Metody rozdziału związków organicznych

Opracował: Wojciech Augustyniak
Krystalizacja (1)
Oczyszczanie ciał stałych
Krystalizacja z indywidualnego rozpuszczalnika
Wybór rozpuszczalnika:
- duża różnica rozpuszczalności oczyszczanego związku na zimno i na gorąco
- bardzo dobra (gotowanie z substancją powierzchniowo czynną i przesączenie roztworu),
albo bardzo słaba (gorący roztwór należy przesączyć) rozpuszczalność zanieczyszczeń
- bierność chemiczna względem oczyszczanego związku
- temperatura wrzenia niższa od temperatury topnienia oczyszczanego związku
- niepalność, mała toksyczność
Należy stosować możliwie małe ilości rozpuszczalnika
Opracował: Wojciech Augustyniak
Krystalizacja (2)
Chłodzenie szybkie: małe kryształy, więcej zarodkow krystalizacji, sprzyja tworzeniu oleju;
chłodzenie wolne: duże kryształy
Inicjacja krystalizacji:
- silne początkowe chłodzenie i powolne ogrzanie do temperatury otoczenia
- naprzemienne chłodzenie i ogrzewanie
- tarcie o ścianki naczynia
- mieszanie
- zaszczepianie
Krystalizacja z mieszaniny rozpuszczalników:
rozpuszczanie w gorącym rozpuszczalniku dobrze rozpuszczającym związek, i wytrącanie
rozpuszczalnikiem źle rozpuszczającym związek
Krystalizacja przez wytrącanie kwasu z roztworu soli, bądź soli amoniowej z roztworu aminy
Opracował: Wojciech Augustyniak
Ekstrakcja (1)
Ekstrakcja z materiału stałego (rozdrobnionego):
- prosta
- ciągła (nie osiąga się stanu równowagi; aparat Soxhleta – zatężanie ekstraktu, skroplony
rozpuszczalnik rozpuszcza kolejną porcję ciała stałego)
Ekstrakcja z cieczy:
- nieciągła (prosta K > 5, wielokrotna K ~ 1, frakcjonowanie – ekstrakcja porcji roztworu
substancji tym samym roztworem rozpuszczalnika – K ~ 1)
- ciągła (nie osiąga się stanu równowagi; perforacja – zatężanie ekstraktu i zawrócenie
skroplonego rozpuszczalnika do procesu, K < 1)
Prawo podziału Nernsta (dla danej temperatury i dla liniowej izotermy podziału):
K = a1/a2 ≈ c1/c2
K – współczynnik podziału
Ekstrakcja wielokrotna:
E=(
1
)n ∗ v ∗ K
v ∗ K +1
E – ilość substancji w n-tym ekstrakcie
P – ilość substancji niewyekstrahowanej
v – stosunek objętości roztworów
P=(
1
)n
v ∗ K +1
Opracował: Wojciech Augustyniak
Ekstrakcja (2)
Dobór rozpuszczalników:
- minimalna wzajemna rozpuszczalność
- bierność chemiczna względem siebie i substancji ekstrahowanych
- duża różnica w rozpuszczalności substancji ekstrahowanych, tj. jeden z rozpuszczalników
musi rozpuszczać obydwie substancje, a drugi jedną z nich; odpowiednie wartości K
- mała lepkość, duże napięcie powierzchniowe (trudniejsze emulgowanie)
- łatwość odzyskania związków z rozpuszczalników
- niska palność
Technika:
- wytrząsanie celem zwiększenia powierzchni kontaktu pomiędzy rozpuszczalnikami
- lepiej ekstrahować więcej razy mniejszymi porcjami rozpuszczalnika, niż mniej razy
większymi porcjami rozpuszczalnika
- efekt solny
- efekt hydrotropowy
- efekt pH
Wykorzystanie możliwości tworzenia soli amin, kwasów i fenoli umożliwia łatwe
przeprowadzanie ich do warstwy wodnej po zakwaszeniu/alkalizacji, a następnie do warstwy
organicznej po alkalizacji/zakwaszeniu
Opracował: Wojciech Augustyniak
Destylacja (1)
Rozdział cieczy
Prawo Raoulta:
yA
p
x
= A ∗ A
1 − y A pB 1 − x A
y – ułamek molowy w fazie gazowej
x – ułamek molowy w fazie ciekłej
p – ciśnienie pary nasyconej
Destylacja prosta:
- wybór sposobu ogrzewania zależny od temperatury wrzenia – łaźnie wodne (do 80oC),
olejowe, płaszcze grzejne
- wybór chłodnicy – chłodnice Liebiega z płaszczem wodnym (do 140oC), lub bez płaszcza;
chłodnica powinna być tym dłuższa, a wylot par do chłodnicy tym wyżej, im mniejsza jest
temperatura wrzenia
- stosowanie kamyków wrzennych celem równomierności ogrzewania całego roztworu
- odpowiednie zamocowanie termometru
- wyrównywanie ciśnienia z otoczenem poprzez otwór za chłodnicą
Destylacja przy stałej objętości służy do zatężania bardzo rozcieńczonych roztworów,
wyjściowa mieszanina jest wkraplana w miarę postępu destylacji
Destylacja w skróconym aparacie dla małych ilości roztworu
Destylacja frakcyjna z kolumną destylacyjną (deflegmatorem) i pionową chłodnicą
zwrotną do rozdziału rozpuszczalników o niewielkiej różnicy temperatur wrzenia
Opracował: Wojciech Augustyniak
Destylacja (2)
Destylacja azeotropowa do usuwania jednego ze składników mieszaniny jako azeotropu, np.
wody z benzenem, toluenem, chloroformem (heteroazeotropy – rozdzielanie się warstw
w temperaturze niższej od temperatury wrzenia)
Destylacja z parą wodną (tworzenie azeotropów ujemnych), stosuje się dla związków o masie
cząsteczkowej niższej od 150g/mol i prężności par wyższej od 10mmHg w 100oC; można w ten
sposób destylować substancje stałe oraz związki wrażliwe na wysokie temperatury
mA
p
M
= A ∗ A
m H2O p H 2O MH 2O
Destylacja pod zmniejszonym ciśnieniem dla związków o wysokich temperaturach wrzenia
(powyżej 250oC), lub nietrwałych:
- używa się nasadki Claisena umożliwiającej wprowadzenie kapilary
- stosuje się kuliste odbieralniki
- pompki wodne służą do generowania próżni
Obliczanie temperatury wrzenia w danym ciśnieniu – równianie Clausiusa-Clapeyrona:
LV
d ln p
const
=
⇒ log p ≈
2
dT
R ∗T
T
Lv – molowe ciepło parowania
Opracował: Wojciech Augustyniak
Chromatografia
Chromatografia – różnica w rozdziale substancji pomiędzy fazę stacjonarną i fazę ruchomą
Techniki chromatograficzne:
- kolumnowa (chromatografia adsorpcyjna, podziałowa, jonowymienna, żelowa, powinowactwa)
- cienkowarstwowa (TLC; chromatografia adsorpcyjna, podziałowa, powinowactwa, elektroforeza)
- bibułowa (chromatografia podziałowa)
- wysokociśnieniowa (HPLC; chromatografia adsorpcyjno-podziałowa, jonowymienna, żelowa)
- gazowa (GC, chromatografia podziałowa)
Opracował: Wojciech Augustyniak
Rodzaje chromatografii
- adsorpcyjna
- podziałowa (rozpuszczalność)
- jonowymienna:
- rozdział ze względu na wymianę jonów ze złożem zawierającym grupy kwaśne (sulfonowe,
karboksylowe, fosforanowe) w wymieniaczach kationów (kationity), lub zasadowe (aminowe)
w wymieniaczach anionów (anionity) związane ze złożem (np. polistyren, celuloza, Sephadex)
- służy do rozdziału związków jonowych, kwasów i zasad (aminy), szczególnie do aminokwasów,
peptydów, białek i kwasów nukleinowych
- stosuje się techniki kolumnowe
- żelowa (sączenie molekularne):
- rozdział ze względu na wielkość związku, małe związki silnie penetrują pory złoża (na ogół
Sephadex, wielkość jego porów (G) decyduje o możliwości rozdzielenia określonych
makromolekuł), dzięki czemu są na nim silniej zatrzymywane
- służy do rozdziału związków wielkocząsteczkowych (białka, kwasy nukleinowe), jak i do ich
odsalania
- stosuje się techniki kolumnowe
- powinowactwa (afinitywna):
- specyficzne oddziaływania ligand-receptor, przeciwciało-antygen, enzym-substrat
- służy głównie do wyodrębniania określonego białka z ekstraktów komórkowych
- stosuje się techniki kolumnowe i cienkowarstwowe
- elektroforeza (rozdział ze względu szybkość migracji jonów w polu elektrycznym)
Opracował: Wojciech Augustyniak
Chromatografia adsorpcyjna
O rozdziale decyduje konkurencja substancji i rozpuszczalnika z fazy ruchomej (ciecz lub – rzadko,
dla rozdziału substancji lotnych – gaz) o wiązanie się do adsorbenta z fazy stacjonarnej (ciało stałe)
Techniki: kolumnowa, cienkowarstwowa, HPLC
Adsorbent powinien:
- mieć jak najsilniej rozwiniętą powierzchnię
- składać się z odpowiednio wielkich ziaren (im mniejsze, tym szybciej ustala się równowaga,
ale tym wolniejszy przepływ rozpuszczalnika) o jednorodnej wielkości
- być bierny chemicznie wobec rozpuszczalnika i substancji rozdzielanych
- być selektywny
Rodzaje adsorbentów:
- polarne, dobrze wiążące związki polarne, aktywność maleje z zawilgoceniem; głównie tlenki i sole
- niepolarne, niezwilżalne, dobrze wiążące związki niepolarne; np. węgiel aktywny
Szereg aktywności adsorbentów pod względem wiązania związków organicznych:
celuloza < skrobia < sacharoza < CaSO4 < silikażel < MgO < Al2O3 < węgiel aktywny
Szereg eluotropowy rozpuszczalników:
heksan < CCl4 < benzen < CHCl3 < (C2H5)2O < CH3COOC2H5 < aceton < C2H5OH < CH3OH
< H2O < CH3COOH < pirydyna
Na ogół stosuje się mieszaniny rozpuszczalników; większa polarność substancji rozwijanej
wymaga większej polarności stosowanego układu na adsorbencie polarnym. Na adsorbencie
niepolarnym szereg eluotropowy należy stosować w odwrotnej kolejności, tzn. im silniejsze
wiązanie substancji ze złożem, tym mniej polarny układ rozwijający należy stosować
Opracował: Wojciech Augustyniak
Chromatografia podziałowa
O rozdziale decyduje podział substancji pomiędzy dwie niemieszające się ciecze
2 warianty: chrom. cieczowo-gazowa (gazowa, GC), lub cieczowo-cieczowa (np. bibułowa)
Techniki: kolumnowa, cienkowarstwowa, GC, HPLC
Chromatografia cieczowo-cieczowa:
- układ z normalnymi fazami: faza ruchoma – ciecz organiczna, faza stacjonarna – ciecz
osadzona na nośniku stałym (np. woda na celulozie); metoda dobra do rozdziału substancji
polarnych, np,. aminokwasy, peptydy, sacharydy, nukleotydy
- układ z odwróconymi fazami: faza ruchoma – woda, faza stacjonarna – rozpuszczalnik
organiczny zaadsorbowany na nośniku; metoda stosowana w rozdziale związków niepolarnych
(podobnie, jak chromatografia adsorpcyjna)
Nośnik powinien:
- być obojętny wobec rozpuszczalników i rozdzielanych substancji
- nie wykazywać własności adsorpcyjnych i jonowymiennych
- być zwilżany fazą ruchomą
- składać się z jednorodnych ziaren o odpowiedniej wielkości (im mniejsze, tym lepszy rozdział,
ale tym wolniejszy przepływ rozpuszczalnika)
Najczęstsze złoża: silikażel, celuloza, skrobia, ziemia okrzemkowa, acetyloceluloza
Opracował: Wojciech Augustyniak
Chromatografia bibułowa
Chromatografia cieczowo-cieczowa (cienkowarstwowa technika chromatografii
podziałowej stosowana głównie do rozdziału aminokwasów, peptydów, sacharydów,
nukleotydów):
- faza ruchoma – homogenna mieszanina rozpuszczalników zawierająca wodę,
stacjonarna – woda zaadsorbowana na bibule
- wykonanie techniką wstępującą (rozpuszczalnik migruje od dolnego końca bibuły
zanurzonego w eluencie) lub zstępujacą (spływową; rozpuszczalnik migruje od
górnego końca bibuły zanurzonego w eluencie)
- detekcja – próba ninhydrynowa na aminokwasy i peptydy, UV na nukleotydy
- Rf nie są dobrze odtwarzalne
Opracował: Wojciech Augustyniak
Chromatografia gazowa
Chromatografia cieczowo-gazowa (kolumnowa technika chromatografii podziałowej
stosowana do rozdziału i analizy gazów, niskowrzących cieczy, lub łatwo lotnych
substancji stałych):
- faza ruchoma – gaz, stacjonarna – wysokowrząca ciecz (olej, smar, glikol polietylenowy)
osadzona na obojętnym nośniku (np. długa kapilara szklana)
- GC wykonuje się zwykle w wysokich temperaturach,
- detekcja – katarometr (zmiana przewodnictwa w obecności związku opuszczającego
kolumnę), spektrometr mas (GC MS)
- związki opuszczają kolumnę przy określonych, dobrze odtwarzalnych czasach retencji
- GC to dobre narzędzie analityczne, można też używać GC do celów preparatywnych
- GC pozwala na oznaczanie ilościowe (pomiar powierzchni pod pikiem)
- zastosowanie chiralnego złoża umożliwia rozdział enancjomerów
- przeprowadzenie w lotne pochodne umożliwia analizę związków nielotnych, np. kwasów
karboksylowych jako estrów trimetylosililowych, aminokwasów jako pochodnych
dabsylowych (jako amidy kwasu 4-(dimetyloamino)-azobenzeno-4’-sulfonowego)
Opracował: Wojciech Augustyniak
Chromatografia kolumnowa
Faza ruchoma – ciecz, faza stacjonarna – złoże stałe lub ciecz zaadsorbowana na złożu
wypełniającym kolumnę
Kolumnę wypełnia się zawiesiną złoża (wysokość złoża powinna być co najmniej 10 razy
większa od średnicy kolumny; minimum 25 razy więcej złoża od próbki w chromatografii
adsorpcyjnej, 100 razy w chromatografii podziałowej), nanosi próbkę od góry i eluuje układem
rozwijającym zbierając frakcje; związki we frakcjach wykrywa się za pomocą chromatografii
cienkowarstwowej
Dobieranie eluentu dla chromatografii adsorpcyjnej: próby za pomocą chromatografii
cienkowarstwowej – różnica Rf rozdzielanych związków powinna być większa niż 0.3,
a jedna z substancji nie powinna mieć Rf wyższego od 0.2
Typowe błędy podczas rozdziału:
- zbyt szeroka kolumna – zbyt duża dyfuzja, nierówny przepływ
- zbyt wąska kolumna lub za małe ziarna lub zbyt mało polarny eluent – za wolny przepływ, dyfuzja
- za mało nośnika lub za grube ziarna – zły rozdział
- mokry eluent, kolumna, nośnik – utrata aktywności nośnika, zły rozdział
- zbyt mało aktywny nośnik – zły rozdział
- złe upakowanie kolumny lub nierówne nałożenie próbki – nierówny rozdział
- zbyt polarny eluent – brak rozdziału
- zbyt szybki przepływ – brak rozdziału, nie ustalają się równowagi międzyfazowe
- zbieranie zbyt dużych frakcji – złe rozdzielenie substancji
Opracował: Wojciech Augustyniak
Chromatografia cienkowarstwowa (1)
Faza ruchoma – ciecz, faza stacjonarna - stałe złoże lub ciecz zaadsorbowana na złożu
nałożonym na płytkę
- technika analityczna, niekiedy preparatywna
- stosowana głównie do sprawdzania czystości związków, kontroli reakcji, analizy wycieków
z kolumny chromatograficznej
- zalety: krótki czas rozwijania, proste metody kontroli, zużycie małych ilości związki (ng)
Rf = (odległość od startu do centrum plamki)/(odległość od startu do czoła rozpuszczalnika)
Rf nie jest dobrze odtwarzalnym parametrem
Dobór układu rozwijającego: tak, aby była wyraźna różnica pomiędzy Rf analizowanych
związków, i aby związki nie zostawały na miejscu nałożenia plamki, oraz aby nie migrowały
z czołem rozpuszczalnika
Opracował: Wojciech Augustyniak
Chromatografia cienkowarstwowa (2)
1. Przygotowanie płytki: warstwa sorbentu 0.2mm grubości, nanoszenie na odtłuszczoną
płytkę, suszenie
2. Nanoszenie próbki: odparowanie rozpuszczalnika, możliwie mała plamka
3. Rozwijanie płytki w szczelnej kamerze chromatograficznej, stosuje się paski bibuły
celem szybszego nasycenia komory parami rozpuszczalnika
4. Wywołanie chromatogramu: UV, pary jodu (układy nienasycone), ogrzewanie po
zwilżeniu stężonym H2SO4 lub 2% KMnO4, ninhydryna (aminy i aminokwasy)
Techniki:
- kilkukrotne rozwijanie w przypadku niskich Rf
- chromatografia dwukierunkowa (rozwijanie chromatogramu w drugim kierunku
w innym układzie rozpuszczalników) w przypadku podobnych Rf
- klinowa (początkowa część chromatogramu zawęża się ku dołowi) celem zwężenia
plamki
- krążkowa (nakraplanie eluentu na środek plamki) celem określenia przydatności układu
do rozdziału)
Opracował: Wojciech Augustyniak
Wysokosprawna chromatografia cieczowa
HPLC – high pressure/performance liquid chromatography
Chromatografia adsorpcyjno-podziałowa
Faza ruchoma – ciecz wtłaczana pod wysokim ciśnieniem; faza stacjonarna – gęsto i jednorodnie
upakowana złożem kolumna z metalu, dobrze odpowietrzona
Detekcja: lampa UV, katarometr, spektrometr mas
Wariant analityczny (węższe kolumny) i preparatywny (szersze kolumny)
Zalety: szybki, zautomatyzowany i precyzyjny rozdział związków; łatwe stosowanie
gradientów; powtarzalność czasów retencji; ilościowe oznaczanie związków (pole
powierzchni pod pikiem); zastosowanie chiralnego złoża umożliwia rozdział enancjomerów
Wada: rozdział małych ilości związków
2 warianty:
- kolumna z normalnymi fazami: polarne złoże (np. krzemionka) i niepolarny rozpuszczalnik –
do rozdziału związków niepolarnych
- kolumna z odwróconymi fazami: niepolarne złoże (np. krzemionka związana
z długołańcuchowymi alkoholami na powierzchni), polarny rozpuszczalnik – do rozdziału
związków polarnych, w tym aminokwasów, peptydów, białek, sacharydów
FPLC – fast protein liquid chromatography: metoda podobna do HPLC, stosuje się niższe
ciśnienia, oraz kolumny typowe dla chromatografii jonowymiennej i sączenia żelowego