Artykuł naukowy

SPEKTROFOTOMETRIA UV-VIS W BADANIU AKTYWNOŚCI
POCHODNYCH 1,3,4-TIADIAZOLI W STOSUNKU DO AChE I
BuChE
A. SKRZYPEK, J. MATYSIAK, A. NIEWIADOMY, Uniwersytet Przyrodniczy,
Katedra Chemii, ul. Akademicka 15, 20-950 Lublin
Abstrakt: Związki z grupy 4-(1,3,4-tiadiazol-2-ilo)benzeno-1,3-dioli posiadają szerokie
spektrum działania biologicznego, uzależnione od rodzaju modyfikacji pierścienia
heterocyklicznego. Znane są one głównie jako substancje o działaniu
przeciwnowotworowym oraz antyproliferacyjnym w stosunku do szerokiej palety
komórek ludzkich linii nowotworowych. W niniejszej pracy podjęto próbę określenia
właściwości inhibicyjnych nowo zsyntezowanych pochodnych z tej grupy związków w
stosunku do acetylocholinoesterazy (AChE) i butyrylocholinoesterazy (BuChE). Są to
enzymy, który należą do klasy hydrolaz i są obecne w błonach presynaptycznych i
postsynaptycznych układu cholinergicznego, w krwinkach czerwonych i w osoczu krwi.
Zastosowano spektrofotometryczną metodę Ellmana, która w prosty sposób pozwala
określić aktywność potencjalnych inhibitorów AChE oraz BuChE. Niektóre z badanych
związków charakteryzują się inhibicją enzymu acetylocholinoesterazy przy stężeniach
rzędu nM, mogą zatem zostać poddane dalszym badaniom w kierunku poszukiwania
substancji o działaniu leczniczym w chorobie Alzheimera lub jako potencjalne
insektycydy.
Wprowadzenie: Choroba Alzheimera jest neurodegeneracyjnym schorzeniem układu
nerwowego charakteryzującym się obecnością blaszek amyloidowych oraz zwyrodnienia
włókienkowego w mózgu osób chorych, co w konsekwencji prowadzi do uszkodzenia
neuronów układu cholinergicznego odpowiedzialnego za procesy uwagi i
przywoływania śladów pamięciowych. Jest to najczęściej występująca postać otępienia,
obejmująca 50 – 80% jego przypadków. Większość przeprowadzonych badań wskazuje
na rozpowszechnienie się tej choroby w granicach 2 – 6 % populacji ogólnej osób
powyżej 65 roku życia [1]. Z uwagi na stałe wydłużanie życia populacji należy
oczekiwać, że jeśli nie zostaną opracowane metody zapobiegania lub leczenia tego
schorzenia, liczba chorych może się podwoić a nawet potroić w ciągu najbliższych lat
[2].
Leczenie objawowe w chorobie Alzheimera dotyczy wpływu na układy
neuroprzekaźnikowe, a zwłaszcza na układ acetylocholinergiczny i zaliczane jest do tzw.
strategii cholinergicznej. Istnieją różne metody zwiększania przekaźnictwa w układzie
cholinergicznym takie jak: bezpośrednie podawanie acetylocholiny (ACh) czy też
prekursorów (lecytyny) oraz działanie na receptory. Jednak tylko inhibitorom
acetylocholinoesterazy udowodniono skuteczność przy stosunkowo niewielkich
działaniach niepożądanych [3, 4]. Są one jedynymi lekami zaakceptowanymi przez
Urząd ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration, FDA) jako metoda
leczenia choroby Alzheimera [5].
Dlatego też w terapii tej choroby istotną rolę odgrywają leki z grupy
inhibitorów acetylocholinoesterazy (AChE), które hamują przez pewien czas rozwój
zmian degeneracyjnych, niestety nie likwidują jej przyczyn. Leki te są przydatne we
wczesnych stadiach choroby - przejściowo poprawiają pamięć i jakość życia osób
dotkniętych chorobą Alzheimera. Nie wywierają natomiast istotnego wpływu na postęp
schorzenia i nie hamują postępujących zmian neurodegeneracyjnych [6, 7].
Pierwszą substancją, którą zastosowano w leczeniu tej choroby była
fizostygmina. Niestety niekorzystne parametry farmakokinetyczne oraz skutki uboczne
w postaci silnych zaburzeń wegetatywnych spowodowały, że nie była ona stosowana na
szerszą skalę. Jednak badania nad fizostygminą wykazały, że stymulacja
neuroprzekaźnictwa ACh może wiązać się z przemijającą poprawą procesów
pamięciowych oraz ogólnego stanu klinicznego chorych [8]. Innym lekiem jest takryna,
niestety działa ona nieselektywnie, hamując zarówno enzymy w tkankach obwodowych,
jak i w ośrodkowym układzie nerwowym. Substancja ta jest agonistą receptorów
muskarynowych (M1 i M2) oraz przyśpiesza syntezę i uwalnianie ACh z magazynów.
Ponadto blokuje kanały jonowe (Na+, K+, Ca2+) oraz hamuje uwalnianie głównego
neuroprzekaźnika o działaniu inhibitującym w układzie nerwowym, tzw. GABA.
Stosowanie takryny powoduje liczne objawy niepożądane takie jak: zwiększenie
aktywności aminotransferaz, zmiany martwicze w biopsji wątroby, nudności.
Zdecydowanie bezpieczniejszym lekiem jest donepezil, który nie działa
hepatotoksycznie, a przy tym jego działanie lecznicze jest uznawane za zadowalające u
większości pacjentów poddanych terapii [9, 10].
Rys. 1. Wzór strukturalny acetylocholiny.
Wspomniany powyżej neuroprzekaźnik - acetylocholina (Rys. 1) pobudza część
postsynaptyczną neuronu cholinergicznego. Prekursorem acetylocholiny jest cholina,
która przenika z przestrzeni międzykomórkowej do wnętrza neuronów. Cholina ulega
estryfikacji, tj. przyłączeniu reszty kwasu octowego do acetylocholiny przy udziale
enzymu acetylotransferazy cholinowej. Powstała ACh jest uwalniana z zakończeń
presynaptycznych do przestrzeni synaptycznej przez dopływające impulsy nerwowe, a
część jej jest magazynowana w neuronach. Po wydzieleniu z zakończeń
presynaptycznych acetylocholina oddziałuje na receptory znajdujące się w
zakończeniach postsynaptycznych i jest bardzo szybko rozkładana przez enzymy tzw.
cholinoesterazy – acetylocholinesterazę (AChE) i butyrylocholinesterazę (BuChE).
AChE występuje w mózgu w neuronach, BuChE w komórkach glejowych, zwłaszcza w
reaktywnym mikrogleju [11]. Zarówno AChE, jak i BuChE występują w płytkach
starczych. W wyniku ubytku neuronów cholinoergicznych znacznie spada aktywność
AChE, a ACh niszczona jest intensywnie przez zawartą w gleju i płytkach starczych
BuChE, której aktywność wzrasta w miarę postępu choroby Alzheimera. Inhibitory
cholinoesteraz dzięki blokowaniu tych enzymów, przyczyniają się do zwiększenia ilości
ACh w synapsach cholinoergicznych, co poprawia neuroprzekaźnictwo.
Omawiane inhibitory można podzielić ze względu na mechanizm ich działania
na trzy grupy: inhibitory odwracalne (np. takryna, donepezil), pseudonieodwracalne
(np. fizostygmina) i nieodwracalne (np. metrifonat). Inhibitory nieodwracalnie i
pseudonieodwracalne nazywane są także acylującymi, ponieważ acylują enzym,
działając w ten sam sposób co substrat. Różnice dotyczą jedynie prędkości deacylacji.
Mogą być one bardzo powolne, w przypadku inhibitorów pseudonieodwracalnych, bądź
nawet równe zeru - dla nieodwracalnych. Natomiast inhibitory odwracalne tworzą
jedynie addytywny kompleks, w konsekwencji nie dając produktów reakcji. W rezultacie
prędkość reakcji hydrolizy ulega spowolnieniu jako efekt konkurencji między
inhibitorem a substratem o centrum katalityczne enzymu [12].
Badając i analizując przebieg reakcji enzymatycznych Leonor Michaelis i Maud
Menten sformułowali teorię działania enzymów i opisali ich kinetykę. Zgodnie z tą
teorią enzym (E) tworzy z substratem (S) kompleks enzym-substrat (ES), a następnie
może z powrotem dysocjować w reakcji odwrotnej na enzym i substrat lub przekształcać
się w produkt (P) i wolny enzym (Schemat 1). Mechanizm łączenia się enzymu z
substratem ma charakter indukowanego dopasowania, opierającego się na dopasowaniu
kształtu enzymu do substratu lub odpowiedniej grupy substratów i przekształceniu ich w
produkty. W kompleksie ES cząsteczka enzymu wymusza optymalne dla reakcji
ułożenie cząsteczek substratów w przestrzeni. W trakcie tworzenia kompleksu również
w cząsteczce enzymu następują zmiany budowy przestrzennej [12].
E+S
k1
k2
ES
k3
E+P
gdzie:
k1, k 2, k3 – stałe szybkości reakcji.
Schemat 1. Reakcja katalizowana enzymatycznie zaproponowana przez Michaelisa i Menten’a
Jeżeli stężenie substratu jest niewielkie, to tylko niektóre cząsteczki enzymu
tworzą kompleks z substratem i reakcja przebiega z szybkością V0 opisaną równaniem
(1). Natomiast przy wysokich stężeniach substratu praktycznie wszystkie cząsteczki
enzymu połączone są z substratem i reakcja biegnie z szybkością maksymalną (Vmax). Tę
zależność ujmuje równanie Michaelisa - Menten’a, którego wykres jest hiperbolą (Rys.
2):
V0 =
V max ×[S]
K m + [S]
(1)
gdzie:
Vmax – szybkość maksymalna reakcji osiągana w warunkach całkowitego wysycenia
enzymu substratem,
[S] – stężenie substratu,
V0 – szybkość początkowa reakcji,
Km – stała Michaelisa – Menten’a.
Rys. 2. Zależność między stężeniem substratu a szybkością reakcji enzymatycznej.
Szybkość reakcji enzymatycznej zależy od stężenia kompleksu (ES) oraz
szybkości jego powstawania i rozpadu. Miarą stabilności kompleksu (ES) jest stała
Michaelisa – Menten’a (Km) (równanie (2)).
Km =
k 2 + k3
k1
(2)
gdzie:
Km - stała Michaelisa – Menten’a,
k1- stała szybkości tworzenia kompleksu ES,
k2- stała szybkości rozpadu kompleksu ES w kierunku uwolnienia substratu,
k3- stała szybkości rozpadu kompleksu ES z wytworzeniem produktu.
Stała Km nie zależy od stężenia enzymu. Jej wartość równa jest takiemu
stężeniu substratu, przy którym początkowa szybkość reakcji (V0) stanowi połowę
szybkości maksymalnej (Vmax) i najczęściej mieści się w granicach 10-1 – 10-7 mol/dm3.
Parametry Vmax i Km charakteryzują aktywność metaboliczną enzymów. Wartość Km
odzwierciedla taką ilość substratu, w którym połowa miejsc aktywnych w cząsteczkach
enzymu jest zajęta. Pozwala to uzyskać informację, jakie stężenie substratu jest
konieczne do osiągnięcia znaczącego przyśpieszenia reakcji [13]. Stwierdzono ponadto,
że jeśli stała szybkości (k2) rozpadu kompleksu (ES) do substratu i wolnego enzymu jest
znacznie wyższa od stałej rozpadu tego kompleksu do produktu i enzymu (k3), to
wówczas wartość Km jest miarą siły wiązania substratu przez enzym. Można ogólnie
wnioskować, że wysoka wartość stałej Km wskazuje na słabe powinowactwo enzymu do
substratu. Aby dokładnie wyznaczyć wartość Km oraz Vmax należy oprzeć się na
równaniu Lineweavera-Burka (równanie (3)), które jest odwrotnością zależności
Michaelisa – Menten’ a, a jej wykresem jest linia prosta (Rys. 3).
1 Km
[ I] 1
1
=
(1 + )
+
v Vmax
K i [S] Vmax
gdzie:
v- szybkość reakcji,
(3)
Km- stała Michaelisa – Menten’a,
Vmax – maksymalna szybkość reakcji,
[I]– stężenie inhibitora,
Ki – stała dysocjacji kompleksu enzym-inhibitor,
[S] – stężenie substratu.
W celu doświadczalnego wyznaczenia Km należy wykonać serię pomiarów, w
których początkową szybkość reakcji wyznacza się stosując różne stężenia substratu, ale
zachowując stałe stężenie enzymu. Aktywność katalityczna enzymu może zostać
zmniejszona poprzez przyłączenie się cząsteczek inhibitora. Typ inhibicji dla substancji
badanej określa się przeprowadzając reakcje enzymatyczne przy rożnych stężeniach
substratu oraz inhibitora. Na początku wyznacza się wartości Km i Vmax, a następnie
uzyskane dane przedstawia się graficznie na wykresie.
Rys. 3. Wykres zależności 1/v od 1/[S] zwany wykresem Lineweavera-Burka.
Interpretacja typu inhibicji enzymatycznej pozwala określić kinetykę badanej
reakcji oraz specyficzność danego enzymu i budowę jego centrum aktywnego. Wyróżnia
się następujące rodzaje inhibicji:
inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca)
inhibicja niekompetycyjna (niewspółzawodnicząca)
inhibicja akompetycyjna
inhibicja mieszana
Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca) występuje wtedy, gdy inhibitor
łączy się z wolną formą enzymu w taki sposób, że enzym nie może związać się już z
substratem. Oznacza to, że inhibitor i substrat wykluczają się nawzajem, najczęściej z
powodu współzawodnictwa o to samo miejsce w enzymie. Inhibitor kompetycyjny może
być pochodną substratu, alternatywnym substratem lub produktem reakcji. Zdarzają się
przykłady inhibicji kompetycyjnej powodowanej przez substancje, które strukturalnie
nie są podobne do substratów, jest to tzw. inhibicja zwrotna. W takim przypadku
inhibitor zostaje połączony z enzymem w miejscu innym niż centrum aktywne.
Powoduje to zmiany konformacji enzymu (w trzecio- lub czwartorzędowej jego
strukturze) i przez to zniekształcone zostaje miejsce lokowania się substratu
uniemożliwiając jego związanie. Inhibitor kompetycyjny nie zmienia wartości Vmax,
rośnie natomiast wyznaczona dla takiego układu wartość Km co świadczy, że
powinowactwo substratu do enzymu maleje.
Inhibicja niekompetycyjna (niewspółzawodnicząca) - w tym przypadku
zarówno użyty inhibitor, jak i substrat nie oddziałują na siebie, ponieważ wiążą się
odwracalnie, losowo i niezależnie w różnych miejscach. Uniemożliwia to przyjęcie
przez enzym odpowiedniej konformacji, wymaganej do jego aktywności katalitycznej,
co powoduje zmniejszenie się maksymalnej szybkości reakcji enzymatycznej (Vmax).
Cząsteczki enzymu pozostające w środowisku reakcyjnym wykazują niezmienione
powinowactwo do substratu (Km pozostaje bez zmian) [14-17].
W inhibicji akompetycyjnej inhibitor wiąże się odwracalnie z kompleksem (ES),
tworząc nieaktywny kompleks (ESI). Inhibitor nie wiąże się do wolnego enzymu. Ten
rodzaj inhibicji rzadko występuje w układach z jednym substratem, natomiast
powszechnie w reakcjach wielosubstratowych. Inhibitor akompetycyjny obniża Vmax i
Km o ten sam współczynnik, co w rezultacie daje wykres dwóch linii (kontrolnej bez
inhibitora i drugiej po dodatku inhibitora) równoległych względem siebie.
Inhibicja mieszana – jeżeli inhibitor może wiązać się zarówno z wolnym
enzymem, jak i z kompleksem enzym-substrat to wówczas wykres Lineweavera-Burka
dla różnych stężeń inhibitora nie przedstawia prostych równoległych, ani przecinających
się na osi rzędnych [18].
Stosowane w leczeniu choroby Alzheimera substancje powodują wiele działań
niepożądanych, m.in. zaburzenia żołądkowo-jelitowe, mają niską biodostępność lub
słabą przenikalność przez barierę krew-mózg. W związku z tym poszukuje się nowych,
bezpieczniejszych oraz skuteczniejszych środków leczniczych. Celem tej pracy jest
próba oceny właściwości inhibicyjnych nowo zsyntezowanych pochodnych 1,3,4 –
tiadiazoli w stosunku do acetylocholinoesterazy i butyrylocholinoesterazy.
Część eksperymentalna:
Synteza pochodnych 4-(1,3,4-tiadiazol-2-ilo)benzeno-1,3-dioli:
Poddane badaniu w stosunku do AChE i BuChE związki zostały otrzymane w
reakcji sulfinylo-bis((2,4-dihydroksyfenylo)metanotionu [19] z hydrazydami (Rys. 4),
gdzie po utworzeniu liniowego produktu – tioaryloilowej pochodnej i przegrupowaniu
tautomerycznym następował proces intramolekularnej addycji. W efekcie końcowym
eliminacja cząsteczki wody prowadziła do utworzenia pierścienia 1,3,4-tiadiazolu [20].
Pierścień 1,3,4–tiadiazolu jest połączony z ugrupowaniem 2,4-dihydroksyfenylowym,
które zapewnia zwilżalność związków wodą oraz utrzymuje równowagę hydrofilowohydrofobową - jeden z koniecznych warunków bioaktywności związków.
Prawdopodobnie decyduje też o stosunkowo niskiej toksyczności substancji.
OH
S
S
OH
O
S
HO
O
+ H2N NH C
OH
R
CH3OH
S
HO
∆, 2-3 h
R
N N
OH
Rys. 4. Schemat syntezy 4-(1,3,4-tiadiazol-2-ilo)benzeno-1,3-dioli
Zsyntezowano w ten sposób ponad 50 różnych połączeń, które poddane były
badaniom enzymatycznym na modelu in vitro. Poniżej (Rys. 5) przedstawiono 4
przykładowe struktury chemiczne dla związków o działaniu inhibicyjnym wobec AChE.
OH
OH
HO
HO
S
N
S
CH3
N
N
CF3
N
2
1
OH
OH
Cl
Cl
HO
HO
S
S
Cl
N
N
N
4
3
H3CO
N
H
H
O
H
N
H N
O C N H
H
O
H3CO
Donepezil
Neostygmina
Rys. 5. Struktury chemiczne zsyntezowanych związków oraz substancji referencyjnych neostygminy i
donepezilu.
Strukturę
wszystkich
połączeń
potwierdzono
za
pomocą
metod
spektroskopowych. Widma 1H NMR i 13C NMR zarejestrowano w DMSO–d6 aparatem
Varian Mercury 400 lub Bruker DRX 500. Widma oscylacyjne – na spektrofotometrze
Perkin – Elmer FT–IR 1725X przy użyciu pastylki z KBr w zakresie 600 – 4000 cm-1.
Widma ze spektroskopii masowej (EI–MS, 70eV) rejestrowano przy użyciu aparatu
AMD-604. Natomiast analizę elementarną (C, H, N) wykonano używając aparatu
Perkin - Elmer 2400.
W celu określenia aktywności AChE i BuChE pomiaru absorbancji dokonano na
spektrofotometrze Varian Cary 50 - Bio z przystawką termostatującą PCB - 150.
Oznaczenia aktywności AChE i BuChE:
Aktywność inhibicyjną otrzymanych związków w stosunku do AChE i BuChE
określono metodą spektrometryczną wykorzystując metodykę opisaną przez Ellmana
[21]. Analizowany spektrofotometrycznie roztwór zawierał: 1 ml (0,1 mol/dm-3, pH =
8,0) buforu fosforanowego, 50 µl barwnika DTNB (0,01 mol/dm-3), 50 µl jodku
acetylotiocholiny (ATChI) (lub jodku butyrylotiocholiny (BuTChI)), 10 µl enzymu
AChE (lub BuChE) oraz 50 µl testowanego związku. Sporządzono siedem różnych
stężeń (w zakresie 10-3 ÷ 10-9 mol/dm-3) badanych połączeń. Roztwory enzymów zostały
przygotowane przez rozpuszczenie 2 U/ml w 2 ml buforu fosforanowego. Wszystkie
odczynniki pochodziły z firmy Sigma –Aldrich (Steinheim, Germany).
Badany roztwór termostatowano w kuwecie przez 10 minut w temperaturze 37 ±
0,2 0C. Hydroliza acetylotiocholiny (butyrylotiocholiny) wywołała zmianę barwy, którą
śledzono ilościowo, mierząc absorbancję przy długości fali 412 nm przez 1 minutę. Jako
odnośnika użyto 0,1 M roztworu buforu fosforanowego o pH = 8,0. Związkami
referencyjnymi były stosowane w medycynie inhibitory AChE i BuChE, których
struktury chemiczne przedstawiono na rysunku 5.
Wszystkie związki zostały zanalizowane w trzech seriach pomiarów, a następnie
wyznaczono dla nich wartości IC50. Jest to takie stężenie substancji będącej
potencjalnym inhibitorem, przy którym inhibicja osiąga wartość 50%. W tym celu za
pomocą programu GraFit 4.09 sporządzono wykresy zależności % inhibicji związku w
zależności od logarytmu ze stężenia potencjalnego inhibitora (log Cm) [22]. Wyniki
wartości IC50 w stosunku do AChE i BuChE dla badanych połączeń oraz związków
wzorcowych przedstawiono w tabeli 1.
Badanie kinetyki reakcji i określanie typu inhibicji:
Następnym etapem badań było określenie typu inhibicji dla wybranych połączeń
W tym celu na początku sporządzono wykres zależność absorbancji (A) od różnych
stężeń jodku acetylotiocholiny (A = f ([S])), gdzie [S] – stężenie ATChI. Jeżeli
przyjmiemy, że w zakresie niskich stężeń substratu wartość zmierzonej absorbancji jest
równoważna z ilością powstałego produktu w czasie, to wtedy szybkość danej reakcji
jest równa wartości tej absorbancji. Wartość szybkości reakcji (V) otrzymano więc z
przekształcenia równania A = f ([S]). Z przekształcenia hiperbolicznego wykresu
Michaelisa - Menten’a otrzymano prostoliniowe wykresy Lineweavera-Burka, czyli
zależność odwrotności szybkości reakcji (1/V) w stosunku do odwrotności stężenia
substratu (1/[S]). Na rysunkach 6 i 7 przedstawiono przykładowe wykresy, dzięki
którym określono typ inhibicji odpowiednio dla związków nr 1 i 2.
Wyniki:
Analiza widm opisywanych związków:
Związek nr 1: 4-(5-(3-metylofenylo)-1,3,4-tiadiazol-2-ilo)benzeno-1,3-diol
Analiza elementarna dla C15H12N2O2S (284,06):
obliczono: C, 63,36; H, 4,25; N, 9,85;
znaleziono: C, 63,42; H, 4,23; N, 9,89;
1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm) δ: 11,14 (s, 1H, HO-C(3)), 10,10 (s, 1H, HOC(1)), 8,08 (d, J = 8,73 Hz, 1H, H-C(5), 7,83 (m, 2H, H-C(2’,4’), 7,45 (t, J = 7,55 Hz,
1H, H-C(5’)), 7,36 (m, 1H, H-C(6’)), 6,53 (d, J = 2,18 Hz, 1H, H-C(2)), 6,48 (dd, J =
8,74 i 2,36 Hz, 1H, H-C(6)), 2,41 (s, 3H, CH3);
13
C NMR (125 MHz, DMSO-d6, ppm) δ: 166,2, 162,6, 161,3, 156,3, 138,8, 131,3, 130,1,
129,2, 128,9, 127,7, 124,4, 108,4, 108,3, 102,3;
IR (KBr, cm-1): 3138 (OH), 1632 (C=N), 1598, 1528, 1471, 1443, 1318 (C=C), 1281,
1262, 1214, 1175 (C-O), 1141, 1041 (N=C-S-C=N), 986, 966, 877, 846, 778 (H-Ar),
684, 665 (C-S-C), 596, 522;
EI-MS (m/z, %): 284 (M+, 100), 168 (4), 167 (38), 153 (6), 150 (3), 149 (15), 142 (4),
135 (13), 119 (5), 118 (4), 117 (5), 116 (4), 107 (5), 91 (9), 80 (3), 65 (4).
Związek nr 2: 4-(5-(4-trifluorometylofenylo)-1,3,4-tiadiazol-2-ilo)benzeno-1,3-diol
Analiza elementarna dla C15H9F3N2O2S (338,30):
obliczono: C, 53,25; H, 2,68; N, 8,28;
znaleziono: C, 53,30; H, 2,65; N, 8,30;
1
H NMR (500 MHz, DMSO-d6, ppm) δ: 11,20 (s, 1H, HO-C(3)), 10,11 (s, 1H, HOC(1)), 9,23 (d, J = 8,11 Hz, 2H, H-C(3’,5’)), 8,10 (d, J = 8,69 Hz, 1H, H-C(5)), 7,90 (d,
J = 8,32 Hz, 2H, H-C(2’,6’)), 6,54 (d, J = 2,30 Hz, 1H, H-C(2)), 6,46 (dd, J = 8,70 i 2,31
Hz, 1H, H-C(6));
13
C NMR (125 MHz, DMSO-d6, ppm) δ: 164,1, 163,4, 161,6, 156,5, 134,0, 129,0, 128,9,
128,0, 125,1 (CF3), 126,3, 126,2, 125,0, 108,4, 108,2, 102,3;
IR (KBr, cm-1): 3452, 3202 (OH), 1631 (C=N), 1600, 1523, 1473 (C=C), 1413, 1320
(CF3), 1235, 1170 (C-O), 1141 (CAR-CF3), 1115, 1067 (N=C-S-C=N), 1012, 996, 985,
964, 843, 829, 799, 671 (C-S-C);
EI-MS (m/z, %): 338 (M+, 100), 319 (9), 309 (4), 203 (20), 189 (14), 171 (4), 169 (4),
167 (47), 153 (13), 152 (6), 145 (12), 139 (8), 135 (15), 121 (7), 119 (9), 112 (5), 108
(7), 107 (14), 106 (5), 95 (7), 80 (90), 69 (11), 51 (8), 39 (11).
Związek nr 3: 4-(5-(2-chlorofenylo)-1,3,4-tiadiazol-2-ilo)benzeno-1,3-diol
Analiza elementarna dla C14H9ClN2O2S (304,75):
obliczono: C, 55,18; H, 2,98; N, 9,19;
znaleziono: C, 55,06; H, 2,99; N, 9,21;
1
H NMR (500 MHz, DMSO-d6, ppm) δ: 11,17 (s, 1H, HO-C(3)), 10,14 (szeroki sygnał,
1H, HO-C(1)), 8,17 (m, 1H, H-C(3’)), 8,14 (d, J = 8,70 Hz, 1H, H-C(5)), 7,69 (m, 1H,
H-C(6’)), 7,55 (m, 2H, H-C(4’,5’)), 6,56 (d, J = 2,32 Hz, 1H, H-C(2)), 6,51 (dd, J = 8,70
i 2,33 Hz, 1H, H-C(6));
13
C NMR (125 MHz, DMSO-d6, ppm) δ: 164,2, 161,8, 161,4, 156,4, 131,8, 131,3, 130,9,
130,6, 129,0, 128,9, 127,8, 108,4, 108,1, 102,4;
IR (KBr, cm-1): 3186 (OH), 1629 (C=N), 1598 (C=C), 1522 (C=C), 1473 (C=C), 1417,
1314, 1230, 1183 (C-O), 1068 (N=C-S-C=N), 1042, 995, 982, 965, 845 (H-Ar), 798,
757, 733, 714, 681 (C-S-C), 648, 632;
EI-MS (m/z, %): 304 (M+, 100), 171 (6), 169 (19), 168 (7), 167 (78), 157 (8), 156 (5),
155 (24), 153 (12), 140 (4), 139 (10), 138 (8), 137 (14), 136 (3), 135 (18), 134 (10), 125
(5), 111 (15), 108 (10), 107 (19), 106 (8), 102 (13), 97 (8), 95 (5), 90 (4), 84 (5), 80 (13),
79 (7), 76 (6), 75 (15), 69 (17), 66 (5), 65 (7), 63 (11), 62 (6), 58 (2), 53 (6), 52 (24), 51
(18), 50 (10), 45 (7), 39 (22), 38 (5).
Związek nr 4: 4-(5-(2,4-dichlorofenylo)-1,3,4-tiadiazol-2-ilo)benzeno-1,3-diol
Analiza elementarna dla C14H8Cl2N2O2S (339,20):
obliczono: C, 49,57; H, 2,38; N, 8,26;
znaleziono: C, C, 49,66; H, 2,36; N, 8,23;
1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm) δ: 11,21 (s, 1H, HO-C(3)), 10,15 (s, 1H, HOC(1)), 8,22 (dd, J = 8,56 i 0,28 Hz, 1H, H-C(5’)), 8,14 (d, J = 8,71 Hz, 1H, H-C(5)), 7,89
(dd, J = 2,11 i 0,27 Hz, 1H, H-C(3’)), 7,65 (dd, J = 8,57 i 2,11 Hz, 1H, H-C(6’)), 6,54 (d,
J = 2,20 Hz, 1H, H-C(2)), 6,41 (dd, J = 8,71 i 2,29 Hz, 1H, H-C(6));
13
C NMR (125 MHz, DMSO-d6, ppm) δ: 164,3, 161,5, 160,0, 156,4, 135,6, 132,2, 132,0,
130,0, 128,9, 128,4, 128,1, 108,5, 108,1, 102,3;
IR (KBr, cm-1): 3400, 3196 (OH), 1630 (C=N), 1595 (C=C), 1524 (C=C), 1478 (C=C),
1411, 1341, 1315, 1246, 1246, 1177 (C-O), 1142, 1110 (C-Cl), 1067 (N=C-S-C=N),
994, 966, 947, 815 (H-Ar), 745, 684, 668 (C-S-C), 648, 614;
EI-MS (m/z, %): 338 (M+, 100), 205 (7), 203 (10), 191 (5), 189 (7), 171 (5), 169 (6), 168
(7), 167 (65), 153 (8), 135 (8), 119 (6), 107 (7), 80 (4), 69 (5), 52 (6), 39 (4).
Widma 1H-NMR otrzymanych związków zawierają charakterystyczne zakresy
przesunięć chemicznych protonów dla zakresu 0-15 ppm względem DMSO w zakresie
11,21÷11,14 ppm i 10,15÷10,10 ppm odpowiednio dla C(3)–OH i C(1)–OH w
pierścieniu rezorcynolowym.
W widmach 13C NMR obserwuje się sygnały w zakresie 166-160 ppm, które są
charakterystyczne dla atomów węgla pierścienia 1,3,4-tiadiazolu.
Natomiast na widmach oscylacyjnych (IR) pojawiają się charakterystyczne pasma
przy częstotliwościach: 3550 – 3510 cm-1 (OH), 1650 – 1610 cm-1 (C=N), 1050 – 1010
cm-1 (N=C-S-C=N).
Na widmach ze spektroskopii masowej zaobserwowano obecność pików jonów
molekularnych M+ oraz inne charakterystyczne fragmentacje dla układu 1,3,4-tiadiazolu.
Analiza aktywności enzymatycznej badanych połączeń:
Aktywność inhibicyjna dla nowo zsyntezowanych związków w stosunku do
AChE i BuChE została wyznaczona poprzez określenie IC50. Uzyskane wartości dla obu
enzymów przedstawiono w tabeli 1.
Analizując wartości IC50 otrzymane w stosunku do acetylocholinoesterazy można
zauważyć, że dwa związki (1 i 2) wykazują inhibicję na poziomie nM, czyli przy takich
wartościach stężeń, które przy obecnym poziomie wiedzy klasyfikują je do dalszych
badań w tym kierunku. Dla związków 3 i 4 stężenie przy którym aktywność enzymu
zmniejsza się o połowę kształtuje się w zakresie µM. Natomiast aktywność wobec
BuChE jest na poziomie mikromoli dla wszystkich połączeń poza związkiem 4, w
którym wartość IC50 jest większa niż 500 µM. W zbadanych układach zarówno efekty
elektronowe, jak i steryczne wpływają na aktywność inhibitującą w stosunku do
analizowanych enzymów.
Tabela 1. Wartości IC50 w stosunku do AChE I BuChE badanych związków i wzorców.
Nr związku
AChE
IC50 ± SD [µM]
BuChE
IC50 ± SD [µM]
1
0,16 ± 0,01
17,02 ± 0,40
2
0,09 ± 0,004
26,49 ± 1,22
3
1,55 ± 0,02
196,24 ± 7,00
4
128,42 ± 7,13
> 500
neostygmina
0,05 ± 0,006
0,07 ± 0,009
donepezil
0,02 ± 0,008
7,52 ± 0,2
Związek 2 (IC50=0,09 µM) posiada najlepszą aktywność inhibicyjną w stosunku
do AChE zbliżoną do związku referencyjnego – neostygminy (IC50=0,05 µM). Może to
sugerować względnie dobre dopasowanie cząsteczek analizowanego związku w centrum
katalitycznym enzymu.
Związki 3 i 4 posiadające atomy chloru odpowiednio w pozycji 2 oraz 2 i 4
pierścienia fenylowego znacznie różnią się aktywnością. Związek 3 wykazał
zdecydowanie lepszą właściwość inhibicyjną (IC50=1,55 µM) w stosunku do
acetylocholinoesterazy. Widać również wyraźną różnicę w wartościach IC50 dla BuChE.
Związek z dwoma atomami chloru wykazuje zdecydowanie gorszą aktywność
inhibicyjną wobec butyrylocholinoesterazy. Natomiast związek 1 wykazuje dobrą
aktywność hamującą zarówno BuChE i AChE.
Analiza wykresu Lineweavera-Burka dla związku 1 (Rys. 6) wskazuje na
mieszany typ inhibicji acetylocholinoesterazy. Natomiast związek 2 (Rys. 7) zachowuje
się jak inhibitor niekompetycyjny, ponieważ na wykresie wartość Km jest stała,
natomiast zmienia się Vmax w zależności od obecności i ilości badanego związku.
1
brak inhibitora
0,12 µM
0,17 µM
V-1 min/ ∆A
30
25
20
15
10
5
0
-12
-8
-4
-5 0
4
8
12
[S]-1 mM-1
Rys. 6. Wykres Lineweavera-Burka przedstawiający mieszany typ inhibicji dla związku nr 1.
2
brak inhibitora
0,10 µM
0,14 µM
V-1 min/ ∆A
25
20
15
10
5
0
-12
-8
-4
-5
0
4
8
12
[S]-1 mM-1
Rys. 7. Wykres Lineweavera-Burka przedstawiający niekompetycyjny typ inhibicji dla związku nr 2.
Ponieważ u osób chorych na Alzheimera aktywność butyrylocholinoesterazy
rośnie, natomiast aktywność acetylocholinoesterazy pozostaje niezmieniona lub ulega
obniżeniu, dlatego prawdopodobnie obydwa enzymy biorą udział w regulacji poziomu
acetylocholiny i stanowią właściwe cele dla terapii deficytu cholinergicznego. Wyniki
badań z użyciem substancji o zwiększonej selektywności wobec butyrylocholinesterazy
(cymseryna, MF-8622) i inhibitorów cholinoesterazy, takich jak riwastygmina, które
działają zarówno na AChE, jak i na BuChE, wskazują na potencjalne korzyści
terapeutyczne z hamowania obydwu enzymów. Tworzenie substancji, które są
swoistymi inhibitorami butyrylocholinoesterazy i dalsze stosowanie inhibitorów
cholinoesteraz, które oprócz AChE hamują także BuChE, powinno doprowadzić do
poprawy wyników leczenia tej choroby [23].
Wnioski: Otrzymano nowe związki z grupy 1,3,4–tiadiazoli o potencjalnym działaniu
biologicznym. Badania spektroskopowe potwierdziły budowę połączeń oraz
przypuszczalny mechanizm reakcji. Przeprowadzone badania in vitro wykazały, że
połączenia z tej grupy związków posiadają właściwości inhibicyjne w stosunku do
acetylocholinoesterazy oraz butyrylocholinoesterazy. Dlatego mogą być poddane
kolejnym etapom badań nad poszukiwaniem skutecznego leku na chorobę Alzheimera.
Literatura:
1. D. K. Lahiri, Curr. Drug Targets, 42 (2003) 97.
2. P. D. Meek, E.K. McKeitan, G.T. Schumock, Pharmacotherapy, 18 (1998) 68.
3. S. Ball, Chemia szarych komórek. Neurochemia i toksykologia ośrodkowego układu
nerwowego. (2003) Medyk, Warszawa.
4. R. Magierski, I. Kłoszewska, T. Sobów, Aktualna Neurologia, 3 (2004) 171.
5. J. L. Cummings, G. Cole, Alzheimer Disease, JAMA, 287 (2002) 2335.
6. M. R. Roberson, L.E. Harrell, Brain Res. Rev., 25 (1997) 50.
7. E. Giacobini, Pharmacol. Res., 64 (2004) 433.
8. R. J. Harvey, S. Eagger, Rev. Contemp. Pharmacother., 6 (1995) 335.
9. H. Sugimoto, H. Ogura, J. Pharmacol. 89 (2002) 7.
10. S. Gauthier, H. Feldman, Curr. Med. Res. Opin., 18 (2002) 347.
11. T. Crook, Th Psychopharmacol. Bull., 12 (1992) 347.
12. A.G. Marangoni. How do enzymes work? In: Enzyme kinetics – a modern
approach.(2003) Wiley Interscience, Hoboken, New Jersey.
13. J. Kączkowski, Podstawy biochemii. (1999) WNT, Warszawa.
14. D. K. Granner, R.K. Murray, V.W. Rodwell, Biochemia Harpera. (2010) PZWL,
Warszawa.
15. J. Witwicki, W. Ardelt, Elementy enzymologii. (1989) PWN, Warszawa.
16. B. Baraniak, Enzymologia w zarysie. (2011), Wyd. Czelej Sp. z o.o.
17. J. M. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer. Biochemia (2009) PWN, Warszawa.
18. K. Pigoń, Z. Ruziewicz, Chemia fizyczna: Podstawy fenomenologiczne. (2005)
PWN, Warszawa.
19. A. Niewiadomy, J. Matysiak, G. Mącik – Niewiadomy, (1999) P – 330263.
20. J. Matysiak, J. Heterocyclic. Chem., 43 (2006) 55.
21. G. L. Ellman, K. D. Courtney, V. Andres, Biochem. Pharmacol., 7 (1961) 88.
22. R. J. Leatherbarrow, Stains, U.K: Erithacus Software Ltd, (1999).
23. R. Bullock, A. Cameron, Curr. Med. Res. Opin., 18 (2002) 258.