docWykorzystanie miejscowo-specyficznych nukleaz
download 
Reklamacja Transkrypt
Wykorzystanie miejscowo-specyficznych nukleaz
Seediscussions,stats,andauthorprofilesforthispublicationat:https://www.researchgate.net/publication/278024048 Wykorzystaniemiejscowo-specyficznych nukleazdomodyfikacjigenomówroślinnych (Site-specificnucleasesinplant... ArticleinAdvancesincellbiology·November2014 CITATIONS READS 0 786 2authors: PawełSega AnnaLinkiewicz AdamMickiewiczUniversity InstytutHodowliiAklimatyzacjiRoslin 4PUBLICATIONS0CITATIONS 41PUBLICATIONS1,554CITATIONS SEEPROFILE SEEPROFILE Someoftheauthorsofthispublicationarealsoworkingontheserelatedprojects: IdentificationandcharacterizationofbarleyhomologsofPSR1transcriptionfactorinvolvedinthe regulationofgeneexpressioninresponsetophosphorusdeficiencyinbarley(Hordeumvulgare). Viewproject AllcontentfollowingthispagewasuploadedbyPawełSegaon11June2015. Theuserhasrequestedenhancementofthedownloadedfile.Allin-textreferencesunderlinedinblueareaddedtotheoriginaldocument andarelinkedtopublicationsonResearchGate,lettingyouaccessandreadthemimmediately. POSTĘPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM 41 2014 NR 4 (701–720) WYKORZYSTANIE MIEJSCOWO-SPECYFICZNYCH NUKLEAZ DO MODYFIKACJI GENOMÓW ROŚLINNYCH SITE-SPECIFIC NUCLEASES IN PLANT GENOME EDITING Paweł SEGA, Anna LINKIEWICZ Laboratorium Kontroli GMO, Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Państwowy Instytut Badawczy w Radzikowie Streszczenie: Możliwość precyzyjnej modyfikacji fragmentu DNA w genomie roślinnym, na drodze mutagenezy miejscowo-specyficznej, stanowi istotne osiągnięcie dla prac podstawowych z zakresu biologii roślin jak też dla biotechnologii roślin uprawnych. Precyzyjne zmiany w genomie są możliwe dzięki opracowaniu przełomowej metody mutagenezy ukierunkowanej, polegającej na wykorzystaniu nukleaz miejscowo-specyficznych – nowych narzędzi biologii syntetycznej. Zaprojektowane domeny wiążące DNA pochodzące z czynników transkrypcyjnych z motywem palca cynkowego czy bakteryjnych czynników aktywujących transkrypcję TAL, w połączeniu z domeną nukleolityczną enzymów restrykcyjnych klasy II, odpowiadają za rozpoznawanie oraz wprowadzanie pożądanych zmian w wybranym locus. Precyzyjne wprowadzenie zmiany w sekwencji DNA, zachodzi w miejscu podwójnego pęknięcia nici DNA, co w konsekwencji wyzwala mechanizmy naprawcze, które obejmują zarówno niehomologiczne łączenie końców jak i rekombinację homologiczną. Wśród nukleaz miejscowo-specyficznych wyróżnić można: meganukleazy, nukleazy z motywem palca cynkowego, aktywujące transkrypcję nukleazy TALE oraz bakteryjny system CRISPR/Cas9. Zastosowanie wymienionych technik może pozwolić na uniknięcie problemów natury prawnej, związanych z wykorzystaniem organizmów genetycznie zmodyfikowanych na drodze transgenezy. W artykule porównano powszechnie stosowane nukleazy miejscowo-specyficzne, a także przeprowadzono ocenę omawianych technik mutagenezy co do możliwości otrzymywania roślin nietransgenicznych o cechach pożądanych w nowoczesnej hodowli roślin. Słowa kluczowe: nukleazy DNA, mutageneza ukierunkowana, inżynieria genetyczna, hodowla roślin Summary: The ability to edit DNA sequences in plant genomes via site-directed mutagenesis is of great importance for basic plant biology and agriculture biotechnology. Targeted genome modifications become possible using site-specific nucleases- new synthetic biology tools. Recent advances in genetic engineering allow to modify naturally occurring nucleases. Designed domains derived from zinc finger transcription factors or transcription activator-like effectors fused to endonuclease domain of a class II restriction enzyme are responsible for identifying and introducing desired changes in the selected locus. Precise editing of DNA sequence occurs by introducing double strand break and repair by 702 P. SEGA, A. LINKIEWICZ subsequent mechanism involving either non-homologous end joining or homologous recombination. Site-specific nucleases comprise meganucleases, zinc-finger nucleases, transcription activator-like effector nucleases, and clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated system. The application of these tools can help overcome legal problems related to use of genetically modified organisms. We present and discuss commonly used systems for site-specific genome engineering and highlight the ability to create non-transgenic plants for modern plant breeding. Key words: DNA nucleases, targeted mutagenesis, genetic engineering, crop breeding improvement WSTĘP Mutacje są kluczowymi czynnikami zmienności oraz ewolucji genomów. Rozwój współczesnej genetyki, inżynierii genetycznej oraz genomiki umożliwił poszukiwanie a także generowanie nowych źródeł zmienności na drodze mutagenezy ukierunkowanej. Spontaniczne mutacje gromadzą się w sposób naturalny, w wyniku np. błędów podczas replikacji, transpozycji oraz naprawy DNA po ekspozycji na światło UV. Mutageny fizyczne takie jak promieniowanie jonizujące, promieniowanie ultrafioletowe czy chemiczne, np. EMS (metanosulfonian etylu) z powodzeniem wykorzystuje się od lat do generowania postępu biologicznego w hodowli roślin. Zastosowanie mutagenów pozwala na indukcję szeregu zmian zlokalizowanych w losowych, niemożliwych do przewidzenia miejscach w całym genomie. Z tego powodu fenotyp roślin otrzymanych po mutagenezie jest wypadkową wszystkich uzyskanych mutacji. Zniwelowanie tła genetycznego po mutagenezie indukowanej jest pracochłonnym etapem w konwencjonalnej hodowli roślin [6, 15, 67]. Dopiero pod koniec lat 90 ubiegłego wieku stało się możliwe indukowanie mutacji w ściśle określonym miejscu w genomie. Osiągnięcia na polu inżynierii genetycznej umożliwiły wprowadzenie w materiale genetycznym roślin uprawnych kierunkowych, miejscowo-specyficznych zmian, takich jak mutacje punktowe, insercje czy delecje całych odcinków DNA. Miejscowo specyficzne nukleazy (ang. Site-Specific Nucleases, SSN), białka enzymatyczne z grupy endonukleaz, umożliwiają wprowadzenie konkretnej zmiany w sekwencji nukleotydowej DNA w określonym miejscu w genomie. Ich działanie polega na rozpoznaniu i przecięciu dwuniciowej cząsteczki DNA o ściśle określonej sekwencji. Podstawowe zastosowania u roślin dotyczą obecnie inaktywacji pojedynczych genów, nieznacznych modyfikacji funkcji genu (poprzez mutację sekwencji czy naprawę rekombinacyjną) oraz miejscowo-specyficznej integracji egzogennej sekwencji DNA [2, 67]. Prace na modelowych gatunkach, takich jak rzodkiewnik [2, 96] czy ryż [52, 59], w dużej mierze przyczyniły się do rozwoju nowej technologii, a w rezultacie do wzrostu w ostatnich latach liczby użytecznych patentów [100]. W pracy zostaną opisane postępy związane z wykorzystaniem technik nukleaz miejscowo-specyficznych do badań nad funkcją genów w systemach roślinnych oraz do uzyskania nowych cech, istotnych dla hodowli roślin. MUTAGENEZA KIERUNKOWA W GENOMICE ROŚLIN 703 UKIERUNKOWANA MODYFIKACJA GENOMÓW ROŚLINNYCH Wszystkie techniki mutagenezy z udziałem miejscowo specyficznych nukleaz łączy wspólny etap prowadzący do pęknięcia podwójnej nici DNA (ang. Double-Strand Break, DSB), oraz odbudowa nici przez jeden z dwóch szlaków naprawczych dsDNA w komórce. Komórkowe procesy naprawy zmian typu DSB polegają na łączeniu niehomologicznych końców DNA (ang. Non-Homologous End Joining, NHEJ) lub homologicznej rekombinacji (ang. Homologous Recombination, HR) [44, 67, 78]. U wyższych eukariontów, w tym u roślin, dominuje szlak naprawy DNA typu NHEJ występujący 1000 razy częściej niż rekombinacja homologiczna [67, 93]. Jednak jest mniej precyzyjny, przez co z większym prawdopodobieństwem generuje małe delecje lub insercje (tzw. indele). W konsekwencji powstałe zmiany prowadzą do wyłączenia funkcji genu lub przesunięcia ramki odczytu [67, 90]. Alternatywnym podejściem jest wykorzystanie obecności donora zawierającego homologiczną sekwencję DNA do miejsca powstania pęknięcia podwójnej nici DNA [47, 54]. Aktywowany jest wówczas mechanizm naprawy HR, co prowadzi do zamiany konkretnej sekwencji, jej integracji lub addycji dodatkowego fragmentu DNA. Homologiczna rekombinacja umożliwia precyzyjną naprawę w miejscu skrzyżowania donorowego DNA z DSB. Pozwala na zamianę egzogennego locus zawierającego w swojej sekwencji bezbłędne mutacje, a także wprowadzanie dowolnych, obcych genów [44, 93]. Techniki miejscowo-specyficznych nukleaz dzieli się na trzy grupy, w zależności od poziomu integracji rekombinowanego DNA z genomem gospodarza. Do pierwszej grupy można zaliczyć metody wykorzystujące nukleazy do generowania miejscowo-specyficznych przypadkowych mutacji, najczęściej za pośrednictwem jednego, podwójnego pęknięcia DNA [36]. Metody należące do tej grupy mogą również być zaprojektowane tak, aby wprowadzać dwa pęknięcia podwójnej nici DNA. Wówczas powstaje duża delecja między dwoma docelowymi regionami DNA. W ten sposób możliwe jest usunięcie całych regionów regulatorowych, egzonów, intronów, całego genu lub nawet części chromosomów. Powstanie dwóch DSB może prowadzić do duplikacji, inwersji lub translokacji sekwencji znajdującej się między powstałymi pęknięciami [56, 72]. W przypadku technik drugiego typu wykorzystuje się egzogenną matrycę DNA (zwaną DNA donorowym) do naprawy uszkodzeń za pomocą mechanizmu homologicznej rekombinacji. Donorowe DNA zawiera pożądane, ukierunkowane mutacje (substytucje nukleotydowe i/lub krótkie indele), ale wymaga również wysokiej homologii sekwencji do genu endogennego, aby umożliwić zajście homologicznej rekombinacji [31]. Tak zmodyfikowany egzogenny fragment DNA jest wprowadzany na miejsce istniejącej, homologicznej sekwencji. Tego typu zmiany są przydatne np. w celu naprawy niepożądanych, spontanicznych mutacji (ukierunkowana korekcja genu) lub wprowadzenia nowych, ukierunkowanych mutacji oraz wartościowych cech (zastąpienie genu lub allelu) [31, 70]. W trzeciej grupie znajdują się 704 P. SEGA, A. LINKIEWICZ techniki mające na celu wprowadzenie długich fragmentów DNA (np. transgenów) w określonym locus, stosując zaprojektowane DNA donorowe. Egzogenne DNA powinno zawierać pożądaną sekwencję wraz z DNA flankującym, wykazującym wysoką homologię do docelowego locus. Ułatwia to ukierunkowaną integrację DNA w miejscu powstania pęknięcia podwójnej nici DNA [56, 70, 72]. NUKLEAZY MIEJSCOWO-SPECYFICZNE Do generowania zmian w genomach roślinnych wykorzystuje się meganukleazy, nukleazy z motywem palca cynkowego (ang. Zinc Finger Nucleases, ZFN), nukleazy TALE (ang. Transcription Activator-Like Effectors) oraz modyfikacje bakteryjnego systemu odpornościowego CRISPR/Cas (ang. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats / CRISPR-associated). MEGANUKLEAZY Meganukleazy są to naturalnie występujące, wysoce specyficzne endonukleazy, zwane również samonaprowadzającymi endonukleazami (ang. homing endonucleases), rozpoznające sekwencje o długości 14-40 pz. Po raz pierwszy zostały opisane w latach osiemdziesiątych XX wieku u drożdży [3, 40]. Można je znaleźć w wielu organizmach żywych, od archebakterii, przez fagi, grzyby, aż po niektóre gatunki alg, rośliny wyższe i zwierzęta. Zidentyfikowano setki tego typu enzymów podlegających ekspresji w różnych kompartymentach komórkowych: jądrze komórkowym, mitochondrium czy chloroplastach. Jednak do tej pory ich rola nie została jednoznacznie opisana, dlatego najczęściej są klasyfikowane jako „samolubne elementy genetyczne”. Uważa się, że meganukleazy biorą udział w rozpoznawaniu oraz cięciu sekwencji łączącej dwa egzony, w której znajduje się intron. Tego typu pasożytnicze molekuły są zdolne do samowycinania z cząsteczki gospodarza (mRNA, rRNA, tRNA z intronów lub białka z intein) oraz ligowania do końca innych cząsteczek bez zaburzania ich biologicznej funkcji [2, 67]. Ze względu na strukturę powtórzeń (motywów) oraz sekwencję aminokwasową, meganukleazy można podzielić na 5 rodzin: LAGLIDADG [43, 86], GIY-YIG [48], HNH [94], His-Cys box [24] oraz PD-(D/E)XK [50, 84]. Nazewnictwo poszczególnych klas enzymów w ramach rodziny, opiera się o prefiks dołączony do nazwy enzymu: I, dla enzymów kodowanych w intronach (np. I-CreI); PI, kodowanych w inteinach (np. PI-SceI) lub F, dla enzymów niezależnie kodowanych (np. F-SceI) [3, 75]. Największą i najlepiej scharakteryzowaną molekularnie rodziną jest LAGLIDADG, której nazwa pochodzi od konserwowanego powtórzenia peptydowego. Meganukleazy z tej rodziny najczęściej są kodowane w intronach lub inteinach, rzadko występują jako niezależne jednostki transkrypcyjne. Niektóre z nich zawierają jeden, inne dwa charakterystyczne motywy sekwencji aminokwasowej LAGLIDADG, któ- MUTAGENEZA KIERUNKOWA W GENOMICE ROŚLIN 705 RYCINA 1. Interakcje DNA-białko meganukleazy I-CreI z docelową sekwencją. Kolorem szarym zaznaczono monomery wiążące DNA. Czerwoną linią zaznaczono miejsce cięcia. Litery N – oznaczają dowolny nukleotyd sekwencji docelowej [wg 2, zmienione] FIGURE 1. DNA-protein interactions of I-CreI meganuclease and targeted DNA sequences DNA-binding monomers are indicated in grey. Red lines show cleavage site. Letter N – means any nucleotide of targeted sequence [acc. to 2, changed] re stanowią zasadniczy element aktywności enzymatycznej. Rodzina ta zawiera dwie bardzo dobrze poznane i molekularnie scharakteryzowane endonukleazy: endonukleaza I-CreI, wyizolowana z Chlamydomonas reinhardtii (ryc. 1), zawierająca jeden motyw [3, 79, 87] oraz endonukleaza I-SceI z Saccharomyces cerevisiae z dwoma motywami [49, 23]. W obu przypadkach struktura peptydu jest podobna, zawierająca fałdowanie αββαββα, z motywem LAGLIDADG zawartym w terminalnym odcinku pierwszej helisy. Charakterystyczne powtórzenie wchodzi w skład dwuczęściowego centrum katalitycznego oraz formuje rdzeń łączący podjednostki. Naturalnie występujące endonukleazy rozcinają w miejscu rozpoznawania konkretne, niezmienne sekwencje DNA. Inżynieria genetyczna pozwala na otrzymanie zrekombinowanych endonukleaz, ukierunkowanych na wybrane locus w genomie [86]. Najczęściej wykorzystywany enzym I-CreI jest homodimerem rozpoznającym fragment sekwencji DNA o długości 22 pz (ryc. 1). Przestrzennie enzym zbudowany jest z dwóch przeciwległych monomerów, z których każdy wiąże odcinek DNA o długości 9 pz [2, 3]. Interakcje białko-DNA zachodzą za pośrednictwem wiązań wodorowych. Pomiędzy odwróconymi monomerami pozostaje fragment DNA o długości 4 pz, który nie jest fizycznie związany z enzymem. Enzym nacina wiązanie fosfodiestrowe po obu stronach centralnej sekwencji, pozostawiając dwa niesparowane odcinki DNA o długości 4 pz z nawisami 3’. Analizy strukturalne kompleksu wiążącego I-CreI wykazały, że mechanizm rozpoznawania DNA nie jest skomplikowany. Wiązane zasady azotowe DNA są określane na podstawie ich bezpośredniego kontaktu z pojedynczym łańcuchem bocznym aminokwasu zawartego w strukturze enzymu [79]. Mechanizm ten pozwala na dobór aktywności oraz miejsca wiązania meganukleaz, poprzez zmianę niewielkiej liczby aminokwasów, bezpośrednio zaangażowanych w wiązanie niezależnych zasad [2]. 706 P. SEGA, A. LINKIEWICZ TABELA 1. Przykładowe zastosowania meganukleaz, ZFN, nukleaz TALE, systemu CRISPR/Cas9 u roślin TABLE 1. List of applications of meganucleases, ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9-mediated genome editing in plants Gatunek Cel badania Nukleaza Metoda dostarczenia Cięcie unikalnej, egzogennej sekwen- Meganukleaza Agrotransformacja cji DNA np. genu markerowego BAR I-CreI ZFN Agrotransformacja czy genu reporterowego GUS Inaktywacja genu ABA-INSENSITIVE4 (ABI4) Inaktywacja genu ALCOHOL Rzodkiewnik DEHYDROGENASE1 (ADH1) oraz TRANSPARENT TESTA4 (TT4) Bawełna Jęczmień Kukurydza Ryż Soja Tytoń Referencja [2] [20] ZFN Agrotransformacja [65] ZFN/TALEN Agrotransformacja Transformacja protoplastów [95] [14] Inaktywacja genów BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1 (BRI1), JASMONATE-ZIMCRISPR/Cas9 -DOMAIN PROTEIN 1 (JAZ1) oraz GIBBERELLIC ACID INSENSITIVE (GAI) Meganukleaza Addycja genów hppd, epsps I-CreI Ukierunkowana mutageneza promoTALEN tora genu HvPAPhy_a Inaktywacja genu reporterowego gfp TALEN Ukierunkowana mutageneza genu Meganukleaza LIGULELESS1 (LG1) I-CreI Agrotransformacja [26] Biolistyczna [22] Agrotransformacja [91] Agrotransformacja [35] Agrotransformacja [32] Addycja genu IPK1 ZFN Kultura komórkowa [83] Inaktywacja promotora genu Os11N3 Inaktywacja genu CHLOROPHYLL A OXYGENASE 1 (CAO1) Ukierunkowana mutageneza genu DICER-LIKE (DCL) Inaktywacja genu mDeRED TALEN Agrotransformacja [52] CRISPR/Cas9 Agrotransformacja [59] ZFN Agrotransformacja [19] CRISPR/Cas9 Agrotransformacja [41] Inaktywacja genów SurA, SurB TALEN Inaktywacja genu PHYTOENE DESATURASE (PDS) CRISPR/Cas9 Agrotransformacja Transformacja protoplastów [97] [53] [63] Meganukleazy jako pierwsze zostały wykorzystane do indukowania ukierunkowanych dwuniciowych pęknięć w genomach roślin m.in. do mutagenezy kukurydzy [32], do usunięcia transgenicznych sekwencji u rzodkiewnika [2], w uzyskaniu transgenezy wielokrotnej (z ang. gene stacking) u bawełny [22] (tab. 1). Nie przypuszcza się jednak, aby meganukleazy w przyszłości pełniły znaczącą rolę w generowaniu zmian genetycznych u roślin, ze względu na czasochłonne tworzenie konstruktów oraz skomplikowaną metodykę (tab. 2). 707 MUTAGENEZA KIERUNKOWA W GENOMICE ROŚLIN TABELA 2. Porównanie technik miejscowo-specyficznej mutagenezy oraz ocena ich przydatności w genomice roślin TABLE 2. Comparison of site-specific nucleases-based methods and their evaluation in plant genomics Meganukleazy •Długość sekwencji docelowej: > 12 pz •Naturalne endodeoksyrybonukleazy ZFN •Długość sekwencji docelowej: 18-30 pz •Dwa monomery zbudowane z 3-6 Cechy modułów, każdy charakterywiążący tryplet DNA styczne + domena FokI •Kompleks białko:DNA +bardzo + niska +najlepiej + poznana cytotoksyczność technika +bardzo + niski +duża + liczba baz poziom efektów danych, sekwenniedocelowych cji oraz aplikacji +wysoce + bioinformatycznych specyficzne +dostępne + metody +prosty + transfer do detekcji oraz oceny Zalety komórki aktywności niedocelowej na genom +możliwość + montażu różnych motywów ZFN (CoDA) TALEN •Długość sekwencji docelowej: 50-60 pz •Dwa monomery, każdy zbudowany z 13-30 modułów, wiążą 1 pz + domena FokI •Kompleks białko: DNA +bardzo + prosta budowa domen wiążących DNA +łatwość + modyfikacji sekwencji +wydajne, + powtarzalne, swoiste +mniej + cytotoksyczne niż ZFN +niski + poziom efektów niedocelowych w genomie +rosnąca + dostępność narzędzi bioinformatycznych, baz danych +stosunkowo + tanie podejście -- ograniczona liczba -- ograniczone możli- -- efektywność procesu meganukleaz do wości ukierunkowania ograniczona w rejonach wykorzystania enzymu na konkretne nieaktywnych tran-- trudne projekto- locus skrypcyjnie (zależne wanie konstruktów -- brak palców cynko- epigenetycznie) w porównaniu do wych dla wszystkich -- wieloznaczność Wady pozostałych technik trypletów DNA modułu rozpoznającego -- budowa -- trudna konstrukcja guaninę (G/A) niemodułowa ukierunkowanych ZFN -- najdroższe podejście Perspektywy + +++ +++++ Specyficzność Wysoka Średnia Wysoka działania Efekty Niskie Wysokie Niskie niedocelowe Toksyczność Niska Wysoka Niska Projektowanie Trudne Trudne Łatwe konstruktu Wydajność vs Średnia Niska Wysoka koszty CRISPR/CAS •Długość sekwencji docelowej: ok. 20 pz •Parowanie RNA oraz DNA przy udziale transkryptu naprowadzającego oraz nukleazy Cas9 •Kompleks RNA:DNA +możliwość + cięcia w konkretnym, specyficznym rejonie DNA +prosta + budowa oparta o jedno, stałe białko oraz elastyczną cząsteczkę RNA +najkrótszy + czas zaprojektowania cząsteczki +najtańsze + podejście +dynamicznie + rosnące zainteresowanie w genomice roślin -- wysoki poziom efektów niedocelowych w genomie -- konieczna ocena wpływu tego podejścia na cyto- oraz genotoksyczność -- mały zasób informacji, aplikacji bioinformatycznych, baz danych +++++ Wysoka Wysokie Wysoka Bardzo łatwe Bardzo wysoka 708 P. SEGA, A. LINKIEWICZ NUKLEAZY Z MOTYWEM PALCA CYNKOWEGO Nukleazy z motywem palca cynkowego są najlepiej scharakteryzowaną oraz jedną z najczęściej wykorzystywanych w ostatnich latach technik miejscowo-specyficznej mutagenezy. W przeciwieństwie do meganukleaz są to syntetyczne białka, powstałe w wyniku połączenia naturalnie występujących domen – wiążącej DNA, z motywem palca cynkowego oraz domeny nacinającą DNA, posiadającej enzym restrykcyjny typu IIS, np. FokI [13]. Palec cynkowy zbudowany z dwóch antyrównoległych β-kartek i jednej α-helisy. W centrum katalitycznym obecny jest jon cynku (Zn2+), który odgrywa kluczową rolę dla funkcjonalności oraz stabilności domeny. Najpopularniejsza klasa palców cynkowych Cys2His2, zawiera motyw sekwencji o długości około 30 aminokwasów [29]. Struktura drugorzędowa domeny zawiera fałdowanie αββα, która jest stabilizowana przez centralnie położony atom cynku koordynowany dwiema wysoce konserwowanymi resztami cysteiny oraz histydyny [29, 31, 72]. Poszczególne palce cynkowe odpowiadają za rozpoznanie trzech sąsiadujących nukleotydów. Zaznaczyć należy, że wykazują one pełną funkcjonalność jako monomery, dzięki czemu możliwe jest łączenie kilku palców cynkowych, w zależności od sekwencji nukleotydowej. Montaż od 3 do 4 monomerów pozwala na ukierunkowanie miejsca docelowego, a w konsekwencji rozpoznanie miejsca wiązania DNA o długości 18-30 pz [15] (ryc. 2A). Nukleazy ZFN posiadają również domenę FokI, która do aktywności katalitycznej wymaga dimeryzacji pary monomerów, rozdzielonych w konstruktach genetycznych przerywnikiem o długości 5-9 pz. Podczas połączenia dwóch monomerów FokI dochodzi do nacięcia DNA oraz powstania pęknięcia podwójnej nici DNA [15, 46, 72]. Do tej pory opracowano liczne rozwiązania pozwalające na projektowanie, tworzenie oraz montaż własnych, niestandardowych nukleaz ZFN. Teoretycznie polimorficzne moduły są zdolne do rozpoznania każdej trójki nukleotydów. Informacje dotyczące naturalnych jak i sztucznych motywów rozpoznających niemal wszystkie kombinacje nukleotydów, można znaleźć w bazie danych ZiFBD [29]. Łączenie poszczególnych monomerów w zależności od sekwencji docelowej (tzw. CoDA, ang. Context-Dependent Assembly) nie jest przypadkowe [76]. Dobór palców cynkowych jest ważny z powodu różnic w efektywności oraz specyficzności wiązania DNA [8]. Palce cynkowe dla pojedynczej nici DNA są montowane przy użyciu N- (F1) oraz C- (F3) końcowych monomerów, zawierających wspólny monomer (F2) (ryc. 2A). Kombinacja ta pozwala na wykorzystanie łącznie 600 różnych palców F1 oraz F3, tak zaprojektowanych aby łączyć się ze stałymi jednostkami F2 [16, 25, 46, 47]. Technika nukleaz ZFN ma zastosowanie nie tylko w medycynie, ale coraz częściej w biotechnologii roślin. W 2005 po raz pierwszy przeprowadzono ukierunkowaną mutagenezę za pośrednictwem nukleaz ZFN u rzodkiewnika [55]. W kolejnych latach zastosowano je u tego samego gatunku do inaktywacji niepożądanych elementów genetycznych po transgenezie np. genu reporterowego gus [20] czy inaktywacji sekwencji endogennych [65, 95]. Podobne badania prowadzono dla tytoniu [12, 88, 92], soi [19], kukurydzy [83] czy petunii [58] (tab. 1). MUTAGENEZA KIERUNKOWA W GENOMICE ROŚLIN 709 RYCINA 2. Schemat trzech nukleaz miejscowo-specyficznych: (A) Para nukleaz z motywem palca cynkowego związana z DNA. Odpowiednio F1, F2, F3 oznaczają pojedyncze moduły, każdy wiążący 3 nukleotydy; Kolorem fioletowym oznaczono domeny nacinające DNA (FokI); (B) Para monomerów TALEN, każdy zbudowany z 16-17 modułow. Czterema kolorami oznaczono indywidualne moduły charakterystyczne dla każdej zasady azotowej. Kolorem fioletowym oznaczono domeny nacinające DNA (FokI); (C) System CRISPR/Cas zawierający nukleazę Cas9 oraz chimerę RNA zbudowaną z komplementarnego jednoniciowego RNA (guided RNA) [wg 13, 15, 67, zmienione] FIGURE 2. Schematic representation of three site-specific nucleases: (A) Pair of ZFNs bound to DNA. Individual modules (F1, F2, F3) recognize and bind three nucleotides of the targeted sequence; FokI cleavage domains are shown as purple elipsas; (B) Pair of transcription activator-like effector nucleases (TALENs) containing 16-17 individual modules, each one binds a single base pair (shows as four colors), FokI cleavage domains are shown as purple elipsas; (C) The CRISPR/Cas system build of single endonuclease, Cas9 and a complementary single-strand guided RNA [acc. to 13, 15, 67, changed] 710 P. SEGA, A. LINKIEWICZ NUKLEAZY TALE Pomimo rosnącego zainteresowania nukleazami z motywem palca cynkowego oraz prac prowadzonych nad tym systemem od 1996 r., możliwości ukierunkowanej mutagenezy są nadal ograniczone. W przełomowych badaniach grupy Bonas [9, 45] został opisany sposób w jaki patogeniczne bakterie z rodzaju Xantomonas infekując roślinę, dostarczają na teren komórki egzogenne białka tzw. czynniki aktywujące transkrypcję. TALEs są naturalnie występującymi białkami, które zawierają domenę wiążącą się z różnymi roślinnymi promotorami. Wywołują choroby u wielu gatunków roślin m.in. u ryżu czy bawełny [82]. Naturalny proces polega na rozpoznaniu poprzez odpowiednie domeny docelowej sekwencji DNA w genomie gospodarza oraz aktywacji ekspresji genów niezbędnych dla rozprzestrzeniania oraz namnażania się patogenu [9, 10, 31]. TALEN, czyli nukleazy powstałe w wyniku dodania domeny nukleolitycznej do domeny wiążącej DNA, konstruowane są jako dimery, podobnie jak ZFN. Charakteryzują się znacznie prostszą budową elementów wiążących DNA, co przekłada się na łatwość ich modyfikacji. Wykazują specyficzne cechy strukturalne, w tym sekwencję odpowiadającą za sekrecję typu III oraz translokację sygnałów w regionie N-końcowym, sygnał lokalizacji jądrowej (ang. Nuclear Localization Signal, NLS), kwasową domenę aktywacji transkrypcji na końcu -C oraz centralną domenę wiążącą DNA. Domena wiążąca DNA może być różnej długości i składa się z 13 do 30 wysoce konserwowanych modułów (ryc. 2B). Każdy moduł odpowiada za rozpoznanie oraz wiązanie jednego, konkretnego nukleotydu. Specyficzność wiązania DNA wynika z obecności pojedynczych polimorfizmów pomiędzy 12 a 13 resztą aminokwasową sekwencji modułów. Polimorficzne składowe białka TALE określa się, jako odrębne powtarzalne zmienne (ang. Repeat-Variable Diresidue, RVD). Można wyróżnić prawie 20 modułów RVD, jednak cztery z nich: HD (rozpoznający cytozynę), NG (rozpoznający tyminę), NI (rozpoznający adeninę) oraz NN (rozpoznający guaninę i adeninę), są najczęściej wykorzystywane na etapie projektowania nukleaz [60, 62, 85]. Odkrycie systemu bakteryjnego regulującego ekspresję genów eukariotycznych szybko stało się przełomowe dla postępu mutagenezy ukierunkowanej roślin. Początkowo opisywano mechanizm działania nukleaz TALE u modelowych gatunków zwierząt. Jednak zaledwie w ostatnich kilku latach opisano efektywność tego podejścia do modyfikacji genomów roślinnych m.in. u rzodkiewnika [14, 51], tytoniu [57, 97], ryżu [52, 80] oraz kłosownicy [80] (tab. 1). SYSTEM CRISPR/CAS9 W ostatnim czasie opisano nowy sposób ukierunkowanej mutagenezy wykorzystujący system CRISPR/Cas, który jest rodzajem mechanizmu odpornościowego występującego u bakterii np. Streptococcus pyogenes. W genomowym locus MUTAGENEZA KIERUNKOWA W GENOMICE ROŚLIN 711 CRISPR kodowana jest endonukleaza Cas9. Białko to jest dużą, monomeryczną nukleazą DNA nakierowaną na sekwencję nukleotydową docelowego locus. Udane rozpoznanie oraz związanie endonukleazy jest zależne od krótkiej sekwencji sąsiadującej tzw. PAM (z ang. Protospacer Adjacent Motif). Ponadto Cas9 tworzy kompleks z dwiema małymi, niekodującymi cząsteczkami RNA znanymi jako CRISPR RNA (crRNA) i transaktywujacym crRNA (tracrRNA). Jednostki RNA umożliwiają białku Cas9 rozpoznanie i przecięcie określonego miejsca w obcym, infekującym komórkę bakterii DNA np. DNA faga czy DNA plazmidowym [4, 15, 68, 74]. W 2012 roku Jinek wraz ze współpracownikami wykazali, że syntetyczna, jednoniciowa chimera RNA (ang. single guided RNA, sgRNA) stanowiąca fuzję crRNA oraz tracrRNA jest tak samo funkcjonalna jak pojedyncze odpowiedniki występujące naturalnie [42]. W rezultacie, w opracowanym systemie CRISPR/Cas wykorzystywanym w mutagenezie występują dwie składowe: endonukleaza Cas9 oraz naprowadzające RNA (gRNA) (ryc. 2C). Zaletą systemu CRISPR/Cas9 jest wysoka specyficzność oraz łatwość projektowania konstruktu, zależna głównie od 20 par zasad budujących gRNA (tab. 2). Białko Cas9 nie wymaga większych zmian i sprawdziło się do tej pory w wielu testowanych systemach. Oprócz tego multipleksowanie i uzyskanie ekspresji kilku syntetycznych RNA w ramach jednego eksperymentu pozwala obniżyć nakłady finansowe i skrócić czas doświadczenia [17]. W rezultacie to właśnie system CRISPR/Cas bazujący na naturalnym systemie odpornościowym bakterii, znajduje największe uznanie wśród badaczy i może stać się przełomową techniką do produkcji pożądanych, nietransgenicznych odmian roślin. Po raz pierwszy w 2013 roku kilka grup badawczych przeprowadziło eksperyment na modelowych gatunkach roślin: tytoniu [53, 63], ryżu [81] oraz rzodkiewniku [53] (tab. 1). AKTYWNOŚĆ NIEDOCELOWA Wszystkie opisane typy mutagenezy miejscowo specyficznej pozwalają na wprowadzenie zaplanowanych zmian w informacji genetycznej roślin. Istnieją jednak dane wykazujące wyjątki od swoistości zaprojektowanych nukleaz, gdzie cięcie endonukleaz nie zawsze następuje wyłącznie w określonym miejscu w genomie. Rozważając aktywność niedocelową nukleaz należy już na etapie projektowania doświadczenia uwzględnić szereg czynników endogennych (epigenetyka, błędy w naprawie DNA) oraz egzogennych (budowa nukleaz, wybór metody transferu do komórki) mogących wpłynąć na skalę tego zjawiska [67]. Główna przyczyna aktywności niedocelowej SSN związana jest z brakiem specyficznego wiązania poszczególnych modułów lub domen białkowych enzymu z docelowym miejscem w genomie. Wzrost aktywności niedocelowej obserwuje się 712 P. SEGA, A. LINKIEWICZ w przypadku obecności innych sekwencji wykazujących wysoki stopień homologii. Ponieważ może to doprowadzić do ewentualnych, niezamierzonych mutacji punktowych lub translokacji, pracuje się nad zwiększeniem przewidywalności doświadczenia oraz zmniejszeniem aktywności wykraczającej poza określony rejon DNA. Istotna jest znajomość mechanizmów naprawy DSB, ponieważ rezultat docelowego cięcia, bez względu na rodzaj nukleaz, jest pośrednio zdeterminowany przez komórkowe mechanizmy naprawy DNA. Różnią się one między organizmami, typami komórek oraz stadiami rozwojowymi organizmu [64, 66, 67]. Wpływ czynników mutagennych na cały organizm jest określany na podstawie testów genotoksycznych oraz cytotoksycznych. Działanie genotoksyczne to zdolność do indukowania zmian na poziomie DNA bezpośrednio przez konkretny mutagen, zarówno dla pojedynczego genu jak i całego genomu. Natomiast testy cytotoksyczne określają możliwości przeżycia komórek, zaburzenia podstawowych procesów komórkowych, replikacji oraz transkrypcji DNA [18, 30]. W komórkach pęknięcia podwójnej nici DNA naprawiane są relatywnie szybko, często nie pozostawiając żadnych śladów lub generując indele o długości kilku par zasad. W kontekście całego genomu te niewielkie zmiany są trudne do zidentyfikowania. Inżynieria genetyczna pozwala na modyfikację enzymów do typu „nickase”, powodujących pęknięcia pojedynczej nici DNA (ang. Single-Strand Break, SSB) a nie podwójnych, jak ma to miejsce w typowej reakcji enzymatycznej [47, 73]. Pojedyncze pęknięcia nici DNA nie są substratami do mniej precyzyjnego szlaku naprawy NHEJ, ale są korygowane za pośrednictwem homologicznej rekombinacji tj. poprzez wycięcie uszkodzonego fragmentu oraz ligację. Zmodyfikowane białka enzymatyczne typu „nickase” stosuje się m.in. w systemie CRISPR/Cas9, w którym zmodyfikowana endonuklaza Cas9-D10A posiada pojedynczą zmianę w sekwencji aminokwasowej [17]. Innym przykładem modyfikacji jest opracowana w warunkach in vitro metoda wykorzystująca integrazę wektora lentiwirusa, która jak się okazuje jest wychwytywana oraz ligowana przez białka uczestniczące w procesie NHEJ [30]. Ponadto nukleazy, ze względu na specyfikę budowy, różnią się poziomem aktywności niedocelowej. Moduły wiążące TALE-DNA wykazują degenerację kodu genetycznego. Co prawda rozpoznają każdy z czterech nukleotydów, jednak moduł dla guaniny wykazuje również powinowactwo do adeniny. Może to prowadzić do niespecyficznego, wielokrotnego wiązania się z DNA. Stale udoskonala się narzędzia wykorzystywane podczas projektowania nukleaz TALE. Jednak w dalszym ciągu opisano oraz zwalidowano niewiele testów jednoznacznie określających wpływ niezamierzonej aktywności na cały genom, tak jak to już zostało opisane dla nukleaz z motywem palca cynkowego [61, 67]. Udoskonalenie oraz porównanie metod diagnostycznych u różnych organizmów w przyszłości pozwoli zwiększyć specyficzność oraz precyzyjnie określić zmiany wywołane aktywnością niedocelową SSN. MUTAGENEZA KIERUNKOWA W GENOMICE ROŚLIN 713 EPIGENETYKA A AKTYWNOŚĆ NUKLEAZ Struktura chromatyny wpływa na upakowanie oraz różnice w dostępności genomowego DNA, co przekłada się na specyficzność a przy tym skuteczność nukleaz [5]. Przykładowo aktywność nukleaz TALE jest obniżona w obecności 5-metylocytozyny, podczas gdy nadaktywność jest obserwowana w czasie demetylacji w regionie cięcia. Analizy in vivo wykazały negatywną korelację pomiędzy aktywnością nukleaz TALE, a liczbą powtórzeń CpG w docelowej sekwencji [11]. Natomiast częstotliwość cięcia miejsc docelowych przez meganukleazy ulega znaczącej poprawie po traktowaniu komórek czynnikami odpowiadającymi za rozluźnienie chromatyny [21]. Z kolei wyciszenie genu ATF7IP, kodującego białko zaangażowane w reorganizację chromatyny, zwiększa prawdopodobieństwo wprowadzenia genu za pośrednictwem homologicznej rekombinacji [21, 67, 89]. Moduły rozpoznające docelowe DNA obecne w ZFN czy TALEN są zależne od czynników transkrypcyjnych, które wiążą się z sekwencjami docelowymi w rejonach chromatynowych. Tym samym białka hybrydowe mogą wiązać się z gęsto upakowanym DNA. Wprowadzone zmiany na poziomie DNA mogą znacząco lub trwale wpłynąć na dynamikę interakcji chromatyny, małych RNA, enzymów, a także sekwencji regulatorowych DNA. Wprowadzenie transgenu do otaczającej struktury chromatyny może wpłynąć na jej lokalne właściwości, powodując tym samym zaburzenie ekspresji genów sąsiadujących, oraz zmianę fenotypu otrzymanego organizmu. Nie ma jednak do tej pory żadnych jednoznacznych przykładów w literaturze, aby takie efekty, jeśli w ogóle występują, utrzymywały się po usunięciu transgenu [1, 67]. Dla roślin zmodyfikowanych genetycznie efekty niedocelowe, cis- czy trans-epigenetyczne są tolerowane dzięki żmudnej, długotrwałej selekcji populacji w programach hodowlanych. Podobnie jak w przypadku tradycyjnych technik hodowlanych, rośliny GM z niepożądanymi cechami fenotypowymi czy niekorzystnymi efektami ubocznymi po mutagenezie, nie przechodzą etapu selekcyjnego [1, 11, 67]. TRANSFER NUKLEAZ DO ORGANIZMU Wybór metody transferu nukleaz do organizmu często jest zależny od: koncentracji nukleaz w komórce, poziomu ich ekspresji, specyficzności wiązania sekwencji docelowej oraz dostępnej aparatury. Minimalizację efektów niedocelowych można uzyskać poprzez optymalizację zawartości nukleaz w komórce. Niska koncentracja powoduje iż cięcie jest wykonywane w stosunkowo krótkim czasie, co ogranicza wtórne uszkodzenia. Mutageneza ukierunkowana na ogół wymaga wprowadzenia genów kodujących nukleazy poprzez transgenezę. Jednakże transgen może zostać rozsegregowany w kolejnych pokoleniach, podczas procesu selekcji [37, 66]. Istotnym jest, że obecność transgenu nie jest wymagana do utrzymania ulepszonej ce- 714 P. SEGA, A. LINKIEWICZ chy. Opracowano wiele metod dostarczenia nukleaz do komórki, między innymi uzyskując przejściową ekspresję z wykorzystaniem kaset ekspresyjnych opartych o promotory indukowane. Konstrukty mogą zostać wprowadzone za pomocą agrotransformacji [65, 95], z wykorzystaniem wektorów plazmidowych [39, 88, 98] czy wektorów wirusowych (lentiwirusy, wektory adenowirusowe, adenosatelitarne wektory wirusowe), które nie integrują z genomem gospodarza, a więc z perspektywy biobezpieczeństwa są mniej kontrowersyjne [18, 38, 69]. Wektory wirusowe powodujące przejściową ekspresję zastosowano między innymi u petunii. Z wirusowym wektorem TRV (ang. Tobacco Rattle Virus) dostarczono nukleazę z motywem palca cynkowego bez etapu transgenezy [58]. Nukleazy mogą również zostać wprowadzone w postaci mRNA, co omija kwestię integracji z genomem oraz skraca czas trwania ekspresji. Podejście to jest stosowane u wielu organizmów modelowych, takich jak muszka owocowa [7], danio pręgowany [28], szczur [34], królik [27] czy komórki ludzkie [99]. Nukleazy mogą zostać również wprowadzone bezpośrednio jako białko. Jednak ich wytwarzanie, izolacja oraz oczyszczanie w odpowiednich ilościach jest niezwykle trudne do osiągnięcia [71]. Niezależnie od sposobu dostarczania, nukleazy mogą być zaopatrzone w konstytutywną lub indukowaną sekwencję odpowiedzialną za degradację oraz redukcję czasu półtrwania w komórce. PODSUMOWANIE Wprowadzenie nowych narzędzi inżynierii genetycznej w postaci nukleaz miejscowo-specyficznych zrewolucjonizowało świat nauki. Nowe metody znacznie poszerzyły dotychczasowe możliwości mutagenezy genomów zarówno roślinnych jak i zwierzęcych. Zmiany w strukturze DNA indukowane technikami SSN są rozpoznawane i naprawiane przez jeden z mechanizmów naprawy DNA w komórce. Teoretycznie nukleazy są przeznaczone do cięcia DNA w określonych miejscach, jednak może dojść również do cięcia w miejscach niezamierzonych. Różne strategie są wykorzystywane do zmniejszenia niezamierzonego efektu mutagenezy, w tym stosowanie heterodimerów czy enzymu typu „nickase” DNA. Do tej pory pozostaje do rozwiązania wiele istotnych problemów związanych ze swoistością, wydajnością oraz toksycznością stosowania SSN, zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo. Na ostateczny efekt niedocelowy powstały w wyniku aktywności nukleaz wpływają: specyfika wybranej metody, częstotliwość występowania miejsc homologicznych do sekwencji docelowej, czynniki endogenne (epigenetyka, wielkość genomu) oraz egzogenne (zastosowany konstrukt, optymalizacja eksperymentu). Udoskonalenie istniejących metod SSN będzie możliwe dzięki oszacowaniu wpływu czynników transkrypcyjnych oraz rekombinaz na strukturę oraz funkcję genomu. Niewiele jest badań, które porównywałyby zastosowanie różnych nukleaz dla modyfikacji określonego endogennego locus. Takie badanie mogłoby dostar- MUTAGENEZA KIERUNKOWA W GENOMICE ROŚLIN 715 czyć wielu istotnych informacji, jeżeli chodzi o wybór oraz modyfikację najbardziej skutecznych oraz bezpiecznych nukleaz. Poszczególne typy SSN (meganukleazy, ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9) różnią się między sobą budową modułów, długością rozpoznawanej sekwencji, specyficznością oraz skalą aktywności niedocelowej i jej toksycznego wpływu na cały organizm. Miejscowo-specyficzne nukleazy stwarzają możliwość przeprowadzenia precyzyjnej korekty, wymiany lub insercji genów bez konieczności stosowania jakichkolwiek markerów selekcyjnych oraz wprowadzania obcego materiału genetycznego. W dalszym ciągu wiele kwestii pozostaje bez jednoznacznej odpowiedzi. Jakie typy mutacji są możliwe do efektywnego wygenerowania w systemach roślinnych? Czy zmodyfikowane zmiany w genomach są stabilne i dziedziczone? Z jaką częstotliwością występują efekty niedocelowe oraz w jaki sposób można zminimalizować ich skutki [33]? Niewykluczone, że w przyszłości realne będzie zaplanowanie oraz wprowadzenie dowolnej zmiany w sekwencji nukleotydowej DNA, z dużą przewidywalnością, bez niekorzystnego wpływu na organizm. Będzie to narzędzie bezpieczne, pozwalające przyspieszyć procesy selekcji oraz hodowli agronomicznie ważnych gatunków roślin. Komercyjne wykorzystanie produktów roślinnych otrzymanych za pośrednictwem tych technik będzie w dużej mierze uzależnione od obowiązujących regulacji prawnych. PODZIĘKOWANIA Praca zrealizowana w ramach tematu badawczego nr. PB 4-1-03-4-01 z funduszu Postępu Biologicznego finansowanego przez Ministerstwo Rolnictwa i Rozwoju Wsi LITERATURA [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] Allis DC, Jenuwein T, Reinberg D. Genetics versus epigenetics. [w] Overview and concepts. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2007; 25 Antunes MS, Smith JJ, Jantz D, Medford JI. Targeted DNA excision in Arabidopsis by a re-engineered homing endonuclease. BMC Biotechnology 2012; 12: 1-12 Arnould S, Delenda C, Grizot S, Desseaux C, Paques F, Silva GH, Smith J. The I-CreI meganuclease and its engineered derivatives: applications from cell modification to gene therapy. Protein Eng 2011; 24: 27-31 Barrangou R. CRISPR-Cas systems and RNA-guided interference. Wiley interdiscip Rev RNA 2013; 4: 267-278 Bell O, Tiwari VK, Toma NH, Schubeler D. Determinants and dynamics of genome accessibility. Nat Rev Genet 2011; 12(8): 554-564 Belhaj K, Chaparro-Garcia A, Kamoun S, Nekrasov V. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods 2013; 9: 39-45 Beumer K, Bhattacharyya G, Bibikova M, Trautman JK, Carroll D. Efficient gene targeting in drosophila with zinc-finger nucleases. Genetics 2006; 172(4): 2391-2401 716 [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] P. SEGA, A. LINKIEWICZ Bhakta MS, Henry IM, Ousterout DG, Das KT, Lockwood SH, Meckler JF, Wallen MC, Zykovich A, Yu Y, Leo H, Xu L, Gersbach CA, Segal DJ. Highly active zinc-finger nucleases by extended modular assembly. Biotechfor 2013; 23: 530-538 Boch J, Bonas U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annu Rev Phytopathol 2010; 48: 419-436 Bogdanove AJ, Shornack S, Lahaye T. TAL effectors: finding plant genes for disease and defense. Curr Opin Plant Biol 2010; 13: 394-401 Bultmann S, Morbitzer R, Schmidt CS, Thanish K, Spada F, Elsaesser J, Lahaye T, Leonhardt H. Targeted transcriptional activation of silent oct4 pluripotency gene by combining designer TALEs and inhibition of epigenetic modifiers. Nucleic Acids Res 2012; 40(12): 5368-5377 Cai CQ, Doyon Y, Ainley WM, Miller JC, Dekelver RC, Moehle EA, Rock JM, Lee YL, Garrison R, Schulenberg L, Blue R, Worden A, Baker L, Faraji F, Zhang L, Holmes MC, Rebar EJ, Collingwood TN, Rubin-Wilson B, Gregory PD, Urnov FD, Petolino JF. Targeted transgene integration in plant cells using designed zinc finger nucleases. Plant Mol Biol 2009; 69: 699-709 Carroll D. Genome engineer ing wit h zinc-finger nucl eases. Genet ics 2011; 188: 773-782 Cermak T, Doyle EL, Christian M, Wang L, Zhang Y, Schmidt C, Baller JA, Somia NV, Bogdanove AJ, Voytas DF. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based construct for DNA targeting. Nucleic Acids Res 2011; 39: 82 Chen K, Gao C. Targeted genome modification technologies and their applications in crop improvements. Plant Cell Rep 2013; doi 10.1007/s00299-013-1539-6 Chou ST, Leng Q, Mixson AJ. Zinc finger nucleases: tailor-made for gene therapy. Drugs Future 2012; 37(3): 183-196 Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marrafffini LA, Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 2013; 339: 819-823 Cornu TI, Thibodeau-Beganny S, Guhl E, Alwin S, Eichtinger M, Joung JK. DNA-binding specificity is a major determinant of the activity and toxicity of zinc-finger nucleases. Mol Ther 2008; 16(2): 325-358 Curtin SJ, Zhang F, Sander JD, Haun WJ, Starker C, Baltes NJ, Reyon D, Dahlborg EJ, Goodwin MJ, Coffman AP, Dobbs D, Joung JK, Voytas DF, Stupar RM. Targeted mutagenesis of duplicated genes in soybean with zinc-finger nucleases. Plant Physiol 2011; 156: 466-473 De Pater S, Neuteboom LW, Pinas JE, Hooykaas PJJ, Van Der Zaal BJ. ZFN-induced mutagenesis and gene-targeting in Arabidopsis through Agrobacterium-mediated floral dip transformation. Plant Biotechnol J 2009; 7: 821-835 Delacote F, Perez C, Guyot V, Mikonio C, Potrel P, Cabaniols JP, Delenda C, Paques F, Duchateau P. Identification of genes regulating gene targeting by a high-throughput screening approach. J Nucleic Acids 2011; doi:10.4061/2011/947212 D’halluin K, Vanderstraeten C, Hulle J, Rosolowska J, Brande I, Pennewaert A, Dhont K, Bossut M, Jantz D, Ruiter R, Broadhvest J. Targeted molecular trait stacking in cotton through targeted double-strand break induction. Plant Biotechnol J 2013; 11: 933-41 Duan X, Gimble FS, Quiocho FA. Crystal structure of PI-SceI, a homing endonuclease with protein splicing activity. Cell 1997; 89: 555-564 Eklund JL, Ulge UT, Eastberg J, Monnat RJ. Altered target site specificity variants of the I-Ppol HisCys box homing endonuclease. Nucleic Acids Res 2007; 35(17): 5839-5850 Esvelt KM, Wang HH. Genome-scale engineering for systems and synthetic biology. Mol Syst Biol 2013; 9 doi:10.1038/msb.2012.66 Feng Z, Zhang B, Ding W, Liu X, Yang DL, Wei P, Cao F, Zhu S, Zhang F, Mao Y, Zhu JK. Efficient genome editing in plants using CRISPR/Cas system. Cell Res 2013; 23: 1229-1232 Flisikowska T, Thorey IS, Offner S, Ros F, Lifke V, Zeitler B, Rottmann O, Vincent A, Zhang L, Jenkins S, Niersbach H, King AJ, Gregory PD, Schnieke AE, Platzer J. Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted replacement in rabbit using zinc finger nucleases. PLoS ONE 2011; 6(6): e21045 MUTAGENEZA KIERUNKOWA W GENOMICE ROŚLIN 717 [28] Foley JE, Maeder ML, Pearlberg J, Joung JK, Peterson RT, Yeh JR. Targeted mutagenesis in zebrafish using customized zinc finger nucleases. Nat Protoc 2009; 4(12): 1855-1867 [29] Fu F, Sander JD, Maeder M, Thibodeau-Beganny S, Joung JK, Dobbs D, Milller L, Voytas DF. Zinc finger database (ZiFBD): a repository for information on C2H2 zinc fingers and engineered zinc-finger arrays. Nucleic Acids Res 2009; 37: 279-283 [30] Gabriel R, Lombardo A, Arens A, Miller JC, Genovese P, Kaeppel C. An unbiased genome genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol 2011; 29(9): 816-823 [31] Gaj T, Gersbach CA, Barbas III CF. ZFN, TALEN and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol 2013; 31(7) 397-402 [32] Gao H, Smith J, Yang M, Jones S, Djukanovic V, Nicholson MG, West A, Bidney D, Falco SC, Jantz D, Lyznik LA. Heritable targeted mutagenesis in maize using a designed endonuclease. The Plant J 2010; 61: 176-187 [33] Gao Y, Zhao Y. Specific and heritable gene editing in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014; 111(12): 4357-4358 [34] Geurts AM, Cost GJ, Freyvert Y, Zeitler B, Miller JC, Choi VM, Jenkins SS, Wood A, Cui X, Meng X, Vincent A, Lam S, Michalkiewicz M, Schilling R, Foeckler J, Kalloway S, Weiler H, Menoret S, Anegon I, Davis GD, Zhang L, Rebar EJ, Gregory PD, Urnov FD, Jacob HJ, Buelow R. Knockout rats produced using deisgned zinc finger nucleases. Science 2009; 325(5939): 433 [35] Gurushidze M, Hensei G, Hiekel S, Schedel S, Valkov V, Kumlehn J. True-breeding targeted gene knock-out in barley using designer TALE-nuclease in haploid cells. PLoS ONE 2014; 9(3): 92046-54 [36] Hackett PB, Somia NV. Delivering the second revolution in site-specific nucleases. Elife 2014; 8 doi 10.7554/eLife.01911 [37] Hoher T, Wallace L, Khan K, Cathomen T, Reichelt J. Highly efficient zinc-finger nuclease-mediated distruption of an eGFP transgene in keratinocyte stem cells without impairment of stem cell properties. Stem Cell Rev and Rep 2012; 8: 426-434 [38] Holkers M, Maggio I, Liu J, Janssen JM, Miselli F, Mussolino C, Recchia A, Cathomen T, Goncalves MAFV. Differential integrity of TALE nuclease genes following adenoviral and lentiviral vector gene transfer into human cells. Nucleic Acids Res 2013; doi:10.1093/nar/gks1446 [39] Holt N, Wang J, Kim K, Friedman G, Wang X, Taupin V, Crooks GM, Kohn DB, Gregory PD, Holmes MC, Cannon PM. Zinc finger nuclease-mediated CCR5 knockout hematopoietic stem cell tranplantation controls HIV-1 in vivo. Nat Biotechnol 2010; 28(8): 839-84 [40] Jacquier A, Dujon B. An intron-encoded protein is active in a gene conversion process that spreads an intron into a mitochondrial gene. Cell 1985; 41: 3830394 [41] Jiang W, Zhou H, Bi H, Fromm M, Yang B, Weeks DP. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucleic Acids Res 2013; 41(20): 188-198 [42] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A pogrammable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 2012; 337: 816-821 [43] Jurica NS, Monnat RJ, Stoddard BL. DNA recognition and cleavage by the LAGLIDADG homing endonuclease I-CreI. Mol Cell 1998; 2(4): 469-476 [44] Kakarougkas A, Jeggo PA. DNA DSB repair pathway choice: an orchestrated handover mechanism. Br J Radiol 2014; doi: bjr.birjournals.org/cgi/reprint/bjr.20130685v3 [45] Kay S, Bonas U. How Xantomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol 2009; 12: 37-43 [46] Kim S, Kim JS. Targeted genome engineering via zinc finger nucleases. Plant Biotechnol Rep 2011; 5: 9-17 [47] Kim E, Kim S, Kim DH, Choi BS, Choi IY, Kim JS. Precision genome engineering with programmable DNA-nicking enzymes. Genome Res 2012; 22: 1327-1333 [48] Kleinstiver BP, Wolfs JM, Edgell DR. The monomeric GIY-YIG homing endonuclease I-Bmol uses a molecular anchor and a flexible tether to sequentially nick DNA. Nucleic Acids Res 2013; 41(10): 5413-5427 718 P. SEGA, A. LINKIEWICZ [49] Kuijpers NGA, Chroumpi S, Vos T, Solis-Escalante D, Bosman L, Pronk JT, Daran JM, Daran-Lapujade P. One-step assembly and targeted integration of multigene constructs assisted by the I-SceI meganuclease in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res 2013; 13(8): 769-781 [50] Laganeckas M, Margelevicius M, Venclovas C. Identification of new homologs of PD-(D/E)XK nucleases by support vector machines traned on data derived from profile-profile alignments. Nucleic Acids Res 2010; 39(4): 1187-96 [51] Li L, Piatek MJ, Atef A, Piatek A, Wibowo A, Fang X, Sabir JS, Zhu JK, Mahfouz MM. Rapid and highly efficient construction of TALE-based transcirptional regulators and nucleases for genome modification. Plant Mol Biol 2012a; 78: 407-416 [52] Li T, Liu B, Spalding MH, Weeks DP, Yang B. High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice. J Genet Genomics 2012b; 39: 209-215 [53] Li JF, Norville JE, Aach J, Mccormack M, Zhang D, Bush J, Church GM, Sheen J. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotechnol 2013; 31: 688-691 [54] Li Y, Reynolds P. O’neill P, Cucinotta FA. Modeling damage complexity-dependent non-homologous end-joining repair pathway. PLOS One 2014; doi:10.1371/journal.pone.0085816 [55] Llyod A, Plaisier CL, Carroll D, Drews GN. Targeted mutagenesis using zinc-finger nucleases in Arabidopsis. PNAS 2005; 102(6): 2232-2237 [56] Lusser M, Parisi C, Plan D, Rodriquez-Cerezo E. Deployment of new biotechnologies in plant breeding. Nature Biotechnol 2012; 30: 231-239 [57] Mahfouz MM, Li L, Shamimuzzaman M, Wibowo A, Fang X, Zhu JK. De novo-engineered tran� scription activator-like effector (TALE) hybrid nuclease with novel DNA binding specificity creates double-strand breaks. Proc Natl Acad Sci 2011; 108: 2623-2628 [58] Marton I, Zuker A, Shklarman E, Zeevi V, Tovkach A, Roffe S, Ovadis M, Tzfira T, Vainstein A. Nontransgenic genome modification in plant cells. Plant Physiol 2010; 154: 1079-1087 [59] Miao J, Guo D, Zhang J, Huang Q, Gin G, Zhang X, Wan J, Gu H, Qu LJ. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system. Cell Res 2013; 23: 1233-36 [60] Miller JC, Tan S, Qiao G, Barlow KA, Wang J, Xia DF, Meng X, Paschon DE, Leung E, Hinkley SJ, Dulay GP, Hua KL, Ankoudinova I, Cost GJ, Urnov FD, Zhang HS, Holmes MC, Zhang L, Gregory PD, Rebar EJ. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol 2011; 29: 143-148 [61] Mussolino C, Morbitzer R, Lutge F, Dannemann N, Lahaye T, Cathomen T. A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity. Nucleic Acids Res 2011; 39(21): 9283-9293 [62] Mussolino C, Cathomen T. TALE nucleases: tailored genome engineering made easy. Curr Opin Biotechnol 2012; 23: 644-650 [63] Nekrasov V, Staskawicz B, Weigel D, Jones JD, Kamoun S. Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol 2013; 31: 691-693 [64] Olsen PA, Solhaug A, Booth JA, Gelazauskaite M, Krauss S. Cellular responses to targeted genomic sequence modification using single-stranded oligonucleotides and zinc-finger nucleases. DNA Repair 2009; 8298-82308 [65] Osakabe K, Osakabe Y, Toki S. Site-directed mutagenesis in Arabidopsis using custom-designed zinc finger nucleases. PNAS 2010; 107(26): 12034-12039 [66] Pattanayak V, Ramirez CL, Joung JK, Liu DR. Revealing off-target cleavage specificities of zinc-finger nucleases by in vitro selection. Nat Methods 2011; 8(9): 765-770 [67] Pauwels K, Podevin N, Breyer D, Carroll D, Herman P. Engineering nucleases for gene targeting: safety and regulatory considerations. New biotechnology 2013; 31(1) 18-25 [68] Pennisi E. The CRISPR cr aze. Science 2013; 341: 833-836 [69] Perez EE, Wang J, Miller JC, Jouvenot Y, Kim KA, Liu O, Wang N, Lee G, Bartsevich VV, Lee YL, Guschin DY, Rupniewski I, Waite AJ, Carpenito C, Carroll RG, Orange JS, Urnov F, Rebar EJ, Ando D, Gregory PD, Riley JL, Holmes MC, June CH. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol 2008; 26(7): 808-816 [70] Podevin N, Davies HV, Hartung F, Nogue F, Casacuberta JM. Site-directed nucleases: a paradigm shift in predictable, knowledge-based plant breeding. Trends Biotechnol 2013; 31: 375-383 MUTAGENEZA KIERUNKOWA W GENOMICE ROŚLIN 719 [71] Pruett-Miller SM, Reading DW, Porter SN, Porteus MH. Attenuation of zinc finger nuclease toxicity by small-molecule regulation of protein levels. PLoS Genet 2009; 5(2): e1000376 [72] Puchta H, Fauser F. Gene targeting in plants: 25 years later. Int J Dev Biol 2013; 57: 629-637 [73] Ramirez CL, Certo MT, Mussolino C, Goodwin MJ, Cradick TJ, Mccaffrey AP, Cathomen T, Scharenberg AM, Joung JK. Engineered zinc finger nickases induce homology-directed repair with reduced mutagenic effects. Nucleic Acids Res 2012; 40: 5560-5568 [74] Richter H, Randau L, Plagens A. Exploiting CRISPR/Cas: interference mechanisms and applications. Int J Mol Sci 2013; doi:10.3390/ijms140714518 [75] Roberts JR, Belfort M, Bestor T, Bhagwat AS, Bickle TA, Bitinaite J, Blumenthal RM, Degtyarev SK, Dryden DTF, Dybvig K, Firman K, Gromova ES, Gumport RI, Halford SE, Hattman S, Heitman J, Hornby DP, Janulaitis A, Jeltsch A, Josephsen J, Kiss A, Klaenhammer TR, Kobayashi I, Kong H, Kruger DH, Lacks S, Marinus MG, Miyahara M, Morgan RD, Murray NE, Nagaraja V, Piekarowicz A, Pingoud A, Raleigh E, Rao DN, Reich N, Repin VE, Selker EU, Shaw PC, Stein DC, Stoddard BL, Szybalski W, Trautner TA, Van Etten JL, Vitor JMB, Wilson GG, Xu SY. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res 2003; 31(7): 1805-1812 [76] Sander JD, Dahlborg EJ, Goodwin MJ, Cade L, Zhang F, Cifuentes D, Curtin SJ, Blackburn JS, Thibodeau-Beganny S, Qi Y, Pierick CJ, Hoffman E, Maeder ML, Khyater C, Reyon D, Dobbs D, Langenau DM, Stupar RM, Giraldez AJ, Voytas DF, Peterson RT, Yeh JR, Joung JK. Selection -free zinc-finger-nuclease engineering by context-dependent assembly (CoDA). Nat Methods 2011; 8: 67-69 [77] Sander JD, Maeder ML, Joung JK. Engineering designer nucleases with customized cleavage specificities. Curr Protoc Mol Biol 2011; doi:10.1002/0471142727.mb1213s96 [78] Sander JD, Joung JK. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnol 2014; 32(4): 347-352 [79] Seligman LM, Chisholm KM, Chevalier BS, Chadsey MS, Edwards ST, Savage JH, Veillet AL. Mutations altering the cleavage specificity of a homing endonuclease. Nucleic Acids Res 2002; 30(17): 3870-3879 [80] Shan Q, Wang Y, Chen K, Liang Z, Li J, Zhang Y, Zhang K, Liu J, Voytas DF, Zheng X, Zhang Y, Gao C. Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs. Mol Plant 2013a; 6(4): 1365-1368 [81] Shan Q, Wang Y, Li J, Zhang Y, Chen K, Liang Z, Zhang K, Liu J, Xi JJ, Qiu JL, Gao C. Targeted genome modification of crop plants using a CRISP-Cas system. Nat Biotechnol 2013b; 31: 686-688 [82] Shornack S, Moscou MJ, Ward ER, Horvath DM. Engineer ing pl ant disease r esistance based on TAL effectors. Annu Rev Phytopathol 2013; 51: 383-406 [83] Shukla VK, Doyon Y, Miller JC, Dekelver RC, Moehle EA, Worden SE, Mitchell JC, Arnold NL, Gopalan S, Meng X, Choi VM, Rock JM, Wu YY, Katibah GE, Zhifang G, Mccaskill D, Simpson MA, Blakeslee B, Greenwalt SA, Butler HJ, Hinkley SJ, Zhang L, Rebar EJ, Gregory PD, Urnov FD. Pr ecise genome modificat ion in t he cr op species Zea mays using zinc-finger nucleases. Nature 2009; 459: 437-440 [84] Steczkiewicz K, Muszewska A, Knizewski L, Rychlewski L, Ginalski K. Sequence, structure and functional diversity of PD-(D/E)XK phosphodiesterase superfamily. Nucleic Acids Res 2012; 40(15): 7016-41 [85] Streubel J, Blucher C, Landgraf A, Boch J. TAL effector RVD specificities and efficiencies. Nat Biotechnol 2012; 30: 593-595 [86] Sussman D, Chadsey M, Fauce S, Engel A, Bruett A, Monnat R Jr, Stoddard BL, Seligman LM. Isolation and characterization of new homing endonuclease specificities at individual target site position. J Mol Biol 2004; 342: 31-41 [87] Thompson AJ, Yuan XQ, Kudlicki W, Herrin DL. Cleavage and recognition pattern of a double-strand -specific endonuclease (I-CreI) encoded by the chloroplast 23S-ribosomal-RNA intron of Chlamydomonas reinhardtii. Gene 1992; 119(2): 247-251 [88] Townsend JA, Wright DA, Winfrey RJ, Morgan FF, Maeder ML, Joung JK, Voytas DF. High frequency modification of plant genes using engineered zinc finger nucleases. Nature 2009; 459(7245): 442-445 720 P. SEGA, A. LINKIEWICZ [89] Valton J, Dupuy A, Daboussi F, Thomas S, Marechal A, Macmaster R, Melliand K, Juilerat A, Duchateau P. Overcoming transcription activator-like effector (TALE) DNA binding domain sensivity to cytosine methylation. J Biol Chem 2012; 287(46): 38427-38432 [90] Voytas DF. Plant genome engineering with sequence-specific nucleases. Annu Rev Plant Biol 2013; 64: 327-350 [91] Wendt T, Holm PB, Starker CG, Christian M, Voytas DF, Brinch-Pedersen H, Holme IB. TAL effector nucleases induce mutations at a pre-selected location in the genome of primary barley transformants. Plant Mol Biol 2013; 83: 279-85 [92] Wright DA, Townsend JA, Winfrey Jr RJ, Irwin PA, Rajagopal J, Lonosky PM, Hall DB, Jondle MD, Voytas DF. High-frequency homologous recombination in plants mediated by zinc-finger nucleases. Plant J 2005; 44: 693-705 [93] Wyman C, Kanaar R. DNA double-strand break repair: all’s well that ends well. Annu Rev Genet 2006; 40: 363-383 [94] Xu S, Kuzin AP, Seetharaman J, Gutjahr A, Chan S, Chen Y, Xiao R, Acton TB, Montelione GT, Tong L. Structure determination and biochemical characterization of a putative HNH endonuclease from Geobacter metallireducens GS-15. PLoS One 2013; doi:10.1371/journal.pone.0072114 [95] Zhang F, Maeder ML, Unger-Wallace E, Hoshaw JP, Reyon D, Christian M, Li X, Pierick CJ, Dobbs D, Peterson T, Joung JK, Voytas DF. High frequency targeted mutagenesis in Arabidopsis thaliana using zinc finger nucleases. PNAS 2010; 107(26): 12028-12033 [96] Zhang F, Voytas DF. Targeted mutagenesis in Arabidopsis using zinc-finger nucleases. Methods Mol Biol 2011; 701: 167-177 [97] Zhang Y, Zhang F, Li X, Baller JA, Qi Y, Starker CG, Bogdanove AJ, Voytas DF. Tr anscr ipt ion activator-like effector nucleases enable efficient plant genome engineering. Plant Physiol 2013; 161: 20-27 [98] Zou J, Maeder ML, Mali P, Pruett-Miller S, Thibodeau-Beganny S, Chou BK, Chen G, Ye Z, Park IH, Daley GQ, Porteus MH, Joung JK, Cheng L. Gene targeting of a disease-related gene in human induced plutipotent stem and embryonic stem cells. Cell Stem Cell 2009; 5(1): 97-110 [99] Zou J, Sweeney CL, Chou BK, Choi U, Pan J, Wang H, Dowey SN, Cheng L, Malech HL. Oxidase -deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease–mediated safe harbor targeting. Blood 2011; 117(21): 5561-5572 [100] Recent patent applications in CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnol 2014; 32(4): 334 doi:10.1038/ nbt.2883 Redaktor prowadzący – Michał Nowicki Otrzymano: 27.05.2014 Przyjęto: 10.08.2014 Anna Linkiewicz, Laboratorium Kontroli GMO, Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Radzikowie tel.: (22) 733 45 17 fax: 22 733 46 81 e-mail: [email protected]
