (2001) Chem. Biochem. 2: 239-245;
Hamilton et al. (1999) Science 286: 950-952; Hammond et al. (2000) Nature 404: 293-296; Zamore et
al. (2000) Cell 101: 25-33; Bernstein et al. (2001) Nature 409: 363-366; Elbashir et al. (2001) Genes
5
Dev. 15: 188-200; Elbashir et al.
(2001) Nature 411: 494-498; International PCT application No. WO 01/29058; International PCT
application No. WO 99/32619).
[0333]
Konstrukty
ekspresjonujące
dwuniciowy
RNA
(dsRNA)
są
wprowadzane
do
gospodarza,takiego jak zwierzę czy roślina z wykorzystaniem replikowalnego wektora, który pozostaje
10
episomalny lub integruje się z genomem. Wybierając odpowiednie sekwencje ekspresja dsRNA może
interferować z gromadzeniem się endogennego mRNA kodującego sHASEGP. RNAi może być także
wykorzystany do hamowania ekspresji in vitro.
[0334] Regiony zawierają co najmniej około 21 (lub 21) nukleotydów, które są wybiórcze (tj. unikalne)
dla sHASEGP, są wykorzystywane do przygotowania RNAi. Mniejsze fragmenty około 21 nukleotydów
15
mogą być transformowane bezpośrednio (tj. in vitro lub in vivo) do komórek; większe cząsteczki RNAi
ds RNA są ogólnie wprowadzane do wektorów , które je kodują. Cząsteczki dsRNA maja długość co
najmniej około 21 bp lub dłuższe jak 50, 100, 150, 200 i dłuższe. Metody, odczynniki i protokoły
dotyczące wprowadzania cząsteczek kwasów nukleinowych do komórek in vitro i in vivo są znane
specjalistom w dziedzinie.
20
[0335] 3. Terapia genowa w przykładowym wykonaniu, kwasy nukleinowe, które zawierają sekwencję
nukleotydową kodującą białko sHASEGP lub jego funkcjonalne domeny lub pochodne, są podawane
w celu funkcji metodą terapii genowej. Termin „terapia genowa” oznacza terapię przeprowadzaną
poprzez podawanie osobnikowi kwasu nukleinowego. W tym wykonaniu kwas nukleinowy wytwarza
kodowane białko, które wpływa na efekt terapeutyczny wspierając działanie białka sHASEGP. Każda
25
metoda terapii genowej znana w stanie techniki mogą być wykorzystane (patrz Goldspiel et al.,
Clinical Pharmacy 12: 488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tolstoshev, An. Rev.
Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 (1993); Mulligan, Science 260: 926-932 (1993); and Morgan and
Anderson, An. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); TIBTECH 11 5: 155-215 (1993). Przykładowo jedna
kompozycja terapeutyczna do terapii genowej zawiera kwas nukleinowy kodujący białko sHASEGP
30
będący częścią wektora ekspresyjnego, który ekspresjonuje białko sHASEGP lub jego domenę, jej
fragment lub białko chimeryczne w odpowiednich komórkach gospodarza. W szczególności taki kwas
nukleinowy posiada promotor, konstytutywny lub indukcyjny, funkcjonalnie połączony z regionem
kodującym białko sHASEGP i opcjonalnie tkankowo-specyficzny. W innym wykonaniu wykorzystana
jest cząsteczka kwasu nukleinowego, w której sekwencja kodująca białko sHASEGP i inne pożądane
35
sekwencje są oflankowane przez regiony wspierające rekombinacje homologiczną w pożądanym
miejscu w genomie, umożliwiając w ten sposób wewnątrzchromosomalną ekspresję kwasu
nukleinowego białka sHASEGP (Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935
(1989); Zijlstra et al., Nature 342: 435-438 (1989)).
[0336] Podanie pacjentowi kwasu nukleinowego może się odbywać w sposób bezpośredni, w
40
przypadku którego pacjent ma bezpośredni kontakt z kwasem nukleinowym lub wektorem będącym
nośnikiem tego kwasu lub w sposób pośredni, w przypadku którego pacjentowi przeszczepiane są
komórki wcześniej transformowane kwasem nukleinowym in vitro.
[0337] W szczególnym wykonaniu kwas nukleinowy jest podawany bezpośrednio in vivo, gdzie jest
ekspresjonowany i wytwarza kodowany produkt. Taki efekt można osiągnąć wieloma sposobami
znanymi w stanie techniki np. wprowadzając go do odpowiedniego wektora ekspresyjnego i podając w
taki sposób, że staje się dostaje się do wnętrza komórki np. w wyniku infekcji z wykorzystaniem
5
defektywnych atenuowanych wektorów retrowirusowych lub wektorów wirusowych innego typu (patrz
U.S. Patent Nr 4980286), przez bezpośrednią iniekcję gołego DNA, mikrowstrzeliwanie (np. „armatka
genowa”; Biolistic, Dupont), opłaszczanie lipidami, powierzchniowymi, receptorami lub czynnikami
transfekcyjnymi, zamykanie w liposomach, mikrocząsteczkach lub mikrokapsułkach,lub podawanie
razem z peptydem, o którym wiadomo, że dostaje się do jadra, lub przez podawanie wraz z ligandem
10
dla receptora pośredniczącego w endocytozie (patrz np. Wu and Wu, J. Biol. Chem, 262: 4429-4432
(1987)) (który może być wykorzystany do inicjowania ekspresji receptorów w komórkach docelowych),
itd. W innym wykonaniu można utworzyć kompleks kwas nukleinowy-ligand, w którym ligand jest
fuzjogennym białkiem wirusowym, który powoduje rozpad endosomów, chroniąc w ten sposób kwas
nukleinowy przed degradacją lizosomalną. W jeszcze innym wykonaniu kwas nukleinowy może być
15
kierowany in vivo do specyficznych komórek, przez które jest pobierany i ekspresjonowany, za
pośrednictwem specyficznego receptora (patrz : PCT Nr WO 92/06180, 16 kwietnia 1992; (Wu et al.);
WO 92/22635, 23 grudzień 1992 (Wilson et al.); WO 92/20316, 26 październik 1992; (Findeis et al.);
WO 93/14188, 22 lipca1993 (Clarke et al.), WO 93/2022, 14 października 1993 (Young)).
Alternatywnie kwas nukleinowy może być wprowadzany do wnętrza komórki i inkorporowany w DNA
20
komórki gospodarza do ekspresji drogą homologicznej rekombinacji (Koller and Smithies, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86: 8932-8935 (1989); Zijistra et al., Nature 342: 435-438 (1989)).
[0338] W specyficznym wykonaniu wynalazku wykorzystano wektor wirusowy, który zawiera kwas
nukleinowy białka sHASEGP. Przykładowo można wykorzystać wektor retrowirusowy (patrz Miller et
al., Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993)).Wspomniane wektory retrowirusowe zostały zmodyfikowane
25
w ten sposób, że usunięto sekwencje retrowirusową niezbędną do pakowania genomu wirusowego i
integracji z DNA komórki gospodarza. Kwas nukleinowy białka sHASEGP, do terapii genowej jest
klonowany do wektora, co ułatwia podanie tego genu pacjentowi. Więcej szczegółów na temat
wektorów retrowirusowych można znaleźć w Boesen et al., Biotherapy
6: 291-302 (1994), opisującej zastosowanie wektora retrowirusowego do wprowadzenia genu MDR1
30
do hematopoetycznych komórek macierzystych w celu podniesienia ich oporności na chemioterapię.
[0339] Inne odnośniki opisujące zastosowanie wektorów retrowirusowych w terapii genowej to :Clowes
et al., J. Clin. Invest. 93: 644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83: 1467-1473 (1994); Salmons and
Gunzberg, Human Gene Therapy 4: 129-141 (1993); and Grossman and Wilson, Curr. Opin. In
Genetics And Devel. 3: 110-114 (1993).
35
[0340] Adenowirusy są innymi nośnikami wirusowymi, które można stosować w terapii genowej.
Adenowirusy są szczególnie atrakcyjnymi nośnikami do dostarczania genów do komórek
nabłonkowych układu oddechowego. Adenowirusy naturalnie infekują nabłonek oddechowy gdzie
wywołują łagodne schorzenia. Innym miejscem docelowym dla adenowirusów jest wątroba, centralny
układ nerwowy, komórki śródbłonka i mięśnie. Zaletą adenowirusów jest zdolność infekowania
40
niedzielących się komórek. Kozarski i Wilson w Current Opinion in Genetics and Development 3: 499503 (1993) opublikowali artykuł przeglądowy dotyczący terapii genowej opartej na adenowirusach.
Bout et al. w artykule opublikowanym w Human Gene Therapy 5: 3-10 (1994) zademonstrowali
zastosowanie wektorów adenowirusowych w transferze genów do śródbłonka oddechowego małp
Rhesus. Inne przykłady zastosowań adenowirusów w terapii genowej można znaleźć w publikacji
Rosenfeld et al., Science 252: 431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68: 143-155 (1992) i Mastrangeli
et al., J. Clin. Invest. 91: 225-234 (1993).
5
[341] Wirusy towarzyszące adenowirusom (AAV) zostały również zaproponowane do stosowania w
terapii genowej (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300 (1993).
[0342] Inne podejście do terapii genowej obejmuje transfer genu do komórek w hodowli komórkowej
takimi metodami jak elektroporacja, lipofekcja, metoda transfekcji fosforanem wapnia lub infekcja
wirusem. Zwykle transfer obejmuje przeniesienie do komórek markera selekcjonującego. Komórki te
10
są następnie poddawane selekcji aby wyizolować te, które pobrały transferowany gen i go
ekspresjonują. Takie komórki są w następnym etapie podawane pacjentowi.
[0343] W tym wykonaniu kwas nukleinowy jest wprowadzany do komórki przed podaniem pacjentowi
uzyskanych in vivo rekombinowanych komórek. Takie wprowadzenie może być przeprowadzone
dowolnym sposobem znanym w stanie techniki, włączając lecz nie tylko, transfekcję, elektroporację,
15
mikroiniekcję, infekcję wektorem wirusowym lub bakteriofagowym zawierającym sekwencję kwasu
nukleinowego, fuzję komórek, transfer genu na nośniku chromosomowym, transfer genu za
pośrednictwem mikrokomórek, fuzja sferoplastu, itd. W stanie techniki znanych jest wiele metod
wprowadzania obcych genów do komórek (patrz np. Loeffler and Behr, Meth. Enzymol. 217: 599-618
(1993); Cohen et al., Meth. Enzymol. 217: 618-644 (1993); Cline, Pharmac. Ther. 29: 69-92 (1985)),
20
które można zastosować, pod warunkiem, że niezbędne funkcje rozwojowe i fizjologiczne docelowej
komórki nie zostaną zakłócone. Technika powinna zapewniać stabilny transfer kwasu nukleinowego
do komórki, w której możliwa jest jego ekspresja, dziedziczenie i ekspresja przez komórki potomne.
[0344] Otrzymane rekombinowane komórki mogą być podane pacjentowi różnymi sposobami znanymi
w stanie techniki. W
25
wykonaniu komórki nabłonka są wstrzykiwane np. podskórnie. W innym
wykonaniu rekombinowane komórki skory mogą być zastosowane jako przeszczep skóry na skórę
pacjenta.
Rekombinowane
komórki
krwi
(np.
hematopoetyczne
komórki
macierzyste
lub
progenitorowe) mogą być podawane dożylnie. Ilość komórek przewidziana do wykorzystania zależy
od pożądanego efektu, stanu pacjenta, itd., i może być określona przez specjalistę w danej dziedzinie.
[0345] Komórki, do których wprowadzona dla celów terapii genowej kwas nukleinowy obejmują
30
dowolny, pożądany i dostępny typ komórki taki jak, lecz nie tylko, komórki nabłonka, komórki
śródbłonka, keratynocyty, fibroblasty, komórki mięśniowe, hepatocyty, komórki krwi takie jak limfocyty
T, limfocyty B, monocyty, makrofagi, neutrofile, eozynofile, megakariocyty, granulocyty, różnego typu
komórki macierzyste i progenitorowe, w szczególności hematopoetyczne lub progenitorowe komórki
macierzyste, np. komórki macierzyste otrzymane ze szpiku kostnego, krwi pępowinowej, krwi
35
obwodowej, wątroby płodowej i innych źródeł.
[0346] Przykładowo komórka użyta w terapii genowej jest autologiczna w stosunku do pacjenta. W
wykonaniu, w którym rekombinowane komórki są stosowane w terapii genowej, kwas nukleinowy
kodujący białko sHASEGP jest wprowadzany do komórek , w taki sposób, że możliwa jest jego
ekspresja przez komórki potomne a rekombinowane komórki, dla uzyskania efektu terapeutycznego,
40
są podawane in vivo. W specyficznym wykonaniu wykorzystano komórki macierzyste lub
progenitorowe. Dowolne komórki macierzyste i/lub progenitorowe, których izolacja i utrzymanie przy
życiu in vivo jest możliwa, mogą być potencjalnie wykorzystane w zgodzie z tym wykonaniem.
[0347] Takie komórki macierzyste zawierają, lecz nie tylko, macierzyste komórki hematopetyczne
(HSC), macierzyste komórki nabłonków tkanek takich jak skóra, nabłonek jelita, komórki
embrionalnego mięśnia sercowego, macierzyste komórki wątroby (PCT Nr WO 94/08598, 28
kwietnia1994), i komórki nerwowe (Stemple and Anderson, Cell 71: 973-985 (1992)).
5
[0348] Nabłonkowe komórki macierzyste (ESC) lub keratynocyty można otrzymać z tkanki, takiej jak
skóra i wyściółka jelita znanymi procedurami (Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A: 229 (1980)).W tkance o
charakterze warstwowym, takiej jak skóra, odnowa odbywa się przez mitozę komórek macierzystych
w obrębie listka zarodkowego, listka położonego najbliżej blaszki podstawnej. Komorki macierzyste w
wyściółce jelita zapewniają szybką odnowę tej tkanki. ESC lub keranocyty otrzymane ze skóry lub
10
nabłonka jelita pacjenta lub dawcy mogą być hodowane w kulturach komórkowych ((Rheinwald, Meth.
Cell Bio. 21A: 229 (1980); Pittelkow and Scott, Cano. Clinic Proc. 61: 771 (1986)). Jeżeli ESC
pochodzą od dawcy można zastosować metody supresji /tłumienia reakcji immunologicznej gospodarz
przeciwko przeszczepowi (np. naświetlanie, podawanie leków lub przeciwciał sprzyjających
umiarkowanej immunosupresji).
15
[0349] W odniesieniu do hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) w tym wykonaniu można
użyć dowolnej techniki do izolacji, namnażania i utrzymywania HSC in vitro, które obejmują (a)
izolację i wyprowadzenie hodowli komórkowej z komórek szpiku kostnego wyizolowanego od
przyszłego gospodarza lub dawcy lub (b) użycie wcześniej wyprowadzonej długoterminowej hodowli,
która może wywoływać alergie lub być ksenogeniczna.
20
[0350] Ogólnie nieautologiczne HSC mogą być wykorzystywane przy użyciu metody supresji
immunologicznych reakcji przyszłego gospodarza/pacjenta w odpowiedzi na przeszczep. W
szczególnym wykonaniu komórki ludzkiego szpilu kostnego można otrzymać z grzebienia talerza
kości biodrowej drogą aspiracji przez igłę (patrz np. Kodo et al., J. Clin. Invest. 73: 1377-1384 (1984)).
Przykładowo HSC mogą być w formie wysoko wzbogaconej lub znacząco oczyszczonej. Wspomniane
25
wzbogacenie można uzyskać wcześniej w czasie lub po długotrwałej hodowli dowolnymi technikami
znanymi w stanie techniki. Długotrwałe hodowle szpiku kostnego mogą być zakładane i utrzymywane
przy użyciu zmodyfikowanych technik hodowli komórkowych według Dextera ((Dexter et al., J. Cell
Physiol. 91: 335 (1977)) lub Witlock-Witte'a (Witlock and Witte, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 36083612 (1982)).
30
[0351] W specyficznym wykonaniu kwas nukleinowy, który ma być wprowadzony do komórki w
ramach terapii genowej, zawiera indukowalny promotor funkcjonalnie połączony z regionem
kodującym, dzięki czemu ekspresja kwasu nukleinowego znajduje się pod kontrolą odpowiedniego
induktora transkrypcji i zależy od jego obecności lub nieobecności.
[0352] 3. Proleki – Wynalazek obejmuje metodę leczenia nowotworów. Metoda polega na podawaniu
35
proleku, który jest trawiony przez sHASEGP w specyficznym miejscu, w rezultacie czego powstaje
aktywny lek lub prekursor, który może ulec konwersji do leku aktywnego in vivo. W wyniku zetknięcia
się z komórką ekspresjonującą aktywną sHASEGP prolek ulega konwersji do leku aktywnego. Prolek
może być koniugatem, który zawiera aktywny lek jak lek przeciwnowotworowy, czynnik cytotoksyczny
lub inny czynnik terapeutyczny (TA) związany z substratem dla docelowej sHASEGP. W koniugacie
40
wspomniany lek lub czynnik jest nieaktywny lub nie jest zdolny do wniknięcia do komórki, natomiast
uzyskuje aktywność w wyniku trawienia. Prolek przykładowo może zawierać siarczan chondroityny,
zazwyczaj stosunkowo krótki bo posiadający mniej niż około 20 podjednostek disacharydowych, który
jest trawiony przez specyficzną sHASEGP. Czynniki cytotoksyczne obejmują, lecz nie tylko, czynniki
alkilujące, czynniki antyproliferacyjne i czynniki wiążące się do tubuliny. Inne czynniki cytotoksyczne
obejmują leki, takie jak winkrystynę, mitomycynę, bleomycynę i paklitaksele.
[0353] J. KOMPOZYCJE FARMACEUTYCZNE I SPOSOBY PODAWANIA LEKU.
5
[0354] 1. Składniki kompozycji farmaceutyczych. Wynalazek obejmuje kompozycje farmaceutyczne
zawierające aktywną sHASEGP, a także warianty substancji, które modulują aktywność polipeptydu
sHASEGP. Przedmiotem wynalazku jest także inny sposób leczenia lub substancja do leczenia
zaburzeń związanych z hialuronidazą, np. substancja o charakterze przeciwciała.
[0355] Polipeptyd sHASEGP oraz druga substancja mogą być pakowane jako osobne kompozycje
10
farmaceutyczne do podawania w mieszaninie, sekwencyjnie lub nieregularnie. Alternatywnie mogą
być dostarczone do podawania jako pojedyncza kompozycja lub dwie kompozycje do podawania jako
jedna kompozycja. Warianty mogą być pakowane jako zestawy gotowe do użycia.
[0356] 2. Formulacje i droga podania.
[0357] Polipeptydy sHASEGP pochodzenia ludzkiego i ich rozpuszczalne domeny o aktywności
15
hialuronidazy, będące przedmiotem niniejszego wynalazku, mogą być formułowane jako kompozycje
farmaceutyczne przeznaczone do podawania w jednej dawce. Stężenie polipeptydów używane w
formulacji pozwala na efektywne dostarczenie w chwili podania ilości, która w planowanej terapii, jest
skuteczna. Zwykle kompozycje farmaceutyczne są formułowane w postaci przeznaczonej do
jednorazowego podania. Dla celów formulacji odważona frakcja polipeptydu sHASEGP, jej
20
rozpuszczalne domeny o aktywności hialuronidazy pochodzenia ludzkiego lub mieszanina obu
wymienionych składników jest rozpuszczana, zawieszana, rozpraszana lub w inny sposób mieszana z
wybranymi nośnikami w efektywnym stężeniu, które pozwala na zmniejszenie lub złagodzenie
leczonego stanu chorobowego.
[0359] Dodatkowo polipeptydy mogą być formułowane jako jedyny w kompozycji aktywny składnik
25
farmaceutyczny lub mogą być mieszane z innymi aktywnymi składnikami. Zawiesina liposomowa,
również liposomy skierowane do danej tkanki, mogą stanowić właściwy i farmaceutycznie
dopuszczalny nośnik, który można przygotować metodami znanym specjalistom w danej dziedzinie.
Za przykład może służyć sposób sporządzania formulacji liposomów opisany patencie złożonym w
Stanach zjednoczonych nr 4,522,811.
30
[0360] Aktywna sHASEGP lub jej rozpuszczalna domena o aktywności hialuronidazy pochodzenia
ludzkiego jest zawarta w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku w ilości wystarczającej do
wywołania
terapeutycznie
niepożądanych
efektów
przydatnego
ubocznych.
efektu,
nie
Terapeutycznie
powodującego
efektywne
u
leczonego
stężenie
można
pacjenta
oznaczyć
doświadczalnie testując polipeptydy w znanych in vitro i in vivo systemach, takich jak test będący
35
przedmiotem wynalazku lub patrz np. Taliani et al. (1996) Anal. Biochem. 240: 60-67, Filocamo et al.
(1997) J. Virology 71: 1417-1427, Sudo et al. (1996) Antiviral Res. 32: 9-18, Buffard et al. (1995)
Virology 209: 52-59, Bianchi et al. (1996) Anal. Biochem. 237: 239-244, Hamatake et al. (1996)
Intervirology 39:249-258, Steinkühler et al. (1998) Biochem. 37:8899-8905, D’Souza et al. (1995) J.
Gen. Virol. 76:1729-1736, Takeshita et al. (1997) Anal. Biochem. 247: 242-246; patrz także np. ,
40
Shimizu et al. (1994) J. Virol. 68: 8406-8408; Mizutani et al. (1996) J. Virol. 70: 7219-7223, Mizutani et
al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 227: 822-826, Lu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 93: 1412-1417, Hahm et al. (1996) Virology 226: 318-326, Ito et al. (1996) J. Gen. Virol. 77:
1043-1054, Mizutani et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 212: 906-911, Cho et al. (1997)
J. Viral. Meth. 65 :201-207 i następnie ekstrapolować na dawkowanie stosowane u ludzi.
[0361] Zazwyczaj wynalazek obejmuje dawkowanie terapeutycznie efektywne. Podawana ilość może
być rzędu od 0.001 do 1 mg/ml krwi, włączając w to zakres około 0.005-0.05 mg/ml krwi i około 0.01
5
mg/ml krwi. Farmaceutyczne dawki jednostkowe są przygotowywane w taki sposob, aby dostarczać
od około 1 mg do około 1000 mg, w tym od około 10 do około 500 mg, i w tym około 25-75 mg
podstawowego składnika aktywnego lub kombinacji składników aktywnych w przeliczeniu na dawkę
jednostkową. Dokładna dawka może być wyznaczona doświadczalnie.
[0362] W pewnych przypadkach korzystna jest wysoka dawka jednostkowa sHASEGP. Przykładowo
10
w podaniu dożylnym korzystne jest stężenie sHASEGP od 500 do 100,000 jednostek na mililitr.
Liofilizowane formulacje sHASEGP idealnie nadają się do przechowywania dużych ilości dawek
jednostkowych sHASEGP. Wynalazkiem objęte jest 200,000 jednostek liofilizowanych fiolek z
sHASGEP do podania dożylnego.
[0363] Wynalazek obejmuje również dawki o wysokim stężeniu do podawania sHASEGP w małych
15
objętościach Wynalazek obejmuje podawanie 5000 jednostek/ml sHASEGP w objętości 10-100 μl,
która jest wstrzykiwana do przedniej komory oka w celu rozpuszczenia wiskoelastycznej substancji
podanej w czasie operacji chirurgicznej katarakty i wszczepienia dodatkowej soczewki. Małe objętości
do
iniekcji
w
dawce
50-200U/ml
stosowane
w
procedurach
dotyczących
przestrzeni
wewnątrzgałkowych, takich jak leczenie krwotoku w ciele szklistym lub oddzielenie się ciała szklistego
20
w retinopatii cukrzycowej, są także objęte wynalazkiem.
[0364] Aktywny składnik może być podawany w jednej dawce lub podzielony na pewną ilość
mniejszych dawek podawanych w odstępach czasowych. Zrozumiałe jest, że dokładna dawka i okres
leczenia są zależne od leczonego schorzenia i mogą być wyznaczone doświadczalnie przy użyciu
protokołów znanych testów lub przez ekstrapolację danych otrzymanych w eksperymentach in vitro
25
lub in vivo. Należy zauważyć, że wartości stężenia i wielkość dawki mogą się zmieniać w zależności
od tego, jak ciężki jest stan pacjenta, który należy złagodzić. Zrozumiałe jest, że dla każdego
poszczególnego przypadku należy ustalić specyficzny tryb dawkowania, w zależności od
indywidualnych potrzeb oraz fachowej opinii osoby podającej lek lub pełniącej nadzór nad
podawaniem kompozycji farmaceutycznej. Zrozumiałe jest, również, że zakres stężenia tu
30
przedstawiony jest wyłącznie przykładowy i nie zakłada się, że zawęża zakres wynalazku, stosowanie
zastrzeganej kompozycji lub zawierającej ten lek kombinacji.
[0365] Pochodne farmaceutycznie dopuszczalne zawierają kwasy, sole, estry, hydraty, solwenty i
formy proleku. Zwykle wybiera się taką pochodną, której właściwości farmakokinetyczne są lepsze niż
odpowiadające sHASEGP lub jej rozpuszczalnej domeny o aktywności hialuronidazy.
35
[0366] Tak więc, w celu utworzenia kompozycji farmaceutycznej, efektywne stężenia lub ilości jednego
lub więcej polipeptydów, będących przedmiotem niniejszego wynalazku lub ich farmaceutycznie
akceptowane pochodne, są mieszane z odpowiednim nośnikiem farmaceutycznym lub nośnikiem do
systemowego, zewnętrznego miejscowego lub lokalnego podania. Polipeptydy sHASEGP lub jego
rozpuszczalne domeny o aktywności hialuronidazy są zawarte w efektywnej dawce terapeutycznej
40
stosowanej do łagodzenia lub leczenia schorzenia, dla którego leczenie objęte jest niniejszym
wynalazkiem. Stężenie aktywnego polipeptydu w kompozycji zależy od absorpcji, inaktywacji,
szybkości wydalania aktywnego polipeptydu, harmonogramu i ilości podawania, szczególnej
formulacji, a także innych czynników znanych specjalistom.
[0367] Czynniki terapeutyczne, stosowane we wspomnianych metodach, mogą być podawane
dowolną drogą znaną specjalistom, lecz nie są ograniczone do drogi podania zewnętrznie miejscowo,
5
dostawowo,
wewnątrztorebkowo,
domięśniowo, dootrzewnowo,
wewnątrzgałkowo,
dokomorowo,
dooponowo,
dożylnie,
śródskórnie, dotchawiczo, jak również drogą podania będącą
kombinacją dowolnych dwóch lub więcej wymienionych sposobów podania. Formulacja w postaci
suchego proszku podawanego do płuc została także przewidziana w niniejszym wynalazku.
[0368] Najbardziej optymalna droga podania będzie się zmieniać w zależności od zaproponowanego
10
zastosowania np. zastosowanie jako czynnik ułatwiający podskórne podanie płynów, zastosowanie w
celu zmniejszenia wewnątrzgałkowego ciśnienia w oku pacjentów z jaskrą otrzymujących
wiskoelastyki, jako „czynnik rozprzestrzeniający” do wzmacniania aktywności chemioterapeutyków.
Różne będą też miejsca podania, jak określony organ wewnętrzny, guz nowotworowy, przestrzeń
wewnątrzgałkowa i naskórek. Sposoby podania obejmują, lecz nie wykluczają, podania miejscowego
15
zewnętrznego,
lokalnego,
dostawowego,
wewnątrztorebkowego,
wewnątrzgałkowego,
dokomorowego, dooponowego, dożylnego, domięśniowego, dotchawiczego, dootrzewnowego,
śródskórnego i podania będącego kombinacją dwóch lub więcej wymienionych sposobów.
Przykładowo do leczenia różnego rodzaju stanów rakowych, jak rak kolczystokomórkowy skóry (ang.
squamous cell carcinoma), rak sutka, rak pęcherza moczowego i rak żołądkowo-jelitowy, podanie
20
lokalne, w tym doguzowe (np. dooponowe, dokomorowe lub wewnątrztorebkowe) ma tę zaletę, że
wspomniany czynnik terapeutyczny może być podawany w dużym stężeniu bez ryzyka komplikacji,
które zwykle towarzyszą systemowemu podaniu czynnika terapeutycznego.
[0369] Farmaceutyczne lub kosmetyczne nośniki lub podłoża, odpowiednie do podania polipeptydów
sHASEGP lub rozpuszczalnej formy domeny hialuronidazowej pochodzenia ludzkiego, będącej
25
przedmiotem niniejszego wynalazku, obejmują dowolne nośniki znane specjalistom, które są
odpowiednie dla poszczególnych sposobów podania. Co więcej polipeptydy mogą być formułowane
jako jedyny farmaceutycznie czynny składnik kompozycji, mogą być łączone z innymi aktywnymi
składnikami, które nie zakłócają pożądanego działania lub z materiałami, które uzupełniają pożądane
działanie i są znane specjalistom w danej dziedzinie. Jako przykład służą polipeptydy sHASEGP,
30
będące przedmiotem niniejszego wynalazku, które mogą być stosowane jako czynniki „dostarczające”
albo „rozprzestrzeniające” w kombinacji z drugą substancją czynną jak czynnik terapeutycznie
skuteczny obejmujący, lecz nie tylko, lek lub prolek. Celem takiej kombinacji jest łatwiejsze
dostarczanie lub wzmocnienie aktywności drugiego aktywnego czynnika. W szczególnym wykonaniu
w celu hamowania lub obniżania ukrwienia w czasie oftalmologicznego zabiegu chirurgicznego,
35
polipeptyd sHASEGP lub jego rozpuszczalna domena o aktywności hialuronidazy pochodzenia
ludzkiego, mogą być formułowane razem z środkiem anestetycznym jak lignokaina czy bupiwakaina
lub ich mieszaniną i opcjonalnie z środkiem hormonalnym jak epinefryna. Polipeptyd sHASEGP lub
jego rozpuszczalna domena o aktywności hialuronidazy pochodzenia ludzkiego mogą być również
formułowane z różnego rodzaju chemioterapeutykami, jak toksyna i TNF, w celu wzmocnienia
40
działania chemioterapeutyku i/lub jego dostępności dla docelowych komórek nowotworowych.
Aktywny składnik jest zawarty w nośniku w ilości wystarczającej aby wywołać terapeutycznie
przydatny efekt bez poważnych efektów toksycznych leczonego osobnika. Efektywne stężenie może
być wyznaczone doświadczalnie poprzez testowanie związków chemicznych stosując systemy in vivo
i in vitro w tym na opisanych tu modelach zwierzęcych.
[0370] Roztwory lub zawiesiny stosowane do aplikowania pozajelitowego, śródskórnego lub
miejscowego zewnętrznego, mogą zawierać następujące składniki : sterylny rozcieńczalnik, taki jak
5
woda do iniekcji, roztwór soli, olej stały, glikol polietylenowy, gliceryna, glikol propylenowy i inny
syntetyczny rozpuszczalnik, substancje antybakteryjne, takie jak alkohol benzylowy, paraben metylu,
antyoksydanty, takie jak kwas askorbinowy i wodorosiarczyn sodu, czynniki chelatujące, takie jak
kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), bufory takie jak octany, cytryniany i fosforany oraz środki
regulujące ciśnienie osmotyczne, takie jak jak chlorek sodu, chlorek wapnia, chlorek magnezu,
10
dekstroza, glicerol i kwas borny. Preparaty do podania pozajelitowego mogą być w ampułkach,
jednorazowych strzykawkach, szklanych, plastikowych lub z innego materiału i w fiolkach
zawierających dawkę pojedynczą lub do wielokrotnego podawania.
[0371] Polipeptydy sHASEGP lub ich rozpuszczalne domeny o aktywności hialuronidazy pochodzenia
ludzkiego mogą być zawieszone w postaci makrocząsteczkowej lub innej odpowiedniej formie, albo
15
przeprowadzone w pochodne będące produktem lepiej rozpuszczalnym i bardziej aktywnym bądź
prolekiem. Forma mieszaniny końcowej zależy od wielu czynników w tym zamierzonego sposobu
podawania i rozpuszczalności polipeptydu w wybranym nośniku lub podłożu. Efektywne stężenie jest
wystarczające do złagodzenia stanu chorobowego, będącego celem terapii, i może być wyznaczone
doświadczalnie, stosując metody znane specjalistom w danej dziedzinie. Frakcja wagowa polipeptydu
20
do formulacji kompozycji jest w wybranym złożu rozpuszczana, zawieszana, rozpraszana lub
mieszana w inny sposób w efektywnym stężeniu, tj. w takim które powoduje złagodzenie lub
ustąpienie stanu chorobowego będącego celem terapii.
[0372] W przypadku, kiedy polipeptydy sHASEGP lub rozpuszczalna domena o aktywności
hialuronidazy
25
pochodzenia
ludzkiego
wykazują
niewystarczającą
rozpuszczalność,
można
zastosować znane specjalistom metody rozpuszczania polipeptydów, które obejmuje, lecz nie tylko,
wykorzystanie korozpuszczalników, takich jak dimetylosulfotlenek (DMSO), użycie surfaktantów takich
jak TWEEN® i Pluronic® F68 lub rozpuszczanie w wodorowęglanie sodu. Pochodne polipeptydów,
takie jak proleki polipeptydowe, mogą być także wykorzystane w formulacji efektywnych kompozycji
farmaceutycznych. Kompozycje farmaceutyczne do zastosowania w oftalmologii są formułowane z
30
dopuszczalnym w oftalmologii nośnikiem. Podanie lokalne do zastosowań w oftalmologii przez
podanie miejscowe zewnętrzne lub iniekcję jest objęte niniejszym wynalazkiem. Pożądane są także
formulacje pozwalające na przedłużone uwalnianie leku. Zazwyczaj kompozycje farmaceutyczne są
formułowane do podania w jednej dawce, która zawiera ilość skuteczną terapeutycznie.
[0373] Po zmieszaniu lub dodaniu polipeptydu do złoża uzyskana mieszanina może być roztworem,
35
zawiesiną, emulsją lub inną formą kompozycji i może występować w formulacji mieszaniny wodnej,
kremu, żelu, maści, emulsji, roztworu, lekarstwa, płynu, zawiesiny, nalewki, pasty, piany, aerozolu,
płynu do płukania, aerozolu, spraya, czopków, opatrunków lub dowolnej innej formulacji odpowiedniej
do systemowego, miejscowego zewnętrznego lub lokalnego podania.
[0374] Forma uzyskanej mieszaniny zależy od wielu czynników, w tym od zamierzonego sposobu
40
podawania i rozpuszczalności związku chemicznego w wybranym nośniku lub złożu. W razie
konieczności wspomniany związek chemiczny przeprowadzany jest w dopuszczalne farmaceutycznie
sole lub inne pochodne. Do lokalnego podawania wewnętrznego, jak domięśniowe, pozajelitowe lub
dostawowe, związki chemiczne są korzystnie formułowane w postaci wodnego roztworu-zawiesiny w
formie izotonicznego buforowanego roztworu soli lub są mieszane z biokompatybilną, przeznaczoną
do podawania wewnętrznego, substancją wspomagającą lub bioadhezyjną.
[0375] Polipeptyd sHASEGP lub jego rozpuszczalna domena o aktywności hialuronidazy pochodzenia
5
ludzkiego jest zawarty w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku w ilości wystarczającej do
wywołania u leczonego pacjenta terapeutycznie użytecznego efektu unikając niepożądanych efektów
ubocznych. Zrozumiałe jest, że liczba i stopień nasilenia działań niepożądanych zależy od stanu
chorobowego stanowiącego powód podawania wspomnianych składników. Przykładem mogą być
pewne toksyczne i niepożądane efekty, które są tolerowane kiedy leczona choroba zagraża życiu, a
10
które nie byłyby tolerowane przy leczeniu zaburzeń lub mniej poważnych schorzeń. Ilości efektywne
do stosowania terapeutycznego będą zależeć oczywiście od tego, jak poważna jest choroba, od wagi i
ogólnego
stanu
leczonego
osobnika
oraz
od
drogi
podania.
Lokalne
podanie
czynnika
terapeutycznego zazwyczaj wymaga mniejszej dawki niż w przypadku którejkolwiek z dróg podania
systemowego, chociaż stężenie lokalne czynnika terapeutycznego może, w pewnych przypadkach,
15
być wyższe po podaniu lokalnym niż stężenie możliwe do osiągnięcia po podaniu systemowym.
[0376] Ze względu na to, że u różnych osobników poddanych leczeniu może wystąpić wiele różnych
objawów schorzenia o różnym stopniu nasilenia i każdy czynnik terapeutyczny posiada unikalne
właściwości terapeutyczne, od lekarza zależy ustalenie jak silna powinna być odpowiedź danego
osobnika na terapię i zgodnie z tym jakie powinno być dawkowanie. Dawki określone in vitro powinny
20
dostarczać danych ułatwiających ustalenie ilości kompozycji farmaceutycznych podawanych in situ. W
niektórych przypadkach do ustalania efektywnego dawkowania w terapii poszczególnych chorób
można wykorzystać model zwierzęcy. Ogólnie jednak, dla potrzeb podawania lokalnego, efektywna
ilość czynnika terapeutycznego to ilość w zakresie od około 0,1 pg do około 1 ng na kilogram masy
ciała, co obejmuje niniejszy wynalazek. Specjalistom w dziedzinie wiadomo, że ustalając efektywną
25
ilość czynnika terapeutycznego, bierze się pod uwagę wiele różnych czynników, co opisano np. w
Goodman And Gilman’s: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press,
1990; Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990; and
Mantyh et al., (Science, 278: 275-79, 1997) w tym iniekcję dooponową neuronalnego ligandu-toksyny.
Każda z powyższych publikacji stanowi w całości integralną część niniejszego dokumentu.
30
[0377] Formulacje polipeptydów sHASEGP lub ich rozpuszczalnych domen o aktywności
hialuronidazy pochodzenia ludzkiego do zastosowania, jak w niniejszym dokumencie, obejmują
sposoby formulacji odpowiednie dla podania drogą doustną, doodbytniczą, miejscowo zewnętrznie,
wziewnie, podpoliczkowo (np. podjęzykowo), pozajelitowo (np. podskórnie, domięśniowo, śródskórnie
lub dożylnie), transdermalnie lub inną dowolną drogą podania. Najbardziej odpowiednia droga
35
podania w danym przypadku zależy od natury i nasilenia leczonego schorzenia oraz od natury
zastosowanego konkretnego aktywnego związku chemicznego. Do podawania ludziom oraz
zwierzętom formulacje są dostarczane w farmaceutycznej dawce jednostkowej, takiej jak tabletki,
kapsułki, pigułki, proszek, granulki, sterylne płyny lub roztwory podawane pozajelitowo oraz płyny i
roztwory podawane doustnie, emulsje wodno-olejowe zawierające odpowiednie ilości polipeptydów
40
i/lub innych czynników i ich pochodnych. Farmaceutyczne terapeutycznie aktywne polipeptydy i/lub
inne czynniki i ich pochodne są zazwyczaj formułowane i podawane w farmaceutycznej dawce
jednostkowej leku lub w wariancie dawki wielokrotnej. Termin „forma jednostkowej dawki leku”, jaki
stosuje się w niniejszym dokumencie, oznacza fizycznie wyodrębnione, odpowiednie do stosowania u
ludzi i zwierząt, jednostki leku pakowane pojedynczo, jak wiadomo ze stanu techniki.
[0378] Wynalazkiem objęte są kompozycje farmaceutyczne przeznaczone do stosowania u ludzi i
zwierząt w formie tabletki, kapsułki, pigułki, proszku, granulek, sterylnych płynów lub roztworów
5
podawanych pozajelitowo oraz płynów i roztworów podawanych doustnie, emulsji wodno-olejowych
zawierających odpowiednie ilości polipeptydu sHASEGP lub rozpuszczalnej formy jej domeny o
aktywności hialuronidazy i opcjonalnie innego czynnika lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej
pochodnej. Terapeutycznie czynne chemiczne związki farmaceutyczne i ich pochodne są zazwyczaj
formułowane i podawane w dawkach jednostkowych lub wielokrotnych leku. Termin „forma
10
jednostkowej dawki leku”, jaki stosuje się w niniejszym dokumencie, oznacza fizycznie wyodrębnione
jednostki odpowiednie do stosowania u ludzi i zwierząt i pakowane pojedynczo, jak wiadomo ze stanu
techniki. Każda jednostkowa forma dawkowania zawiera z góry określoną ilość farmaceutycznie
aktywnego związku wystarczającą, w połączeniu z wymaganym nośnikiem, podłożem lub
rozcieńczalnikiem, do uzyskania pożądanego efektu terapeutycznego. Przykłady jednostkowych form
15
dawkowania obejmują, lecz nie tylko, ampułki, strzykawki i pojedynczo pakowane tabletki lub kapsułki.
Za przykład mogą służyć formulacje o małej objętości, które zawierają stabilizowany roztwór
zawierający od 1 do 5000 jednostek sHASEGP w małej objętości od 5 do 50 ul i mogą być
przygotowywane w strzykawce do jednorazowego użycia w iniekcji np. substancji wiskoelastycznej.
Formy jednostkowej dawki mogą być podawane w częściach dawki lub w jej wielokrotnościach.
20
Wielokrotne dawkowanie jest wielokrotnością identycznych form dawki jednostkowej, pakowanych w
pojedyncze pojemniki, do podawania w postaci osobnych form dawek jednostkowych. Przykłady form
dawek wielokrotnych obejmują fiolki, butelki zawierające tabletki, kapsułki lub butelki o objętości około
pół litra (1 pinta, GB = 0,57 l, US = 0,47 l) lub 4,546 l (1 galon). Stąd wielokrotna forma dawkowania
jest wielokrotnością jednostkowej formy dawkowania w jednym opakowaniu.
25
[0379] Kompozycja farmaceutyczna może zawierać, oprócz aktywnego składnika, takiego jak
polipeptyd
sHASEGP,
rozcieńczalnik
taki
jak
laktoza,
sacharoza,
fosforan
dwuwapniowy,
karboksymetyloceluloza, środek nawilżający, taki jak stearynian magnezu, stearynian wapnia i talk, a
jako spoiwo może zawierać skrobię, naturalne gumy takie jak guma arabska, glukoza, melasa,
poliwinylopirolidon, celulozy i ich pochodne, powidon, krospowidony i inne substancje wiążące znane
30
w stanie techniki. W celu uzyskania roztworu lub zawiesiny płynne kompozycje farmaceutyczne,
przeznaczone do podawania, mogą być przygotowywane np. przez rozpuszczanie, rozpraszanie lub
mieszanie aktywnego związku innymi sposobami, jak to zdefiniowano powyżej, jak również
rozpuszczanie, rozpraszanie lub mieszanie innymi sposobami farmaceutycznych adjuwantów w
nośniku, takim jak woda, sól fizjologiczna, wodny roztwór dekstrozy, glicerol, glikol, etanol i podobne.
35
Jeżeli istnieje taka potrzeba kompozycja farmaceutyczna, przeznaczona do podawania pacjentom,
może zawierać mniejsze ilości nietoksycznych substancji pomocniczych, takich jak środki zwilżające,
środki emulgujące lub środki rozpuszczające, środki buforujące i im podobne np. octan, cytrynian
sodu, pochodne cyklodekstranu, monolaurynian sorbitolu, trójetanoloamina/octan sodu, oleinian
trójetanoloaminy i inne tego rodzaju czynniki. Metody przygotowania takich postaci dawkowania są
40
znane lub będą oczywiste dla specjalisty w danej dziedzinie (patrz np. Remington’s Pharmaceutical
Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 15th Edition, 1975). Kompozycja farmaceutyczna
lub formulacja, przeznaczona do podawania pacjentom, zawiera czynny związek w ilości
wystarczającej do złagodzenia objawów u leczonego osobnika. Przykładem jest standardowo
stabilizowana formulacja sHASEGP lub jej rozpuszczalnej domeny o aktywności hialuronidazy,
będąca przedmiotem wynalazku, która zawiera 150 U/ml rozpuszczalnej glikoproteiny formułowanej w
EDTA, NaCl i CaCl2. Dodatkowo w formulacji mogą być obecne środki przeciwbakteryjne lub
5
przeciwgrzybicze, włączając w to, lecz nie tylko, tiomersal. Inna formulacja objęta niniejszym
wynalazkiem występuje w postaci stabilizowanego roztworu zliofilizowanej formy sHASEGP lub jej
rozpuszczalnej domeny o aktywności hialuronidazy w EDTA, NaCl i CaCl2, zawierająca aktywną
glikoproteinę rozpuszczalną w stężeniu 150 U/ml z dodatkiem laktozy w stężeniu 13 mg/ml.
Wynalazek obejmuje również formulację zawierającą stabilizowany roztwór bądź liofilizowaną postać
10
sHASEGP lub jej rozpuszczalną domenę o aktywności hialuronidazy w EDTA, NaCl i CaCl2., a także
albuminę, Pluronik® F68, TWEEN® i/lub inne detergenty. Inna formulacja, objęta niniejszym
wynalazkiem, zarówno postać zliofilizowana jak i stabilizowany roztwór, zawiera efektywną ilość
sHASEGP lub jej rozpuszczalną domenę o aktywności hialuronidazy w stężeniu od 1 do 300 U/ml w
EDTA, NaCl i CaCl2.
15
[0380] Możliwe jest przygotowanie formy dawkowania lub kompozycji farmaceutycznej zawierającej
aktywne składniki w przedziale stężenia wagowego od 0,005% do 100% zrównoważonego
nietoksycznym nośnikiem. Do podawania doustnego kompozycja farmaceutyczna może przybrać
formę np. tabletek lub kapsułek przygotowanych przy pomocy metod powszechnie stosowanych w
danej dziedzinie z farmaceutycznie dopuszczalnymi substancjami pomocniczymi takimi jak środki
20
wiążące (np. zżelowana skrobia kukurydziana, poliwinylopirolidon lub hydroksypropylometyloceluloza,
wypełniacze (np. laktoza, mikrokrystaliczna celuloza, wodorofosforan wapnia), środki nawilżające (np.
stearynian magnezu , talk lub krzemionka), środki przyspieszające rozpad (np. skrobia ziemniaczana,
karboksymetyloskrobia sodu) lub substancje powierzchniowo czynne (np. laurylosiarczan sodu).
Tabletki mogą być powlekane przy użyciu metod dobrze znanych w stanie techniki.
25
[0381] sHASEGP, jej rozpuszczalna domena o aktywności hialuronidazy lub farmaceutycznie
dopuszczalne pochodne mogą być przygotowane z nośnikami w postaci wolno uwalniającej się lub
powlekanej, które chronią rozpuszczalną glikoproteinę przed szybkim usuwaniem z organizmu.
Kompozycja
taka
może
zawierać
dla
uzyskania
pożądanej
kombinacji
właściwości
inne
farmaceutycznie czynne środki, powszechnie znane w stanie techniki i istotne w terapii jednego lub
30
większej liczby schorzeń obejmujące, lecz nie tylko, środek chemioterapeutyczny, środek
przeciwbólowy, środek przeciwzapalny, środek przeciwbakteryjny, środek pełzakobójczy, środek
antymalaryczny, środek przeciwdrgawkowy, środek przeciwdepresyjny, środek przeciwko zapaleniu
stawów, środek przeciwgrzybiczy, środek przeciwnadciśnieniowy, środek przeciwgorączkowy, środek
przeciwpasożytniczy, środek antyhistaminowy, agonistę receptorów alfa-adrenergicznych, alfa-bloker,
35
środek znieczulający, środek rozszerzający oskrzela, biocyd, środek bakteriobójczy, środek
bakteriostatyczny, bloker beta-adrenergiczny, środek blokujący kanały wapniowe, lek układu sercowonaczyniowego, środek antykoncepcyjny, środek zmniejszający przekrwienie, środek moczopędny,
środek tłumiący, środek diagnostyczny, elektrolit, środek nasenny, środek hormonalny, środek
hiperglikemiczny, środek zwiotczający mięśnie, środek obkurczający mięśnie, środek oczny, środek
40
parasympatomimetyczny,
środek
wspomagający
psychikę,
środek
uspokajający,
środek
sympatykomimetyczny, atraktyk, środek związany z układem moczowym, środek dopochwowy,
środek wirusobójczy, środek witaminowy, środek niesteroidowy przeciwzapalny, inhibitor enzymu
konwertującego angiotensynę, polipeptyd, białko, kwas nukleinowy, lek, prolek, związek organiczny i
środek usypiający. Zrozumiałe jest, że taka łączona terapia stanowi kolejny aspekt kompozycji
farmaceutycznej i sposobów leczenia będących przedmiotem tego wynalazku.
[0382] 1. KOMPOZYCJA STOSOWANA DO PODAWANIA DOUSTNEGO
5
[0383] Doustne postaci dawkowania leku są w postaci stałej, w postaci żelu lub płynu. Stałe postaci
leku to tabletki, kapsułki, granulki i proszki luzem. Rodzaje tabletek doustnych obejmują tabletki
prasowane, tabletki do żucia i ssania, które mogą być powlekane substancją kwasoodporną (tabletki
dojelitowe), otoczką cukrową lub polimerem. Kapsułki mogą być sporządzane z twardej lub miękkiej
żelatyny, natomiast granulki i proszki mogą być dostarczane w formie musującej lub niemusującej w
10
kombinacji z innymi składnikami znanymi specjalistom.
[0384] Kompozycja farmaceutyczna zawierająca sHASEGP lub jej rozpuszczalną domenę o
aktywności hialuronidazy może występować w formie płynnej np. w formie roztworów, syropów lub
zawiesiny, albo jako lek, który przed użyciem należy rozpuścić w wodzie lub w innej odpowiedniej do
tego celu substancji pomocniczej. Środki płynne tego typu mogą być, przy pomocy metod
15
powszechnie w danej dziedzinie stosowanych, sporządzane z farmaceutycznie dopuszczalnymi
domieszkami, jak czynniki suspendujące (np. syrop sorbitolowy, pochodne celulozy lub utwardzone
tłuszcze jadalne), emulgatory (np. lecytyna lub guma arabska), bezwodne substancje pomocnicze (np.
olej migdałowy, estry kwasów tłuszczowych lub frakcjonowane oleje jadalne), konserwanty (metylolub propylo-p hydroksybenzoesan lub kwas sorbowy).
20
[0385] W pewnych wykonaniach, formulacje występują w postaci stałych form dawkowania, korzystnie
w postaci kapsułek lub tabletek. Tabletki, pigułki, kapsułki, kołaczyki i podobne mogą zawierać
dowolny z wymienionych składników lub związków o podobnej naturze a więc substancję wiążącą,
substancję rozcieńczającą, substancję rozpierającą, substancję nawilżającą, substancję poślizgową,
substancję słodzącą i substancję smakową.
25
[0386] Przykłady substancji wiążących obejmują mikrokrystaliczną celulozę, tragakantę, roztwór
glukozy, gumę arabską, klej roślinny, roztwór żelatyny, pastę sacharozową i skrobiową. Substancje
nawilżające obejmują talk, stearynian magnezu lub wapnia, kwasy tłuszczowe z widłaka
gwiaździstego i kwas stearynowy. Przykładowo substancje rozcieńczające obejmują np. laktozę,
sacharozę, skrobię, kaolin, mannitol, fosforan dwuwapniowy. Substancje poślizgowe obejmują, lecz
30
nie tylko, koloidalny dwutlenek krzemu. Substancje rozpierające obejmują wewnętrznie usieciowaną
sól sodową karboksymetylocelulozy, skrobię kukurydzianą, skrobię ziemniaczaną, k sól sodową
karboksymetyloskrobii, kwas alginowy, bentonit, metylocelulozę, agar i karboksymetylocelulozę.
Substancje
koloryzujące
obejmują
np.
dowolny,
dopuszczony
przez
FDA,
certyfikowany,
rozpuszczalny w wodzie barwnik FD i C oraz mieszaniny barwników, a także rozpuszczalne w wodzie
35
dopuszczone przez FDA barwniki zawieszone w wodzianie glinu. Substancje słodzące obejmują
sacharozę, laktozę, mannitol, sztuczne słodziki jak sacharyna i dowolną ilość natryskowo suszonych
substancji smakowych. Substancje smakowe obejmują naturalne substancje smakowe ekstrahowane
z roślin np. z owoców, mieszanki syntetyczne wytwarzające przyjemny zapach, takie jak, lecz nie
tylko, mięta pieprzowa lub salicylan metylu. Substancje powierzchniowo czynne obejmują
40
monostearynian glikolu propylenowego, monooleinian sorbitanu, monolaurynian glikolu dietylenowego
i eter monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu. Otoczki o charakterze przeciwwymiotnym obejmują
metylocelulozę, sól sodową karboksymetylocelulozy, glikol polietylenowy oraz octanoftanal.
[0387] W przypadku podawania doustnego, jeżeli istnieje taka potrzeba, można dostarczać sHASEGP
lub jej rozpuszczalną domenę o aktywności hialuronidazy w kompozycji farmaceutycznej, która chroni
je przed kwaśnym środowiskiem żołądka. Przykładem może być kompozycja farmaceutyczna
sformułowana jako tabletka dojelitowa, która nie rozpada się w żołądku i uwalnia substancję leczniczą
5
w jelicie cienkim. Kompozycja farmaceutyczna może być sformułowana w kombinacji ze środkiem
zobojętniającym kwas lub inną tego typu substancją.
[0388] Jeżeli formą dawkowania jest kapsułka, może ona zawierać, oprócz materiału jak opisano
powyżej, nośnik płynny taki jak ciekły tłuszcz. Dodatkowo, formy dawki jednostkowej mogą zawierać
różnego rodzaju inne substancje, które modyfikują fizyczną formę dawki jednostkowej np. otoczka
10
cukrowa i inne formy powlekania o przeznaczeniu dojelitowym. Związki chemiczne mogą być
podawane jako składowe eliksiru, zawiesiny, syropu i opłatka, aerozolu, gumy do żucia lub form
podobnych. Syrop może zawierać, oprócz składników czynnych, sacharozę i czynniki słodzące oraz
określone konserwanty, barwniki, koloranty i substancje smakowe.
[0389] sHASEGP lub jej rozpuszczalna domena o aktywności hialuronidazy może być także mieszana
15
z innymi substancjami czynnymi, które nie wpływają niekorzystnie na pożądane działanie lub z
substancjami, które uzupełniają pożądane działanie, jak środki zobojętniające kwasy, blokery H2 lub
środki moczopędne. Czynny składnik jest związkiem lub jego farmaceutycznie dopuszczalną
pochodną, jak opisano w niniejszym dokumencie, a jego stężenie może wynosić do około 98%
wagowych czynnego składnika.
20
[0390] Nośniki dopuszczalne farmaceutyczne zawarte w tabletkach są substancjami wiążącymi,
nawilżającymi, rozcieńczającymi, rozpierającymi, kolorującymi, nadającymi smak i czynnymi
powierzchniowo. Tabletki dojelitowe dzięki swojej otoczce są odporne na kwaśne środowisko w
żołądku i rozpuszczają się lub rozpadają w obojętnym lub zasadowym środowisku jelita cienkiego.
Tabletki
25
drażowane
są
prasowanymi
tabletkami,
które
powleczono
różnymi
warstwami
dopuszczalnych farmaceutycznie substancji. Tabletki powlekane polimerem są to tabletki prasowane,
które powleczono polimerem lub inną odpowiednia substancja powlekającą. Wielokrotne tabletki
prasowane to tabletki powstające w wyniku więcej niż jednego cyklu prasowania przy wykorzystaniu
farmaceutycznie dopuszczalnych substancji wspomnianych wcześniej. W powyższych formach
dawkowania można użyć substancji koloryzujących. Substancji smakowych i koloryzujących można
30
użyć w tabletkach prasowanych, drażowanych, wielokrotnie prasowanych i w tabletkach do żucia.
Substancje smakowe i koloryzujące są szczególnie przydatne w formowaniu tabletek do żucia i
ssania.
[0391] Formy dawkowania doustnego obejmują roztwory wodne, emulsje, zawiesiny, roztwory i/lub
zawiesiny rekonstytuowane z niemusujących granulek i musujących preparatów, rekonstytuowane z
35
musujących granulek. Roztwory wodne obejmują np. eliksiry i syropy. Emulsje występują w postaci
oleju w wodzie lub w postaci wody w oleju.
[0392] Eliksiry są preparatami klarownymi, słodzonymi i wodno-alkoholowymi. Stosowane w eliksirach
farmaceutycznie dopuszczalne nośniki zawierają rozpuszczalnik. Syropy są to skoncentrowane
roztwory wodne cukru, np. sacharozy i zawierają konserwant. Emulsja jest systemem dwufazowym, w
40
którym ciecz jest rozproszona w innej cieczy w postaci małych kulek. Farmaceutycznie dopuszczalne
nośniki stosowane w emulsjach są bezwodnymi cieczami, emulgatorami i konserwantami. W
zawiesinach używa się farmaceutycznie dopuszczalnych czynników zawieszających i konserwantów.
Farmaceutycznie dopuszczalne substancje stosowane w niemusujących granulkach do rekonstytucji
w postaci płynnej formy doustnej obejmują rozcieńczalniki, substancje słodzące i substancje
powierzchniowo czynne. Farmaceutycznie dopuszczalne substancje stosowane w granulkach
musujących do rekonstytucji w postaci płynnej formy doustnej, zawierają kwasy organiczne i źródło
5
dwutlenku węgla. Substancje koloryzujące i smakowe są stosowane we wszystkich powyższych
formach dawkowania.
[0393] Rozpuszczalniki obejmują glicerynę, sorbitol, alkohol etylowy i syrop. Przykłady konserwantów
obejmują glicerynę, metylo i propyloparaben, kwas benzoesowy, benzoesan sodu i alkohol. Przykłady
bezwodnych płynów stosowanych w emulsjach obejmują olej mineralny i olej z nasion bawełny.
10
Przykłady czynników emulgujących obejmują żelatynę, gumę arabską, tragakantę, bentonit i
surfaktanty, takie jak monooleinian polioksyetylenosorbitolu. Substancje zawieszające obejmują sól
sodową karboksymetylocelulozy, pektynę, tragakantę, krzemian magnezowo-aluminiowy i gumę
arabską. Rozcieńczalniki obejmują laktozę i sacharozę. Substancje słodzące obejmują sacharozę,
syropy, glicerynę i sztuczne słodziki, takie jak sacharyna. Substancje powierzchniowo czynne
15
obejmują monostearynian glikolu propylenowego, monooleinian sorbitanu, monolaurynian glikolu
dietylenowego i polioksyetylenowany laurylosiarczan eteru. Organiczne domieszki obejmują kwas
cytrynowy i winny. Źródła dwutlenku węgla obejmują kwaśny węglan sodu i wodorowęglan sodu.
Substancje koloryzujące obejmują dowolny, dopuszczony przez FDA i certyfikowany, rozpuszczalny w
wodzie barwnik lub mieszaninę barwników. Substancje smakowe obejmują naturalne ekstrakty
20
smakowe z roślin, np. z owoców i syntetyczne mieszaniny związków, które wytwarzają przyjemne
doznania smakowe.
[0394] W postaci stałej formy dawkowania roztwór lub zawiesina, np. w węglanie propylenu, olejach
roślinnych lub trójglicerydach, jest zamknięty w żelatynowych kapsułkach. Taki roztwór oraz jego
preparacja i zamykanie w kapsułkach są ujawnione w patencie w Stanach Zjednoczonych Nr
25
4,328,245; 4,409,239; and 4,410,545. Postać płynnej formy dawkowania tj. roztwór, np. w glikolu
polietylenowym, może być rozcieńczany w dostatecznej ilości farmaceutycznie dopuszczalnego
nośnika (np. w wodzie), co ułatwia odmierzanie odpowiedniej dawki przed podaniem leku pacjentowi.
[0395] Alternatywnie, doustne formulacje płynne lub półstałe mogą być przygotowywane przez
rozcieńczanie lub rozpraszanie sHASEGP lub jej rozpuszczalnej domeny o aktywności hialuronidazy
30
w olejach roślinnych, glikolach, trójglicerydach, estrach glikolu propylenowego (np. w węglanie
propylenu) i w innych nośnikach. Doustne formulacje płynne lub półstałe mogą być przygotowywane
również przez kapsułkowanie wspomnianych roztworów lub zawiesin w twardych lub miękkich
osłonkach żelatynowych kapsułek. Inną przydatną formulację zawiera patent U.S. Patent Nos. Re
28,819 i 4,358,603.
35
[0396] Formulacje odpowiednie do podania podpoliczkowego (podjęzykowego) obejmują przykładowo
tabletki do ssania zawierające sHASEGP lub jej rozpuszczalną domenę o aktywności hialuronidazy, w
aromatyzowanej bazie leku, zwykle sacharozie, gumie arabskiej lub tragakancie. Formulacje te
obejmują także pastylki zawierające związek chemiczny w niereaktywnej bazie takiej jak żelatyna,
gliceryna, sacharoza lub guma arabska.
40
[0397] Jak wiadomo specjalistom, formulacje tabletek i kapsułek mogą być we wszystkich
urzeczywistnieniach powlekane w celu modyfikacji lub przedłużenia czasu rozpadu czynnego
składnika np. konwencjonalną, odporną, na trawienie w żołądku otoczką jak salicylan fenylu, woski i
ftalan octanu celulozy.
[0398] 2. PŁYNY PODAWANE W ZASTRZYKACH, ROZTWORY I EMULSJE.
[0399] W niniejszy wynalazek włączone jest podanie pozajelitowe sHASEGP lub jej rozpuszczalnej
5
domeny o aktywności hialuronidazy, ogólnie odbywające się poprzez wstrzyknięcie podskórne,
domięśniowe lub dożylne. Płyny do wstrzyknięcia mogą być przygotowane w postaci powszechnie
znanej jako płynny roztwór lub zawiesina, w postaci stałej, odpowiedniej do sporządzenia przed
iniekcją roztworu lub zawiesiny w płynie lub w postaci emulsji. Odpowiednią substancją
wspomagającą jest np. woda, roztwór soli, dekstroza, glicerol lub etanol. Dodatkowo, jeżeli jest taka
10
potrzeba, kompozycje farmaceutyczne, przeznaczone do podawania pacjentowi mogą zawierać
mniejsze ilości nietoksycznych substancji pomocniczych takich jak substancje powierzchniowo czynne
lub emulgatory, czynniki buforujące, stabilizatory, czynniki podnoszące rozpuszczalność i inne
czynniki jak np. octan sodu, monolaurynian sorbitanu, oleinian trietanoloaminy i cyklodekstryny.
Wynalazek zawiera też implantacje systemów powolnego lub opóźnionego uwalniania leku, które
15
pozwalają utrzymać stały poziom dawkowania (patrz np. patent US nr 3,710,795). Procent sHASEGP
lub jej rozpuszczalnej domeny o aktywności hialuronidazy zawarty w tego typu pozajelitowej
kompozycji zależy od jej specyficznej natury a także od aktywności związku chemicznego i wymagań
leczenia.
[0400] Podanie pozajelitowe kompozycji farmaceutycznej obejmuje podanie dożylne, podskórne i
20
domięśniowe. Preparacje do podania pozajelitowego obejmują sterylne roztwory gotowe do
wstrzyknięcia, sterylne suche rozpuszczalne produkty, takie jak liofilizowane proszki gotowe do
zmieszania przed użyciem z rozpuszczalnikiem lub sterylnym roztworem, podskórne tabletki, sterylne
zawiesiny gotowe do wstrzyknięcia, sterylne suche nierozpuszczalne produkty gotowe do zmieszania
z substancją pomocniczą tuż przed użyciem i sterylne emulsje. Roztwór może mieć charakter wodny
25
lub bezwodny.
[0401] W przypadku podania dożylnego odpowiednie nośniki obejmują roztwór soli fizjologicznej lub
roztwór soli fizjologicznej w PBS oraz roztwory zawierające czynniki zagęszczające, takie jak glukoza,
glikol polietylenowy, glikol polipropylenowy i ich mieszaniny.
[0402] Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, stosowane w preparatach przeznaczonych do podania
30
pozajelitowego, zawierają podłoże wodne, podłoże bezwodne, czynniki przeciwbakteryjne, czynniki
izotoniczne, bufory, antyoksydanty, środki znieczulające miejscowo, czynniki zawieszające i
rozpraszające, emulgatory, czynniki wychwytujące lub chelatujące i inne farmaceutycznie
dopuszczalne substancje.
[0403] Przykłady podłoży wodnych obejmują chlorek sodu, roztworu Ringera, izotoniczny roztwór
35
dekstrozy, sterylną wodę, dekstrozę i mleczan Ringera. Bezwodne podłoża przeznaczone do
podawania pozajelitowego, zawierają oleje stałe na bazie roślinnej, olej z nasion bawełny, olej
kukurydziany, olej sezamowy i olej arachidowy. Czynniki przeciwko drobnoustrojom w stężeniach
hamujących wzrost bakterii lub grzybów muszą być dodawane do preparatów o przeznaczeniu
pozajelitowym pakowanych w wielodawkowe pojemniki, które zawierają fenole lub krezole, związki
40
rtęci, alkohol benzylowy, chlorobutanol, ester metylowy i propylowy kwasu p-hydroksybenzoesowego,
tiomersal, chlorek benzalkonium, chlorek benzyloamoniowy. Czynniki izotoniczne obejmują chlorek
sodu i dekstrozę. Bufory obejmują fosforany i cytryniany. Antyoksydanty obejmują wodorosiarczan
sodu. Środki miejscowo znieczulające obejmują hydrochlorek prokaliny. Środki zawieszające i
rozpraszające obejmują sól sodową karboksymetyloceluozy, hydroksypropylometylocelulozę i
poliwinylopirolidon. Emulgatory obejmują polisorbat 80 (TWEEN 80). Czynniki wyłapujące i
chelatujące jony metali obejmują EDTA. Nośniki farmaceutyczne obejmują także alkohol etylowy,
5
glikol polietylenowy i glikol propylenowy jako mieszalne podłoże i wodorotlenek sodu, kwas solny,
kwas cytrynowy i kwas mlekowy do dopasowywania pH.
[0404] Stężenie związków czynnych farmaceutycznie jest ustalone na poziomie skutecznej ilości,
która pozwala uzyskać pożądany efekt farmakologiczny. Dokładna dawka zależy od wieku, wagi i
stanu pacjenta lub zwierzęcia, co wiadomo ze stanu techniki.
10
[0405] Preparaty w formie dawek jednostkowych, przeznaczone do podawania pozajelitowego, są
pakowane w ampułki, fiolki i strzykawki z igłą. Wszystkie preparaty do podawania pozajelitowgo
muszą być sterylne, co jest w stanie techniki znane i praktykowane.
[0406] Przykładowo, skutecznym sposobem podania jest dożylny i dotętniczy wlew sterylnego
roztworu wodnego zawierającego czynny związek. Innym urzeczywistnieniem jest sterylny wodny lub
15
olejowy roztwór lub zawiesina zawierająca czynną substancję, która do wytworzenia pożądanego
efektu farmakologicznego wymaga wstrzyknięcia
[0407] Leki wstrzykiwane do leczonej tkanki (tkanek) są przewidziane do podania miejscowego lub
systemowego. Zazwyczaj skuteczna dawka terapeutyczna jest formułowana z zawartością czynnej
substancji o stężeniu przynajmniej 0,1% w/w do około 90% w/w lub więcej, korzystnie więcej niż 1%
20
w/w. Substancja czynna, jak sHASEGP lub jej rozpuszczalna domena o aktywności hialuronidazy,
mogą być podawane w pojedynczej dawce lub w kilku mniejszych dawkach podawanych w odstępach
czasowych. Zrozumiale jest, że precyzyjne dawkowanie i czas trwania leczenia jest zależny od typu
leczonej tkanki i może być wyznaczony doświadczalnie wykorzystując znane protokoły testowania lub
ekstrapolując rezultaty otrzymane w testach in vitro i in vivo. Należy zauważyć, że stężenie i dawka
25
mogą się zmieniać w zależności od wieku leczonego osobnika. Zrozumiałe jest również, że dla
każdego konkretnego leczonego osobnika, należy ustalić specyficzny schemat dawkowania w czasie
okresu leczenia i w zależności od potrzeb indywidualnych oraz fachowej opinii osoby podającej lek lub
nadzorującej formulację. Zrozumiałe jest również, że przedstawione w niniejszym dokumencie zakresy
stężeń są wyłącznie stężeniami przykładowymi i nie ograniczają zakresu lub zastosowania
30
praktycznego zastrzeganej formulacji.
[0408] Związki chemiczne, będące przedmiotem niniejszego wynalazku, mogą być formułowane z
przeznaczeniem do podawania pozajelitowego w iniekcjach np. w dużej jednorazowej dawce do
wstrzykiwania (ang. bolus injection) lub we wlewie dożylnym. Formulacje do celów iniekcyjnych mogą
występować w formie jednostkowej dawkowania z dodatkiem konserwantu np. w ampułkach lub
35
pojemnikach zawierających dawkę wielokrotną. Kompozycja farmaceutyczna może być w postaci
zawiesiny, roztworu lub emulsji w podłożu olejowym lub wodnym i może zawierać składowe
formulacyjne jak czynniki zawieszające, stabilizujące i/lub rozpraszające. Alternatywnie, czynne
składniki mogą występować w formie proszku do rekonstytucji przed użyciem w odpowiednim podłożu
np. w sterylnej wodzie wolnej od pirogenów lub w innych rozpuszczalnikach. Przykładowo wynalazek
40
dotyczy postaci leku z przeznaczeniem do podawania pozajelitowego, która zawiera efektywną ilość
sHASEGP lub jej rozpuszczalnej domeny o aktywności hialuronidazy, tj. od 500 do 500 000 U w
roztworze stabilizującym lub formie liofilizowanej.
[0409] Wspomniany związek chemiczny może być zawieszany w postaci mikrocząsteczkowej lub innej
odpowiedniej formie lub może być przeprowadzony w pochodne w celu uzyskania aktywniejszego
produktu lub proleku. Forma otrzymanej mieszaniny zależy od wielu czynników, w tym od planowanej
drogi podawania i od rozpuszczalności związku w wybranym nośniku lub podłożu. Efektywne stężenie
5
jest wystarczające do złagodzenia objawów leczonego stanu i może być wyznaczone doświadczalnie.
[0410] 3. PROSZKI LIOFILIZOWANE
[0411] Wynalazek obejmuje także liofilizowane proszki zawierające sHASEGP lub jej rozpuszczalną
domenę o aktywności hialuronidazy, która przed podaniem może być rekonstytuowana w postaci
roztworu, emulsji lub innej mieszaniny. Formulacje tego typu mogą być sporządzane i rekostytuowane
10
w postaci stałej lub żelu.
[0412] Sterylny liofilizowany proszek jest przygotowywany przez rozpuszczenie w odpowiednim
rozpuszczalniku porcji jego postaci stałej lub przez zmieszanie porcji roztworu zawierającego
sHASEGP lub jej rozpuszczalną domenę o aktywności hialuronidazy. Rozpuszczalnik może zawierać
substancję pomocniczą, która podnosi rozpuszczalność a także inne farmaceutyczne komponenty
15
proszku lub rekonstytuowanego roztworu przygotowanego na bazie proszku. Substancjami
pomocniczymi mogą być, lecz nie tylko, dekstroza, sorbitol, fruktoza, syrop kukurydziany, ksylitol,
gliceryna, glukoza, sacharoza, laktoza i inne odpowiedniego rodzaju czynniki. Rozpuszczalnik może
także zawierać bufor,takie jak bufor cytrynianowy, fosforan sodu lub potasu lub inne znane
specjalistom w dziedzinie bufory, zazwyczaj o pH bliskim obojętnemu. Liofilizowaną postać leku
20
otrzymuje się w wyniku kolejnych sterylnych filtracji, stosowanych naprzemiennie z liofilizacją,
przeprowadzanych w standardowych warunkach znanych specjalistom w dziedzinie. Ogólnie roztwór
otrzymywany po sterylnej filtracji jest w celu przeprowadzenia liofilizacji porcjowany do fiolek. Każda
fiolka może zawierać pojedynczą dawkę, taką jak 10-1000 mg, 100-500 mg lub wielokrotność dawki
danej substancji.
25
[413] W skrócie, liofilizowany proszek jest przygotowywany przez rozpuszczenie dekstrozy, sorbitolu,
fruktozy, syropu kukurydzianego, ksylitolu, gliceryny, glukozy, laktozy i innych odpowiednich
czynników w ilości około 1-20% w odpowiednim buforze o pH blisko obojętnemu, jak cytrynian,
fosforan sodu lub potasu i w innych tego typu buforach znanych specjalistom. Następnie wybrana sól,
jak np. sól sodowa sHASEGP (około 1 gm soli na 10-100 gms buforu, zazwyczaj 1 gm/30 gms) jest
30
dodawana do otrzymanej mieszaniny w temperaturze wyższej niż temperatura pokojowa, taka jak
około 30-35oC i mieszana do rozpuszczenia. Otrzymany roztwór jest rozcieńczany przez dodawanie
buforu w celu obniżenia stężenia końcowego.
[0414] Rekonstytucja wspomnianego liofilizowanego proszku w wodzie do iniekcji dostarcza postaci
leku do podawania pozajelitowego. W tym celu ilość terapeutyczna liofilizowanego proszku
35
zawierającego sHASEGP lub jej rozpuszczalną domenę o aktywności hialuronidazy jest
rekonstytuowana przez dodawana na objętość w mililitrach sterylnej wody lub innego odpowiedniego
nośnika. Dokładna ilość zależy
od wybranego związku chemicznego i może być wyznaczona doświadczalnie metodami znanymi
specjalistom w dziedzinie.
40
[0415] 4. PODANIE MIEJSCOWE ZEWNĘTRZNE
[0416] Mieszaniny przeznaczone do podawania miejscowego zewnętrznego są przygotowywane jak
już opisano dla podawania lokalnego i systemowego. Do podawania miejscowego zewnętrznego
uzyskana mieszanina może występować w postaci roztworu, zawiesiny, nalewki, past, pian, aerozoli,
sprayów, czopków, opatrunków, bandaży, plastrów naskórnych lub innych postaci odpowiednich do
podawania.
[0417] Kompozycje farmaceutyczne sHASEGP, jej rozpuszczalnej domeny o aktywności hialuronidazy
5
lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych pochodnych mogą występować w postaci aerozoli do
podania miejscowego jak np. inhalacja (patrz np. U.S Patent Nos. 4,044,126, 4,414,209, i 4,364,923,
który opisuje aerozole do podawania sterydów przydatne w leczeniu chorób o podłożu zapalnym,
szczególnie astmy). Postaci leków przeznaczone do podawania do układu oddechowego mogą
występować w formie aerozoli, roztworu do rozpylania z użyciem rozpylacza lub jako
10
mikrocząsteczkowy proszek do wdychania, w postaci czystej lub z dodatkiem niereaktywnego nośnika
np. laktozy. W przypadku podawania do układu oddechowego cząsteczki w postaci leku, jak
wymieniono powyżej, będą mieć zwykle średnicę mniejszą niż 50 mikronów, przykładowo mniej niż 10
mikronów.
[0418] Kompozycja farmaceutyczna do podawania przez inhalację, w sposób opisany w niniejszym
15
wynalazku, może być dostarczana w formie aerozolu lub spray'u w opakowaniach pod ciśnieniem lub
w rozpylaczach z odpowiednim gazem, który obejmuje, lecz nie tylko dichloro-difluorometan, trichlorofluorometan, dichloro-tetrafluoroetan, dwutlenek węgla i inne odpowiedniego rodzaju gazy. W
przypadku aerozolu pod ciśnieniem, dawka jednostkowa może być wyznaczona przez pomiar przy
użyciu zaworu. Kapsułki i naboje np. żelatynowe do zastosowania w inhalatorach lub insuflatorach
20
mogą być w postaci zawierającej mieszaninę leku w proszku i odpowiedniego proszku bazowego jak
laktoza lub skrobia.
[0419] Kompozycja farmaceutyczna może występować w postaci odpowiedniej do podawania
lokalnego, zewnętrznego i wewnętrznego, jak do lokalnego podawania zewnętrznego na powierzchnię
skóry lub błon śluzowych,( np. do oka), w formie żeli, kremów i balsamów przeznaczonych do
25
podawania do oka, podawania wewnątrztorebkowego i wewnątrzrdzeniowego. Wynalazkiem objęte
jest również podawanie transdermalne, do oka, na powierzchnie błon śluzowych lub podczas inhalacji.
Do podawania do nosa przeznaczony jest roztwór zawierający bądź samą aktywną substancję bądź
wariant roztworu z domieszką farmaceutycznie dopuszczalnej substancji pomocniczej.
[0420] Jako przykład służą postaci leków odpowiednie do podawania miejscowego zewnętrznego na
30
powierzchnię skóry lub do oka, które ogólnie występują w postaci maści, kremu, balsamu, pasty, żelu,
spray'u, aerozolu i oleju. Nośniki możliwe do zastosowania obejmują wazelinę, lanolinę, glikole
polietylenowe, alkohole i kombinacje dwóch lub więcej wymienionych składników. Postaci leków
przeznaczone do podawania miejscowego zewnętrznego mogą korzystnie zawierać od 0,05 do 15%
wagowych substancji zagęszczających, w tym, lecz nie tylko, hydroksypropylometylocelulozę,
35
metylocelulozę, poliwinylopirolidon, alkohol poliwinylowy, glikole polialkilenowe, poli(metakrylany
hydroksyalkilów) lub polimetyloakrylamidy. Postać leku do zastosowania miejscowego zewnętrznego
jest często aplikowana do worka spojówkowego w kroplach lub jako maść. Może być także stosowana
w irygacji lub nawilżaniu oka, zatok twarzowych i zewnętrznego przewodu słuchowego. W stanie
płynnym wspomniana postać leku może występować również jako trójwymiarowa macierz zbudowana
40
z polimeru w formie paska, soczewek kontaktowych i form podobnych, z których uwalniane są czynne
składniki. Postać leku do zastosowania miejscowego zewnętrznego może być również wstrzykiwana
do przedniej komory oka i w inne miejsca. Przykładowo wynalazek obejmuje postać leku do
stosowania śródocznego po iniekcji materiału wiskoelastycznego, zawierającą stabilizowany roztwór
efektywnej ilości sHASEGP lub jej rozpuszczalnej domeny o aktywności hialuronidazy zawierającej się
w przedziale od 1 do 5000 U rozpuszczalnej glikoproteiny o 30-150,000 U/mg specyficznej aktywności
w małej objętości takiej jak od 5 do 50 ul.
5
[0421] Tego rodzaju roztwory, w szczególności przeznaczone do zastosowania oftalmologicznego,
mogą być w postaci 0,01%-10% izotonicznego roztworu o pH około 5-7 w odpowiedniej soli.
[0422] 5. Kompozycje farmaceutyczne dla innych dróg podania.
[0423] Niniejszym wynalazkiem objęte są inne drogi podawania, jak aplikacja miejscowa i zewnętrzna,
plastry naskórne i podawanie doodbytnicze.
10
[0424] Przykładem są farmaceutyczne formy dawkowania do podawania doodbytniczego w postaci
czopków doodbytniczych, kapsułek i tabletek o działaniu ogólnoustrojowym. Termin „czopki
doodbytnicze', w rozumieniu niniejszego wynalazku, oznaczają formę stałą do wprowadzania do
odbytu, która topi się lub mięknie w temperaturze ciała uwalniając jeden lub więcej farmaceutycznie
lub terapeutycznie aktywnych składników. Substancje dopuszczalne farmaceutycznie, stosowane w
15
czopkach doodbytniczych, są to substancje bazowe lub podłoża i czynniki, które podnoszą
temperaturę topnienia. Przykładami takich substancji bazowych są masło kakaowe (olej kakaowy ),
glicerol-żelatyna, CARBOWAX (glikol polioksyetylenowy) i odpowiednie mieszaniny mono-, di- i
trójglicerydów kwasów tłuszczowych. Możliwe jest zastosowanie innych kombinacji substancji
bazowych. Czynniki podnoszące temperaturę topnienia czopków obejmują spermacet i wosk. Czopki
20
doodbytnicze mogą być sporządzane metodą prasowania lub kształtowania w formie. Typowa waga
czopka doodbytniczego wynosi około 2 do 3 gm.
[0425] Tabletki i kapsułki do podawania doodbytniczego są sporządzane tymi samymi metodami oraz
z wykorzystaniem tej samej farmaceutycznie dopuszczalnej substancji, co postaci leków do
podawania doustnego.
25
[0426] Postaci leku odpowiednie do podawania transdermalnego mogą występować jako osobne
plastry, które są przystosowane do pozostawania w ścisłym kontakcie z naskórkiem pacjenta przez
dłuższy okres czasu. Tego typu plastry zawierają odpowiedni składnik czynny, taki jak, opcjonalnie,
buforowane roztwory wodne zawierające czynny składnik w stężeniu np. od 0,1 do 0,2 M. Postać leku
odpowiednia do podawania transdermalnego może być również dostarczana poprzez jonoforezę
30
(patrz np. Pharmaceutical Research 3 (6): 318 (1986)) i zazwyczaj przyjmuje formę opcjonalnie
buforowanego roztworu aktywnego składnika.
[0427] Kompozycje farmaceutyczne można również podawać z wykorzystaniem aparatury do
kontrolowanego uwalniania i/lub dostarczania leku (patrz w patencie U.S. Patent Nos. 3,536,809;
3,598,123; 3,630,200; 3,845,770; 3,847,770; 3,916,899; 4,008,719; 4,687,610; 4,769,027; 5,059,595;
35
5,073,543; 5,120,548; 5,354,566; 5,591,767; 5,639,476; 5,674,533 and 5,733,566). Czynne składniki
lub ich farmaceutycznie dopuszczalne pochodne mogą być przygotowywane razem z nośnikami, które
chronią czynny składnik przed szybkim usunięciem z organizmu, jak w przypadku powlekania lub
postaci leku o przedłużonym działaniu.
[0428] W jednym wykonaniu kompozycji farmaceutycznej i sposobów objętych niniejszym
40
wynalazkiem, czynnik terapeutyczny jest podawany miejscowo w podłożu wolno uwalniającym lek. np.
w postaci kapsułek z systemem rozproszenia koloidalnego lub stabilizowanymi kryształami polimeru.
Przydatne systemy rozproszenia koloidalnego obejmują nanokapsułki, mikrosfery, kuleczki do
opłaszczania i systemy oparte na lipidach w tym emulsje typu olej w wodzie, micele, mieszane micele
i liposomy. Przykładem jest system rozproszenia koloidalnego, który może być w formie liposomu albo
mikrosfery. Liposomy to sztuczne pęcherzyki błonowe, używane jako nośniki, które, po wstrzyknięciu
lub wszczepieniu, wolno uwalniają lek. Kilka przykładów koniugatów lipidowo-polimerowych i
5
liposomów zostało ujawnionych w patencie U.S. Nr 5631018, który jest tu włączony jako odniesienie w
całości
dokumentu.
Innym
przykładem
nośników
wolno
uwalniających
lek
jest
macierz
biodegradowalna (patent U.S. Nr 5041292), koniugaty z polimerami dendrytycznymi (U.S. Patent No.
5,714,166), liposomy wielopęcherzykowe (Depofoam®, Depotech, San Diego, CA) (U.S. Patent Nr
5,723,147 and 5,766,627). Jednym z rodzajów mikrosfer odpowiednich do kapsułkowania czynników
10
terapeutycznych przeznaczonych do lokalnego wstrzykiwania (np. do tkanki podskórnej) jest
poli(D,L)laktyd, jak to opisano w D. Fletcher, Anesth. Analg. 84:90-94, (1997).Przykładem jest wolno
uwalniająca się postać leku zawierająca terapeutyczną ilość sHASEGP lub jej rozpuszczalną domenę
o aktywności hialuronidazy w zakresie od 1 do 5000 U/ml, która może być stosowana do różnych
celów i do leczenia różnych schorzeń w tym, lecz nie tylko, w postaci kosmetycznej i do leczenie
15
uszkodzeń rdzenia kręgowego.
[0429] Pożądany poziom we krwi można utrzymać przez wlew dożylny aktywnego czynnika
terapeutycznego, jak to ma miejsce w przypadku podawania plazmy. Należy zauważyć, że lekarz
zaangażowany w leczenie wiedziałby jak i kiedy zakończyć, przerwać lub zmniejszyć dawkę
terapeutyczną z powodu toksyczności lub zaburzeń czynności szpiku kostnego, wątroby lub nerki.
20
[0430] Skuteczność i/lub toksyczność polipeptydu sHASEGP i/lub jego inhibitora(ów), występujących
osobno lub w kombinacji z innymi czynnikami, takimi jak czynniki efektywne terapeutycznie, można
oszacować metodami znanymi w stanie techniki (patrz np. O & Apos; Reilly, Investigational New
Drugs 15: 5-13 (1997)).
[0431] 6. ARTYKUŁY DO PRODUKCJI
25
[0432] Polipeptydy sHASEGP lub ich rozpuszczalne domeny o aktywności ludzkiej hialuronidazy lub
kompozycje farmaceutyczne zawierające którykolwiek z wcześniej opisanych czynników mogą być
przygotowane jako zestawy zawierające opakowanie, zawarty w tym opakowaniu związek chemiczny
lub jego odpowiednią pochodną będąca przedmiotem wynalazku, która jest skuteczna w leczeniu
chorób lub zaburzeń rozważanych w niniejszym wynalazku oraz etykietę informującą, że dany
30
związek chemiczny lub jego odpowiednia pochodna przeznaczony jest do leczenia chorób lub
zaburzeń objętych niniejszym wynalazkiem. Opcjonalnie etykieta może opisywać zaburzenia, dla
których opisana terapia jest odpowiednia.
[0433] Artykuły przemysłowe będące przedmiotem niniejszego wynalazku obejmują opakowania.
Opakowania stosowane do pakowania produktów farmaceutycznych są dobrze znane specjalistom w
35
tej dziedzinie (patrz: patenty US Nr 5323907, 5052558 i 5033352). Przykłady opakowań stosowanych
w przemyśle farmaceutycznym obejmują, lecz nie są do nich ograniczone, opakowania konturowe,
butelki, tubki, inhalatory, pompy, worki, fiolki, pojemniki, strzykawki, butelki i każdy innym materiał
opakowaniowy odpowiedni do wybranej formulacji i zaplanowanej metody podawania i leczenia.
Będąca przedmiotem niniejszego wynalazku szeroka gama formulacji związków chemicznych i
40
kompozycji farmaceutycznych rozważana jest tutaj w odniesieniu do jakiegokolwiek zaburzenia, w
którym czynnikiem pośredniczącym lub przyczyną jest infekcja wirusem HCV.
[0434] Przedmiotem niniejszego wynalazku są gotowe zestawy zawierające wspomniane kompozycje
farmaceutyczne i/lub kombinacje wraz z instrukcjami ich podawania. Taki zestaw może jeszcze
zawierać zazwyczaj sterylnie zapakowaną igłę lub strzykawkę do wstrzyknięć kompleksu oraz
zapakowany nasączony alkoholem wacik. Opcjonalnie instrukcje opisują podanie aktywnego czynnika
5
przez klinicystę lub przez pacjenta. Przykładowo, przedmiotem niniejszego wynalazku jest gotowy
zestaw zawierający strzykawkę o małej objętości z zawartością skutecznej ilości sHASEGP lub jej
rozpuszczalnej domeny o aktywności ludzkiej hialuronidazy, w ilości 1 – 5000 U rozpuszczalnej
glikoproteiny, w objętości 5 – 50 µl. Opcjonalnie zestaw taki może zawierać drugą strzykawkę
zawierającą środek wiskoelastyczny. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także gotowy zestaw
10
zawierający strzykawkę o małej objętości z zawartością skutecznej ilości sHASEGP lub
rozpuszczalnej domeny o aktywności ludzkiej hialuronidazy, w ilości 1 – 500 U rozpuszczalnej
glikoproteiny i terapeutyczną ilość drugiego aktywnego składnika, takiego jak lek, mała cząsteczka,
białko lub kwas nukleinowy.
[0435] K. MODELE ZWIERZĘCE
15
[0436] Przedmiotem niniejszego wynalazku są transgeniczne modele zwierzęce oraz zwierzęta
transgeniczne, takie jak myszy i szczury, krowy, kurczaki, świnie, kozy, owce, małpy, włączając w to
goryle i inne ssaki naczelne. Szczególnie, wynalazek dotyczy zwierząt transgenicznych, innych niż
człowiek, do których wprowadzono kwas nukleinowy kodujący polipeptyd sHASEGP lub zwierząt
transgenicznych, w których poprzez zamianę lub modyfikację promotora lub innego regionu
20
endogennego genu modyfikuje się ekspresję tego polipetydu. Takie zwierzę można otrzymać przez
wspomaganie rekombinacji miedzy endogennym kwasem nukleinowym i egzogennym genem dla
sHASEGP, który to gen może być nadekspresjonowany lub którego ekspresja może być zahamowana
w wyniku ekspresji tego genu pod silnym promotorem na drodze rekombinacji homologicznej lub
innego typu rekombinacji.
25
[0437] Zwierzęta transgeniczne można otrzymywać przez wbudowanie kwasu nukleinowego z
wykorzystaniem którejkolwiek z metod wprowadzania, włączając w to, lecz nie ograniczając się do
tych metod, mikroiniekcję, lipofekcję i inne metody wprowadzania genów do rozrodczych lub
somatycznych komórek, takich jak embrionalne komórki macierzyste. Zazwyczaj, taki kwas
nukleinowy jest wprowadzany do komórki, takiej jak embrionalna komórka macierzysta (ES), a kolejne
30
etapy to: iniekcja komórek ES do blastocysty, implantacja blastocysty do macicy matki zastępczej i
następujące po tym narodziny zwierzęcia transgenicznego. Ogólnie wprowadzenie heterologicznego
kwasu nukleinowego do chromosomu zwierzęcia zachodzi w wyniku rekombinacji między
heterologicznym kwasem nukleinowym kodującym sHASEGP i endogennym kwasem nukleinowym.
Taki heterologiczny kwas nukleinowy może być wbudowany do ściśle określonego chromosomu. W
35
niektórych przypadkach można otrzymywać zwierzęta z nokautem. Takie zwierzę może być
początkowo otrzymane w wyniku zainicjowania homologicznej rekombinacji między genem,
kodującym polipeptyd sHASEGP znajdującym się na chromosomie zwierzęcia, a egzogennym genem
kodującym polipeptyd sHASEGP, który jest biologicznie nieaktywny (zazwyczaj w wyniku insercji
sekwencji heterologicznej, np. genu oporności na antybiotyk). W jednym wykonaniu wynalazku, taka
40
homologiczna rekombinacja przeprowadzana jest przez transformowanie embrionalnych komórek
macierzystych (ES) wektorem zawierającym, inaktywowany w wyniku insercji, gen polipeptydu
sHASEGP, w taki sposób, że dochodzi do homologicznej rekombinacji. Następnie komórki ES są
wstrzykiwane do blastocysty, po czym następuje implantacja blastocysty (do macicy) matki zastępczej
i narodziny chimery (zwierzęcia z nokautem) będącego nosicielem nieaktywnego genu kodującego
polipeptyd sHASEGP (patrz: Capecchi, Science 244: 1288-1292 (1989)). Taka chimera może być
hodowana w celu otrzymania nokautowanych homozygotycznych zwierząt potomnych, które
5
następnie mogą zostać wykorzystane do otrzymywania kolejnych nokautowanych zwierząt. Zwierzęta
nokautowane obejmują tu, ale nie są do nich ograniczone, myszy, chomiki, owce, świnie, bydło i ssaki
inne niż człowiek. Przykładem są nokautowane myszy. Otrzymane w powyższy sposób zwierzęta
mogą służyć jako modele specyficznych chorób, takich jak nowotwory wykazujące obniżoną ekspresję
polipeptydu sHASEGP. Nokautowane zwierzęta mogą być stosowane jako modele zwierzęce dla tego
10
typu chorób, dla potrzeb prowadzenia badań przesiewowych lub testów do oceny zdolności
cząsteczek do leczenia lub zapobiegania wspomnianym chorobom lub zaburzeniom.
[0438] Możliwe jest również otrzymywanie innego typu zwierząt transgenicznych, włączając w to te,
które wykazują wysoki poziom ekspresji polipeptydu sHASEGP. Do grupy takich zwierząt zalicza się
zwierzęta nokautowane, otrzymywane metodą knock-in (ukierunkowana insercja sekwencji), u których
15
normalny gen zastąpiony jest swoim wariantem, takim jak mutant, forma nadeksprejonowana lub inna
forma. Przykładowo gen pochodzący z jednego gatunku, taki jak endogenny gen szczurzy, może być
zastąpiony genem innego gatunku, np. genem człowieka. Zwierzęta mogą być również otrzymywane
w wyniku niehomologicznej rekombinacji w innych miejscach na chromosomie. Niniejszy wynalazek
obejmuje
20
również
zwierzęta
posiadające
wiele
zintegrowanych
z
genomem
fragmentów
wprowadzonego DNA.
[0439] Po otrzymaniu zwierzęcia transgenicznego pierwszej generacji, taka chimera może być
hodowana w celu otrzymania kolejnych zwierząt charakteryzujących się nadekspresją, obniżoną
ekspresją lub brakiem ekspresji polipeptydu sHASEGP. Do grupy takich zwierząt należą, lecz grupa ta
nie jest do nich ograniczona, myszy, chomiki, owce, świnie, bydło i ssaki inne niż człowiek. Otrzymane
25
w powyższy sposób zwierzęta mogą służyć jako modele specyficznych chorób, takich jak nowotwory
wykazujące nadekspresję lub brak ekspresji polipeptydu sHASEGP. Przykładowo zwierzęta te mogą
być stosowane jako modele zwierzęce dla tego typu chorób do prowadzenia badań przesiewowych
lub testów dla cząsteczek pod kątem zdolności tych cząsteczek do leczenia lub zapobiegania takim
chorobom lub zaburzeniom. W szczególnym wykonaniu niniejszy wynalazek dostarcza myszy
30
wykazujących nadekspresję lub brak ekspresji polipeptydu sHASEGP.
[0440] Przedstawione poniżej przykłady spełniają jedynie rolę demonstracyjną i w żaden sposób nie
ograniczają zakresu wynalazku.
[0441] L. TERAPEUTYCZNE ZASTOSOWANIA sHASEGP.
[0442] Przez ponad 40 lat rzeźnie stanowiły podstawowe źródło wykorzystywanych do celów
35
klinicznych, preparatów zwierających naturalnie występujące hialuronidazy. Podstawowym źródłem
tego enzymu są wołowe i owcze jądra. Jednakże takie preparaty enzymów są bardzo surowe. Są one
sprzedawane jako preparaty o czystości w granicach 0.5% - 5% i specyficznej aktywności w granicach
30 - 100 000 U/mg. Niski poziom czystości tych preparatów i źródło pochodzenia (rzeźnia) powoduje,
że są one immunogenne i stanowią potencjalne źródło zakażenia chorobą Creutzfeldta-Jacoba oraz
40
innymi patogenami bydła i owiec. Znane są przypadki wystąpienia reakcji anafilaktycznych w
odpowiedzi na podanie preparatów zawierających wołową i owczą hialuronidazę.
[0443] Hialuronidazę pochodzenia wołowego lub bakteryjnego wykorzystywano w leczeniu chorób
związanych z nadmiarem kwasu hialuronowego oraz w celu poprawienia dystrybucji płynów
fizjologicznych i/lub czynników terapeutycznych w ustroju. Na przykład podczas zabiegów chirurgii
oftalmologicznej, hialuronidaza wołowa może być wstrzykiwana okołoopuszkowo, pozaopuszkowo lub
5
pod tylną część torebki Tenona (sub-Tenon’s block) razem ze środkami znieczulającymi. Co więcej,
gdy nie stosowano hialuronidazy wołowej wzrastała liczba pooperacyjnych powikłań (Brown SM et al.
J Cataract Refract Surg. 1999 Sep; 25(9): 1245-9.). Hialuronidaza wołowa używana jest również jako
antidotum w przypadkach miejscowej nekrozy będącej wynikiem okołożylnej iniekcji substancji o
działaniu nekrotycznym, takich jak alkaloidy Vinca (Few, B.J. (1987) Amer. J. Matern. Child Nurs. 12,
10
23-26). Hialuronidaza z jąder wołowych znajduje również zastosowanie w leczeniu torbieli
galaretowatych pochewki ścięgna (Paul et al. J Hand Surg 1997 Apr; 22 (2): 219-21). Może być
również użyta aby ułatwić podskórne podawanie płynów podczas wlewów podskórnych (Berger EY,
Am Geriatr Soc 1984 Mar; 32(3):199-203). Znalazła także zastosowanie jako środek obniżający
ciśnienie wewnątrzgałkowe u pacjentów chorujących na jaskrę oraz pacjentów z kataraktą, którzy
15
przyjmują płyny wiskoelastyczne (patent US Nr. 4820516, opublikowany 11.04.1989).
[0444] Hialuronidazy pochodzenia wołowego lub bakteryjnego wykorzystywano również jako tzw.
„czynniki rozprzestrzeniający” (ang. spreading agent), wzmagające aktywność chemioterapeutyków
i/lub ich docieranie do nowotworów (Schuller et al., 1991, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 32:173,
abstract no. 1034; Czejka et al., 1990, Pharmazie 45:H.9). Połączenie chemioterapii z podawaniem
20
hialuronidazy jest skuteczne w leczeniu różnych typów raka, włączając w to raka pęcherza
moczowego (Horn et al., 1985, J. Surg. Oncol. 28:304-307), raka płaskokomórkowego (Kohno et al.,
94, J. Cancer Res. Oncol. 120:293-297), raka piersi (Beckenlehner et al., 1992, J. Cancer Res. Oncol.
118:591-596), raka przewodu pokarmowego (Scheithauer et al., 1988, Anticancer Res. 8:391-396).
Sama hialuronidaza jako środek leczniczy jest skuteczna w leczeniu raka mózgu (glejak) (zgłoszenie
25
patentowe PCT nr WO88/02261, opublikowane 07.04.1988). Podawanie hialuronidazy pobudza także
reaktywność, pierwotnie opornych na chemioterapię, nowotworów trzustki, żołądka, okrężnicy,
jajników i piersi (Baumgartner et al., 1988, Reg. Cancer Treat. 1:55-58; Zanker et al., 1986, Proc.
Amer. Assoc. Cancer Res. 27:390). Niestety obecność zanieczyszczeń i fakt, że hialuronidazy te nie
pochodzą od człowieka powoduje wywołanie reakcji anafilaktycznej.
30
[0445]
Hialuronidaza
wołowa,
oprócz
swojej
pośredniej
aktywności,
wykazuje
dodatkowo
bezpośrednie działanie przeciwnowotworowe. Zapobiega ona wzrostowi przeszczepionych myszom
guzów (De Maeyer et al., 1992, Int. J. Cancer 51:657-660) i hamuje rozwój nowotworu wywołanego
działaniem czynników rakotwórczych (Pawlowski et al., 1979, Int. J. Cancer 23:105-109; Haberman et
al., 1981, Proceedings of the 17th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology,
35
Washington, D.C., 22:105, abstract no. 415).
[0446] Mając na uwadze znaczenie terapeutyczne hialuronidaz wołowych, szczególnie w
chemioterapii, w połączeniu z konwencjonalnymi chemioterapeutykami lub jako chemioterapeutyk,
istnieje w tym zakresie zapotrzebowanie na zasadniczo oczyszczone preparaty hialuronidazy
pochodzenia ludzkiego. Istnieje także zapotrzebowanie na wydajne, niskonakładowe sposoby
40
wytwarzania hialuronidazy pozwalające dostarczyć na rynek znaczące ilości tego enzymu. Niniejszy
wynalazek rozwiązuje te problemy.
[0447] Kwas hialuronowy jest niezbędnym składnikiem macierzy pozakomórkowej. Występuje w
tkance łącznej ssaków i stanowi główny składnik ciała szklistego oka. W tkance łącznej cząsteczki
wody pochodzące z uwodnionego hialuronianu kształtują przestrzeń między tkankami, tworząc w ten
sposób środowisko sprzyjające przemieszczaniu się komórek i ich proliferacji. Hialuronian odgrywa
5
kluczową rolę w zjawiskach biologicznych związanych z ruchliwością komórki, w tym w zjawiskach
takich jak szybki rozwój, regeneracja, proces naprawczy, embriogeneza, rozwój embrionalny, proces
gojenia się ran, angiogeneza, tumorogeneza (Toole 1991 Cell Biol. Extracell. Matrix, Hay (ed), Plenum
Press, New York, 1384-1386; Bertrand et al.1992 Int. J. Cancer 52:1-6; Knudson et al, 1993 FASEB J.
7:1233-1241). Co więcej, poziom hialuronianu koreluje ze stopniem agresywności nowotworu (Ozello
10
et al. 1960 Cancer Res. 20:600-604; Takeuchi et al. 1976, Cancer Res. 36:2133-2139; Kimata et al.
1983 Cancer Res.43:1347-1354).
[0448] W następstwie uszkodzenia rdzenia kręgowego, astrocyty wytwarzają glejowe blizny,
zawierające siarczany proteoglikanów (CSPG). Cząsteczki CSPG odgrywają istotna rolę w procesie
hamowania wzrostu aksonu (Levine, 1994; Powell et al.). Przykładowo, podczas rozwoju płodowego,
15
CSPG odpychają aksony i hamują adhezję komórek nerwowych. Cząsteczki te odgrywają również
ważną rolę w tworzeniu połączeń między astrocytami (Snow et al., 1990, 1992; Powell and Geller,
1999). Ponadto obserwuje się wzrost ekspresji CSPG w następstwie uszkodzenia centralnego
systemu nerwowego (ang. CNS) (Mckeon et al., 1991; Davies et al., 1997).
[0449] Badania pokazują, że efekty hamujące działanie cząsteczek CSPG dotyczą w zasadzie
20
siarczanu chondroityny (CS) – łańcucha cukrowego glikozoaminoglikanu (GAG) (Snow et al., 1990;
Cole and McCable, 1991; Geisert and Bidanset, 1993). Poparte jest to odkryciem, że dooponowe
podanie chondroitynazy pochodzenia bakteryjnego w istocie pobudza regenerację aksonu. Ponadto,
w wyniku przeprowadzonych doświadczeń elektrofizjologicznych ustalono, że zregenerowane w
wyniku terapii CST aksony odzyskały swoje funkcjonalne połączenia (Bradbury, et al 2002). Ponadto,
25
poza bezpośrednimi hamującymi efektami działania cząsteczek CSPG, potrafią one również
oddziaływać z cząsteczkami adhezyjnymi komórek lub czynnikami neurotrofowymi wpływając przez to
na wzrost aksonu (Roberts et al., 1988; Ruoslahti and Yamaguchi, 1991; Milev et al., 1994). Dlatego
też rekombinowane ssacze hialuronidazy są użyteczne w znoszeniu hamującego efektu działania
cząsteczek CSPG w bliźnie neurogleju i pobudzaniu regenaracji aksonu po przebytym urazie.
30
[0450] W zależności od przypadku, różna będzie ilość glikoprotein sHASEGP wymagana do wydajnej
degradacji cząsteczek CSPG w bliźnie neurogleju. W niektórych przypadkach, aby usunąć cząsteczki
CSPG w bliźnie, wymagane będzie powtarzające się dooponowe podawanie sHASEGP w ilości 10 –
5000 U. W innych przypadkach korzystne będzie ciągłe dostarczanie sHASEGP przez zastosowanie
formulacji o przedłużonym uwalnianiu. Alternatywnie, w celu zwiększenia efektu usuwania cząsteczek
35
CSPG, skuteczne może być podanie wektorów, stosowanych w terapii genowej, kodujących
sHASEGP.
[0451] Glikoproteiny sHASEGP mogą również znaleźć zastosowanie w leczeniu przepukliny krążka
międzykręgowego metodą nazywaną chemonukleolizą. Chondroitynaza ABC, enzym trawiący
podobne substraty co sHASEGP, może indukować redukcję ciśnienia wewnątrzkrążkowego w odcinku
40
lędźwiowym kręgosłupa (Sasaki et al., 2001, Ishikawa et al., 1999). Wyróżnia się trzy typy urazów
krążków. Wysunięty krążek międzykręgowy (protruzja) to taki, którego ciągłość jest nienaruszona, ale
dochodzi do wytworzenia wybrzuszenia. W przypadku ekstruzji dysku jądro miażdżyste (NP) przerywa
ciągłość pierścienia włóknistego, pozostając jednak w krążku. W przypadku sekwestracji dysku,
kawałek NP wydostaje się na zewnątrz dysku do wnętrza kanału kręgowego. Chemonukleoliza jest
skuteczna w przypadku protruzji i ekstruzji dysku, ale nie w przypadku sekwestracji dysku. W USA
chemonukleoliza jest dopuszczona do stosowania jedynie w przypadku schorzeń lędźwiowego
5
odcinka kręgosłupa. W innych krajach jest stosowana w celu skutecznego leczenia przepuklin
szyjnego (górnego) odcinka kręgosłupa. Chemonukleoliza jest tym samym zachowawczą metodą
będącą alternatywą dla operacji krążka w przypadkach, kiedy wskazana jest redukcja ciśnienia
wewnątrzkrążkowego.
[0452] W związku z tym, że retikulum endoplazmatyczne lub komórki wątroby mogą wiązać i
10
internalizować krążące glikoproteiny zawierające w swojej strukturze specyficzne cukry, to określony
skład i struktura łańcucha(ów) cukrowych tych glikoprotein może bezpośrednio wpływać na okres
półtrwania tych glikoprotein w surowicy. Hepatocyty posiadają na swojej powierzchni receptory, które
rozpoznają łańcuchy glikanów zawierające terminalne (tj. znajdujące się na najbardziej oddalonym
końcu(ach) względem polipeptydu) reszty Gal. Natomiast makrofagi posiadają receptory rozpoznające
15
terminalne reszty Man lub GlcNAc, a hepatocyty i limfocyty – receptory wiążące wyeksponowane
reszty fukozy. Nie zidentyfikowano natomiast receptorów specyficznych dla kwasów sjalowych. Mimo
to i w pewnym stopniu zależnie od przestrzennej struktury glikanów, regułą jest, że im większa jest
liczba wyeksponowanych reszt cukrowych rozpoznawanych przez receptory powierzchniowe komórek
wątroby i retikulum endoplazmatycznego, tym szybciej glikoproteiny będą usuwane z surowicy. Z
20
powodu braku receptorów specyficznie rozpoznających kwasy sjalowe, glikany, zawierające łańcuchy
boczne zakończone lub zwieńczone kwasem sjalowym, nie indukują procesu usuwania białka, do
którego są przyłączone.
[0453] Obecność i natura glikanu(ów) na glikoproteinie może mieć wpływ nie tylko na rozpoznanie
glikoproteiny przez receptory specyficzne dla cukrów, które obecne są w wątrobie i retikulum
25
endoplazmatycznym, ale również na jej istotne biochemiczne właściwości. Usuniecie glikanów z
glikoproteiny najczęściej powoduje obniżenie jej rozpuszczalności, ale również wzrost podatności na
degradację proteolityczną, będący wynikiem destabilizacji prawidłowego fałdowania białka i/lub
odkrycia miejsc wrażliwych na działanie proteaz. Z podobnych powodów, stan glikozylacji białka może
wpływać na rozpoznanie białka przez układ odpornościowy.
30
[0454] Glikoproteiny sHASEGP mogą być stosowane do usuwania komórek wzgórka jajonośnego
otaczającego oocyt przed zamrożeniem komórki jajowej lub przed zastosowaniem innych technik
zapłodnienia in vitro, takich jak śródcytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika (ICSI). Hialuronidaza
może zostać dodana do zebranych oocytów w buforowanym roztworze soli o stężeniu 10 – 200 U/ml.
Oocyty oddzielane są od usuniętych komórek wzgórka jajonośnego przez odsysanie i kilkakrotnie
35
przemywane pożywką pozbawioną hialuronidazy. Następnie oocyty mogą być zamrażane lub
wykorzystane w technikach zapłodnienia in vitro.
[0455] Glikoproteiny sHASEGP znajdują również zastosowanie w poprawianiu skuteczności wnikania
chemioterapeutyków do litych guzów. Glikoproteiny te mogą być wstrzykiwane doguzowo razem z
czynnikami przeciwnowotworowymi lub dożylnie, w przypadku rozsianych lub trudnodostępnych
40
nowotworów. Takim czynnikiem przeciwnowotworowym może być chemioterapeutyk, przeciwciało,
peptyd lub wektor stosowany w terapii genowej, wirus lub DNA. Dodatkowo, glikoproteiny sHASEGP
mogą być stosowane do rozluźnienia połączeń międzykomórkowych w masie guza, co umożliwia
podniesienie wrażliwości lekoopornych komórek na działanie chemoterapeutyków (St Croix et al
Cancer Lett 1998 Sep 11; 131 (1): 35-44). Glikoproteiny sHASEGP znajdują również zastosowanie w
ułatwianiu
dostarczania
glikozoaminoglikanów
5
takich
preparatów
jak,
biologicznych,
przeciwciała
powodujących
monoklonalne,
cytokiny
odkładanie
i
inne
się
leki
przeciwnowotworowe. Wiele nowotworów indukuje delecje genów zaangażowanych w katabolizm
glikozoaminoglikanów, co powoduje miejscową akumulację tych cząsteczek, która uniemożliwia
czynnikom przeciwnowotworowych oraz składnikom układu odpornościowego przenikanie do masy
nowotworu.
[0456] sHASEGP mogą być również stosowane w celu zwiększenia wrażliwości nowotworu opornego
10
na klasyczne metody chemioterapii. W jednym wykonaniu wynalazku, sHASEGP jest podawana
pacjentowi z nowotworem związanym z defektem LUKA-1, w ilości pozwalającej na zwiększenie
dyfuzji w obrębie zmiany nowotworowej (np. po to, aby zwiększyć obieg i/lub nagromadzenie się
chemioterapeutyków wewnątrz oraz wokół zmiany nowotworowej), zahamowanie ruchliwości
komórki(ek) nowotworowych (np. przez degradację HA), i/lub na obniżenie progu wrażliwości
15
komórki(ek) nowotworowych na apoptozę (np. przez wprowadzenie komórki(ek) nowotworowych w
stan anoikis, tzn. w stan który czyni komórkę(i) nowotworowe bardziej podatne na działanie
chemioterapeutyków lub innych czynników, które mogą doprowadzić do śmierci komórki, szczególnie
ułatwić zaprogramowaną śmierć komórki w stanie anoikis. W rozumieniu niniejszego dokumentu
określenie „chemioterapeutyki” obejmuje wszystkie, zarówno syntetyczne (np. cisplatyna), jak i
20
naturalnie występujące cząsteczki (np. czynnik nekrozy nowotworu, (IF)), które ułatwiają
zahamowanie wzrostu komórki nowotworowej i korzystnie doprowadzają do śmierci komórki
nowotworowej, a bardzo korzystnie selektywnie doprowadzają do śmierci komórki nowotworowej.
[0457] Przedmiotem szczególnego zainteresowania jest zastosowanie sHASEGP w leczeniu
przerzutujących i nieprzerzutujących nowotworów, szczególnie nowotworów przerzutujących,
25
charakteryzujących się obniżonym lub niewykrywalnym poziomem aktywności hialuronidazy w
odniesieniu do komórek nienowotworowych (komórek normalnych). Glikoproteina sHASEGP może
być stosowana jako chemioterapeutyk (osobno lub w kombinacji z innymi chemioterapeutykami) w
leczeniu któregokolwiek z nowotworów, szczególnie w leczeniu nowotworów inwazyjnych.
Przykładowo, sHASEGP może być stosowana w leczeniu drobnokomórkowego raka płuc, raka
30
płaskonabłonkowego płuc, a także raka piersi, jajników, głowy i szyi lub jakiegokolwiek raka
związanego z zahamowanym poziomem hialuronidazy lub z defektem genu LUCA-1 (hpHAza) (np. z
takim defektem genu LUCA-1, który nie zapewnia ekspresji odpowiedniego poziomu hpHAazy lub
koduje wadliwą hpHAazę, która nie zapewnia odpowiedniego poziomu aktywności hialuronidazy) lub z
innymi defektami związanymi z obniżonym katabolizmem hialuronianu. Ponieważ degradacja z
35
użyciem sHASEGP nie wymaga współudziału komórek, korzystne jest zastosowanie sHASEGP w
leczeniu nowotworów złośliwych, związanych z niedoborem w katabolizmie HA.
[0458] Specyficzne dawkowanie, właściwe dla zastosowania leku, może być łatwo określone przez
specjalistę z danej dziedziny przy uwzględnieniu czynników omówionych powyżej (patrz np: Harrison’s
Principles of Internal Medicine, 11th Ed., 1987). Dodatkowo, możliwe jest ekstrapolowanie właściwego
40
dawkowania u ludzi w oparciu o pomiar enzymatycznej aktywności sHASEGP in vitro i/lub w oparciu o
wiedzę na temat skutecznych dawek stosowanych w badaniach na zwierzętach. Przykładowo, 70-300
TRU hialuronidazy jest skuteczna w redukcji masy guza nowotworowego u myszy SCID. W oparciu o
te dane, odpowiednia dawka hialuronidazy dla człowieka, o wadze około 70 kg, wynosiłaby około
250.000 – 1.200.000 TRU. Ilość sHASEGP podawana ludziom zazwyczaj mieści się w zakresie 1 – 5
000 000 TRU, korzystnie w zakresie 100 000 – 1 500 000 TRU, zazwyczaj między 250 000 i 1 200
000 TRU i odpowiada średniej przepisywanej dawce w wysokości 725 000 TRU.
5
[0459] W jednym wykonaniu wynalazku, preparat sHASEGP sporządzany jest jako roztwór o stężeniu
około 150 000 TRU/ml w 0.15 M soli fizjologicznej. Taki preparat jest następnie wstrzykiwany dożylnie
w dawce 150 000 TRU/kg masy ciała pacjenta. Alternatywnie, formulacja enzymu może być
wstrzykiwana podskórnie, aby umożliwić hialuronidazie penetrację w okolice zmiany nowotworowej. W
korzystnym wykonaniu wynalazku, sHASEGP są wstrzykiwane okołonowotworowo lub doguzowo. W
10
innym korzystnym wykonaniu wynalazku, preparat sHASEGP sporządzany jest w formie liposomów i
podawany zarówno dożylnie (przez wstrzyknięcie), doguzowo lub w okolice komórek nowotworowych
wykazujących defekt genu LUCA-1 (hpHAza). Dożylne wstrzyknięcie sHASEGP skutkuje dotarciem
sHASEGP do miejsca objętego zmianami nowotworowymi. Ponadto, w związku z tym, że terminalne
kwasy sjalowe zapobiegają usuwaniu sHASEGP z krążenia za pośrednictwem retikulum
15
endoplazmatycznego, wysoko usjalowana sHASEGP jest korzystna w przypadku podania
pozajelitowego. Porównanie wysoko usjalowanej sHASEGP z nieusjalowaną wołową i owczą
hialuronidazą wykazało znacznie korzystniejszą farmakokinetykę tej glikoproteiny.
[0460] WSPOMAGANIE TERAPII GENOWEJ
[0461] Skuteczność większości nośników in vivo, stosowanych do wprowadzania genów nie
20
odpowiada skuteczności obserwowanej in vitro. Glikozoaminoglikany mogą utrudniać transfer i dyfuzję
DNA oraz
wektorów wirusowych do wielu typów komórek. Znaczna ilość takiej substancji
pochodzącej z zewnątrzkomórkowej macierzy potrafi znacząco utrudnić wspomniane procesy.
Dubensky i wsp. (Proc Natl Acad Sci U S A 1984 Dec; 81 (23):7529-33) wykazali, że hialuronidaza w
kombinacji z kolagenazą może ułatwić transdukcję DNA in vivo. Pokazano również, że
25
adenosatelitarny wirus może być efektywnie stosowany w terapii genowej wspomaganej hialuronidazą
(Favre et al, Gene Ther 2000 Aug;7(16): 1417-20).
[0462] W niniejszym wynalazku wykazaliśmy, że sHASEGP otwiera kanały zewnątrzkomórkowej
macierzy o określonym rozmiarze. Kanały te nie wspomagają dyfuzji cząsteczek o średnicy większej
niż około 200 - 500 nm. Zastosowanie sHASEGP ułatwia dyfuzję mniejszych cząsteczek, takich jak
30
retrowirusy, adenowirusy, adenosatelitarne wirusy i kompleksy DNA.
[0463] Alternatywnie, aby ułatwić replikację i rozprzestrzenianie się wirusów w tkankach docelowych,
mogą być one na przykład wyposażone w gen kodujący sHASEGP. Taką tkanką docelową może być
tkanka nowotworowa, wewnątrz której wspomniany wirus zdolny jest do selektywnej replikacji.
Wirusem takim może być również wirus nie powodujący lizy komórek docelowych, który ulega
35
selektywnej pod określonym promotorem. W momencie replikacji wirusa, koekspresja sHASEGP z
genami wirusowymi będzie ułatwiała rozprzestrzenianie się wirusa in vivo.
[0464] Alternatywnie kwas nukleinowy, będący przedmiotem zainteresowania, i sHASEGP, mogą być
zastosowane jednocześnie lub sekwencyjnie lub w sposób rozłożony w czasie. Określenie
„jednocześnie” odnosi się do podania jednoczesnego. W takim przypadku, oba niezbędne składniki
40
mogą być zmieszane przed podaniem w celu otrzymania kompozycji farmaceutycznej lub mogą
zostać podane do komórki lub organizmu gospodarza w tym samym czasie. Możliwe jest także
podanie tych substancji kolejno, jedna po drugiej, niezależnie od tego, który ze składników, będących
przedmiotem wynalazku, jest podawany jako pierwszy. Ostatecznie, możliwe jest zastosowanie
schematu podania, z dawkami rozłożonymi w czasie lub podawanymi w sposób, w którym
dawkowanie jest wstrzymywane i wznawiane w odstępach czasowych, które mogą ale nie muszą być
regularne. Podkreśla się tu, że drogi i miejsca podania tych dwóch składników mogą być różne. Tak
5
więc zgodnie z jednym szczególnie korzystnym wariantem wykonania, przedmiotem wynalazku jest
sHASEGP podawana przed kwasem nukleinowym, w taki sposób, że drogi podania obu składników
korzystnie są podobne. Odstęp czasowy pomiędzy wstrzyknięciem nie jest krytyczny i może zostać
określony przez specjalistę w danej dziedzinie. Można zalecić odstęp czasowy od 10 min do 72 godz.,
korzystnie od 30 min. do 48 godz., korzystniej od 1 do 24 godz. i bardzo korzystnie od 1 do 6 godz.
10
[0465] Dodatkowo, kombinacja będąca przedmiotem wynalazku, może być połączona z jedną lub
wieloma cząsteczkami, w przypadku których zakłada się, że będą one poprawiały dostarczanie
danego kwasu nukleinowego. Takimi cząsteczkami mogą być cząsteczki działające ochronnie na
kwas nukleinowy (przez określenie „ochronnie” rozumie się ochronę przed degradacją w komórce),
cząsteczki poprawiające penetrację kwasu nukleinowego lub jego ekspresję w komórce gospodarza
15
(fuzogeniczny peptyd, sygnał lokalizacji jądrowej, itp.), cząsteczki umożliwiające wniknięcie do
jednego określonego typu komórki (ligand lub przeciwciało rozpoznające białka powierzchniowe
komórki itp.), cząsteczki przedłużające efekt terapeutyczny (czynniki immunosupresyjne itp.). Taka
kombinacja może być również połączona z czynnikami, które ułatwiają transfekcję (białka itp.).
[0466] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem kompozycja farmaceutyczna może być przygotowana na
20
potrzeby miejscowego lub pozajelitowego podania lub podania drogą pokarmową. W szczególności
wymienić należy drogi podania, takie jak podanie dożołądkowe, podskórne, dosercowe, dożylne,
dootrzewnowe, wewnątrzmaziówkowe, doguzowe, dopłucne, donosowe i dotchawicze, a szczególnie
podanie domięśniowe. Podanie kompozycji farmaceutycznej może być wykonane z zastosowaniem
jakiejkolwiek techniki znanej specjaliście (wstrzyknięcie, droga doustna, areozol, wkroplenie itp.), w
25
postaci pojedynczej dawki lub dawki jednokrotnie albo kilkukrotnie powtórzonej w określonych
odstępach czasowych. Droga podania może być dostosowana do genu, który ma być dostarczony i
stanowi przedmiot zainteresowania oraz rodzaju leczonej choroby. Formulacja może obejmować
akceptowane w farmacji nośniki (substancje pomocnicze, adiuwanty itp.). Substancja powodująca
dezorganizację zewnątrzkomórkowej macierzy oraz kwas nukleinowy będący przedmiotem
30
zainteresowania korzystnie rozpuszczane są w buforze farmaceutycznie dopuszczalnym, który to
bufor może być hipertoniczny, hipotoniczny lub izotoniczny. Rozpatrywane są różne bufory. Te, które
można by wymienić jako przykłady, to roztwór soli fizjologicznej (0.9% NaCl), niefizjologiczny roztwór
soli (1.8% NaCl), roztwór Hepes-Ringer, roztwór Ringera z dodatkiem mleczanu, bufor sporządzony
na bazie roztworu Tris-HCl (10 mM Tris-HCl, pH 7.5 -8, 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 - 8, 1
35
mM MgCl2 ), bufor fosforanowy (bufor Krebsa: monohydrat fosforanu), roztwór cukru (np. glukozy,
sacharozy, trehalozy itp.) lub sama woda.
[0467] WLEW PODSKÓRNY
[0468] Wlew podskórny czy też podskórna infuzja płynów, jest użyteczną i łatwą techniką nawadniania
odpowiednią dla lekko i umiarkowanie odwodnionych pacjentów, a szczególnie dla osób starszych.
40
Metodę tę uznaje się za bezpieczną i nie powodującą żadnych poważnych komplikacji. Najczęstszym
działaniem ubocznym jest lekki podskórny obrzęk, który może być leczony masażem miejscowym lub
przy pomocy środka moczopędnego działającego ogólnoustrojowo. Taki płyn o działaniu
terapeutycznym można podawać w objętości około 3 l w okresie 24 godz., w dwa odrębne miejsca.
Typowymi miejscami wlewu jest klatka piersiowa, brzuch, udo i górna część ramienia. Korzystnie,
roztworem jest normalna sól fizjologiczna. Jednakże inne roztwory soli fizjologicznej takie jak
półnormalna sól fizjologiczna, roztwór glukozy w soli fizjologicznej lub 5% glukoza również mogą być
5
stosowane. Jeśli zachodzi potrzeba do takiego roztworu może być dodanych chlorek sodu.
Dodatkowo, podobnymi drogami podania mogą być dostarczane inne leki. Ludzka sHASEGP może
być dodana w celu wspomagania absorpcji płynu i zwiększania całkowitej szybkości podania.
Stosowanie ludzkiej sHASEGP w przypadku powtarzających się wlewów podskórnych jest bardziej
korzystne w porównaniu z enzymami pochodzenia zwierzęcego. Powodem tego jest to, że ludzka
10
sHASEGP, w przeciwieństwie do enzymu wołowego, najprawdopodobniej nie jest immunogenna,
może być podawana w warunkach domowych przez członków rodziny lub pielęgniarkę, a technika
podania znana jest każdemu lekarzowi rodzinnemu.
[0469] W przypadku chorych leczonych ambulatoryjnie, miejsca wlewu podskórnego obejmują brzuch,
górną część klatki piersiowej, miejsce powyżej piersi, miejsce ponad przestrzenią międzyżebrową i
15
okolice łopatki. U pacjentów obłożnie chorych, korzystne miejsca podania to uda, brzuch i zewnętrzna
strona górnej części ramienia. Igła i wężyki powinny być zmieniane po okresie jednego do dwóch dni,
chociaż zestaw infuzyjny pozostawiano w miejscu wlewu na dłuższy okres bez żadnych komplikacji.
Możliwe jest także trzykrotne podanie podskórne, w ciągu jednego dnia, jednej dużej dawki sHASEGP
(150 U), przed pierwszym porannym wlewem, w objętości 500 ml przez okres od 1 do 2 godz.
20
[0470] UŁATWIANIE TERAPEUTYCZNYCH INIEKCJI
[0471] Wiele cząsteczek wstrzykiwanych transdermalnie dociera do krążenia wolno lub z bardzo niską
wydajnością. Na farmakokinetykę i farmakodynamikę cząsteczek wstrzykiwanych podskórnie (SC) lub
domięśniowo (IM) wpływa kilka czynników. Generalnie, większe cząsteczki nie wspomagane
aktywnym transportem docierają do krążenia wolniej i mniej wydajnie. Podskórna biodostępność jest
25
wyznaczana przez wyliczenie stosunku pola powierzchni pod krzywą otrzymaną dla podania CS do
pola powierzchni pod krzywą dla podania dożylnego (AUCSC/AUCdożylne). Drugim czynnikiem jest
ładunek i powinowactwo do cząsteczek macierzy zewnątrzkomórkowej, które odgrywają kluczową role
w podskórnej sekwestracji cząsteczek. Jeśli takie składniki zostaną zdegradowane miejscowo, nigdy
nie dotrą do pożądanego celu i w związku z tym będą wykazywały obniżoną całkowitą biodostępność
30
systemową względem organów docelowych.
[0472] Ponieważ duże cząsteczki są zazwyczaj podawane dożylnie, lekarstwo jest od razu dostępne
w krwiobiegu. Zaletą byłoby jednak, aby lekarstwo mogło być podawane podskórnie, domięśniowo lub
śródskórnie, ponieważ podanie takimi metodami jest o wiele łatwiejsze do wykonania przez pacjenta.
Ma to znaczenie szczególnie wtedy, gdy takie lekarstwo musi być przyjmowane regularnie przez całe
35
życie, a leczenie rozpoczyna się dość wcześnie, kiedy pacjent jest dzieckiem. Jednakże lekarstwo o
dużych rozmiarach lub labilna cząsteczka, taka jak czynnik krzepnięcia VIII o masie 170 – 300 kDa,
charakteryzują się zazwyczaj bardzo niską biodostępnością w przypadku podań podskórnych,
domięśniowych lub śródskórnych, kiedy to wchłanianie jest niewystarczające a degradacja znacząca.
[0473] Z punktu widzenia medycyny ratunkowej, poza potrzebą zwiększenia biodostępności wielu
40
podskórnie podawanych preparatów biologicznych, bardzo istotna jest także ich szybsza
farmakokinetyka. Nieudana próba uzyskania dostępu żylnego, w przypadku wielu pacjentów może
uniemożliwić, zastosowanie innego szybko działającego leku podawanego systemowo. W niektórych
przypadkach, po tym jak nie udaje się uzyskać dostępu żylnego, stosuje się zastrzyk podskórny, co
dodatkowo prowadzi do opóźnienia w dotarciu (leku) do organów docelowych. W związku z tym
zamiast ryzykować stratą czasu potrzebnego do uzyskania dostępu dożylnego, korzystne z punktu
widzenia pierwszej pomocy byłoby metody podania zapewniające szybszą dostępność leków.
5
Przykłady cząsteczek, które mogą być dostarczane podskórnie jak również dożylnie obejmują
epinefrynę, atropinę, Narcan, lignokainę i dekstrozę.
[0474] Wiele cząsteczek wstrzykiwanych transdermalnie dociera do krążenia wolno lub z bardzo niską
wydajnością. Na farmakokinetykę i farmakodynamikę cząsteczek wstrzykiwanych podskórnie (SC) lub
domięśniowo (IM) wpływa kilka czynników. Generalnie, większe cząsteczki nie wspomagane
10
aktywnym transportem docierają do krążenia wolniej i mniej wydajnie. Podskórna biodostępność jest
wyznaczana przez wyliczenie stosunku pola powierzchni pod krzywą otrzymaną dla podania CS do
pola powierzchni pod krzywą dla podania dożylnego (AUCSC/AUCdożylne). Drugim czynnikiem jest
ładunek i powinowactwo do cząsteczek macierzy, które odgrywają kluczową role w podskórnej
sekwestracji cząsteczek. Jeśli takie składniki zostaną miejscowo zdegradowane, nigdy nie dotrą do
15
pożądanego celu i w związku z tym będą wykazywały obniżoną całkowitą biodostepność systemową
względem organów docelowych.
[0475] Ponieważ duże cząsteczki są zazwyczaj podawane dożylnie, lekarstwo jest od razu dostępne
w krwiobiegu. Zaletą byłoby jednak, aby lekarstwo mogło być podawane podskórnie, domięśniowo lub
śródskórnie, ponieważ podanie takimi metodami jest o wiele łatwiejsze do wykonania przez pacjenta.
20
Ma to znaczenie szczególnie wtedy, gdy takie lekarstwo musi być przyjmowane regularnie przez całe
życie, a leczenie rozpoczyna się dość wcześnie, kiedy pacjent jest dzieckiem. Jednakże lekarstwo o
dużych rozmiarach lub labilna cząsteczka, taka jak czynnik krzepnięcia VIII o masie 170 – 300 kDa,
charakteryzują się zazwyczaj bardzo niską biodostępnością w przypadku podań podskórnych,
domięśniowych lub śródskórnych, kiedy to wchłanianie jest niewystarczające a degradacja znacząca.
25
[0476] Z punktu widzenia medycyny ratunkowej, poza potrzebą zwiększenia biodostępności wielu
podskórnie podawanych preparatów biologicznych, bardzo istotna jest także ich szybsza
farmakokinetyka. Czas potrzebny do uzyskania dostępu dożylnego u wielu pacjentów może wykluczyć
zastosowanie innego szybko działającego leku podawanego systemowo. W niektórych przypadkach,
po tym jak nie udaje się uzyskać dostępu żylnego, stosuje się zastrzyk podskórny, co dodatkowo
30
prowadzi do opóźnienia w dotarciu (leku) do organów docelowych. W związku z tym zamiast
ryzykować stratą czasu potrzebnego do uzyskania dostępu dożylnego, korzystne z punktu widzenia
pierwszej pomocy byłoby metody podania zapewniające szybszą dostępność leków. Przykłady
cząsteczek, które mogą być dostarczane podskórnie jak również dożylnie obejmują epinefrynę,
atropinę, Narcan, lignokainę i dekstrozę.
35
[0477] Dodatkową korzyścią wynikającą z niniejszego wynalazku jest możliwość podskórnego (SC)
lub domięśniowego (IM) dostarczania równoważnych lub większych objętości w sposób nie zadający
bólu i nie powodujący stanów chorobowych związanych z ciśnieniem i objętością roztworu w miejscu
wstrzyknięcia.
[0478] KRWOTOK DO CIAŁA SZKLISTEGO OKA
40
[0479] W celu zminimalizowania prawdopodobieństwa dalszego odwarstwiania lub przedarcia
siatkówki podczas wykonywania witrektomii, we wcześniejszym patencie US Nr 5292509 (Hageman)
proponowano wstrzykiwać do ciała szklistego określone wolne od proteaz glikozoaminoglikanazy, po
to, aby przed usunięciem ciała szklistego spowodować jego oddzielenie lub „oderwanie” się od
siatkówki. Takie „oderwanie” lub oddzielenie się ciała szklistego oka pozwala zminimalizować
prawdopodobieństwo dalszego przedarcia lub odwarstwienia siatkówki podczas usuwania ciała
szklistego. Przykładami takich specyficznych, wolnych od proteaz, glikozoaminoglikanaz, które można
5
zastosować do spowodowania „oderwania” się ciała szklistego wydają się być chondroitynaza ABC,
chondroitynaza AC, chondroitynaza B, sulfatazy 4-siarczanu chondroityny , sulfataza 6-siarczanu
chondroityny, hialuronidaza i β-glukuronidaza.
[0480] Mimo iż wiadomo jest, że hialuronidazy nadają się do użytku w różnych zastosowaniach w
okulistyce, włączając w to zastosowanie wspomagające witrektomię opisane w patencie US nr
10
5292509 (Hageman), wyniki opublikowanych badań pokazały, że hialuronidaza sama w sobie może
być toksyczna dla siatkówki i/lub innych struktur anatomicznych oka. Patrz: The Safety of Intravitreal
Hyaluronidase; Gottleib, J. L.; Antoszyk, A. N., Hatchell, D. L. and Soloupis, P., Invest Ophthalmol Vis
Sci 31:11, 2345-52 (1990). Ponadto, stosowanie pochodzących z rzeźni, zanieczyszczonych
preparatów hialuronidazy może prowadzić do rozwoju zapalenia błony naczyniowej oka lub zapalenia
15
oka. Zastosowanie ludzkiej sHASEGP jest tym samym korzystne zarówno z powodu jej większej
mocy, czystości i tego, że taki enzym nie jest pochodzenia zwierzęcego, co w odwrotnym przypadku
może prowadzić do wywołania immunogennych reakcji i wytworzenia przeciwciał neutralizujących
aktywność następnych dawek tej glikoproteiny. W innym wykonaniu wynalazku, do oka może być
wstrzykiwana pegilowana forma sHASEGP. Taka pegilowana sHASEGP nie jest tak szybko usuwana
20
z ciała szklistego, gdzie przez dłuższy okres czasu zachowuje swoja aktywność.
[0481] Toksyczny dla oka efekt działania niektórych preparatów hialuronidaz został potwierdzony
przez badaczy, którzy zaproponowali użycie takich preparatów jako toksycznych czynników
drażniących do wywoływania eksperymentalnego tworzenie się nowych naczyń krwionośnych oka w
modelach zwierzęcych do badania toksyczności (patrz: An Experimental Model of Preretinal
25
Neovascularization in the Rabbit; Antoszyk, A. N., Gottleib, J. L., Casey, R C., Hatchell, D. L. and
Machemer, R., Invest Ophthalmol Vis Sci 32:1, 46-51 (1991). Jeśli chodzi o zabiegi wewnątrzgałkowe,
korzystne jest tutaj zastosowanie wysoko czyszczonej sHASEGP, wolnej od zanieczyszczeń
zawierających rtęć lub związki pochodzenia wołowego lub bakteryjnego. Ponadto ze względu na sam
brak wołowych patogenów i obniżone ryzyko immunogenności, rekombinowana ludzka sHASEGP jest
30
bardziej korzystna w porównaniu z preparatami pochodzącymi z rzeźni. Przewiduje się, że najbardziej
korzystna jest pegilowana sHASEGP.
[0482] Przedmiotem niniejszego wynalazku jest metoda enzymatyczna z zastosowaniem sHASEGP
do leczenia zaburzeń oftalmologicznych u ssaków. W jednym wariancie wykonania, niniejszy
wynalazek obejmuje wspomnianą sHASEGP, która jest pegilowana, w celu wydłużenia czasu jej
35
przebywania w ciele szklistym i uniemożliwienia jej miejscowego wchłaniania. Efekt zapobiegania
procesowi nowotworzenia naczyń krwionośnych i zwiększonej szybkości usuwania z ciała szklistego
cząstek toksycznych dla siatkówki, osiągany jest przez podawanie hialuronidazy w ilości
wystarczającej do upłynnienia ciała szklistego bez powodowania toksycznych uszkodzeń leczonego
oka. Upłynnienie ciała szklistego zwiększa szybkość wymiany płynów w komorze wypełnionej ciałem
40
szklistym. Taki wzrost szybkości wymiany płynów prowadzi do usuwania tych cząstek oraz stanów
powodujących uszkodzenie oka i siatkówki.
[0483] KOSMETYCZNE ZASTOSOWANIA sHASEGP
[0484]
Wiadomo,
że
hialuronidazy
wywołują
efekt
depolimeryzacji
długich
łańcuchów
mukopolisacharydu, substancji podstawowej odpowiedzialnej za zatrzymanie związanych cząsteczek
wody i spowolnienie, poprzez zamykanie naczyń włosowatych, dyfuzji płynów organicznych
5
usuwających produkty uboczne metabolizmu.
Takie zatrzymanie wody i produktów ubocznych metabolizmu w połączeniu z tłuszczami
wypełniającymi komórki tłuszczowe stanowi klasyczny obrzęk skóry określany jako tzw. „świńska
skóra” lub „skórka pomarańczowa”. W takim przypadku depolimeryzacja będzie wiec prowadzić do
pocięcia długich łańcuchów mukopolisacharydu na mniejsze fragmenty, prowadząc tym samym do
10
eliminacji wody, produktów ubocznych metabolizmu, powrotu do normy krążenia żylnego i
limfatycznego oraz zaniku obrzęku miejscowego.
[0485] W związku z tym korzystne jest zastosowanie sHASEGP, poprzez jej podskórne podanie, do
usuwania glikozoaminoglikanów zaangażowanych w nagromadzenie się tzw. cellulitis i pobudzenia
krążenia w układzie limfatycznym. Ze względu na to, że sHASEGP zdolna jest do usuwania
15
wspomnianych glikozoaminoglikanów i charakteryzuje się brakiem immunogennych składników białek
pochodzenia zwierzęcego (rzeźnie), wysoką czystością i prawdopodobnym brakiem immunogenności,
korzystne jest zastosowanie ludzkiej sHASEGP do leczenia cellulitis. W celu pobudzenia stałej
degradacji glikozoaminoglikanów i zapobiegania ich ponownemu nagromadzaniu, sHASEGP może
być podawana podskórne w postaci zastrzyków, transdermalnie w formie maści lub kremów lub w
20
postaci dających się wstrzykiwać formulacji o opóźnionym uwalnianiu.
[0486] TRANSPLANTACJA ORGANÓW
[0487] Hialuronian wywołuje kilka biologicznych efektów, które po części wynikają z rozmiarów tej
cząsteczki (West, D.C., Kumar, S. Exp.Cell. Res. 183, 179-196, 1989). Zawartość hialuronianu w
organie wzrasta w różnych stanach zapalnych. Dlatego też wykazano podwyższone stężenie
25
hialuronianu w tkankach różnych organów objętych stanem zapalnym i uszkodzeniami będącymi
efektem działania układu odpornościowego, takimi jak zapalenie zębodołu lub zapalenie pęcherzyków
płucnych (Nettelbladt et al., Am Rev Resp Dis 1989; 139:759-762) i zawał mięśnia sercowego
(Waldenstrom et al., J Clin Invest 1991; 88(5): 1622-1628). Inne przykłady to odrzucenie przeszczepu
allogenicznego nerki (Ha’llgren et al., J Exp Med 1990a; 171: 2063-2076; Wells et al., Transplantation
30
1990;50: 240-243), przeszczepu jelita cienkiego (Wallander et al., Transplant Int 1993; 6: 133-137) lub
przeszczepu serca (Hällgren et al., J Clin Invest1990b;85:668-673) lub zapalenie mięśnia sercowego
pochodzenia wirusowego (Waldenstrdm et al., Eur J Clin Invest 1993; 23: 277-282).
[0488] Pojawienie się obrzęków śródmiąższowych związanych z przeszczepieniem organu stanowi
poważny problem chirurgii transplantacyjnej. W przypadku aż 25% przeszczepów dojdzie do
35
obrzęków o takim stopniu, że czynność narządu będzie czasowo utracona. Ponadto, w 2-3%
przypadków, obrzęk powodował rozerwanie nerki prowadzące do rozległego krwotoku.
[0489] Glikoproteina sHASEGP może być wykorzystana do degradacji nagromadzonych w
przeszczepionym narządzie glikozoaminoglikanów. Eliminowanie tych cząsteczek powoduje usuwanie
wody z przeszczepionego organu i przywrócenie jego funkcji. W celu zmniejszenia ciśnienia
40
śródmiąższowego może być podawana dawka sHASEGP mieszcząca się w zakresie 500 – 10 000
U/kg.
[0490] PATOLOGICZNE NAGROMADZENIE SIĘ GLIKOZOAMINOGLIKANÓW W MÓZGU
[0491] Podwyższony poziom hialuronianu obserwuje się w wielu mózgowo-rdzeniowych schorzeniach.
Normalnie poziom tzw. „mózgowo-rdzeniowego” hialuronianu u dorosłych jest mniejszy niż 200 µg/l
(Laurent et al, Acta Neurol Scand 1996 Sep;94(3):194-206). Poziom ten może podwyższyć się do
5
ponad 8000 µg/l w przypadku chorób takich jak zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, zwężenie
kanału kręgowego, uraz głowy i udar mózgu. Dlatego też podawanie wysokousjalowanej sHASEGP
dooponowo lub przez ogólnoustrojowe wstrzyknięcie może być zastosowane do rozkładu substratów
tego enzymu występujących w podwyższonym stężeniu.
[0492] Brak wydajnie krążącej chłonki w mózgu także może prowadzić do powstania zagrażającego
10
życiu obrzęku będącego wynikiem urazu głowy. Akumulacja hialuronianu jest wynikiem zwiększonej
syntezy syntazy HA i obniżonej degradacji hialuronianu. Ma ona na celu zwiększenie zawartości wody
w uszkodzonej tkance tak, aby umożliwić leukocytom wynaczynienie, jednakże w pewnych
przypadkach może być śmiertelna. Podanie ludzkiej sHASEGP pacjentowi cierpiącemu na uraz głowy
może w takim przypadku doprowadzić do usunięcia nagromadzonego w tkance hialuronianu wraz ze
15
związaną z nim wodą. Ludzka sHASEGP może być podawana dooponowo za pośrednictwem
przetoki. Alternatywnie, w celu dostarczenia jej do tkanki mózgu, wysokousjalowana sHASEGP może
być podawana dożylnie.
[0493] Poziom hialuronianu dramatycznie wzrasta w przypadku niedokrwienia mózgu będącego
wynikiem udaru, co jest związane ze zwiększona ekspresją syntazy HA i jego obniżonym
20
katabolizmem. Niewydolność pomp jonowych i wyciek plazmy do tkanki śródmiąższowej powoduje
zatrzymanie płynu, który w przypadku, gdy nie zostanie prawidłowo usunięty przez układ limfatyczny,
może doprowadzić do martwicy. Akumulacji płynu w tkance śródmiąższowej w przypadku
niedokrwienia będącego następstwem reperfuzji
próbowano zapobiegać przez blokowanie
przepuszczalności naczyń krwionośnych. Jednak, kiedy płyn wypływa poza naczynie krwionośne,
25
zablokowanie przepuszczalności naczyń krwionośnych może również zablokować wchłanianie
obrzęku i zaostrzyć stan pacjenta.
[0494] Ludzka sHASEGP może być również zastosowana do leczenia obrzęku związanego z guzem
mózgu, szczególnie takim, który jest związany z glejakiem wielopostaciowym. Obrzęki, będące
wynikiem guzów mózgu, powstają w następstwie nagromadzenia się hialuronianu w nie zmienionej
30
nowotworowo części mózgu. Podawanie hialuronidazy do miejsc akumulacji hialuronianu (np. przez
dożylne wstrzyknięcie lub przetokę) może złagodzić obrzęk związany z tego typu stanami
nowotworowymi przez degradację nagromadzonego w tych miejscach hialuronianu. Dlatego tez
hialuronidaza jest skuteczna w leczeniu guzów mózgu nie tylko dlatego, że w wyniku jej działania
dochodzi do redukcji masy guza i zahamowania jego wzrostu i/lub przerzutowania, ale także dlatego,
35
że jej zastosowanie łagodzi obrzęk wynikający z opisanego stanu nowotworowego. Podczas leczenia
obrzęku, ludzką sHASEGP można podawać w sposób analogiczny do tego stosowanego w leczeniu
hialuronidazą pochodzącą z jąder wołowych (patrz np. Sa Earp Arq. Braz. Med. 44:_217-20).
[0495] LECZENIE NAGROMADZENIA GLIKOZOAMINOGLIKANÓW W CHOROBIE SERCOWONACZYNIOWEJ
40
[0496] Wykorzystując modele zwierzęce eksperymentalnego zawału mięśnia sercowego, wykazano,
że podawanie hialuronidazy redukowało obszar martwicy niedokrwiennej u zwierząt doświadczalnych
(Maclean, et. al Science 1976 Oct 8;194(4261):199-200). Zaproponowany mechanizm, przez który
hialuronidaza zmniejsza obszar martwicy niedokrwiennej u zwierząt, polega na redukcji gromadzenia
się hialuronianu, do którego dochodzi w przypadkach niedokrwienia będącego następstwem
reperfuzji. Uważa się, że zmniejszenie obszaru martwicy niedokrwiennej związane jest ze
zwiększeniem drenażu limfatycznego, natlenienia tkanki i redukcji zawartości wody w mięśniu
5
sercowym. Podczas gdy udawało się osiągnąć efekt redukcji obszaru martwicy niedokrwiennej na
modelach zwierzęcych, takich korzystnych efektów nie osiągano w przeprowadzanych na szeroką
skalę badaniach u ludzi. Hialuronidaza z wołowych jąder charakteryzuje się bardzo krótkim okresem
półtrwania w surowicy wynoszącym w przypadku zwierząt i człowieka około 3 min. (Wolf, et. al., J
Pharmacol Exp Ther 1982 Aug;222 (2):331-7). Tak krótki okres półtrwania jest wynikiem obecności
10
terminalnych reszt mannozy, które są łatwo rozpoznawane przez receptory wymiatające (ang.
scavenger receptors) retikulum endoplazmatycznego. Stosowanie hialuronidazy może wywołać
korzystny efekt u małych zwierząt z racji posiadania przez nie mniejszego łożyska naczyniowego.
Istnieje zapotrzebowanie na enzym o zwiększonym okresie półtrwania. Wysokousjalowane sHASEGP
cechuje korzystna farmakokinetyka, wynikająca z obecności terminalnych kwasów sjalowych w
15
strukturach glikanów sHASEGP, przez co nie są one rozpoznawane przez receptory wymiatające
(ang. scavenger receptors). Wysokousjalowana sHASEGP, w dawce 100 – 200 000 U/kg, może być
wykorzystana w celu ułatwienia wchłaniania nadmiaru hialuronianu powstałego przy niedokrwieniu
będącym wynikiem reperfuzji oraz w celu redukcji rozmiaru obszaru martwicy niedokrwiennej.
[0497] Wysokousjalowana sHASEGP może być również stosowana, aby ograniczyć odkładanie się
20
płytek miażdżycowych. Płytki takie akumulują glikozoaminoglikany i pośredniczą w adhezji
makrofagów i komórek piankowatych (Kolodgie et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002 Oct
1;22(10):1642-8). Podawanie wysokousjalowanej sHASEGP może zostać wykorzystane do
zmniejszenia formowania się płytki miażdżycowej. Niniejszy wynalazek obejmuje powtarzalne
podawanie hialuronidazy w dawkach 100 – 100 000 U/kg, a użycie dla tych celów ludzkiego
25
rekombinowanego białka, o niskim ryzyku wzbudzania odpowiedzi immunologicznej i podwyższonym
okresie półtrwania, będzie skutkowało większą redukcją płytki miażdżycowej.
[0498] LECZENIE MARTWICY TKANEK OBWODOWYCH
[0499] W wielu chorobach do martwicy tkanek dochodzi w wyniku niewydolności krążenia żylnego.
Brak wydajnego natlenienia jest jedną z głównych przeszkód w regeneracji tkanki. Wykazano, że
30
wewnątrztętnicze leczenie hialuronidazą polepsza obraz kliniczny pacjenta cierpiącego na chorobę
tętnic obwodowych (Elder et. al, Lancet (1980) 648-649). Glikoproteina sHASEGP może być
wstrzykiwana do tętnicy od 3 do 5 razy w tygodniu w dawkach 10 – 200 000 U.
[0500] WZMOCNIENIE ZNIECZULENIA
[0501]
35
Hialuronidazy
pochodzenia
zwierzęcego
są
powszechnie
używane
do
wywołania
okołogałkowej blokady w znieczuleniu miejscowym stosowanym w chirurgii ocznej. Obecność enzymu
eliminuje potrzebę stosowania dalszych blokad i przyspiesza wystąpienie akinezy (bezruch gałki
ocznej). Okołogałkowa blokada i blokada polegająca na podaniu środka znieczulającego pod tylną
część torebki Tenona (ang. sub-Tenon’s block) są najbardziej powszechnymi metodami stosowanymi
podczas zabiegów okulistycznych, w których można zastosować hialuronidazę. Od chwili wycofania
40
Wydase®, w przypadkach stosowania blokady okołogałkowej, donoszono o wzrastajacej liczbie
pooperacyjnych komplikacji związanych z podwójnym widzeniem i opadaniem powiek (Brown et al J
Cataract Refract Surg 1999; 25:1245-9).
[0502] Z chwilą zaprzestania stosowania Wydase®, w sprzedaży pojawiła się hialuronidaza
pochodząca z jąder wołowych. Jednakże, z użyciem takich sterylnych preparowanych na miejscu
produktów
wiąże
się
kilka
problemów
http://www.ashp.org/shortage/hyaluronidase.cfm?cfid=11944667&CFToken=942
5
6953
(patrz:
-
ref#ref.
Preparaty takie są produktami nie dopuszczonymi do obrotu przez FDA. Tym samym FDA nie ma
kontroli nad ich jakością i zgodnością z wymogami procesu ich produkcji.
[0503] Glikoproteina sHASEGP w ilości 10 – 500 U może być zmieszana bezpośrednio z 5 ml 2%
lidokainy (ksylokainy), 5 ml 0.5% bupiwakainy (markainy) i opcjonalnie z epinefryną w stosunku 1:200
000. Glikoproteina sHASEGP może być zastosowana w celu przyspieszenia wystąpienia akinezy i
10
wyeliminowania potrzeby stosowania dodatkowych blokad. Glikoproteina ta jest także użyteczna do
wywoływania akinezy w chirurgii kosmetycznej związanej z plastyką powiek i liftingiem twarzy. Może
być także zastosowana do wspomagania dyfuzji środków przeciwzapalnych i redukcji obrzęku tkanek
powstałych po takich zabiegach operacyjnych.
[0504] Glikoproteina sHASEGP może być także zmieszana z buforowanym roztworem soli, takim jak
15
bufor wodoroweglanowy, aby zapobiec dyskomfortowi odczuwalnemu podczas iniekcji. W trakcie
przeprowadzania nacięć, sHASEGP może być zmieszana ze środkiem znieczulającym zarówno w
celu zmniejszenia całkowitej objętości materiału wymaganego do wstrzyknięcia, jak również aby
zredukować ból wynikający z obrzęku tkanki.
[0505] OBNIŻENIE CIŚNIENIA ŚRÓDGAŁKOWEGO
20
[0506] Powszechnie występującym efektem ubocznym u pacjentów, którzy przeszli operację
katarakty, jest znaczny i rzadko przedłużający się wzrost ciśnienia śródgałkowego. Stan ten bywa
poważny u pacjentów obarczonych zmianami tarczy nerwu wzrokowego, będącymi wynikiem
zachorowania na jaskrę. Zazwyczaj wzrost ciśnienia jest bardziej drastyczny podczas wstrzykiwania
do oka czynników wiskoelastycznych takich jak kwas hialuronowy, jednak ciśnienie śródgałkowe po
25
operacji podnosi się nawet wtedy, kiedy takie czynniki nie zostały użyte. Ponadto opisany wzrost
ciśnienia może nastąpić nawet wtedy, kiedy podczas zabiegu operacyjnego nie stosuje się żadnych
dodatkowych
leków.
W
niektórych
przypadkach,
zalecane
jest
pozostawienie
czynnika
wiskoelastycznego w oku, co często wymaga podawania pacjentom dużych dawek inhibitorów
anhydrazy weglanowej. Inhibitory te obniżają ciśnienie śródgałkowe poprzez obniżenie wytwarzania
30
cieczy wodnistej oka, płynu normalnie wydzielanego w oku przez ciało rzęskowe. Obecnie znane
metody łagodzenia pooperacyjnych wzrostów ciśnienia w oku obejmują różne rodzaje kropli do oczu
zawierających
takie
składniki
jak
czynniki
blokujące
receptory
β-adrenergiczne,
czynniki
sympatykomimetyczne, środki zwężające źrenicę, alfa-2 adrenomimetyki, inhibitory anhydrazy
weglanowej i czynniki działające na zasadzie mechanizmu działania prostaglandyny.
35
[0507] Korzystną metodą usuwania substancji wiskoelastycznej, takiej jak kwas hialuronowy, jest
wstrzyknięcie sHASEGP podczas lub natychmiast po zabiegach operacyjnych wykonywanych w
obrębie przedniego lub tylnego odcinka oka. Jednakże możliwe są również inne metody podawania
znane w stanie techniki,. Podczas zabiegów operacyjnych w obrębie przedniego odcinka oka, w celu
umożliwienia w chwili rozpoczęcia zabiegu kwasowi hialuronowemu zadziałania jako przegroda,
40
korzystne jest, aby kwas hialuronowy i sHASEGP były podawane przez wstrzyknięcie do przedniej
komory oka. W niektórych przypadkach, podczas przeszczepiania rogówki, kombinację kwasu
hialuronowego i sHASEGP można umieścić na powierzchni struktur wewnątrzgałkowych przed
przyszyciem przeszczepu rogówki. Kombinacja tego typu może być również użyta w zabiegach
operacyjnych w obrębie tylnego odcinka oka, takich jak leczenie operacyjne chorób siatkówki czy ciała
szklistego oka.
[0508] W niektórych przypadkach po zakończeniu operacji zaleca się pozostawić w komorze przedniej
5
oka czynnik wiskoelastyczny taki jak Healon.TM, Viscoat.TM lub inne substancje wypełniające. Takie
postępowanie sprawdza się szczególnie przy wzroście ciśnienia, gdy zawartość wnętrza gałki ocznej
ma tendencje do zbliżania się i naciskania na tylną powierzchnię rogówki. Jeśli dojdzie do takiego
stanu w oku zawierającym syntetyczną wewnątrzgałkową soczewkę, ciśnienie w śródbłonku rogówki
może spowodować znaczne uszkodzenie komórek i będący wynikiem tego obrzęk rogówki i utratę
10
przezroczystości, co skutkuje pogorszeniem widzenia. Zazwyczaj, jeśli stwierdza się u pacjenta
znacznie podniesione ciśnienie, to pod koniec operacji, zarówno w celu obniżenia produkcji cieczy
wodnistej oka i/lub zwiększenia jej odpływu, należy podać takiemu pacjentowi duże dawki inhibitorów
anhydrazy węglanowej, miejscowo w postaci kropel zawierających beta-blokery i agonistów
receptorów alfa-2. Wszystkie te czynniki powodują efekty uboczne i w niektórych przypadkach nie
15
zaleca się ich stosowania u pacjentów z różnymi typami stanów chorobowych, takich jak problemy z
oddychaniem, choroby serca lub nadciśnienie tętnicze. Jednakże zastosowanie w takich przypadkach
sHASEGP eliminuje potrzebę podawania takim pacjentom wysokich dawek wspomnianych leków.
[0509] Dodatkowo, w siatce włókien kolagenowych w kącie przesączania oka znajduje się znacząca
ilość kwasu uronowego. Pod wpływem działania sHASEGP dochodzi do jego degradacji i tym samym
20
poprawy odpływu cieczy przez siatkę włókien kolagenowych w kącie przesączania oka. Tym samym
ciśnienie śródgałkowe w oku pacjenta będzie spadać. Kombinacje sHASEGP z innymi czynnikami
przedniej komory oka, takimi jak metyloceluloza (np. Ocucoat.RTM, preparat komercyjnie dostępny w
Storz Instrument Co.), stosowane jako przegrody i/lub środki zabezpieczające podczas operacji
katarakty, będą wydajne także w zapobieganiu znacznemu wzrostowi ciśnienia. W efekcie będą one
25
otwierać siatkę włókien kolagenowych w kącie przesączania oka i umożliwiać większy drenaż cieczy
wodnistej poprzez degradacje obecnych tam znacznych ilości kwasu hialuronowego.
[0510] Usuwanie glikozoaminoglikanów z siatki włókien kolagenowych w kącie przesączania oka jest
także użyteczne przy obniżaniu ciśnienia śródgałkowego u osób cierpiących na jaskrę z otwartym
kątem przesączania. Ludzką sHASEGP można podawać przez wstrzykniecie podspojówkowe lub
30
bezpośrednio do komory przedniej oka.
[0511] TORBIELE GALARETOWATE POCHEWKI ŚCIĘGNA
[0512] Torbiel galaretowata pochewki ścięgna (znana również pod nazwą torbiel nadgarstka, guz
biblijny lub torbiel ścięgna grzbietowego) to najbardziej powszechny guz tkanki miękkiej ręki. Jest to
wyczuwalny pod skórą pęcherzyk wypełniony płynem. Zazwyczaj jest on związany z pochewką
35
ścięgna (otoczka nawilżająca ścięgno) ręki lub nadgarstka lub jest połączony ze znajdującym się pod
nim stawem. Niektóre z tych torbieli nie posiadają widocznego połączenia do żadnej struktury.
Torbiele galaretowate pochewki ścięgna mogą również występować w stopie. Często pojawiają się w
miejscach urazów więzadeł otaczających wyściółkę ścięgien lub stawów, gdzie dochodzi do
uwypuklenia się wyściółki przez ubytek więzadła i utworzenia guza pod skórą. Ze stanem tym często
40
wiąże się stan zapalny. Tkanka będąca w stanie zapalnym produkuje galaretowatą substancję, która
wypełnia wystający guz. Guzy tego typu, w związku z wysokim ciśnieniem śluzowatego płynu
wypełniającego torbiel, mogą być bardzo twarde, przez co często mylone są z wyrostkami kostnymi.
[0513] sHASEGP może być stosowana do leczenia torbieli galaretowatych pochewki ścięgna.
Doguzowe wstrzyknięcie sHASEGP w ilości 5 - 1000 U, a następnie delikatne odsysanie przy pomocy
igły, pozwala usunąć torbiel bez potrzeby przeprowadzania zabiegu operacyjnego. Opcjonalnie razem
z sHASEGP wstrzykiwane mogą być kortykosteroidy
5
[0514] OBRZĘK ŚLUZOWATY
[0515] Skórne nacieki glikozoaminoglikanów są cechą charakterystyczną nadczynności tarczycy,
niedoczynności tarczycy, obrzęku śluzowatego podudzi i obrzęku tkanki. Kwas hialuronowy jest
głównym GAG we wszystkich tych stanach i w prawidłowej skórze. Istnieje minimalna zmienność
histologiczna dotycząca rozmieszczenia cząsteczek GAG w skórze. Nabyte zwyrodnienie śluzowate
10
skóry (mucynoza) charakteryzuje się podobnym rozmieszczeniem GAG i ich składem chemicznym.
Pewne różnice morfologiczne w aktywności fibroblastów sugerują, że zwyrodnienie śluzowate skóry w
przypadku obrzęku śluzowatego podudzi i obrzęku tkanki jest procesem miejscowym, podczas gdy
nacieki GAG w chorobach tarczycy są pochodzenia ogólnoustrojowego. Zaburzenia te mogą być
łagodzone przez sHASEGP podawaną zarówno miejscowo jak i ogólnoustrojowo. W przypadku
15
przewlekłego leczenia, można przewidzieć stosowanie pegilowanej sHASEGP.
[0516] ZASTOSOWANIA sHASEGP W CHOROBACH PŁUC
[0517] Stężenie hialuronianu w płynie pęcherzyków oskrzelowych (BAL) normalnych osobników
wynosi zazwyczaj mniej niż 15 ng/ml. Jednak stężenie to wzrasta dramatycznie w przypadku zespołu
zaburzeń oddechowych (Bjermer Br Med J (Clin Res Ed) 1987 Oct 3; 295(6602):803-6). Na przykład
20
w przypadku ARDS, stężenie hialuronianu może wrosnąć do 500 ng/ml podczas, gdy w przypadku
tzw. „płuca farmera”, stężenie to osiąga wartość 1000 ng/ml (Hallgren et al Am Rev Respir Dis. 1989
Mar;139(3):682-7), (Larrson et al Chest. 1992
Jan;101(1):109-14). Wzrost ilości hialuronianu w płucach może przeszkadzać w dyfuzji tlenu i
wymianie gazowej, jak również aktywacji neutrofili i odpowiedzi makrofagów.
25
[0518] Z wielu powodów do leczenia takich stanów nie zaleca się stosowania preparatów hialuronidaz
wołowych. Po pierwsze wiadomo, że preparaty hialuronidazy z jąder pochodzenia zwierzęcego są
zanieczyszczone proteazami serynowymi, takimi jak akrozyna. Po drugie, obce dla człowieka enzymy
pochodzenia wołowego zwiększa prawdopodobieństwo wystąpienia reakcji anafilaktycznej, która
może prowadzić do śmierci pacjenta. Natomiast wysoko oczyszczony preparat rekombinowanej
30
ludzkiej sHASEGP może być podany zarówno do płuc jak i dożylnie. Ludzka sHASEGP może być
również podawana pacjentom cierpiącym na inne choroby płuc, związane z podwyższonym poziomem
glikozoaminoglikanów. Jej podanie może poprawić docieranie do płuc innych, podanych jednocześnie
z sHASEGP, cząsteczek
[0519] Przykłady przytaczane w następującej części doświadczalnej ilustrują poszczególne warianty
35
wykonania wynalazku, nie ograniczając jednak w żaden sposób jego treści.
[0520] PRZYKŁAD 1
[0521] TEST AKTYWNOŚCI HIALURONIDAZY OPARTY NA MIKROMIARECZKOWANIU
[0522] Poniższy przykład przedstawia szybki test do pomiaru aktywności hialuronidazowej sHASEGP.
Aktywność w tym teście wyrażana jest w jednostkach TRU, IU lub NFU w odniesieniu do
40
standardowych preparacji hialuronidazy opisywanych przez WHO.
[0523] TEST OPARTY NA MIKROMIARECZKOWANIU Z UŻYCIEM BIOTYNYLOWANEGO
HIALURONIANU
[0524] Wolne grupy karboksylowe reszt kwasu glukuronowego hialuronianu są biotynylowane w
jednoetapowej reakcji z wykorzystaniem hydrazydu biotyny (Pierce), Sulfo-NHS (Pierce) i 1-etylo-
5
dimetyloaminopropylo-karbodiimidu (Sigma). Taki biotynylowany substrat HA jest w drugim etapie
kowalencyjnie wiązany do 96-dołkowej płytki przeznaczonej do mikromiareczkowania. Po zakończeniu
reakcji enzymatycznej, pozostała reszta substratu wykrywana jest za pomocą reakcji awidynaperoksydaza, której wynik można odczytać w standardowym czytniku płytek ELISA. W przypadku, gdy
to właśnie substrat jest kowalencyjnie związany z powierzchnią płytki, nie dochodzi do powstawania
10
artefaktów takich jak zależne od pH wymywanie biotynylowanego substratu. Czułość testu pozwala na
szybki pomiar aktywności hialuronidazy izolowanej z hodowli komórkowych i próbek biologicznych z
wariacją miedzy testami wynoszącą 10%.
[0525] a. PROTOKÓŁ
[0526] PREPARACJA BIOTYNYLOWANEGO SUBSTRATU HA
15
[0527] Przed związaniem z biotyną, 100 mg HA (Sigma Chemicals) rozpuszczono w 0.1 M MES, pH
5.0 do końcowego stężenia 1 mg/ml pozostawiając do rozpuszczenia przez okres co najmniej 24
godz. w 4 °C. Sulfo-NHS (Pierce; Rockford IL) dodano do roztworu CS04 MES tak, aby końcowe
stężenie wynosiło 0.184 mg/ml. Hydrazyd biotyny (Pierce) rozpuszczono w DMSO, w wyniku czego
otrzymano 100 mM roztwór podstawowy, który dodano do roztworu CS04 do końcowego stężenia
20
równego
1
mM.
Roztwór
podstawowy
1-etylo-dimetyloaminopropylo-karbodiimidu
(EDAC)
przygotowano jako 100 mM roztwór w wodzie, który następnie dodano do roztworu biotyny i HA tak,
aby końcowe stężenie EDAC wynosiło 30 mM. Taki roztwór mieszano przez noc w 4 °C. Niezwiązaną
biotynę i EDAC usuwano przez dializę wobec wody przy trzech zmianach porcji wody o objętości
tysiąckrotnie większej niż dializowana próbka. Wydializowany, biotynylowany HA (bHA) porcjowano i
25
przechowywano w 20 °C przez okres do kilku miesięcy.
[0528] Sulfo-NHS rozcieńczono w wodzie z zawartością bHA (2 mg/ml) do stężenia 0.184 mg/ml i
rozpipetowano na płytce 96-dołkowej COVALINK-NH (NUNC, Placerville, NJ) w ilości 50 µg na dołek.
EDAC rozcieńczono do stężenia 0.123 mg/ml w wodzie i rozpipetowano na płytce 96-dołkowej
COVALINK-NH zawierającej roztwór bHA, osiągając ostatecznie stężenie bHA - 10 µg/dołek i EDAC –
30
6.15 µg/dołek. Płytki inkubowano przez noc w °C lub przez 2 godz. w 23 °C, co dawało porównywalne
wyniki. Po kowalencyjnej immobilizacji bCS04 na płytkach do mikromiareczkowania, roztwór do
sprzęgania został usunięty przez wytrząsanie, płytki przemyto 3 razy w PBS zawierającym 2 M NaCl i
50 mM MgSO4 (Bufor A). Płytki można przechowywać w 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
[0529] Płytki COVALINK-NH z immobilizowaną bHA równoważono buforem do testu w ilości 100
35
µ/dołek (0.1 M mrówczan, pH 3.7, 0.1 M NaCl, 1% TRITON X-100, 5 mM sacharolakton dla
lizosomalnej hialuronidazy lub 10mM Hepes pH 7.4 z 1 mM CaCl2 i 1 mg/ml albuminy (ICN) surowicy
ludzkiej dla enzymów aktywnych w pH obojętnym). Zestaw standardów do kalibracji aktywności
enzymatycznej wyrażonej we „względnych jednostkach redukcji zmętnienia” (rTRU) przygotowano
przez rozpuszczenie hialuronidazy z jąder wołowych (Sigma typ VI-S) w buforze dla enzymów
40
działających w obojętnym pH w ilości od 1.0 do 1 × 10
–6
rTRU/dołek. Przetestowano próbki w
objętości 100 µl/dołek w trzech powtórzeniach. Próbki hialuronidazy aktywnej w kwaśnym pH
przygotowywano w buforze dla hialuronidazy lizosomalnej w rozcieńczeniu od 1:10 do 1: 130 000 i
rozpipetowano po 100 µl/dołek. Dla większości testów prowadzonych na ekstraktach tkankowych i
ludzkiej plazmie wystarczająca była inkubacja przez 30 min. w 37 °C. Dołki zawierające pozytywne i
negatywne kontrole (odpowiednio brak enzymu lub brak ABC - patrz poniżej) przygotowano w trzech
5
powtórzeniach.
[0530] Reakcje zakończono dodając 6 M Guanidyna-HCl w objętości 200 µl/dołek, po czym płytkę
trzykrotnie przemyto 300 µl/dołek roztworem PBS z 2 M NaCl, 50 mM MgSO4, 0.05% TWEEN 20
(bufor B). Zestaw zawierający kompleks awidyna –biotyna (ABC) (Vector Labs; Burlingame CA)
przygotowano w 10 ml PBS zawierającym 0.1% TWEEN 20, który poddano preinkubacji przez 30 min.
10
w temperaturze pokojowej. Dodano roztwór ABC (100 µl/dołek) i inkubowano przez 30 min. w
temperaturze pokojowej. Płytkę przemywano 5-krotnie buforem B, a następnie dodano substrat – ofenylenodiaminę (OPD) w ilości 100 µ/dołek przez rozpuszczenie 10 mg tabletki OPD w 10 ml 0.1 M
buforu cytrynian-fosforan (pH 5.3) i dodając 7.5 µl 30% H2O2. Płytkę inkubowano w ciemności przez
10 – 15 min., a następnie odczytywano przy użyciu czytnika płytek ELISA przy długości fali 492 nm
15
(Titertek Multiskan PLUS; ICN) wykorzystując oprogramowanie Delta Soft II dla czytnika płytek z z
firmy Biometallics (Princeton NJ) do monitorowania reakcji. Krzywa standardowa dla hialuronidazy z
jąder wołowych została przygotowana z wykorzystaniem czteroparametrowej krzywej korelacji dla
komercyjnych preparatów hialuronidazy, a w przypadku nieznanych próbek wartości interpolowano
przez pomiar absorbancji przy długości fali 492 nm.
20
[0531] Do analizy zależności aktywności hialuronidaz od pH, wykorzystuje się oczyszczoną
rekombinowaną sHASEGP i hialuronidazę izolowaną z jąder wołowych. Wpływ pH na aktywność
enzymatyczną mierzy się przez rozcieńczenie oczyszczonej sHASEGP lub częściowo oczyszczonej
hialuronidazy izolowanej z jąder wołowych do stężenia 0.1 rTRU w następujących buforach: 50 mM
mrówczan, pH 3-4.5; 50 mM octan, pH 5-6;
25
50 mM MES, pH 6-7; lub 50 mM HEPES, pH 7-8. Próbki testuje się przez 30 min. w 37 °C, a
aktywność wyrażona jest jako procent maksymalnej aktywności. Do sporządzania buforów nie
używano NaCl, ponieważ może on zmienić optymalne pH dla preparacji hialuronidazy z jąder
wołowych (Gold, Biochem. J. 205:69-74, 1982; Gacesa et al. Biochem. Soc. Trans. 7:1287-1289,
1979). Stężenie fizjologiczne soli (0.15 M) obniżało rzeczywiste optymalne pH, a efekt ten był
30
silniejszy w przypadku oczyszczonych preparatów enzymu z jąder wołowych niż w przypadku
wyjściowej surowej próbki.
[0532] b. WYNIKI
[0533] Hialuronian był biotynylowany w jednostopniowej reakcji z użyciem hydrazydu biotyny i EDAC.
Poprzez ograniczenie ilości EDAC, który to związek sprzęga wolne grupy karboksylowe HA z
35
hydrazydem biotyny, tylko mała część wszystkich reszt kwasu uronowego w HA została
-5
-3
wyznakowana. EDAC (3 x 10 M) dodany do HA (2.8 × 10 M) powoduje, że sprzęganiu ulega jedna
cząsteczka hydrazydu biotyny na 93 disacharydowe podjednostki HA.
[0534] Przygotowano czteroparametrową krzywą korelacji dla standardowej reakcji hialuronidazy
izolowanej z jąder wołowych mierzonej w pH 3.7, przy rozcieńczeniu enzymu od 1 do 1 × 10-6
40
TRU/dołek. Czteroparametrową krzywą korelacji ustalono z równania y=((A-D)/(1+(conc/C)^B)) + D),
gdzie logit y= In (y’/1-y’), y’= (y-D)/(A-D), B=-b/ln 10 i C=EXP (a/B). Cztery parametry (A, B, C, D)
obliczono wykorzystując program komputerowy i algorytm 2+2 z regresją liniową (Rodbard et al., Clin.
Chem. 22: 350, 1976). Krzywa korelacji uwzględnia sigmoidalny charakter krzywej wzorcowej.
Optymalna dokładność pomiaru próbki zazwyczaj osiągana jest w zakresie 0.001 do 0.1 TRU/dołek w
czasie 30 min. inkubacji. Podczas inkubacji trwającej 60 min. wykrywalna aktywność wynosiła 1/1000
5
TRU. Aby wyznaczyć krzywą standardową dla mniejszego zakresu można również używać
standardowej krzywej logarytmicznej. Mimo iż niniejszy wynalazek przedstawiono w połączeniu z
konkretnymi korzystnymi wykonaniami, powinno być zrozumiałe, że zastrzegany wynalazek nie jest w
żaden sposób do nich ograniczony.
[0535] PRZYKŁAD 2
10
[0536] KLONOWANIE cDNA dla sHASEGP
[0537] Specjalista w dziedzinie może otrzymać kwas nukleinowy kodujący ludzką sHASEGP wieloma
sposobami obejmującymi, lecz nie tylko, sztuczną syntezę genu, RT-PCR, przeszukiwanie biblioteki
cDNA przez hybrydyzację (np. patrz Gmachl et al. FEBS 336(3) 1993, Kimmel et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90 1993 10071-10075). Alternatywnie, klony kodujące ludzką sHASEGP mogą być
15
otrzymane z IMAGE lub od innego dystrybutora dysponującego sekwencjami ludzkiego genomu
(Invitrogen Clone ID IOH10647).
[0538] Całkowita długość cDNA ludzkiej PH20 wynosi 2009 nukleotydów i zawiera otwartą ramkę
odczytu obejmującą 1530 nukleotydów. 5'UTR jest nietypowo duży, co może sugerować , że jeden z
intronów, zawierający 9 niekodujących kodonów start, nie został usunięty i hamuje translację nie
20
pozwalając na związanie się rybosomu do poprawnego inicjującego kodonu metioniny. Na podstawie
sekwencji przewidziano, że białko (GenBank Accession Number np. NP_003108) zawiera 509
aminokwasów sekwencji ID. SEKW. Nr 1, a obliczona masa molekularna wynosi 58kDa.
[0539] W celu sekwencjonowania DNA klonów, namnożone w PCR prążki zostały wycięte z żelu a
DNA, odzyskane za pomocą gotowego zestawu Gel Extraction Kit (Qiagen) i wklonowane do
25
odpowiedniego wektora w kompatybilne miejsca restrykcyjne uzyskane w wyniku trawienia enzymami
restrykcyjnymi.
Wszystkie
reakcje
sekwencjonowania
zostały
przeprowadzone
z
użyciem
dwuniciowego DNA i zestawu TaqDyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems) w
automatycznym sekwenatorze ABI według instrukcji producenta Prism™ (Applied Biosystems).
[0540] Otwarta ramka odczytu ludzkiej PH-20 została otrzymana w wyniku namnożenia biblioteki
30
cDNA z ludzkich jąder (Clontech, Palo Alto CA) za pomocą Łańcuchowej Reakcji Polimerazy przy
użyciu pary primerów ID. SEKW. Nr 14 i ID. SEKW. Nr 47. Produkty PCR trawiono enzymami NheI i
BamHI i klonowano w miejsca restrykcyjne NheI i BamHI wektora IRESpuro2 (Clontech).
[0541] PRZYKŁAD 4
[0542] IZOLACJA sHASEGP Z cDNA LUDZKIEJ PH20
35
[0543] Wektor ekspresyjny dla aktywnej katalitycznie sekrecyjnej rekombinowanej formy sHASEGP
pochodzenia ludzkiego, zdolny do efektywnej glikozylacji w komórkach ssaczych, został wytworzony
jak opisano poniżej. Wynalazek obejmuje także inne konstrukty ekspresyjne z promotorami i genami
selekcyjnymi funkcjonującymi komórkach gospodarza pochodzących od różnych gatunków, takich jak
drożdże i komórki owadzie, które są także zdolne do wytworzenia sHASEGP. Można również
40
wykorzystać geny pozytywnie selekcjonujące, jak syntaza glutaminy lub reduktaza dihydrofolianowa
(DHFR). Przykłady podane poniżej nie mają na celu zawężenia zakresu wynalazku, lecz raczej
dostarczenie przykładów kilku systemów ekspresyjnych, które można by zastosować.
[0544] W celu uzyskania rozpuszczalnej postaci sHASEGP przygotowano mutanty delecyjne, które
nie posiadają hydrofobowego końca C-terminalnego. Wykorzystując program GPI do przewidywania
miejsc cięcia zlokalizowano miejsce odtrawiania kotwicy GPI, które w pełnej długości cząsteczce
białka z kotwicą GPI znajduje się w okolicy aminokwasu w pozycji N483. Za pomocą zestawu siedmiu
5
3' primerów (tzw. primerów nested) skonstruowano siedem mutantów delecyjnych, które nie posiadały
przewidzianej w programie GPI kotwicy GPI zaczynającej się w pozycji Y482 i sukcesywnie usuwanej
po jednym aminokwasie w każdym kolejnym mutancie. Primery te zostały zaprojektowane z miejscami
restrykcyjnymi dla enzymów NheI (5') i BamHI (3'), aby umożliwić wklonowanie mutantów delecyjnych
do wektora IRESpuro2 w wariantach bez znacznika i kodonu stop w primerze 3' lub ze znacznikiem
10
His-tag na C-końcu białka dla ułatwienia etapu oczyszczania i detekcji, np. primery ID. SEKW. Nr 8,
ID. SEKW. Nr 9 i ID. SEKW. Nr 10 użyto do wytworzenia mutantów delecyjnych o terminalnym
aminokwasie w pozycji Y482, F481 i I480 i bez 6xHis-tag. Inne primery wytworzono z podobnym
składem zasad i odpowiednimi modyfikacjami, dzięki którym aminokwas jest wprowadzany do
sekwencji lub usuwany. Do wytworzenia wariantów ze znacznikiem His-tag użyto tych samych
15
primerów co do wytworzenia wariantów bez znacznika z tym, że primer antysensowny (ang. reverse)
nie zawiera kodonu stop a primer sensowny (ang. forward) pozostaje taki sam (konstrukt z His-tag
powielano z primerami ID. SEKW. Nr 19, 20, 21, 22, 23,24 i 25, które są antysensowne, nie zawierają
kodonu stop i odpowiadają primerom antysensownym bez His-tag). Nakładające się primery zostały
wykorzystane do skonstruowania sześcioaminokwasowego łącznika z sześcioma dodatkowymi
20
histydynami między miejscami BamHI i NotI wektora IRESpuro2. Mutanty ze znacznikiem His-tag
otrzymano ligując produkt PCR trawiony enzymami NheI i BamHI do wektora IRESpuro2 zawierający
His-tag.
[0545] Opierając się na homologii do enzymu z jadu pszczół sprawdzono jakie modyfikacje na Ckońcu prowadzą do wytworzenia sekrecyjnego, aktywnego w pH obojętnym enzymu. W tym celu
25
przeprowadzono serię delecji poczynając od końca z miejscem przyłączania kotwicy GPI do
potencjalnej „domeny katalitycznej”.
[0546] DNA kodujące klon kompletnej cząsteczki ludzkiej sHASEGP z kotwicą GPI i zawarte w
wektorze IRESpuro2 zostało użyte jako matryca do wytworzenia różnego typu skróconych mutantów
delecyjnych. Programy modelujące podają kilka przewidzianych miejsc cięcia dla polipeptydu o pełnej
30
długości. Jedno z tych miejsc znajdowało się w pozycji N483 (ID. SEKW. Nr 1). W celu wytworzenia
sześciu mutantów delecyjnych primery PCR zostały zaprojektowane w taki sposób, by sukcesywnie
skracać białko od pozycji N483 rozpoczynając skracanie w pozycji Y482 (brak N) i kończąc w pozycji
E477 (brak P).
[0547] a. PROTOKÓŁ
35
[0548] WYTWARZANIE SKRÓCONYCH MUTANTÓW POZBAWIONYCH N483:
[0549] Klon cząsteczki sHASEGP o pełnej długości, z kotwicą GPI, położony między miejscami
restrykcyjnymi NheI i BamHI w wektorze pIRESpuro2 wykorzystano jako matrycę. Matryca ta została
powielona z primerem 5' zawierającym miejsce NheI, które zaczyna się od metioniny natywnego
peptydu sygnałowego w pozycji M1 (ID. SEKW. Nr 14) i z primerem 3' zawierającym miejsce BamHI,
40
kończącym się w pozycji Y482 (ID. SEKW. Nr 8). Produkt PCR naniesiono na 1% żel agarozowy aby
dokonać rozdziału i potwierdzić poprawną wielkość namnożonego prążka. Następnie prążek wycięto z
żelu, oczyszczano, poddano trawieniu enzymami NheI i BamHI i wklonowano do wektora pIRESpuro2
(Clontech) między miejsca restrykcyjne NheI i BamHI. W ten sposób otrzymano wektor ekspresyjny
do ekspresji skróconego mutanta sHASEGP, kończącego się w pozycji N482 i pozbawionego kotwicy
GPI z sekwencją aminokwasową (ID. SEKW. Nr 5 dla sekwencji powstałego polipeptydu sHASEGP
aż do pozycji Y482) i sekwencję nukleotydową (ID. SEKW. Nr 48 – nukleotydy kodujące polipeptydu
5
ID. SEKW. Nr 5) jak oznaczono.
[0550] Wytworzenie innych skróconych mutantów, pozbawionych odpowiednio Y482, F481, I480,
Q479, i P478.
[0551] Zastosowano tą sama strategie z jedyną różnicą polegającą na użyciu dla każdego mutanta
odpowiedniego primera 3'. Odpowiednie mutanty są jak następuje:
10
[0552] 3’ primer dla mutanta sHASEGP, który jest pozbawiony Y482 -ID. SEKW. Nr 9
[0553] 3’ primer dla mutanta, który jest pozbawiony F481-ID. SEKW. Nr 10
[0554] 3’ primer dla mutanta, który jest pozbawiony I480 -ID. SEKW. Nr 11
[0555] 3’ primer dla mutanta, który jest pozbawiony Q479 -ID. SEKW. Nr 12
[0556] 3’ primer dla mutanta, który jest pozbawiony P478 -ID. SEKW. Nr 13
15
[0557] Wytwarzanie dalszych mutantów do wyznaczenia minimalnie aktywnej domeny sHASEGP.
[0558] Dalsze delecje, w blokach po dziesięć aminokwasów, rozpoczynające się od najbardziej
wewnętrznego 3' końca skróconego mutanta sHASEGP aktywnego w obojętnym pH, którym jest
mutant aż do pozycji E477. Primer sensowny z miejscem restrykcyjnym NheI ID. SEKW. Nr 14
zastosowano razem z odpowiednio ulokowanym primerem 3' aby powielić w PCR mutanty delecyjne
20
sHASEGP o pożądanej długości licząc od C-końca. Przykładem jest PCR z wykorzystaniem primerów
opisanych w ID. SEKW. Nr 14 i 26 jako, odpowiednio, 5' i 3' primery, wykorzystano do wytworzenia
polipeptydu o sekwencji ID. SEKW. Nr 49 pod warunkiem, że jest on ekspresjonowany z konstruktu
ekspresyjnego IRESpuro2. Podobnie primery 3' antysensowne opisane w ID. SEKW. Nr
27,28,29,30,31 i 32 wykorzystano do wytworzenia mutantów delecyjnych o końcu odpowiednio w
25
pozycji A 447, S430, G413, S394, A372 i S347 dojrzałej cząsteczki sHASEGP. Produkty PCR w
każdym przypadku trawiono enzymami NheI i BamHI, a produkt trawienia klonowano do wektora
pIRESpuro2 między miejsca restrykcyjne dla NheI i BamHI. Kilka niezależnych klonów z każdej grupy
testowano na obecność sekrecyjnej, aktywnej w obojętnym pH, sHASEGP. Test przeprowadzano po
transfekcji przejściowej komórek CHO w pożywce CD-CHO wolnej od białek surowicy (Invitrogen,
30
CA). Próbki do testu pobierano w wyznaczonym czasie. DNA pochodzący z minipreparacji
bakteryjnych kultur, hodowanych przez noc, został wprowadzony do komórek poprzez transfekcję przy
użyciu odczynnika do transfekcji Genejuice (Novagen, CA) według rekomendowanych przez
producenta protokołów. Aktywność hialuronidazy mierzono w teście mikropłytkowym jak opisano
powyżej.
35
[0559] b. REZULTATY
[0560] W celu zidentyfikowania minimalnie aktywnej w obojętnym pH domeny sekrecyjnej zmierzono
aktywność hialuronidazową skróconych mutantów sHASEGP.
40
Aminokwas od 1 do:
U/ML/24HRS PH7.4
347
0,000
372
0,000
394
0,000
413
0,000
430
0,000
447
0,000
467
0,089
477
0,567
478
0,692
479
0,750
480
0,575
481
0,740
482
0,329
483
0,800
509
0,044
[0561] Uzyskane wyniki wykazały, że wszystkie sześć aminokwasowych mutantów delecyjnych z
jedną mutacją punktową, kończących się we wskazanych pozycjach aminokwasów, tj. w pozycji od
Y482 do E477 posiadało wyższą aktywność sekrecyjną niż sHASEGP z kotwicą GPI.
[0562] Rezultaty wskazały również, że delecje sięgające za pozycję A467 całkowicie eliminowały
5
aktywność sekrecyjną. Sekrecyjna aktywność w obojętnym pH klonów A467 zmniejszyła się do około
10% aktywności klonu P478 lub N483. Stąd wyciągnięto wniosek, że do uzyskania aktywnej w
obojętnym pH domeny o aktywności hialuronidazy, niezbędny jest, jak to wcześniej ustalono na
podstawie enzymu z jadu pszczoły, większy fragment C-końcowej domeny ludzkiej sHASEGP.
Cysteiny w domenie C-końcowej są więc niezbędne dla aktywności w obojętnym pH. Minimalnie
10
aktywną domenę definiuje wąski fragment 10 aminokwasów przed miejscem cięcia GPI w pozycji
N483.
[0563] PRZYKŁAD 5 – WPŁYW MODYFIKACJI PEPTYDU SYGNAŁOWEGO NA AKTYWNOŚĆ
SEKRECYJNEJ sHASEGP.
[564] Ludzka sHASEGP posiada wyjątkowo długi spodziewany natywny peptyd sygnałowy.
15
Dodatkowo, obecność dwóch reszt cysteiny w peptydzie sygnałowym może podczas intensywnej
ekspresji
prowadzić
do
agregacji
multimerów
polipeptydowych
w
obrębie
retikulum
endoplazmatycznego, co spowoduje obniżenie wydajność tej ekspresji. Przetestowano zatem serię
peptydów sygnałowych, które są bardziej skuteczne pod względem zdolności do wzmacniania sekrecji
sHASEGP.
20
[0565] a. PROTOKÓŁ
[566] Peptyd sygnałowy Kappa skonstruowano przez nakładające się etapy przyłączania i wydłużania
reakcji PCR z wykorzystaniem primerów odpowiadających sekwencji SEQ Nr 37, 38, 39 i 40.
Otrzymana sekwencja Kappa została powielona w reakcji PCR z zastosowaniem primerów
zawierających na 5' końcu miejsca cięcia dla enzymów NheI (jak opisano w ID. SEKW. Nr 41) i
25
miejsce EcoRI na 3' końcu (jak opisano w ID. SEKW. Nr 42). Pozwoliło to na wklonowanie peptydu
sygnałowego Kappa (sekwencja polipeptydowa jest opisana w ID. SEKW. Nr 43) do wektora Litmus
39 (NEB) między miejsca restrykcyjne NheI i EcoRI. sHASEGP w obrębie swojej sekwencji posiada
miejsce EcoRI. Dlatego konstrukt Kappa znajdujący się między NheI i EcoRI został powielony z
primerem 5' SpeI (jak opisano w ID. SEKW. Nr 44) i primerem 3'MluI (jak opisano w SEQ Nr 45).
5
sHASEGP bez kotwicy GPI, z terminalnym aminokwasem w pozycji P478, został wycięty z wektora
pIRESpuro2 enzymami NheI i BamHI i wklonowany do wektora Litmus 39 (NEB) w miejsca NheI i
BamHI. Otrzymany wektor Litmus zawierajacy sHASEGP, tj. Litmus-sHASEGP, został poddany
trawieniu enzymami SpeI i MluI, a następnie zligowany z produktem PCR - konstruktem Kappa
powielonym z miejscami restrykcyjnymi SpeI i MluI. Aby utworzyć w wektorze Litmus 39 wspólna
10
ramkę odczytu dla sekwencji sygnałowej Kappa i dojrzałego polipeptydu sHASEGP, przeprowadzono
mutagenezę punktową. Pary primerów odpowiadające ID. SEKW. Nr 34 i 35 użyto do wytworzenia
sekwencji Kappa z natywną Asp jako aminokwasem terminalnym przyłączonym w pozycji F38
sHASEGP (do P 478) (jak opisano w ID. SEKW. Nr 46 dla sekwencji polipeptydu lub białka
fuzyjnego). Inne kombinacje par primerów, jak urzeczywistniono w ID. SEKW. Nr 33 i ID. SEKW. Nr
15
35, użyto do wytworzenia sekwencji sygnałowej Kappa kończącej się terminalną Asp(D) połączoną z
L36 cząsteczki sHASEGP, a parę ID. SEKW. Nr 33 i ID. SEKW. Nr 36 użyto do wytworzenia
sekwencji Kappa zakończonej terminalną Gly (G) (przed terminalną Asp (D)) związaną do
aminokwasu w pozycji L36 sHASEGP. ID. SEKW. Nr 34 z ID. SEKW. Nr 36 zostały użyte do
wytworzenia konstruktu zakończonego sekwencją Kappa na Gly (G)(przed terminalną Asp(D))
20
przyłączona do F38 sHASEGP. Konstrukty Kappa-sHASEGP otrzymane przez mutagenezę
punktową, zostały oczyszczone w żelu, poddane trawieniu restrykcyjnemu enzymem DpnI aby usunąć
jakiekolwiek zanieczyszczenia DNA gospodarza, następnie poddane trawieniu enzymami NheI oraz
BamHI i wklonowane w miejsca cięcia NheI/BamHI szkieletu wektora HisIresPuro2, który posiada
znacznik
25
His-tag (szcześcioaminokwasowy łącznik z sześcioma dodatkowymi histydynami)
wklonowany między miejsce cięcia dla BamHI i NotI w wektorze pIREsPuro2. Stąd po ligacji
otrzymano konstrukt, który odpowiada kombinacji G lub D na końcu sekwencji liderowej Kappa i
pozycji L36 lub F38 na początku dojrzałej sHASEGP. Kilka niezależnych klonów każdego typu
konstruktu wprowadzano drogą transfekcji do komórek CHO hodowanych w pożywce CD-CHO
(Invitrogen, CA) w celu sprawdzenia czy obecność sekwencji liderowej Kappa zwiększałaby ilość
30
sekrecjionowanego białka w porównaniu do ilości sekrecjonowanego białka natywnego. DNA
izolowanym w minipreparacji z całonocnych kultur wprowadzono drogą transfekcji z wykorzystaniem
czynnika do transfekcji Genjuice (Novagen, CA), postępując zgodnie z zaleceniami producenta.
Następnie w określonym czasie pobierano próbki do testów mikropłytkowych. Aktywność
hialuronidazy była mierzona w teście mikropłytkowym jak opisano powyżej.
35
[0567] Konstrukt łańcucha Kappa mysiej IgG sekwencji liderowej sHASEGP testowano pod kątem
wyższego poziomu sekrecjonowania aktywnych sHASGEP działających w obojętnym pH.
[568] b. WYNIKI
Konstrukt ludzkiego genu sHASEGP
U/ML/_24HOURS PH 7.4
Sekwencja liderowa IgG Kappa sHASEGP AA 38-478 3,0257
HIS6
Natywna sekwencja liderowa sHASEGP AA 1-478 0,4857
HIS6
[569] Wyniki testów enzymatycznych wskazują na to, że sekwencja liderowa IgG Kappa była zdolna
do podniesienia poziomu sekrecji sHASEGP około 7 do 8 razy w porównaniu do sekrecji natywnej
sekwnecji liderowej. Inne konstrukty zawierające tą sekwencję z wariantami miejsca fuzji sekwencji
liderowej od Asp do Gly łańcucha Kappa do pozycji L36 lub F38 sHASEGP także dawały wyższy
5
poziom aktywności sekrecjonowanej hialuronidazy działającej w obojętnym pH. Przykłady te maja na
celu raczej poszerzyć niż zawęzić zakres wynalazku, ponieważ inne skuteczne sekwencje liderowe
mogą być także stosowane w opisanej technologii.
[0570] PRZYKŁAD 6
[0571] WYTWARZANIE WEKTORA EKSPRESYJNEGO LUDZKIEJ sHASEGP
10
[0572] sHASEGP bez znacznika epitopu został wytworzony przez wklonowanie do bicistronowej
kasety ekspresyjnej HZ24 (ID. SEKW. Nr 47). Wektor plazmidowy HZ24 do ekspresji sHASEGP
obejmuje podstawową część wektora pCI (Promega), sekwencję DNA kodującą aminokwasy od 1 do
482 ludzkiej hialuronidazy PH20, sekwencję wewnętrznego miejsca wiązania rybosomu (ang. internal
ribosome entry site ,IRES) pochodzącą z wirusa EMCV (Clontech) i gen mysiej reduktazy
15
dihydrofolianowej (DHFR). Szkielet wektora pCI zawiera także DNA kodujące gen oporności na βlaktamazę (AmpR), miejsce f1 rozpoczęcia replikacji, region regulatorowy enhanser/promotor
cytomegalii, chimeryczny intron i pochodzący z wirusa SV40 sygnał poliadenylacji (SV40). DNA
kodujące konstrukt sHASEGP
zawierał sekwencję Kozak położoną przed metioniną natywnej
sekwencji liderowej i kodon stop w pozycji tyrozyny 482. Otrzymany konstrukt pCI-PH20-IRES-DHFR-
20
SV40pa (HZ-24) powstaje w postaci pojedynczej cząsteczki mRNA pod promotorem CMV, która
koduje sekwencję aminokwasów od 1 do 482 PH20 i sekwencję aminokwasów od 1 do 187 reduktazy
dihydrofolianowej oddzielone sekwencją IRES.
[0573] Otwarta ramka odczytu ludzkiej PH20 została powielona na matrycy klonu IOH10647
(Invitrogen, Carlsbad CA) z wykorzystaniem primera 5', w którym znajduje się miejsce restrykcyjne dla
25
NheI i sekwencja konsensusowa Kozak przed metioniną PH20 i z wykorzystaniem primera
antysensownego, który wprowadził za tyrozyną 482 kodon stop oraz miejsce cięcia BamHI.
Otrzymany produkt PCR został poddany trawieniu enzymami NheI i BamHI, a następnie wprowadzony
w warunkach ligacji do plazmidu pIRESpuro2 (Clontech, Palo Alto, CA).
[0574] PRZYKŁAD 7
30
[0575] OTRZYMANIE LINII KOMÓRKOWEJ EKSPRESJONUJĄCEJ sHASEGP
[0576] Nie transfekowane komórki DG44 CHO, rosnące w modyfikowanej pożywce dla komórek CDCHO DHFR(-), uzupełnionej 4mM glutaminą i 18 ml preparatu Plurionic F68/L (Gibco), zostały przed
transfekcją wysiane do butelek przeznaczonych do wytrząsanych hodowli komórkowych w ilości 0,5 x
106 komórek /ml. Komórki hodowano w temperaturze 37oC w wilgotnej atmosferze nasyconej 5% CO2,
35
w inkubatorze przy wytrząsaniu 120 rpm. Rosnące eksponencjalnie, nie transfekowane komórki DG44
CHO, przed transfekcją testowano pod kątem żywotności. 60,000,000 żywych nie transfekowanych
komórek z hodowli DG44 CHO zwirowywano, a pelet zawieszano w taki sposób, by uzyskać gęstość
20,000,000 komórek na 0,7 ml 2 x stężonego buforu do transfekcji (2x HeBS = 40 mM Hepes, pH 7.0,
274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.4 mM Na2HPO4, 12 mM. Dextrose). Do każdej porcji zawieszonych
40
komórek dodawano 0,09 ml linearnej formy plazmidu HZ24 (250 ug), a roztwór komórki/DNA
przenoszono do kuwety elektroporacyjnej (szczelina 0,4 cm BTX Gentronics) w temperaturze
pokojowej. Negatywną kontrolę stanowiły komórki elektroporowane bez DNA. Mieszanina
komórki/DNA elektroporowano warunkach prądowych 330V i 960uF lub przy 350V i 960uF.
[0578] Po elektroporacji komórki przenoszono z kuwety na płytkę 6-dołkową do hodowli komórkowych
i hodowano przez 2 dni w temperaturze 37oC w wilgotnej atmosferze nasyconej 5% CO2, stosując 5
5
ml zmodyfikowanej pożywki dla komórek DHFR(-) uzupełnionej 4 mM glutaminy i zawierającej 18 ml
Plurionic F68/L (Gibco).
[579] Dwa dni po elektroporacji z każdego dołka pobierano 0,5 ml pożywki i testowano pod kątem
aktywności hialuronidazy.
[0580] Początkowa aktywność hialuronidazy w pożywce komórek DG44 CHO transfekowanych HZ24
10
w 40 godz. po transfekcji.
Transfekcja 1 przy 330V
Transfekcja 2 przy 350V
Kontrola negatywna
Rozcieńczenie
1 do 10
1 do 10
1 do 10
Aktywność U/ml
0,25
0,52
0,015
[0581] Komórki transfekowane w warunkach prądowych przy 350V (transfekcja 2) zbierano z dołka,
liczono i rozcieńczano do stężenia 10,000-20,000 żywych komórek na 1 ml. 0,1 ml porcji zawiesiny
komórkowej przenoszono do każdego z pięciu dołków na 96-dołkowej okrągłodennej płytce. 0,1 ml
15
pożywki dla CD-CHO (Gibco) zawierające 4 mM Glutamaxu-1, bez hipoksantyny i tymidyny dodawano
do każdego dołka z komórkami (objętość końcowa 0,2 ml).
[0582] Z hodowli w obecności metotreksatu prowadzonej na 5 płytkach otrzymano dziesięć klonów.
ID płytka/dołek
1C3
2C2
3D3
3E5
3C6
2G8
1B9
2D9
4D10
1E11
A1 kontrola (+)
H12 kontrola (-)
20
Relatywna aktywność hialuronidazy
261
261
261
243
174
103
304
273
302
242
333
0
[0583] Sześć klonów transfekowanych HZ24 namnożono i przeniesiono w postaci jednokomórkowej
zawiesiny do butelek do wytrząsania. Klony 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11 i 4D10 wysiano na
okrągłodenną płytkę 96-dołkową stosując dwukierunkową strategię rozcieńczania. Rozcieńczone
klony rosły na podłożu nie transfekowanych DG44 CHO (500 komórek na dołek) w celu zapewnienia
niezbędnych czynników wzrostowych w czasie pierwszych dni hodowli. Dla każdego z 10 klonów
25
przygotowano 10 płytek.
[0584] Klon 3D3 utworzył 24 widoczne klony. Aktywność hialuronidazy zmierzono w supernatancie 8
spośród 24 subklonów (> 50 U/ml). Wymienione 8 klonów namnożono w butelkach do hodowli T-25 w
obecności 50 nM metotreksatu. Klon 3D3, hodowany w obecności 5 nM metotreksatu namnażano
następnie w obecności 500 nM metotreksatu, selekcjonując w ten sposób klony produkujące ponad 1
30
000 U/ml w butelkach do wytrząsania (klon 3D3 5M).
[0585] PRZYKŁAD 8
[0586] PRODUKCJA sHASEGP
[0587] Probówka zamrożonych komórek klonu 3D3 5M została rozmrożona, a komórki namnożone w
5
butelkach typu spinner flask w 1L CHO CDM (Invitrogen, Carlsbad CA) uzupełnionym 100 nM
metotreksatem i Glutamaxem (Invitrogen). Komórki przeniesiono z naczyń typu spinner flask do 5L
5
bioreaktora (Braun) w innoculum o gęstości 4 x 10 żywych komórek/ml. Wartości parametrów
początkowych wynosiły: 37oC, pH 7,2 i 25% rozpuszczonego tlenu i napowietrzanie 0 -100 cc/min. Po
168 godz. dodawano pierwszą porcję pożywki (zasilenie 1, 250 ml ) (CD CHO + 50g/L glukozy). Po
10
216 godzinach hodowli dodawano drugą porcję pożywki (zasilenie 2, 250 ml ) (CD CHO + 50g/L
glukozy + 10 mM maślanu sodu). Ostatecznie otrzymano 1600 U/ml przy maksymalnej gęstości
komórek 6 milionów/ml. Dodatek maślanu sodu spowodował silny wzrost produkcji sHASEGP w jej
końcowych etapach.
Wzrost klonu 3D3-5N i produkcja sHASEGP, bioreaktor o pojemności 5L
Godziny
wzrostu
0
24
48
72
96
120
144
15
Ilość żywych
% żywych
komórekx10
komórek
E5
4,4
100
5,7
100
10,1
100
17,1
99
28,6
99
28,8
99
60,2
100
U/ml
Obj.(mL)
[Glukoza]
0
0
37
62
118
240
423
4500
4500
4500
4500
4500
4500
4500
547
536
501
421
325
274
161
168
55
100
478
4500
92
192
66,6
98
512
4750
370
216
55,2
92
610
4750
573
240
53
88
710
5000
573
264
49,8
84
852
5000
474
288
312
336
40
31
25,4
70
61
52
985
1467
1676
5250
5250
5250
770
773
690
Dodatek substancji
odżywczych
250ml substancji
odżywczych
zasilenie 1
250ml substancji
odżywczych
zasilenie 2
250ml substancji
odżywczych
zasilenie 2
[0588] PRZYKŁAD 9
[0589] OCZYSZCZANIE sHASEGP
[0590] Kondycjonowana pożywka z klonu 3D3 była klarowana metodą głębokiej filtracji i diafiltracji z
przepływem stycznym w buforze Hepes pH 7.0. Rozpuszczalną sHASEGP oczyszczano w
20
sekwencyjnej chromatografii na jonowymiennym złożu Sepharose Q (Pharmacia), następnie w
chromatografii oddziaływań hydrofobowych na złożu fenylo-Sepharose (Pharmacia), w chromatografii
na złożu boronianu fenylu (Prometics) w chromatografii na złożu hydroksyapatytowym (BioRad,
Richmond, CA).
[591] sHASEGP wiązano do złoża typu Sepharose Q i eluowano 400 mM NaCl w tym samym buforze.
25
Eluat rozcieńczano 2M siarczanem amonu do końcowego stężenia 500 mM AsO4 i przepuszczano
przez kolumnę ze złożem fenylo-Sepharose (o niskiej substytucji), a następnie wiązano do kolumny ze
złożem z boronianem fenylu. Po etapie płukania buforem z 50mM bicyną bez AsO4 w pH 9,0,
sHASEGP wymywano ze wspomnianej kolumny w buforze Hepes o pH 6.9. Eluat nanoszono na
ceramiczne złoże hydroksyapatytowe w 5mM PO4 z 1 mM CaCl2 przy pH 6.9 i eluowano 80 mM PO4 z
5
1 mM CaCl2 przy pH 7,4.
[0592] Oczyszczona sHASEGP posiadała specyficzną aktywność wynoszącą ponad 65,000 USP/mg
białka oznaczoną testem turbidymetrycznym, stosując standardy USP. Oczyszczoną sHASEGP
wymywano z kolumny ze złożem 5RPC styrenodiwinylobenzenowym jako pojedynczy pik od 24 do 26
min. w gradiencie między 0,1% TFA/H2O do 0,1% TFA/90% acetonitryl/10% H2O i rozdzielono jako
10
pojedynczy szeroki prążek o masie 61 kDa w elektroforezie z SDS. Po traktowaniu PNGazą-F masa
prążka wynosiła 52 kDa. Sekwencjonowanie aminokwasów N-końca wykazało, że sekwencja
sygnałowa została skutecznie usunięta.
[0593] Sekwencja aminokwasowa N-końca oczyszczonej sHASEGP.
15
Pozycja
1
2
3
4
5
6
7
8 9 10 11
Teoretycznie Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn
Zaobserwowana - Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn
[0594] PRZYKŁAD 10
[0595] ANALIZA GLIKOZYLACJI sHASEGP WYTWARZANEJ W KOMÓRKACH DG44 CHO
[0596] Istnieją sprzeczne dane na temat tego czy sHASEGP pochodząca z różnych gatunków
wymaga glikozylacji dla swojej katalitycznej aktywności. Na przykład pokazano, że enzymatycznie
20
aktywna hialuronidaza z jadu pszczelego może być syntezowana w komórkach, które nie posiadają
maszynerii niezbędnej do glikozylacji np. takich jak E. coli. Ponadto potraktowanie PGNazą
oczyszczonej hialuronidazy z jąder wołowych nie powodowało inaktywacji enzymu (Yamagata et al
1997). Inne badania donoszą o utracie aktywności w wyniku deglikozylacji i o tym, że dodatkowo
wymagane są wiązania dwusiarczkowe.
25
[0597] Ponieważ wszystkie te testy były jednak wykonywane na surowych lub częściowo
oczyszczonych preparatach, nie jest do końca jasne, czy utrata aktywności była wynikiem obecności
w teście deglikozylowanego enzymu czy też zawartych w zanieczyszczeniach surowych preparatów
proteaz lub bezpośredniej zależności między glikozylacją a aktywnością enzymatyczną.
[0598] a. PROTOKÓŁ
30
[0599] Aby sprawdzić czy funkcjonalna N-glikozylacja może zostać wprowadzona do ludzkiej
sHASEGP z wykorzystaniem systemu ekspresyjnego opartego na komórkach CHO w warunkach
wolnych od białek, cDNA kodujące ludzką sHASEGP-HIS6 było ekspresjonowane, z wykorzystaniem
bicistronowej kasety IRESpuro, w komórkach CHO hodowanych w zdefiniowanych pod względem
chemicznym podłożach. Komórki hodowano w pożywce CHO CDM (Invitrogen/Gibco) przez 72 godz.,
35
a następnie zagęszczano i filtrowano używając membrany Pellicon TFF (Millipore) o limicie
przepuszczalności 30 kDa. Bufor koncentratu wymieniono na 10 mM Hepes pH 7.4, 50 mM NaCl.
Przefiltrowany koncentrat nanoszono następnie na złoże DEAE-sefaroza i wymywano w gradiencie 0
– 1 M NaCl na złożu firmy Pharmacia przeznaczonym do FPLC. Elucja ludzkiej sHASEGP
następowała przy stężeniu 10 – 30% NaCl. Zawartość sHASEGP we frakcjach z kolumny wskazywało
40
na to, że przy stężeniu soli 10 – 30% NaCl odzyskiwano większość enzymu. Frakcje zawierające
enzym, zebrane przy stężeniu soli 10 – 30% były następnie oczyszczane przy pomocy chromatografii
powinowactwa na jonowymieniaczu Ni-IMAC. Ludzką sHASEGP, po przemyciu, wymywano ze złoża
IMAC 10 mM imidazolem z 50 mM octanem pH 5.0. Białko zagęszczano i dializowano w buforze
wobec 10 mM HEPES pH 7.4. Aktywność enzymatyczna tak wysoko oczyszczonego enzymu,
5
zmierzona w teście mikromiareczkowania ELISA opartym na wykorzystaniu biotynylowanych
substratów, wynosiła 97 000 U/mg białka w obecności 1mM jonów wapnia i 1mg/ml HSA.
[0600] W celu identyfikacji zmian względnej masy cząsteczkowej białka, oczyszczoną ludzką
sHASEGP traktowano przez noc PNGazą lub neuraminidazą a następnie elektroforezie w żelu,
elektrotransferowi i reakcji western-blot z zastosowaniem przeciwciała monoklonalnego anty-His6
10
skoniugowanego z HRP (Qiagen) i detekcji ECL.
[0601] b. WYNIKI
[0602] Analiza western-blot wykazała, że ludzka sHASEGP produkowana w komórkach CHO była
wrażliwa na działanie PNGazy. Względna masa cząsteczkowa takiej ludzkiej sHASEGP wskazywała,
że białko to było uprzednio wysoko glikozylowane. W wyniki całonocnego trawienia PNGazą,
15
otrzymano jedną populację ludzkiej sHASEGP co wskazywało na to, że mała heterogenność białka w
obrębie prążka zawierającego preparat kontrolny (nietrawiony PNGazą) mogła być wynikiem
obecności połączonych przez atom N ugrupowań cukrowych. Częściowe trawienie glikoproteiny
PNGazą F prowadziło do powstania serii produktów pośrednich migrujących w żelu od pozycji
odpowiadającej białku nie traktowanemu PNGazą F do dalszych pozycji w zależności od czasu
20
trawienia. Mimo iż prążki w 7% żelu były rozdyfundowane, można było dostrzec przynajmniej 6
różnych pośrednich izoform.
[0603] Traktowanie sHASEGP neuraminidazą wykazało, że komórki CHO faktycznie są zdolne do
syntezy usjalowanej ludzkiej sHASEGP. W wyniku traktowania sHASEGP neuraminidazą i analizie
białka przy pomocy techniki western-blot z użyciem 7% żelu, syntezowana przez komórki CHO ludzka
25
sHASEGP wykazywała spowolnienie migracji w żelu rzędu około 1 – 3 kDa w porównaniu z
sHASEGP kontrolna (nietraktowana enzymem). Tym samym jest to więc pierwsze doniesienie o
otrzymaniu w znacznym stopniu usjalowanej sHASEGP. Usjalowanie ma istotne znaczenie zarówno
dla stabilności jak i podwyższenia okresu półtrwania ludzkiej sHASEGP, tymczasem znajdująca się w
spermie wielu gatunków sHASEGP nie jest usjalowana i nie reaguje z lektynami rozpoznającymi
30
kwasy sjalowe.
[0604] Analiza sHASEGP techniką FACE
[0605] Analiza glikanów aktywnej sHASEGP techniką FACE pozwala na szybkie określenie profilów
katalitycznie aktywnych glikoprotein sHASEGP.
[0606] PROTOKÓŁ
35
[0607] Oczyszczoną hialuronidaza ekspresjonowna w klonie 3D3 5M analizowano za pomocą
profilowania N-glikanów metodą FACE (Prozyme). Glikany były uwalniane z glikoprotein (128.7 pg)
w wyniku traktowania N-glikanazą (opisywaną skrótem PNGaza), znakowane fluoroforem ANTS i
rozdzielone przy użyciu elektroforezy. Względne pozycje prążków odpowiadającym glikanom
wyznaczano przeprowadzając rozdział próbki i jej rozcieńczeń równolegle z rozdziałem standardów ze
40
znanymi pozycjami migracji wyrażanymi w jednostkach „stopnia polimeryzacji” (DP)
[0608] WYNIKI
[0609] Profil uwolnionych N-glikanów danej próbki hialuronidazy obejmował dziesięć prążków, z
których sześć (migrujących w żelu w pozycjach odpowiadających prążkom standardów G5 – G12)
posiadało intensywność większa niż 9%. Dodatkowo, prążek migrujący równolegle ze standardem G9
był prążkiem najintensywniejszym – 35% - 46%.
5
[0610] sHAS
[0611] Analiza glikanów EGP.
glikan z sHASEGP Stopień Polimeryzacji Zawartość procentowa
1
15,64
1,2
2
13,68
3,4
3
11,61
10,0
4
10,04
10,4
5
8,37
35,4
6
7,32
9,7
7
6,14
9,0
8
5,57
12,4
9
3,84
2,3
10
3,26
0,5
[0612] PRZYKŁAD 11
[0613] ZALEŻNOŚĆ AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ OD N-GLIKOZYLACJI sHASEGP
10
[0614] a. PROTOKÓŁ
[0615] Próbki oczyszczonej sHASEGP znakowanej His6 zmieszano z buforem zawierającym
neuraminidazę i PNGazę oraz dodatkowo dodatek lub brak 50 mM oktaglukozydu (OG) i inkubowano
przez noc w 37
C. Trawienie oligosacharydów identyfikowano poprzez opóźnienie migracji w żelu
analizowane techniką western-blot.
15
[0616] b.
[0617] WYNIKI
PRÓBKA
U/ML
Bez Rx
22,01
Neuraminidaza O/N 50mM OG
23,57
PNGaza F z 50mM OG
0,0
PNGaza F bez 50mM OG o/n
10,74
[0618] PRZYKŁAD 12
[0619] AKTYWNOŚĆ sHASEGP WZGLĘDEM SIARCZANOWANYCH I NIESIARCZANOWANYCH
20
GLIKOZOAMINOGLIKANÓW
[0620] Poza testem opartym na mikromiareczkowaniu z użyciem HA, specyficzność substratowa
sHASEGP względem innych glikozoaminoglikanów lub proteoglikanów może być badana w teście
spowolnienia migracji w żelu z wykorzystaniem oczyszczonych substratów. Wiele testów na
aktywność hialuronidazy oparto na pomiarach obecności nowopowstałych redukujących grup N-
25
acetyloaminowych (Bonner and Cantey, Clin. Chim. Acta 13: 746-752, 1966) lub na pomiarach spadku
lepkości (De Salegui et al., Arch. Biochem. Biophys. 121: 548-554, 1967) lub zmętnienia (Dorfinan
and Ott, J. Biol. Chem. 172: 67, 1948). Wszystkie te metody są wydajne w przypadku oznaczania
obecności lub braku aktywności endoglukozoaminidazowej w stosunku do oczyszczonych substratów.
[0621] a. PROTOKÓŁ
[0622] TEST SPOWOLNIENIA MIGRACJI W ŻELU - Glikozoaminoglikany miesza się z
rekombinowaną sHASEGP w celu zbadania jej aktywności endoglukozoaminidazowej, która objawia
się wzrostem zwiększonej mobilności substratem w żelu. Siarczan chondroityny A, agrekan i D
pochodziły z firmy Calbiochem. Hialuronian (pępowina ludzka), siarczan chondroityny C, siarczan
5
dermatanu, siarczan heparanu pochodziły z firmy Calbiochem. Hialuronian z ludzkiej pępowiny
uzyskano z ICN. Każdy testowany substrat rozcieńczano do stężenia 0.1 mg/ml. Próbki oczyszczonej
sHASEGP lub kondycjonowane media od komórek ekspresjonujących sHASEGP, o objętości 10 µl,
mieszano z 90 µl testowanego substratu w odpowiednim buforze i inkubowano przez 3 godz. w 37 °C.
Po inkubacji, próbki neutralizowano buforem do prób (Tris-EDTA, pH 8.0, błękit bromofenolowy i
10
glicerol)
i
poddawano
rozdziałowi
w
elektroforezie
na
15%
żelu
poliakryloamidowym.
Glikozoaminoglikany identyfikowano przez barwienie żelu przez noc 0.5% roztworem barwnika Alcian
Blue w 3% lodowatym kwasie octowym, a następnie odbarwienie 7% lodowatym kwasem octowym.
Poziom degradacji oznaczano przez porównanie mobilności substratu w obecności i przy braku
enzymu.
15
[0623] b. WYNIKI
[0624] Białko sHASEGP-His6 w ilości 100 U/10 µl w 90 µl 10 mM buforu HEPES, zawierającego 50
µg/ml albuminy surowicy ludzkiej i 10 µg różnych glikozoaminoglikanów i proteoglikanów, inkubowano
przez 2 godz. w 37 °C. Rozdział elektroforetyczny i przeprowadzone po nim barwienie barwnikiem
Alcian Blue pokazały przyspieszoną migrację w przypadku chondroityny A, C i D, agrekanu i
20
hialuronianu, natomiast nie dotyczyła ona ani siarczanu heparanu ani siarczanu chondroityny B.
Podczas gdy niestrawione glikozoaminoglikany migrowały w środku żelu w sposób rozmazany,
strawione produkty stanowiły większość wybarwionych Alcian blue prążków migrujących razem z
frontem barwnika wraz z małą ilością dodatkowego materiału migrującego jako tzw. ang. „incremental
ladder”.
25
[0625] PRZYKŁAD 13 – WPŁYW JONÓW METALI NA AKTYWACJĘ sHASEGP
[0626] Poza wymaganą dla aktywności enzymatycznej sHASEGP glikozylacją, wykazano, że dla
swojej optymalnej aktywności enzymatycznej ludzka sHASEGP dodatkowo jest aktywowana
kationami. Pokazano, że po kolejnych etapach oczyszczania sHASEGP przy użyciu chromatografii
wykazywała ona niską aktywność. Glikoproteina sHASEGP znakowana tzw. His6 posiadała bardzo
30
niską specyficzną aktywność kiedy była oczyszczana na złożu DEAE, a następnie kolejne etapy
oczyszczania na złożu Ni-IMAC. Ponieważ złoże IMAC chelatuje jony metali, różne metale były z
powrotem dodawane do sHASEGP aby określić jej względną aktywność enzymatyczną.
[0627] a. PROTOKÓŁ
[0628] Oczyszczoną sHASEGP inkubowano 2 godz. w temperaturze pokojowej z 0.1 mM niklem (Ni),
35
kobaltem (Co), cynkiem (Zn), wapniem (Ca) i magnezem (Mg), a następnie badano jej aktywność
przez określenie aktywności hialuronidazowej przy użyciu testu opartego na mikromiareczkowaniu.
[0629] b. WYNIKI
Dodatek soli metalu Aktywność enzymu w obojętnym pH [U/ml]
Brak dodatków
11,909
6,0306
100 µM Ni
8,972
100 µM Co
3,7476
100 µM Zn
101,9892
100 µM Ca
[0630] Znaczny wzrost aktywności hialuronidazowej obserwowano po inkubacji sHASEGP z 0.1 mM
wapniem lub 0.1 mM magnezem. Tego typu aktywacji nie obserwowano podczas inkubacji enzymu z
innymi metalami. Dodanie wapnia do sHASEGP zwiększało specyficzna aktywność o około 97 000 U
5
na mg białka, co zmierzono przez pomiar absorbancji przy długości fali 280 nm. Następnie określono
zależność tej aktywności od dawki wapnia lub magnezu w celu ustalenia optymalnego dla enzymu
stężenia tych jonów.
Podwójnie naładowany metal
[mM]
100
10
1
0.1
0.01
0.001
0.0001
0.00001
2+
2+
[Ca ]
[Mg ]
1
108
169
123
59
47
39
55
1.3
104
164
78
18
13
13
15
[0631] Okazało się, że do aktywacji sHASEGP dochodzi przy stężeniu na poziomie mikromolarnym.
10
Stężenie zarówno jonów wapnia jak i magnezu powyżej 10 mM wykazywało działanie hamujące. Aby
wykluczyć sytuację, że niespecyficznie mógł być aktywowany raczej substrat niż enzym, CaCl2 w 10
mM buforze HEPES inkubowano na płytce do mikromiareczkowania z immobilizowanym
biotynylowanym substratem, a następnie płytkę przemywano. Kiedy do takiej płytki dodano enzym, nie
obserwowano żadnej aktywacji. Taka aktywacja była również testowana z użyciem natywnej
15
sHASEGP uwalnianej fosfolipazą C, która to wykazywała podobną podatność na aktywację wapniem,
co wykluczyło możliwość wystąpienia artefaktów związanych C-końcem znacznika His6.
[0632] PRZYKŁAD 14
[0633] WPŁYW ALBUMINY NA AKTYWNOŚĆ sHASEGP
[0634]
20
Odkryto,
że
dla
optymalnej
aktywności
enzymu,
przy
sporządzaniu
rozcieńczeń
rekombinowanej rHUPH20 i innych preparatów hialuronidaz z jąder wołowych, wymagany jest
dodatek albuminy.
[0635] a. PROTOKÓŁ
[0636] Albuminę surowicy ludzkiej (ICN) rozcieńczono w buforze 10 mM HEPES z wapniem aby
określić efekty albuminy na aktywność enzymatyczną. Przeprowadzono testy enzymatyczne z
25
sHASEGP i komercyjnymi preparatami używając zarówno 1 mM CaCl2 jak i 1 mg/ml albuminy
surowicy ludzkiej.
[0637] b. Wyniki
[0638] Aktywacja aktywności hialuronidazy następowała przy dużych rozcieńczeniach albuminy. Nie
było jasne czy ta aktywacja była wynikiem zapobiegania procesowi denaturacji lub czy albumina
30
wpływała na dostęp substratu. Korzystna formulacja ludzkiej sHASEGP mogłaby w takim razie
zawierać albuminę i sól metalu składającą się zarówno z wapnia lub magnezu.
[0639] PRZYKŁAD 15 – ROZSZERZONA AKTYWNOŚĆ IN VIVO OCZYSZCZONEJ sHASEGP
[0640] a. PROTOKÓŁ
[0641] Oczyszczoną sHASEGP w 10 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1 % Pluronic rozcieńczono
35
do stężenia 0.5U/ l w apyrogennej wodzie z dodatkiem 0.15 M NaCl. W celu podania całkowitych
dawek w ilości 0.01, 0.05, 0.1 U na wstrzyknięcie, wykonano serie rozcieńczeń w całkowitej objętości
20
l soli fizjologicznej. Następnie do roztworów dodano 20
objętości 40
l roztworu Trypan Blue do całkowitej
l i wstrzyknięto podskórnie w okolicy obu boków myszom
Nu/Nu
BALB/c znieczulonym
wcześniej przez podanie dootrzewnowe ketaminy/ksylazyny. Obszary zabarwienia mierzono w dwóch
5
wymiarach przy pomocy mikrosuwmiarki w czasie t=0 do t=45 min. Wielkość obszaru wyrażono w
mm2. Jako kontrolę wykorzystano rekombinowaną ludzką HYAL1, która nie posiada aktywności w
obojętnym pH, ale jest białkiem sekrecyjnym.
[0642] b. Wyniki
TESTOWANY SKŁADNIK
A, Kontrola – sól fizjologiczna
B, sHASEGP - 0,01 U
C, sHASEGP - 0,05 U
D, sHASEGP - 0,10 U
E, HYAL1 - 100 U
10
OBSZAR BARWNIKA @ 45 MIN,
51,5 mm2
76,8 mm2
98,22 mm2
180,4 mm2
67,48 mm2
[0643] PRZYKŁAD 16 – KINETYKA AKTYWNOŚCI DYFUZYJNEJ sHASEGP
[0644] a. PROTOKÓŁ
[0645] Rekombinowaną oczyszczoną sHASEGP-His6 podzielono na dwie porcje. Jedną ogrzewano w
95 °C przez 15 min w termocyklerze z ogrzewaną pokrywą. Drugą porcję pozostawiono w
temperaturze pokojowej. Termiczną inaktywację enzymu sprawdzano w teście enzymatycznym
15
opartym na mikromiareczkowaniu. Przeprowadzono analizę kinetyczną porównując materiał
termicznie inaktywowany z materiałem natywnym. Oczyszczony sHASEGP lub odpowiadający mu
materiał termicznie inaktywowany wstrzykiwano podskórnie w ilości 4 U razem z barwnikiem Trypan
blue. Obszar zabarwienia mierzono w różnych punktach czasowych aż do 15 min.
[0646] b. WYNIKI
20
sHASEGP [4 U]
tminuty po wstrzyknięciu
t0 = 52,38
t3 = 116,51
t6,5= 181,93
t10= 216,96
t16= 279,99
sHASEGP [4 U]
(ENZYM INAKTYWOWANY TERMICZNIE)
tminuty po wstrzyknięciu
t0 = 50,58
t3 =65,48
t6,5 =63,87
t10 =65,80
t16 =74,3
[0647] PRZYKŁAD 17 – ODBUDOWANIE BARIERY SKÓRNEJ PRZERWANEJ PRZEZ sHASEGP
[0648] a. PROTOKÓŁ
[0649] W celu wyznaczenia czasu regeneracji porów otwartych w wyniku podskórnego podania
25
sHASEGP, 2 jednostki oczyszczonej sHASEGP lub soli fizjologicznej jako kontroli wstrzykiwano
podskórnie zwierzętom w dwa przeciwległe boki w czasie t=0. Następnie w to samo miejsce
podawano trypan blue, w czasie t=30 min., t=60 min. i t=24 godz. Obszar dyfuzji barwnika mierzono
15 min. po podaniu dla każdego punktu czasowego i porównywano z wartościami otrzymanymi dla
kontroli.
30
[0650] b. WYNIKI
2 JEDNOSTKI
tilość godzin po iniekcji sHASEGP
t0.5h= 183
t1h= 167
t22h = 61
KONTROLA – SÓL FIZJOLOGICZNA
tilość godzin po iniekcji sHASEGP
t0.5h= 54
t1h = 50
t22h= 48
[0651] Otrzymane wyniki pokazały, że bariera skórna powraca do stanu pierwotnego w ciągu 24 godz.
od podania 2 jednostek enzymu.
[0652] PRZYKŁAD 18 – POMIAR ROZMIARU KANAŁÓW OTWARTYCH PRZEZ sHASEGP
5
[0653] Pokazano, że ludzka sHASEGP otwiera kanały w przestrzeni śródmiąższowej w stopniu
wystarczającym, aby umożliwić dyfuzje związków drobnocząsteczkowych, takich jak Trypan Blue.
Jednakże nie było wiadomo, jakie są górne granice rozmiaru cząsteczek, które mogą dyfundować w
obecności sHASEGP.
[0654] a. PROTOKÓŁ
10
[0655] W celu pomiaru rozmiaru kanałów otwartych przez ludzką sHASEGP wykorzystano cząsteczki
fluorescencyjne o różnych rozmiarach: fluorescencyjne dekstrany o średniej masie cząsteczkowej 4
400 i 2 mln Da (Sigma), jak również znakowane fluoresceiną kuleczki o zdefiniowanej średnicy od 20
nm do 500 nm (Molecular Probes). Cząstki te podawano podskórnie w objętości 40 µl, po czym w to
samo miejsce wstrzykiwano sHASEGP lub kontrolę w postaci soli fizjologicznej. Obszar czoła
15
barwnika był następnie mierzony w dwóch wymiarach w 15 min. od wstrzyknięcia.
[0656] b. WYNIKI
Czynnik dyfuzyjny
sHASEGP
Kontrola
sHASEGP
Kontrola
sHASEGP
Kontrola
sHASEGP
Kontrola
sHASEGP
Kontrola
sHASEGP
Kontrola
Rozmiar cząsteczek
użytych do testu dyfuzji
4400 Da
4400 Da
2 x 106 Da
2 x 106 Da
20 nm średnicy
20 nm średnicy
100 nm średnicy
100 nm średnicy
200 nm średnicy
200 nm średnicy
500 nm średnicy
500 nm średnicy
Obszar w 15 min,
Odchylenie standardowe
84,2
38,0
141,2
51,7
92,3
51,6
61,0
40,0
35,5
27,9
44,8
41,2
25,7
5,8
4,5
8,1
20,6
3,0
5,7
7,0
1,6
8,2
13,6
9,8
[0657] Otrzymane wyniki pokazują, że cząsteczki o rozmiarach od około 1 kDa (Trypan Blue) do 50
nm średnicy (kuleczki lateksowe) pokazały zwiększona dyfuzję w wyniku podania sHASEGP. Podczas
20
gdy albumina surowicy wołowej (66 kDa) charakteryzowała się podobna kinetyką dyfuzji co Trypan
Blue, to kuleczki lateksowe o średnicy 50 nm potrzebowały znacznie więcej czasu na dyfuzję. Kuleczki
o rozmiarach 500 nm nie dyfundowały aż do 480 min.
[0658] PRZYKŁAD 19 – PROFILE FARMAKOKINETYCZNE PRZECIWCIAŁ BIOTYNYLOWANYCH
W SUROWICY PO RÓWNOLEGŁYM PODSKORNYM WSTRZYKNIECIU LUDZKIEJ sHASEGP
25
[0659] a. PROTOKÓŁ
[0660] Samice myszy BALB/c znieczulano mieszaniną ketaminy i ksylazyny. Myszom wstrzykiwano
podskórnie 20 µl 0.5 mg/ml roztworu biotynylowanych mysich IgG zmieszanych z 20 µl soli
fizjologicznej lub 20 µl sHASEGP w ilości odpowiadającej 4 U aktywności.
[0661] b. WYNIKI
CZAS PO INIEKCJI
surowicze IgG t=0 godz.
surowicze IgG t=2 godz.
surowicze IgG t=51 godz.
KONTROLA
0 ng/ml
0 ng/ml
4152 ng/ml
sHASEGP (4 U)
0 ng/ml
360 ng/ml
4176 ng/ml
[0662] Wyniki pokazują, że sHASEGP polepsza kinetykę dystrybucji dużych cząsteczek w surowicy.
Podczas gdy w 2 godz. po iniekcji nie identyfikowano biotynylowanych IgG w grupie kontrolnej,
5
stężenie przeciwciał w grupie, której podawano sHASEGP wynosiło 360 ng/ml.
[0663]
PRZYKŁAD
20
-
AKTYWNOŚĆ
ROZPRZESTRZENIANIA
SIĘ
CZĄSTECZEK
WSTRZYKIWANYCH PODSKÓRNIE PO UPRZEDNIM DOŻYLNYM WSTRZYKNIĘCIU LUDZKIEJ
sHASEGP.
[0664] a. PROTOKÓŁ
10
[0665] Barwnik wstrzykiwano w czterech miejscach, a każde z nich używane było dla każdej dawki
testowanego składnika i nośnika kontrolnego. Wstrzykniecie barwnika następowało 45 min. po
dożylnej iniekcji. Każda dawka składnika testowego lub składnika kontrolnego podawana była dożylnie
dwóm zwierzętom. Pomiaru obszaru czoła barwnika po 45 min. od podania enzymu dokonywano w
2.5, 5, 10 i 15 min. dla każdej dawki lub kontroli w postaci nośnika.
15
[0666] b. WYNIKI
[0667] Wyniki pokazują, że wysoko oczyszczona sHASEGP była dostępna ogólnoustrojowo w
dalszych tkankach po podaniu dożylnym. Aktywność rozprzestrzeniania się ogólnoustrojowo
podawanej sHASEGP była zależna od dawki. Nie obserwowano różnic między nośnikiem kontrolnym
a wstrzyknięciem sHASEGP w dawce 10 U.
20
Typ
Dawka IV
Czas [minuty]
PH20
PH20
PH20
PH20
PH20
PH20
PH20
PH20
PH20
PH20
PH20
PH20
PH20
PH20
PH20
PH20
PH20
PH20
PH20
PH20
Kontrola
Kontrola
Kontrola
Kontrola
1000
1000
1000
1000
300
300
300
300
100
100
100
100
30
30
30
30
10
10
10
10
0
0
0
0
2,5
5
10
15
2,5
5
10
15
2,5
5
10
15
2,5
5
10
15
2,5
5
10
15
2,5
5
10
15
Średnie
pole
powierzchni (mm2)
86,417
102,17
124,53
129,81
59,137
73,638
87,092
92,337
56,308
63,156
10 76,519
77,432
50,534
59,493
68,102
71,118
36,4
39,859
45,649
48,41
34,652
36,279
44,687
53,002
Odchylenie
standardowe
2,834193
2,221146
6,304944
1,434319
7,218615
7,51197
8,686008
10,66466
7,741934
11,42052
16,18449
17,32264
10,64287
5,163971
11,00071
9,934212
3,807072
6,680932
4,44936
6,546835
5,935037
3,614544
5,821216
2,812439
Wykaz sekwencji
[0668]
<110> DeliaTroph Pharmaceuticals, Inc.
Frost, Gregory
Kundu, Anirban
Bookbinder, Louis
<120> Rozpuszczalna glikoproteina o aktywności hialuronidazy (SHASEGP), proces preparacji
taki sam, jej zastosowania i kompozycja farmaceutyczna
<130> DELIA1340WO
<150> US 60/452,360
<151> 2003-03-05
<160> 53
<170> FastSEQ dla wersji Windows 4.0
<210> 1
<211> 509
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARBOHYD
<222> 82, 166, 235, 254, 368, 393, 490
<400> 1
<210> 2
<211> 35
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 474
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 448
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 482
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
<210> 6
<211> 1530
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(1530)
<223> PH-20 Glikoproteina o aktywności hialuronidazy zakotwiczona przez GPI
<400> 6
<210> 7
<211> 509
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARBOHYD
<222> 82, 166, 235, 254, 368, 393, 490
<400> 7
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213>Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowny z miejscem cięcia dla enzymu BamHI na 5’ końcu, do
wytwarzania kotwicy GPI z delecją od pozycji N483, której sekwencja kończy się w pozycji
Y482.
<400> 8
aattggatcc tcagtagaaa atttgaggtt cttc 34
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowny z miejscem cięcia dla enzymy BamHI na 5’ końcu, do
wytwarzania kotwicy GPI z delecją od pozycji Y482, której sekwencja kończy się w pozycji
F481
<400> 9
aattggatcc tcagaaaatt tgaggttctt ctg 33
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowny z miejscem cięcia dla enzymu BamHI na 5’ końcu, do
wytwarzania kotwicy GPI z delecją od pozycji F481, której sekwencja kończy się w pozycji
1480
<400> 10
aattggatcc tcaaatttga ggttcttctg tctc 34
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowny z miejscem cięcia dla enzymy BamHI na 5’ końcu, do
wytwarzania kotwicy GPI z delecja od pozycji 1480, której sekwencja kończy się w pozycji
Q479
<400> 11
aattggatcc tcattgaggt tcttctgtct cc 32
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowany z miejscem cięcia dla enzymy BamHI na 5’ końcu, do
wytwarzania kotwicy GPI z delecją od pozycji Q479, której sekwencja kończy się w pozycji
P478
<400> 12
aattggatcc tcaaggttct tctgtctcca tg 32
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowny z miejscem cięcia dla enzymy BamHI na 5’ końcu do
wytwarzania kotwicy GPI z delecją od pozycji P478, której sekwencja kończy się w pozycji
E477
<400> 13
aattggatcc tcattcttct gtctccatgg g 31
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer sensowny z miejscem cięcia dla enzymy NheI na końcu 5’
<400> 14
aattgctagc atgggagtgc taaaattcaa gc 32
<210> 15
<211> 1473
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(1473)
<223> sHASEGP aż do pozycji P478 ze znacznikiem His-tag
<400> 15
<210> 16
<211> 490
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211> 39
<212 DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer sensowny z sekwencją łącznika His
<400> 17
ataattggat ccggttctgg tgctcaccat caccatcac 39
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowny z sekwencją łącznika His
<400> 18
tataattgcg gccgcctaat ggtgatggtg atggtgag 38
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> 3’ Primer antysensowany bez kodonu stop do wytwarzania skróconego produktu HISsHASEGP bez kotwicy GPI, którego sekwencja kończy się w pozycji N483
<400> 19
aatggatcca ttgtagaaaa tttgaggttc 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> 3’ Primer antysensowany bez kodonu stop, do wygenerowania skróconego produktu
HIS-sHASEGP bez kotwicy GPI, którego sekwencja kończy się w pozycji Y482
<400> 20
aatggatccg tagaaaattt gaggttcttc 30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> 3’ Primer antysensowany bez kodonu stop do wygenerowania
HIS-sHASEGP bez kotwicy GPI, którego sekwencja
<400> 21
aattggatcc gaaaatttga ggttcttctg 30
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
skróconego produktu
kończy się w pozycji F481
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> 3’ Primer antysensowany bez kodonu stop do wygenerowania
HIS-sHASEGP bez kotwicy GPI, którego sekwencja
skróconego produktu
kończy się w pozycji I480
<400> 22
attggatcca atttgaggtt cttctgtctc. 30
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> 3’ Primer antysensowany bez kodonu stop, do wygenerowania
HIS-sHASEGP bez kotwicy GPI, którego sekwencja
skróconego produktu
kończy się w pozycji Q479
<400> 23
aattggatcc ttgaggttct tctgtctcc 29
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> 3’ Primer antysensowany bez kodonu stop, do wygenerowania
HIS-sHASEGP bez kotwicy GPI, którego sekwencja
skróconego produktu
kończy się w pozycji P478
<400> 24
aattggatcc aggttcttct gtctccatg 29
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> 3’ Primer antysensowany bez kodonu stop, do wygenerowania
HIS-sHASEGP bez kotwicy GPI, którego sekwencja
skróconego produktu
kończy się w pozycji E477
<400> 25
aattggatcc ttcttctgtc tccatggg 28
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowny mutanta delecyjnego sHASEGP, którego
sekwencja kończy się
w pozycji A467
<400> 26
aattggatcc ctaagcatct atacagacac catcag 36
<210> 27
<211> 35
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowny mutanta delecyjnego sHASEGP, którego
sekwencja kończy się
w pozycji A447
<400> 27
aattggatcc ctaagctttc tccttacaac tcaag 35
<210> 28
<211> 34
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowny mutanta delecyjnego sHASEGP, którego sekwencja kończy się w
pozycji S430
<400> 28
aattggatcc ctaagaaaat tgctccaggt cttc 34
<210> 29
<211> 36
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowny mutanta delecyjnego sHASEGP, którego sekwencja kończy się w
pozycji G413
<400> 29
aattggatcc ctatccacct ttctcaagtt gaatag 36
<210> 30
<211> 36
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowny mutanta delecyjnego sHASEGP, którego sekwencja kończy się w
pozycji S394
<400> 30
aattggatcc ctatgaattc cagtttttcc ttatac 36
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowny mutanta delecyjnego sHASEGP, którego
sekwencja kończy się
w pozycji A372
<400> 31
aattggatcc ctatgctagt gtgacgttga ttatg 35
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowny mutanta delecyjnego sHASEGP, którego sekwencja kończy się w
pozycji S347
<400> 32
aattggatcc ctaacttcgc attatactga ggg 33
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer sensowny LN wykorzystywany w ukierunkowanej mutagenezie do wytworzenia
białka fuzyjnego sHASEGP z sekwencją liderową Kappa. L36 jest pierwszym aminokwasem
sHASEGP nastepujacym po sekwencji liderowej Kappa.
<400> 33
ctgaatttca gagcacctcc tgttattcc 29
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer sensowny FR wykorzystywany w ukierunkowanej mutagenezie do wytworzenia
białka fuzyjnego sHASEGP z sekwencją liderową Kappa. F38 jest pierwszym aminokwasem
sHASEGP następujacym po sekwencji liderowej Kappa
<400> 34
ttcagagcac ctcctgttat tccaaatg 28
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowny Asp wykorzystywany w ukierunkowanej mutagenezie do
wytworzenia białka fuzyjnego sHASEGP z sekwencją liderową Kappa. Asp jest ostatnim
aminokwasem sekwencji liderowej Kappa przed L36 lub F38 w sekwencji PH-20
<400> 35
gtcaccagtg gaacctggaa ccc 23
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowny Gly wykorzystywany w ukierunkowanej mutagenezie do
wytworzenia białka fuzyjnego sHASEGP z sekwencją liderową Kappa. Gly jest ostatnim
aminokwasem sekwencji liderowej Kappa przed L36 lub F38 w sekwencji PH-20
<400> 36
accagtggaa cctggaaccc agag 24
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer sensowny dla pierwszego fragmentu sekwencji liderowej Kappa
<400> 37
gagacagaca cactcctgct atgggtactg 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowny dla pierwszego fragmentu sekwencji iderowej
<400> 38
cccagagcag cagtacccat agcaggagtg 30
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
Kappa
<223> Primer sensowny dla drugiego fragmentu sekwencji liderowej Kappa
<400> 39
ggtactgctg ctctgggttc caggttccac 30
<210> 40
<211> 27
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowny dla drugiego fragmentu sekwencji liderowej
Kappa
<400> 40
gcgtcaccag tggaacctgg aacccag 27
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer sensowny z miejscem restrykcyjnym NheI dla sekwencji liderowej Kappa
<400> 41
attgctagca tggagacaga cacactcctg 30
<210> 42
<211> 28
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowny EcoR1 dla sekwencji liderowj Kappa
<400> 42
aattgaattc gtcaccagtg gaacctgg 28
<210> 43
<211> 21
<212> PRT
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Sekwencja liderowa łańcucha mysiego IgK
<400> 43
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223>Primer sensowny dla sekwencji liderowej Kappa z miejscem restrykcyjnym SpeI
<400> 44
actcactagt gctagcatgg agacagacac 30
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Primer antysensowny dla sekwencji liderowej Kappa z miejscem restrykcyjnym MluI
<400> 45
aattacgcgt gaattcgtca ccagtggaac 30
<210> 46
<211> 462
<212> PRT
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Białko fuzyjne sekwencji kiderowej Kappa z sHASEGP z F38 jako pierwszym
aminokwasem prawdopodobnej formy sekrecyjnej sHASEGP (aż do P478)
<400> 46
<210> 47
<211> 40
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> 3’ Primer antysensowny z miejscem restrykcyjnym BamHI, zawierający kodon stop, dla
sekwencji sHASEGP z kotwicą GPI aż do pozycji L509
<400> 47
aattggatcc ctacagaaga aatgataaga aacaaaatac 40
<210> 48
<211> 1449
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 48
<210> 49
<211> 467
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49\\
<210> 50
<211> 1536
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 50
<210> 51
<211> 6630
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Wektor plazmidowy HZ24
<400> 51
<210> 52
<211> 2009
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 52
<210> 53
<211> 2395
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 53
Zastrzeżenia patentowe
1.
Zasadniczo oczyszczona glikoproteina, zawierająca aktywny w środowisku obojętnym
rozpuszczalny polipeptyd hialuronidazy, zawierający co najmniej jedno ugrupowanie cukrowe
połączone przez atom N, przy czym:
ugrupowanie cukrowe połączone przez atom N jest kowalencyjnie związane z resztą
asparaginy polipeptydu;
zasadniczo oczyszczona glikoproteina zawiera sekwencję aminokwasów objętą sekwencją
ID. SEKW. Nr 1 lub sekwencję, która wykazuje co najmniej 91% identyczność sekwencji
aminokwasowej z sekwencją aminokwasów objętą sekwencją ID. SEKW. Nr 1; i
zasadniczo oczyszczona glikoproteina jest rozpuszczalna.
2.
Zasadniczo oczyszczona glikoproteina według zastrz.1, w której polipeptyd jest
kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca aminokwasy 36 - 482 sekwencji ID.
SEKW. Nr 1 lub aminokwasy 1 - 482 sekwencji ID. SEKW. Nr 1.
3.
Zasadniczo oczyszczona glikoproteina według zastrz. 2, przy czym cząsteczka kwasu
nukleinowego ma sekwencję nukleotydów przedstawioną w sekwencji ID. SEKW. Nr 48.
4.
Zasadniczo oczyszczona glikoproteina według zastrz. 1, w której polipeptyd obejmuje
sekwencję aminokwasów przedstawioną w sekwencji ID. SEKW. Nr 1, skróconą przy reszcie
aminokwasowej, którą stanowi lub która znajduje się pomiędzy resztami aminokwasowymi 467 do
483.
5.
Zasadniczo oczyszczona glikoproteina według zastrz. 1, w której polipeptyd obejmuje
sekwencję aminokwasów przedstawioną w sekwencji ID. SEKW. Nr 1, skróconą przy reszcie
aminokwasowej wybranej spośród reszty 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 i 483.
6.
Zasadniczo oczyszczona glikoproteina według zastrz. 5, przy czym polipeptyd jest
wydzielany przez komórki CHO.
7.
Zasadniczo oczyszczona glikoproteina według zastrz. 1, w której polipeptyd
modyfikowany jest polimerem.
8.
Zasadniczo oczyszczona glikoproteina według zastrz. 7, w której polimerem jest PEG
lub dekstran.
9.
Sposób wytwarzania zasadniczo oczyszczonej glikoproteiny określonej w zastrz. 1,
obejmujący:
wprowadzenie kwasu nukleinowego, który koduje polipeptyd określony w zastrz. 1,
funkcjonalnie połączonego z odpowiednim promotorem do komórek zdolnych do wprowadzania do
polipeptydu ugrupowań cukrowych połączonych przez atom N;
hodowanie komórek w warunkach, w których kodowany polipeptyd jest wyrażany przez
komórkę; oraz
odzyskiwanie wyrażanego polipeptydu(ów)
10.
Sposób według zastrz. 9, w którym komórkę stanowi komórka CHO.
11.
Kompozycja farmaceutyczna zawierająca glikoproteinę określoną w dowolnym z
zastrz. 1 - 8.
12.
Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 11, w której polipeptyd wytwarzany jest w
wyniku ekspresji w komórkach ssaczych cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego aminokwasy 1 -
482 sekwencji ID. SEKW. Nr 1 lub cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego aminokwasy 36 - 482
sekwencji ID. SEKW. Nr 1.
13.
Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 12, przy czym komórkę ssaczą stanowi
komórka CHO.
14.
Kompozycja
farmaceutyczna
według
zastrz.
11
dodatkowo
zawierająca
farmaceutycznie czynny środek.
15.
Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 14, w której farmaceutycznie czynny
środek jest wybrany spośród środków chemoterapeutycznych, środków przeciwbólowych, środków
przeciwzapalnych,
środków
przeciwbakteryjnych,
środków
pełzakobójczych,
środków
rzęsistkobójczych, środków przeciwko chorobie Parkinsona, środków antymalarycznych, środków
przeciwdrgawkowych, środków przeciwdepresyjnych, środków przeciwko zapaleniu stawów, środków
przeciwgrzybiczych, środków przeciwnadciśnieniowych, środków przeciwgorączkowych, środków
przeciwpasożytniczych, środków antyhistaminowych, agonistów receptorów alfa-adrenergicznych,
alfa-blokerów, środków znieczulających, środków rozszerzających oskrzela, biocydów, środków
bakteriobojczych, środków bakteriostatycznych, blokerów beta-adrenergicznych, środków blokujących
kanały wapniowe, leków układu sercowo-naczyniowego, środków antykoncepcyjnych, środków
zmniejszających
przekrwienie,
środków
moczopędnych,
diagnostycznych,
elektrolitów,
środków
nasennych,
środków
środków
tłumiących,
środków
hormonalnych,
środków
hiperglikemicznych, środków zwiotczających mięśnie, środków obkurczających mięśnie, środków
ocznych, środków parasympatomimetycznych, środków wspomagających psychikę, środków
uspokajających, środków sympatykomimetycznych, ataraktyków, środków związanych z układem
moczowym,
środków
dopochwowych,
środków
wirusobójczych,
środków
witaminowych,
niesteroidowych środków przeciwzapalnych, inhibitorów enzymu konwertującego angiotensynę,
polipeptydów, białek, kwasów nukleinowych, leków, cząsteczek organicznych lub środków
usypiających.
16.
Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 14, w której farmaceutycznie czynny
środek wybrany jest spośród insuliny, cytokiny, przeciwciała i przeciwciała monoklonalnego.
17.
Koniugat zawierający rozpuszczalną glikoproteinę określoną w zastrz. 1, lub
zawierający domenę rozpuszczalnej proteiny określonej w zastrz. 1.
18.
Kompozycja, według dowolnego zastrzeżenia 11 - 16 do zastosowania w leczeniu
nadmiaru glikozaminoglikanów, do leczenia nowotworu, do leczenia zaburzeń sercowo-naczyniowych,
do zwiększania penetracji środków chemoterapeutycznych do guza litego, do zastosowania w
wywoływaniu upłynniania ciała szklistego, do zastosowania w dostarczaniu cząsteczki o rozmiarze
mniejszym niż 500 nm do tkanki zawierającej nadmiar glikozoaminoglikanów.
19.
Zastosowanie kompozycji określonej w dowolnym z zastrz. 11 - 16 do wytwarzania
leku do leczenia stanów związanych z nadmiarem glikozoaminoglikanów, do leczenia zaburzeń
sercowo-naczyniowych, do zwiększania penetracji środków chemoterapeutycznych do guza litego, do
zastosowania w wywoływaniu upłynniania ciała szklistego, do zastosowania w dostarczaniu
cząsteczki o rozmiarze mniejszym niż 500 nm do tkanki zawierającej nadmiar glikozoaminoglikanów.