właściwości fizykochemiczne tłuszczów

WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNE TŁUSZCZÓW
1. Rozpuszczalność barwników w tłuszczach
Substancje podobne pod względem budowy chemicznej do tłuszczów, tj. związki, których drobiny
nie mają wcale lub posiadają niewiele grup hydroksylowych, są dobrze rozpuszczalne w tłuszczach.
Barwnik o dużej masie cząsteczkowej Sudan III, stosowany do wybarwiania tłuszczu w preparatach
histologicznych, zawiera tylko jedną grupę hydrofilową i długi, niepolarny łańcuch węglowodorowy
– dzięki temu jest dobrze rozpuszczalny w tłuszczach.
Wykonanie: Do 2 ml wody dodać nieco barwnika Sudan III. Barwnik nie rozpuszcza się. Wprowadzić
następnie 0,5 ml oleju i zmieszać zawartość probówki. Barwnik rozpuszcza się.
2. Zmydlanie tłuszczów
Tłuszcze jako estry łatwo ulegają hydrolizie, dając w zależności od czynnika wywołującego hydrolizę
różne produkty. Jeżeli hydroliza zachodzi pod wpływem pary wodnej, powstaje glicerol i mieszanina
kwasów tłuszczowych. Jeżeli natomiast czynnikiem powodującym hydrolizę są alkalia lub węglany
potasowców, wówczas nie otrzymuje się wolnych kwasów tłuszczowych lecz ich sole, czyli mydła
oraz glicerol.
Wykonanie: W parowniczce porcelanowej ogrzać około l g smalcu. Dodać następnie l,5 ml 30% roztworu
NaOH, potem l ml etanolu i mieszać, ogrzewając łagodnie, aż do utworzenia się jednolitej masy (mydła).
Do otrzymanego mydła wprowadzić 40 ml wrzącej wody i ogrzewać do całkowitego rozpuszczenia się
mydła.
a) Otrzymywanie mydła nierozpuszczalnego
Mydła w zależności od rodzaju wchodzącego w ich skład metalu dzielą się na rozpuszczalne
i nierozpuszczalne w wodzie. Sole baru, wapnia i ołowiu (metali dwuwartościowych)
w przeciwieństwie do sodu i potasu (metali jednowartościowych) nie rozpuszczają się w wodzie tworzą mydła nierozpuszczalne.
Wykonanie: Do probówek zawierających po 2 ml roztworu mydła wprowadzić kroplami 1% roztworu
CaCl2. Wytrąca się osad mydła, który nie rozpuszcza się po dodaniu wody.
b) Wysalanie mydła
Micele koloidowe mydła utrzymują się w roztworze dzięki ochronnemu działaniu otaczającego je
płaszcza wodnego. Dodanie do takiego układu elektrolitu o większym powinowactwie do wody
(NaCl) niż mydło powoduje odwodnienie miceli. Duży nadmiar jonów w środowisku zobojętnia
ponadto ładunki elektryczne na powierzchni. Cząsteczki koloidu (fazy rozproszonej) pozbawione
otoczki wodnej i odpychającego działania jednoimiennych ładunków, wypadają z roztworu.
Wykonanie: Do 5 ml roztworu mydła dodać NaCl w stanie stałym, aż do wysycenia. Wypada osad
wysolonego mydła, który oddziela się przez dekantację.
c) Wydzielanie wolnych kwasów
Mydła są solami słabych kwasów i mocnych zasad. Pod wpływem mocnych kwasów nieorganicznych
następuje cofnięcie dysocjacji grupy karboksylowej kwasu tłuszczowego, w wyniku czego powstają
niezdysocjowane, nierozpuszczalne w wodzie kwasy tłuszczowe.
Wykonanie: Do 5 ml roztworu mydła dodać po kropli stężonego H2SO4, aż do otrzymania kwaśnego
środowiska. Roztwór mętnieje z powodu wydzielania się wolnych kwasów tłuszczowych.
3. Odróżnianie kwasów tłuszczowych od tłuszczów obojętnych
Wykonanie: a) Do roztworu z ćw. 2c dodać 3 ml eteru. Następnie do probówki zawierającej l ml 0,002M
NaOH, zabarwiony fenoloftaleiną na różowo, dodać kroplami eterowy roztwór kwasów tłuszczowych.
Zawartość probówki odbarwia się. b) Ogrzewać kwasy tłuszczowe z krystalicznym KHSO4. Nie wydziela
się charakterystyczny zapach akroleiny, powstający z tłuszczów w przypadku ogrzewania z KHSO 4.
4. Wykazanie obecności kwasów nienasyconych w tłuszczach
Pod wpływem substancji utleniających, np. KMnO4 dochodzi do rozerwania łańcucha węglowego w
miejscu podwójnych wiązań, z równoczesnym utlenieniem atomów węgla do grup karboksylowych.
Analizując produkty rozpadu, można określić położenie wiązania podwójnego w cząsteczce kwasu.
Równocześnie z utlenieniem kwasu nienasyconego zachodzi redukcja utleniacza. W środowisku
obojętnym mangan redukuje się ze stopnia utlenienia +7 na +4.
Wykonanie: Do probówki zawierającej 2 krople oleju dodać 5 ml IM Na2CO3. Zawartość probówki lekko
ogrzać i wytrząsając dodawać po kropli 0,01M roztworu KMnO4, aż do trwającego około 2 minuty
różowego zabarwienia.
5. Wykrywanie tłuszczów za pomocą reakcji akroleinowej
Tłuszcze zawierające glicerol, ogrzewane z KHSO4 dają dodatnią reakcję akroleinową. Podczas
ogrzewania glicerolu w obecności krystalicznego KHSO4 dochodzi do odciągnięcia dwóch cząsteczek
wody z glicerolu. Powstaje aldehyd nienasycony tzw. akroleina, której pary mają ostry duszący
zapach przypominający zapach formaliny. Akroleinę można wykryć również reakcją lustra
srebrnego, gdyż jako aldehyd ma ona właściwości redukujące.
Wykonanie: Do kropli oleju jadalnego w suchej probówce dodać szczyptę KHSO4. Zawartość probówki
ogrzewać przez kilka minut. Wydziela się przykry, drażniący zapach akroleiny.
6. Rozpuszczalność tłuszczów
Tłuszcze rozpuszczają się dobrze w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak
benzen, chloroform, aceton, toluen i eter, a w mniejszym stopniu także w etanolu i metanolu.
Wykonanie: Do probówek zawierających po 1 ml rozpuszczalników organicznych (etanol, chloroform,
aceton) dodać odrobinę tłuszczu. Zaobserwować różnicę w stopniu rozpuszczalności tłuszczu w
poszczególnych rozpuszczalnikach organicznych.
7. Tworzenie emulsji tłuszczu w obecności emulgatora
Tłuszcz nie rozpuszczają się w wodzie. W przypadku silnego wytrząsania z wodą rozbija się na drobne
kropelki i po chwili wypływa ponownie na powierzchnię wody. Jeżeli do wody doda się emulgatora (środka
zmniejszającego napięcie powierzchniowe na granicy faz tj. siłę, która przeciwstawia się zwiększeniu
powierzchni granicznej między wodą i tłuszczem), po wytrząsaniu małe kropelki tłuszczu bardzo długo będą
utrzymywać się w wodzie, nie łącząc się wzajemnie. Powstaje biała, ,,mleczna’’ ciecz, tzw. emulsja tłuszczu
Wykonanie: Do 2 probówek, zawierających po 4 ml wody dodać kilka kropli oleju. Do jednej z nich
wprowadzić 0,5 ml roztworu mydła. Zawartość obu probówek silnie wstrząsnąć. W probówce
zawierającej środek emulgujący tworzy się trwała emulsja tłuszczu w wodzie.
Ekstrakcja lecytyn z żółtka jaja
Lecytyny występują w dużych ilościach w żółtku jaja, skąd mogą być wyekstrahowane etanolem na
gorąco. Ich rozpuszczalność w alkoholu jest uwarunkowana obecnością grup hydrofilowych: reszty
kwasu fosforowego i IV-rzędowej zasady - choliny. Po odparowaniu z ekstraktu etanolu pozostaje
mazisty osad lecytyny podbarwiony żółto ekstrahującymi się równocześnie związkami
karotenowymi.
Wykonanie: Żółtko jaja zalać w zlewce 40 ml etanolu, wymieszać. Zlewką przykryć szkiełkiem
zegarkowym i ogrzewać 10 minut w gorącej łaźni wodnej, uważając aby alkohol nie odparował. Wytrąca
się osad zdenaturowanych białek i niektórych lipidów. Osad ten odsączyć i przepłukać na sączku
niewielką ilością etanolu. Przesącz i popłuczyny zawierające rozpuszczalną lecytynę odparować w
parowniczce na łaźni wodnej. Uzyskany preparat lecytyny zachować do badania właściwości tłuszczów
oraz identyfikacji substancji wchodzących w skład lecytyn.
Analiza składu chemicznego lecytyn
1. Próba na fosfor
Wykonanie: Niewielką ilość osadu lecytyn stopić w suchym tygielku porcelanowym z 3-krotną ilością
mieszaniny spalającej (KNO3 i Na2CO3 w stosunku 2:3). Stop rozpuścić w gorącej wodzie i przesączyć.
Do przesączu dodać stężony roztwór HNO3 i 5% roztwór molibdenianu amonu. Po zagotowaniu wytrąca
się żółty, krystaliczny osad fosforomolibdenianu amonowego.
2. Próba na azot
Wykonanie: Osad lecytyn ogrzać w probówce z równą ilością wapna sodowanego (mieszanina Ca(OH)2 i
NaOH w stosunku 1:1). Wydziela się amoniak, który poznaje się po zapachu lub zmianie zabarwienia
zwilżonego papierka lakmusowego, trzymanego nad probówką..
3. Próba na glicerol
Wykonanie: Z częścią otrzymanego osadu lecytyn wykonać próbę akroleinową na glicerol. Zapach
akroleiny wydzielający się pod wpływem ogrzewania lecytyn z KHSO4 świadczy o tym, że komponentem
alkoholowym lecytynach jest glicerol.
4. Zmydlanie lecytyn
Wykonanie: Osad lecytyn ogrzewać z 5 ml 30% NaOH w obecności 2,5 ml 30% etanolu. Obserwuje się
powstanie mydła. Pod wpływem ogrzewania z ługiem ulegają hydrolizie estrowe połączenia glicerolu i
kwasów tłuszczowych występujących w lecytynach.
5. Próba na cholinę
Wykonanie: Grudkę lecytyny zalać w parowniczce 4 ml 2M roztworu NaOH, ogrzewać łagodnie stale
mieszając i uzupełniając ubytek odparowanej wody. Roztwór utrzymywać we wrzeniu przez 5 minut.
Następnie dodać 80% roztworu kwasu octowego do wystąpienia odczynu kwaśnego wobec papierka
lakmusowego. Wytrącone kwasy tłuszczowe odsączyć. Kroplę przesączu przenieść na szkiełko
podstawowe, dodać kroplę stężonego roztworu jodu. Nakryć szkiełkiem nakrywkowym i oglądać w małym
powiększeniu mikroskopu. Po upływie minuty powstają pryzmatyczne, brunatne kryształy jodku choliny.
WYKRYWANIE WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W TŁUSZCZACH
Uwaga !!!
Reakcje dla witamin przeprowadzać wyłącznie w suchych probówkach i bezwzględnie
pod dygestorium!
Witamina A
Wykrywanie witaminy A metodą Carra-Price’a - reakcja z chlorkiem antymonu(III)
Witamina A i karotenoidy dają niebieskie zabarwienie z nasyconym roztworem trójchlorku
antymonu. Witaminę A z materiału biologicznego ekstrahujemy za pomocą chloroformu. Ekstrakt
chloroformowy służyć może nie tylko do wykrywania, ale również do ilościowego oznaczania
witaminy A, poprzez pomiar absorbancji produktu reakcji z SbCl3.
Wykonanie: Do 1 ml roztworu, zawierającego badaną substancję dodać 2 ml 30% chloroformowego
roztworu SbCl3. Powstaje niebieskie, szybko zanikające zabarwienie. Reakcja jest również
charakterystyczna dla karotenoidów i niektórych steroli
Uwaga: Wszystkie użyte do analizy odczynniki powinny być wolne od domieszek wody i alkoholu
Witamina E
Wykrywanie witaminy E (tokoferoli)
Tokoferole, tzn. witamina E, to grupa pokrewnych związków występujących w olejach roślinnych,
wywodzących się od tokolu a różniących się między sobą liczbą i położeniem grup metylowych.
W celu identyfikacji poszczególnych tokoferoli należy je przedtem rozdzielić, czy też oddzielić od
towarzyszących im związków. Można tu wykorzystać różnicę w polarności poszczególnych
związków. Tokoferole związane estrowo lub w roztworach tłuszczów trzeba najpierw uwolnić przez
zmydlanie. Grupą funkcyjną nadającą im właściwości redukcyjne jest grupa OH w pozycji 6.
Metody oznaczania tokoferoli są oparte na wykorzystaniu tych właściwości w reakcjach
chemicznych.
Reakcja Further-Meyera
Wykonanie: Do 1 ml badanej substancji dodać 0,2 ml stężonego kwasu azotowego(V). Ogrzewać
mieszaninę na łaźni wodnej w temp. 75 0 C przez 15 minut. Powstaje związek o głęboko czerwonym
zabarwieniu ponieważ utlenianie tokoferoli kwasem azotowym powoduje powstawanie ortochinonów
o zabarwieniu czerwonym, tzw. czerwień tokoferolowi.
Reakcja Naira-Mogara
Wykonanie: Zmieszać 1 cm3 etanolowego roztworu badanej substancji z 0,5 cm3 1/2% roztworu kwasu
molibdenofosforowego w kwasie octowym. Pojawienie się żółtozielonego zabarwienia świadczy o obecności
związku redukującego
Reakcja Emmerie-Engla (z chlorkiem żelaza(III) i -dwupirydylem)
Wykonanie: Do 1ml etanolowego roztworu badanej substancji dodać 0,5 ml 0,2% etanolowego roztworu
FeCl3, a następnie 1 ml 0,5% etanolowego roztworu etanolu -dwupirydylu. Powstaje intensywnie
czerwone zabarwienie od soli ’-dwupirydylowej tokoferolu z jonami żelaza(III).
Witaminy z grupy D
Wykrywanie witamin D2 i D3 (ergokalcyferolu i cholekalcyferolu)
Reakcja z bezwodnikiem octowym w obecności stężonego kwasu siarkowego
Wykonanie: Do 1ml roztworu zawierającego badaną substancję dodać 0,1 ml bezwodnika octowego oraz
0,1 ml stężonego H2SO4 i całość intensywnie wymieszać. Pojawia się zabarwienie czerwone, szybko
przechodzące w fioletowe i często błękitne, a potem zielone (zależnie od zawartości witamin w próbce)
Reakcja z chlorkiem antymonu(III)
Wykonanie: Do 1 ml roztworu zawierającego badaną substancję dodać 2 ml 30 % chloroformowego
roztworu chlorku antymonu(III). Pojawia się pomarańczowożółte zabarwienie, które po krótkim czasie
staje się bardziej intensywne.
Reakcja z sacharozą w obecności stężonego kwasu siarkowego (VI)
Wykonanie: Do 1 ml etanolowego roztworu badanej substancji dodać 1ml etanolowego roztworu
sacharozy i kilka kropli stężonego kwasu siarkowego(VI). Pojawia się czerwone zabarwienie, a podczas
dodawania większej ilości kropli tego odczynnika może pojawić się barwa niebieska.
Reakcja z bromem
Wykonanie: Do 1 cm3 chloroformowego roztworu badanej substancji dodać 5 kropli roztworu bromu
w chloroformie. Powstaje zielone zabarwienie roztworu.
Materiał teoretyczny do ćwiczenia obejmuje zagadnienia wykładowe oraz wiadomości z podręcznika „Ćwiczenia z
biochemii”, L. Kłyszejko Stefanowicz, rozdz. 8.1, tzn. Lipidy i lipoproteiny, str. 306-320.