IMAGEN Influenza virus A and B [PL]

IMAGEN INFLUENZA
VIRUS A AND B
PL
K610511-2
50
Test immunofluorescencji bezpośredniej do wykrywania wirusa
grypy A i B.
1.
PRZEZNACZENIE
Test IMAGEN™ Influenza virus A i B jest jakościowym testem
immunofluorescencji bezpośredniej, służącym do wykrywania i
różnicowania wirusa grypy A i B w próbkach klinicznych lub do
potwierdzenia i różnicowania wirusa grypy A i B w hodowlach
komórkowych.
2.
PODSUMOWANIE
Wirusy grypy A i B są przedstawicielami rodzaju Influenza,
zaliczanymi do rodziny Orthomyxoviridae1. Szczepy wirusa grypy
A infekują rozmaite zwierzęta, ludzi, konie, świnie, ssaki morskie i
ptaki, natomiast szczepy wirusa grypy B zakażają, jak się wydaje,
tylko ludzi.
U ludzi infekcje wirusami grypy A i B mogą powodować ostre,
a niekiedy, u osób immunokompetentnych i nieodpornych
poważne choroby układu oddechowego. Infekcje wirusem
grypy A i B występują corocznie w postaci epidemii, często
zaczynających się nagle i szybko się rozprzestrzeniających.
Epidemie te mogą występować jako niewielkie, lokalne ogniska
lub jako ogólnoświatowe epidemie, zależnie od dominującego
szczepu3. Okresowo, w wyniku trwającej ewolucji wirusów grypy
A, występują epidemie choroby, które mogą mieć istotny wpływ
na zdrowie ludności całego świata2,4.
Przenoszenie wirusa grypy odbywa się przez wdychanie
kropelek zawierających wirusa, pochodzących z wydzielin układu
oddechowego nosicieli wykazujących lub nie wykazujących
objawy choroby. Czynniki środowiskowe, takie jak zatłoczenie,
sprzyjają szerzeniu się infekcji. Replikacja wirusów odbywa się w
komórkach orzęsionego nabłonka walcowatego górnych i dolnych
dróg oddechowych, powodując nekrozę i rozkład komórek. Okres
szczytu rozprzestrzeniania się wirusa ma miejsce od 1 dnia przed
do 3-4 dnia po rozpoczęciu choroby.
W czasie trwania epidemii grypy dominujący szczep wirusa
może odpowiadać za 15-50% infekcji układu oddechowego,
występujących u dorosłych i dzieci. Choroby układu oddechowego
mogą przyjmować formę od łagodnej choroby górnych dróg
oddechowych do poważnego zapalenia płuc3. Ostre zapalenie
płuc spowodowane wirusami grypy A i B może być śmiertelne,
zwłaszcza, jeśli towarzyszy mu wtórna lub równoczesna infekcja
bakteryjna u starszych lub nieodpornych osób.
Wirusy grypy były uznawane za przyczynę szerzenia się szpitalnych
zakażeń dróg oddechowych oraz na oddziałach geriatrycznych i
pediatrycznych, prowadzących do przedłużenia hospitalizacji oraz
zwiększonej zachorowalności i śmiertelności.
Szybka laboratoryjna diagnoza infekcji wirusem grypy A lub B
odgrywa ważną rolę w opiece nad pacjentem, wpływając na
stosowaną terapię antywirusową i umożliwiając skuteczne
postępowanie przy wybuchach epidemii i ich opanowywaniu3,5.
Metody diagnostyczne obejmują bezpośrednie wykrywanie
wirusa lub białek wirusa w próbkach klinicznych (np. aspiraty z
nosogardzieli), izolację żywotnych wirusów w jednowarstwowej
kulturze komórkowej inokulowanej wydzielinami z układu
oddechowego oraz wykrywanie swoistych immunoglobulin wirusa
grypy. Izolacja wirusów grypy z próbek z układu oddechowego
może być przeprowadzona w liniach komórkowych, takich jak
komórki pierwotne nerek rezusa lub komórki z nerek psa MadinDarby’ego (MDCK) przy użyciu technik takich jak hemadsorpcja
lub hemaglutynizacja w celu identyfikacji szczepu wirusa.
Stosowano różne techniki do potwierdzania identyfikacji izolatów
wirusa grypy, w tym test hamowania hemoadsorpcji, hamowania
hemaglutynacji, testy neutralizacji, mikroskopię elektronową lub
immunofluorescencję pośrednią. Techniki te są pracochłonne,
czasochłonne i wymagają pewnego doświadczenia technicznego,
którego w niektórych laboratoriach może zabraknąć.
Testy immunofluorescencji bezpośredniej wykorzystujące
swoiste przeciwciała monoklonalne stanowią szybką i czułą
metodę bezpośredniego wykrywania wirusów grypy A i B
w próbkach klinicznych takich jak aspiraty nosogardzielowe
lub do potwierdzenia obecności wirusa grypy izolowanego
w jednowarstwowych hodowlach komórkowych6. IMAGEN
Influenza virus A i B jest testem immunofluorescencji
bezpośredniej, służącym do wykrywania i identyfikacji szczepów
wirusa A i B w próbkach klinicznych hodowli komórkowych. W
teście wykorzystuje się specyficzne dla gatunku przeciwciała
monoklonalne w celu wykrycia epitopów glikoprotein wirusa
grypy oraz białek fuzyjnych, swoistych albo dla wirusa typu A,
albo wirusa typu B.
3.
ZASADA TESTU
Test IMAGEN Influenza virus A i B zawiera przeciwciała
monoklonalne skoniugowane z izotiocyjanianem fluorosceiny
(FITC), swoiste albo dla wirusa grypy A albo wirusa grypy B.
Są one używane w jednoetapowej bezpośredniej technice
immunofluorescencji. Próbki są inkubowane z odczynnikami
przeciwciała skoniugowanego z FITC przez 15 minut, a nadmiar
odczynnika jest wypłukiwany zbuforowanym roztworem soli
fizjologicznej (PBS). Miejsca wybarwione są montowane i
poddawane obserwacji pod mikroskopem przy użyciu oświetlenia
epifluorescencyjnego. Jeśli obecny jest wirus grypy A lub B,
w połączeniu z odpowiednimi odczynnikiem obserwuje się
charakterystyczną fluorescencję w kolorze zielonego jabłka,
wewnątrz cytoplazmy i jądra komórkowego, która kontrastuje z
czerwonym tłem komórek niezainfekowanych.
Ciała monoklonalne użyte w tym teście pochodzą z Department
of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for
Disease Control, Atlanta, Georgia, U.S.A
Immunogen wykorzystywany do uzyskania przeciwciał przeciwko
wirusowi grypy A obejmował szczepy A / Puerto Rico / 8 / 34 (H1N1)
oraz A / Bangkok /1 / 79 (H3N2). Immunogen wykorzystywany
do uzyskania przeciwciał przeciwko wirusom grypy B obejmował
szczepy B / Lee / 40 oraz B / Singapore /-222 / 79
4.
DEFINICJE
Poniższe symbole zostały użyte w informacji o produkcie.
Kod produktu i nr kat
Sprawdzić w instrukcji stosowania
N
Zawiera ilość materiału wystarczającą do <N>
badań
Producent
Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro
6.
DODATKOWE ODCZYNNIKI
6.1. ODCZYNNIKI
Świeży aceton (do utrwalania).
Zużyć przed
Numer serii
Zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS) o pH 7,5 do
przepłukiwania wybarwionych próbek i do przygotowywania
próbek.
Ograniczenia co do temperatury przechowywania
5.
DOSTARCZONE ODCZYNNIKI
50 - Każdy zestaw zawiera materiały wystarczające do
- Okres
przetestowania 50 preparatów kultury komórkowej.
przechowywania produktu podano na etykiecie zewnętrznego
pudełka.
5.1.
ODCZYNNIKI IMAGEN INFLUENZA VIRUS A I B
Jedna książeczka instrukcji użytkowania
szkiełka kontroli dodatniej z 2 x 2 studzienkami
zawierającymi utrwalone acetonem komórki
nerek koczkodana zielonego (Vero) zakażonego
albo wirusem grypy A lub wirusem grypy B w
oddzielnych rejonach studzienek.
Jedna butelka każdego z następujących:
3mL płynu do montowania. Środek do
montowania zawiera inhibitor fotowybielania
w roztworze glicerolu (pH 10,0).
1,4mL odczynnika testu IMAGEN Influenza
A. Odczynnik zawiera oczyszczone mysie
przeciwciała monoklonalne swoiste dla wirusa
grypy A, skoniugowane z FITC. Przeciwciała
monoklonalne są skierowane przeciw białku
macierzy i nukleoproteidzie grypy A.
1,4mL odczynnika testu IMAGEN Influenza
B. Odczynnik zawiera oczyszczone mysie
przeciwciała monoklonalne swoiste dla wirusa
grypy B, skoniugowane z FITC. Przeciwciała
monoklonalne są skierowane przeciw
nukleoproteidzie i białku hemaglutyniny
grypy B.
5.2. PRZYGOTOWANIE, PRZECHOWYWANIE I POWTÓRNE
UŻYWANIE SKŁADNIKÓW ZESTAWU
Aby uzyskać optymalne parametry zestawu ważne jest, żeby
wszystkie niezużyte składniki zestawu były przechowywane w
warunkach zgodnych z następującymi instrukcjami.
5.3. SZKIEŁKA KONTROLI DODATNIEJ Szkiełka kontroli dodatniej są dostarczane opakowane osobno,
każde w torebce foliowej zawierającej azot. Nieużyte szkiełka
przechowywać w temperaturze 2-8°C. Przed otwarciem
opakowania szkiełka powinny być pozostawione na 5 minut w
swoim opakowaniu w temperaturze pokojowej (15-30°C).
Barwić szkiełko natychmiast po odpakowaniu.
5.4. PŁYN DO MONTOWANIA Gotowy do użycia. Przechowywać w temperaturze 2-8°C. Przed
otwarciem opakowania płyn do montowania powinien być
pozostawiony na 5 minut w temperaturze pokojowej (15-30°C).
5.5.
ODCZYNNIKI IMAGEN INFLUENZA A I B -
/
Gotowe do użycia. Niezużyty odczynnik A i B przechowywać w
temperaturze 2-8°C. Odczynniki powinny być przechowywane w
ciemności w temperaturze 2-8°C, a na 5 minut przed otwarciem
pozostawione w temperaturze pokojowej (15-30°C).
6.2. AKCESORIA
Do stosowania razem z IMAGEN Influenza Virus A i B przeznaczone
są następujące produkty. Więcej informacji można uzyskać w
lokalnej filii lub u dystrybutora Oxoid.
Ogólne
Pokryte teflonem szkiełka mikroskopowe z pojedynczą studzienką
o średnicy 6mm (100 szkiełek w pudełku) można uzyskać w
lokalnej filii Oxoid lub u dystrybutora.
IMAGEN Influenza Positive Control Slide (nr kat. nr S611230-2).
7.
WYPOSAŻENIE
Wymagane jest następujące wyposażenie:
Pipeta precyzyjna i jednorazowe końcówki do przenoszenia 25µL
Kąpiel przemywająca
Szkiełka przykrywkowe nadające się do przykrycia studzienki o
średnicy 6mm
Niefluorescencyjny olejek imersyjny
Mikroskop epifluorescencyjny z systemem filtrów do FITC
(maksymalna długość fali wzbudzenia 490nm, średnia długość fali
emisji 520nm) i powiększenie x200 x 500.
Inkubator na 37°C
Wolnoobrotowa wirówka
Do próbek bezpośrednich
Urządzenie do pobierania śluzu (tylko próbki z nosogardzieli)
Do potwierdzenia wyników hodowli
Sterylne waciki, medium do przenoszenia wirusów (VTM) oraz
pojemnik odpowiedni do pobierania, przenoszenia i hodowania
wirusa grypy
Linie komórek zalecane do hodowli i izolacji wirusów grypy
8.
ŚRODEK OSTROŻNOŚCI
- Do badań diagnostycznych in vitro. Każda osoba
wykonująca test przy użyciu tego produktu musi być przeszkolona
w zakresie jego używania i musi mieć doświadczenie w
procedurach laboratoryjnych.
8.1. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
8.1.1
Odczynniki IMAGEN Influenza A i B zawierają 15mmol/L
azydku sodu, który jest trucizną. Azydek sodu może
reagować z miedzianymi i ołowianymi elementami
kanalizacji tworzącymi wybuchowe azydki metalu.
Zawsze usuwaj materiały zawierające azydek spłukując
je dużą ilością wody.
8.1.2
Szkiełka będące pozytywnymi kontrolami dla wirusa
grypy A i B są utrwalone w ten sposób, że nie zawierają
wykrywalnych żywych mikroorganizmów. Jednakże
szkiełka te powinny być traktowane i przechowywane
jako potencjalnie zainfekowane.
8.1.3
W przypadku, w którym na podstawie klinicznych
i epidemiologicznych kryteriów zalecanych przez
instytucje odpowiedzialne za zdrowie publiczne
podejrzewa się zakażenie nowym wirusem grypy
A, próbki należy pobrać z zachowaniem środków
ostrożności odpowiednich dla nowego wirusa grypy i
przesłać do centralnych laboratoriów referencyjnych
w celu przebadania. Nie należy rozpoczynać hodowli
wirusów, jeżeli dana instytucja nie zapewnia co najmniej
3. poziomu bezpieczeństwa biologicznego w zakresie
uzyskiwania i hodowli próbek.
8.1.4
W odczynniku obecny jest błękit Evansa. Może on być
rakotwórczy i nie należy dopuszczać do jego kontaktu ze
skórą.
8.1.5
Należy zachować ostrożność przy stosowaniu płynu
do montowania ponieważ może on powodować
podrażnienie skóry. Jeśli dojdzie do takiego kontaktu
skórę należy spłukać wodą.
8.1.6
Nie jeść, nie pić, nie palić, nie przechowywać lub
przygotowywać żywności i nie stosować kosmetyków w
obrębie wyznaczonego miejsca pracy.
8.1.7
Nie pipetować materiału ustami
8.1.8
Używać rękawiczek jednorazowych przy pracach z
próbkami klinicznymi i zakażonymi komórkami, zawsze
myć ręce po pracy z zakaźnymi materiałami.
8.1.9
Wszystkie próbki kliniczne usuwać zgodnie z lokalnym
prawodawstwem.
8.1.10 Na żądanie dostępne są dla wyszkolonego personelu
Karty charakterystyki bezpieczeństwa materiału.
8.2. TECHNICZNE ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
8.2.1
Nie używać składników po upływie daty ważności
wydrukowanej na etykietkach. Nie mieszać i nie
wymieniać odczynników z różnych partii/ serii.
8.2.2
Odczynniki są dostarczane w stałych stężeniach
roboczych. Przechowywanie odczynników w warunkach
innych niż szczegółowo opisane w Rozdziale 5 będzie
miało niekorzystny wpływ na wyniki testu.
8.2.3
W dniu użycia przygotować zgodnie z wymaganiami
świeży zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS).
8.2.4
Przepłukiwanie w PBS jest konieczne. Użycie
innych płynów do przepłukiwania, takich jak woda
wodociągowa lub destylowana unieważni wyniki.
8.2.5
Unikać mikrobiologicznego skażenia odczynników.
8.2.6
Odczynników nie wolno zamrażać.
9.
POBIERANIE I PRZYGOTOWYWANIE PRÓBEK7,8
Pobieranie i przygotowywanie próbek ma fundamentalne
znaczenie w diagnozie wirusowej infekcji układu oddechowego
metodami bezpośredniej immunofluorescencji i hodowli
komórkowej. Próbki musza być pobierane z miejsca infekcji
w czasie największej aktywności wirusa, tak aby zawierały jak
najwięcej zainfekowanego materiału i muszą być przygotowane
w taki sposób, aby zachować albo nienaruszone komórki wolne
od przylegającego śluzu itd. do bezpośredniej obserwacji próbek
pod mikroskopem lub zapewnić żywotność wirusów w próbkach,
które maja być hodowane.
Rozdzielanie komórek
Jeśli potrzeba, przed wirowaniem dodać do próbki 2mL
zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej (PBS) w celu
zmniejszenia lepkości i rozpuszczenia śluzu. Wirować ekstraktor
śluzu w temperaturze pokojowej (15-30°C) przez 10 minut przy
380g. Usunąć supernatant, który może być użyty do kultury
komórkowej. Ponownie przygotować zawiesinę osadu komórek
w 2mL PBS i delikatnie poruszać pipetą o szerokim otworze lub
delikatnie zamieszać, aż śluz się rozdzieli i zostanie uwolniony
materiał komórkowy. Unikać gwałtownego pipetowania lub
zawirowania, aby nie uszkodzić komórek. Kiedy otrzyma się
jednolitą zawiesinę dodać więcej PBS, zgodnie z wymaganiami,
poruszając pipetą lub mieszając po dodaniu dodatkowego PBS,
żeby dokładniej przepłukać komórki. Usunąć i wyrzucić wszelkie
widoczne drobiny śluzu, które jeszcze pozostały. Nadmierna
ilość śluzu musi zostać usunięta ponieważ przeszkadzałaby w
odpowiednim przenikaniu odczynnika i mogłaby spowodować
nieswoistą fluorescencję.
9.1. PRÓBKI KLINICZNE
9.1.1 Aspiraty/ wydzieliny z nosogardzieli
Przygotowanie szkiełek
Używając sterylnej pipety zebrać warstwę komórek do płynnej
pożywki. Wytrącić komórki przez wirowanie przy 200g przez 10
minut w temperaturze pokojowej (15 30°C) i usunąć supernatant.
Pobieranie
Pobrać próbki z rejonu nosogardzieli do ekstraktora śluzu za
pomocą rurki o rozmiarze 8. Zachowując temperaturę 2-8°C
należy jak najszybciej dostarczyć do laboratorium ekstraktor i
rurki w celu dokonania badań.
Jeśli wszystkie wydzieliny pozostają w rurce i żadna ilość nie
dociera do ekstraktora, wypłukać je z rurki do PBS. Najlepiej
zrobić to wkładając pipetę do końca rurki, która przylegała do
ekstraktora śluzu. Zasysać odpowiedni płyn do rurki i wypuszczać
go, dopóki nie zostaną uwolnione wydzieliny przylegające do
ścianki rurki. Zasysać do pipety zawiesinę i ją uwalniać dopóki śluz
nie zostanie odpowiednio rozdrobniony.
Przygotowanie szkiełek
Po zakończeniu procedury rozdzielania komórek odwirować
powstałą zawiesinę komórkową w temperaturze pokojowej
(15-30°C) przez 10 minut przy 380g i odrzucić supernatant.
Ponownie przygotować zawiesinę komórek w odpowiedniej
ilości PBS, aby rozpuścić cały pozostały śluz, zachowując zarazem
wysoką gęstość komórek. Umieścić 25µL ponownie przygotowanej
zawiesiny komórek w miejscu studzienek na szkiełku.
Pozostawić próbkę do dokładnego wyschnięcia na powietrzu
w temperaturze pokojowej (15-30°C) i utrwalić w świeżym
acetonie przez 10 minut. Jeśli próbka nie zabarwi się natychmiast
pozostawić ją w temperaturze -70°C tak długo, jak potrzeba.
Przechowywane szkiełka powinny być poddane testowi w ciągu 2
tygodni od przygotowania, przy dłuższym okresie przechowywania
może bowiem pogorszyć się ich stan.
9.2. HODOWLA KOMÓRKOWA
Inokulacja kultur komórkowych
Próbki pobrane w celu dokonania diagnozy infekcji wirusem grypy
powinny być inokulowane w linii komórek rutynowo stosowanych
w laboratorium, metodami przyjętymi w laboratorium. Kultury
komórkowe powinny być regularnie badane w kierunku działania
cytopatycznego (CPE), powinny być też w regularnych odstępach
przeprowadzane testy hemadsorpcyjne. Wszystkie hodowle
dodatnie w teście hemadsorpcyjnym lub hodowle komórek
wykazujące CPE mogą być pobierane i badane w kierunku
wirusów grypy A i B.
Przepłukać komórki przez powtórne przygotowanie zawiesiny
osadu komórek w PBS i powtórzyć wirowanie. Usunąć supernatant
i powtórnie przygotować zawiesinę osadu komórek w niewielkiej
objętości świeżego PBS, aby utrzymać wysoką gęstość komórek.
Umieścić objętości zawiesiny komórek równe 25µL w
poszczególnych studzienkach na szkiełkach. Pozostawić
próbkę do dokładnego wyschnięcia na powietrzu i utrwalać w
świeżym acetonie przez 10 minut w temperaturze pokojowej
(15-30°C). Jeśli próbka nie zabarwi się natychmiast pozostawić ją
w temperaturze 4°C na noc lub w temperaturze -70°C tak długo,
jak potrzeba. Przechowywane szkiełka powinny być poddane
testowi w ciągu 2 tygodni od przygotowania, przy dłuższym
okresie przechowywania może bowiem pogorszyć się ich stan.
10.
PROCEDURA TESTU
PRZED PRZEPROWADZENIEM PROCEDURY TESTOWEJ PROSZĘ
ZAJRZEĆ DO ROZDZIAŁU 8.2 TECHNICZNE ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
10.1. DODANIE ODCZYNNIKA
Dodać 25µL Odczynnika A do jednego miejsca utrwalonego
preparatu komórkowego na 6mm studzience i 25µL Odczynnika B
do innego miejsca utrwalonego preparatu komórkowego na innej
studzience o średnicy 6mm na szkiełku (patrz Rozdział 6) lub do
odpowiednich studzienek na szkiełku kontroli dodatniej. Upewnić
się, że odczynniki pokrywają całą powierzchnię każdej studzienki.
Odczynnik musi być stosowany na Positive dobrze i odczynnik B
muszą być stosowane na B pozytywna dobrze.
10.2. PIERWSZA INKUBACJA
Inkubować szkiełka z odczynnikami w wilgotnej komorze przez
15 minut w temperaturze 37°C. Nie pozwolić, aby odczynnik
wysechł na próbce ponieważ spowoduje to pojawienie się
nieswoistego zabarwienia.
10.3. PRZEPŁUKIWANIE SZKIEŁKA
Wypłukać nadmiar odczynnika za pomocą zbuforowanego
roztworu soli fizjologicznej (PBS) a następnie delikatnie
przez 5 minut przepłukiwać szkiełko w kąpieli z mieszadłem
zawierającej PBS. Odsączyć PBS i wysuszyć szkiełko na powietrzu
w temperaturze pokojowej (15-30°C).
10.4. DODAWANIE PŁYNU DO MONTOWANIA
Dodać jedną kroplę płynu do montowania do centrum każdej
studzienki i umieścić szkiełko przykrywkowe na płynie do
montowania i próbce, upewniając się, że nie zostały uwięzione
żadne pęcherzyki powietrza.
10.5. ODCZYTYWANIE SZKIEŁKA
Obejrzeć cały obszar studzienek zawierających wybarwione próbki
przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego. Fluorescencja, jak
opisano w Rozdziale 11, powinna być widoczna przy powiększeniu
x200-x500. (Najlepsze wyniki uzyskuje się, jeśli oględzin dokonuje
się bezpośrednio po barwieniu, ale w ciemności w temperaturze
2-8oC próbki mogą być przechowywane do 24 godzin).
11.
INTERPRETACJA WYNIKÓW TESTU
11.1. KONTROLE
11.1.1 Szkiełka kontroli dodatniej
Przy barwieniu i oglądaniu tak, jak opisano w Rozdziale 10,
szkiełko kontroli dodatniej powinno zawierać komórki z widoczną
jądrową i/ lub cytoplazmatyczną, soczyście zieloną fluorescencją,
kontrastującą z tłem materiału zabarwionego ujemnie.
Komórki te są nieco większe niż komórki nabłonka oddechowego
ale wykazują podobną jądrową i/ lub cytoplazmatyczną
fluorescencję przy infekcji wirusem grypy. Aby przekonać się,
czy procedura barwienia została przeprowadzona w sposób
zadowalający, należy zastosować szkiełka kontroli dodatniej.
Szkiełka te są przygotowywane ze szczepów wirusa grypy w
jednowarstwowych hodowlach komórkowych i będą jedynie
stanowić właściwą kontrolę procedury testowej a nie etapy
procedur, którym poddawane są próbki. Procedury, którym
poddawane są próbki powinny być kontrolowane przy użyciu
materiału klinicznego.
11.1.2 Kontrola ujemna
Jeśli potrzebne jest szkiełko kontroli ujemnej zaleca się
zastosowanie niezainfekowanych, nienaruszonych komórek
tego samego typu t, co użyte do hodowli i izolacji wirusa grypy.
Komórki powinny być przygotowane i utrwalone jak opisano w
Rozdziale 9.2 i wybarwione jak opisano w Rozdziale 10.
11.2. PRÓBKI KLINICZNE
11.2.1 Wygląd komórek zainfekowanych wirusem grypy
Wewnątrzkomórkowa, jądrowa i/ lub cytoplazmatyczna, ziarnista
soczyście zielona fluorescencja widoczna jest w komórkach
nabłonka oddechowego z wirusem grypy.
Niezainfekowane komórki barwią się na czerwono przy ujemnym
barwieniu błękitem Evansa.
11.2.2 Interpretacja
Diagnoza dodatnia stawiana jest kiedy jedna lub więcej komórek
w utrwalonej, wybarwionej próbce wykazuje z odczynnikiem
albo wirusa grypy A albo B, swoisty wzór fluorescencji, opisany
w Rozdziale 11.2.1
Ujemną diagnozę stawia się wtedy, gdy utrwalone, wybarwione
próbki nie wykazują fluorescencji z żadnym z dwóch odczynnikówi.
W przypadku bezpośrednio barwionych próbek aspiratów
z nosogardzieli należy obserwować przynajmniej 20 nie
zainfekowanych komórek nabłonka oddechowego zanim poda
się wynik ujemny. Jeśli obecne są komórki niedostatecznie
wybarwione patrz rozdział 11.2.3
W przypadku próbek pobranych z innych miejsc (np. plwociny)
przed stwierdzeniem ujemnego wyniku obserwuje się co najmniej
50 nie zainfekowanych komórek nabłonka oddechowego.
11.2.3 Komórki niedostatecznie wybarwione
Jeśli na płytce obecne są niedostatecznie wybarwione komórki, to
pozostała część próbki klinicznej powinna być wirowana przez 10
minut przy 380g w temperaturze pokojowej (15-30°C). Ponownie
przygotować zawiesinę komórek w mniejszej objętości PBS przed
powtórnym przeniesieniem (25µL) do obszarów studzienek.
Alternatywnie można zażądać powtórnej próbki klinicznej.
11.3. POTWIERDZENIE WYNIKÓW HODOWLI KOMÓRKOWEJ
11.3.1 Wygląd komórek zainfekowanych wirusem grypy
Zainfekowane komórki będą wykazywać wewnątrzkomórkową,
jądrową i/ lub cytoplazmatyczną soczyście zieloną fluorescencję i
powinny być uznane za dodatnie pod względem grypy.
Nie zainfekowane komórki będą się barwić z błękitem Evansa
ujemnie na czerwono i powinny być uznane za ujemne pod
względem grypy.
11.3.2 Interpretacja wyników
Diagnoza dodatnia stawiana jest kiedy jedna lub więcej komórek
w utrwalonej, wybarwionej próbce wykazuje z którymś z
odczynników IMAGEN Influenza A lub Influenza B typowy wzór
fluorescencji, opisany w Rozdziale 11.3.1
Przed przedstawieniem wyniku ujemnego, w studzience płytki
musi być widocznych co najmniej 50 nie zainfekowanych komórek
z hodowli komórkowej. Jeśli obecne są komórki niedostatecznie
wybarwione patrz rozdział 11.2.3
11.3.3 Komórki niedostatecznie wybarwione
Jeśli na płytce obecne są niedostatecznie wybarwione komórki,
to pozostała część próbki klinicznej powinna być wirowana
przez 10 minut przy 200g w temperaturze pokojowej (15-30°C).
Ponownie przygotować zawiesinę komórek w mniejszej objętości
PBS przed powtórnym przeniesieniem (25µL) do obszarów
studzienek. Alternatywnie można zażądać powtórnej próbki
klinicznej.
12.
OGRANICZENIA PARAMETRÓW
12.1. Stosować wyłącznie dostarczony płyn do montowania.
12.2. Wygląd obrazu fluorescencji może różnić się zależnie od
typu mikroskopu i zastosowanego źródła światła.
12.3. Zaleca się, aby do pokrycia obszaru studzienki o średnicy
6 mm zastosować 25µL odczynnika. Zmniejszenie tej
objętości może spowodować trudności z pokryciem
miejsca zajmowanego przez próbkę i zmniejszyć czułość.
12.4. Odczynniki są dostarczane w stałych stężeniach roboczych.
Modyfikacja odczynników lub ich przechowywanie w
warunkach innych niż zalecane może mieć niekorzystny
wpływ na wyniki testu.
12.5. Nie wykrycie wirusów grypy może być wynikiem takich
czynników jak pobranie próbki w niewłaściwym momencie
choroby, nieprawidłowe pobranie i/lub traktowanie
próbki, nieudana hodowla komórkowa itd. Wynik ujemny
nie wyklucza możliwości infekcji wirusowej.
12.6. Test IMAGEN Influenza virus A i B wykrywa swoiste dla
typu antygeny grypy A i B. Nie może być używany do
identyfikacji podtypów grypy A i B.
12.7. Obecność wirusa grypy w wydzielinach nosogardzielowych
niekoniecznie wyklucza możliwości równoczesnej
infekcji innymi patogenami. Wyniki testu powinny być
interpretowane w powiązaniu z informacjami dostępnymi
na podstawie badań epidemiologicznych, diagnozy
klinicznej pacjenta i innych procedur diagnostycznych.
12.8. Czasem nieswoiste barwienie ma miejsce jako artefakt
w teście immunochemicznym z powodu wiązania
fragmentów Fc przeciwciała z antygenem białka A
występującego na ścianie komórkowej niektórych
szczepów Staphylococcus aureus9. Odczynnik testowy
IMAGEN Influenza virus A i B został tak zmodyfikowany,
aby nie wiązał się z białkiem A szczepu Cowan 1
Staphylococcus aureus.
12.9. Wyniki testu powinny być interpretowane w powiązaniu
z informacjami dostępnymi na podstawie badań
epidemiologicznych, badań klinicznych pacjenta i innych
procedur diagnostycznych.
12.10. U pacjentów, u których donosowo zastosowano
szczepionkę przeciwko wirusom grypy A, wynik testu
może być dodatni do trzech dni po szczepieniu.
13.
OCZEKIWANE WARTOŚCI
W strefie klimatu umiarkowanego wybuchy epidemii grypy typu
A albo B mają miejsce głównie między późną jesienią a wczesną
wiosną, ale w tropikach sezonowość występowania jest mniej
wyraźnie zaznaczona.
Generalnie, częstość zakażenia wirusem grypy A u
nieuodpornionych dzieci i dorosłych jest podobna, przy
czym kliniczne przejawy infekcji są odwrotnie skorelowane z
wiekiem10,11,12. W czasie epidemii wirusa grypy B najwyższe
współczynniki zachorowań występują zazwyczaj wśród dzieci w
wieku szkolnym13,14. W czasie zimy, kiedy najczęstszym wirusem
grypy jest wirus, który krążył przez ostatnie parę lat i wobec tego
znaczna część populacji jest nań uodporniona, można uznać,
że wirusy grypy odpowiadają za około 15% wszystkich infekcji
układu oddechowego. Kiedy do populacji trafia nowy antygenowy
szczep wirusa grypy i znaczna część osób z nim się stykających
nie ma nań odporności, wirus tego szczepu może powodować
do 50% wszystkich zakażeń układu oddechowego. Jeśli do celów
diagnostycznych stosuje się zarówno metody serologiczne jak i
antygenowe w przypadku rozpoznanej i zdefiniowanej epidemii
współczynnik wykrywalności może osiągnąć 100%15.
14.
CHARAKTERYSTYKA WYNIKÓW DLA KONKRETNYCH
WIRUSÓW
14.1. REAKTYWNOŚĆ PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH
Stosując test immunologiczny wykazano, że przeciwciała użyte w
tym teście są swoiste dla typu wirusa. Przeciwciała wirusa grypy A
wykrywają szczepy wirusa grypy A H1N1, H2N2, H3N2 a przeciwciała
wirusa grypy B wykrywają różne wirusy zebrane miedzy 1940 a
19846,16,17.
14.2. BADANIA KLINICZNE
IMAGEN Influenza virus A i B był oceniany jako test do
bezpośredniego stosowania w dwóch klinicznych ośrodkach
badawczych zajmujących się wydzielinami i plwociną pobieraną
od dzieci i dorosłych, hospitalizowanych z objawami infekcji
układu oddechowego. Test był również oceniany w 5 ośrodkach
badawczych zajmujących się hodowlą szczepów macierzystych
wirusa w celu potwierdzenia obecności wirusów grypy. Badania te
były przeprowadzane w USA, w Europie i na Dalekim Wschodzie.
Ośrodki badawcze przeprowadziły bezpośrednie testy na 213
próbkach klinicznych i 227 próbkach hodowli komórkowych w celu
potwierdzenia wyników. Szczepy wykrywane przez przeciwciała
monoklonalne w teście IMAGEN Influenza virus A i B obejmowały
22 różne szczepy wirusa grypy A i 20 różnych szczepów wirusa
grypy B. Zastosowano standardowe (wzorcowe) metody takie
jak test immunonofluorescencji pośredniej przeprowadzany
bezpośrednio na próbkach i kulturach wirusa w komórkach
nerkowych pawiana, komórkach MDCK oraz jajach kurzych z
zarodkiem. Kultury dodatniego wirusa były potwierdzone za
pomocą immunofluorescencji pośredniej przy użyciu albo ciał
monoklonalnych albo poliklonalnych, albo też testu hamowania
hemoglutynacji (HAI).
14.3. WYNIKI KLINICZNE
14.3.1 Próbki bezpośrednie
Próbki kliniczne były pobierane głownie zimą 1984-87 a ośrodki
badawcze porównywały test IMAGEN Influenza virus A i B ze
standardowymi metodami. Do tych ocen użyto zarówno świeżych
klinicznych próbek, jak i wcześniej zamrożonych.
Przy zastosowaniu metod wzorcowych wynik uznawano
za dodatni jeśli albo wynik dla kultury komórkowej albo
immunoflurescencji pośredniej był dodatni. Umożliwiało to
wykrycie obecności nieżywotnego wirusa przez fluorescencję lub
komórek pozbawionych wirusa za pomocą hodowli komórkowej.
Tabela 14.3.1 zawiera wyniki otrzymane za pomocą odczynnika
IMAGEN Influenza virus A. W sumie częstość występowania
grypy w tych populacjach wynosiła 24,9%. Wyników testów
IMAGEN Influenza A były skorelowane z testami standardowymi
(211 przypadków, 99,1%). Czułość testu wyniosła 96,2% (51/53)
a swoistość 100% (160/160), zakładając, że standardowe testy
miały czułość i swoistość 100%. Wartości predyktywne dla
wyników dodatnich i ujemnych wynosiły odpowiednio 100%
(51/51) i 98.8% (160/162).
Czułość, swoistość i wartości predyktywne były wyliczane tak, jak
opisano poprzednio18.
W Tabeli 14.3.2 przedstawiono wyniki otrzymane za pomocą
odczynnika IMAGEN Influenza virus B. W sumie częstość
występowania grypy B w tych populacjach wynosiła 7.0%.
Odzwierciedla to niską częstość występowania grypy B w Europie
w czasie badań klinicznych. Wyniki testów IMAGEN Influenza B
były skorelowane z testami standardowymi 210 przypadków
(98.6%). Czułość testu wyniosła 88,7% (13/15), a swoistość
99,5% (197/198). Wartości predyktywne dla wyników dodatnich
i ujemnych wynosiły odpowiednio 92.9% (13/14) i 98.9%
(197/199).
Tabela 14.3.1
Porównanie
wyników
testów
przy
bezpośrednim zastosowaniu odczynnika IMAGEN Influenza
virus A do próbek klinicznych z testami standardowymi
WYNIKI
Metoda standardowa
IMAGEN Influenza virus A
Ośrodek 1
Ośrodek 2
ŁĄCZNIE Liczba próbek (213)
TESTÓW
Uje
Uje
59
101
160
Dod
Dod
35
16
51
Dod
Uje
1
1
2
Uje
Dod
0
0
0
Tabela 14.3.2
Porównanie
wyników
testów
przy
bezpośrednim zastosowaniu odczynnika IMAGEN Influenza
virus B do próbek klinicznych z testami standardowymi
WYNIKI
Metoda standardowa
IMAGEN Influenza virus B
Ośrodek 1
Ośrodek 2
ŁĄCZNIE Liczba próbek (213)
TESTÓW
Uje
Uje
81
116
197
Dod
Dod
12
1
13
Dod
Uje
1
1
0
Uje
Dod
1
0
1
14.3.2 Potwierdzenie za pomocą hodowli
Test IMAGEN Influenza virus A i B był badany na izolatach
klinicznych i szczepach macierzystych izolowanych w hodowlach
komórkowych przez pięć ośrodków. Izolacja wirusa została
dokonana przy użyciu pierwotnych lub wtórnych komórek nerek
pawiana lub w komórkach nerek psa Madin-Darby’ego (MDCK).
Hodowle komórkowe były przepłukiwane PBS przed nałożeniem
na szkiełka (patrz Rozdział 9.2). Szkiełka były utrwalane w acetonie
a następnie testowane odczynnikami IMAGEN Influenza virus A i
B. Do tych ocen użyto zarówno świeżych klinicznych izolatów, jak
i wcześniej zamrożonych próbek.
W sumie ocenie poddano 227 hodowli, z których 54 było
dodatnich pod względem wirusa grypy A, a 30 hodowli było
pozytywnych pod względem wirusa B. Wyniki dla izolatów
hodowli komórkowych zostało potwierdzone przy użyciu
immunofluorescencji lub testu hamowania hemaglutynacji (HAI).
Wyniki wskazują (Tabele 14.3.3 i 14.3.4) wskazują, że odczynnik
grypy A wykrył wszystkie wyizolowane wirusy grypy A (czułość
100%) a odczynnik wirusa B wykrył wszystkie wyizolowane wirusy
grypy B (czułość 100%).
Swoistość obu odczynników wynosiła 100%.
Tabela 14.3.3
Porównanie wyników testów uzyskanych przy
użyciu odczynnika IMAGEN Influenza virus A dla potwierdzenia
wyników hodowli za pomocą testów standardowych
WYNIKI
Metoda standardowa
IMAGEN Influenza virus A
Ośrodek 1
Ośrodek 2
Ośrodek 3
Ośrodek 4
Ośrodek 5
ŁĄCZNIE Liczba próbek (227)
TESTÓW
Uje
Uje
59
27
43
23
21
173
Dod
Dod
13
1
13
22
5
54
Dod
Uje
0
0
0
0
0
0
Uje
Dod
0
0
0
0
0
0
Tabela 14.3.4
Porównanie wyników testów uzyskanych przy
użyciu odczynnika IMAGEN Influenza virus B dla potwierdzenia
wyników hodowli za pomocą testów standardowych
WYNIKI
Metoda standardowa
IMAGEN Influenza virus B
Ośrodek 1
Ośrodek 2
Ośrodek 3
Ośrodek 4
Ośrodek 5
ŁĄCZNIE Liczba próbek (227)
TESTÓW
Uje
Uje
69
25
54
27
22
197
Dod
Dod
3
3
2
18
4
30
Dod
Uje
0
0
0
0
0
0
Uje
Dod
0
0
0
0
0
0
14.4. REAKTYWNOŚĆ KRZYŻOWA
Test IMAGEN Influenza virus A i B był przeprowadzany dla
preparatów innych wirusów i organizmów, których obecność w
wydzielinach układu oddechowego czy kulturach komórkowych
jest prawdopodobna. Wszystkie organizmy poddane testom
(Tabela 14.4) wykazywały ujemna reakcje z odczynnikiem
IMAGEN Influenza Virus, zarówno A jak i B.
Tabela 14.4
Organizmy testowane testem the IMAGEN
Influenza virus A i B i uznane za niereaktywne
Acholeplasma laidlawii
Adenowirus typy 1 5 i 7
Bordetella parapertussis
Bordetella pertussis
Branhamella catarrhalis
Candida albicans
Chlamydia psittaci
Chlamydia trachomatis
Coxsackie virus typy A9 i B4
Cytomegalovirus
Echovirus typy 3, 6, 9, 11 i 22
wirus Epsteina-Barra
Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma salivarium
Mycoplasma orale
Mycoplasma hominis
Mycoplasma arginini
Mycoplasma hyorhinus
Neisseria meningitidis A
Neisseria meningitidis B
Neisseria lactamica
Neisseria perflava
Neisseria cinerarea
Wirus grypy rzekomej typy 1,
2i3
Foamy virus
Pneumocystis carinii
Herpes simplex virus typy 1 i 2 Wirus polio typy 1 i 2
Legionella pneumophila
Syncytialny wirus oddechowy
wirus odry
Rhinovirus
Wirus świnki
Wirus małpi typy 5 i 40
Mycobacterium tuberculosis
Staphylococcus aureus
Mycobacterium avium
Streptococcus gps A,B,C,D F i G
Mycobacterium intracellulare Varicella zoster virus
15.
PIŚMIENNICTWO
1.
Frankl, R.I.B., Fauquet, C.M., Knudson, D.L., and Brown, F. (1992)
Classification and Nomenclature of Viruses. Fifth Report of the
International Committee on Taxonomy of Viruses. Archives of Virology
Supplement 2, Spurger Velacy, New York, pp 263-270.
Webster, R.G., Bean, W.J., Gorman, O.T., Chambers, T.M., and
Kawaoka, Y. (1992)
2.
3.
Evolution and Ecology of Influenza A viruses.
Microbiological Reviews. 56: No 1, 152-179.
Potter, C.W. (1990)
Influenza. In Principles and Practice for Clinical Virology (eds A.J.
Zuckerman et al). John Wiley and Sons Ltd, Chichester, pp 213-238.
Murphy, B.R., and Webster, R.G. (1990)
4.
5.
Orthomyxoviruses in Virology (eds B.N. Fields and D.M. Kripe) Raven
Press, New York, pp 1091-1152.
Galbraith, A.W. (1980)
6.
Influenza - Recent developments in prophylaxis and treatment.
British Medical Bulletin. 41: 381-385.
McQuillan, J., Madeley, C.R., and Kendal (1985)
Monoclonal antibodies for the rapid diagnosis of Influenza A and B virus
infections by immunofluorescence.
Lancet. 11: 911-914
Gardner, P.S., and McQuillin, J. (1980)
7.
8.
9.
Rapid virus diagnosis: Application of immunofluorescence (2nd Ed)
Butterworth, London, pp 92-123.
McIntosh, K., Masters, H.B., Orr, I., Chao, R.K., and Barkin, R.M.
(1978)
The immunologic response to infection with respiratory syncytial virus
in infants.
Journal of Infectious Diseases. 138: 24-32.
Krech T., Gerhard Fsadni D., Hofmann N., Miller S.M. (1985)
Interference of Staphylococcus aureus in the detection of Chlamydia
trachomatis by monoclonal antibodies.
The Lancet 1: 1161-1162.
10. Hall C.E., Cooney M.K., Fox J.P. (1973)
The Seattle virus watch. IV. Comparative epidemiologic observations of
infections with influenza A and B viruses. 1965-1969, in families with
young children.
American Journal of Epidemiology 98: 365-380.
11. Monto A.S., Kioumehr F. (1975)
The Tecumseh study of respiratory illness IX. Occurrence of influenza
in the community, 1966-1971
American Journal of Epidemiology 102: 553 563.
12. Foy H.M., Cooney M.K., Allan I. (1976)
Longitudinal studies of types A and B influenza among Seattle
schoolchildren and families, 1968 1974.
Journal of Infectious Diseases 134: 362 369.
13. Chin D.Y., Mosley W.H., Poland J.D., Rush D., Belden E.A., Johnson
O. (1963)
Epidemiologic Studies of type B influenza in 1961-1962.
American Journal of Public Health 53: 1068-1074.
14. Retailliau H.F., Storch G.A., Curtis A.C., Horne T.J., Scally M.J.,
Mettiwick M.A.W. (1979)
The epidemiology of influenza B in a rural setting in l977.
American Journal of Epidemiology 109: 639-649.
15. Caul E.O. (1986)
Personal communication (on file at Oxoid (Ely) Ltd).
16. Walls H.H., Harmon M.W., Slagle J.J., Stocksdale C., Kendal A.P.
(1986)
Characterisation and evaluation of monoclonal antibodies developed
for typing influenza A and influenza B viruses.
Journal of Clinical Microbiology 23: 240 245.
17. Espy M.J., Smith T.F., Harmon M.W., Kendal A.P. (1986)
Rapid detection of influenza virus by shell vial assay with monoclonal
antibodies.
Journal of Clinical Microbiology 24: 677 679.
18. Galen R.S. (1982)
Application of the predictive value model in the analysis of test
effectiveness in Clinics in Laboratory Medicine Symposium on Test
Selection Strategies. Volume 2. WB Saunders Company: 685 699.
PORADY TECHNICZNE I OBSŁUGA KLIENTA
IFU X7850A-PL Zmieniony grudnia 2013
OXOID Limited, Wade Road, Basingstoke,
Hampshire, RG24 8PW, Wielka Brytania
W sprawach wszelkich informacji proszę się kontaktować z lokalną
filią lub dystrybutorem Oxoid.