problemy proteomiki klinicznej – trendy

problemy proteomiki klinicznej – trendy

PROBLEMY PROTEOMIKI KLINICZNEJ ...
POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI
111
TOM 36, 2009 SUPLEMENT NR 25 (111–115)
PROBLEMY PROTEOMIKI KLINICZNEJ –
TRENDY, NIEBEZPIECZEÑSTWA I PROBLEMY*
CLINICAL PROTEOMICS – TRENDS, PITFALLS AND PROBLEMS
Jerzy SILBERRING
Zak³ad Neurobiochemii, Wydzia³ Chemii Uniwersytetu Jagielloñskiego, Kraków
Streszczenie: Proteomika kliniczna zajmuje siê badaniami na pograniczu chemii, biochemii i medycyny,
wykorzystuj¹c nowoczesne narzêdzia badawcze, jak m.in. techniki mikroekstrakcji i separacji z³o¿onych
próbek biologicznych, metody identyfikacji bia³ek za pomoc¹ spektrometrii mas i bioinformatykê. Na
wspó³czesn¹ proteomikê sk³adaj¹ siê zarówno badania podstawowe, jak te¿ badania kliniczne. Pomiêdzy
tymi dyscyplinami zachodzi ci¹g³a wymiana informacji (translacja), przyczyniaj¹c siê do sta³ego postêpu
wiedzy o okreœlonych schorzeniach. Ten proces jest czêœci¹ biologii systemów, czyli zrozumienia, w jaki
sposób funkcjonuje organizm cz³owieka. W rzeczywistoœci, czyli w praktyce laboratoryjnej, za³o¿enie
to, jakkolwiek ambitne, napotyka na szereg trudnoœci metodologicznych. G³ównym problemem jest tu
brak ogólnie przyjêtej, standardowej strategii, umo¿liwiaj¹cej monitorowanie okreœlonych schorzeñ, a
tak¿e brak kryteriów jakoœciowych dla tej, z³o¿onej z szeregu etapów, strategii. Bez przyjêcia takich
ogólnych norm, porównywanie wyników uzyskiwanych w ró¿nych laboratoriach nie ma w tej sytuacji
¿adnego uzasadnienia. Ju¿ na etapie kolekcjonowania materia³u biologicznego wystêpuje wiele w¹tpliwoœci zwi¹zanych z dynamik¹ przemian metabolicznych, wp³ywem: wieku, leków, œrodowiska, sposobu
pobierania i przechowywania próbek itp. na koñcowy wynik analiz. Dodatkowo, kilkanaœcie bia³ek
stanowi ponad 96% ca³kowitego sk³adu bia³kowego surowicy, a zakres stê¿eñ pomiêdzy poszczególnymi sk³adnikami siêga 1010. Jednoczesna analiza ogromnej liczby danych przekracza mo¿liwoœci standardowego oprogramowania, dostarczanego wraz z aparatur¹ pomiarow¹. Kryteria selekcji uzyskanych
danych tak¿e w sposób zasadniczy wp³ywaj¹ na wynik koñcowy, a spektakularnym przyk³adem mo¿e
byæ jedna z niedawnych publikacji, w której autorzy analizowali mieszaninê 6 bia³ek standardowych,
otrzymuj¹c w koñcowym etapie wydruk komputerowy, zawieraj¹cy identyfikacjê ok. 800 bia³ek!! Czy
w œwietle powy¿szych faktów mo¿liwa jest w ogóle rzetelna i powtarzalna analiza?
S³owa kluczowe: proteomika kliniczna.
Summary: Clinical proteomics is an analytical strategy functioning at the edge between chemistry, biochemistry, and medicine. This approach utilizes modern and ultrasensitive techniques, such as microextraction and separation of complex biological samples, identification with the aid of mass spectrometry, and
*Niniejszy materia³ jest fragmentem przygotowywanej ksi¹¿ki (A. Kraj i J. Silberring, red.)
„Proteomika i Metabolomika”, która uka¿e siê w 2009 r. nak³adem Wydawnictwa Uniwersytetu Warszawskiego.
112
J. SILBERRING
advanced bioinformatics. Nowadays proteomics is based on basic research and clinical investigations.
Between those disciplines there is a constant exchange of information (translation) and this process is part
of the systems biology, i.e. understanding how human organism works. In reality, i.e. in a daily laboratory
practice this assumption, however ambitious, meets many methodological ambiguities. The major issue is
a lack of the commonly accepted, standard (or optimal) analytical strategy to handle biological material,
and to monitor specific diseases. There is also an urgent need to evaluate quality criteria for this multi-task
approach. Without such widespread norms, data comparison between various laboratories is out of
question. Many ambiguities already appear during material collection phase. This is associated with the
overall dynamics of such complex biological system as living organism, influence of age, medications,
environment, a way the sample is collected and stored, etc. on the final result of the entire analysis.
Additionally, several proteins comprise 96% of the protein content in plasma and the dynamic range of
molecules reaches nearly 1010, which obscures less abundant components having important biological
impact. Thus, simultaneous analysis of a huge amount of raw data is far beyond capabilities of modern
instrumentation and software, and, even more important, cannot be fully interpreted by operators and
translated to a common biological sense. One spectacular example may here be cited, where authors
honestly reported analysis of a mixture of 6 standard proteins, which resulted in a printout containing
„identification” of ca. 800 proteins! How the above contributes to the reliable and reproducible analysis?
Key words: clinical proteomics.
WSTÊP
Proteomika kliniczna zajmuje siê badaniami na pograniczu chemii, biochemii i
medycyny, wykorzystuj¹c nowoczesne narzêdzia badawcze, jak m.in. techniki
mikroekstrakcji i separacji z³o¿onych próbek biologicznych, metody identyfikacji bia³ek
za pomoc¹ spektrometrii mas i bioinformatykê. Wspó³czesna proteomika obejmuje
zarówno badania podstawowe, jak i badania kliniczne. Pomiêdzy tymi dyscyplinami
zachodzi ci¹g³a wymiana informacji (translacja), przyczyniaj¹c siê do sta³ego postêpu
wiedzy o okreœlonych schorzeniach. Ten proces jest czêœci¹ biologii systemów, czyli
zrozumienia, w jaki sposób funkcjonuje organizm cz³owieka.
CZY PROTEOMIKA POMO¯E NAM W POSZUKIWANIU
BIOMARKERÓW?
W rzeczywistoœci, czyli w praktyce laboratoryjnej za³o¿enie to, jakkolwiek ambitne,
napotyka na wiele trudnoœci metodologicznych. G³ównym problemem jest tu brak
ogólnie przyjêtej, standardowej strategii, umo¿liwiaj¹cej monitorowanie okreœlonych
schorzeñ. Brak tak¿e kryteriów jakoœciowych oceniaj¹cych poszczególne etapy
klinicznej analizy proteomicznej. Nie jest bowiem oczywiste, co oznacza dobrze
wykonana elektroforeza w ¿elu poliakrylamidowym i jak powinien przedstawiaæ siê
wielowymiarowy rozdzia³ chromatograficzny? Jaki powinien byæ udzia³ t³a (czy w
ogóle powinien byæ?) i w jaki sposób okreœliæ, czy wybarwione bia³ko w ¿elu ma
„w³aœciwy” kszta³t? Bez przyjêcia takich ogólnych norm, porównywanie wyników
uzyskiwanych w ró¿nych laboratoriach nie ma w tej sytuacji ¿adnego uzasadnienia.
PROBLEMY PROTEOMIKI KLINICZNEJ ...
113
PRZYGOTOWANIE PRÓBEK,
CZYLI PIERWSZY ETAP PRODUKCJI ARTEFAKTÓW
Proteomika jest znakomitym narzêdziem do produkcji ogromnej iloœci danych, w
znacznym stopniu niedaj¹cych siê zweryfikowaæ. Ju¿ na etapie kolekcjonowania
materia³u biologicznego wystêpuje szereg w¹tpliwoœci, zwi¹zanych z dynamik¹
przemian metabolicznych, wp³ywem wieku, leków, œrodowiska, sposobu pobierania
i przechowywania próbek itp. na koñcowy wynik analiz [1]. Dobrym przyk³adem
materia³u, który stanowi ogromne wyzwanie dla analizy proteomicznej, jest surowica
krwi. Kilkanaœcie bia³ek stanowi ponad 96% jej ca³kowitego sk³adu bia³kowego, a
ró¿nica stê¿eñ pomiêdzy poszczególnymi sk³adnikami siêga 1010. Z kolei usuwanie
tych kilkunastu bia³ek za pomoc¹ chromatografii powinowactwa jest niezwykle
kosztowne, czasoch³onne i najczêœciej eliminuje te¿ inne istotne sk³adniki mieszaniny,
zaburzaj¹c proporcje iloœciowe. Jednoczesna analiza ogromnej liczby danych
przekracza mo¿liwoœci standardowego oprogramowania, dostarczanego wraz z
aparatur¹ pomiarow¹. Wynika st¹d jednoznacznie, ¿e kluczowym elementem ca³ej
strategii bêdzie preseparacja sk³adników mieszaniny. Od efektywnoœci tego procesu
zale¿eæ bêdzie koñcowy wynik. Nie ma w chwili obecnej metody, która umo¿liwia³aby rozdzia³ bia³ek z odpowiedni¹ selektywnoœci¹, a mieszanina ju¿ tylko kilku
sk³adników nie jest prawid³owo analizowana przez oprogramowanie.
BIOINFORMATYKA – NAJS£ABSZE OGNIWO PROTEOMIKI
Kryteria selekcji uzyskanych danych tak¿e w sposób zasadniczy wp³ywaj¹ na
wynik koñcowy, a spektakularnym przyk³adem mo¿e byæ jedna z niedawnych
publikacji, w której autorzy analizowali mieszaninê 6 standardowych bia³ek, otrzymuj¹c
w koñcowym etapie wydruk komputerowy, zawieraj¹cy identyfikacjê ok. 800
bia³ek!!! Czy w œwietle powy¿szych faktów mo¿liwa jest w ogóle rzetelna i
powtarzalna analiza?
Problemem jest tutaj nie tylko brak odpowiednich narzêdzi bioinformatycznych,
ale przede wszystkim s³aba znajomoœæ tej tematyki przez badaczy. Identyfikacja bia³ka
jest, przynajmniej intuicyjnie, bardziej zrozumia³a ni¿ skomplikowany warsztat
informatyczny i chemometryczny. Dotyczy to jednak tak¿e drugiej strony, czyli
samych bioinformatyków, nie maj¹cych najczêœciej odpowiedniej wiedzy biochemicznej, aby prawid³owo oceniæ sens biologiczny wydruków komputerowych. Kolejnym
przyk³adem jest wykazywanie sporej liczby hipotetycznych bia³ek (ang. hypothetical
proteins), które komputer identyfikuje nie na podstawie kompletnej sekwencji
aminokwasowej w bazie bia³ek, ale na podstawie przet³umaczonej sekwencji
nukleotydów w bazie genów. Nikt nie zadaje sobie pytania, czy takie bia³ko w
rzeczywistoœci w ogóle istnieje i czy mo¿e mieæ jak¹kolwiek funkcjê biologiczn¹.
Przewa¿aj¹ca wiêkszoœæ oprogramowania do analizy wielowymiarowych ¿eli zak³ada
rozk³ad normalny i stosuje test Studenta oraz analizê wariancji (one-way ANOVA)
114
J. SILBERRING
do oceny ró¿nic pomiêdzy próbkami. Zwykle taki rozk³ad nie jest weryfikowany przed
rozpoczêciem analizy, a dodatkowo statystyka wymaga co najmniej 3–7 powtórzeñ (czyli
3–7 rozdzia³ów KA¯DEJ próbki), aby test Studenta mo¿na by³o stosowaæ [2]. Zwiêksza
to znacz¹co koszty i czasoch³onnoœæ procedury. W zespole autora przeprowadzono z kolei
eksperymenty podwójnego znakowania stabilnymi izotopami, po³¹czone z technik¹ shotgun.
W rezultacie wygenerowano ponad 50 000 widm fragmentacyjnych, których analiza by³a
mo¿liwa dopiero po opracowaniu w³asnego oprogramowania. Nale¿y jednak przyj¹æ
za³o¿enie, ¿e eksperyment musi zostaæ powtórzony co najmniej trzykrotnie i to w ca³oœci.
CZY TO JEST COΠWARTE?
Przytoczmy tu jedno zdanie z wywiadu przeprowadzonego przez czasopismo
Science [4] z Amosem Bairochem, twórc¹ bazy SwissProt, serwera ExPASy i
szeregu znakomitych narzêdzi bioinformatycznych: „...much of the data generated
by proteomics groups over the past decade is junk”. Rzeczywiœcie, obserwuj¹c
gwa³towny rozwój laboratoriów proteomicznych, to w³aœnie ³atwoœæ pozyskiwania
funduszy na „modne” kierunki, niedostatek fachowców, a przede wszystkim brak
walidacji uzyskanych wyników spowodowa³y lawinow¹ „produkcjê” danych, których
nie mo¿na porównaæ nawet w tym samym laboratorium. Trzeba te¿ pamiêtaæ, ¿e
metodami proteomicznymi identyfikujemy œrednio ok. 20% sekwencji danego bia³ka.
Mo¿na oczywiœcie uznaæ, ¿e jest to wystarczaj¹cy dowód na istnienie okreœlonej
moleku³y, ale nie jest to wartoœciowa informacja z punktu widzenia kompletnej
struktury bia³ka (przynajmniej I-rzêdowej), bez podania modyfikacji potranslacyjnych,
ew. mutacji itp. A przecie¿ najczêœciej modyfikacje odgrywaj¹ g³ówn¹ rolê w
regulowaniu funkcji moleku³. Wszystkie stosowane obecnie techniki analizuj¹
ekspresjê bia³ka, a nie jego aktywnoœæ. Jaka jest wiêc relacja np. pomiêdzy
nadekspresj¹ enzymu a jego aktywnoœci¹ katalityczn¹?
Z powy¿szych wzglêdów istotna jest walidacja uzyskanych wyników i potencjalnych „biomarkerów”, które na tym etapie analizy ¿adnymi biomarkerami nie s¹.
Procedura walidacji jest tak samo z³o¿ona jak inne, nieproteomiczne metody identyfikacji biomarkerów i tak samo kosztowna i czasoch³onna. Wymagania s¹ tu
jednoznacznie sformu³owane; nale¿y opracowaæ specyficzn¹ metodê analizy iloœciowej (np. ELISA, reakcja enzymatyczna itp.) i zweryfikowaæ uzyskane dane
porównuj¹c próbki kliniczne, wyznaczyæ szereg parametrów, zakres norm itp. S¹ to
standardowe procedury stosowane m.in. w chemii klinicznej czy chemii s¹dowej i
powszechnie znane. Mówimy tu oczywiœcie wy³¹cznie o markerach sygnalizuj¹cych
rozwój choroby, a nie o tworzeniu potencjalnych leków, co czêsto jest mylone.
PRZYSZ£OŒÆ „OMIKI”
Pomimo przewijaj¹cego siê tu pesymizmu, strategie „omiczne” maj¹ przysz³oœæ,
po przyjêciu pewnych zastrze¿eñ. Nie mo¿na ka¿dej z technik traktowaæ oddzielnie
PROBLEMY PROTEOMIKI KLINICZNEJ ...
115
a g³ówny dogmat biologii molekularnej (gen – transkrypcja – translacja – bia³ko)
nale¿y uznaæ za kierunek rozwoju metodologii, czyli prowadziæ analizê ca³oœciow¹ i
nie pomijaæ innych dziedzin nauki. Wydaje siê, ¿e po pocz¹tkowym okresie euforii
zaczynaj¹ pojawiaæ siê publikacje nawi¹zuj¹ce do rzeczywistych problemów i
wyzwañ proteomiki [5]. Nie ulega natomiast w¹tpliwoœci, ¿e narzêdzia „omiczne”
nie nadaj¹ siê, przynajmniej na razie, do identyfikacji biomarkerów przy ³ó¿ku
pacjenta. Mog¹ natomiast wspomagaæ ten proces na etapie wstêpnej analizy jako
œrodek a nie cel ca³ej strategii. Spektrometria mas jest tylko jednym z elementów
tej procedury i z pewnoœci¹ nie spe³nia funkcji black box, do którego wprowadza
siê próbkê, naciska guzik i uzyskuje wynik. Sytuacji z pewnoœci¹ nie u³atwia
powstawanie kolejnych dziedzin „omiki”, chemogenomiki i chemoproteomiki,
bazuj¹cych na odmiennych za³o¿eniach [3].
Jak dot¹d nie uda³o siê uzyskaæ metodami proteomicznymi ¿adnego wartoœciowego
biomarkera, np. w diagnostyce nowotworów prostaty ci¹gle najlepszym testem
pozostaje oznaczanie PSA, przy wszystkich jego ograniczeniach. Analogiczna
sytuacja przedstawia siê w zastosowaniach chemii kombinatorycznej, gdzie nak³ady
stoj¹ w ra¿¹cej dysproporcji do uzyskiwanych efektów w przemyœle farmaceutycznym. Mo¿e wiêc warto przemyœleæ ca³¹ koncepcjê i prowadziæ poszukiwania
w po³¹czeniu z innymi metodami, jak np. metaanalizy wp³ywu okreœlonych leków
na du¿e grupy pacjentów lub poszukiwanie okreœlonych modyfikacji potranslacyjnych,
co daje szansê na zawê¿enie obszaru badañ do rozs¹dnego zakresu. Zanim wiêc
dojdziemy do celu, up³ynie znacznie wiêcej czasu ni¿ pocz¹tkowo zak³adano.
LITERATURA
[1] AHMED FE. Sample preparation and fractionation for proteome analysis and cancer biomarker discovery by mass spectrometry. J Sep Sci 2009; 32: 771–798.
[2] BIRON DG, BRUN C, LEFEVRE T, LEBARBENCHON C, LOXDALE HD, CHEVENET F, BRIZARD
J-P, THOMAS F. The pitfalls of proteomics experiments without the correct use of bioinformatics tools.
Proteomics 2006; 6: 5577–5596.
[3] JACOBY E. Chemogenomics – drug discovery's panacea? Mol Bio Syst 2006; 2: 218–220.
[4] SERVICE RF. Proteomics prime time. Science 2008; 321: 1758–1761.
[5] YAN L, TONACK S, SMITH R, DODD S, JENKINS RE, KITTERINGHAM N, GREENHALF W,
GHANEH P, NEOPTOLEMOS JP, COSTELLO E. Confounding effects of obstructive jaundice in the
interpretation of proteomic plasma profiling data for pancreatic cancer. J Proteome Res 2009; 8: 142–
148.
Prof. dr hab. Jerzy SILBERRING
Zak³ad Neurobiochemii, Wydzia³ Chemii Uniwersytetu Jagielloñskiego
ul. R. Ingardena 3, 3, 0-060 Kraków
e-mail: [email protected]